Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЗНАЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В И РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С СРЕДИ ЛИЦ РАЗЛИЧНОЙ ЭТНИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ И БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ В И С

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ЗНАЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В И РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С СРЕДИ ЛИЦ РАЗЛИЧНОЙ ЭТНИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ И БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ В И С"

ЛДЕЛЬ ЖУМАНАВАД

У

ЗНАЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В И РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С СРЕДИ ЛИЦ РАЗЛИЧНОЙ ЭТНИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ И БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ ВИС

03.00.15 - генетика 14 00 30 - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03454Э72

Москва-2008 г.

003454972

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета ГОУ ВПО «Российский Университет дружбы народов» и в лаборатории эпидемиологии вирусных гепатитов Учреждения Российской академии медицинских наук «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова РАМН»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Михайлов Михаил Иванович

Семененко Татьяна Анатольевна Щипков Валерий Петрович

Ведущая организация: ГУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится « 17» декабря 2008 г в 15 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертации Д 212.203.15 при Государственном Образовательном Учреждении Высшего Профессионального Образования «Российский Университет дружбы народов» по адресу. 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д 8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного Образовательного Учреждения Высшего Профессионального Образования «Российский Университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д 6

Автореферат разослан « /7»_Ц^_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета / /у/ кандидат биологических наук, доцент /уГ /

Гагани Ольга Борисовна

На правах рукописи

АДЕЛЬ ЖУМАН АВАД

КАЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА

ГЕПАТИТА В И РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С :РЕДИ ЛИЦ РАЗЛИЧНОЙ ЭТНИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ И БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ В II С

03 00.15 - генетика 14.00.30 - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2008 г.

Общая характеристика работы Актуальность темы исследования В 2004-2007 гг проявления эпидемического процесса гепатита В (ГВ) и гепатита С (ГС) в Российской Федерации приобрели принципиально новый качественный характер, продолжающееся снижение заболеваемости острыми формами сочетается с увеличением регистрации клинически выраженного хронического ГВ (ХГВ) и ГС (ХГС) и сохранением высокого уровня и активно выявляемых скрытых форм инфекции Важнейшим из маркеров ВГВ и ВГС является вирусная нагрузка данных вирусов в плазме или сыворотке крови пациентов Определение вирусной нагрузки вирусов гепатита В и С (ВГВ и ВГС), т. е концентрации вирусной ДНК и РНК в плазме или сыворотке крови, крайне важно в клинической практике, поскольку широкомасштабные когортные исследования показали роль высоких значений вирусной нагрузки ВГВ и ВГС как прогностического маркера неблагоприятного исхода заболевания - цирроза гтречени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы - ГЦК (С J Chu с соавт, 2002; С J Chen с соавт, 2006, U H Iloeje с соавт, 2006) Количественное определение ДНК ВГВ и РНК ВГС, наряду с биохимическими показателями, служит основным инструментом мониторинга противовирусной терапии и оценки ее эффективности (W О Cooksley с соавт, 2004, H В Keeffe с соавт, 2004), а также прогноза успеха лечения (Л Lok с соавт, 2004, А Л Van der Eijk с соавт, 2006) Величина вирусной нагрузки ВГВ и ВГС также является важным фактором, определяющим риск перинатальной передачи этих вирусов (А Soderstrom, 2003), и критерием допуска инфицированных медицинских работников к инвазивиым процедурам (EJ Buster, 2003) Учитыва» важность определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС в клинической практике, одним из основных требований к диагностикам для количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС является точность и воспроизводимость анализа В лабораторной практике используется целый ряд тестов для количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС, преимущественно основанных на методе полимеразной реакции (ПЦР) в реальном времени и методе разветвленных цепей ДНК (рДНК) Однако не установлен единый алгоритм определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС с помощью данных тестов Показано, что заболеваемость ЦП и ГЦК у среди лиц, проживающих в гиперэндемичных по ВГВ и ВГС территориях, значительно превышает аналогичные показатели в общей популяции Так, среди коренного населенля Аляски заболеваемость ГЦК в 5 раз превышает заболеваемость среди белого населения США (В J McHalon с соавт, 2001) Более высокие уровни заболеваемости ЦП и ГЦК связаны с высокой распространенностью ВГВ и ВГС в данных популяциях При этом установлено, что с повышенным риском карцшогенеза связаны определенные факторы

организма и вируса - генотип вируса, возвращение к HBeAg-позитивному стаггусу после периода сероконверсии по анги-НВе и старший возраст (S Е Livingston с соавт, 2007) Однако недоказанный остается предположение о том, что с повышенным риском развития ЦП и ГЦК при ГВ и ГС могут быть связаны определенные генетические факторы Учигывая, что связь между высокими значениями вирусной нагрузки ВГВ и ВГС и риском развития ЦП и ГЦК в настоящее время подтверждена, вполне возможным представляется существование различий между уровнями вирусной нагрузки ВГВ и ВГС среди инфицированных этими вирусами лип, принадлежащих к различным генетическим группам и проживающих в регионах с разными уровнями эвдемичности по ВГВ и ВГС

Цель исследован/ля

Целью настоящего исследования являлось определение значимости количественного выявления ДНК ВГВ и РНК ВГС в регионах с различными уровнями эндемичности по гепатитам В и С

Задачи исследования:

1 сравнить методы и диагностические препараты для количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС,

2. разработать алгоритм применения тестов для определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС,

3 определить уровни вирусной нагрузки ВГВ и ВГС в разных группах населения - у пациентов с ХГВ и ХГС, проживающих в региона)! с умеренным (Московская область) и высоким (Республика Тыва) уровнями эндемичности,

4 проанализировать клиническое значение количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС

Научная новизна

1 Впервые показана более высокая воспроизводимость результатов определения вирусной нагрузки, полученных методом анализа разветвленные цепей ДНК (рДНК) по сравнению с методом ПЦР в реальном времени

2 Впервые в России предложен алгоритм определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС, основанный на ■ последовательном применении иммунологических и молекулярно-биологических тестов

3 Впервые в России показано отсутствие значимых различий между средними значениями вирусной нагрузки ВГВ и ВГС и долей лиц с высокими и низкими уровнями виремии среди пациентов с ХГВ и ХГС, проживающими в регионах с высокой и низкой степенью эндемичности по данным инфекциям

4 Впервые в России на основании когортного исследования и разбора клинических случаев установлена роль уровней виремии ВГВ и ВГС в прогрессировании заболевания печени и их влияния на степень гистологической активности при ВГВ- и ВГС-ассоциированном ХГ

Практическая значимость полученных новых научных знаний

1 Предложенный алгоритм определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС

может применяться как в клинической практике, так и при исследованиях, посвященных значимости определения вирусной нагрузки при вирусных ГВ и ГС

2 Установленное влияние уровней виремии ВГВ и ВГС на степень гистологической активности при ВГВ- и ВГС-ассоциированном ХГ и на прогрессирование заболевания печени доказывает необходимость применения тестов для количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС в клинической практике

3 Доказанное отсутствие влияния на уровни вирусной нагрузки ВГВ и ВГС генетического (этнической принадлежности) и эпидемиологического (степени эндемичности территории проживания по ГВ и ГС) факторов позволяют унифицировать подходы к мониторингу вирусной нагрузки у пациентов с ГВ и ГС, что имеет большое значение для клинической практики

Апробация работы и публикации по теме диссертации Основные положения, выводы и практические рекомендации представлены на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клиническои медицины», Москва, 2006 г, VII Российской международно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечеиие и профилактика», Москва, 2007 г, IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008 г Апробация работы проведена на заседании отдела вирусных гепатитов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им М П Чумакова РАМН

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них статей в центральной печати - одна, тезисов - четыре

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 12 источников отечественных и 124 зарубежных авторов Работа изложена на 131 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц, 29 рисунков, 2 клинических наблюдения

Основные положения, выносимые на защиту

1 Показана высокая специфичность тест-систем для определения вирусной нагрузки вируса ГВ - "VERSANT HBV 3 0" (метод разветвленных цепей ДНК) и «Биотитр-В» (метод ПЦР в реальном времени) и согласованность результатов, полученных с помощью данных тестов

2 Для теста "VERSANT HBV 3 0" (метод разветвленных цепей ДНК) установлена более высокая степень воспроизводимости результатов по сравнению с тестом «Биотитр-В» (метод полимеразной цепной реакции - ПЦР в реальном времени), максимальное значение коэффициента вариации для двух тест-систем составило 2,79% и 10,69% соответственно

3 Показано отсутствие значимых различий между средними значениями вирусной нагрузки ВГВ и ВГС и долей лиц с высокими и низкими уровнями виремии среди пациентов с ХГВ и ХГС, проживающими в регионе с высокой степенью эндемичности (Республика Тыва) и регионе с низкой степенью эндемичности (Московская область)

4 Установлено, что такой генетический фактор, как этническая принадлежность, и такой эпидемиологический фактор, как проживание на территории с высокой или низкой степенью эндемичности по ГВ и ГС, не оказывают влияние на уровни виремии этих вирусов

5 Анализ клинического значения количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС, проведенный среда пациентов с ХГВ и ХГС, показал отсутствие статистически значимой взаимосвязи между биохимическими показателями и уровнями виремии ВГВ и ВГС, однако была выявлена тенденция к повышению уровней активности аминотрасфераз (AJIT и ACT) у пациентов с высокой вирусной нагрузкой ВГВ и ВГС

Содержание работы Материалы и методы исследования Для определения уровней вирусной нагрузки ВГВ и ВГС у нативных пациентов (не получавших противовирусной терапии) с ХГВ и ХГС, проживающих в регионах с умеренным и высоким уровнями эндемичности С этой целью обследовали 54 пациента с ХГ, проживающих в Республике Тыва (гиперэндемичный район) и 127 пациентов - с ХГ, проживающих в Московской области (умеренная степень эндемичности) На момент обследования у всех пациенюв отсутствовала тяжёлая патология внутренних органов, злокачественные заболевания, ожирение, а также не была зафиксирована алкогольная шш наркотическая зависимость В исследование не включались беременные и кормящие грудью женщины, пациенты с аутоиммунными заболеваниями печени

Диагноз ХГВ и ХГС устанавливали на основании клинических данных, наличия маркеров инфицирования ВГВ и ВГС (HBsAg, ДНК ВГВ, анти-ВГС, РНК ВГС) и

повышения уровня сывороточных аминотрансфераз (AJIT и ACT) в течение последних 6 месяцев В план обследования включен анализ анкет для выявления потенциальных факторов риска инфицирования вирусами гепатитов с парентеральной передачей Распределение больных по полу, возрасту и нозологическим формам представлено в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика обследованных больных с ХГВ и ХГС

Регион Нозологическая форма м/ж Средний возраст годы, X+SD Предполагаемая длительность заболевания, годы, X±SD

Московская область ХГВ, п=64 34/30 44±24 5 4±3 7

ХГС, п=63 33/30 44±27 4 6±2 8

Республика Тыва ХГВ, п = 6 2/4 30*23 негустановлена

ХГС,п = 33 10/23 42 ±28 4 8+3 1

Биохимические показатели активности АЛТ и ACT, фракции билирубина, протромбиновый индекс, креатинин, общий белок определялись на многофункциональном биохимическом анализаторе «Labsystem-M2340» (Финляндия)

С целью обнаружения вирионов в печени и их идентификации часть биопсийного материала от двух клинических случаев, анализировавшихся в работе, изучалась с помощью электронной микроскопии в лаборатории патоморфологии вирусных заболеваний ГУ ИПВЭ РАМН (зав лаб - профессор И А Морозов) срезы изучали в световом микроскопе с целью сопоставления с морфологической картиной, полученной на клинической базе (ГКБ N° 12 г Москвы) кафедры госпитальной терапии № 2 лечебного факультета РГМУ (зав кафедрой - академик РАМН, профессор Г И Сторожаков)

Для определения серологических маркеров ГВ и ГС были использованы коммерческие тест-системы производства ЗАО «Веетор-Бест» «Вектогеп В- HBs - антиген-стрип», с заявленной чувствительностью 0,1 нг/мл для выявления HBsAg, «Вектогеп В - HBs -антиген- подтверждающий тест стрип» с чувствительностью 0,1 нг/мл - для подтверждения в реакции нейтрализации позитивных результатов выявления HBsAg , «ГепаБест аши-HBc-IgG-CTpnn» и «BeKToHBcAg-IgM - стрип» - для выявления иммуноглобулинов класса IgG и IgM к core антигену вируса гепатита В, «BeieroHBsAg-антитела» - для количественного определения антител к HBsAg в диапазоне от 0 до 200мМЕ/мл, «РекомбиБЕСТ- анти-ВГС-стрип» - для выявления иммуноглобулинов классов G и М к вирусу гепатита С, «РекомбиБЕСТ- анги-ВГС подтверждающий тест» - с целью подтверждения положительных результатов ИФА, полученных при скрининге. Все постановки выполняли в соответствии с протоколами производителя

При анализе молекулярных маркеров ГВ и ГС проводили выделение тотальных нуклеиновых кислот из образцов сыворотки крови с помощью набора для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови ООО НПФ «ЛИТЕХ» в соответствии с инструкцией производителя Определение ДНК ВГВ проводили в ПЦР с праймерами к консервативному участку ргесоге/соге генома ВГВ с чувствительностью не менее 100 копий/мл по результатам тестирования серии предельных разведений образцов с извгстной концентрацией ДНК ВГВ. РНК ВГС определяли методом обрагной транскрипции - ПЦР (ОТ-ПЦР) с праймерами к консервативному участку 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) с чувствительностью не менее 100 копий/мл по результатам тестирования серии предельных разведений образцов с известной концентрацией РНК ВГС Генотип ВГС определяли методом ОТ-ПЦР с генотип-специфичными праймерами, предложенными Т ОИлоиМ Mizokami, 1998.

Для количественного определения ДНК-ВГВ и РНК-ВГС были использованы наборы «Биотитр-В» и «Биотитр-С», соответственно, производства ООО НПФ «ЛИТЕХ» Постановку данных тестов проводили проводи, ш в соответствии с инструкцией производителя в анализаторе TaqMan 48 (Roche)

В процессе сравнительных испытаний двух методов количественного определения ДНК ВГВ в сыворотке и плазме крови человека - '"VERSANT HBV 3 0" (Bayer, метод разветвленных цепей ДНЮ, и «Биотитр-В» (ООО НПФ «ЛИТЕХ», Россия, ПЦР в реальном ^ремепи) проводили тестирование образцов сыворотки крови, полученных от пациентов с клинически подтвержденной ВГВ-инфекцией (п = 56) Среди обследованных пациентов у 33 (58,9%) был ХГВ, у 15 (26,8%) - «носительство» HBsAg, у 2 (3,6%) - ВГВ-ассошшрованный ЦП, у 3 (5,4%) - коинфекция ВГВ и ВГС, у 2 (3,6%) - коинфекция ВГВ и вируса гепатита дельта (НГО), и у I (1,8%) - коинфекция ВГВ, ВГС и ВГВ Образцы сыворогкн крови, полученные от данных пациентов, тестировали однократно, параллельно в тестах "VERSANT HBV 3 0" и «Биетитр-В» Для образцов, значения которых находились в линейном диапазоне для обоих тестов, "VERSANT HBV 3 0" и «Биотитр-В», соответственно, проводили определение корреляции полученных значений по Пирсону Чувствительность и воспроизводимость результатов количественного определения ДНК ВГВ в тесте 'VERSANT HBV 5 0" в сравнении с дизгностикумом «Биотитр-В» (ООО НПФ «ЛИТЕХ») определяли с помощью панели разведений стандарта ДНК ВГВ Панель представляла собой рат ведения стандарта, содержащего рекомбинантную ДНК ВГВ (производитель «Авиценна», Россия) в ВГВ-негативной человеческой плазме Панель содержала 5 разведении с шагом 1 lg копий ДНК ВГВ/мл, с концентрациями от 7 lg копий ДНК ВГВ/мл до 3 lg копий ДНК ВГВ/мл В каждом тесте

проводили трехкратное определение для каждой концет рации стандарта Для анализа клинической специфичности двух тестов проводили тестирование ВГВ-негативных образцов сыворотки крови, полученных от доноров крови, нереактивных по HBsAg и анти-НВс в ИФА (п = 60)

Статистические методы Для обработки полученных результатов использовали общепринятые методы вариационной статистики, включая oi ределение коэффициента корреляции по Пирсону и коэффициента вариации (CV%) Оценку достоверности различий между сравниваемыми величинами осуществляли на основании t-критерия Стьюдента (различия оценивались как достоверные при вероятности 95% - р <0,05)

Результаты н их обсуждение Сравнительная характеристика двух тестов, предназначенных для определения вирусной нагрузки ВГВ в сыворотке крови и плате, основанных на применении двух разных методов детекции

Оценка воспроизводимости тестов с помощью панели разведений рекомбинантней ДНК ВГВ показала более высокую воспроизводимость теста "VERSANT HBV 3 0" -коэффициент вариации колебался от 0,79% до 2,79%, тогда как значения коэффициента вариации для референс-теста «Биотитр-В» составляли от 2,39% до 10,69% (табл 2) Для каждого разведения панели - 103 Konmt/мл, 104 копий/мл, Ю5 копий/мл, 10° копий/мл и 107 копий/мл значения коэффициента вариации были ниже при использовании теста "VERSANT HBV 3 0" но сравнению с референс-тестом

Таблица 2. Результаты количественного определения ДНК ВГВ в панели разведений _стандарта ВГВ (рекомбинантиая ДНК ВГВ), «Авиценна» _ __,

Концентрация ДНК HBV (копии ДНК HBV) 10'' 10" 105 il? п 10J

Средний титр в «VERSANT HBV 3 0» (lg когшй/мл) 1,7x10" 6,23 5,7 х 10' 5,76 5,3x104 4,72 3,0 х 10J 3,48

Коэффициент вариации (CV%) 2,54% 1,34% 0,79% 2,77%

Средний титр в «Биотитр-В» (lg копий/мл) 6,2 х 10" 6,79 6,6 х 10' 5,S2 9,4 х 104 4,97 5,5 х 104 3,74 0

Коэффициент вариации (CV%) 4,36% 10,69% 2,39% 5,67% -

Клиническую специфичность двух тсегов оценивали с помощью анализа ВГВ-негативных образцов сыворотки крови, полученных от доноров крови, нереактивных по

HBsAg и анти-НВс в ИФА (п = 60) Тестирование 60 образцов сыворотки крови, полученных от ВГВ-нереактивных допоров крови, показало, что все образцы были негативны по ДНК ВГВ в тестах "VERSANT HBV 3 0" и «Биотитр-В». Таким образом, клиническая специфичность обоих тестов составила 100%

Сопоставление результатов, полученных в тестах "VERSANT HBV 3 0" и «Биотитр-В», проводили для образцов сыворотки крови, полученных от пациетов с клинически подтвержденной ВГВ-инфекцией (п = 56)

Образцы сыворотки крови, полученные от данных пациентов, тестировали однократно, параллельно в тестах "VERSANT HBV 3 0" и «Биотитр-В» Дискордантными считали результаты, полученные в двух тестах, если они различались не менее чем на 1 lg копт! ДНК ВГВ/мл. Для образцов, значения которых находились в линейном диапазоне для обоих тестов, "VERSANT HBV 3 0" и «Биотитр-В», соответственно, проводили определение корреляции полученных значений по Пирсону

Среди 56 образцов, полученных от пациентов с подтвержденной ВГВ-инфекцией, дискордантные результаты при тестировании в "VERSANT HBV 3 0" и «Биотитр-В» были получены для 4 образцов, что составило 7,1% от общего числа протестированных образцов Все 4 образца с дискордантными результатами были получены от пациентов с ХГВ и имели высокую вирусную нагрузку (более 106 копий/мл в обоих тестах) В пределы линейных диапазонов обоих тестов (2х103 - Ю8 копий ДНК ВГВ/мл для "VERSANT HBV 3 0" и 103 - 107 копий ДНК ВГВ/мл для «Биотитр-В», соответственно) укладывались значения, полученные для 30 образцов (53,6%) (рис 1) Значение коэффициента корреляции по Пирсону для результатов, полученных в "VERSANT HBV 3 0" и тесте •чБиотитр-В», и находящихся в линейном диапазоне для обоих тестов, составило 0,712.

=> s

3 4 5 6 7 S

HBV |0 копиий^ми, Бмотигр-В

Рис. 1. Корреляция результатов, полученных при тестировании в тестах VERSANT HBV 3.0 и в «Биотитр-В» образцов сыворотки крови от инфицированных ВГВ пациентов

Среди ВГВ-инфицированных пациентов распределение значений концентрации ДНК ВГВ. полученных в тесте "VERSANT HBV 3 0", было следующим - среди «носителей»

10

HBsAg и пациентов с коинфскцией ВГС, ВГО, а также у пациентов с ВГ'В-ассоциированным ЦП уровни вирусной нагрузки ВГВ были низкими (-^ 2000 копай/мл) или средними (<10' копий/мл) У пациента с коинфекцией ВГВ, ВГТ) и ВГС вирусная нагрузка ВГВ была < 2000 копий/мл Среди пациентов с ХГВ преобладали средние уровни вирусной нагрузки ВГВ (20/33; t0,6%), однако у 7/33 (21,2%) регистрировали высокие уровни виремии (>106 копий/мл), а у 6/33 (18,2%) - низкие уровни виремии ВГВ (< 2000 копий/мл)

Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности изучавшихся тестов и согласованности полученных в >ых результатов, однако для теста "VERSANT HBV 3 0" (метод разветвленных цепей ДНК) показана более высокая степень воспроизводимости по сравнению с тестом «Биотитр-В» ( метод ПЦР в реальном времени)

Таким образом, было сделало заключение о возможности применения с равной эффективностью двух данных методов для дальнейших исследований по определению значимости количественного выявления ДНК ВГВ и РНК ВГС в регионах с различными уровнями эндемичносги по ГВ и ГС Однако, учитывая расхождения в воспроизводимости двух анализировавшихся тест-систем, очевидно, что для получеши сопоставимых результатов в разных когортах пациентов такие исследования необходимо проводить каким-либо одним методом Учитывая большею доступность, для решения последующих задач исследования, включая определение уровней вирусной нагрузки ВГВ и ВГС у пациентов сХГВ и ХГС, проживающих в регионах с умеренным и высоким уровнями эндемичности, и анализ клинического значения количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС. нами были выбраны системы «Биотитр-В» и «Биотитр-С», к основе которых лежит технология ПЦР в реальном времени

На основании полученных данных, для проведения исспедований, посвященных, значимости определения вирусной нагрузки при вирусных ГВ и ГС, нами был предложен алгоритм применения тестов для определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС Ниже приведена последовательность действий, представляющая данный алгоритм

1 Тестирование серологических маркеров ГВ и ГС - HBsAg и анти-ВГС, соответственно, с сертифицированными чувствительными ИФА тсст-системами

2 Определение в качественном ГЩР-тесте, обладающем чувствительностью 100 копий/мл, ДНК ВГВ и РНК ВГС в образцах сыворотки/плазмы крови, положительных по HBsAg и анти-ВГС соответственно

3 Проведение количественного анализа ДНК ВГВ и РНК ВГС в образцах сыворотки/плазмы крови с вирсмией ВГВ и ВГС соответственно, выявленной в чувствительном качественном ГЩР-тесте Количественное определение ДНК ВГВ и Р'ЯК

ВГС должно проводиться во всех исследуемых образцах одним методом, с использованием одной тест-системы

Уровни вирусной нагрузки ВГВ и ВГС у пациентов е регионах с умеренным и высоким уровнями эндемичности

Для исследований по анализу уровней вирусной нагрузки ВГВ и ВГС у пациентов с ХГВ и ХГС, проживающих на территориях с умеренными и высокими уровнями эндемичности, были выбраны два региона Российской Федерации - Московская область и Республика Тыва Республика Тыва, по данным регистрации заболеваемости ГВ, является гиперэндемичным регионом по ВГВ-инфекции В 2007 г показатели заболеваемости ХГВ достигли 22,01 на 100 тыс населения, что в 1,6 раза превышает показатель для Российской Федерации (РФ) - 14,0 на 100 тыс нас и в 5,3 раза - показатели для Московской области (4,13 на 100 тыс населения) Показатель заболеваемости острым гепатитом В (ОГВ), по данным за 2007 г, в Республике Тыва (9,39 на 100 тыс населения) также значительно превышают средний показатель по РФ (5,28 на 100 тыс населения) и показатель по Московской области (7,65 на 100 тыс населения)

Показатели заболеваемости ХГС в Республике Тыва, по данным за 2007 г, в 5,4 раза ниже, чем в РФ (соответственно 6,8 и 37,01 на 100 тыс населения), и почти в 2 раза ниже по сравнению с показателем заболеваемости ХГС в Московской области (12,94 на 100 тыс населения) Также в Московской области в 2007 г заболеваемость ОГС превышала средний показатель по РФ - 6,96 на 100 тыс населения против 3,58 на 100 тыс населения, тогда как аналогичный показатель в Республике Тыва составил всего 0,97 на 100 тыс населения

Таким образом, в нашем исследовании Республика Тыва является регионом с высоким уровнем эндемичности по ГВ, а Московская область - регионом с низким уровнем эндемичности rio ГВ По ГС ситуация обратная - Московская область является регионом, эндемичным по ГС, тогда как для Республики Тыва характерен низкий уровень эндемичиости по ГС

Результаты анкетирования, проведенного с целью выяснения демографических данных пациентов, предполагаемой продолжительности заболевания, источников инфицирования, факторов риска, показали, что две анализируемых когорты - пациенты с ХГВ и ХГС, проживающие в Московской области и Республике Тыва, достоверно не различались по возрасту, средней продолжительности заболевания и распределению

факторов риска инфицирования, что является хорошей предпосылкой для изучения влияния генетических факторов и региона проживания на величину вирусной ншрузки ВГВ и ВГС

Среди 64 пациентов с ХГВ, проживающих в Московской области, ДНК ВГВ была выявлена в сыворотке крови у всех пациентов Значения вирусной нагрузки ВГВ у пациентов с ХГВ, проживающих в этом регионе, колебались от 1 х 103 до 1 х 107 копий/мл, составляя в среднем 1,0 х 105 копий/мл При этом доля лиц с вирусной нагрузкой ВГВ, не превышавшей среднее значение, выявлена у 48,4% (31/64) обследованных, а доля лиц с вирусной нагрузкой ВГВ более 1,0 х 105 копий/мл - у 51,6% (33/64)(табл 3)

Таким образом, распределение в когорте пациентов с ХГВ, проживающих в Московской области, лиц с высокой и низкой вирусной нагрузкой ВГВ было практически равным Среди 6 пациентов с ХГВ, проживающих в Республике Тыва, определяемые уровни ДНК ВГВ были выявлены всего у 2 пациентов, остальные являлись отрицательными по ДНК ВГВ У двух пациентов с виремией ВГВ вирусная нагрузка составила 1 х 104 копий/мл и 1 х 107 копий/мл (в среднем - 5х 10' копий/мл) Выявление вирусной ДНК только у двух из 6 пациентов с ХГВ, проживающих в Республике Тыва, не позволяют проводить корректное сопоставление значений вирусной нафузки ВГВ у пациентов, проживающих в двух обследованных регионах Однако средние значения ВГВ, полученные для пациентов, положительных по вирусной ДНК в сыворотке крови, указывают на тенденцию к отсугствию различий эюго показателя у пациентов разной расовой принадлежности-, проживающих на территориях с разными уровнями эндемичности по ВГВ

Среди 63 пациентов с ХГС, проживающих в Московской области. РНК ВГС в сыворогке крови была выявлена во всех слу чаях, при этом значения вирусной нагрузки ВГС в дайной группе пациентов варьировали 01 2.4 х 104 копий/мл до 1 х 107 копий/мл. Средняя величина вирусной нагрузки ВГС у пациентов, проживающих в Московской области, не превышала 5,0 х 106 копий/мл, при эгом доля лиц с низкой вирусной нагрузкой (менее 5,0 х 10б) составила 56,0% (34/63), а лиц с высокой вирусной нагрузкой -46,0% (29/63) (табл 3) Статистически значимые различия по частоте выявления высокой и низкой вирусной нагрузки ВГС среди пациентов Московской области отсутствовали (р>0,05)

Таким образом, доли больных с высокими и низкими уровнями виремии ВГС в данной когорте были сходными Анализ генотипов ВГС у наблюдавшихся пациентов

показал, что генотип 1Ь встречался у 46% (29/63) пациентов, генотип За - у 54% (34/63) пациентов.

Среди 33 пациентов с ХГС, проживающих в Республике Тыва, РНК ВГС была выявлена у всех пациентов Генотип ВГС 1Ь был устаповлен у 17 (51%) пациентов, генотип ВГС За - у 16 (48%) пациентов, т е распределение генотипов ВГС среди пациентов с ХГС. проживающих в республике Тыва, было сходным с наблюдавшимся среди пациентов ;;з Московской области Уровни вирусной нагрузки колебались от 3,5 х 104 до 1 х 107 копий/мл, составив в среднем 5,0 х 106 копий/мл Данный показатель был идентичен значению, полученному при анализе вирусной нагрузки ВГС у пациентов с ХГС, проживающих в Московской области

Таблица 3. Распределение лиц с низкой и высокой вирусной нагрузкой ВГВ у пациентов, проживающих в регионах с разными уровнями эндемичности

по ВГВ и ВГС

Регион Средние значения вирусной нагрузки, копии/мл

ВГВ ВГС

<1,0x10' > 1,0 х 10' <5,0х 10" > 5,0 х 106

Московская область 31/64 (48,4%) 33/64 (51,6%) 56,0% (34/63) 46,0% (29/63)

Республика Тыва 1/2 1/2 42,4% (14/33) 57,6% (19/33)

Доля лиц с концентрациями РНК ВГС в сыворотке крови, превышающими среднее значение (высокая вирусная нагрузка), составила 57,6% (19/33), доля лиц с низкой вирусной нагрузкой (ниже среднего значения) - 42,4% (14/33) (табл 3) Распределение лиц с высокой и низкой вирусной нагрузкой ВГС среди пациентов с ХГС, проживающих в Республике Тыва, как и среди лиц, проживающих в Московской области, было примерно равным

Таким образом, две группы пациентов с ХГС, проживающих в регионах с разной степенью эндемичности по ГС, не различались по доле лиц с высокими и низкими уровнями виремии ВГС Средние значения в.'фусной нагрузки ВГС также были одинаковыми в этих двух группах - 5,0 х 106 копий/мл Полученные результаты продемонстрировали, что в двух группах пациешов с ХГС, имеющих разную расовую принадлежность, и как следствие, различающихся по генетическим факторам организма, проживающих в регионах с разными уровнями эндемичности по ГС, отмечены одинаковые средние уровни виремии ВГС и сходное распределение лиц с высокой и низкой вирусной нагрузкой ВГС Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии влияния уровня эндемичности региона проживания и этнической принадлежности пациента на уровни вирусной нагрузки ВГВ и ВГС соответственно

14

Анализ клинического значения количественного определения ДНК ВГВ и РНК вгс

Задачей данного этапа исследован™ явилось изучение особенностей клинического течения хронического вирусного гепатита в зависимости от вида вирусов - ВГВ, ВГС, их генотипов и уровня виремии Исследования проводили среди 127 пациентов с ХГВ (п = 64) и ХГС (п = 63), проживающих в Московской области

Больные ХГ вирусной этиологии были разделены на 2 группы, с высокой (1а и На) и низкой (16 и Нб) вирусной нагрузкой ВГВ и ВГС соответственно На основании результатов определения средних значений вирусной нагрузки ВГВ и ВГС, приведенных выше, для ГВ в качестве показателя, разделяющего уровни нагрузки на высокий и низкий, была выбрана концентрация ДНК ВГВ, равная 1,0х105 копий/мл, для ГС - концентрация РНК ВГС, равная 5,0х106 копий/мл (табл 4)

Генотшшрование ВГВ показало принадлежность изолятов, выделенных от HBsAg-позитивных пациентов, к генотипу Э У больных ХГС выявлены генопипы ВГС 1Ь и За у 29 пациентов с высокой вирусной нагрузкой ВГС (> 5,0 х 10' копий/мл) Из них генотип 1Ь был выявлен у 13 (44,8%) человек, генотип За - у 16 (55,2%) Среди 34 пациентов с низкой вирусной нагрузкой ВГС (<5,0 х 106 копий/мл) генотип 1Ь был обнаружен у 16 (47,1%) обследованных, генотип За-у 18 (52,9%) (табл 5) Таким образом, распределение генотипов ВГС было сходным в группах пациентов с высоким и низким уровнями виремии

Таблица 4. Распределение больных с хроническими вирусными гепатитами в

Вирусная нагрузка, копии/мл

ХГВ (I группа) ХГС (11 группа)

1а 16 Па Нб

>1,0x10' < 1,0 х Ю3 > 5,0 х 10ь < 5,0 х Ю6

(п=33) (п=31) (п=29) (п=34)

Таблица 5. Распределение генотипов ВГВ н ВГС у обследованных больных

Генотипы ВГВ и ВГС

ХГВ (1 группа) ХГС (11 группа)

]я 16 Па Иб

(11=33) (ч=31) (п=13) (п=16) (п=16) (п=18)

Б О 1Ь За 1Ь За

Клинические проявления у больных с наличием маркеров репликации ВГВ и ВГС соответствовали астеническому и болевому синдромам Жалобы на боли и/или чувство

15

тяжести в правом подреберье отмечали 46 (70%) и 46 (70%) больных ХГВ и ХГС, соответственно Слабость, быстрая утомляемость наблюдались у 26 (39,4%) при ХГВ и у 26 (39,4%) - ХГС В меньшем проценте случаев больные отмечали тошноту - 7 (10,6%) и 7 (10,6%), отрыжку — 2 (3%) и 2 (3%), нарушение стула - 9 (13,6%) и 9 (13,6%) больных ХГВ и ХГС, соответственно

"Малых" печеночных знаков не выявлено Желтушность склер при осмотре была обнаружена у 2 больных ХГВ, что составило (3,1 %) У 26 (39,4%) пациентов с ХГВ и у 26 (39,4%) обследованных с ХГС печень выступала из-под края реберной дуги по срединно-юпочичной линии на 0,5-4 см (в среднем - 2,2±0,5 см) Размеры селезенки были не изменены.

По данным УЗИ органов брюшной полости, признаки диффузного поражения печени выявлены у 42 и 34 больных ХГВ и ХГС, что составило 65,6% и 54,0% соответственно Гепатомегалия отмечена у 32 (50,0%) и 32 (50,8%) при ХГВ и ХГС соответственно, повышение эхогенности ткани печени - у 62 (96,9%) и 62 (98,4%), ослабление видимости сосудистых структур - у 10 (15,6%) и 10 (15,9%) - при ХГВ и ХГС соответственно Признаков портальной гипертензии по результатам УЗИ и эндоскопии верхних отделов пищеварительного тракта получено не было Частота выявления клинических признаков поражения печени была сходной у больных ХГВ и ХГС

С целью оценки функционального состояния печени у данных пациентов с ХГВ и ХГС. анализировали показатели активности АЛТ, ACT и содержание билирубина в сыворотке крови в зависимости от вирусной нагрузки ВГВ и ВГС (табл 6)

Анализ биохимических показателей у больных ХГВ с высокой (>1,0 х 105 копий/мл, п=33) и низкой вирусной нагрузкой ВГВ (<1,0 х 105 копий/мл, п=31) показал отсутствие статистически достоверных различий активности АЛТ, ACT и билирубина в этих двух группах Однако была отмечена тенденция к повышению уровня показателей в группе пациентов с высокой вирусной нагрузкой ВГВ

Таблица 6. Биохимические показатели (М±80) у больных ХГВ и ХГС _с высоким и низким уровнем вирусной нагрузки, п=127_

Вирусная нагрузка, копии/мл АЛТ, МЕ/мл ACT, МЕ/мл Билирубин, мкмоль/л

ДНК ВГВ, >1,0 х 10" (п=33) 53,61 ± 35,92 45,89 ±27,85 14,67 ± 9,47

ДНК ВГВ, <1,0 х 105(п=31) 38,70 ±27,31 36,81 ±26,41 13,39 ±6,70

РНК ВГС, >5,0 х 106(п=29) 73,65 ± 55,09 62,39 ± 52,30 10,6 ± 4,87

РНК ВГС, <5,0 х Ю6(п=34) 62,63 ±38,97 40,96 ±22,31 13,59 ±8,40

fíe были выявлены статистически достоверные различия активности АЛТ, ACT и билирубина в группах пациентов с высокой (>5,0 х 106 копий/мл, п=29) и низкой (<5,0 х 106 копий/мл, п=34) вирусной нагрузкой ВГС Эта закономерность сохранялась и при тенденции к повышению показателей активности АЛТ и ACT в группе пациентов с высоким уровнем РНК ВГС

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии значимых различий по уровням вирусной нагрузки ВГВ и ВГС, а также доле лиц с высокой и низкой вирусной нагрузкой, среди пациентов с хроническими гепатитами В и С, относящихся к различным этническим группам и проживающих в регионах, различающихся степенью эндемичности по ВГВ и ВГС Установлено, что генетический фактор - этническая принадлежность, и эпидемиологический фактор - проживание на территории с высокой или низкой степенью риска многократной встречи с возбудителем не оказывают влияние на уровни виремии этих вирусов и, соответственно на активность репликации ВГВ и ВГС Анализ клинического значения количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС, проведенный среди пациентов с ХГВ и ХГС, проживающих в нсэндемичном по данным инфекциям регионе (Московская область), показал отсутствие статистически значимой взаимосвязи между биохимическими показателями и величиной вирусной нагрузки ВГВ и ВГС, однако была показана тенденция к повышению таких биохимических показателей, как уровни активности АЛТ и ACT у пациентов с высокой вирусной нагрузкой

Результаты гистологического обследования и глубокого морфологического анализа, проведенного с помощью электронной микроскопии, на конкретных клинических примерах пациентов с высокой и низкой вирусной нагрузкой ВГВ и ВГС, соответственно, подтверждают данные о роли уровней виремии в прогрессировании заболевания печени и их влиянии на степень гистологичской активности при ВГВ- и ВГС-ассоциированном хроническом гепатите

Выводы

1 Показана высокая специфичность тест-систем для определения вирусной нагрузки вируса гепатита В - "VERSANT HBV 3.0" (метод разветвленных цепей ДНК) и «Биотитр-В» (метод ПЦР в реальном времени) и согласованность результатов, полученных с помощью данных тестов

2 Показано отсутствие значимых различий между средними значениями вирусной нагрузки ВГВ и ВГС и долей лиц с высокими и низкими уровнями виремии среди пациентов с хроническими гепатитами В и С, проживающими в регионе с высокой

степенью эндемичносги (Республике Тыва) и регионе с низкой степенью эндемичносги (Московская область)

3. Для теста "VERSANT HBV 3 0" (метод разветвленных цепей ДНК) установлена более высокая степень воспроизводимости результатов по сравнению с тестом «Биотитр-В» (метод ПЦР в реальном времени), максимальное значение коэффициента вариации для двух тест-систем составило 2,79% и 10,69% соответственно

4. Установлено, что такой генетический фактор, как этническая принадлежность, и такой эпидемиологический фактор, как проживание на территории с высокой или низкой степенью эндемичносги по гепатиту В и С, не оказывают влияние на уровни виремии этих вирусов.

5. Анализ клинического значения количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС, проведенный среди пациентов с ХГВ и ХГС, показал отсутствие статистически значимой взаимосвязи между биохимическими показателями и уровнями виремии ВГВ и ВГС, однако была выявлена тенденция к повышению уровней активности АЛТ и ACT у пациентов с высокой вирусной нагрузкой ВГВ и ВГС

Практические рекомендации

1. Для оптимизации количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС в образцах сыворотки и плазме крови рекомендуется соблюдать последовательность действий, включающую тестирование серологических маркеров ГВ (HBsAg) и ГС (анти-ВГС), детекцию ДНК ВГВ и РНК ВГС в качественном ПЦР-тесте с чувствительностью не менее 100 копий/мл с последующей оценкой уровня виремии

2 Выявленная взаимосвязь между уровнем вирусной нагрузки и степенью активности некровоспалителыюго процесса печени сгидетельствует о необходимости осуществления клинико-вирусологического обследования больных с вирусными гепатитами В и С в динамике с целью своевременного выявления прогрессирования заболевания

3 Отсутствие влияния генетических и эпидемиологических факторов на уровни виремии

ВГВ и ВГС подтверждает целесообразность проведения универсального вирусологического мошггоринга вне зависимости от этнической принадлежности пациентов и распространенности вирусных гепатитов на территориях их проживания

Публикации, содержаi.'iiie основные научные результаты диссертации

1 Жуман Авад А Молекулярная характеристика изоиятов вируса гепатита В, выделенных от пациентов со скрытым гепат.'том В / Ганина А А, Кюрегян К К, Исаева О В.,

Дмитриев П Н , Жумаи Авад А, Михайлов МИ// Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2006 С 101

2 Жумаи Авад А Частота выявления и генотипическое разнообразие ОВУ-С среди ВИЧ инфицированных пациентов / Дмитриев П Н , Цыкина М Н , Моисеева А В , Серков И Л , Пронин А Ю , Жумаи Авад А и др // Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2006 С 132-133

3 Жуман Авад А Сравнительная характеристика двух тестов, предназначенных для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворогке крови и плазме, основанных на применении двух разных методов детекции // Жумаи Авад А , Кюрегян К К , Исаева О В., Михайлов М И . Материалы VII Российской международно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика», Москва, 2007 С 23-25

4 Жуман Авад А Сравнительная характеристика двух тестов, предназначенных для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови и плазме, основанных на применении двух разных методов детекции // Жуман Авад А, Кюрегян К К, Исаева О В , Михайлов М И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2008, Том 146, №8 С 213-216

5 Жуман Авад А Изучение вирусов, вызывающих гепатиты, с помощью молекулярно-биологических методов / Исаева О В , Кюрегян К К , Попова О Е , Ганина А А , Дмитриев ПН, Жуман Авад А, Михайлов МИ // Сборник трудов IV съезда российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008 С 356

АДЕЛЬ ЖУМАН АВАД БИНСААД (ЙЕМЕН) ЗНАЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В И РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С СРЕДИ ЛИЦ РАЗЛИЧНОЙ ЭТНИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ И БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ ВИС

В работе изучены характеристики двух тестов, предназначенных для количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС в сыворотке и плазме крови человека - "VERSANT HBV 3 0", основанного на методе разветвленных цепей ДНК (рДНК), и «Биотитр-В», основанного на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени Разработан алгоритм применения тестов для определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС Определены уровни вирусной нагрузки ВГВ и ВГС у пациентов с ХГВ и ХГС,

проживающих в регионах с умеренным (Московская область) и высоким (Республика Тыва) уровнями эндемичности по гепатитам В и С Проанализировано клиническое значение количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС

Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности изучавшихся тестов и согласованности, полученных в них результатов, однако для теста "VERSANT HBV 3 0" показана более высокая степень воспроизводимости по сравнению с тестом «Биотитр-В»

Показано отсутствие значимых различий между средними значениями вирусной нагрузки у пациентов с хроническими гепатитами В и С, проживающими в регионе с высокой степенью эндемичности (Республике Тыва) и регионе с низкой степенью эндемичности (Московская область)

Установлено, что генетический фактор, как эпическая принадлежность, и эпидемиологический фактор, не оказывают влияние на уровни виремии этих вирусов. Показана отсутствие взаимосвязи между биохимическими показателями и уровнями виремии, однако была выявлена тенденция к повышению уровней активности AJIT и ACT у пациентов с высокой вирусной нагрузкой ВГВ и ВГС

ADEL GUMAAN AWADH BINSAAD (YEMEN)

SIGNIFICANCE OF QUANTITATIVE MEASUREMENT OF DNA OF HEPATITIS В VIRUS AND RNA OF HEPATITIS С VIRUS AMONG PERSONS WITH ARIOUS ETHNICITY AND PATIENTS WITH HEPATITIS В AND С

It has been studied the characteristics of two tests for quantitative detection of HBV DNA and RNA HCV m human serum or plasma "VERSANT HBV 3 0" - based on branched DNA technology, and "Biotiter-B" - based on real-time PCR The algorithm of application of these tests is developed to determine viral load of HBV and HCV Levels of viral load of HBV and HCV in different patients with CHB and CHC, living in regions with low ( Moscow area) and high (Republic Tyva) levels of endemicity are determined Clinical significance of quantitative measurement of DNA of HBV and RNA of HCV is analyzed

The out put of the study proved about higher specificity of applied tests and concurrence of the results of quantitation of viral load, although the results reproducibility was higher for "VERSANT HBV 3 0" compared to "Biotiter-B"

It is indicated that ar. absence of significant distinctions between average values of viral load of HBV and HCV among patients with chronic hepatitis В and С with high and low levels of viremia. living in regions with high (Republic Tyva) and low ( Moscow area) levels of endemicity

It is established, that genetic factor, as an ethnicity, and epidemiological factor, do not influence on viremia caused by HBV and HCV It has shown absence of significant interrelation between biochemical parameters and level of viremia, however was revealed tendency of increasing the levels of ALT and AST of patients with high viral load of HBV and HCV

Отпечатано в издательстве «Химия и Бизнес» Формат А5, тираж 100 экз заказ № 209

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Авад, Бин Саад Адель Жуман (Йемен)

Список сокращений. 2 стр.

Введение. 6 стр.

Глава 1. Эпидемиология вирусных гепатитов ВиС. 11 стр. в Российской Федерации

1.1. Эпидемиология вирусного гепатита В в Российской Федерации 11 стр.

1.2. Эпидемиология вирусного гепатита С в Российской Федерации .20 стр.

Глава 2. Определение вирусной нагрузки ВГВ при гепатите В. 32 стр.

2.1. Вирусная нагрузка ВГВ при разных формах ВГВ-инфекции. 32 стр.

2.2. Значение определения концентраций ДНК ВГВ при гепатите В 33 стр.

Глава 3. Определение вирусной нагрузки ВГС при гепатите С. 45 стр.

Глава 4. Количественные методы выявления ДНК ВГВ И РНК ВГС 60 стр.

1.1. Амплификационные методы выявления ДНК ВГВ и РНК ВГС. 61 стр.

1.2. Методы выявления ДНК-ВГВ и РНК-ВГС, основанные на гибридизации без амплификации нуклеиновых кислот.67 стр.

Глава 5. Материалы и методы исследования.73 стр.

1. Описание групп пациентов.73 стр.

1.1. Пациенты с гепатитами В и С из гиперэндемичного региона (Республики Тыва). 73 стр.

1.2. Пациенты с ГВ и ГС из региона со средним уровнем заболеваемости (г. Москва). 74 стр.

2. Методы выявления маркеров ГВ и ГС.77 стр.

2.1. Серологические маркеры ВГВ и ВГС.77 стр.

2.2. Молекулярные маркеры ВГВ и ВГС.77 стр.

3. Проведение сравнительных испытаний двух наборов для количественного определения ДНК ВГВ - "VERSANT HBV 3.0" «Биотитр-В». 79 стр.

4. Методы статического анализа результатов исследований.81 стр.

Глава 6. Результаты и обсуждение.82 стр.

6.1 .Сравнительная характеристика двух тестов, предназначенных для количественного определения ДНК ВГВ в сыворотке крови и плазме, основанных на применении двух разных методов детекции. 82 стр.

6.2. Уровни вирусной нагрузки ВГВ и ВГС у пациентов в регионах с умеренным и высоким уровнями эндемичности. 89 стр.

6.3. Клиническая характеристика пациентов и течение ХГВ и ХГС 94 стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ЗНАЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В И РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С СРЕДИ ЛИЦ РАЗЛИЧНОЙ ЭТНИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ И БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ В И С"

В 2004-2007 гг. проявления эпидемического процесса гепатита В (ГВ) и гепатита С (ГС) в Российской Федерации приобрели принципиально новый качественный характер: продолжающееся снижение заболеваемости острыми формами сочетается с увеличением регистрации клинически выраженного хронического ГВ (ХГВ) и ГС(ХГС) и сохранением высокого уровня и активно выявляемых скрытых форм инфекции. Важнейшим из маркеров является вирусная нагрузка вирусов ГВ и ГС в плазме или сыворотке крови пациентов [9,126]. Определение вирусной нагрузки вирусов гепатита В и С (ВГВ и ВГС), то есть концентрации вирусной ДНК и РНК в плазме или сыворотке крови, крайне важно в клинической практике [22,131], поскольку широкомасштабные когортные исследования показали роль высоких значений вирусной нагрузки ВГВ и ВГС как прогностического маркера неблагоприятного исхода заболевания — цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы [25,29,71,113,132]. Количественное определение ДНК ВГВ и РНК ВГС, наряду с биохимическими показателями, является основным инструментом мониторинга противовирусной терапии и оценки ее эффективности [34,74], а также прогноза успеха лечения [84]. Величина вирусной нагрузки ВГВ и ВГС также является важным фактором, определяющим риск перинатальной передачи этих вирусов [119] и критерием допуска инфицированных медицинских работников к инвазивным процедурам [19]. Учитывая важность определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС в клинической практике, одним из основных требований к диагностикам для количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС является точность и воспроизводимость анализа. В лабораторной практике используется целый ряд тестов для количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС, преимущественно основанных на методе полимеразной реакции (ПЦР) в реальном времени и методе разветвленных цепей ДНК (рДНК). Однако не установлен единый алгоритм определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС с помощью данных тестов. Вирусная нагрузка при ГВ и ГС является важнейшим вирусологическим показателем, позволяющим прогнозировать исход заболевания и ответ на противовирусную терапию. Показано, что заболеваемость циррозом печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК) у лиц, проживающих в гиперэндемичных по ВГВ и ВГС территориях, значительно превышает аналогичные показатели в общей популяции. Так, среди коренного населения Аляски заболеваемость ГЦК в 5 раз превышала заболеваемость среди белого населения США [89]. Более высокие уровни заболеваемости ЦП и ГЦК связаны с высокой распространенностью ВГВ и ВГС в данных популяциях, при этом установлено, что с повышенным риском карциногенеза связаны определенные факторы организма и вируса — генотип вируса, возвращение к HBeAg-позитивному статусу после периода сероконверсии по анти-НВе и старший возраст [82]. Однако недоказанным остается предположение о том, что с повышенным риском развития ЦП и ГЦК при ГВ и ГС могут быть связаны определенные генетические факторы. Учитывая, что связь между высокими значениями вирусной нагрузки ВГВ и ВГС и риском развития ЦП и ГЦК в настоящее время подтверждена, вполне возможным представляется существование различий между уровнями вирусной нагрузки ВГВ и ВГС среди инфицированных этими вирусами лиц, принадлежащих к различным генетическим группам и проживающих в регионах с разными уровнями эндемичности по ВГВ и ВГС.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось определение значимости количественного выявления ДНК ВГВ и РЕК ВГС в регионах с различными уровнями эндемичности по ГВ и ГС.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. сравнить методы и диагностические препараты для количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС;

2. разработать алгоритм применения тестов для определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС;

3. определить уровни вирусной нагрузки ВГВ и ВГС в разных группах населения - у пациентов с ХГВ и ХГС, проживающих в регионах с умеренным (Московская область) и высоким (Республика Тыва) уровнями эндемичности;

4. проанализировать клиническое значение количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС.

Научная новизна работы

1. Впервые показана более высокая воспроизводимость результатов определения вирусной нагрузки, полученных методом анализа разветвленных цепей ДНК (рДНК) по сравнении с методом ПЦР в реальном времени.

2. Впервые в России предложен алгоритм определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС, основанный на последовательном применении иммунологических и молекулярно-биологических тестов.

3. Впервые в России показано отсутствие значимых различий между средними значениями вирусной нагрузки ВГВ и ВГС и долей лиц с высокими и низкими уровнями виремии среди пациентов с хроническими гепатитами В и С, проживающими в регионах с высокой и низкой степенью эндемичности по данным инфекциям.

4. Впервые в России на основании когортного исследования и разбора клинических случаев установлена роль уровней виремии ВГВ и ВГС в прогрессировании заболевания печени и их влиянии на степень гистологической активности при ВГВ- и ВГС-ассоциированном хроническом гепатите.

Практическая значимость полученных новых научных знаний

1. Предложенный алгоритм определения вирусной нагрузки ВГВ и ВГС может применяться как в клинической практике, так и при исследованиях, посвященных значимости определения вирусной нагрузки при вирусных гепатитах В и С.

2. Установленное влияние уровней виремии ВГВ и ВГС на степень гистологической активности при ВГВ- и ВГС-ассоциированном хроническом гепатите и на прогрессирование заболевания печени доказывает необходимость применения тестов для количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС в клинической практике.

3. Доказанное отсутствие влияния на уровни вирусной нагрузки ВГВ и ВГС генетического фактора — этнической принадлежности и эпидемиологического фактора — степени эндемичности территории проживания по ГВ и ГС позволяют унифицировать подходы к мониторингу вирусной нагрузки у пациентов с ГВ и ГС, что имеет большое значение для клинической практики.

Апробация работы и публикации по теме диссертации

Основные положения, выводы и практические рекомендации представлены на V Конференции молодых ученых; России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2006 г.; VII Российской международно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика», Москва, 2007 г.; IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008 г. Апробация работы проведена на заседании отдела вирусных гепатитов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них статей в центральной печати - одна, тезисов — четыре.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 12 источников отечественных и

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Авад, Бин Саад Адель Жуман (Йемен)

ВЫВОДЫ

1. Показана высокая специфичность тест-систем для определения вирусной нагрузки вируса гепатита В - "VERSANT HBV 3.0" (метод разветвленных цепей ДНК) и «Биотитр-В» (метод ПЦР в реальном времени) и согласованность результатов, полученных с помощью данных тестов.

2. Показано отсутствие значимых различий между средними значениями вирусной нагрузки ВГВ и ВГС и долей лиц с высокими и низкими уровнями виремии среди пациентов с хроническими гепатитами В и С, проживающими в регионе с высокой степенью эндемичности (Республике Тыва) и регионе с низкой степенью эндемичности (Московская область).

3. Для теста "VERSANT HBV 3.0" (метод разветвленных цепей ДНК) установлена более высокая степень воспроизводимости результатов по сравнению с тестом «Биотитр-В» (метод ПЦР в реальном времени), максимальное значение коэффициента вариации для двух тест-систем составило 2,79% и 10,69% соответственно.

4. Установлено, что такой генетический фактор, как этническая принадлежность, и такой эпидемиологический фактор, как проживание на территории с высокой или низкой степенью эндемичности по гепатиту В и С, не оказывают влияние на уровни виремии этих вирусов.

5. Анализ клинического значения количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС, проведенный среди пациентов с ХГВ и ХГС, показал отсутствие статистически значимой взаимосвязи между биохимическими показателями и уровнями виремии ВГВ и ВГС, однако была выявлена тенденция к повышению уровней активности АЛТ и ACT у пациентов с высокой вирусной нагрузкой ВГВ и ВГС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оптимизации количественного определения ДНК ВГВ и РНК ВГС в образцах сыворотки и плазме крови рекомендуется соблюдать последовательность действий, включающую тестирование серологических маркеров ГВ (HBsAg) и ГС (анти-ВГС), детекцию ДНК ВГВ и РНК ВГС в качественном ПЦР-тесте с чувствительностью не менее 100 копий/мл с последующей оценкой уровня виремии.

2. Выявленная взаимосвязь между уровнем вирусной нагрузки и степенью активности некровоспалительного процесса печени свидетельствует о необходимости осуществления клинико-вирусологического обследования больных с вирусными гепатитами В и С в динамике с целью своевременного выявления прогрессирования заболевания.

3. Отсутствие влияния генетических и эпидемиологических факторов на уровни виремии ВГВ и ВГС подтверждает целесообразность проведения универсального вирусологического мониторинга вне зависимости от этнической принадлежности пациентов и распространенности вирусных гепатитов на территориях их проживания.

117

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Авад, Бин Саад Адель Жуман (Йемен), Москва

1. Блюгер А. Ф., Залцман В.К., Картманова О.Я. Ультраструктурная патология печени. Рига: «Зинатне», 1989.

2. Гурская Т.Ю., Никитин И.Г., Размахнина Н.И., Попединский Н.М. К вопросу о вертикальной передаче HCV-инфекции // Мир вирусн. гепат. 2005. - № Ю. - С. 2 - 5.

3. Жебрун А.Б., Шляхтенко Л.И., Мукомолов С.Л. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор, 6 выпуск СПб., - 2006. -С. 11-27.

4. Казанцев А.П., Зубик Т.М. Дифференциальная диагностика инфекционных болезней М.ЮОО «МИА», 1999.- С. 482.

5. Кюрегян К.К., Геворкян М.Г. Метод разветвленных цепей ДНК (bDNA) для обнаружения ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С // Мир вирусных гепатитов. 2005. - № 9. - С. 2 - 4.

6. Лакина Е.И., Масалова О.В., Абдулмеджидова А.А., Кущ А.А. Вирусная нагрузка и тяжесть заболевания гепатитом С: есть ли связь? // Бюллетень НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН М., 2001. -С. 24-36.

7. Михайлов М.И. Вирусы гепатитов // Сб. тр. ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН: Мед. вирусол. М., 2007. - Т. XXIV. - С. 205-223.

8. Морозов И.А., Княженцева А.К., Ильченко Л.Ю., Гордейчук И.В.

9. Электронная микроскопия в диагностике латентных (скрытых) форм HBV-инфекции // Мат. 14 РГН в РЖГГК / Прилож. к журн. РЖГГК. № 32. - С. 96.

10. Хлопова И. Н., Самохвалов Е. И. Частота обнаружения РНК вируса гепатита G у больных вирусными гепатитами // Гепатит В, С, D и G: проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики: Тезисы докл. II Российск. конф. М., 1997. - С. 234.

11. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика).- М.: ФГОУ «ВУНМЦ Роздрава», 2003. С. 22-27.

12. Adinolfi L.E, Andreana A., Utili R. HCV RNA levels in serum, liver, and peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis С patients and their relationship to liver injury // Am. J. Gastroenterol. 1998. - Vol. 93. - P. 2162-2166.

13. Adinolfi L.E., Utili R., Andredna A. Serum HCV RNA Levels Correlate with histological liver damage and concur with steatosis in progression of chronic hepatitis С // Dig. Dis. Sci. 2001. - Vol. 46. - P. 1677-1683.

14. Arase Y., Chayama K., Murashima N. Fluctuation patters of HCV-RNA serum level in patients with chronic hepatitis С // J. Gastroenter. 2000. -Vol. 35.-P. 221-225.

15. Ballardini G., Manzin A., Giostra F. Quantitative liver parametrs of HCV infection relation to HCV genotypes, viremia and response to interferon treatment // J. Hepat. - 1997. - Vol. 26. - P. 779-786.

16. Banerjee K., Sarin S.K, Naik S.R. et al. Polymerase chain reaction based diagnostic assay for identification of hepatitis В virus // Indian. J. Med. Res. 1992.-Vol. 95.-P. 173 - 178.

17. Birkenmeyer L.G. Detection of hepatitis А, В and D virus by the polymerase chain reaction // J. Virol. Methods. 1994. - Vol. 49. - P. 101 -112.

18. Caspari G., Gerlich W. Mandatory hepatitis В virus testing for doctors // Lancet 1998. - Vol. 352. - P. 991.

19. Castera L., Vergniol J., Foucher J. Prospective comparison of transient elastography, Fibrotest, APRI, and liver biopsy for the assessment of firsis in chronic hepatitis С // Gastroenter. 2005. - Vol. 128. - P. 343-350.

20. Carbonell N., Thiers V., Pol S. et al. Non А, В, C, D chronic hepatitis (CH): natural history, HGV prevalence // J. Hepatol. 1997. - Vol. 26. - P. 196.

21. Chang Т., Gish R., De Man R. et al. A comparison of entecavir and lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis В // N. Engl. J. Med. -2006. Vol. 354. - P. 1001-1010.

22. Chen G., Lin W., Shen F. et al. Past HBV viral load as predictor of mortality and morbidity from HCC and chronic liver disease in a prospective study //Am. J. Gastroenterol. 2006. - Vol. 101. - P. 1797-1803.

23. Chen С J., Yang H.I, Su J. Risk of Hepatocellular Carcinoma Across a Biological Gradient of Serum Hepatitis В virus DNA Level // JAMA. -2006.-Vol. 295.-P. 65-73.

24. Chien R.N., Liaw Y.F. Chien R.N., Liaw YF. Short-term lamivudine therapy in HBeAg-negative chronic active hepatitis В in Taiwan // Antivir. Ther. 2006. Vol. 11. - P. - 947-952.

25. Chevalie S., Pawlotsky J. Hepatitis С virus Serological and virological tests and clinical diagnosis of HCV-Related Liver Disease // Int. J. Med. Sci.2006.-Vol.3.-P. 35-40.

26. Chu C.J, Hussain M., Lok A.S. Quantitative serum HBV DNA levels during different stages of chronic hepatitis В infection // Hepat. 2002. -Vol. 36. - P. 1408-1415.

27. Cho S.W., Hwang S.G., Han D.S. In situ detection of hepatitis С virus RNA in liver tissue using a digoxigenin-labeled probe created during a polimerase chain reaction // J. Med. Virol. -1996. Vol. 48, N 3. - P. 327-333.

28. Coelho-Little M.E., Jeffers L.J., Bernstein D.E. et al. Hepatitis С virus in alcoholic patients with and without clinically apparent liver disease // Alcohol. Clin. Exp. Res. 1995. - Vol. 19. - P. 1173-1176.

29. Colombatto P., Randone A., Civico G. et al. Hepatitis G virus RNA in the serum of patients with elevated gamma glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase: a specific liver disease // J. Viral. Hepatitis. 1996. - Vol. 3. - P. 301-306.

30. Colonno R.J., Rose R.E., Baldick C.J. et al. Entecavir resistance is rare invnuclroside naive patients with hepatitis В IIJ. Hepatol. 2007. - Vol. 44. - P. 1656-1665

31. Cooksley W.G. Treatment of hepatitis В with interferon and combination therapy // Clin. Liv. Dis. 2004. - Vol. 8. - P. 353-370.

32. Corey L., Gretch D., Wilson J. Acessment of hepatitis С virus RNA levels by quantitative competitive RNA polymerase chain reaction: high-titer viremia correlates with advanced stage of disease // J. Infect. Dis. -1994. -Vol. I 69.-P. 1219-1225.

33. Dalgard O., Bj0ro K., Helium K.B. Treatment with pegylated interferon and ribavirin in HCV infection with genotype 2 or 3 for 14 weeks: a pilot study // Hepat. 2004. - Vol. 40. - P. 1260-1265.

34. Davis G.L., Lau J.Y. Factors predictive of a beneficial response to therapy of hepatitis С // Hepat. 1997. - Vol. 26. - P. 122-127.

35. Davis G.L., Wong J.B., McHutchison J.G. Early virologic response treatment with peginterferon alfa-2b plus ribavirin in patients with chronichepatitis С // Hepat. 2003. - Vol. 38. - P. 645-652.

36. De Moliner L., Pontisso P., De Salvo G.L. Serum and liver HCV RNA levels in patients with chronic hepatitis C: correlation with clinical and histological features // Gut 1998. - Vol. 42. - P. 856-860.

37. Desmet V.J., Gerber M., Hoofnagle J.H. Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging. // Hepat. -1994. Vol. I 9. - P. 1513-1520.

38. Deutsche Vereinigung zur Bekampfung der Viruskrankheiten. Empfehlungen zur Verhutung der Ubertragung von Hepatitis-B-Virus durch infiziertes Personal im Gesundheitsdienst // Epid. Bull. 1999. -Vol. 30. - P. 222-223.

39. Di Bisceglie A.M., Chung Y.W., Dailey P.J. et al. Hepatitis С Viral (HCV) markers in serum and Liver of chronically infected patients // Hepatol. -1994.-Vol. 20.-P. 236A.

40. Di Martino V., Saurini F., Samuel D. Long-term longitudinal study of intrahepatic hepatitis С virus replication after liver transplantation // Hepatol. 1997. - Vol. 26. - P. 1343-1350.

41. Dries V., von Both I., Muller M. Detection of hepatitis С virus in paraffin-embedded liver biopsies of patients negative for viral RNA in serum //! Hepat. 1999. - Vol. 28. - P. 223-229.

42. EASL Jury. EASL International Consensus Conference on Hepatitis B. 1314 September, 2002: Geneva, Switzerland. Consensus statement (short version) // J. Hepatol. 2003. - Vol. 39. - P. 3-25.

43. Erker J. C., Leary T. P., Desialet S. M. et al. Analyses of TT virus full-length genomic sequences // J. Gen. Virol. 1999. - Vol. 80. - P. 1743 - 1750.

44. Esteban J.I., Cordoba J., Sauleda S. The clinical picture of acute and chronic hepatitis C// Hepatitis С Virus / Ed.W. Reesink, Basel, Switzerland: Karger, 1998.-P.102-118.

45. Fabrizi F., Mangano S., Alongi G. Influence of hepatitis В virus virema upon serum aminotransferase activity in dialysis population // Int. J. Artif.

46. Organs. 2003. - Vol. 26. - P. 1048-1055.

47. Fattovich G. Natural history and prognosis of hepatitis В // Semin. Liv. Dis. -2003.-Vol. 23.-P. 47-58.

48. Feray C., Samuel D., Thiers V. Reinfection of liver graft by hepatitis С virus after liver transplantation // J. Clin. Invest. 1992. - Vol. 89. - P. 13611366.

49. Fried M.W., Shiftman M.L., Reddy K.R. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis С virus infection // N. Engl. J. Med. 2002. -Vol. 347. - P. 975-982.

50. Ghany M., Liang T.J. Drug targets and molecular mechanisms of drug resistance in chronic hepatitis В // Gastroenterol. 2007. - Vol. 132. - P. -1574-1585.

51. Gil В., Quian C., Riezu-Boj J.I. Hepatic and extra-hepatic HCV RNA strands in chronic hepatitis C: different patterns of response to interferon treatment // Hepat. 1993. - Vol. 18. - P. 1050-1054.

52. Gosalvez J., Rodriguez-Inigo E., Ramiro-Dias J. Relative quantification and mapping of hepatitis С virus by in situ hybridization and digital image analysis // Hepatol. 1998. - Vol. 27. - P. 1428-1434.

53. Gretch D., Corey L., Wilson J. et al. Acessment of hepatitis С virus RNA levels by quantitative competitive RNA polymerase chain reaction: high-titer viremia correlates with advanced stage of disease // J. Infect. Dis. -1994.-Vol. 169.-P. 1219-1225.

54. Halfon P., Bourliere M., Raab J. et al. Molecular analysis of sexual or intrafamilian transmission of hepatitis-G virus in HCV-infected couplies // J. Hepatol. 1997. - Vol. 26. - P. 1694-1696.

55. Hassoba H. M., Terrault N. A., el-Gohary А. М. Antibody to GBV-C second envelope glycoprotein (anti — GBV-C E2): is it a marker for immunity? // J. Med. Virol. 1997. - Vol. 53. - P. 354-360.

56. Hepatitis В infected health care workers. Health Service Circular, 2000. -http://www.doh.gov.uk/.

57. Heringlake S., Ockenda J., Tillmann H. L. et al. GB virus C/hepatitis G virus infection: a favorable prognostic factor in human immunodeficiency virus-infected patients? // J. Infect. Dis. 2003. - Vol. 187. - P. 504-507.

58. Heyward W.L., Lanier A.P., Bender T.R. et al. Primary hepatocellular carcinoma in Alaskan natives, 1969-1979 // Int. J. Cancer. 1981. - Vol. 28. - P. 47-50.

59. Hillemanns P., Dannecker C., Kimmiq R. Obstetric risks and vertical transmission of hepatitis С virus infection in pregnancy // Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2000. - Vol. 79. - P. 543-547.

60. Hoofngale J. H., Di Biscegli A. M. Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis // Semin. Liver. Dis. 1991. - Vol. 11. - P. 73-83.

61. Hu K.Q. A Practical Approach to Management of Chronic Hepatitis // Int. J. Med. Sci. 2005. - Vol. 2. - P. 17-23.

62. IGZ bulletin Preventie Iatrogene Hepatitis B, 2002. -www.igz.nl/32601/2002bulletinpreventie

63. Iloeje U., Yang H., Jen C. Risk and Predictors of Mortality Associated With Chronic Hepatitis В Infection // Clin. Gastroenter. Hepatol. 2005. - Vol. 5. -P. 921-931.

64. Iloeje U.H., Yang H., Su J. Baseline HBV viral load and excess mortality associated with chronic hepatitis В infection: The REVEAL-HBV study // 57th AASLD October 27- 31, 2006, Boston. - A 949.

65. Jamal M.M., Soni A., Quinn P.G. Clinical features of hepatitis C-infected patients with persistently normal alanine transaminase levels „ in the Southwesten United States //Hepat. -1999. Vol. 30. - P. 1307-1311.

66. Kaneko S., Kobayashi K., Miller R.H. Detection of hepatitis В virus DNA using the polymerase chain reaction technique // J. Clin. Lab. Anal. 1990. -Vol. 4. - P. 479-482.

67. Keeffe E.B., Dieterich D.T., Han S-H.B. et al. A treatment algorithm for the management of chronic hepatitis В virus infection in the United States: an update // Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2006. - Vol. 4. - P. 1-27.

68. Keeffe E.B., Zeuzem S., Koff R.S. et al. Report of an international workshop: roadmap for management of patients receiving oral therapy for chronic hepatitis В // Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2007. - Vol. 5. - . 890897.

69. Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis // Hepatol. 1981. - Vol. 1. - P. 431

70. Langley D.R., Walsh A.W., Baldick C.J. Inhibition of hepatitis В virus polymerase by entecavir // J. Virol. 2007. - Vol. 81. - P. 3992-4001.

71. Lai C.L., Shouval D., Lok A.S. et al. Entecavir versus lamivudine for patients with HBeAg-negative chronic hepatitis В // N. Engl. J. Med. 2006. -Vol. 354.-P. 1011-1026.

72. Lau G.K.K., Fang J.V.C., Wu P.S. Detection of hepatitis С virus genome in formalin-fixed parafin-embedded liver tissue by in situ reverse transcription polymerase chain reaction // J. Med. Virol. 1994. - Vol. 44, N 5. - P. 406409.

73. Lau J.Y., Davis G.L., Kniffen J. et al. Significance of serum hepatitis С virus RNA levels in chronic hepatitis С // Lancet. 1993. - Vol. 41. - P. 501-504.

74. Le Guen В., Squadrito G., Nalpas B. Hepatitis С virus Genome Complexity correlates with response to interferon therapy: a study in French patients with chronic hepatitis С // Hepat. 1997. - Vol. 25. - P. 1250-1253.

75. Livingston S.E., Simonetti J.P., McMahon B.J. et al. Hepatitis b virus genotypes in Alaska native people with hepatocellular carcinoma: preponderance of genotype F // J. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 195. - P. 5-11.

76. Lok A.S., Chien D., Choo Q.L. Antibody response to core, envelope and nonstructural hepatitis С virus antigens: comparison of immunocompetent and immunosuppressed patients // Hepat. 2003. - Vol. 18. - P. 497-502.

77. Lok A.S-F. Navigating the maze of hepatitis В treatments // Gastroenterol. -2007. Vol. 132. - P. 1586-1594.

78. Manns M.P., McHutchison J.G., Gordon S.C. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial // Lancet 2001. - Vol. 358. - P. 958-965.

79. Martin J., Navas S., Quiroga J. A. Quantification of hepatitis С virus in liverand peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis С virus infection // J. Med. Virol. 1998. - Vol. 54. - P. 265-270.

80. Martin I., Poljak M., Seme K. et al. Comparative evaluation of semiautomated COBAS AMPLICOR HBV Monitor Test and manual microwell plate-based AMPLICOR HBV MONITOR Test // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 2. - P. 758-761.

81. Marzano A., Gaia S., Ghisetti V. Viral load at the time of liver transplantation and risk of hepatitis В virus recurrence // Liver Transpl. -2005.-Vol. 11.-P. 402-409.

82. McHalon BJ, Hoik P, Bulkow L et al. Serologic and clinical outcomes of 1536 Alaska natives chronically infected with hepatitis В virus // Ann. Intern. Med. 2001. - Vol. 35. - P. 759-768.

83. McGuinnes PH., Bishop G.A., Painter D.M. Intrahepatic hepatitis С RNA levels do not correlate with degree of liver injury in patients with chronic hepatitis С // Hepat. 1996. - Vol. 23. - P. 676-687.

84. McMahon В J. The natural history of chronic hepatitis В virus infection // Semin. Liv. Dis. 2004. - Vol. 24. - P. 17-21.

85. Mellor J., Haydon G., Blair C. Low level or absent in vivo replication of hepatitis С virus and hepatitis G virus / GB virus С in peripheral blood mononuclear cells // J. Gen. Virol. 1998. - Vol. 79. - P. 705-714.

86. Mizokami M., Nakano Т., Orito E. Hepatitis В virus genotype assignment using restrction fragment lengh polymorphism patterns // FEBS Lett. 1999. -Vol. 450.-P. 66-71.

87. Moaven L.D., Tennakoon P.S., Badwen D.S. et al. Mother-to-baby transmission of hepatitis G virus // Med. J. Aust. 1996. - Vol. 165. - P. 8485.

88. Morozov I. A., Knjazhentseva A.K. Hepatocyte ultrastructure and virus-dependent lesions under chronic HBV hepatitis // Falk symp. 167, 20-21 Sept. 2008, Mainz.-A. 81.

89. Mushahwar I. K.5 Erker J. C.5 Muerhoff A. S. et al. Molecular and biophysical characterization of TT virus: Evidence for a new virus family infecting humans // P.N.A.S. USA - 1999. - Vol. 96. - P. 3177-3182.

90. Negro F., Giostra E., Krawczynski K. Detection of intrahepatic hepatitis С virus replication by strand-specific semi-quantitative RT-PCR: preliminary application to the liver transplantation model // J. Hepatol. 1998. - Vol. 29. -P. 1-11.

91. NIH Consensus Statemet on Management of Hepatitis C: 2002 // NIH Consens State Sci Statements. 2002. - Vol. 19. - P. 1-46.

92. Ohno Т., Mizokami M. Genotyping with type-specific primers that can type HCV types 1-6. Methods in molecular medicine // Hepatitis С protocols. 1998. - Vol. 19. - P. 159-164.

93. Okumura A., Yoshioka K., Aiyama T. Different constitution of hepatitis С virus population in peripheral blood mononuclear cells and plasma in patients with type С chronic liverdisease // Dig. Dis. Sci. 1998. - Vol. 43. -P. 377-383.

94. Onto E., Mizokami M., Nakano T. et al. Serum hepatitis С virus RNA level as a predictor of subsequent response to interferon alpha therapy in Japanese patients with chronic hepatitis С // J. Med. Virol. 1994. - Vol. 44.-P. 410-414.

95. Pawlotsky J-M. Use and interpretation of virological tests for hepatitis С // Hepat. 2002. - Vol. 36. - P. 65-73.

96. Pawlotsky J-M., Ben Yahia M., Andre C. et al. Immunological disorders in С virus chronic active hepatitis: a prospective case-control study // Hepatol. 1994. - Vol. 19. - P. 841 - 848.

97. Persico M., Persico E., Gesue L. et al. Etiology and clinical relevance of hepatitis G virus in viral hepatitis // J. Hepatol. 1997. - Vol. 26 (Suppl.l). -P. 201.

98. Poynard Т., Imbert-Bismut F., Munteanu M. FibroTest-FibroSURE: towards a universal biomarker of liver fibrosis? // Expert. Rev. Mol. Diagn. 2005. - Vol. 5. - P. 15-21.

99. Poynard Т., McHutchison J., Manns M. Impact of pegylated interferon alfa-2b and ribavirin on liver fibrosis in patients with chronic hepatitis С // Gastroenter. 2002. - Vol. 122. - P. 1303-1313.

100. Rapti B.I., Dimou E., Mitsoula P., Hadziyannis S.J. Adding-on versus switching-to adefovir therapy in lamivudine-resistant HBeAg-negative chronic В // Hepatol. 2007. - Vol. 45. -P. 266-268.

101. Reddy K.R., Wright T.L., Pockros P. Efficacy and safety of pegylated (40-kd) interferon alpha-2a compared with interferon alpha-2a in noncirrhotic patients with chronic hepatitis С // Hepat. 2001. - Vol. 33. - P. 433-438.

102. Rey D., Fraize S., Vidnic J. et al. High prevalence of GB virus C/hepatitis G virus RNA in patients infected with human immunodeficiency virus // J. Med. Virol. 1999. - Vol. 57. - P. 75-79.

103. Robinson D.M., Scott L.J., Plosker G.L. Entecavir. A review of its use in chronic hepatitis В // Drugs 2006. - Vol. 66. - P. 1605-1622.

104. Rodriguez-Inigo E., Bartolome J., de Lucas S. Histological damage in chronic hepatitis С is not related to the extent of infection in the liver // Am. J. Pathol. 1999. - Vol. 54. - P. 1877-1881.

105. Sato S., Yamada M., Miyazaki Y. et al. Relationship between molecular state of serum HBV DNA and clinical features of hepatitis В virus carriers // Tohoku J. Exp. Med. 1993. - Vol. 171. - P. 309-317.

106. Seidi S., Koenig В., Reinhardt G. Higher detection rate of hepatitis G and С virus RNA in liver tissue than in serum of deceased injection drug users // Int. J. Legal. Med. 1999. - Vol. 112. - P. 35-38.

107. Shaw Т., Bartholomeusz A., Locarnini S. HBV drug resistance: Mechanisms, detection and interpretation // Hepatol. 2006. - Vol. 44. - P. 593-606.

108. Shibuya A., Tareuchi A., Kamata K. et al. Prevalence of hepatitis G virus RNA and anti — E2 in a Japanese haemodialysis population // Nephrol. Dial. Transplant. 1998. - Vol. 13. - P. 2033-2036.

109. Soderstrom A., Norkrans G., Lindh M. Hepatitis В virus DNA during pregnancy and post partum: aspects on vertical transmission // Scand. J. Infect. Dis.-2003.-Vol. 11-12. P. 814-819.

110. Sugano M., Hayashi J., Joon S. Quantification of hepatitis С viral RNA in liver and serum samples using competitive polymerase chain reaction // J. Clin. Pathol. 1995. - Vol. 48. - P. 820-825.

111. Tanaka E., Alter H. J., Nakatsuji Y. et al. Effect of hepatitis G virus infection on chronic hepatitis С // Ann. Int. Med. 1996. - Vol. 125. - P. 740-743.

112. Terrault N.A., Dailey P.J., Ferrell L. et al. Hepatitis С virus: quantitation and distribution in liver // J. Med. Virol. 1997. - Vol. 51. - P. 217-224.

113. Terrdult N.A., Pawlotsky J-M., McHutchison J. Clinical utility of Viral Load Measurements in individuals with Chronic Hepatitis С infection on antiviral therapy // J. Vir. Hepat. 2005. - Vol. 12. - P. 465-472.

114. Tillmann H.L. Antiviral therapy and resistance with hepatitis В virus infection. World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13. - P. 125-140.

115. Tillmann H. L., Heiken H., Knapik-Botor A. et al. Infection with GB virus С and reduced mortality among patients with HIV infection // N. Engl. J. Med. 2001. - Vol. 345. - P. 715-724.

116. Tram T.T, Martin P. Hepatitis B: epidemiology and natural history // Clin. Liver Dis. 2004. - Vol. 8. - P. 255-266.

117. Wejstal R., Manson A. Perinatal transmission of Hepatitis G Virus and Hepatitis С Virus infections // Clin. Infect. Dis. 1999. - Vol. 28. - P. 816837.

118. Wilber J.C., Urdea M.S. Quantification of HCV RNA in clinical specimens by branched DNA(bDNA) technology // Methods in Molecular Medicine Hepatitis C. 1998. - Vol. 19. - P. 71-78.

119. Xiang J., Wunschmann S., Dickema D. J. et al. Effect of coinfection with GB virus С on survival among patients with HIV infection // N. Engl. J. Med. 2001. - Vol. 345. - P. 707-714.

120. Yeo W., Mo F.K., Chan S.L. et al. Hepatitis В viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy // Hepatol. 2007. -Vol. 45.-P. 1382-1389.

121. Young K.C., Chang T.T, Liou T.C. Detection of hepatitis С vims RNA in peripheral blood mononuclear cells and in saliva. // J. Med. Virol. 1993.1. Vol. 41.-Р. 55-60.

122. Zeuzem S. Overview of commercial HBV Assay Systems. Methods in molecular Medicine // Hepatitis В and D Protocols 2004. - Vol. 95. - P. 313.

123. Zeuzem S., Buti M., Ferenci P. Efficacy of 24 weeks treatment with peginterferon alfa-2b plus ribavirin in patients with chronic hepatitis С infected with genotype 1 and low pretreatment viremia // J. Hepatol. 2006. -Vol. 44.-P. 97-103.

124. Zignego A.L., De Carli M., Monti M. Hepatitis С vims infection of mononuclear cells from peripheral blood and liver infiltrates in chronically infected patients // J. Med. Virol. 1995. - Vol. 47. - P.58-64.