Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые вирусы гепатита В птиц

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прасолов, Алексей Владимирович

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

I. Изучение гепатита В и обнаружение инфекционного агента.

История изучения гепатита В человека.

Эпидемиология гепатита В человека.

Патогенез заболевания.

Методы лечения и профилактики гепатита В.

Гепаднавирусы и их хозяева. Экспериментальные модели изучения гепатита В.

П.Характеристика вируса гепатита В уток.

Общие признаки всех представителей Hepadnaviridae.

Типы вирусных частиц.

Структура вирусного генома и кодируемые им белки.

Жизненный цикл вируса DHBV.

1) взаимодействие "вирус - клетка": а) белки вирусной оболочки PreS/S. б) карбоксипептидаза gpl 80.

2) транспорт вирусной ДНК в ядро.

3) образование сссДНК.

4) вирусные РНК-транскрипты.

5) регуляторные элементы вирусного генома.

6) инкапсидация вирусной РНК.

7) синтез вирусной ДНК.

8) созревание вирусных частиц и их секреция.

9) инфекция клеток de novo.

III. Значение убиквитин-протеасомного пути деградации белков для репликации гепаднавирусов.

Актуальность разработки стратегии воздействия на универсальные клеточные процессы.

Убиквитин-протеасомный путь деградации клеточных белков и строение 26S протеасомы.

Ингибиторы протеасом и их применение.47.

Экспериментальная часть.

I.Материал ы.

Коллекция сывороток крови птиц.

Реактивы.

Стандартные растворы.

Антитела.*.

Пластиковая и стеклянная посуда, другие материалы.

Коммерческие киты.

Бактериальные штаммы, линии перевиваемых клеток и первичные культуры клеток.

Культуральные и бактериальные среды.55.

Ферменты.

Маркеры.

Плазм иды.

Олигонуклеотидные прайм еры амплификации и секвенирования ДНК.

Приборы.

Компьютерные программы.

II. Методы.

Иммуноферментный анализ.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Подготовка проб для проведения ПЦР.

Клонирование амплифицированной полноразмерной ДНК вирусов.

Лигирование.

Трансформация компетентных бактериальных клеток Е.соН ОН5-а.

Определение нуклеотидной последовательности продуктов ПЦР-амплификации и ДНК клонов.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК геномов и последовательностей аминокислотных остатков белков известных и обнаруженных вирусов гепатита В птиц.

Подготовка полноразмерной геномной ДНК вирусных клонов для трансфекции ЬМН клеток.

Трансфекция ЬМН клеток.

Инфекция первичной культуры гепатоцитов уток.

Анализ вирусной ДНК по методу Саузерна. а) приготовление проб для гибридизации. б) экстракция ДНК из вирусных частиц. в) краткое описание блот-гибридизационного анализа.

Анализ внутриклеточной экспрессии вирусных белков методом непрямой иммунофлюоресценции.

Ш.Результаты и обсуждение.

1. Анализ коллекции из 145 сывороток крови 41 вида птиц.

2. Обнаружение и характеристика вируса гепатита В журавлей СНВУ.

Обнаружение вирусных белков в сыворотках крови журавлей методом иммуноблоттинга.

Детекция вирусной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Обнаружение вирусных частиц в образцах сыворотки крови журавлей с использованием электронной микроскопии.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК генома обнаруженного вируса.

Клонирование ДНК генома вируса журавлей СНВУ.

Сравнительный анализ последовательности геномной ДНК вирусов гепатита

В птиц.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков вирусов гепатита В птиц.

Трансфекция ЬМН клеток ДНК вирусных клонов СНВУ.

Анализ экспрессии вирусных белков в трансфецированных ЬМН клетках.

Секреция вирусного е-антигена в культуральную среду ЬМН клеток.

Детекция синтеза вирусной ДНК.

Анализ пермиссивности ПГУ для вируса гепатита В журавлей.

3. Обнаружение и характеристика вируса гепатита В красного-ловых гусей КННВУ.

Обнаружение вируса в сыворотке крови красноголового гуся методом иммуноблоттинга и ПЦР-амплификации.

Прямое определение нуклеотидной последовательности геномной ДНК нового вируса и её клонирование.

Анализ геномной ДНК и предсказанной последовательности аминокислотных остатков белков вируса 1ШНВ V.

Трансфекция ЬМН клеток.

Иммуноферментный анализ экспрессии вирусных белков в ЬМН клетках.

Анализ экспрессии вирусных белков в ЬМН клетках методом непрямой иммунофлюоресценции.,.

Детекция вирусной ДНК по методу Саузерна.

Анализ пермиссивности ПГУ для вируса гепатита В красноголовых гусей.

4. Обнаружение и характеристика вируса гепатита В аистов 131 STHBV.

Обнаружение вируса в сыворотках крови белых и чёрных аистов методом иммуноблоттинга и ПЦР-анализа.

Установление последовательности нуклеотидов гена PreS белка вируса.

Оценка инфекционности вируса STHB V для гепатоцитов утки.

5. Разработка подходов к созданию антивирусной стратегии с использованием ингибиторов протеасом.

ИП подавляют секрецию вирусных частиц.

ИП блокируют вторичную инфекцию культуры ПГУ.

ИП влияют на фосфорилирование вирусного Core белка.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые вирусы гепатита В птиц"

Гепатит В, вызываемый представителем семейства вирусов Нерас1паутс1ае - гепаднавирусов, относится к числу наиболее распространённых инфекционных заболеваний человека, являясь, по данным Всемирной организации здравоохранения, третьим по уровню заболеваемости в мире. От рака печени, возникаюшего вследствие развития хронической формы гепатита В, умирает ежегодно более 1 млн. человек.

Несмотря на усилия, направленные на изучение гепатита В и природы его возбудителя, ряд принципиально важных вопросов остаётся неразрешённым.

До последнего времени это было связано, в первую очередь, с отсутствием адекватной, легкодоступной и недорогостоящей экспериментальной модели исследования, а также с узкой видоспецифичностью вируса, не позволяющей изучать гепатит В человека на традиционных лабораторных животных.

Положение изменилось с обнаружением вирусов гепатита В птиц и грызунов. Несмотря на некоторые отличия, все гепаднавирусы характеризуются рядом общих признаков: сходством морфологии и организации генома вируса, общей схемой репликации, тропизмом к клеткам печени, а также крайне узким спектром хозяев. Эта общность свойств позволяет использовать выводы, сделанные в результате исследований вирусов гепатита В животных, в изучении вируса гепатита В человека.

Для разработки действенной стратегии лечения и профилактики гепатита В человека требуется детальное и глубокое понимание природывируса: от знания первичной структуры его ДНК до клеточных факторов, задействованных в репликации вируса.

Необходимую для этого информацию может предоставить сравнительный структурно-функциональный анализ целого ряда вирусов гепатита В разных видов животных. Вирусы гепатита В птиц являются наиболее удобной и распространенной в настоящее время экспериментальной моделью изучения особенностей семейства вирусов Hepadnaviridae в целом.

В этой связи актуальным является поиск новых гепаднавирусов птиц, их сравнительная молекулярно-биологическая характеристика и выявление на этой основе филогенетических взаимоотношений между представителями Avihepadnavirnses.

Вирусы гепатита В птиц могут быть использованы также в качестве модели при разработке антигепаднавирусной стратегии. Перспективным направлением в этой области является изучение воздействия ингибиторов протеасом на клеточный убиквитин-протеасомный путь деградации белков, необходимый для функционирования универсальных клеточных механизмов и, опосредованно, - для репликации гепаднавирусов. В связи с этим практический интерес представляет изучение действия наиболее эффективных ингибиторов протеасом (PS 341, эпономицина и эпоксомицина) на развитие гепаднавирусной инфекции in vitro.

Настоящая работа посвящена поиску, обнаружению, сравнительной молекулярно-биологической и структурно-функциональной характеристике вирусов гепатита В разных видов птиц, а также установлению филогенетических взаимоотношений Avihepadnaviruses.

Работа нацелена также на развитие антигепаднавирусной стратегии в ходе изучения противовирусного действия ингибиторов протеасом напервичную культуру гепатоцитов уток, инфицированных вирусом гепатита В уток.

Обзор литературы I. Изучение гепатита В и обнаружение возбудителя заболевания.

Вирусный гепатит - собирательное название для целого ряда инфекционных заболеваний печени человека, вызываемых, по крайней мере, пятью различными возбудителями.

Наиболее характерным внешним проявлением гепатита, также известного, как "желтуха", является изменение цвета склеры и кожных покровов, связанное с повышением в крови уровня билирубина.

История изучения гепатита В человека.

Первые дошедшие до нас упоминания о заболевании найдены в письменных источниках древних вавилонцев и других народов античности. Интересно, что и в вавилонском Талмуде, и в рукописях Гиппократа (Codex Hippocraticus) уже были описаны как внешние симптомы, так и менее явные внутриорганизменные проявления болезни.

К числу наиболее значительных европейских свидетельств возникновения вспышек заболевания в более позднее время относятся записи немецкого естествоиспытателя Лурмана (Lurman, 1885), сделанные в XIX-OM веке. В 1885 году он описал случай массового заболевания бременских портовых рабочих. Причиной вспышки была сделанная им за 68 месяцев до этого прививка против оспы с использованием вакцины, приготовленной на основе компонентов человеческой крови. В последовавших за этим сообщениях об аналогичных случаях в другихстранах Европы основной причиной возникновения эпидемии называли использование нестерильных инструментов в клиниках.

Тем не менее, возможность распространения гепатита через кровь и ее компоненты была официально признана не ранее 30-ых годов ХХ-го столетия. Эпидемии, разразившиеся в подразделениях Британской армии в 1937 году и в войсках армии США в 1942 году, повлекли за собой детальный анализ причин возникновения подобных вспышек заболевания. Результатом этих исследований стало признание прямой связи возникновения заболевания с переливанием крови, а также с использованием её производных (Zuckermann A.J., 1975).

Основываясь на симптоматике и эпидемиологии заболевания, был сделан вывод о существовании, по крайней мере, двух, на первый взгляд схожих, заболеваний. Термины "Гепатит А" и "Гепатит В" были введены в 1947 году для обозначения инфекционного эпидемического и "сывороточного" (передающегося через кровь и её производные) гепатита (MacCallum F.O., 1947) и были официально приняты Комитетом по вирусному гепатиту Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ).

В 1963 году Барух Блумберг проводил анализ сывороток человеческой крови, изучая наследуемый полиморфизм компонентов крови людей из различных регионов мира. В сыворотке крови австралийского аборигена он обнаружил антиген (Аи), иммуноспецифически взаимодействующий с компонентами (антителами) сыворотки крови американского пациента (Blumberg et al., 1982). Тем не менее, выявление в сыворотке Аи - антигена (обозначаемого в соответствии с современной терминологией как HBsAg - антиген белка вирусной оболочки) было сопоставлено с фактом заражением гепатитом В только в 1968 году. Именно тогда Принс, Окоши и Мураками (Prince A.M., 1968; Okochi and Murakami,1968) показали, что обнаружение Au-антигена в крови пациента является специфическим индикатором гепатита В.

Установление этой взаимосвязи явилось переломным моментом в изучении гепатита В. С этого времени стало возможным исследование динамики и масштаба распространения заболевания, даже несмотря на то, что сам инфекционный агент в тот момент ещё не был обнаружен. Частота выявления HBsAg до сих пор служит показателем широты распространения HBV-инфекции.

В 1970 году Дэйну с сотрудниками удалось выявить возбудитель гепатита В - ДНК-содержащий вирус диаметром 42 нм (Dane et al., 1970).

Разработка первых вакцин, в основе которых лежало использование HsAg антиген - содержащих неинфекционных вирусных частиц, выделенных из крови пациентов, началось уже в 1975 году.

Эпидемиология гепатита В человека.

Несмотря на все усилия, приложенные к выработке стратегий лечения и профилактики распространения гепатита В, это заболевание было и остаётся одной из самых серьёзных медицинских проблем современности.

Количество хронических носителей инфекции, достигающее в мире, по последней оценке ВОЗ, 350 млн. человек, продолжает неуклонно расти; по меньшей мере, 1 млн. человек умирает ежегодно от рака печени, возникшего на одной из стадий развития гепатита В.

Гепатит В занимает третье место по распространённости среди инфекционных заболеваний, уступая по количеству инфицированных только венерическим заболеваниям и ветряной оспе.

Географическое распределение носителей инфекции в мире крайне неравномерно. В регионах с высокой плотностью носителей гепатита В -Юго-Восточной Азия, Китае и Африке более половины населенияинфицированы на протяжении жизни, до 8% населения являются хроническими носителями инфекции. В этих странах заболевание распространяется в результате как вертикальной (неонатальной), так и горизонтальной трансмиссии. К регионам с низким процентом инфицированного населения относятся Северная Америка, Западная Европа и Австралия. В этих странах среди взрослого населения преобладает горизонтальный путь передачи инфекции (как следствие употребления внутривенных наркотиков или незащищённого секса).

По официальным данным Минздрава в Российской Федерации в настоящее время выявлено более 5 миллионов носителей вируса гепатита В. При этом острой формой гепатита В болеют 35 человек на 100000 человек, хро нической формой - 31 человек на 100000 человек.

Патогенез заболевания.

Развитие гепатита В само по себе не оказывает цитопатического эффекта - не приводит к гибели клеток печени - гепатоцитов. Поражение печени является исключительно результатом развития иммунного ответа организма. Тем не менее, несмотря на всю травматичность этого процесса, мощный и полноценный иммунный ответ является залогом полного и скорого выздоровления. Иными словами, адекватный иммунный ответ, ведущий к полному уничтожению вирусной инфекции в организме, часто сопряжён с гибелью большого количества инфицированных гепатоцитов в короткий срок на начальных стадиях развития инфекции.

Выделяют следующие основные этапы развития инфекции:1) попадание возбудителя в организм (заражение);2) фиксация вируса на гепатоците и проникновение его внутрь клетки;3) размножение вируса и выход новых вирусных частиц из гепатоцитов в кровяное русло;4) включение иммунологических реакций, направленных на элиминацию вируса;5) поражение других органов и систем;6) формирование полноценного иммунного ответа; освобождение от возбудителя и выздоровление или развитие хронической формы заболевания.

Скорость уничтожения вирусной инфекции в организме определяется целым рядом взаимодополняющих друг друга факторов: иммунным статусом пациента, наличием других заболеваний, возрастом и полом, потреблением алкоголя, наркотических средств и медикаментов, применяемой стратегией лечения и т.д. Их совокупность определяет развитие одной из форм заболевания.

Заражение вирусом гепатита В человека может привести к развитию быстротекущей или хронической формам заболевания.

Быстротекущая форма заболевания развивается у 95 % взрослых пациентов. Выведение вируса из организма и полное выздоровление происходит за сравнительно короткое время. Протекание всего цикла (от момента заражения до полного выздоровления) занимает в среднем от 1 до 6 месяцев, включая и бессимптомный инкубационный период, часто длящийся несколько недель.

В этот начальный период развития инфекции нередко происходит инфицирование всей популяции гепатоцитов, так как иммунный ответ пациента еще слишком слаб для нейтрализации вируса. После того, как иммунный ответ достигает своего пика, в течение нескольких недель происходит полное выведение вируса из крови и гепатоцитов заражённого организма.

В случае широкомасштабного заражения клеток печени на ранней стадии развития заболевания их замещение на здоровые гепатоциты может затянуться до 12 месяцев. В этот период реконвалесценции происходит постепенное исчезновение клинических, биохимических и морфологических симптомов заболевания.

Быстротекущая форма протекания болезни далеко не всегда безобидна и в 0,5 % случаев переходит в острую инфекцию, заканчивающуюся летальным исходом. Причиной смерти является единовременный некроз подавляющей части гепатоцитов, сочетающийся с нарушением механизма их регенерации, витаминного баланса, а также с утратой печенью способности осуществлять детоксикацию накапливающихся в организме вредных соединений.

Заражение вирусом гепатита В человека может также вызвать развитие хронической формы заболевания (у 5 % взрослых пациентов), характеризующейся наличием HBsAG в крови пациента, а также воспалительным процессом, сохраняющимся в печени пациента свыше 6 месяцев (Seeger and Mason, 2000). Заболевание переходит в хроническую форму в том случае, если по каким-либо причинам не происходит развитие иммунного ответа или он слишком слаб для подавления инфекции. Хроническая форма часто возникает в случае "вертикального" переноса инфекции от матери к младенцу (так называемая "неонатальная" трансмиссия). При этом заражение происходит ещё до окончательного формирования его иммунной системы. Соответственно, впоследствии организм не расценивает вирусные белки как чужеродные и их секреция в организме не вызывает развития иммунного ответа. В этих условиях ребёнок становится бессимптомным хроническим носителем инфекции. Хроническая инфекция развивается, согласно вышеописанному сценарию, у 95 % всех инфицированных младенцев. В то же время только 30 %инфицированных детей, вышедших из младенческого возраста, становятся хроническими носителями инфекции.

При хронической форме гепатита В у взрослых пациентов элиминирование вирусной инфекции и сопряжённые с этим воспалительные процессы могут длиться в течение десятилетий (вместо нескольких недель при быстротекущей форме заболевания), приводя к развитию цирроза печени и других осложнений.

Наиболее серьёзным следствием хронической формы гепатита В является карцинома печени, возникающая почти исключительно у пациентов с циррозом печени. Рак печени у пациентов с хроническим гепатитом В развивается, в среднем, через 25-30 лет протекания заболевания. Более 25 % всех случаев хронического гепатита В заканчивается возникновением не поддающегося лечению рака печени, от которого в мире ежегодно погибает более 1 млн. человек (Evans et al.,1998). До настоящего времени не удалось выявить какого-либо специфического для гепатита В человека онкогена, ответственного за развитие карциномыМеханизмы и факторы взаимодействия вируса с организмом, направляющие развитие инфекции по одному из вышеописанных путей, на данный момент мало изучены. Отсутствие глубокого понимания особенностей взаимодействия вируса гепатита В с организмом инфицированного хозяина представляет собой, таким образом, одну из основных трудностей при разработке действенных подходов к лечению и профилактике заболевания.

Методы лечения и профилактики гепатита В.

Несмотря на интенсивное в последнее время изучение гепатита В человека, все попытки создания эффективной стратегии борьбы с этим заболеванием имеют пока только ограниченный успех.

Одним из наиболее действенных современных подходов к лечению хронической формы гепатита В является терапия а-интерфероном. При полном подавлении инфекции у 50 % пациентов в остальных случаях данный способ лечения, тем не менее, не оказывает видимого эффекта на протекание заболевания (Hoofnagel et al, 1997). Последние разработки в области медикаментозной терапии, в частности, использование аналогов нуклеозидов и соединений, модулирующих иммунный ответ организма, являются дорогостоящими, их долговременный эффект и отдалённые последствия пока не изучены (Seeger С. and Mason W.S., 2001).

Другой подход, всеобщая вакцинация, также не всегда возможна. В большинстве регионов мира с наиболее высокой заболеваемостью гепатитом В (от 5 до 20 % населения) вакцинация не может быть полностью проведена в связи с низким уровнем жизни. Вакцинация не действенна в случаях уже развившегося заболевания или для профилактики передачи вируса от инфицированной матери новорожденному. Кроме того, всегда сохраняется опасность появления мутантных форм вируса (Ferrell et al., 2000; Zhang et al., 2000), не чувствительных к иммунному ответу организма, обусловленному применением имеющихся вакцин.

Для разработки действенной стратегии лечения и профилактики гепатита В человека необходимо детальное и глубокое понимание природы вируса.

Актуальность изучения особенностей жизненного цикла вируса, как клеточных, так и вирусных процессов и факторов, задействованных на каждом из этапов развития заболевания, сохраняется в полной мере.

Только всестороннее знание механизмов заболевания и природы его возбудителя, всех аспектов взаимодействия вируса и организма хозяина может привести к созданию универсальной и эффективной антивирусной стратегии лечения.

Принимая во внимание определённое сходство вируса гепатита В с вирусом ВИЧ и другими ретровирусами, результаты исследований в этой области могут быть использованы в разработке подходов к лечению и других заболеваний.

Гепаднавирусы и их хозяева.

Экспериментальные модели изучения гепатита В.

Одним из основных факторов, лимитирующих изучение гепатита В человека и его возбудителя, является крайне узкий спектр хозяев вируса, не позволяющий исследовать развитие заболевания на традиционных лабораторных животных.

До последнего времени отсутствовала как легкодоступная и недорогостоящая экспериментальная "животная" модель, так и перевиваемая клеточная линия, пермиссивная для инфекции. Ситуация изменилась с обнаружением вирусов гепатита В птиц и млекопитающих.

Все известные сегодня вирусы гепатита В относятся к одной из двух групп, Orthohepadnaviruses и Avihepadnaviruses, образующих, в свою очередь, семейство вирусов Hepadnaviridae.

К Orthohepadnaviruses относят, наряду с вирусом человека (HBV), вирус гепатита В сурков (WHV), земляных и арктических белок (GSHV и AGSHV), а также гепаднавирусы приматов: орангутангов, горилл, гиббонов и др. (Schafer et al., 1998).

Вирусы гепатита В, инфицирующие некоторые виды уток (впервые вирус DHBV был обнаружен у уток Anas domesticus из Китая и США (Zhou, 1980; Mason et al. 1980), а впоследствии и у других видов уток (Schoedel et al., 1991; Triatni et al., 2001), серых цапель Ardea cinerea (HHBV) (Netter etal., 1997; Sprengel et al., 1988), гусей Росса Anser rossii и снежных гусей Ans er caerulescens caerulescens (RGHBV и SGHBV, соответственно) (Chang S.-F. et al., 1999) образуют группу Avihepadnaviruses.

Несмотря на некоторые отличия, все представители семейства Hepadnaviridae характеризуются рядом общих признаков (морфология и строение вируса, организация вирусного генома, общая схема и механизмы репликации и крайне узкий спектр хозяев каждого представителя семейства), что позволяет экстраполировать результаты, полученные на животных моделях, на исследование гепатита В человека. Использование вышеперечисленных вирусов гепатита В птиц и млекопитающих и их хозяев, а также культур первичных гепатоцитов печени этих животных в качестве экспериментальной модели сыграло и продолжает играть большую роль в изучении закономерностей и факторов жизненного цикла вируса гепатита В, универсальных для всех представителей семейства Hepadnaviridae.

Из всех упомянутых выше животных утки представляют собой наиболее легкодоступную и дешёвую экспериментальную модель. Использование так называемой "утиной" модели, под которой в зависимости от контекста понимают как саму птицу, так и культуры первичных гепатоцитов утки, предоставляет широкие возможности для изучения гепатита В in vitro и in vivo. Благодаря её удобству и широкому распространению, вирус гепатита В уток DHBV является в настоящее время наиболее детально изученным представителем семейства Hepadnaviridae.

Для понимания задач и результатов настоящей работы представляется целесообразным привести в этой её части краткое схематическое описание жизненного цикла вируса. Учитывая то, что большинство опытов в этой работе было проведено с использованием "утиной" экспериментальной модели, описание жизненного цикла будет проведено на примере вирусагепатита В уток БНВУ. Жизненный цикл вируса гепатита В человека будет упоминаться в дальнейшем только в случае принципиально важных отличий механизмов и факторов его жизненного цикла от таковых цикла вируса БНВУ.II. Характеристика вируса гепатита В уток.

Вирус гепатита В уток - ДНК-содержащий вирус с выраженным тропизмом к клеткам печени, принадлежащий к семейству вирусов Hepadnaviridae.

Для всех представителей семейства характерен синтез одной ("минус"-цепи) из двух цепей геномной ДНК в реакции обратной транскрипции РНК-промежуточного продукта, так называемого "прегенома" (см. далее). На основании этого вирусы гепатита В относят к параретровирусам и объединяют с представителями семейств вирусов Retroviridae и Caulimoviridae в группу вирусов, характеризующихся наличием обратной транскрипции как одной из стадий репликативного цикла (Mayo М.А. and Pringle C.R., 1998).

Общие признаки всех представителей Hepadnaviridae.

Все вирусы гепатита В имеют следующие основные признаки, характерные для всех известных представителей группы:а) наличие кольцевой, частично двухцепочечной, геномной ДНК длиной 3,0 - 3,3 т.п.н.;б) общая схема организации вирусного генома;в) общая схема репликации вируса;г) синтез геномной ДНК с РНК матрицы в ходе обратной транскрипции;д) наличие в вирионе ковалентносвязанной с ДНК полимеразы, способной достраивать одноцепочечный участок "плюс"-цепи вирусной ДНК,благодаря своей эндогенной ДНК- полимеразной активности (см. ниже);е) стандартный набор вирусных антигенов;ж) сходная морфология и строение вирусных частиц;з) синтез нескольких типов вирусных частиц, в частности, синтез большого числа несодержащих ДНК неинфекционных липопротеиновых субвирусных частиц ("теней" вируса);и) крайне узкая видоспецифичность каждого гепаднавируса;к) наличие преимущественного тропизма к клеткам печени - гепатоцитам.

Типы вирусных частиц.

Одной из характерных особенностей вирусов гепатита В является продукция нескольких типов вирусных частиц.

В сыворотке крови уток, инфицированных вирусом DHBV, обнаружено два типа вирусных частиц:1. Инфекционные вирионы размером около 60 нм.

Центральное положение в вирионе занимает икосаэдрический внутренний капсид размером 35,0-37,5 нм (Nassal and Schaller, 1996), образованный 180 димерами Core белка вирусного капсида. В капсид заключёна кольцевая, частично двухцепочечная, молекула ДНК вирусного генома. С 5'- концом "минус"-цепи вирусной ДНК ковалентно связан Р-белок, обладающий ДНК-зависимой ДНК - полимеразной и РНК-зависимой ДНК - полимеразной активностями (Ganem and Schneider, 2002), в то время как с 5'-концом "плюс"-цепи ассоциирована кэпированная олигорибонуклеотидная последовательность (Lien et al., 1986; Seeger et al.,1986; Will et al., 1987). Внешняя оболочка вируса образована липидной мембраной клетки хозяина, содержащей в качестве структурных белковых компонентов вирусной природы два белка вирусной оболочки DHBV PreS/S и S (Sprengel et al., 1985; Schlicht et al., 1989).

2. Неинфекционные субвирусные частицы размером 35-60 нм ("тени").

Эти частицы не содержат ни внутреннего вирусного капсида, ни вирусной ДНК и состоят исключительно из белков внешней оболочки вируса PreS/S и липидов клеточной мембраны хозяина (Mason et al., 1980). Количество этих частиц превышает на несколько порядков число инфекционных частиц, синтезируемых вирусом. Предполагают, что такая сверхпродукция "теней" является частью защитной стратегии вируса, позволяющей связывать нейтрализующие антитела (с одинаковой эффективностью узнающие и связывающие оба типа секретируемых вирусных частиц) и таким образом увеличивающей вероятность заражения новых клеток инфицированного организма. Однако, это не единственная функция "теней". В соответствии с современными представлениями, эти вирусные частицы способны также увеличивать эффективность заражения в условиях низкой множественности инфекции (MOI) (Bruns et al., 1998).

При заражении гепатитом В человека в крови пациента обнаруживают три типа вирусных частиц (Рис. 1):1. Инфекционные вирусные частицы размером 42-нм. также известные как частицы Дейна (Dane particles).

Частицы Дейна - вирусные частицы, обладающие структурой, сходной с таковой ранее описанных инфекционных вирусных частиц DHBV. Их22липопротеиновая наружная оболочка содержит в качестве белкового компонента вирусный гликопротеин, серологически определённый как HBsAg. Внутри внешней вирусной оболочки находится (как и в случае с DHBV) ДНК-содержащий вирусный нуклеокапсид размером 25-27 нм, состоящий из димеров вирусного структурного Core белка, фосфопротеина с молекулярным весом 21 кДа.

2. Неинфекционные сферические вирусные частицы диаметром 20-нм.

Как и в случае с DHBV, это - вирусные частицы, не содержащие ни вирусной ДНК, ни капсида и состоящие только из липопротеиновой оболочки. Количественное соотношение этого типа вирусных частиц и частиц Дейна вируса HBV в крови пациентов достигает 1:10.000-1.000.000.

3. Неинфекционные вирусные частицы-филаменты.

Характерной чертой HBV является секреция сравнительно небольшого количества вирусных частиц-филаментов. Несмотря на то, что филаменты могут значительно варьировать по длине, их диаметр в большинстве равен 20 нм.

Н ВС 'и- /.^ * Нуклео- Внгрнон ' капшд 40нмБчастицы«Тенн»Рис. 1 Структура вирусных частиц вируса гепатита В человека, А - инфекционная вирусная частица; Б - структура вириона и секретируемых "теней" вируса.

Структура вирусного генома и кодируемые им белки.

Ввиду небольшого размера генома (около 3.000 т.п.н.) вируса гепатита В, его организация крайне компактна. Все нуклеотиды вирусного генома входят в состав четырёх частично перекрывающихся открытых рамок считывания (ОРС). Таким образом, некоторые участки нуклеотидной последовательности участвуют в транскрипции более чем одного белка. Некодирующих участков в составе генома вируса гепатита В нет. Наряду с тем, что открытые рамки считывания частично перекрываются, для некоторых из них свойственно наличие нескольких АТС кодонов инициации трансляции (Рис. 2). Благодаря этому, одна ОРС может кодировать последовательность нескольких вирусных белков. Вследствие этого белки, кодируемые одной ОРС, могут иметь общуюпоследовательность С-концевой части, в то время как длина их N-концевой части будет варьировать.

В полном соответствии с этим принципом для вируса DHBV описаны два белка вирусной оболочки PreS и S, иногда также обозначаемые как "Большой L" (Large) и "Малый S" (Small) белки оболочки, соответственно, кодируемые PreS/S ОРС (Pugh et al., 1987; Schlicht et al., 1987). Для вируса HBV характерно наличие ещё и третьего белка PreS2, обозначаемого также как "Средний М" (medium) белок оболочки вируса. ATG, инициаторный ко дон этого белка, находится между инициаторными ко донами PreSl и S белков вируса HBV.

Синтез белков, кодируемых РгеС/С рамкой считывания, происходит сходным образом. Инициация трансляции на первом AUG инициаторном кодоне ведёт к синтезу молекулы-предшественника (обозначаемой как "ргесоге"), ко- и посттрансляционный процессинг которой ведёт к образованию зрелой формы белка - е-антигена (e-Ag) (Schlicht et al., 1987; Schneider et al.,1991) Инициация трансляции на втором ATG кодоне ведёт к синтезу структурного Core белка вирусного капсида (Takahashi et al.,1983; Standring et al., 1988). Необходимо отметить тот факт, что, несмотря на общее происхождение, дальнейшая судьба этих белков сильно различается. В то время как Core белок необходим для образования вирусного капсида, е-антиген секретируется из инфицированной клетки и, согласно современным представлениям, играет важную роль в развитии инфекции. Какой-либо прямой взаимосвязи между этими двумя процессами до сих пор выявлено.

Ген PreC/CГен Р-6елка5Vи—tf.T.s.,^Рис. 2. Схема организации генома вируса гепатита В уток DHBV. А - стрелками показано расположение генов вирусных белков; Б - гены PreS/S и РгеС/С и кодируемые ими РНК-транскрипты.

Р-протеин - единственный белок, транслируемый с Р-ОРС. В составе Р-белка различают регионы с ДНК-зависимой ДНК-полимеразной и обратно-транскриптазной активностями. Р-белок обладает, кроме того, и РНКазной (RNAse-H) активностью, в то время как его аминоконцевая последовательность ответственна за ковалентное связывание в вирионе с 5'-концом минус цепи геномной ДНК (Ganem and Schneider, 2002).

До последнего времени считалось, что Х-белок кодируют только X-ОРС геномов представителей группы Orthohepadnaviruses - вирусов гепатита В млекопитающих. Функции Х-белка не до конца понятны. Известно, однако, что он обладает регуляторными свойствами и активирует транскрипцию большого числа клеточных промоторов (Grob, 1998; Lau andWright, 1993; Henkler and Koshy, 1996). Кроме того, ему приписывалась регуляторная роль в развитии хронической формы гепатита В и образовании гепатокарциномы. Последнее предположение основывалось на наблюдении, что у уток, хронически инфицированных вирусом DHBV, гепатокарцинома в норме не развивается. Поскольку у уток отсутствовал и классический ATG-инициаторный кодон трансляции Х-белка, взаимосвязь синтеза регуляторного Х-белка с развитием карциномы печени казалась очевидной (Su et al., 1998). Тем не менее, недавно были получены экспериментальные данные, демонстрирующие экспрессию Х-подобного белка вируса DHBV со "скрытой" рамки считывания, начинающейся с неканонического инициаторного кодона. (Chang et al., 2001). В ходе последующего анализа нуклеотидной последовательности геномов удалось выявить наличие сходных Х-ОРС с неканоническими инициаторными кодонами и для других представителей Avihepadnaviruses (Netter et al., 1997; Pult et al., 2001). Действительно ли Х-белок HBV и Х-подобный продукт вирусов птиц обладают сходными функциями и какова роль X-белка в развитии гепатокарциномы, ещё предстоит выяснить.

Жизненный цикл вируса DHBV.

1. Взаимодействие "вирус - клетка".

Первым шагом при заражении гепатитом В является связывание вируса к клеткой и проникновение в неё. Механизмы и факторы, участвующие во взаимодействии клетки и вируса на ранних этапах развития инфекции, до сих пор мало изучены.

Кинетика проникновения вируса DHBV в клетку также необычна: процесс присоединения вируса к клетке и внедрения в неё занимает значительное время. В экспериментах с инкубацией гепатоцитов в вирус-содержащей среде максимальный уровень инфекции достигался только через 16 часов. (Pugh and Summers, 1989).

Фактором, определяющим проникновение вируса в клетку, является его взаимодействие с клеточным рецептором. Согласно современным представлениям о ранних этапах развития инфекции, существует несколько кандидатов на роль белков-участников взаимодействия "вирус-клетка".

Принимая во внимание всё значение данного взаимодействия для развития инфекции, представляется необходимым описать имеющиеся гипотезы более подробно.

Как неоднократно было отмечено ранее, одной из самых характерных черт представителей Hepadnaviridae является их крайне узкая видоспецифичность. Считается, что узнавание вирусом клетки "своего" хозяина определяется (по меньшей мере, частично) его взаимодействием с клеточными рецепторами уже на этапе проникновения вируса в клетку (Ishikawa and Ganem 1995; Condreay et al., 1990). К настоящему моменту молекулярно-биологические механизмы ранних этапов развития инфекции ещё недостаточно изучены. Тем не менее, недавно был выявлен рядклеточных и вирусных белков, прямо или косвенно участвующих во взаимодействии вируса гепатита В с клеткой (Breiner et al., 1998).а) белки вирусной оболочки PreS/S.

Результаты изучения особенностей вирусов HHBV и DHBV указывают на важную роль PreS домена L белка вирусной оболочки во взаимодействии с клеточным рецептором.

На данный момент общепризнано, что PreS домен L белка внешней оболочки вируса гепатита В играет важную роль в его взаимодействии с клеткой. Это утверждение основывается на целом ряде данных. Так, было продемонстрировано блокирование распространения инфекции гепатита В DHBV в культуре гепатоцитов добавлением в среду PreS- рекомбинантных белков (Klingmuller and Schaller, 1993). Показано, что антитела к определённым участкам PreS белка блокируют инфекцию гепатоцитов утки вирусными частицами DHBV, препятствуя взаимодействию вируса с соответствующими клеточными рецепторами (Cheung et al., 1990; Lambert et al., 1990; Neurath et al., 1986). Эксперименты по псевдотипированию с использованием химерных вирусов продемонстрировали значение последовательности аминокислотных остатков и структуры PreS белка в определении узкого круга хозяев вируса (Ishikawa and Ganem, 1995).

В дальнейшем было показано, что последовательность PreS белка, включающая аминокислоты 30-115 L белка вируса DHBV, участвует в связывании карбоксипептидазы gpl80 - одного из наиболее вероятных кандидатов на роль клеточного рецептора вируса гепатита В (Urban et al., 1998). В составе этой аминокислотной последовательности можно, в свою очередь, выделить два субрегиона. В то время как аминокислоты 85-115 абсолютно необходимы для связывания gpl80, участок, включающий в себя аминокислоты с 30-ой по 85-ую, играет роль энхансера этого процесса. Сэтим участком частично перекрывается последовательность (аминокислотные остатки 22-37), определяющая, по мнению Урбана и его коллег, круг хозяев вируса.

Кроме того, выявлены и другие структурно-функциональные элементы L белка, участвующие во взаимодействии вируса с клеткой. Так, например, миристилирование второй аминокислоты (глицин) L белка способствует прикреплению вируса к клетке, вероятно, увеличивая локальную концентрацию вируса на внешней клеточной мембране (Urban et al., 2001).б) карбоксипептидаза gpl80.

Гораздо меньше известно о клеточных рецепторах гепатита В. Несмотря на то, что в последнее время был выявлен целый ряд клеточных белков, способных связываться с PreS оболочки вируса in vitro, их роль в проникновении вируса в клетку и развитии инфекции in vivo не доказана (Budkowska et al., 1993; Komai and Peeples, 1990; Neurath et al., 1992; Hirsch et al., 1991).

В настоящий момент главным кандидатом на роль клеточного рецептора считают белок gpl80 (карбоксипептидазу D), впервые обнаруженный в экспериментах с гепатоцитами утки.gpl80, гликопротеин с молекулярной массой 180 кДа, трансмембранный белок, состоящий из трёх доменов (Tan et al., 1997). Один из них, С-терминальный цитоплазматический домен величиной в 60 аминокислот, обладает высоким специфическим сродством к вирусному белку PreS и участвует в его связывании (Eng et al., 1998).

Есть определённые основания считать gp 180 клеточным рецептором вируса гепатита В: участок PreS домена, ответственный за связывание с gpl80, совпадает с независимо выявленным участком связывания PreS склеточным рецептором (Breiner et al, 1998); добавление свободной растворимой формы gpl80 (рекомбинантного белка, лишённого трансмембранного участка прикрепления к мембране) в культуральную среду гепатоцитов утки блокирует их заражение вирусными частицами. Кроме того, было показано, что возникновение мутаций в последовательности PreS домена, нарушающих структуру его участка связывания с gpl80, приводят к ингибированию инфекционности секретируемых вирусных частиц (Eng et al., 1998).

Тем не менее, есть данные, свидетельствующие, по-видимому, о более комплексном и сложном взаимодействии вируса с клеточным(и) рецептором(ами) и роли gpl80 в этом процессе: gpl80 обнаружен не только в гепатоцитах, но и в других клетках, не пермиссивных для вируса гепатита В; искусственная экспрессия gpl80 в трансфецированных LMH клетках (линия клеток, способных поддерживать все стадии репликативного цикла вируса гепатита В, но не пермиссивных per se для инфекции) не делает их пермиссивными для вируса гепатита В; антитела к gpl80 не способны блокировать инфекцию культуры гепатоцитов утки вирусом DHBV. Эти и другие данные последних исследований ставят под сомнение роль gpl80 в качестве первичного и единственного клеточного рецептора вируса гепатита В. Более вероятным представляется существование многокомпонентного клеточного рецепторного комплекса (в состав которого входит и gpl80), ответственного за многоэтапный процесс связывания вируса и его проникновение в клетку.

Транспорт вирусной ДНК в ядро.

Каким бы ни был механизм проникновения в клетку, вирусные частицы в результате попадают в цитоплазму (Рис. 3).

Свяшшш»яруса с рецептором л/ Цронхкиюхенке ъ клеткушчкшваию кафешп хнрусных частнцИнфекция Транспорт ¿гпоио ДНК в ядроч Дпстракхамие А<+)ВД61Ш! \сооо |^/ССС ДНК I\ Траиофпщии *ч/ЭкспортхранскрхптохКап. кап.

КПП"•поли А•Поли А•ПОЛИ АВнрусмие транскргаггыТражлтщй ч>^ ИшиокипацияБелкк: РНК-пре генома Р-бейгёсТсвте, 'X.•■■■■■1 Сюо» \ <+) вдяшСинтез щелкСборка / ндклеокаггеида/Соге белок-:-.■■»-. а: • ■«Поли АРис. 3. Схема жизненного цикла вируса гепатита В.

Последующие, так называемые "пост-рецепторные" этапы развития вирусной инфекции в клетке также пока крайне мало изучены. Для эффективного заражения клетки вирусные нуклеокапсиды должны быть доставлены в её ядро, где и происходит репликация вирусной геномной ДНК. Ряд данных указывает на роль микротрубочек клетки в процесседоставки нуклеокапсидов к ядру (Ganem and Schneider, 2002), однако более подробные данные ещё не получены.

На следующем этапе происходит доставка вирусной ДНК в ядро клетки. Механизм этого процесса практически не исследован. Неизвестно, имеет ли место доставка интактных нуклеокапсидов в ядро клетки (Eckhardt et al., 1991;, Ou et al., 1989; Yeh et al., 1990) или же высвобождение вирусной ДНК из капсида происходит ещё в цитоплазме (Kann et al., 1997). В последнем случае вирусный геном попадает в ядро через ядерные поры либо самостоятельно, либо с помощью белкового посредника. Роль такого посредника в доставке вирусного генома в ядро могут играть Core и/или Р-белки вируса (Kann et al.,1997; Mabit et al., 2001).

Образование сссДНК.

После того, как частично двухцепочечная кольцевая молекула вирусной ДНК попадает в ядро клетки, происходит достраивание более короткой цепи до полной длины с образованием ковалентно замкнутой кольцевой двухцепочечной формы ДНК, также известной как сссДНК (covalently closed circular DNA), в "эндонуклеазной полимеразной реакции". Необходимо отметить, что достройке одноцепочечного участка "плюс"-цепи вирусной ДНК предшествует удаление 5'-терминальных структур обеих цепей (олигорибонуклеотида и Р-белка). Некоторые данные указывают на активное использование клеточных механизмов хозяина на стадии достройки участка "плюс"-цепи ДНК и ее последующего лигирования с образованием полностью замкнутой кольцевой молекулы ДНК (Kock and Schlicht, 1993).

Вирусные РНК-транскрипты.сссДНК, а точнее, её "минус"-цепь, служит матрицей для синтеза РНК транскриптов вируса. В соответствии с их функцией и длиной различают два класса вирусных транскриптов: "геномные" и "субгеномные" РНК. В состав обоих классов входит несколько транскриптов, несущих так называемую "кэп "-структуру на одном конце (5'-конце) и полиаденилированных по общему сигналу полиаденилирования, соответственно, на другом конце (3'-конце).

В то время как "субгеномные" транскрипты выполняют роль иРНК для трансляции L, S (а в случае HBV ещё и М) и X белков, две "геномные" РНК участвуют в синтезе РгеС, С и Р белков. С/Р геномная РНК бифункциональна: она не только кодирует последовательность С и Р белков, но и служит матрицей для синтеза "минус"-цепи ДНК в реакции обратной транскрипции. С этой ДНК-кодирующей функцией С/Р геномной РНК связано и другое её название - "прегеномная" РНК. РгеС РНК, напротив, не используется для обратной транскрипции и выступает исключительно в роли иРНК, кодирующей последовательность белка-предшественника РгеС, продуктом посттрансляционной модификации которого является описанный ранее е-антиген.

Регуляторные элементы вирусного генома.

Регуляция трансляции белков вируса DHBV с четырёх, частично перекрывающихся ОРС, осуществляется одним энхансером и 5 промоторами, ответственными за регуляцию независимой транскрипции с PreS-, S-, Core-, РгеС- и Х-генов.

В то время как у HBV обнаружено два энхансера (Рис. 4), у DHBV известен только один такой регуляторный элемент, расположенный левее от промотора Core гена (Creszenzo-Chaigne et al., 1995; Liu et al., 1994; Schneider and Will, 1991).¡У Eni энхансер X промоторРис. 4.Схема расположения регуляторных элементов генома вируса гепатита В человека: указана локализация вирусных промоторов и энхансеров.

Промоторы разных генов отличаются по структуре. Так, одним из функциональных элементов промотора, контролирующего синтез PreS-PHK, является ТАТА-Ьох элемент, тогда как в промоторе, ответственном за транскрипцию S-гена, этот элемент, по-видимому, отсутствует (Buscher et al., 1985). Промоторные-регионы, также содержащие ТАТА-Ьох в качестве структурно-функционального элемента, были выявлены и для РгеС- и С-генов (Creszenzo-Chaigne et al., 1995; Liu et al., 1994; Schneider and Will,Уже на начальных этапах изучения жизненного цикла вируса гепатита В было показано, что обратная транскрипция вирусной ДНК происходит внутри вирусных капсидов (Summers and Mason, 1982). В соответствии с этим, инкапсидация вирусной РНК-матрицы представляется необходимой1991).

Инкапсидация вирусной РНК.предпосылкой реакции обратной транскрипции и, таким образом, является первым этапом репликации ДНК вирусного генома. При этом происходит инкапсидация только самого короткого из ранее описанных вирусных транскриптов - прегеномной РНК (Enders et al., 1987). Как было выяснено в ходе дальнейших исследований, для инкапсидации прегеномной РНК требуется взаимодействие как вирусных белков, так и ряда клеточных белковых факторов. Согласно современным представлениям, этот процесс идёт по следующей схеме:На первой стадии процесса происходит взаимодействие прегеномной РНК с вирусным Р-белком с образованием рибонуклеопротеинового комплекса (Hirsch et al., 1990; Bartenschlager et al., 1990). Важную роль в этой реакции играют сигналы инкапсидации вирусной РНК. В то время как у HBV был выявлен только один такой сигнал, получивший название е-сигнала инкапсидации (Junker-Niepmann et al., 1990), для успешного протекания инкапсидации DHBV РНК требуется функциональная активность и второго дополнительного сигнала, расположенного ближе к З'-концу РНК транскрипта (Hirsch et al.,1991). Необходимо подчеркнуть тот факт, что прегеномная РЖ обладает двумя такими копиями в-сигнала на 5'- и 3'-концах молекулы, соответственно, в то время как у всех субгеномных транскриптов функциональная 5'-концевая копия сигнала отсутствует. Как было недавно показано, в образовании рибонуклеопротеинового (РНП) комплекса принимают участие и клеточные белки-шапероны hsp90 и р23 (Hu and Seeger, 1996; Ни et al.,1997).

На следующем этапе инкапсидации вирусной РНК происходит взаимодействие сформировавшегося рибонуклеопротеинового комплекса с вирусными капсидами. Сборка капсидов из молекул вирусного Core белка осуществляется, судя по всему, независимо от образования РНП-комплекса и состоит из двух этапов: димеризации молекул Core белка (Zhoy et al.,361992) и агрегации этих димеров с образованием структуры вирусного капсида (Seifer et al., 1993). Никаких промежуточных стадий до сих пор выявлено не было. В какой момент попадает в капсид вирусная РНК, не выяснено. Также остаётся открытым вопрос о механизмах взаимодействия вирусного капсида с РНП-комплексом. Предполагают, что в то время как N-концевая часть Р-белка связывает прегенномную РНК вируса, С-терминальный участок отвечает за взаимодействие (прямое либо опосредованное) с капсидными белками (Pollack and Ganem, 1994).

Синтез вирусной ДНК.

После того, как было установлено, что "минус"-цепь ДНК вириона ковалентно связана с Р-белком, было сделано предположение о возможной роли Р-белка в качестве праймера синтеза ДНК: подобный механизм был выявлен ранее для аденовирусов (Challberg and Kelly, 1989).

Действительно, Р-белок P-s РНП комплекса инициирует обратную транскрипцию РНК в районе 5'-концевой копии в-сигнала РНК (последовательность нуклеотидов которого образует шпилькообразную структуру) с образованием затравки длиной 3-4 нуклеотида. Затем Р-белок и ковалентно связанная с ним ДНК-затравка переносятся в район 3'-концевой копии последовательности DR1, где и продолжается дальнейшее удлинение "минус"-цепи ДНК. Механизм этого переноса ещё не выяснен.

Одновременно с синтезом ДНК происходит деградация матричной молекулы прегеномной РЖ, осуществляемая РНКаза Н доменом Р-белка. Деградация РНК транскрипта делает возможным последующее функционирование синтезируемой цепи ДНК в качестве матрицы синтеза "плюс"-цепи. К моменту завершения синтеза полноразмерной длины "минус"-цепи ДНК интактным остаётся только небольшой фрагмент РНК, состоящий из так называемого г участка и последовательности DR1. Этот кэппированный РНК олигомер комплементарен гомологичной последовательности участка DR2 5'-конца "минус"-цепи и служит после транслокации в этот район затравкой для синтеза "плюс"-цепи ДНК. Обычно происходит преждевременное прекращение синтеза "плюс"-цепи ДНК, в результате которого в кольцевой двухцепочечной молекуле геномной ДНК вириона остаётся характерный одноцепочечный "gap" участок. Предполагается, что терминация связана с созреванием вирусной частицы, в ходе которого они попадают в структуры эндоплазматического ретикулума (ЭР) и, таким образом, больше не могут использовать цитоплазматический пул дезоксинуклеотидтрифосфатов. Вследствие этого дальнейший синтез "плюс"- цепи физически невозможен.

Созревание вирусных частиц и их секреция.

Следующим этапом формирования инфекционных вирусных частиц является "одевание" капсидов во внешнюю оболочку вируса. В ходе электронно-микроскопического исследования этого процесса на примере вируса гепатита В человека HBV было показано, что начальный этап окончательной сборки вирусных частиц происходит внутри компартментов ЭР (Gerber et al, 1974; Patzer et al., 1986). Результаты проведённого в дальнейшем биохимического анализа локализуют основное место сборки вирусных частиц в компартментах, расположенных между мембранами ЭР и структурами комплекса Гольджи (Huovila et al., 1992). С этими данными также согласуется высокое содержание во внешней оболочке внутриклеточных вирусных частиц богатых манозой олигосахаридных цепей, связанных с аспарагином, - модификация, специфичная для ЭР (Patzer et al., 1984).

Мембраны ЭР клетки играют важнейшую роль в сборке вирусных частиц, так как именно на них происходит синтез вирусных белков внешней оболочки, которые являются интегральными по отношению к мембранам ЭР и характеризуются определённым пространственным положением в мембране. Необходимо особо отметить тот факт, что топология этих белков в мембране внешней оболочки вируса впоследствии меняется (на стадии отпочковывания или позднее - время и механизм этой модификации не установлены) (Bruss et al., 1994). Интегральные клеточные белки отсутствуют в билипидном слое оболочки вирусной частицы (бывшей мембране ЭР клетки). Вирусные белки внешней оболочки способны, согласно современным представлениям, самостоятельно инициировать замыкание мембран ЭР в сферические структуры с их последующим отпочковыванием. Именно этот процесс происходит при формировании "теней" вируса, состоящих исключительно из внешней вирусной оболочки.

Таким образом, взаимодействия на этом этапе белков внешней вирусной оболочки с белками нуклеокапсида вируса не требуется. Происходит ли взаимодействие белков капсида с белками вирусной оболочки при формировании инфекционных вирусных частиц Дэйна, ещё предстоит выяснить.

После сборки вирусных частиц осуществляется их транспорт по конститутивному секреторному пути через структуры комплекса Гольджи, где происходит окончательное созревание готовых к секреции вирусных частиц (Patzer et al., 1986).

Инфекция клеток de novo.

В заключение необходимо остановиться на ещё одной интересной особенности репликативного цикла вирусной ДНК. Как уже было описано выше, центральную роль в репликации вируса играет сссДНК. Для эффективной инфекции клетки требуется поддерживать в ней определённое число молекул сссДНК. В соответствии с современными представлениями, обратная транскрипция РНК, ведущая в конечном счёте к образованию сссДНК, проходит внутри нуклеокапсидов вируса в цитоплазме инфицированной клетки. Соответственно, должен существовать механизм, регулирующий доставку внутриклеточных ДНК-содержащих нуклеокапсидов обратно в ядро клетки, - инфекция de novo. Вскоре было действительно показано, что такой механизм действительно существует: на ранних этапах развития инфекции, когда количество синтезированных белков внешней оболочки вируса ещё невелико, происходит обратный транспорт нуклеокапсидов в ядро клетки, обеспечивающий постоянное присутствие в нём 10-20 молекул сссДНК. На более поздних стадиях инфекции, характеризующихся гораздо более высоким внутриклеточным содержанием PreS и S белков, превалирует секреция ДНК-содержащихкапсидов уже в составе вирусных частиц, что делает возможным распространение вирусной инфекции на соседние ещё не заражённые клетки печени (Ganem and Schneider, 2002).

Несмотря на наличие общих представлений о гепатите В человека, возбудителе заболевания - гепадновирусе и этапах его жизненного цикла, (описанного на модели гепадновируса гепатита В утки), особенности взаимодействия вируса с клетками организма хозяина, а также вирусные и клеточные факторы, участвующие в этом процессе, остаются недостаточно изученными.

Необходимая дополнительная информация может быть получена в ходе сравнительного молекулярно-биологического, структурно-функционального и филогенетического анализа различных гепадновирусов разных хозяев.

Современным подходом к решению этой задачи является детальный анализ нуклеотидной последовательности вирусной ДНК и структурно-функциональная характеристика вирусных геномов.

Сопоставление первичной структуры геномов гепаднавирусов с их функциональными особенностями является предпосылкой выявления неизвестных ранее генетических элементов и установления их роли во взаимодействии вируса с организмом хозяина, в определении возможных терапевтических мишеней.

Особую важность в этой связи приобретает поиск новых представителей гепадновирусов, в первую очередь, вирусов гепатита В птиц как экспериментальной модели и их структурно-функциональная и эволюционно -филогенетическая характеристика.III. Значение убиквитин-протеасомного пути деградации белков для репликации гепаднавирусов.

Одновременно с направленным детальным изучением природы вируса гепатита В и особенностей его взаимодействия с организмом инфицирванного хозяина предпринимаются попытки разработки антивирусной стратегии, основанной на воздействии на основные клеточные процессы.

Актуальность разработки стратегии воздействия на универсальные клеточные процессыКак уже было отмечено ранее, одним из наиболее серьёзных последствий гепатита В является развитие хронической формы этого заболевания. Кроме того, согласно современным представлениям, при хронической форме протекания заболевания возрастает риск возникновения карциномы печени, - осложнения, приводящего к более чем 1 млн. смертей в год.

Имеющиеся стратегии лечения и профилактики гепатита В не обладают необходимой эффективностью и универсальностью действия и не могут гарантировать радикальное уничтожение возбудителя заболевания в клетках хронически инфицированного пациента. Так, один из наиболее распространённых сегодня терапевтических подходов лечения гепатита В -использование цитокинов (интерферона а и его модификаций) приводит к полной элиминации вируса в организме пациента только в 50 % случаев и нередко сопровождается побочными эффектами. Другие современные методы борьбы с заболеванием (например, использование аналоговнуклеотидов, инъекции специфических HBV-нейтрализующих антител, медикаментозное лечение) также далеко не всегда эффективны. Так, при трансплантации пациенту здоровой печени донора применение указанных методов зачастую не способно предотвратить её заражение de novo. Необходимо иметь в виду, что даже при эффективном начальном подавлении инфекции в ходе лечения сохраняется опасность возникновения (а точнее, распространения из минорных субпопуляций) мутантных форм вируса, резистентных к применяемым терапевтическим средствам.

В целом, сравнительно низкая эффективность существующих стратегий лечения во многом объясняется недостаточной пока глубиной понимания природы вирусов гепатита В, а также специфики их взаимодействия с организмом хозяина. Действительно, на данный момент многие этапы жизненного цикла вируса, а также механизмы и факторы развития инфекции в организме хозяина изучены недостаточно.

Учитывая всё ранее сказанное, наиболее актуальной сегодня представляется разработка стратегий, в основе которых лежало бы воздействие на универсальные клеточные процессы и регуляторные механизмы клеточного метаболизма, необходимые для репликации, созревания и распространения вируса гепатита В, или прямо, или косвенно, связанные с этими процессами.

Убиквитин-протеасомный путь деградации клеточных белкови строение 26S протеасомы.

Одним из таких важнейших путей регуляции клеточного метаболизма является убиквитин-протеасомный путь деградации клеточных белков.

Если ещё сравнительно недавно считалось, что регуляция клеточного метаболизма происходит только на уровне синтеза ферментов и изменениябольшое значение клеточных процессов, определяющих деградацию белков (Deshaies, 1995; Ciechanover, 1998; Voges et al., 1999).

Одним из основных путей деградации клеточных белков является гидролиз белков по АТФ- и убиквитин- зависимому протеолитическому пути, центральным функциональным компонентом которого является 26S протеасома - мультисубъединичный белковый комплекс. 26S протеасома обнаружена как у самых примитивных эукариот, так и у высших организмом (Coux et al., 1996), для неё характерна как цитоплазматическая, так и ядерная локализация в клетке (Rüssel et al., 1999; Brooks et al., 2000).

26S протеасома представляет собой гантелеобразную симметричную структуру и состоит из каталитически активного центрального цилиндрического 20S ядра (иногда называемого также 20S протеасомой) с молекулярной массой 750 кДа и двух периферийно расположенных19S частиц (по 800 кДа), называемых иногда РА700 (Protein Activator) (Voges et al., 1999) (Рис. 6):■ШШтртшттлт:: 26S протеасомаРис 6. Строение 20S и 26S протеасом.

Если 20S протеасома осуществляет собственно протеолиз белков, то 19S частицы выполняют роль её регуляторных субъединиц (Абрамова и др., 2002). Оба типа этих субъединиц 26S протеасомы способны осуществлять АТФ- и убиквитин-зависимый протеолиз только в комплексе друг с другом.

20S субъединица - это полый цилиндр длиной 15-17 нм и диаметром 11-12 нм, состоящий из четырёх, лежащих друг на друге колец, каждое из которых образовано семью белковыми субъединицами с молекулярной массой 20-35 кДа (Lowe et al.,1995; Groll et al., 1997). Периферические кольца сформированы 7 субъединицами а-типа, а центральные - 7 субъединицами ß-типа. Субъединицы а- и ß-типа обладают сходной третичной структурой, но несколько отличаются на уровне аминокислотной последовательностиКаталитические центры, осуществляющие протеолиз, локализованы на двух центральных кольцах 20 S ядра, образованных субъединицами ß-типа (Coux et al., 1996; Voges et al., 1999; Groll et al., 1999). Сегодня известны 3 основных типа энзиматической активности протеасомы, центры которых локализованы на 3-х различных субъединицах каждого ß-кольца: химотрипсинподобная, трипсинподобная и постглютамилгидролазная активности. Протеолиз белков, несущих специальные сигналы деградации (см. ниже), осуществляется в центральном расширении канала 20S ядра. Диаметр отверстий, связывающих канал с "внешним" пространством, лишь немного больше белковой ос-спирали. Поэтому только белки с нарушением компактности третичной структуры, преимущественно линеаризованной формы, могут быть подвергнуты деградации по убиквитин-протеасомному пути.

20S субъединица приобретает функциональную способность гидролизовать белки только после присоединения к ней 19S субъединиц (РА 700), каждая из которых состоит, в свою очередь, из, по крайней мере,17 различных полипептидов. Белковые субъединицы РА700 формируют два структурно и функционально различающихся комплекса, называемых "lid"-и "base"- комплексами. "Lid''-комплекс состоит из 8 субъединиц (Rnp 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12), не обладающих АТФазной активностью, но отвечающих за распознавание и подготовку убиквитинированных субстратов к деградации и за взаимодействие с рядом непротеасомных белков (Ferrell et al., 2000). В состав "base"- комплекса входят, наряду с тремя регуляторными субъединицами (Rnp 1, 2, 10) шесть АТФаз (Rpt 1-6), участвующих как в АТФ-зависимом процессе объединения 20S и 19S субъединиц протеасомы, так и в гидролизе АТФ, сопровождающем несколько этапов деградации белков.

Основным субстратом 26 S протеасомы являются полиубиквити-нилированные белки (Hochshtrasser, 1996; Rock and Goldberg, 1999). Убиквитин - полипептид с высококонсервативной последовательностью, состоящий из 76 аминокислотных остатков. В эукариотических клетках существует, по меньшей мере, четыре различных типа убиквитин-протеин лигаз. Каждый отвечает за убиквитинирование субстрата, несущего определённые сигналы деградации (ими могут быть как первичные мотивы, так и вторичные пост-трансляционные модификации) (Schwarz and Ciechanover, 1999). В последовательности аминокислотных остатков убиквитина присутствуют семь остатков лизина, по каждому из которых может идти присоединение других молекул этого белка. Эти линейные и разветвлённые полиубиквитиновые цепи являются для протеасомы сигналом о том, что конъюгированные с ними белки должны быть деградированы (Hersko and Chiechanover, 1998; Baumeister et al., 1998) (Рис. 7).

Присоединение молекул(ы) убиквигииа к белкуф-Убиквитин( АТФПротеолго белкаРис. 7. Схема протеолиза белков по убиквитин-протеасомному пути деградации.

Полиубиквитин узнаётся одной из Кпр субъединиц РА 700 и заякоривается в ней, удерживая белок на протеасоме. В процессе деградации белка полиубшсвитиновые цепи высвобождаются и расщепляются до мономеров изопепти дазами.

Ингибиторы протеасом и их применение.

Изучение убиквитин-протеасомного пути привело к обнаружению целого ряда соединений различного происхождения, способных подавлять нормальное функционирование протеасом. Эти соединения получили собирательное название ингибиторов протеасом.

К числу наиболее изученных и эффективных ингибиторов протеасом можно отнести:- эпоксикетон эпоксомицин С28Н86^С>7 (а также его производное эпономицин С20НзбК2О5), выделенный из актиномицетов, - наиболееэффективный ингибитор протеасом из всех встречающихся в природе соединений этой группы (Meng et al., 1999 a, b). Его отличительной чертой также является крайне низкая токсичность для клеток (Hanada et al., 1992; Sugawara et al., 1990),- ингибитор протеасом PS 341 (C19H25BN4O4), полученный синтетическим путём. Исследования PS 341 показали стабильность этого соединения в физиологических условиях, а также сохранение его активности при внутривенном введении пациенту (Adams and Stein, 1996; Adams et al., 1998). Действие PS 341 при этом отличается высокой избирательностью.

Подавление функциональной активности протеасом ведёт к изменениям в механизмах регуляции жизненного цикла (Schwarz and Chiechanover, 1999), транскрипции (Palombella et al., 1994), протеолиза многих вирусных белков (Pamer and Cresswell, 1998), а также развития вирусных инфекций и опухолей. Таким образом, долговременное ингибирование протеасом приводит в конечном счёте к необратимым изменениям и гибели клеток.

Тем не менее, селективное и кратковременное применение ингибиторов протеасом может оказывать обратимое воздействие на клеточные процессы, которое может быть использовано в терапевтических целях. Так, был продемонстрирован in vitro цитотоксический эффект эпоксомицина на опухолевые клетки, а также индуцированное инъекциями эпоксомицина подавление развития меланомы и лейкемии у мышей (Hanada et al., 1992; Sugawara et al., 1990). Наряду с подавлением этим и другими (в том числе эпономицином и PS 341) ингибиторами протеасом развития разных форм рака и воспалительных процессов (Rivett and Çardner, 2000), был выявлен и антивирусный потенциал применения этих соединений.

49Например, недавно было описано подавление ингибиторами протеасом сборки, секреции и созревания вирусных частиц ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (Schubert et al., 2000а и b; Ott et al., 2000). Также была продемонстрировано значение убиквитин-протеасомного пути в репликации вирусов саркомы Рауса RSV (Patnaik et al., 2000), вируса иммунодеффицита обезьян SIV (Strack et al., 2000) и вируса Эбола (Harty et al., 2000). Конкретные механизмы взаимодействия вируса с протеасомами пока мало изучены. Данные результаты указывают и на возможную роль убиквитин-протеасомного пути в репликации Hepadnaviridae - основного объекта данной работы. До настоящего времени не было опубликованно почти никаких данных о воздействии ингибиторов протеасом или значении убиквитин-протеасомного пути в целом на развитие гепатита В. Исключение составляет сообщение о подавлении трансактивирующей функции X белка в результате ингибирования синтеза одной из субъединиц 26S протеасомы (Hu et al., 1999), а также данные о взаимодействии этого вирусного белка и с другими белковыми компонентами 26S протеасомы (Zhang et al., 2000).

Экспериментальная часть. I. МатериалыКоллекция сывороток крови птиц.

Основной целью первой части данной работы являлось обнаружение и характеристика новых вирусов гепатита В птиц. Решение поставленной задачи было непосредственно связано с проведением скрининга коллекции из 145 сывороток крови 41 вида птиц из национальных парков, зоопарков и ветеринарных клиник Германии и США (Табл. 1).

Реактивы.

Использованные в работе соли являлись коммерческим продуктом фирм "Merck", "Sigma", "Bio-Rad", "Serva" и имели на упаковке специалные отметки "высокая степень очистки" и "для аналитических целей". Бактериальные среды и растворы, использованные при проведении опытов, были приготовлены на воде, деионизованной с помощью прибора RO 35 TS-System фирмы Millipore.

АцетонАгар, бактоагар АгарозаАкриламид (30%) Акриламид (40 %) Ампициллин Бисакриламид (0,8%) Гибридизационный раствор QuickHyb Глицерин (87%) ГлицинДезоксинуклеотидтрифосфаты Диметилсульфоксид (DMSO) Дитиотриэтол (DTT) ДНК из спермы лосося Изопропиловый спирт КанамицинКраситель белков Ponceau S (З-Меркаптоэтанол Метиловый спирт Минеральное масло МовиолНеионный детергент Tween 20Buesing und Fasch, Oldenburg, ГерманияDifco, Detroit, США Sigma, Deisenhofen, Германия National Diagnostics, Atlanta, США Rotiphorese, Roth, Karlsruhe, Германия Boehringer, Mannheim, Германия National Diagnostics, Atlanta, СШАStratagene, Amsterdam, Нидерланды Merck, Darmstadt, Германия ICN Biochemicals, Aurora, США Promega, Madison, США Sigma, Deisenhofen, Германия Merck, Darmstadt, Германия Promega, Madison, США Merck, Darmstadt, Германия Serva, Heidelberg, Германия Sigma, Deisenhofen, Германия Merck, Darmstadt, Германия Merck, Darmstadt, Германия Sigma, Deisenhofen, Германия Hoechst, Frankfurt, Германия Serva, Heidelberg, ГерманияSigma, Deisenhofen, Германия Merck, Darmstadt, Германия Bio-Rad, Hercules, СШАBiochrom, Berlin, ГерманияNational Diagnostics, Atlanta, США Serva, Heidelberg, Германия Molecular Probes, Eugene, США ICN Biochemicals, Aurora, США Hartmann Analytic, Braunschweig, ГерманияAppligene, Германия Merck, Darmstadt, Германия Roche, Mannheim, Германия Roche, Mannheim, Германия Merck, Darmstadt, Германия Merck, Darmstadt, ГерманияСтандартные растворы:10 x PBS (фосфатно-солевой буфер) (рН 7,4):растворяли 80 г NaCl, 2 г КС1, 17,8 г Na2HP04x 2Н20, 2,4 г КН2Р04 в воде, подводили рН, после чего доводили конечный объём раствора до 1.000 мл водой и автоклавировали его.

10% SDS: растворяли 100 г SDS в Н20 и доводили конечный объём раствора до 1.000 мл.

5М NaCl: растворяли 292,2 г NaCl в Н20 и после доведения конечногообъёма раствора до 1.000 мл водой автоклавировали его.

10 х TBS: растворяли 60,5 г Tris, 87,6 г NaCl в Н20 и после доведенияконечного объёма раствора до 1.000 мл автоклавировали его.

0,5М EDTA (рН 8): растворяли 186,12 г №2ЭДТА х 2Н20 в Н20 подводилирН, после чего доводили конечный объём раствора до 1.000 мл водой иавтоклавировали его.

1М Tris (рН 6,8): растворяли 121.14 г Tris в Н20 подводили рН, после чего доводили конечный объём раствора до1.000 мл водой и автоклавировали его.

1,5М Tris (рН 8,8): растворяли 181,17 г Tris в Н20, подводили рН, после чего доводили конечный объём раствора до 1.000 мл водой и автоклавировали его.

Неионный детергент NP-40 Персульфат аммония (APS) Сухое молокоСыворотка эмбрионов крупного рогатого скота (FCS) Sequagel XR,Sequagel complete buffer reagentТетрациклинТрансферинTrisа-32Р-Уридинтрифосфат (UTP) ФенолФормальдегид (37%) FUGENE 6 Этидиумбромид Этиловый спиртЭтилендиамидтриацетат (EDTA)20 х (рН 7,0): растворяли 175,3 г хлорида натрия, 88,2% двуводного цитрата натрия в Н20, подводили рН, после чего доводили конечный объём раствора до 1.000 мл водой и автоклавировали его.

АнтителаПервичные антитела:(Fernholz, 1992) (H.Will, неопубликовано) (H.Will, неопубликовано) (H.Will, неопубликовано)DHBV PreS/Kpn I (кроличьи поликлональные) ННВУ PreS 0729 (кроличьи поликлональные) DHBV Core D-087 (кроличьи поликлональные) DHBV PreS (мышиные поликлональные) 900-1Вторичные антитела:Goat-anti-rabbit HRPO IgG(H+L) Антикроличьи козьи антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (Dianova, Германия)Goat-anti-mouse (Alexa Fluor 488) Антимышиные козьи антитела, коньюгированные с флюоресцентным красителем Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, США)Goat-anti-mouse (Alexa Fluor 594) Антимышиные козьи антитела, коньюгированные с флюоресцентным красителем Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, Eugene, CILLA)Goat-anti-rabbit (Alexa Fluor 488) Антикроличьи козьи антитела, коньюгированные с флюоресцентным красителем Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, США)Goat-anti-rabbit (Alexa Fluor 594) Антикроличьи козьи антитела, коньюгированные с флюоресцентным красителем Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, Eugene, США)Пластиковая и стеклянная посуда, другие материалыСтерилизирующий раствор Antifect Liquid Schuelke und Mayr,Norderstedt, Германия Стерильные пластиковые пипетки Greiner, Nürtingen, ГерманияПластиковые пробирки (1,5 мл и 2 мл) Культуральные матрацы (50 мл и 250 мл), культуральные чашки (60 мм) 12-ти луночные культуральные плашкиГибридизационный фильтр Hybond NКолонки G-25-SaulenНитроцеллюлозная мембрана ProtranСтерильные носики для пипеток Рентгеновская плёнка Kodak X-Omat XAR25 Бумага 3 ММ ВатманнЦентрифужные пробирки (15мл и 50 мл)Eppendorf, Hamburg, ГерманияBecton und Dickinson, Heidelberg, ГерманияAmershamPharmacia, Freiburg, ГерманияAmershamPharmacia, Freiburg, ГерманияSchleicher & Schnell, Dassel, ГерманияEppendorf, Hamburg, ГерманияEastman Kodak, Rochester, США Schleicher & Schuell, Dassel, ГерманияBecton und Dickinson, Heidelberg, ГерманияКоммерческие китыRapid DNA Ligation Kit,Qiagen Maxi Isolation Kit, Qiagen Mini Isolation Kit, QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen Blood extraction kit Ready prime Random Prime Labeling System,ECL Western Blotting Detection SystemSuper Signal West Dura Extended Duration Substrate Kit SequiTherm Long-Read Cycle Sequencing Kit-LC Expand Long Template PCR System Expand High Fidelity PCR System PCR Purification KitRoche Molecular Biochemicals, Mannheim, Германия Qiagen, Hilden, Германия Qiagen, Hilden, Германия Qiagen, Hilden, Германия Qiagen, Hilden, ГерманияAmershamPharmacia, Freiburg, ГерманияAmersham Pharmacia, Heidelberg, ГерманияPIERCE, ГерманияEpicentre Technologies, США Boehringer Mannheim, Германия Boehringer Mannheim, Германия Qiagen, Hilden, Германия♦Бактериальные штаммы, линии перевиваемых клеток и первичныекультуры клетокБактериальные штаммы:штамм E.coli DH5aЛинии перевиваемых клеток:LMH - линия иммортализованных клеток печени цыплёнка (Kawaguchi et al., 1987).

Первичные культуры клеток:ПГУ (PDH) - Первичная культура гепатоцитов утиных эмбрионов (Коеск and Schlicht., 1993; Bruns et al., 1998).

Культуральные и бактериальные среды Культуральные средыВсе компоненты, использованные для приготовления клеточных культуральных сред, произведены компанией GIBCO/BRL, Eggenstein, Германия.

В жидкую и твёрдую бактериальные среды при необходимости добавляли один из антибиотиков со следующей конечной рабочей концентрацией: канамицин 50 мкг/мл или ампициллин - 100 мкг/мл.

Ферменты Рестрикционные эндонуклеазы:Bgl I New England Biolabs, Schwalbach, СШАNot I New England Biolabs, Schwalbach, СШАSap I New England Biolabs, Schwalbach, СШАХеш I New England Biolabs, Schwalbach, СШАФерменты рестрикции использовались с соответствующими 10 х буфе-рами рестрикции той же фирмы-производителя.

ПриборыКамера для проведения агарозного гель-электрофорезаКамера для проведения полиакрила-мидного гель-электрофореза Прибор для проведения дот-блота ГерманияПроявитель Agfa Curix 60 Кассета для радиоавтографии Качалка Innova 4230 Магнитная мешалка Флюоресцентный микроскоп Zeiss Axiovert S-100 Конфокальный микроскоп Leica-TCSPeqLab Biotechnology, Erlangen, ГерманияAmersham, Freiburg, Германия Schleicher & Schoell, Dassel,PMA Bode, Hamburg, Германия Kodak, Stuttgart, Германия New Brunswick Scientific, США Ikamag Reo, ЯпонияZeiss, ГерманияConfocal Microscope Фотометр 3.000 pro Автоматические пипетки Автоматическая пипетка Labopet 240 Кварцевые кюветыАмплификатор RoboCycler Gradient 40 Термомиксер Настольная центрифуга 5415 СНастольная центрифуга 5415 RЦентрифуга с охлаждениемBiofuge FrescoВесыВодяная баня Ультрафиолетовая лампа Секвенатор 4000L Вакуумный концентраторLeica, Германия Pharmacia, Freiburg, Германия Eppendorf, Hamburg, Германия Greiner, Frickenhausen, Германия Hellma, Moellheim, Германия Stratagene, Нидерланды Eppendorf, Hamburg, ГерманияEppendorf, Hamburg, ГерманияEppendorf, Hamburg, ГерманияHereaus, Hannover, Германия Sartorius, Goettingen, Германия GFL, Burgwedel, Германия MWG-Biotech, Ebersberg, Германия MWG-Biotech, Ebersberg, Германия Bachofer, ГерманияКомпьютерные программыMac Vector 6.5.3 и 7.0Microsoft Power Point (Macintosh и PC)Microsoft Word (Macintosh и PC)Microsoft Excel (Macintosh и PC)Adobe Photoshop 6.0Tina Program 2.09dGenetyx Mac 9.0SplitsTree 2 ProgramAcrobat reader 5.0BAS Reader 2.9Пакет программ Base ImagIRPubMed (National libbrary of medicine) Web siteNCBI Blast Search ProgramExPasy Molecular Biology ServerNetOGlyc and DictyOGlyc glycosylation prediction programms NetPhos putative phosphorylation sites predictionИ. МетодыИммуноферментный анализ.

Для проведения анализа сывороток крови птиц на предмет содержания вирусных белков методом иммуноферментного анализа 1.0 мкл. сыворотки крови добавляли к инкубационной смеси, содержащей 39 мкл. PBS (8.1 мМ Na2HP04, 1.8 мМ КН2РО4, 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, pH 7.4), 20 мкл. 1 М DTT и 40 мкл. 2 х буфера Лэммли (Laemmli, 1970). Затем пробы кипятили в течение 5 мин. и центрифугировали на скорости 13000 тыс.об./мин. в течение дальнейших 5 мин. при комнатной температуре для удаления клеточного дебриса в настольной центрифуге. 20 мкл. супернатанта наносили на SDS-coдержащий (0,1%) 15% акриламидный гель и проводили фракционирование образца в геле в течение ночи. После этого белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Protran (Schleicher & Schuell) с помощью капиллярного переноса. Затем в течение 2 часов проводили блокирование мембран иммуноблота в 5% растворе порошкового молока в TBS (50 мМ TrisHCl, 150 MMNaCl).

Для анализа внутриклеточной экспрессии вирусных белков втрансфецированных LMH или инфицированных ПТУ клетки лизировали в200 мкл. буфера Лэммли, лизаты кипятили 5 мин. и центрифугировали нанастольной центрифуге на 13.000 тыс.об./мин. в течение 5 мин. прикомнатной температуре для осаждения клеточного дебриса. 20 мкл.супернатанта наносили на SDS-coдержащий (0,1%) 15% акриламидныйгель. Дальнейшие стадии анализа проводили по вышеописанной схеме сиспользованием тех же стандартных разведений указанных ранее антител.

Состав буфера Лэммли:Tris HCl (pH 6.8) 100 мМГлицерин 10 %10 % SDS 2 % Бромфеноловый синий 0,1%ß-Меркаптоэтанол 0,2 МПолимеразная цепная реакция (ПЦР).

Амплификацию полноразмерной геномной ДНК вируса из сыворотки крови птиц проводили в соответствии с протоколом Full-length Hot Start ПЦР амплификации (полноразмерной амплификации с предварительным нагреванием) (Netter et al, 1997). Сыворотку крови разводили 1:200-1:2000 в воде и непосредственно использовали как источник ДНК-матрицы при проведении реакции амплификации без предварительной экстракциивирусной ДНК. При проведении реакции использовали праймеры "полной амплификации" (full-length primers) STHBV, HHBV и DHBV sap+/sap-, применение которых позволяет амплифицировать полноразмерную длину ДНК генома соответствующих вирусов гепатита В (Рис. 8).

Рис. 8 Принцип амплификации полноразмерной геномной ДНК вируса гепатита В с использованием "sap+/sap- full-length"- праймеров на примере вируса серых цапель ННВ V.

При подготовке проб использовались компоненты стандартных коммерческих китов Expand High Fidelity PCR system (Boehringer Mannheim) или TAKARA-ExTaq (Takara).

При подготовке проб в каждую пробирку вносили реагенты в следующем соотношении:10 X ПЦР буфер 4,5 мкл.dNTP, 2,5 мМ 5,0 мкл.праймер 1,10 мкМ 1,5 мкл.праймер 2, 10 мкМ 1,5 мкл.

Н20 31,5 мкл.

ДНК или разведённая сыворотка крови 1,0 мкл.

Конечный объём пробы составлял 50 мкл.

Клонирование амплифицироваииой полноразмерной ДНК вирусов.

Лигирование.

К раствору ДНК вектора клонирования и вставки (амплифицированного вирусного генома), взятых в количественном соотношении 1 : 3 (20 нг : 60 нг, соответственно), в 1 х Буфере разведения общим объёмом 10 мкл добавляли 10 мкл. 2 х Буфера лигирования и 1 мкл.

Т4 ДНК лигазы, конечную смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течение 30 мин. при комнатной температуре. Все использованные в реакции реагенты - компоненты коммерческого кита Rapid DNA Ligation Kit (Roche).

Трансформация компетентных бактериальных клеток E.coli DH5-a.

Очищенные продукты ПНР амплификации использовали в качестве ДНК-матрицы при "прямом" определении последовательности нуклеотидов обеих цепей ДНК отдельных генов или полноразмерного генома вируса. Определение последовательности вирусной ДНК проводили по методу Сэнгера на секвенаторе фирмы MWG Biotech. Тот же протокол использовали и при прочтении последовательности клонированной вирусной ДНК. В последнем случае в качестве ДНК-матрицы служила выделенная из бактериальных клеток и очищенная плазмидная ДНК рекомбинантных вирусов. При проведении реакции использовали праймеры секвенирования, меченные флюоресцентной меткой (IRD), комплементарные к наиболее консервативным участкам ДНК генома известных гепаднавирусов птиц, а также разработанные специально для секвенирования новых вирусов гепатита В птиц: DHBV 301+ IRD, CHBV 361-IRD, CHBV 1638+IRD, CHBV 2790- IRD, RHHBV 702+ IRD, RHHBV 2222+ IRD, RHHBV 1924-IRD, RHHBV 2684- IRD, RHHBV 702+ IRD, SG 649+ IRD, SG 1071+ IRD, HHBV 1330-IRD, HHBV 2225-IRD, HHBV 1186+IRD, HHBV 314- IRD, HHBV 1962-IRD, HHBV 722+ IRD. Кроме того, при секвенировании клонированной вирусной ДНК использовали IRD-меченые праймеры M13fwd и M13rev, комплементарные к участкам ДНК вектора клонирования pXcmKnl2 (Netter et al., 1997). Секвенирование проводили с использованием реагентов коммерческого кита SequiTherm long read cycle sequencing kit (Epicentre Technologies) на приборах Li-Cor Model 4000 и Li-Cor Model 4000L (MWG Biotech), в то время как при обработке результатов использовали пакеты компьютерных программ Base ImaglR software set и Li-Cor Base ImaglR software set.

При подготовке проб использовали реагенты (полимеразу, 10 х Буфер и dNTP) из коммерческого кита SequiTherm Long-Read Cycle Sequencing Kit-LC (Epicentre Technologies). При приготовлении проб реагенты смешивали в следующем соотношении:Конечный объём смеси доводили Н20 до 17 мкл.

Затем в лунки 96-луночной плашки вносили по 2 мкл. G/A/T/C dNTP (дезоксинуклеотидтрифосфатов) из коммерческого кита и добавляли туда же 3,8 мкл. приготовленной реакционной смеси. На реакционную смесь в каждой лунке наслаивали минеральное масло.

10 х Буферпраймер секвенирования полимераза 5 ед./мкл. ДНК0,25 пикомольциклом)При фракционировании исследуемых проб использовали 5 %-ный акриламидный гель следующего состава:Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК геномов и последовательностей аминокислотных остатков белков известных и обнаруженных вирусов гепатита В птиц.

Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов ДНК геномов и последовательностей аминокислотных остатков белков известных и обнаруженных нами вирусов гепатита В птиц, а также установление филогенетических взаимосвязей между ними было проведено с помощью компьютерных программ Mac Vector 6.5.3 и 7.0, Genetyx Mac 9.0, и NCBI Blast Search Program. Установление филогенетических взаимоотношений представителей Avihepadnavirnses с помощью программы SplitsTree 2 program (Bandelt and Dress, 1992; Dress et al., 1996) было проведено совместно с сотрудниками Билифельдского университета (Билифельд, Германия).

Подготовка полноразмерной геномной ДНК вирусных клонов для трансфекции LMH клеток.

Для гидролиза ДНК вирусных клонов рестрикционнымиэндонуклеазами использовали смесь следующего состава:Буфер рестрикции NEB 4 5 мкл.

Плазмидная ДНК 10 мкг.Sap I (2 ед/мкл) 5 мкл.Bgl I (5 ед/мкл) 2 мкл.

Т4 ДНЕС-лигаза 1 мкл. (400 ед./мкл.)Н2О 66,6 мкл.

Конечный объём: 100 мкл.

Для использования в трансфекции конечный объём реакционной смеси понижали до 10 мкл. с помощью вакуумного концентратора Vacuum concentrator (Bachofer).

Трансфекция LMH клеток.

В качестве положительного контроля опыта проводили трансфекцию клеток 4 мкг. ДНК плазмиды pDHBV16t, содержащей тандем геномной ДНК вируса DHBV16. После 14 часов инкубации клеток в среде, содержащей вирусную ДНК, клетки тщательно промывали несколько раз в PBS, приливали к ним новую культуральную среду и инкубировали в течение последующих 2-4 дней. Эффективность трансфекции оценивали визуально по уровню экспрессии зелёного флюоресцентного белка (GFP).

Для трансфекции LMH клеток использовали смесь следующих компонентов:Вирусная ДНК (линейная или кольцевая) 10 мкл. (2,5 мкг.)*Конечный объём: 100 мкл.* При использовании модифицированного протокола подготовкивирусной ДНК к трансфекции реальное количество ДНЗС, используемой притрансфекции, составляло за счёт ДНК фрагментов вектора около 5 мкг.

Первичную культуру гепатоцитов уток получали перфузией печени 21-дневных эмбрионов уток 0,5% раствором коллагеназы (Sigma, Deisenhofen) в культуральной среде William's medium Е (GIBCO/BRL). Приготовленные, согласно стандартному протоколу (Bruns et al.,1998),ДНК pEGFP-Cl FugeneКультуральная среда1 мкл. (0,5 мкг.) 18 мкл. 71 мкл.

Инфекция первичной культуры гепатоцитов уток.гепатоциты рассевали на 12-луночные плашки. Спустя 2-3 дня проводили инфекцию путём прямого переноса вирус-содержащих культуральных сред трансфецированных LMH клеток на культуры гепатоцитов. Параллельно проводили инфекцию гепатоцитов добавлением в их культуральную среду аликвот (5-10 мкл.) исходных вирус-содержащих сывороток крови инфицированных птиц. Спустя 14 часов вирус-содержащую культуральную среду отбирали, гепатоциты отмывали трижды в PBS, после чего добавляли к ним новую, свободную от вируса культуральную среду. Спустя ещё 3 дня дальнейшей инкубации клетки лизировали в буфере Лэммли для дальнейшего анализа или же фиксировали смесью метанола и ацетона в соотношении 1:1 для дальнейшего анализа методом непрямой иммунофлюоресценции.

Анализ вирусной ДНК по методу Саузернаа) приготовление проб для гибридизации.

Вирусная ДНК была экстрагирована из внутриклеточных вирусных частиц трансфецированных LMH клеток, из вирусных частиц, секретируемых из этих клеток в культуральную среду и осаждённых из неё центрифугированием с 8% полиэтиленгликолем (ПЭГ), а также из вирусных частиц из исходных сывороток крови инфицированных птиц. Экстракция вирусной ДНК проводили, согласно следующему протоколу:б) экстракция ДНК из вирусных частиц.

1. Для экстракции вирусной ДНК приблизительно 1,5 млн. LMH клеток (1/2 трансфецированных клеток, собранных с одной лунки шестилуночной культуральной плашки), инкубировали на льду в течение 20-25 мин. с 0,5 мл. лизисного буфера, содержащего неионный детергент NP-40 (50 мМ Tris х HCl, 10 мМ ЭДТА, 1 % NP40).

2. Осаждали дебрис лизированных клеток центрифугированием при 13000 об./мин. в течение 1 мин. в настольной центрифуге при комнатной температуре.

6. Добавляли к смеси равный объём водонасыщенного фенола, тщательно перемешивали и центрифугировали 5 мин. в настольной центрифуге при 13000 об./мин. до полного разделения фаз при комнатной температуре.

7. Отбирали водную фазу и добавляли к ней равный объём смеси фенола и хлороформа (в соотношении 1:1), тщательно перемешивали и центрифугировали 5 мин в настольной центрифуге при 13000 об./мин. до полного разделения фаз.

8. Отбирали водную фазу и добавляли к ней равный объём хлороформа, тщательно перемешивали и центрифугировали 5 мин. в настольной центрифуге при 13000 об./мин. до полного разделения фаз.

После удаления супернатанта промывали осадок 70% этиловымспиртом. После высыхания осадок растворяли в воде и после добавлениясоответствующего объёма буфера нанесения наносили пробу в лунки 1,5 %агарозного геля для её фракционирования согласно стандартному протоколу, проведения анализа по методу Саузерна (Sambrook et al, 1989).

При экстракции геномной ДНК вирусных частиц из культуральной среды этапы 1-3 не нужны.в) краткое описание блот-гибридизационного анализа.

Стандартный протокол анализа ДНК по методу Саузерна (Sambrook et al., 1989) включает в себя электрофорез ДНК- проб, перенос их на фильтр с помощью капиллярного переноса, гибридизацию фильтра с меченым радиоактивным ДНК-зондом и радиоавтографию. Метод позволяет обнаружить ДНК, содержащую участки, комплементарные одной из цепей ДНК-зонда, а также определить её размер.

После фракционирования проб электрофорезом в 1.5% агарозном геле вирусную ДНК денатурировали в щелочном растворе (1,5 М NaCl, 0,5 М NaOH). Затем ДНК-содержащий агарозный гель последовательно отмыли в нейтрализующем растворе (1М TrisHCl, 1,5 М NaCl) и Н20. ДНК была перенесена на мембрану Hybond-N (Amersham LIFE SCIENCE) с использованием капиллярного переноса в течение ночи. Иммобилизация ДНК на фильтре была осуществлена с помощью облучения ультрафиолетом.

Для детекции ДНК-сигналов проводили гибридизацию фильтра с ДНК-зондом - 32рмеченой плазмидой pDHBV16t, содержащей тандем геномной ДНК вируса DHBV16. Мечение плазмидной ДНК проводили с использованием реагентов коммерческого кита Readyprime Random Prime Labeling System (Amersham LIFE SCIENCE), согласно протоколу производителя.

Анализ внутриклеточной экспрессии вирусных белков методом непрямой иммунофлюоресценции.

1. Анализ коллекции из 145 сывороток крови 41 видов птиц.

В ходе работы был проведей анализ коллекции сывороток крови птиц из национальных парков, зоопарков и ветеринарных клиник Германии и США.

Первичный анализ 145 образцов коллекции методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к белку PreS оболочки вируса гепатита В уток и серых цапель, а также к вирусному е-антигену DHBV выявил вирусные белки в 32 образцах сывороток крови птиц 9 видов (Табл. № 1).

Анализ образцов коллекции методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами DHBV sap+/sap-, HHBV sap+/sap- и STHBV sap+/sap-, комплементарными к консервативным последовательностям справа и слева от "nick''-области ДНК генома вируса уток, серых цапель и белых аистов, соответственно, выявил присутствие вирусной ДНК в тех же 32 образцах сыворотки, содержащих, согласно результатам иммуноблоттинга, вирусные белки. В качестве матрицы для амплификации была использована вирусная ДНК из образцов сывороток крови, разведённых в воде 1/200-1/2000. Предварительную экстракцию вирусной ДНК из сывороток крови птиц не проводили. Для амплификации ДНК из разных образцов сывороток были использованы её разные эмпирически подобранные разведения, что объясняется разным содержанием клеточных факторов, ингибирующих эффективную амплификацию, в различных образцах сывороток (Netter et al., 1997).

Таким образом, первичный анализ образцов коллекции сывороток крови птиц выявил присутствие вирусных белков и ДНК в сыворотках крови больших белых и больших голубых цапель {Ardeas heroidasoccidentalis и Ardeas heroidas, соответственно), белых и черных аистов {Ciconia ciconia и Ciconia nigra), представителей семейства утиных -разноцветного чирка Anas versicolor и роскошной свиязи Anas sibilatrix, красноголового гуся (Chloephaga rubidiceps), а также в образцах сывороток нескольких особей серого венценосного журавля и журавля-красавки (Baleatrica regulorum и Arthropoides virgo) (Табл. 2).

Для более точного определения природы обнаруженных вирусов в каждом случае была установлена последовательность нуклеотидов обеих цепей участка вирусной ДНК, кодирующей PreS белок вирусной оболочки. Ген PreS белка является наиболее вариабельным участком ДНК генома вируса гепатита В, поэтому сравнительный анализ его последовательности разных изолятов вируса является стандартным подходом при оценке их филогенетических отношений. (Последовательность гена PreS белка является своего рода "визитной карточкой" вируса.) При проведении секвенирования в качестве ДНК-матрицы были использованы продукты прямой амплификации вирусной ДНК из сыворотки с sap+/sap- праймерами.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена PreS белка вирусов, обнаруженных в проанализированных образцах сывороток, дал следующие результаты:1. Впервые выявлено наличие известных вирусов гепатита В в сыворотках крови птиц, случаи заражения которых вирусами - представителями семейства Hepadnaviridae никогда не были зарегистрированы ранее: а) вирус гепатита В серых цапель HHBV впервые обнаружен в образцах сывороток крови большой белой и большой голубой цапель {Ardeas heroidas occidentalis и Ardeas heroidas). Все вирус-содержащие сыворотки получены из крови диких птиц, таким образом, впервыеполучено доказательство существования вируса HHBV в природных резервуарах;б) впервые показана возможность заражения разноцветного чирка Anas versicolor и роскошной свиязи Anas sibilatrix вирусом гепатита В утки DHBV (Duck Hepatitis В Virus), обнаруженным ранее у других представителей семейства утиных;в) получено дополнительное, независимое подтверждение существования в популяции диких белых аистов (Ciconia ciconia) вируса STHBV (Stork Hepatitis В Virus), характеристика которого еще не была завершена на момент получения описываемых данных. Впервые зарегистрирован случай инфекции этим вирусом черного аиста (Ciconia nigra).

2. Новые представители Avihepadnaviruses обнаружены в сыворотках крови птиц, инфицирование которых вирусами гепатита В никогда не было зарегистрировано ранее:а) в образцах сыворотки крови нескольких особей серого венценосного журавля (Baleatrica regulorum) и журавля-красавки (Antropoides virgo) обнаружен новый вирус, получивший название Вируса Гепатита В Журавлей CHBV (Crane Hepatitis В Virus);б) в сыворотке крови красноголового гуся {Chloephaga rubidiceps) обнаружен неизвестный ранее представитель группы вирусов гепатита В птиц, названный Вирусом Гепатита В красноголового гуся RHHBV (Ruddy-headed Goose Hepatitis В Virus).

Основной задачей следующего этапа работы стал структурнофункциональный анализ новых вирусов - представителейAvihepadnaviruses - CHBV, RHHBV и STHBV.

2. Обнаружение и характеристика вируса гепатита В журавлей CHBV.

Из трёх новых вирусов вирус гепатита В журавлей CHBV, обнаруженный в образцах сывороток крови нескольких представителей отряда птиц Gruiformes, представлял для нас наибольший интерес. До настоящего момента случаев заражения представителей этого отряда птиц вирусами гепатита В зарегистрировано не было. Таким образом, обнаружение вируса CHBV и результаты его изучения значительно расширяет наши представления о распространении и природе вирусов гепатита В птиц.

В силу того, что наше внимание было в первую очередь сконцентрировано на вирусе журавлей CHBV, большинство методов и их модификаций, применённых в ходе исследований, было разработано и опробовано в ходе описания именно этого вируса. Вследствие этого подробное описание применённой стратегии и методов исследования новых вирусов приведено в данной работе на примере вируса гепатита В журавлей. Характеристика вирусов гепатита В красноголового гуся и белых аистов осуществлялась по той же схеме.

Обнаружение вирусных белков в сыворотках крови журавлейметодом иммуноблоттинга.

В ходе первичного анализа были исследованы методом иммуноблоттинга образцы сыворотки крови 3-х серых венценосных журавлей (Baleatrica regulorum), 4-х журавлей-красавок (Arthropoides virgo), 2-х журавлей Стэнли (Arthropoides paradisea), 2-х манжурских журавлей (Grus japonensis) и одного канадского журавля {Grus canadensis). Инкубациямембраны иммуноблота с поликлональными антителами к РгеБ белку оболочки вируса гепатита В утки (ЛНВУ РгеЭ Крп I) или серой цапли (ННВУ РгеБ 0729) привела к появлению иммуноспецифических сигналов, соответствующих по молекулярной массе белкам оболочки вирусов ЭНВУ и/или ННВУ в положительном контроле, в случае образцов сыворотки крови нескольких особей серого венценосного журавля (образцы сыворотки крови № А654, № А780 и № 6) и журавля-красавки (образцы сыворотки крови № 1,2 и 5) (Рис. 9).

Специфичность полученных сигналов подтверждается отсутствием таковых в негативном контроле. Интенсивность сигналов в случае образцов сывороток крови серых венценосных журавлей была значительно выше по сравнению с сыворотками крови журавлей-красавок вне зависимости от того, какие антитела, ОНВУ РгеЭ или ННВУ РгеБ, применялись прианализе. Этот факт может объясняться как разным уровнем перекрёстного взаимодействия применённых антител с вирусными антигенами, так и разным уровнем синтеза белка оболочки у обнаруженных вирусных изолятов. Абсолютная интенсивность сигналов в случае обоих изолятов была выше при использовании антител к белку оболочки вируса DHBV.

Параллельно с этим был проведён иммуноферментный анализ тех же образцов с поликлональными антителами к Core белку вируса DHBV (DHBV Core D-087), перекрёстно реагирующими и с е-антигеном вируса. В случае иммуноферментного анализа образцов сыворотки крови серых венценосных журавлей (образцы № А654, № А780 и № 6) и журавлей-красавок (образцы № 1, 2 и 5) с этими антителами были выявлены три основных иммуноспецифических сигнала, в то время как в остальных образцах и в этом случае вирусные белки обнаружить не удалось (Рис. 10).

ВД40— 3020Рис. 10. Обнаружение е-антигена в сыворотках крови серых венценосных журавлей (образцы 1-5) и журавлей-красавок (6-9). Вирус-содержащую и свободную от вируса сыворотки крови серых цапель (10 и 11, соответственно) использовали в качестве контролей. Иммуноблотгтинг-анализ проведён с использованием поликлональных антител к Core белку капсида вируса уток DHBV.

Два обнаруженных сигнала соответствовали, по-видимому, сигналам моно- и дигликозилированной форм е-антигена HHBV в положительном контроле (Schlicht et al., 1987; Schneider et al., 1991), в то время как третий сигнал (белка с более низкой электрофоретической мобильностью)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1185принадлежал какой-то ещё гликозилированной или негликозилированной форме е-антигена.

Таким образом, результаты первичного анализа методом иммуноблоттинга свидетельствуют о наличии вирусных белков в 7 из 13 проанализированных образцов сывороток крови журавлей.

Детекция вирусной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В дополнение к иммуноблоттинг-анализу, выявившему наличие вирусных белков, и ПЦР-амплификации, показавшей присутствие вирусной ДНК в тех же образцах сыворотки крови журавлей, был проведен анализ сывороток крови журавлей с использованием электронной микроскопии.

Анализ образцов сывороток крови был проведён доктором X. Хохенбергом (Институт экспериментальной вирусологии и иммунологии, Гамбург) в соответствии с разработанным им протоколом (Hohenberg Н., 1994) на электронном микроскопе Philips СМ 120. Вирусные частицы фиксировали на микроносителях, покрытых смесью иммуноглобулинов к PreS белкам вирусов DHBV и HHBV, и затем после получения ультратонких срезов исследуемых образцов исследовали с помощью электронной микроскопии. Электронная микроскопия выявила присутствие вирусных частиц со средним диаметром 40 нм. в тех же образцах сыворотки крови журавлей, которые содержали, согласно результатам предыдущих экспериментов, вирусные белки и ДНК (Рис. 12). Диаметр и морфологияобнаруженных вирусных частиц схожи с таковыми вирусных частиц ОНВУ и ННВУ в положительном контроле.

Рис. 12. Электронная микрофотография вирусных частиц, обнаруженных в сыворотке крови серых венценосных журавлей.

Таким образом, все три применённые метода исследования (иммуноферментный анализ, ПНР-анализ и электронная иммуномикроскопия) дали независимое подтверждение наличия вирусного агента в указанных образцах сывороткок крови нескольких особей венценосных журавлей и журавлей-красавок.счОпределение нуклеотидной последовательности ДНК генома обнаруженного вируса.

Для дальнейшей характеристики обнаруженного вируса и оценки степени его родства с известными вирусами гепатита В птиц было необходимо определить нуклеотидную последовательность ДНК его генома. Достаточное для проведения дальнейших исследований количество ДНК полноразмерного вирусного генома было получено в ходе двух независимых амплификаций вирусной ДНК из двух сывороток крови серых венценосных журавлей и двух сывороток крови журавлей-красавок,проведённых с использованием STHBV sap+/sap- праймеров. После очистки продуктов амплификации вирусной ДНК величиной в 3 т.п.н. определение последовательности нуклеотидов проводили с использованием IRD-праймеров секвенирования, меченных флюоресцентной меткой: DHBV 301+ IRD, CHBV 361-IRD, CHBV 1638+IRD, CHBV 2790- IRD, RHHBV 702+ IRD, RHHBV 2222+ IRD, RHHBV 1924-IRD, RHHBV 2684- IRD, RHHBV 702+ IRD, SG 649+ IRD, SG 1071+ IRD, HHBV 1330-IRD, HHBV 2225-IRD, HHBV 1186+IRD, HHBV 314- IRD, HHBV 1962-IRD, HHBV 722+ IRD (см. разделы "Материалы" и "Методы" данной работы).

Кроме того, чтобы исключить гипотетическую возможность введения искусственных мутаций в последовательность продуктов амплификации вирусной ДНК, что возможно по ряду причин (Netter et al.,1997), была проведена дополнительная амплификация участка ДНК вирусных изолятов, содержащего так называемую "nick''-область генома. Продукты этой амплификации, проведённой с праймерами CCHBV 2183+ и CCHBV 2852-, комплементарными нуклеотидным последовательностям справа и слева от этой области, были также подвергнуты очистке и последующему прямому секвенированию.

Сравнительный компьютерный анализ последовательности нуклеотидов геномной ДНК обнаруженных вирусов, а также предсказанной последовательности аминокислотных остатков их белков, продемонстрировал их большое сходство, но не идентичность, с аналогичными последовательностями ранее описанных представителей Avihepadnaviruses.

Сравнение последовательности нуклеотидов вирусной ДНК, выделенной из сывороток крови венценосных журавлей и журавлей-красавок, выявило небольшое количество различий между ними,характерное для изолятов одного вируса, выделенных из разных особей животного-носителя. Определённая гетерогенность последовательности нуклеотидов ДНК изолятов служит подтверждением независимого инфицирования различных особей журавлей новым вирусом. Тот факт, что исследуемые образцы сывороток крови журавлей были получены из разных источников (см. Табл.1), является аргументом в пользу того, что заражение вирусом произошло ещё в дикой природе, а не в неволе, и полученные результаты не являются, тем самым, результатом контаминации какого-либо рода.

В дальнейшем в качестве основного объекта изучения использовался изолят вируса из сыворотки крови серых венценосных журавлей CCHBV (Crowned Crane Hepatitis В virus). Сравнительный компьютерный анализ полной геномной последовательности вируса выявил наибольшее сходство CCHBV с вирусами RGHBV (уровень гомологии 84%), DHBV (83%) и SGHBV (83%). Согласно результатам этого анализа, вирусы гепатита В белого аиста STHBV и серой цапли HHBV несколько более эволюционно удалены от CCHBV - 79% и 77%, соответственно. Большая часть уникальных последовательностей генома CCHBV (делеции, вставки и точечные мутации), отличающих его от других Avihepadnaviruses, находятся в районе гена PreS белка вирусной оболочки - наиболее вариабельного участка генома вирусов гепатита В птиц.

Основываясь на данных сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов ДНК геномов вирусов, был сделан вывод об обнаружении неизвестного ранее представителя семейства Hepadnaviridae, инфицирующего серых венценосных журавлей (изолят CCHBV) и журавлей-красавок (изолят DCHBV), представителей отряда птиц Gruiformes, названного СНВV (Cranes Hepatitis В Virus).

Необходимо подчеркнуть, что сама возможность заражения представителей отряда птиц Gruiformes вирусом гепатита В была показана впервые.

Клонирование ДНК генома вируса журавлей СНВУ.

В ходе дальнейших опытов амплифицированную с помощью STHBV sap+/sap- праймеров полную геномную ДНК вируса клонировали в вектор pXcmKnl2 (Netter et al.,1997). Продукты клонирования после этого использовали при трансформации штамма бактерий E.coli DH5a. Амплифицированную таким образом рекомбинантную ДНК впоследствии выделили из бактерий и очистили. Отобранные по результатам рестрикционного анализа клоны CCHBV 1, CCHBV 2 и CCHBV 3 использовали в ходе последующих опытов. Необходимо отметить тот факт, что клон CCHBV 1 и клоны CCHBV 2 и CCHBV 3 были получены в результате клонирования вирусной ДНК, амплифицированной из сывороток крови двух разных особей венценосного журавля (образцы А 654 и А 780, соответственно). Для каждого из этих трех клонов установили полную последовательность нуклеотидов обеих цепей ДНК. Причём при секвенировании использовали как IRD-праймеры, комплементарные последовательности ДНК клонированного вирусного генома (см. выше), так и IRD-праймеры М13+ и М13-, имеющие гомологию с последовательностями участков вектора pXcmKnl2, расположенными справа и слева от сайта клонирования (Netter et al.,1997). Сравнительный анализ последовательностей ДНК клонированных вирусных геномов выявил существование различий между ними в 95 участках (данные не приведены). Сравнение полной последовательности геномной ДНК с данными проведённого параллельно определения последовательности нуклеотидов продукта амплификации участка вирусного генома,содержащего "nick''-область, продемонстрировало отсутствие каких-либо дополнительных искусственно введённых мутаций в этом регионе.

Показательно, что положение гетерологичных участков ДНК клонированных геномов совпадает с таковым продуктов прямой амплификации вирусной ДНК из сывороток, выявленным при их секвенировании. Иными словами, клоны репрезентативны по отношению к соответствующим изолятам вируса из разных образцов. Полученные результаты также согласуются с данными о сравнительно низком уровне гетерогенности последовательностей ДНК клонов вирусов DHBV (Schoedel et al., 1991) и SGHBV (Chang et al., 1999), а также с результатами прямого секвенирования ДНК генома изолятов HHBV, выделенных из различных сывороток (Netter et al.,1997).

Последовательности нуклеотидов геномной ДНК клонов CCHBV 1, CCHBV 2 и CCHBV 3 помещены в информационный банк данных EMBL GenBank под номерами AJ441111, AJ441112, AJ441113, соответственно. Клон CCHBV 1 был выбран в качестве репрезентативного: данные о последовательности нуклеотидов ДНК его генома и последовательности аминокислотных остатков его белков использовали в дальнейшем при проведении сравнительного анализа вирусов гепатита В птиц (последовательность нуклеотидов ДНК генома клона CCHBV 1 вируса приведена в Приложении 1; предсказанная последовательность аминокислотных остатков белков клона CCHBV 1 приведена в Приложении 2).

58 из 95 выявленных различий в последовательности нуклеотидов геномной ДНК клонов не ведут к появлению аминокислотных замен. 37 ведут к замене аминокислот в Р-белке, причём только 7 из них консервативны, 6 - к замене в последовательности аминокислот PreS-домена L белка (2 из 6 замен консервативны) и одна - к неконсервативной замене впоследовательности S-домена L белка. Практически ни одна из этих замен не изменяет последовательности структурно-функциональных элементов белков, охарактеризованных как необходимые или важные для эффективной репликации и транскрипции на примере вируса DHBV. Последовательность этих структурно-функциональных элементов консервативна и у других описанных вирусов гепатита В птиц. Последовательности таких важных функциональных элементов, как DR1 и DR2, или уникального сайта полиаденилирования PAS консервативны у всех Avihepadnaviruses. Последовательность e-сигнала инкапсидирования геномной РНК вируса CHBV схожа с таковой RGHBV. Последовательность второго сигнала инкапсидирования, изученного на примере вируса утки DHBV (Calvert and Summers, 1994), одинакова у всех клонов вируса журавлей, но отличается от таковой других вирусов гепатита В птиц. Последовательности донорного и акцепторного сигналов сплайсинга, необходимых для сплайсинга первичного транскрипта и эффективной репликации вируса in vivo (Obert et al., 1996), также консервативны у CHBV. Нуклеотидные последовательности трёх участков связывания факторов транскрипции (С/ЕВР, HNF1 и HNF3), расположенные в регионе вирусного энхансера (Lilienbaum et al., 1993; Liu et al., 1994), а также последовательности вирусного промотора (ов) консервативны у CHBV и RGHBV, но отличаются от таковых STHBV и ННВ V. Особенностью вируса журавлей CCHBV является существование трёх аминокислотных замен в последовательности РХ (S/T) региона PreS белка (Приложение 2).

Сравнительный анализ геномной последовательности вирусов гепатита В птиц.

Анализ геномной последовательности репрезентативного клона CCHBV 1 с помощью сетевой поисковой программы Blast Search выявилследующие изоляты А уИаерас1пау1гизез как наиболее схожие с вирусом гепатита В журавлей на этом уровне: 1ЮНВУ, БОНВУ 15, ОНВУ 16, ННВУ 4 и БТНВУ 21. Последовательности геномной ДНК и белков этих изолятов вирусов гепатита В птиц использовались в дальнейшем в ходе сравнительного анализа (Приложение 1 и 2). Длина генома ССНВУ 1 составляет 3021 п.н. - на 3 п.н. длиннее, чем последовательность генома ЬЮНВУ, обладающего наиболее высоким уровнем гомологии с СНВУ. В целом, отличие вирусов гепатита В птиц по длине геномной ДНК в основном определяется гетерогенностью последовательности её РгеБ-кодирующего региона. Принято считать, что высокая вариабельность этого домена связана с ролью РгеЭ белка в определении круга хозяев вируса, тропизма вирусной инфекции, а также существенна для взаимодействия с клеточными рецепторами.

Результаты сравнительного анализа полной последовательности ДНК и организации генома вирусного репрезентативного клона ССНВУ 1 полностью совпали с данными, полученными ранее при первичном сравнительном анализе последовательности вирусной геномной ДНК из сыворотки крови: вирус гусей Росса ЬЮНВУ наиболее близок к СНВУ-уровень гомологии составляет 84 %, в то время как для обоих вирусов ЗОНВУ 15 и ОНВУ 16 этот показатель составляет 83 %, для БТНВУ 21 -79 % и для ННВУ 4-77 %.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностейбелков вирусов гепатита В птиц.

Наряду со сравнением последовательности нуклеотидов ДНК геномов АугкераЗпауЬгтез, был проведён и сравнительный анализ предсказанных последовательностей аминокислот кодируемых вирусных белков. Проведённое исследование показало, что наибольшим сходством с вирусомгепатита В журавлей и на этом уровне обладает вирус RGHBV, в то время как STHBV и HHBV обладают наименьшим уровнем гомологии с CHBV.

Наиболее показательным в этом отношении является сравнительный анализ PreS домена - наиболее вариабельной аминокислотной последовательности вируса. Именно в последовательности белка вирусной оболочки, а также в частично перекрывающимся с ним спэйсерном участке Р-белка находится большинство аминокислотных замен, имеющих в абсолютном большинстве случаев неконсервативный характер. В этой связи необходимо особо отметить факт наличия короткой вставки, состоящей из трёх аминокислотных остатков (РМК) в регионе PreS белка CHBV (аминокислотные остатки 22-37), участвующем, согласно современным представлениям, в определении спектра хозяев вируса. Интересно, что в то время как в последовательности данного участка PreS белка вирусов HHBV и STHBV подобная (отличающаяся, правда, по аминокислотному составу) вставка также присутствует, у гепаднавирусов уток и гусей её нет. При этом с вирусами гепатита В уток и гусей вирус CHBV объединяет миристилирование второй аминокислоты (глицина) PreS белка. Вирусы HHBV и STHBV отличаются расположением такого сигнала миристилирования в S домене L белка. Миристилирование PreS белка DHBV играет важную роль при инфицировании первичных культур гепатоцитов уток (Macrae et al., 1991). Кроме того, нельзя не упомянуть уникальность 6 аминокислотных замен в участке PreS белка (аминокислоты 30-115), обладающем сродством к одному из основных кандидатов на роль клеточного рецептора вируса гепатита В - белку gpl80. Также обращают на себя внимание два аминокислотных остатка (126 и 127 у CHBV), присутствующие только у вирусов CHBV и RGHBV. Представляется логичным предположить, что, по-крайней мере, часть вышеупомянутых уникальных аминокислот в PreS домене L белка существенна длявзаимодействия вируса гепатита В с клеточным рецептором(ами) и играет роль в определении круга хозяев вируса.

По аналогии с HHBV и STHBV у CCHBV 1 отсутствует (а точнее мутирован) PX(S/T) мотив, присутствующий в PreS домене вирусов DHBV, SGHBV и RGHBV. На примере вируса уток DHBV было показано, что фосфорилирование PX(S/T) мотива имеет важное значение для трансактивационной активности PreS белка (Borel et al., 1998; Rothmann et al., 1998). Необходимо отметить, что в составе PreS белка двух других клонов вируса журавлей (CCHBV 2 и CCHBV 3) PX(S/T) мотив присутствует.

В отличие от PreS домена, S белок вирусной оболочки характеризуется высоким уровнем консервативности у всех вирусов гепатита В птиц. Аминокислотная последовательность S белка CHBV, содержащая только несколько консервативных замен, не является в этом отношении исключением. В составе S белка CHBV обнаружено только 4 уникальных аминокислотных замены.

РгеС/С кодирующая последовательность также высоко консервативна у всех известных Avihepadnaviruses. Наиболее вариабельным её участком является так называемая "птичья вставка" (large avian insertion domain), отсутствующая в последовательности белка капсида всех вирусов гепатита В млекопитающих. Последовательность hhr (hydrophobic heptad repeat) домена, необходимого для димеризации Core капсидных белков и окончательной сборки самого кансида вируса (Yu et al., 1996), высоко консервативна у всех вирусов гепатита В птиц.

РгеС/С непроцессированный белок-предшественник CHBV содержит 3 потенциальных сайта гликозилирования. Последовательность одного из этих сайтов, наиболее близко расположенного к N-терминальному концу, присутствует у всех вирусов группы. Другой потенциальный сайтгликозилирования, расположенный в С-терминальном участке РгеС/С последовательности CHBV, присутствует только у вирусов STHBV и HHBV, в то время как последовательность третьего сигнала, расположенного в "Thr/ pro kinase" - домене С белка, является общей для вирусов CHBV, RGHBV и STHBV.

Три из четырёх потенциальных сайтов фосфорилирования (SPXX), значение которых для регуляции функций Core белка было показано на примере DHBV (Yu and Summers, 1994), также присутствуют и в структуре С-терминального домена капсидного белка CHBV. Последовательность недавно описанного "Thr/ pro kinase" мотива, присутствующего в структуре Core белка всех известных Avihepadnaviruses (Barrasa et al., 2001), а также сигнала ядерной локализации NLS, описанного впервые для Core белка DHBV (Mabit et al., 2001), также обнаружена и у CHBV.

Последовательность аминокислотных остатков Р-белка высоко консервативна у всех Avihepadnaviruses, включая и CHBV. Исключение составляет нефункциональный спейсерный домен Р-белка, кодирующая последовательность которого частично перекрывается с геном PreS белка. Большинство аминокислотных замен Р-белка вируса журавлей сосредоточено именно в этом регионе. Остаток тирозина в терминальном домене TP Р-белка, также как и последовательности, определяющие обратную транскрипционную и РНКаза Н активности Р-белка, строго консервативны у CHBV, так же как и у других гепаднавирусов птиц.

В геноме CHBV выявлена потенциальная открытая рамка считывания Х-белка длиной 246 п.н. (максимальная величина Х-белка CHBV может составлять, таким образом, 81 аминокислотный остаток). Также, как и в случае вируса DHBV, канононический ATG-инициаторный кодон трансляции в её последовательности отсутствует. Действительно ли происходит экспрессия Х-белка (как это было экспериментально показанодля вируса DHBV (Chang et al., 2001)), предстоит ещё выяснить. Если синтез Х-белка действительно происходит, то, возможно, и этот вирусный белок участвует во взаимодействии с клеточными рецепторами и определении круга хозяев вируса CHBV.

Таким образом, был проведен сравнительный анализ последовательности геномной ДНК клонов CHBV, а также предсказанной последовательности аминокислот кодируемых ими белков и их первичная характеристика. При этом не было выявлено ни одной модификации, которая бы могла вести к преждевременному прекращению трансляции белков, синтезу их дефектной или укороченной формы ни для одного из отобранных клонов. На основании компьютерного анализа последовательности нуклеотидов геномной ДНК вирусных клонов, а также предсказанных последовательностей аминокислотных остатков вирусных белков был сделан вывод, что клоны CCHBV 1-3 репрезентативны и функционально компетентны.

Сравнительный анализ полной последовательности нуклеотидов вирусной ДНК клонов CCHBV с последовательностями геномов других Avihepadnaviruses, проведенный с помощью программы MacVector, подтвердил полученную в ходе предыдущего анализа картину филогенетических взаимоотношений внутри группы. Филогенетическое родство Avihepadnaviruses, выявленное в ходе сравнительного анализа последовательности геномов вирусных изолятов, проведённого с помощью компьютерной SplitsTree Program (Huson D.H.,1998), может быть отражено в виде следующей дендрограммы (Рис. 13).

ННВУ4 ННВУВ 1ШВУС НЫВУБ * «Т ННВУ АВирус серых цапельБТИВУ16 ЗТНВУ 7( 8ТНВУ 1 8ТНВУ21Вирус белых аистовгусей Росса1ЮНВУ#венценосных журавлейВирус снежных гусейССНВУ2 ССНВУЗВИВ VI ОНВУЗ ОНВУНВиССБвСНВУ 19 вСНВУ 15 8СНВУ7 вОШУ 13 8<ШВУ9НРиОА АГ40440бнриБгсс БНВУСв БИВУ16НЕТШИХ БНВУ6350 ШВУ 26 47045 ОНВУ 22 БНВУСС БНВУНЕиСОЕВирус утокРис. 13. Схема филогенетических взаимоотношений вирусов гепатита В птиц, построенная на основе результатов сравнительного анализа последовательности нуклеотидов ДНК их геномов.

Результаты сравнительного компьютерного анализа предсказанных последовательностей аминокислотных остатков белков вирусов также подтверждают ранее сделанные выводы о филогенетическом родстве ССНВУ, в первую очередь, с вирусами гепатита В уток и гусей (Рис. 14). Наиболее показательным при этом являются результаты сравнительного анализа последовательностей белков оболочки РгеБ.ННВУ4ССНВУ1-ВНВУ1б-ННВУ45ШВУ215 £№№15-ГНВЛГК — ССНВУ1 -НСНВУВНИВУ 4• 5ТНВУ21-5&НВУ15-ВНВ\*16ССНВ^1--КСНВ^Рис. 14. Схема филогенетических взаимоотношений вирусов гепатита В птиц, построенная на основе результатов сравнительного анализа предсказанной последовательности аминокислотных остатков их белков: А - РгеБ/Б Б - РгеС/С В -Р-белка.

Получение такой картины филогенетических связей ССНВУ с другими представителями АчгкераскпаяЪгтез явилось полной неожиданностью, так как, согласно современной таксономии птиц, ближайшими родственниками журавлей, представителей отряда птиц Сгш/огтеБ, принято считать аистов и цапель, относящихся к отрядуCiconiiformes. Вместе они формируют надотряд Passerimorphae трибы Passeraee, в то время как гуси и утки относятся к отряду Anseriformes, надотряду Anserimorphae трибы Galloanserae и, таким образом, эволюционно гораздо более удалены от журавлей (Рис. 15) (Noble S.P. and Lynch P.J., 1993).ArcheamifheСЗа» Avelarvda» RdiluSut dus tfecuifteIntacta« Eon»Qrier Sí/THhicniftrmesPrier Tmarrbftirmei1пиЬн БЛоаиошNeowöÏUvda» Тагам«Sufartrier Prier Cruáfbrmes СДитвцЬае ——Prier CjlhfbrmesSuptniie Аиотмя^а« Prier Aoíerifbrmesi утки; гусиlarvdajs HatPrier TúrnictfbrmesPrier PiciformesSùjtiuta GdMinilli«Prier GalbuSfbrmahndú( (нашSuperorier ВцсегрфгтегBuoeroámorphaМуйийгжOrder TrotonifärniesPrier Coriáifbrrrkilu«]«*.sémite С «Км ; СмадмштДае Prier Св№$ягтвSiQandá КШастпддДа* Prier СисиЩЬгте:Ísrvdüí líiíeaeSuperarte Prier Asoiifbrma АрсДштпДа*Suferordo1 Prier ¿¿¡UsoofispifbrmesSiiperoxlff ХшдДиддДае.f*^ Я&афгтяPrier SlriiifbrmèiSujeraierPrier ColurrúifbrmejPrier GrmjbrmesPrier OcmijfbrmesЖУРАВЛИ ЦАПЛИ, АИСТЫPrier PanssertfbrméiРис.15. Схема филогенетических отношений птиц. Любопытным в этой связи является тот факт, что, если филогенетическое родство всех до сих пор описанных представителей А ткерскЫатгтез в целом совпадало с таковым их хозяев, вирус журавлей СНВУ представляет собой исключение из этого правила (см. далее).

Трансфекция ЬМН клеток ДНК вирусных клонов СНВУ.

Для дальнейшего изучения особенностей обнаруженного вируса было необходимо исследовать на практике компетентность клонов СНВУ в экспрессии вирусных белков, синтезе геномной ДНК, сборке вирусных частиц и их секреции. Протекание всех этих стадий репликационного цикла вируса наблюдали на примере трансфецированных клеток печени цыплёнка ЬМН.

Ллазмидная ДНК рестр. лнгир.вирусиыи„. геном. Sapl Sapl.3,0вектор ■ ^BgLI• ■««0,25=* " " 0,15Рис. 16. Схема гидролиза рекомбинантной ДНК клонов рестрикционнымиэндонуклеазами.

Рекомбинантные вирусные геномы вырезали из плазмидной ДНК клонов CCHBV 1-3 в ходе ее рестрикции ферментами Sap I и Bgl I (Рис. 16). Такой же процедуре подвергли эквивалентное количество ДНК плазмиды pSGHBVl-19, представляющей собой геном вируса SGHBV, клонированный в вектор pXcmKn 12 по той же схеме, что и в случае клонов CCHBV, и взятой в качестве позитивного контроля. Ферменты рестрикции затем инактивировали нагреванием, после чего провели лигирование получившейся смеси вирусной геномной ДНК и фрагментов вектора клонирования путём прямого добавления Т4 ДНК-лигазы в реакционнуюсмесь. Образовавшиеся в результате реакции кольцевые и линейные полимеры ДНК вирусных геномов использовали для трансфекции иммортализованной линии клеток LMH, способной поддерживать все стадии решгакативного цикла вируса, но непермиссивной per se для вирусов гепатита В птиц (Рис. 17).,*.** V. векторКольдаюяДНКРестрнкцкярЦС lS/ATro сайгу Хип! н послвдумцю дфк^орюпровтяв вектора.вирусаЩ"^Йй ii- ЛипфоймОвТрангформащкя бактериальны»: юшгаи РН5-а рвкомЯнюнтивй»:* ДШСвеияр»КольцгааяДНК П&адшшдоаSMi-t-HaiT 14 лнгаэа** ■ ■ л I"лнг кровавее вкруг кой генвмивйДНК.

Рис.17. Схема амплификации вирусной геномной ДНК. В качестве дополнительного положительного контроля LMH клетки трансфецировали интактной кольцевой ДНК плазмиды pDHBV16-t-27, содержащей тандем (в ориентации "голова-хвост") генома изолята вируса гепатита В уток DHBV 16.

Через 2-4 дня после проведения трансфекции культуральную среду собрали, клетки лизировали в буф!»ере Лэммли, после чего лизаты LMHКУклеток использовали при проведении иммуноферментного анализа внутриклеточной экспрессии вирусных белков PreS и Core.

Анализ экспрессии вирусных белков в трансфецированныхЬМН клетках.

В ходе иммуноферментного анализа экспрессии вирусных белков в ЬМН клетках, трансфецированных рекомбинантной ДНК клонов ССНВУ, проведённого с использованием поликлональных антител к Рге8 белку вируса ННВУ, были получены иммуноспецифические сигналы, соответствующие полноразмерному РгеБ белку оболочки с молекулярной массой 33/34 кДа и ряду продуктов его деградации (Рис. 18 ). Гораздо более слабый сигнал с тем же молекулярным весом (33/34 кДа) был выявлен в случае клеток, трансфецированных ДНК ЭОНВУ. Слабый сигнал, соответствующий РгеБ белку вируса БНВУ, был получен только после дополнительной инкубации мембраны иммуноблота с поликлональными антителами к РгеБ белку ОНВУ, что объясняется низким уровнем специфического взаимодействия ННВУ РгеБ антител с РгеБ белком оболочки вируса БНВУ. Специфичность взаимодействия в случае инкубации с обоими типами антител доказывается отсутствием каких-либо сигналов в негативном контроле.

При анализе лизатов CCHBV-трансфецированных LMH клеток с поликлональными антителами к Соге белку вируса DHBV был продемонстрирована внутриклеточная экспрессия белка с молекулярным весом 31 кДа. Кроме того, при длительной экспозиции той же мембраны иммуноблота удалось показать наличие дополнительных минорных сигналов, соответствующих, по-видимому, продуктам деградации Соге белка. Положение выявленных иммуноспецифических сигналов Соге белка DHBV (32 кДа) и SGHBV (33/34 кДа) в позитивном контроле соответствует ранее опубликованным данным (Chang et al., 1997). Интересно, что интенсивность Соге-сигналов в случае CCHBV выше таковой в позитивном контроле, что, очевидно, свидетельствует о более высоком уровне экспрессии капсидных белков вируса журавлей в данных условиях (Рис. 18).

Внутриклеточную экспрессию вирусных белков исследовали также методом непрямой двойной иммунофлюоресценции. В этом случае при трансфекции LMH клеток рекомбинантной ДНК вирусных клонов в качестве плазмиды-репортера использовали плазмиду pEGFP-Cl, кодирующую Зелёный Флюоресцирующий Белок GFP (Green Fluorescent Protein), по уровню экспрессии которого судили об эффективности трансфекции в целом. Через 2-4 дня после проведения трансфекции клетки фиксировали охлаждённой смесью метанола и ацетона в соотношении 1:1.

В ходе анализа трансфецированных LMH методом непрямой иммунофлюоресценции были получены данные, полностью подтверждающие результаты иммуноферментного анализа. Фиксированные LMH клетки инкубировали со смесью поликлональных антител к Соге белку и моноклональных антител к PreS белку вируса DHBV. Последующее добавление соответствующих вторичных антител привело к выявлению в большинстве клеток интенсивных иммуноспецифических флюоресцентныхсигналов, свидетельствующих об активной внутриклеточной экспрессии вирусных белков. Распределение PreS-сигналов в культуре LMH клеток, как и ожидалось, полностью совпадало с таковым сигналов белка вирусного капсида Core (данные не приведены).

Секреция вирусного е-антигена в культуральную среду LMH клеток.

Культуральная среда трансфецированных LMH клеток была исследована на предмет секреции вирусного е-антигена. Иммуноферментный анализ, проведённый с использованием поликлональных антител к Core белку вируса DHBV, выявил присутствие в среде нескольких форм е-антигена, соответствующих, очевидно, его посттрансляционным модификациям. Четыре различающиеся друг от друга по молекулярной массе формы белка представляют собой, по-видимому, moho-, ди-, три-, и негликозилированную форму вирусного е-антигена. Результаты иммуноблотного анализа указывают на использование всех трёх, предсказанных ранее на основании данных анализа РгеС/С кодирующей последовательности генома вируса CHBV, сигналов гликозилирования е-антигена (Рис. 19).сснву | §цДа 1 2 3 -и QРис.19. Секреция е-антигена в культуральную среду LMH клеток, трансфецированных ДНК клонов вирусов гепатита В журавлей, уток и снежных гусей. Иммуноблоттинг-анализ проведён с использованием поликлональных антител к Core белку капсида вируса уток DHBV.

106Детекция вирусной ДНК.

Также была исследована компетентность клонов в синтезе вирусной ДНК, сборке вирусных частиц и их секреции. Анализ вирусной ДНК, экстрагированной как из культуральных сред трансфецированных ЬМН клеток, так и из вирусных частиц, выделенных из исходных образцов сывороток крови нескольких венценосных журавлей и журавлей-красавок, проводили методом гибридизации по Саузерну с использованием радиоактивного гибридизационного зонда (32Р -меченая плазмида рБНВVI64-27, содержащая тандем генома вируса утки БН^ 16). Наличие репликативных интермедиатов вирусной ДНК было принято за критерий эффективного развития инфекции.

Гибридизационный анализ ДНК из вирусных частиц, осаждённых из культуральных сред ЬМН клеток при их центрифугировании с полиэтиленгликолем, выявил присутствие релаксированной кольцевой (ЫС), а также одноцепочечечной линейной форм вирусной ДНК (88). Кроме того, было выявлено наличие репликативных интермедиатов ДНК, занимающих по своей молекулярной массе промежуточное положение (Рис. 20). Картина распределения сигналов соответствует таковой в позитивном контроле (ЗОНВУ).■ RCssРис. 20. Саузерн-блот анализ геномной ДНК ССНВУ в вирусных частицах из сыворотки крови и культуральной среды трансфецированных ЬМН клеток. Образцы 1-2 - образцы сыворотки крови венценосных журавлей 3-4 - образцы сыворотки крови журавлей-красавок, 5 - сыворотка крови утки; 6-9 - культуральная среда ЬМН клеток, трансфецированных клонированной геномной ДНК вируса журавлей (6-8) и вируса снежных гусей (9) (положительный контроль). Образец 10 - негативный контроль. 11С- релаксированная кольцевая геномная ДНК, ББ - одноцепочечная ДНК.

Принято считать, что секретируемые зрелые вирусные частицы содержат только двухцепочечную вирусную ДНК (вирус SGHBV является единственным описанным на сегодня исключением из этого случая) (Chang et al., 1999). Детекция сигналов одноцепочечной линейной SS формы вирусной CCHBV ДНК объясняется секрецией в культуральную среду незрелых непокрытых внешней оболочкой вирусных капсидов (naked capsids). Это явление считается типичным для протекания инфекции в трансфецированных LMH клетках (Mabit et al., 2001). В случае анализа ДНК вирусных частиц, выделенных из вирус-содержащих образцов сывороток крови журавлей, сигналы одноцепочечной линейной ДНК, как и ожидалось, отсутствуют.

Выявление промежуточных продуктов синтеза вирусной ДНК (репликативных интермедиатов) в вирионах из трансфецированных LMH клеток, а также из их культуральных сред, является признаком активной репликации вирусного генома, а в случае вирусных частиц из исходныхсывороток крови инфицированных птиц и культуральных сред LMH клеток - также свидетельством успешного протекания сборки и секреции вирусных частиц.

Анализ пермиссивности ПГУ для вируса гепатита В журавлей.

Вирусные частицы из культуральной среды трансфецированных LMH клеток использовали для прямой инфекции культуры клеток печени эмбрионов утки ПГУ. Первичная культура гепатоцитов утки была приготовлена из печени 21-дневних утиных эмбрионов, согласно стандартному протоколу (Bruns et ah, 1998). Вирус-содержащую культуральную среду трансфецированных LMH клеток перенесли на гепатоциты утки (ПГУ) спустя 3-4 дня после постановки трансфекции.

Параллельно с этим экспериментом проводили инфекцию ПГУ вирусными частицами из исходных вирус-содержащих сывороток крови серых венценосных журавлей и журавлей-красавок путём прямого добавления аликвот сывороток в культуральную среду приготовленных ПГУ.

В обоих случаях инкубацию клеток в вирус-содержащей среде проводили в течение 12 часов, после чего среду заменяли на новую, свободную от вирусов. На третий день после проведения инфекции ПГУ клетки лизировали в Лэммли-буфере для последующего иммуноферментного анализа. Часть инфицированных клеток фиксировали смесью метанола и ацетона для анализа методом непрямой иммунофлюоресценции.

Оценку продуктивности вирусной инфекции гепатоцитов проводили с использованием методов иммуноблоттинга и непрямой иммунофлюоресценции. При анализе использовались те же антитела к вирусным белкам, что и описанные ранее при аналогичном исследованииФазовыйРис. 22. Внутриклеточная экспрессия вирусных белков в гепатоцитах утки, инфицированных вирусными частицами из сывороток крови серых венценосных журавлей и уток, (положительный контроль). Анализ методом непрямой иммунофлюоресценции проведён с использованием поликлональных антител к PreS белку оболочки вируса серых цапель HHBV Ядра клеток окрашены красителем Hoechst Nuclear Dye.

Эффективность инфекции вирусами CHBV была сравнима с таковой в положительном контроле (DHBV и SGHBV) и достигала, согласно результатам анализа методом непрямой иммунофлюоресценции, 30%.

Результаты анализа пермиссивности ЛГУ для вируса CHBV согласуются с данными, полученными ранее в ходе сравнительного филогенетического анализа вируса гепатита В журавлей CHBV, являясь^ тем не менее^ неожиданными по своей сути.

Известно, что ПГУ пермиссивны для вирусов DHBV, SGHBY и RGHBV, в то время как все попытки инфицирования гепатоцитов утки STHBV или ННВV до сих пор не приводили к успеху (Pult et al., 2001; Netter et al., 1997). Продемонстрированная нами в ходе исследованияфункциональная способность изолятов вируса СНВУ инфицировать ПГУ подтверждает его близость с вирусами гепатита В уток и гусей, предсказанную ранее в ходе сравнительного компьютерного анализа геномных и белковых последовательностей вируса. Описанные до сих пор вирусы гепатита В птиц можно условно подразделить, основываясь на результатах сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов их генов и спектра хозяев, на две группы.

К одной из них можно отнести вирусы БНВУ, БвНВУ, ЯвНВУ, в то время как вторая включает в себя БТНВУ и ННВУ. Такое подразделение известных вирусов гепатита В на группы в целом совпадает с таксономическим подразделением их хозяев. Новый вирус СНВУ занимает благодаря своим свойствам особое положение среди этих вирусов, возможно, представляя собой переходное звено между группами. Одним из возможных объяснений наблюдаемого явления может быть несоответствие темпов эволюция Ау1кера(1пау1гше8 и их хозяев.

Полученные в данной работе результаты также указывают на вероятное сходство клеточных рецепторов и механизмов взаимодействия с вирусом гепатита В у гепатоцитов уток и журавлей. Нельзя полностью исключить и существования в случае СНВУ уникального механизма взаимодействия вируса и клетки хозяина. Вследствие малоизученности механизмов, определяющих узкий спектр хозяев вируса, окончательный ответ на этот и другие, оставшиеся пока открытыми, вопросы может быть получен только в ходе дальнейшего изучения и сравнительного анализа этого и других АугИераЛпау^шез, а также их хозяев.

3. Обнаружение и характеристика вируса гепатита В красноголовых гусей ЬШНВУ.

Анализ вируса красноголового гуся проводился согласно схеме разработанной ранее при характеристике вируса В журавлей (см. выше). В соответствии с этим далее подробно будут описаны только те этапы изучения вируса, на которых в силу специфики этой части работы было сделано отступление от ранее описанной схемы или введены какие-либо модификации в стандартные методы.

Обнаружение вируса в сыворотке крови красноголового гуся методом иммуноблоттинга и ПЦР-амплификации.

При анализе образцов коллекции сывороток крови птиц методом иммуноблоттинга были получены данные, указывающие на присутствие в образце сыворотки красноголового гуся Chloephaga гиЫсИсерБ белков, иммуноспецифически взаимодействующих с поликлональными антителами к РгеБ белку вирусной оболочки БНВУ. Инкубация мембраны иммуноблота с БНВУ РгеБ-специфическими антителами привела к появлению ряда сигналов, соответствующих собственно вирусному РгеБ белку и продуктам его деградации (Рис. 23).

Таким образом, применённые молекулярно-биологических методы выявили в анализируемой сыворотке крови красноголового гуся присутствие вирусных белков и ДНК. Полученные данные иммуно-ферментного- и ПЦР - анализа позволяют предположить, что обнаруженный вирус имеет большую гомологию с вирусом гепатита В уток DHBV, чем с HHBVhSTHBV.

Прямое определение нуклеотидной последовательности геномной ДНК нового вируса и её клонирование.

Полноразмерная вирусная геномная ДНК из сыворотки крови красно-голового гуся была амплифицирована с использованием DHBV-, HHBV- и STHBV-специфических sap+/sap- праймеров, согласно стандартному протоколу. Продукты амплификации очистили от компонентов реакционной смеси с помощью реагентов коммерческого кита PCR Purification Kit (Qiagen), после чего было проведено прямое определение их последовательности. В силу указанных ранее причин для предварительной оценки филогенетического родства описываемого вируса с Avihepadna-viruses была выбрана последовательность участка ДНК генома, кодирующего PreS белок. При установлении последовательности этого гена использовали праймеры секвенирования DHBV 301+ IRD и HHBV 1962-IRD, а также специально созданные впоследствии праймеры секвенирования RHHBV 702+ IRD и RHHBV 1924-IRD.

Полученная последовательность гена PreS белка обнаруженного вируса была использована в ходе сравнительного анализа с таковымиизвестных АуНаерадпсыггтех. Проведённый анализ выявил её наибольшое сходство, но не идентичность, с последовательностью гена РгеБ белка изолята вируса гепатита В уток БНВУ НРиСОЕ. Следующим по степени гомологии представителем гепаднавирусов птиц является вирус снежных гусей БОНВУ 15, в то время как согласно результатам проведённого анализа, БТНВУ и ННВУ наиболее удалены филогенетически от нового вируса (Рис. 24)р---БННВУ4--ПНВУЙОРиССЕ-йетшу 15-ССНВУ1- -ННВУ 4-ЭТИКУ 21-КСНВУРис.24. Схема филогенетических отношений гепаднавирусов птиц, основанная на результатах сравнительного анализа последовательности нуклеотидов ДНК их геномов.

На следующем этапе исследования было проведено секвенирование полноразмерной ДНК вирусного генома с использованием праймеров секвенирования: БНВУ 301+ЖД БО 649+ ЖД Бв 1071+ ЖД ННВУ 1330-ЖД ННВУ 2225-ЖД ННВУ 1186+ЖД ННВУ 314- ЖД ННВУ 1962-ЖД ННВУ 722+ ЖД ЯННВУ 702+ ЖД ЯНИВУ 2222+ ЖД 1ШНВУ 1924-ЖД 1ШНВУ 2684- ЖД КННВУ 702+ ЖД СНВУ 361-ЖД СНВУ 1638+ЖД СНВУ 2790- ЖБ.

Сравнительный анализ полных последовательностей ДНК вирусных геномов подтвердил сделанный ранее вывод о принадлежности обнаруженного вируса к группе АугкерскЗпауггжея и высокой степени гомологии его геномной последовательности с таковой вируса гепатита Вуток DHBV. Тем не менее, выявление ряда особенностей (уникальные нуклеотидные замены, вставки и делеции) геномной ДНК исследуемого вируса, отличающих его от DHBV, позволяет сделать вывод об обнаружении нового, ранее неизвестного представителя группы Avihepadnaviruses, названного вирусом гепатита В красноголового гуся RHHBV (Ruddy-headed goose hepatitis В virus).

В ходе дальнейших экспериментов амплифицированная ДНК вируса была клонирована, согласно описанной ранее схеме. На основании результатов рестрикционного анализа для дальнейших экспериментов были отобраны пять клонов, для каждого из которых была дополнительно установлена полная последовательность нуклеотидов клонированной геномной ДНК и проведён ёе компьютерный анализ.

Анализ геномной ДНК и предсказанной последовательности аминокислотных остатков белков вируса RHHBV.

Компьютерный анализ последовательности нуклеотидов вирусной ДНК RHHBV и предсказанной на её основе последовательности аминокислотных остатков вирусных белков клонов свидетельствует в пользу функциональной компетентности четырёх из пяти клонов, В кодирующей последовательности PreS белка клона RHHBV 1 в ходе анализа был обнаружен дополнительный сигнал терминации трансляции (данные не приведены). Таким образом, в случае этого клона происходит экспрессия только укороченной формы белка вирусной оболочки, что, в свою очередь, делает невозможным сборку инфекционных вирусных частиц.

В последовательности нуклеотидов вирусной ДНК и предсказанной на её основе последовательности аминокислотных остатков вирусных белков остальных клонов не было выявлено ни одной модификации,которая могла бы вести к преждевременному прекращению трансляции белков, синтезу их дефектной или укороченной формы и, тем самым, к снижению или полной потере инфекционности секретируемых вирусных частиц. Последовательности аминокислотных остатков структурно-функциональных элементов вирусных белков, существенных для эффективной репликации вируса, консервативны и в случае указанных клонов RHHBV. Совокупность полученных в ходе анализа данных позволяет сделать вывод, что клоны RHHBV 2-5 репрезентативны и функционально компетентны.

Для проведения детального описания особенностей организации вируса гепатита В красноголовых гусей и дальнейшего его сравнительного анализа с другими Avihepadnaviruses был выбран репрезентативный клон RHHBV 4. Результаты сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов ДНК геномов вирусов гепатита В и предсказанных последовательностей аминокислотных остатков вирусных белков представлены в Приложении 3 и Приложении 4, соответственно.

Как и в случае со всеми известными гепаднавирусами птиц, большинство уникальных нуклеотидных замен RHHBV находится в последовательности гена PreS белка вирусной оболочки, а также в частично перекрывающемся с ним участке генома, кодирующем спейсерный участок Р-белка. Соответственно, большинство модификаций последовательностей аминокислотных остатков находится в соответствующих участках этих вирусных белков. Большинство аминокислотных замен в PreS и Р-белках имеют неконсервативный характер.

Также как и у наиболее близких RHHBV (как показал проведённый с помощью сетевой поисковой программы Blast Search анализ известных гепаднавирусов) изолятов вирусов DHBV HPUCGE, SGHBV 21 и RGHBV, но в отличие от вирусов STHBV 21 HHBV 4 и CHBV 1, у вирусакрасноголовых гусей отсутствует вставка (три аминокислотных остатка) в регионе, ответственном за определение круга хозяев вируса. В последовательности PreS домена L белка выявлен и PX(S/T) мотив, присутствующий у вирусов DHBV, SGHBV и RGHBV, но не обнаруженный у вирусов STHBV, HHBV и CHBV. Выявление этих особенностей указывает на принадлежность изучаемого вируса к подгруппе внутри Avihepadnaviruses, образованной вирусами уток и гусей. При этом такие аминокислотные мотивы, как WTP, существенный для нейтрализации вируса (Sunyach et al.,1999), или XDPXL-мотив, определяющий взаимодействие структурных вирусных белков Core и PreS (Yu et al., 1998), универсальны для всех известных гепаднавирусов, в том числе и для RHHBV. В последовательности PreS участка L белка был, кроме того, выявлен целый ряд одиночных неконсервативных аминокислотных замен. Их функциональное значение ещё предстоит выяснить.

В отличие от PreS домена L белка последовательность аминокислотных остатков S белка вирусной оболочки характеризуется в целом высоким уровнем консервативности у всех вирусов гепатита В птиц. Последовательность S белка RHHBV, содержащая только несколько консервативных замен, не является в этом отношении исключением.PreC/C-кодирующая последовательность RHHBV обладает свойствами, характерными для этого участка генома всех гепаднавирусов птиц: домен "птичьей вставки" является наиболее вариабельным (Bringas 1997), а последовательность hhr, - наиболее консервативным её регионом (Yu et al., 1996).

В последовательности непроцессированного белка-предшественника РгеС/С вируса RHHBV выявлено всего два потенциальных сайта гликозилирования: один из них находится в N-терминальном участке белка и присутствует у всех известных гепаднавирусов птиц, в то время какпоследовательность второго сигнала, расположенного в регионе "Thr/pro kinase"- мотива белка является общей только для вирусов CCHBV, RGHBV и STHBV.

Все четыре потенциальных сайта фосфорилирования (SPXX), выявленных на примере DHBV (Yu and Summers, 1994), также обнаружены и в структуре С-терминального домена капсидного белка RHHBV. Последовательность недавно обнаруженного "Thr/pro kinase"- мотива, присутствующая в структуре Core белка всех Avihepadnaviruses (Barrasa et al., 2001), а также сигнала ядерной локализации NLS, описанного впервые для DHBV (Mabit et al., 2001), выявлена и у RHHBV.

Компьютерный анализ последовательности Р-белка RHHBV продемонстрировал отсутствие каких-либо существенных перестроек или аминокислотных замен в участках, определяющих её функциональную активность. Большинство аминокислотных замен Р-белка вируса красноголовых гусей сосредоточено в нефункциональном спейсерном домене Р-белка, что характерно также и для всех других известных A vihepadnaviruses.

Результаты анализа генома RHHBV свидетельствуют о существовании потенциальной открытой рамки считывания величиной 264 п.н., с которой в случае инициации трансляции с неканонического инициаторного кодона возможна экспрессия Х-белка с максимальной величиной 86 аминокислотных остатков. Действительно ли происходит синтез Х-белка RHHBV и какова его длина in vivo, ещё предстоит выяснить в ходе дальнейших экспериментов.

Трансфекция LMH клеток.

Оценку функциональной компетентности полученных клонов проводили в культуре LMH клеток. Геномы вирусов RHHBV и SGHBV(взятого в качестве позитивного контроля) вырезали из плазмидной ДНК клонов RHHBV 1-5 и SGHBV 1-19, соответственно, в ходе её рестрикции ферментами Sap I и Bgl I. Продукты рестрикции разделили в ходе фракционирования на 1% агарозном геле, после чего вирусную геномную ДНК экстрагировали из геля с помощью реагентов коммерческого кита QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

Согласно разработанному ранее стандартному протоколу, при проведении трансфекции была, таким образом, использована линеаризованная вирусная ДНК (Chang et al., 1999.) При постановке трансфекции в качестве дополнительного позитивного контроля использовали интактную плазмиду pDHBV16-t-27, содержащую тандем (ориентировка "голова-хвост") геномной ДНК вирусного изолята DHBV 16.

В соответствии с ранее описанной схемой изучения компетентности клонов анализу подверглись как сами трансфецированные LMH клетки, так и образцы их культуральной среды, собранные на 2-4 день после постановки трансфекции. В зависимости от того, с помощью какого метода (иммуноферментный анализ или анализ по Саузерну) предполагалось проводить дальнейшее изучение образцов, клетки лизировали в Лэммли -или NP-40 -буфере, соответственно. Для проведения анализа экспрессии вирусных белков методом непрямой иммунофлюоресценции часть клеток фиксировали смесью метанола с ацетоном в соотношении 1:1.

Проведённый иммуноферментный анализ лизатов трансфецирован-ных LMH клеток с использованием поликлональных антител к структурным Core (DHBV Core D-087) и PreS (DHBV PreS Kpn I) белкам вируса DHBV продемонстрировал интенсивную внутриклеточную экспрессию PreS белка оболочки вируса. В то же время никаких признаков экспрессии Core белка вирусного капсида не удалось выявить даже при повторной длительной инкубации мембраны иммуноблота с соответствующими DHBVспецифическими поликлональными антителами к Core белку. Одновременно с этим в позитивном контроле были выявлены иммуноспецифические сигналы, свидетельствующие об эффективной экспрессии как PreS, так и Core белка вируса SGHBV. В этой связи необходимо отметить, что в силу физического расположения гена PreS в геноме Avihepadnaviruses синтез белка вирусной оболочки может с равной эффективностью идти как с линейных, так и кольцевых молекул вирусной ДНК, амплифицированной с использованием sap+/sap- пары праймеров. Для экспрессии же Core белка вируса абсолютно необходима рециркуляризация вирусной линейной ДНК, амплифицированной по описанной ранее схеме. Таким образом, результаты иммуноферментного анализа указывали на то, что спонтанной рециркуляризации трансфецированной линейной ДНК вируса RHHBV, в отличие от ДНК SGHBV, в трансфецированных LMH клетках не произошло (Chang et al.,1999). При этом в ходе сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов рекомбинантной ДНК клонов SGHBV и RHHBV никаких существенных модификаций, которые могли бы обусловливать существование таких функциональных различий, обнаружено не было.

Принимая во внимание выявленную специфику пост-трансфекционных этапов развития RHHBV инфекции в LMH клетках, в существующую схему проведения эксперимента были внесены изменения. Согласно модифицированному протоколу, трансфекцию LMH клеток проводили теперь предварительно рециркуляризованной геномной ДНК клонов RHHBV. Для этого непосредственно после рестрикции клонов RHHBV 1-5 и SGHBV 1-19 и инактивации ферментов рестрикции Sap I и Bgl I нагреванием проводили прямое лигирование как линейной ДНК генома вируса, так и образовавшихся в результате рестрикции фрагментов вектора клонирования, путём добавления Т4 ДНК-лигазы непосредственнов реакционную смесь. Образовавшиеся кольцевые и линейные полимеры вирусных геномов использовали в дальнейшем при проведении трансфекции LMH.

Иммуноферментный анализ экспрессии вирусных белков в LMH клетках.

Иммуноферментный анализ лизатов LMH клеток, трансфецированных предварительно рециркуляризованной вирусной геномной ДНК клонов, с поликлональными антителами DHBV Core D-087 продемонстрировал экспрессию белка вирусного капсида как в случае RHHBV, так и в случае позитивных контролей. Результаты иммуноферментного анализа свидетельствуют о внутриклеточной экспрессии Core белка вируса RHHBV, крайне близкого по молекулярному весу (32 кДа) таковому вируса DHBV (Рис. 25). Интенсивность экспрессии тем, не менее, была значительно выше как в случае DHBV-, так и в случае SGHBV-позитивных контролей. Повторное проведение эксперимента продемонстрировало воспроизводимость этого результата.Ар32 *р32 'Рис. 25. А - Внутриклеточная экспрессия вирусного Core белка в LMH клетках, трансфецированных клонированными геномами вируса гепатита В красно головых гусей RHHBV 1-5 (лунки 3-7). В качестве положительного контроля были использованы образцы лизатов LMH клеток, трансфецированных клонированной ДНК геномов вирусов DHBV и SGHBV (1-2). 8 -негативный контроль. Иммуноферментный анализ проведён с использованием поликло-нальных антител к Core белку вируса DHBV. Б - Короткая экспозиция той же мембраны иммуноблота.

Анализ экспрессии РгеБ белка вирусной оболочки выявил общую для всех трёх использованных в эксперименте гепаднавирусов (Рис. 26) картину распределения сигналов. В результате инкубации мембраны иммуноблота с поликлональными БНВУ РгеБ Крп I антителами были выявлены два основных иммуноспецифических сигналов, соответствующих РгеЭ белку вируса (36 кДа) и основному продукту его деградации (28 кДа), а также ряд гораздо более слабых промежуточных сигналов. В целом, картина распределения сигналов белков вируса 1ШНВУ соответствовала таковой белков вирусной оболочки ЭЕВУ в позитивном контроле эксперимента. При этом относительная интенсивность соответствующих сигналов в случае ЫННВУ и БНВУ не всегда совпадала.»о Г1 ^1 2 3 4 5 6 7Рис. 26. Внутриклеточная экспрессия РгеБ вирусного белка в ЬМН клетках, трансфеци-рованных клонированными геномами вирусов гепатита В уток ОНВУ (1) и красноголовых гусей ЯННВУ (2-6). 7 - негативный контроль. Иммуноферментный анализ проведён с использованием поликлональных антител к РгеБ белку вируса БНВУ.

В случае клона 1ШНВУ 1 удалось выявить только слабый сигнал, соответствующий, по-видимому, укороченной форме РгеБ белка. Полученные таким образом экспериментальные данные согласуются с результатами анализа предсказанной последовательности аминокислотных остатков РгеБ/Б белка этого клона, согласно которым в кодирующей последовательности РгеБ гена присутствует дополнительный сигналтерминации трансляции, препятствующий экспрессии полноразмерной формы белка. Возникновение подобной мутации должно препятствовать и сборке инфекционных вирусных частиц.

Таким образом, согласно данным иммуноблотного анализа, четыре из пяти клонов RHHBV компетентны в экспрессии белков вирусного капсида и внешней оболочки. Более низкая по сравнению с позитивным контролем интенсивность сигналов Core белка вируса RHHBV может быть объяснена низкой специфичностью взаимодействия вирусных белков RHHBV с DHBV антителами, но, скорее всего, действительно отражает более низкий уровень экспрессии белков с исследуемых клонированных геномов RHHBV (см. данные анализа вирусной ДНК по Саузерну).

Анализ экспрессии вирусных белков в LMH клетках методом непрямой иммунофлюоресценции.

Параллельно с иммуноферментным анализом был проведён анализ экспрессии вирусных белков методом непрямой иммунофлюоресценции. Этот подход полностью подтвердил данные иммуноферментного анализа, продемонстрировав эффективную внутриклеточную экспрессию Core и PreS белков для всех вирусных клонов, за исключением клона RHHBV 1, дефектного по PreS белку. Кроме того, применение метода непрямой иммунофлюоресценции в сочетании с использованием конфокальной микроскопии дало возможность получить дополнительные данные о внутриклеточном распределении экспрессируемых вирусных белков. В то время как для PreS белка была показана исключительно цитоплазматическая локализация, в случае Core белка RHHBV наблюдалось образование внутриядерных гранул. Анализируемые клоны значительно различались по признаку внутриклеточного распределения Core белка: так, в случае клона RHHBV 3 ядерная локализация наблюдалась для значительной фракциикапсидного белка (Рис.27), в то время как у других клонов RHHBV тенденция к образованию внутриядерных гранул Core белка была выражена менее явно (Рис. 28).АР Цш слитом аРис. 27. Локализация гранул Core белка вируса красноголовых гусей RHHBV (клон RHHBV 3) в ядре трансфецированных LMH клеток, продемонстрированная с помощью конфокальной микроскопии. А - Последовательное изображение "срезов" клетки, обработанной антителами к Core белку вируса DHBV. Б - Увеличенное изображение "среза", заключённого в рамку на Рис.27. АCore Hoechst наложениеРис.28. Внутриклеточная локализация Core белка клонов вируса RHHBV 3 и RHHBV 4 в трансфецированных LMH клетках. Core - специфическая иммунофлюоресценция в клетках, обработанных антителами к Core белку вируса DHBV. Hoechst - окраска ядер красителем Hoechst Nuclear Dye.

В то же время для Core белков вирусов DHBV и SGHBV в позитивном контроле удалось выявить только дитоплазматическую локализацию.

Механизм и функциональное значение образования этих внутриядерных белковых гранул, продемонстрированное пока только для вируса красноголового гуся RHHBV, ещё предстоит выяснить в ходе дальнейших экспериментов.

Детекция синтеза вирусной ДНК по методу Саузерна.

Для анализа компетентности клонов RHHBV в репликации вирусного генома вирусная ДНК была экстрагирована как из внутриклеточных вирусных частиц, так и из вирусных частиц, секретируемых в кулыуральную среду трансфецированных LMH клеток и осаждённых из неё центрифугированием с полиэтиленгликолем. Анализ синтеза вирусной ДНК проводился по методу Саузерна с использованием 32р-меченогогибридизационного зонда - ДНК плазмиды рОНВУ 16-1-27. В случае образцов ДНК всех пяти вирусных клонов 11ННВУ, выделенных из вирусных частиц культуральных сред трансфецированных клеток, инкубация с гибридизационным зондом привела к появлению двух основных сигналов, соответствующих релаксированной кольцевой (ЯС) и одноцепочечной линейной (ББ) вирусной ДНК. Кроме этого был выявлен целый ряд минорных сигналов, соответствующих промежуточным продуктам репликации (репликативные интермедиаты) и являющихся признаком успешного протекания синтеза вирусной геномной ДНК (Рис. 29).

1-* го -ч- <П1 2 3 4 5 б 7 8Рис. 29. Анализ по методу Саузерна геномной ДНК вирусных частиц из культуральных сред ЬМН клеток, трансфецированных ДНК клонов Ю1НВУ (лунки 1-5), БОНВУ и БНВУ (лунки 7 и 8, соответственно). Лунка 6-негативный контроль. ЛС и ББ обозначают положение релаксированной кольцевой двухцепочечной и одноцепочечной линейной вирусной ДНК, соответственно.

Идентичность картины распределения ДНК-сигналов для клонов ЯННВУ показывает, что преждевременная терминация синтеза РгеБ белка клона ЯННВУ 1, не оказывает, по-видимому, прямого воздействия на синтез и инкапсидацию его новосинтезированной вирусной ДНК. Аналогичная картина распределения сигналов была зафиксирована и в случае позитивных контролей. Интенсивность сигналов в последнем случае была, однако, гораздо выше. Таким образом, сравнительно небольшое количество синтезируемой вирусной ДНК коррелирует с выявленным ранее низкимуровнем экспрессии Core белка клонов вируса RHHBV. При анализе ДНК внутриклеточных вирусных частиц получили ту же картину распределения сигналов (данные не приведены).

Таким образом, в соответствии с данными иммуноферментного и иммунофлюоресцентного анализа, а также результатами блоттинга по Саузерну четыре из пяти клонов вируса красноголового гуся компетентны в экспрессии структурных вирусных белков, синтезе ДНК, сборке и секреции вирусных частиц.

Кроме того, сравнение соотношения уровня экспрессии PreS белка вируса красноголового гуся RHHBV с уровнем экспрессии его Core белка и уровнем синтеза вирусной геномной ДНК с аналогичным соотношением для вируса гепатита В уток DHBV позволяет предположить и существование отличия между двумя вышеназванными вирусами в пропорциональном соотношении секретируемых инфекционных вирусных частиц и неинфекционных "теней". Возможно, следствием более высокого относительно Core белка уровня синтеза белка вирусной оболочки PreS является и более высокое процентное содержание "теней" вируса по отношению к секретируемым инфекционным вирусным частицам. Справедливость этого предположения ещё предстоит проверить в ходе дальнейших экспериментов in vitro и in vivo. Исследование этого явления, возможно, позволит окончательно определить функциональное значение суперэкспрессии вирусных "теней", характерной для всех гепаднавирусов.

Анализ инфекционности вирусных частиц для ПГУ.

Одним из важных аспектов проводимого исследования новых гепаднавирусов птиц является изучение их видоспецифичности. В этой связи большой интерес представляет вопрос о пермиссивности первичной культуры гепатоцитов утки для вируса RHHBV. При проведенииэксперимента по инфекции ПГУ использовали вирусные частицы как из культуральной среды трансфецированных LMH клеток, так и из вирус-содержащего образца сыворотки крови красноголового гуся. В качестве дополнительного контроля инфекции использовали DHBV-содержащую и вирус-негативную сыворотки крови уток. При проведении опыта и обработке его результатов использовали стандартные условия, описанные ранее.

Анализ внутриклеточной экспрессии вирусных белков RHHBV, являющейся одним из важнейших признаков развития продуктивной инфекции в культуре ПГУ, не дал положительного результата ни в одном из вышеупомянутых случаев. Не только при проведении иммуноферментного анализа лизатов клеток, но и при анализе фиксированных клеток методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моно- и поликлональных антител к PreS и Core белкам вируса DHBV не удалось выявить ни одного иммуноспецифического сигнала. Попытка инфекции ПГУ RHHBV не привела к успеху даже при использовании вирусных частиц из образца вирус-содержащей сыворотки крови красноголового гуся (данные не приведены). При этом обилие характерных специфических сигналов в позитивном контроле свидетельствовало о потенциальной пермиссивности для инфекции культур ПГУ использованных в опыте.

Отсутствие развития инфекции в случае заражения ПГУ вирусом RHHBV не согласуется и с данными о высокой пермиссивности гепатоцитов утки для SGHBV (Chang et al., 1999) и RGHBV (личное сообщение), являющихся его близкими родственниками. В соответствии с этим неинфекционность RHHBV для ПГУ должна была бы сопровождаться и наличием уникальных модификаций и перестроек в участках генома вируса RHHBV, ответственных (согласно современным представлениям) за взаимодействие с клеточными факторами и определяющих его круг хозяев.

Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов вирусной ДНК и последовательностей аминокислотных остатков вирусных белков не выявил, однако, никаких принципиальных отличий ЯННВУ в этих регионах от вирусов 80НВУ и 1ЮНВУ. Тем не менее, нельзя полностью исключить возможности мутации пока неизвестных (невыявленных) структурно-функциональных элементов вируса БШНВУ, определяющих его видоспецифичность, обусловливающую его неинфекционность для ПТУ.

Кроме того, необходимо принять во внимание тот факт, что был проведён анализ вируса из единственного образца сыворотки крови красноголового гуся, условия хранения которого с момента отбора крови до начала экспериментов неизвестны. Практика показывает, что отсутствие оптимальных условий хранения сыворотки крови, например, многократное замораживание и оттаивание ведёт к резкому снижению инфекционности содержащегося в сыворотке вируса вплоть до полной её потери. Если подобное происходило с исследуемым образцом сыворотки крови красноголового гуся, то неспособность вирусных частиц БШНВУ инфицировать ПТУ представляется закономерной и легко объяснимой. Кроме того, наличие специфических сложностей при трансфекции клонированных геномов БШНВУ, механизм возникновения которых на настоящий момент ещё не выяснен, возможно, указывает на дефектность полученных клонов. Таким образом, непермиссивность культур ПТУ для КННВУ инфекции как в случае вирусных частиц из сыворотки крови красноголового гуся, так и из культуральной среды трансфецированных ЬМН клеток, возможно, объясняется чисто техническими причинами.

Независимо от того, какое из высказанных предположений является верным, очевидна необходимость проведения дальнейшего изучения вируса гепатита В красноголовых гусей для ответа на этот и другие оставшиеся открытыми вопросы.

4. Обнаружение и характеристика вируса гепатита В белых аистов STHBV.

Из 145 образцов скринируемой коллекции сывороток крови 20 принадлежали белым Ciconia ciconia (17 образцов) и чёрным Ciconia nigra (3 образца) аистам. Анализ этих сывороток методом иммуноферментного- и ПЦР- анализа выявил в 15 (14 и 1, соответственно) проанализированных сыворотках крови аистов наличие вирусных белков и ДНК. Ранее уже были получены данные о существовании вируса белых аистов, получившего название STHBV (Stork Hepatitis В Virus). Тем не менее, характеристика нового вируса не была доведена до конца, а ряд полученных результатов требовал независимой проверки. Исходя из этого, было решено объединить данные обоих исследований, а также провести ряд дополнительных экспериментов в рамках анализа инфекционости вируса STHBV для культур гепатоцитов утки.

Обнаружение вируса в сыворотках крови белых и чёрных аистов методом иммуноблоттинга и ПЦР-анализа.

Анализ 20 сывороток крови белых и чёрных аистов был проведён в рамках скрининга коллекции по стандартной описанной выше схеме (См. "Материалы" и "Методы", а также в разделах данной работы, посвящённых обнаружению и описанию вирусов CHBV и RHHBV). Принимая во внимание продемонстрированную ранее филогенетическую близость вирусов серых цапель и белых аистов, для иммуноферментного анализа образцов сыворотки крови аистов были в первую очередь использованы поликлональные антитела к PreS белку вируса HHBV (HHBV PreS 0729). Согласно результатам этого анализа, 14 сывороток крови белых аистов и 1сыворотка крови чёрного аиста содержали PreS белки вирусной оболочки (Рис. 30)Рис.30. Обнаружение белков вирусной оболочки при анализе сывороток крови белых и чёрных аистов методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к PreS белку вируса HHBV. Типичный иммуноблот: 1-5 - белые аисты 6-7 - чёрные аисты, 8 и 9 -HHBV вирус-содержащая и свободная от вируса сыворотки крови серых цапель, нанесённые в качестве положительного и негативного контролей, соответственно.

Повторная инкубация мембраны иммуноблота с поликлональными антителами к PreS белку вируса DHBV (DHBV PreS Kpn I) не привела к появлению новых иммуноспецифических сигналов.

Выявление вирусной ДНК в анализируемых сыворотках было проведено методом ПЦР-анализа с DHBV и HHBV sap+/sap- праймерами, а также со специально разработанными STHBV-специфическими sap+/sap-праймерами (Pult et al., 2001). Анализ сывороток крови методом ПЦР-амплификации продемонстрировал присутствие вирусной ДНК в 15 сыворотках крови аистов (Рис. 31), содержащих, согласно иммуно-ферментному анализу, вирусные белки. Наиболее высокая эффективность амплификации при этом была достигнута со STHBV-специфическими праймерами, в то время как амплификация вирусной ДНК с DHBV-специфическими праймерами характеризовалась наименее высоким1 2 3 4 5 6 7 8 920уровнем синтеза продуктов реакции (полноразмерной вирусной геномной ДНК).

Для прочтения последовательности гена PreS белка обнаруженного вируса и её последующего сравнения с соответствующими кодирующими последовательностями известных гепаднавирусов птиц в качестве ДНК-матрицы были использованы продукты амплификации, проведённой со STHBV-специфическими sap+/sap- праймерами. После стандартной процедуры очистки продуктов амплификации с использованием Qiagen PCR Purification Kit (Qiagen) секвенирование данного участка вирусного генома было проведено с использованием описанных ранее праймеров секвенирования, меченных флюоресцентной меткой.

В ходе анализа последовательности гена PreS белка вируса из сывороток крови белого, а также чёрного аистов была продемонстрирована высокая степень её гомологии с соответствующей последовательностью гена PreS белка ранее обнаруженного вируса белых аистов STHB V. Отличиемежду сравниваемыми последовательностями ограничивалось несколькими нуклеотидными заменами, молчащими на белковом уровне или приводящими к консервативными аминокислотным заменам (данные не приведены). На основаниии результатов проведённого сравнительного анализа последовательности нуклеотидов гена РгеБ белка был сделан вывод об обнаружении в исследованных образцах коллекции сывороток крови изолятов ранее выделенного и частично охарактеризованного вируса белых аистов БТНВУ. Вирус БТНВУ, однако, был обнаружен ранее только в сыворотках крови белых аистов, в то время как случаев заражения им чёрных аистов до сих пор зарегистрировано не было. Таким образом, в результате проведённого нами скрининга образцов коллекции сывороток крови птиц, была получена новая информация о видоспецифичности (круге хозяев) вируса БТНВУ.

Оценка инфекционности вируса БТНВУ для гепатоцитов утки.

В ходе проводившегося ранее изучения вируса БТНВУ была установлена полная последовательность нуклеотидов геномной ДНК вируса, после чего она была клонирована в вектор рХстКп12. В дальнейшем был проведён компьютерный анализ последовательности нуклеотидов геномной ДНК и предсказанных последовательностей аминокислотных остатков белков полученных клонов, а также их функциональный анализ. Как и раньше, функциональная характеристика клонов проводилась с использованием методов иммуноферментного анализа, блоттинга по методу Саузерна и иммунофлюоресцентного непрямого анализа ЬМН клеток, трансфецированных рекомбинантной ДНК вирусных клонов, а также их культуральных сред. По результатам проведённого анализа для дальнейших экспериментов был отобран клонSTHBV 21, компетентный в экспрессии структурных вирусных белков, синтезе геномной ДНК и секреции вирусных частиц.

К моменту проведения описываемой работы оставался неразрешённым вопрос об инфекционности вируса белых аистов для культур ПГУ. При проведении анализа пермиссивности гепатоцитов утки для STHBV были использованы вирусные частицы как из культуральной среды LMH клеток, трансфецированных вирусной ДНК клона STHBV 21, так и из исходных вирус-содержащих сывороток крови белого и чёрного аистов. В качестве контроля инфекции были использованы как вирусные частицы из культуральной среды LMH клеток, трансфецированных рекомбинантной ДНК клонов HHBV 4 и DHBV 3, так и из HHBV- и DHBV-содержащих и вирус-негативных сывороток крови цапель и уток (М01=1), соответственно.

Инфекция первичной культуры ПГУ и её последующий анализ проводился по ранее описанной схеме с использованием иммуноферментного анализа и анализа методом непрямой иммунофлюоресценции. Учитывая крайне низкую пермиссивность ПГУ для HHBV (Ishikawa and Ganem, 1995), наиболее близкого, согласно исследованиям филогенетических отношений Avihepadnaviruses к вирусу STHBV, гепатоциты были лизированы (или, соответственно, фиксированы) только на седьмой день после постановки инфекции. Такая необычно длительная инкубация ПГУ должна была способствовать более широкому распространению инфекции STHBV в культуре гепатоцитов. Несмотря на это, иммуноферментный анализ лизатов гепатоцитов с поликлональными антителами к структурным белкам PreS и Core вирусов DHBV и HHBV не привёл к выявлению иммуноспецифических сигналов, свидетельствовавших об эффективной внутриклеточной экспрессии этих белков в ПГУ, ни в случае инфекции гепатоцитов вирусными частицами из культуральнойэансфедированных LMH клеток, ни в случае STHBY-содержащих исходных сывороток крови аистов. Для выявления единичных сигналов внутриклеточной экспрессии вирусных белков был проведён иммунофлюоресцентный анализ фиксированных гепатоцитов с использованием поликлональных антител к Core белку вируса DHBV, перекрёстно реагирующих с Core белком вируса STHBV. Согласно результатам проведённого анализа/ эффективность инфекции ЛГУ вирусными частицами клона STHBV 21 былауприблизительно; в 10000 раз ниже эффективности DHBV-инфекции в позитивном контроле (Рис. 32).АБРис.32. Анализ внутриклеточной экспрессии вирусных белков в гепатоцитах утки, инфицированных вирусными частицами из сывороток крови аистов (Б) и уток (А), (положительный контроль). Анализ методом непрямой иммунофлюоресценции проведён с использованием поликлональных антител к PreS белку оболочки вируса серых цапель HHBV. Ядра клеток окрашены красителем Hoechst Nuclear Dye.

В случае инфекции ПТУ вирусными частицами БТНВ V из исходных сывороток крови инфицированных аистов также удалось выявить лишь5. Разработка подходов к созданию антивирусной стратегии с использованием ингибиторов протеасом.

Было исследовано in vitro действие наиболее изученных и эффективных ингибиторов протеасом - PS 341, эпономицина и эпоксомицина на развитие и распространение гепатита В культуре гепатоцитов утки. В ходе работы получены следующие результаты:ИП подавляют секрецию вирусных частиц.

Для оценки воздействия ИП на протекание вирусной инфекции в культуральную среду инфицированных ПГУ было добавлено различное количество ингибитора протеасом PS 341 (конечная концентрация 1 нМ, 10 нМ, 1 мкМ, 3 мкМ и 10 мкМ). Через 48 часов инкубации среда была собрана, а сами клетки лизированы в Лэммли буфере. Последующий анализ внутриклеточной экспрессии вирусных белков проводился методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к PreS белку оболочки DHBV или Core белку капсида вируса DHBV. Согласно результатам анализа, обработка заражённых гепатоцитов ингибитором протеасом PS 341 ведёт только к крайне незначительному снижению внутриклеточной экспрессии PreS или Core белка даже при высокой концентрации PS 341 в среде. При этом окраска мембраны иммуноблота с нанесёнными на нее белками исследуемых образцов реагентом Кумасси Синий не выявила сколько-нибудь заметного снижения уровня экспрессии клеточных белков.

В то же время при иммуноферментном анализе собранных культуральных сред отмечено ярко выраженное подавление секреции PreS белка в культуральную среду, находящееся в прямой зависимости от концентрации PS 341 в среде. Уже при сравнительно низкой концентрацииРБ 341, равной 10 нМ, содержание РгеБ белка в среде снизилось, по меньшей мере, в 10 раз по сравнению с контрольной культурой хронически инфицированных гепатоцитов, не подвергшейся обработке РБ 341 (Рис. 33). Проведенный параллельно дот-блот анализ содержания вирусной ДНК в образцах культуральных сред данного эксперимента подтвердил сделанный вывод о резком снижении уровня секреции вирусных частиц после обработки гепатоцитов ИП (данные не приведены).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что обработка инфицированных ПГУ ингибитором протеасом РБ 341 с концентрацией ниже 10 мкМ не влияет на уровень внутриклеточной экспрессии структурных белков, но ведёт к значительному подавлению секреции вирусных частиц в культуральную среду этих клеток.

При этом, согласно данным проводимого, приблизительно, каждые 12 часов визуального контроля морфологии клеток, повышение концентрации ИП (РЭ 341) в среде до 10 мкМ не оказывает токсического действия на жизнеспособность гепатоцитов.ps341cm.iv!)10 3 1 0.01 0.001„—р36 р28Рис.33. ИП подавляют секрецию вирусных частиц из ПГУ, инфицированных вирусом гепатита В уток DHBV. Иммуноферментный анализ проведен с использованием поликло-нальных антител к PreS белку вируса DHBV.

ИП блокируют вторичную инфекцию культуры ПГУ.

В ходе проведения параллельных экспериментов было продемонстрировано резкое снижение инфекционности вирусных частиц, секретируемых гепатоцитами утки, обработанными ИП (данные не приведены). Эти данные также предполагают блокирование вторичной инфекции, т.е. распространения инфекции на еще не инфицированные гепатоциты.

К культуре ПГУ была добавлена культуральная среда, содержащая вирус DHBV. После 16 часов инкубации среда была удалена, клетки подвергнуты интенсивной отмывке в PBS и к ним добавлена новая среда, не содержащая вирус. Спустя три дня (время, необходимое для установления первичной инфекции) эта среда была, в свою очередь, заменена на среду, с конечной концентрацией в ней ИП PS 341, эпономицина или эпоксомицина, равной 1 мкМ. Спустя ещё три дня клетки были фиксированы смесью метанола и ацетона (1/1) и анализированы методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием поликлональных антител к Core белку вируса DHBV. В образцах, подвергнутых обработке ИП, было выявлено гораздо меньшее количество инфицированных клеток, чем в контрольных образцах инфицированных гепатоцитов, где подобная обработка ИП не проводилась (данные не приведены).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Прасолов, Алексей Владимирович

Выводы:

1. В коллекции из 145 сывороток крови 41 вида птиц в 32 образцах 9 видов были обнаружены вирусы гепатита В птиц.

2. Обнаружены новые вирусы гепатита В птиц : а) в сыворотке крови серых венценосных журавлей (Baleatrica regu-lorum) и журавлей-красавок {Arthropoid.es virgo) - вирус гепатита В журавлей CHBV с необычно широким спектром хозяев; б) в сыворотке крови красноголового гуся (Chloephaga rubidiceps) -вирус гепатита В красноголовых гусей RHHBV; в) в сыворотке крови белых и чёрных аистов (Ciconia ciconia и Cico-nia nigra) - вирус гепатита В аистов STHBV.

3. Проведён молекулярно-биологический анализ новых вирусов: а) определена полная нуклеотидная последовательность ДНК геномов трёх обнаруженных новых вирусов гепатита В птиц (CHBV, RHHBV и STHBV). На её основе предсказана последовательность аминокислотных остатков вирусных белков. б) проведён сравнительный компьютерный анализ последовательностей нуклеотидов геномных ДНК, а также предсказанных последовательностей аминокислотных остатков белков известных и обнаруженных новых гепаднавирусов птиц. в) проведён функциональный анализ новых вирусов in vitro.

4. Впервые показана пермиссивность представителей отряда птиц Gruiformes (Журавлеобразные) и семейства Ciconiidae (Аистовые) для вирусов гепатита В.

5. Выявлен более широкий, чем это предполагалось ранее, спектр хозяев вирусов гепатита В - DHBV и HHBV. Впервые продемонстрировано присутствие известных Avihepadnaviruses в сыворотке крови птиц,

145 случаи заражения которых вирусами гепатита В птиц никогда не были зарегистрированы ранее: а) вирус серой цапли впервые обнаружен у больших белых (Ardeas heroidas occidentalis) и больших голубых цапель (Ardeas heroidas); б) вирус уток DHBV впервые обнаружен у представителей семейства утиных разноцветного чирка (Anas versicolor) и роскошной свиязи (Anas sibilatrix).

6. Впервые установлено супрессирующее влияние ингибиторов протеасом на развитие первичной и вторичной инфекции гепатита В утки in vitro в культуре ПГУ.

Подписи к приложениям Приложение 1

Сравнение последовательности нуклеотидов геномной ДНК клона ССНВ\/ 1 вируса гепатита В журавлей с соответствующими последовательностями клонированных геномов других известных вирусов гепатита В птиц: РСНВУ, БСНВУ 15, ОНВУ 16, ННВУ4 и вТНВУ 21. Точки и дефисы в последовательностях нуклеотидов геномной ДНК вирусных клонов, сравниваемых с ССНВ\/, обозначают гомологичные и отсутствующие нуклеотиды, соответственно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прасолов, Алексей Владимирович, Москва

1. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., и Карпов B.J1. Протеасома: разрушать, чтобы жить. Мол. Биол.2000; 36(5):761-776

2. Adams J., Behnke М., Chen S., Cruickshank A.A., Dick R.L., Grenier L., Klunder J. M., Ma Y.-T., Plamondon L., and Stein R.L. Potent and selective inhibition of the proteasome: dipeptidyl boronic acids. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998; 8:333-338

3. Adams J., and Stein R. Novel inhibitors of the proteasome and their theurapeutic use in inflammation. Annu. Rep. Med. Chem. 1996; 31:279-288

4. Bandelt H.J and Dress A.W. Split decomposition: a new and useful approach to phylogenetic analysis of distance data. Mol Phylogenet Evol. 1992; l(3):242-52.

5. Barrasa M.I., Guo J.T., Saputelli J., Mason W.S., and Seeger C. Does a cdc2 kinase-like recognition motif on the core protein of hepadnaviruses regulate assembly and disentegration of capsids? J.Virol. 2001; 75:2024-2028

6. Bartenschlager R., Junker-Niepmann M., and Schaller H. The P gene product of hepatitis В virus is required as a structural component for genomic RNA encapsidation. J. Virol. 1990; 64(11):5324-5332

7. Baumeister W., Walz J., Zuhl F., and Seemueller E. The proteasome: paradigm of a self-compartmentalizing protease. Cell. 1998; 92(3):367-380

8. Blumberg B.S. and Krugman S., moderators. Passive and active immunization and treatment. In: Szmuness W., Alter H.J., Maynard J.E., eds. Viral hepatitis 1981 Symposium. Philadelphia: Franklin Institute Press, 1982: 377-544

9. Borel C., Sunyach C.,Hantz 0.,Trepo C„ and Kay A. Phosphorylation of DHBV Pre-S: Identification of the major site of phosphorylation and effects of mutations on the virus life cycle. Virology. 1998; 242:90-98

10. Buscher M., Reiser W., Will H., and Schaller H. Transcripts and the putative RNA pregenome of duck hepatitis В virus: Implications for reverse transcription. Cell. 1985; 40(3):717-724

11. Calvert J. and Summers J. Two regions of an avian hepadnavirus RNA pregenome are required in cis for encapsidation. J.Virol. 1994; 68:2084-2090

12. Challberg M.D. and Kelly T.J. Animal virus DNA replication. Annu. Res. Biochem. 1989; 58: 671-717

13. Chang S.-F., Netter H.J., Bruns M., Schneider R., Froelich K., and Will H. A new avianhepadnavirus infecting snow geese (Anser caerulescens) produces a significant fraction of virions containing single stranded DNA. Virology 1999; 262: 39-54

14. Chang S.-F., Netter H.J., Hildt E., Schuster R., Schaefer S., Hsu Y.C., Rang A., and Will H. Duck hepatitis B virus expresses a regulatory HBx-like protein from a hidden open reading frame. J. Virol. 2001; 75: 161-170

15. Cheung R.C., Trujilo D.E., Robinson W.S., Greenberg P.L., and Marion P.L. Epitope-specific antibody response to the surface antigen of duck hepatitis B virus in infected ducks. Virology. 1990; 176:546-552

16. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome pathway: on protein death and cell live. EMBO J. 1998;17:7151-7160

17. Condreay L.D., Cats C.E., Mason W.S., and Wu T.T. Efficient duck hepatitis B virus production by an avian liver tumor cell line. J. Virol. 1990; 60:3249-3258

18. Dane DS, Cameron CH, and Briggs M. Virus-like particles in the serum of patients with Australia-antigen-associated h epatitis. 1970. Lancet. 1:695-698

19. DeMartino G.N., and Slaughter C. A. J. The proteasome, a novel protease regulated by multiple mechanisms. Biol. Chem. 1999; 274: 22123-22126

20. Deshaies R.J. Trends Cell Biol. 1995; 5: 428-434

21. Eng F.J., Novikova E.G., Kuroki K., Ganem D., and Fricker L.D. A protein that binds duck hepatitis B virus particles, has metallocarboxypeptidase D-like enzymatic activity. J Biol Chem 1998: 273(14):8382-8388

22. Fernholz D. Studien zur Synthese and Funktion der Huellproteine bei Hepatitis B Viren. Ph.D. thesis, Universitaet Muenchen, Germany 1992

23. Ferrel K., Wilkinson C.R., Dubiel W., and Gordon C. Regulatory subunit interactions of the 26S proteasome, a complex problem. Trends Biol. Sci. 2000; 25:83-88

24. Ganem D. and Schneider R.J. Hepadnaviridae: the viruses and their replication. In: Fields "Virology" 2002; vol. 2 (86) 2923-2969

25. Gerber M.A., Hadziyannis S.,Vissoulis C., Schaffner F., Paronetto F., and Popper H. Electron microscopy and immunoelectronmicroscopy of cytoplasmic hepatitis B antigen in hepatocytes. Am. J. Pathol. 1974; 75(3):489-502

26. Grob P.J. Hepatitis B: virus, pathogenesis and treatment. Vaccine 1998; 16:11-16

27. Groll M., Dietzel L., Loewe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H.D., and Huber. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 1997; 386: 463-471

28. Groll M., Heinemeyer W., Jager S., Ullrich T., Bochtler M., Wolf D.H., and Huber R. Thecatalytic sites of 20S proteasomes and their role in subunit maturation: a mutational and crystallographic study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 10976-10983

29. Hanada M., Sugawara K., Kaneta K., Toda S., Nishiyama Y., Tomita K., Yamamoto H., Konishi M., and Oki T. Epoxomicin, a new antitumor agent of microbial origin. J. Antibiot. 1992; 45: 1746-1752

30. Henkler F. and Koshy R. Multiple functions of the hepatitis B virus X protein. Viral Hepatitis Rev. 1996;2:143-59

31. Hershko A. and Ciechanover A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67:425-479

32. Hirsch R.C., Lavine J.E., Chang L.J., Varmus H.E., and Ganem D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for the reverse transcription. Nature 1990; 344 (6266):552-555

33. Hirsch R.C., Loeb D.D., Pollack J.R., and Ganem D. cis-Acting sequences required for encapsidation of duck hepatitis B virus pregenomic RNA. J.Virol. 1991; 65(6):3309-3316

34. Hochshtrasser M. Ubiquitin-dependent protein degradation. Annu. Rev. Genetics. 1996; 30: 405439

35. Hohenberg, H., Mannweiler, K., and Mueller, M. High-pressure freezing of cell suspensions in cellulose capillary tubes. J. Microsc, 1994; 175: 34-43

36. Hoofnagle J. H. and DiBisceglie A.M. The treatment of chronic viral hepatitis. N. Engl. J. Med. 1997; 336:347-356

37. Hu J. and Seeger C. Hsp90 is required for the activity of a hepatitis B virus reverse transcriptase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93(3): 1060-1064

38. Hu J., Toft D.O., and Seeger C. Hepadnavirus assembly and reverse transcription require a multi-component chaperone complex which is incorporated into nucleocapsids. EMBO J. 1997; 16(l):59-68

39. Hu Z., Zhang Z., Doo E., Coux O., Goldberg A.L., and Liang T.J. Hepatitis B virus X protein is both a substrate and a potential inhibitor of the proteasome complex. J. Virol. 1999; 73:72317240

40. Junker-Niepmann M., Bartenschlager R., and Schaller H. A short cis-acting sequence is acting is required for hepatitis B virus pregenome encapsidation and sufficient for packaging of foreign RNA. EMBO J. 1990; 9 (10): 3389-3396

41. Kawaguchi T., Nomura K., Hirayama T., and Kitagawa T. Establishment and characterisation of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH. Canser Res. 1987; 47: 4460-4464

42. Kuroki K., Cheung R., Marion P.L., and Ganem D. A cell surface protein that binds avian hepatitis B virus particles. J.Virol. 1994; 68:2091-2096

43. Liu C., Mason W.C., and Burch J.B. Identification of factor-binding sites in the duck hepatitis B virus enhancer and in vivo effects of enhancer mutations. J.Virol. 1994; 68:2286-2296

44. Lowe J., Stock D., Jap B. Zwickl P, Baumeister W., and Huber R. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 1995; 268: 533-539

45. MacCallum F.O. Homologous serum jaundice. Lancet 1947; 2:691-692

46. Macrae D. R., Bruss V., and Ganem D. Myristylation of a duck hepatitis B virus envelope protein is essential for infectivity but not for virus assembly. Virology. 1991; 181:359-363

47. Marion P. L., Cuilen J. M., Azcarraga R.R., Van Davelaar M. J., and Robinson W.S. Experimental transmission of duck hepatitis B virus to Pekin ducks and to domestic geese. Hepatology. 1987; 7: 724-731

48. Mason W.S., Seal G., and Summers J. A virus of Pekin ducks with structural and biological rekatedness to human hepatitis B virus. J.Virol. 1980; 36: 829-836

49. Mayo M.A. and Pringle C.R. Virus taxonomy-1997. J.Gen.Virol. 1998;79:649-657

50. Mellon P., Parker V., Glutzman Y., and Maniatis T. Identification of DNA sequences required for transcription of the human alpha 1 -globin gene in a new SV40 host-vector system. Cell. 1981 Dec;27(2 Pt l):279-88

51. Meng L., Kwok B.H., Sin N., and Crews C.M. Eponemycin exerts its antitumor effect through the inhibition of proteasome function. Canser Res. 1999a; 59: 2798-2801

52. Meng L., Mohan R., Kwok B.H., Elofsson M., Sin N., and Crews C.M. Epoxomicin, a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999b; 96(18):10403-10408

53. Neurath A.R., Kent S.B., Strick N., and Parker K. Identification and chemical synthesis of a host cell receptor binding site on hepatitis B virus. Cell 1986:46(3):429-436

54. Neurath A.R., Strick N., and Li Y.Y. Cells transfected with human interleukin 6 cDNA acquire binding sites for the hepatitis B virus envelope protein. J.Exp.Med. 1992; 176(6): 1561-1569

55. Ott D.E., Coren, L.V, Chertova E.N., Gagliardi T.D., and Schubert U. Ubiquitination of HIV-1 and MuLV Gag. Virology. 2000; 278:111-121

56. Ou J.H., Yeh C.T., and Yen T.S. Transport of hepatitis B virus precore protein into the nucleus after cleavage of its signal peptide. J. Virol. 1989; 63(12): 5238-5243

57. Palombella V.J., Rando O.J., Goldberg A.L., and Maniatis T. The ubiquitin-proteasome pathway is required for processing the NF-kappa B1 precursor protein and the activation of NF-kappa B. Cell. 1994; 78:773-785

58. Pamer E. and Cresswell P. Mechanisma of MHC class I-restricted antigen processing. Annu. Rev. Immunol. 1998; 16:323-358

59. Pathaik A., Chau V., and Wills J.W. Ubiquitin is part of the retrovirus budding machinery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 13069-13074

60. Pollack J.R. and Ganem D. Site-specific Rna binding by a hepatitis B virus reverse transcriptase initiates two distinct reactions: RNA packaging and DNA synthesis. J.Virol. 1994; 68 (9): 55795587

61. Prince A.M. An antigen detected in the blood during the incubation period of serum hepatitis. Proc Natl acad Sci USA 1968; 60: 814-821

62. Pugh J.C., Snisky J.J., Summers J.W., and Schaeffer E. Characterization of a pre-S polypeptide on the surfaces of infectious avian hepadnavirus particles. J. Virol. 1987; 61 (5): 1384-1390

63. Pugh J.C. and Simmons H. Duck hepatitis B virus infection of Muscovy duck hepatocytes and nature of virus resistance in vivo. J.Virol. 1994; 68: 2487-2494

64. Pugh J.C. and Summers J.W. Infection and uptake of duck hepatitis B virus by duck hepatocytes maintained in the presence of dimethyl sulfoxide. Virology. 1989; 172(2):564-572

65. Pult I., Netter H.J., Bruns M., Prassolov A., Sirma H., Hohenberg H., Chang S.-F., Froelich K., Krone O., Kaleta E. F., and Will H. Identification and analysis of a new hepadnavirus in white storks. Virology. 2001; 289:114-128

66. Rigg R.J. and Schaller H. Duck hepatitis B virus infection is not dependent on low pH. J.Virol. 1992;66(5):2829-2836

67. Rivett A.J. and Gardner R.C. Proteasome inhibitors: from in vitro uses to clinical trials. J.Pept. Sci. 2000; 6:478-488

68. Robertson B.H., and Margolis H.S. Primate hepatitis B viruses genetic diversity, geography and evolution. Rev. Med. Virol. 2002; 12: 133-141

69. Rock K.L. and Goldberg A.L. Degradation of cell proteins and the generation of MHC class Ipresented peptides. Annu. Rev. Immunol. 1999; 17: 739-779

70. Rothmann K., Schnolzer M., Radziwill G., Hildt E., Moelling K., and Schaller H. Host cellvirus cross talk: Phosphorylation of a hepatitis B virus envelope protein mediates intracellular signaling. J. Virol. 1998; 72: 10138-10147

71. Russel S.J., Steger K.A., and Jonston S.A. Subcellular localization, stoichiometry, and protein levels of 26 S proteasome subunits in yeast. J.BioI.Chem. 1999; 274:21943-21952

72. Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Handbook Laboratory Press. 1989

73. Schlicht H.J., Kuhn C., Guhr B., Mattaliano R.J., and Schaller H. Biochemical and immunological characterization of the duck hepatitis B virus envelope proteins. J.Virol. 1987;61(7): 2280-2285

74. Schlicht H.J., Radziwill G., and Schaller H. Synthesis and encapsidation of duck hepatitis B virus reverse transcriptase do not require formation of core-polymerase fusion proteins. Cell.1989;56(l):85-92

75. Schlicht H.J., Salfeld J., and Schaller H. The duck hepatitis B virus pre-C region encodes a signal sequence which is essential for synthesis and secretion of processed core proteins but not for virus formation. J. Virol. 1987; 61(12): 3701-3709

76. Schneider R., Fernholz D., Wildner G., and Will H. Mechanisms, kineticss and role of duck hepatitis B virus e-antigen expression in vivo. Virology 1991; 182(2): 503-512

77. Schoedel F, Weimer T., Fernholz D., Schneider R., Sprengel R., Wildner G., and Will H. The biology of avian hepatitis B viruses. In: "Molecular Biology of hepatitis B viruses."

78. A. McLachlan,Ed) CRC Press. Boca Raton. FL. 1991:53-80

79. Schubert U., Anton L.C., Gibbs J., Norbury C.C., Yewdell J.W., and Bennink J.R. Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes. Nature. 2000b;404: 770-774

80. Seeger C., Ganem D., and Varmus H.E. Biochemical and genetic evidence for the hepatitis B virus replication strategy. Science. 1986; 2329(4749): 477-484

81. Seeger C. and Mason W.S. Hepatitis B virus biology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; 64:5168

82. Seifer M., Zhou S., and Standring D.N. A micromolar pool of antigenically distinct precursors is required to initiate cooperative assembly of hepatitis B virus capsids in Xenopus oocytes. J. Virol. 1993; 67 (1): 249-257

83. Sprengel R., Kaleta E.F., and Will H. Isolation and characterization of a hepatitis B virus endemic in herons. J. Virol. 1988; 62: 3832-3839

84. Sprengel R., Kuhn C., Manso C., and Will H. Cloned duck hepatitis B virus DNA is infectious in Pekin ducks. J.Virol. 1984; 52(3):932-937

85. Sprengel R., Kuhn C., Will H., and Schaller H. Comparative sequence analysis of duck and human hepatitis B virus genomes. J. Med. Virol. 1985; 15: 323-333

86. Strack B., Calistri A., Accola M.A., Palu G., and Goettlinger H.G. A role for ubiquitin ligase recruitment in retrovirus release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 13063-13068

87. Su Q., Schroeder C.H., Hofman W.J.Expression of hepatitis B virus X protein in HBV-infected human livers and hepatocellular carcinomas. Hepatology. 1998; 27:1109-1120

88. Sugawara K., Hatori M., Nishiyama Y., Tomita K., Kamei H., Kohishi M., and Oki T. Eponomycin, a new antibiotic active against B16 melanoma. J. Antibiot. 1990; 43: 8-18

89. Summers J. and Mason W.S. Replication of the genome of a hepatitis B-like virus by reverse transcription of an RNA intermediate. Cell 1982; 29(2):403-415

90. Sunyach C., Rollier C., Robaczewska M., Borel C., Barraud L., Kay A., Trepo C., Will H., and Cova L. Residues critical for duck hepatitis B virus neutralization are involved in host cell interaction. J.Virol. 1999; 73: 2569-2575

91. Takahashi K, Machida A, Funatsu G, Nomura M, Usuda S, Aoyagi S, Tachibana K, Miyamoto H, Imai M, Nakamura T, Miyakawa Y, Mayumi M. Immunochemical structure of hepatitis e-antigen in the serum. J Immunol. 1983 ; 130(6):2903-7.

92. Tan F., Rehli M., Krause W.S., and Skidgel R.A. Sequence of human carboxypeptidase D reveals it to be a member of the regulatory carboxypeptidase family with three tandem active site domains.Biochem.J. 1997; 327:81-87

93. Tong S., Li J., and Wands J. R. Interaction between duck hepatitis B virus and a 170-kilodalton cellular protein is mediated through a neutralizing epitope of the pre-S region and occurs duringviral infection. J Virol. 1995; 69: 7106-7112

94. Tong S., Li J., and Wands J. R. Carboxypeptidase D is an avian hepatitis B virus receptor. J. Virol. 1999; 73: 8696-8702

95. Triatni M., Ey P., Tran T., Le Mire M., Qiao M., Burrell C., and Jillbert A. Sequence comparison of an Australian duck hepatitis B virus strain with other avian hepadnaviruses. J. Gen. Virol. 2000; 82: 373-378

96. Urban S., Breiner K.M., Fehler F., Klingmueller U., and Schaller H. Avian hepatitis B infection is initiated by the interaction of a distinct pre-S subdomain with the cellular receptor gpl80. J.Virol. 1998; 72(10): 8089-8097

97. Urban S. and Grippon P. Inhibition of duck hepatitis B virus infection by a myristoylated Pre-S peptide of the large viral surface protein. J. Virol. 2002; 76(4); 1986-1990

98. Urban S., Schwarz C., Marx U.C., Zentgraf H., Schaller H., and Multhaup G. Receptor recognition by a hepatitis B virus reveals a novel mode of a high affinity virus-receptor interaction. EMBO J. 2001; 19:1217-1227

99. Voges D., Zwickl P., and Baumeister P. The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Annu. Rev. Biochem. 1999; 68: 1015-1068

100. Will H., Reiser W., Weimer T., Pfaff E., Buscher M., Sprengel R., Cattaneo R., and Schaller H. Replication strategy of human hepatitis B virus. J.Virol. 1987; 61(3):904-911

101. Yeh C.T., Liaw Y.F., and Ou J.H. The arginine-rich domain of hepatitis B virus precore and core proteins contains a signal for nuclear transport. J. Virol. 1990; 64 (12): 6141-6147

102. Yu M., Emerson S.U., Cote P., Shapiro M., and Purcell R.H. The GDPA1 region of the Pre-Sl envelope protein is important for morphogenesis of woodchuck hepatitis virus. Hepatology.1998; 27:1408-1414

103. Yu M., Miller R.H., Emerson S., and Purcell R.H. A hydrophobic heptad repeat of the core protein of woodchuck hepatitis virus is required for capsid assembly. J. Virol. 1996; 70:70857091

104. Yu M. and Summers J. Multiple functions of capsid protein phosphorylation in duck hepatitis B virus replication. J. Virol. 1994; 68: 4341-4348

105. Zhang Z., Torii N., Furusaka A., Malayaman N., Hu Z., and Liang T.J. Structural and167

106. Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

107. Pult I., Netter H.J., Bruns М., Prassolov A., Sirma Н., Hohenberg Н., Chang S.-F., Frolish k., Krone O., Kaleta E.F., and Will H."Identification and Analysis of a New Hepadnavirus in White Storks". Virology 2001, V.289, 114-128.

108. Прасолов А. "Обнаружение нового вируса гепатита В птиц с необычно широким кругом хозяев" Доклады Академии наук 2002 Т.387, N2, 261-264

109. Prassolov A., Hohenberg Н., Schneider С., Cova L., Krone О., Frolich К, Will Н., and Sirma Н."А New Avian Hepadnavirus in Cranes with Unexpected Host Range" Journal of Virology (Принято в печать)

110. Prassolov A., Sirma H., Frolish K., Newbold J., Will H., Steinbach. "Variants of Hepatitus В like virus in captive and free ranging great blue herons (Ardea heroidas) from North America" Journal of Wild desease (принято в печать).

111. Заявка на международный патент PCT/DE 01 -03908, зарегистрирована 3. 10. 2001 г.

112. Средства для подавления вирусных инфекций."

113. Заявка на патент в Германии AZ 10149388.3, зарегистрирована 3.10. 2001.

114. Средства для подавления инфекций, вызываемых вирусами группы гепатита В"1681. БЛАГОДАРНОСТИ

115. Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю профессору Александру Габибовичу Габибову за плодотворные дискуссии и всестороннюю поддержку, оказанную на всех этапах работы.

116. Искренне признателен профессору Г.Виллу за постоянную поддержку и интерес к моей работе, ценные замечания и советы.