Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействия вирусов с детонационными наноалмазными материалами и композитами на основе полианилина

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействия вирусов с детонационными наноалмазными материалами и композитами на основе полианилина"

фгфвах рукописи 7/сг^у

ИВАНОВА Марина Викторовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ С ДЕТОНАЦИОННЫМИ НАНОАЛМАЗНЫМИ МАТЕРИАЛАМИ И КОМПОЗИТАМИ НА ОСНОВЕ ПОЛИАНИЛИНА

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидат? биологических наук

Москва-2014 ] 8 (^¡гц ^

005552575

005552575

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

Маркушин Станислав Георгиевич, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией генетики РНК-содержащих вирусов ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова», РАМН Москва

Кордюкова Лариса Валентиновна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела хроматографического анализа «НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова», Москва

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа » Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Санкт -Петербург

Защита диссертации состоится « 6 » октября 2014 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.131.01 в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздаара России

Автореферат разослан Г 7 »^¿¿"¿^У/^/2014 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор медицинских наук \ _ Елена Ивановна Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Циркуляция в биосфере патогенных микроорганизмов среди восприимчивых организмов (человека, млекопитающих, птиц) определяет актуальность разработки средств и методов их дезактивации и удаления из среды. Распространение вирусных инфекций может осуществляться несколькими путями, среди которых наибольшую опасность по масштабности вовлечения в эпидпроцесс представляют воздушно-капельный и водный. Водная среда поддерживает жизнеспособность в природе энтеровирусов, вирусов гепатитов А и Е, аденовирусов, а также вирусов гриппа птиц. Инфицирование в начале XXI века людей и животных вирусами гриппа птиц A(H5N1), A(H7N7), A(H7N3), A(H9N2), а с 2013 года — A(H7N9) представляет риск формирования нового пандемического варианта (WER 2002, 2003, 2004, 2009, WHO 2014). Одним из примеров стало появление в апреле 2009 года вируса гриппа свиней — тройного реассортанта A(HlNl)pdm 09 вирусов гриппа птиц, свиней и человека. Его широкое распространение среди людей вынудило ВОЗ объявить уже в июне 2009 года 6-ую фазу пандемии (WER 2009, Львов Д.К., 2009). Ежегодно в мире регистрируют от 500 до 2000 заболеваний полиомиелитом у людей, что обуславливает присутствие вакцинного штамма вируса полиомиелита Сэбина типа 1 в списке вирусов, обязательных при исследовании эффективности вирулицидного действия дезинфицирующих средств (Носик H.H., Носик Д.Н., 2006). Удаление биологических патогенов из водных растворов может быть осуществлено с помощью фильтров, содержащих материалы, способных адсорбировать микроорганизмы.

Состояние научной разработанности проблемы. В научной литературе приводятся данные о взаимодействии вирусов с сорбентами. В России для вирусов гриппа были предложены: силикатные пористые сорбенты, соли BaS04, анионообменные смолы, макропористое стекло, модифицированный графит (Железнова Н.В. и др., 1975; Закстельская ЛЯ., Шендерович С.Ф., 1979; Рыбинская Л.Н. и др., 1982; Чубарова Н.И. и др., 1997; Иванова В.Т., Курочкина Я.Е. и др.,

2008). Успехи нанотехнологии в открытии и синтезе наноразмерных материалов, обладающих физико-химическими свойствами, отличными от своих макроскопических аналогов (Рамбиди Н.Г., Березкин А.В., 2009), позволяют рассматривать их в качестве возможных высокоэффективных сорбентов для вирусов. Открытые в России в 60-е годы XX века детонационные наноалмазы (ДНА) и их аналоги представляют интерес для биологов за счет наличия на их поверхности радикалов, содержащих атомы неуглеродной природы (О, Н, N, S), обуславливающих способность сорбировать биологические объекты (Schrand A.M. et al., 2009). К началу наших исследований была известна только одна работа по сорбции белков вируса ВИЧ через конковалин А на ДНА (Fujimura Т. et al., 2009). Способность некоторых полимеров, например, полианилина (ПАНИ) сорбировать вирусы (Иванова В.Т. и др., 2009) вызвала интерес к изучению ПАНИ композитов разной формы, в том числе с включением атомов серебра (Ag), поскольку присутствие Ag открывает возможность получения материалов, как с антивирусными, так и антибактериальными свойствами, присущими Ag (Щербаков Ф.Б. и др., 2006).

Цель исследования — изучить сорбционное взаимодействие вирусов гриппа человека и птиц, полиовируса (вакцинного штамма Сэбина типа 1), фрагментов ДНК, бычьего сывороточного альбумина с современными детонационными наноалмазными материалами и их модификациями, а также с полимерными композитами полианилина различной структуры, в т.ч. содержащими серебро, и произвести оценку этого взаимодействия по качественным и количественным показателям.

Задачи исследования

1. Изучить взаимодействие эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа человека и птиц с рядом новых материалов различной природы, состоящих из микро- и наноразмерных частиц на основе: 1) углеродных материалов в виде детонационных наноалмазных частиц и их производных, углеродных нанотрубок, 2) проводящих полимеров на основе ПАНИ нанотрубок, композитов — ПАНИ нанотрубок и ПАНИ гранул, содержащих серебро.

2. Исследовать влияние ряда физических (температуры и времени воздействия) и биологических (систем культивирования и степени очистки вирусов) факторов на эффективность сорбции вирусов гриппа на детонационные наноалмазные материалы и их модификации.

3. Изучить сорбцию фрагментов ДНК на различные наноалмазные и полимерные наносорбенты.

4. Исследовать взаимодействие вируса полиомиелита на модели вакцинного штамма Сэбина типа 1 с наноалмазными и полимерными наносорбентами.

5. Оценить возможность использования выбранных сорбентов для удаления из растворов белков невирусной природы — бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулинов из иммунных сывороток.

6. Рассмотреть влияние исследуемых сорбентов на биологические объекты in vivo и in vitro .

Объект исследования. Эталонные, эпидемические, пандемические штаммы вирусов гриппа А и В, циркулировавшие в России и в мире в период с 1999 по 2013 годы; вирусы гриппа птиц с гемагглютинином Н5 (реассортанты A(H5N1) и A(H5N2)); полиовирус вакционного штамма Сэбина тип 1, фрагменты ДНК (полученные в результате амплификации РНК вирусов гриппа), иммуноглобулины.

Предмет исследования. Изучение взаимодействия вирусов гриппа человека, птиц, реассортантов, полиовируса, иммуноглобулинов, фрагментов ДНК с современными наноразмерными сорбентами различной природы (наноалмазные материалами и полимерными композитами) в зависимости от различных факторов: структуры вирусов, степени их очистки и методов культивирования, времени контакта вирусов с сорбентами, температуры среды, концентрации вирусов и сорбентов. Определение репродуктивной вирусной активности клеток и состояния животных после контакта с сорбентами.

Теоретические и методологические основы исследования. В основу научно-квалификационного исследования легли вопросы вирусологии, дезинфектологии. В работе применяли общенаучные и специальные методы исследования (методы культивирования вирусов и лабораторной медицинской

диагностики, молекулярно-биологические методы изучения структуры и свойств вирионов).

Информационная база исследования. В качестве информационных источников использовали научные публикации российских и зарубежных исследователей, представленных в журналах и книгах, материалы конгрессов и конференций, состоявшихся в РФ и за рубежом, методические инструкции и указания Минздрава РФ и Роспотребнадзора, инструкции к использованным в работе тест системам.

Основные научные результаты исследования, полученные лично автором.

Автором разработан метод удаления вирусов из водных растворов с помощью детонационных наноаламазных материалов. Проведена оценка влияния температурных, временных, количественных параметров, состава среды и антигенных свойств вирусов гриппа на сорбционное взаимодействие вирусов с изучаемыми сорбентами, проведена модификация наноалмазов (хлорирование, графитизация), изучено взаимодействие наноматериалов с вирусом полиомиелита, изучено влияние присутствия Ag в ПАНИ нанотрубках на сорбцию вирусов гриппа, полиомиелита, фрагментов ДНК. Проведена иммунизация животных, рассмотрено влияние исследуемых наноматериалов на культуру клеток тканей MDCK и гемопоэз лабраторных животных. Впервые установлена способность детонационных наноматериалов и их модификаций, композитов ПАНИ-нанотрубок и гранул, содержащих Ag и без него, сорбировать вирусы гриппа А и В из растворов (физиологического раствора, раствора культуральной питательный среды Игла MEM, аллантоисной жидкости куриных эмбрионов), фрагменты ДНК из ФР.

Впервые выявлена способность детонационных наноматериалов, ПАНИ нанотрубок и гранул, содержащих и не содержащих Ag, сорбировать полиовирус из раствора культуральной питательной среды Игла MEM.

Впервые установлено, что введение частиц Ag в структуру ПАНИ нанотрубок и гранул повышает их адсорбционную способность относительно вирусов гриппа А и В, фрагментов ДНК, полиовируса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вирусы гриппа и фрагменты ДНК (полученные в результате амплификации участков РНК вируса гриппа) активно сорбируются из растворов на ДНА содержащие наноматериалы.

2. Параметры эксперимента - температура и время взаимодействия не оказывают влияния (после 15 минут контакта) на эффективность взаимодействия вирусов гриппа с исследуемыми наноматериалами.

3. Вирусы гриппа и фрагменты ДНК способны сорбироваться из растворов на полианилиновые нанотрубки, содержащие серебро и без серебра. Присутствие серебра увеличивает сорбционное взаимодействие.

4. Вирус полиомиелита (вакцинный штамм Сэбина тип 1) способен сорбироваться из растворов на наноматериалы на основе полианилиновых нанотрубок с серебром и без него, а также на модифицированные наноалмазы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты по изучению взаимодействия вирусов гриппа А и В, фрагментов ДНК, полученных при амплификации РНК вирусов гриппа, с детонационными наноматериалами (шихтой, наноалмазами и их аналогами с модифицированной поверхностью составили предмет заявки на изобретение "Сорбенты — детонационные наносодержащие материалы; способы получения иммуносорбентов на их основе и иммуносорбции" №2013117675 от 17.04.2013 г. Изложенный в заявке метод может быть рекомендован для деконтаминации растворов, содержащих вирусы гриппа А и В, в том числе пандемических штаммов A(HlNl)pdm09, вирусов гриппа птиц из водных резервуаров в среде их обитания, фрагментов ДНК. Важно отметить, что ДНА материалы способны удалять из растворов вирус полиомиелита (вакцинный штамм Сэбина тип 1), внесенный в список вирусов обязательных для исследования антивирусных дезинфекционных средств (Носик H.H., Носик Д.Н., 2006).

Расширен спектр адсорбционных свойств ПАНИ материалов при добавлении в их состав серебра. Наряду с ранее установленными антибактериальными свойствами Ag содержащих материалов данные композиты обладают антивирусной активностью и могут использоваться как материалы для водных фильтров, обладающие как антивирусным, так и антибактериальным действием, имеющие практическое применение в медицине и быту.

Апробация результатов исследования. Результаты работ были представлены на международных симпозиумах, конференциях и выставках: VII Московском международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития», 21-25 марта 2011; German-Russian Young Researchers Workshop on "Methods to study Influenza virus", Berlin Germany 20-23.-09. 2011; IV Nanotechnology International Forum, Rusnanotech 26-28 октября 2011; 6th Nanosmat conference, Krakov, Poland, 17-20th October 2011; XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии 25-30 сентября 2011 года, Волгоград; IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 26-28 марта 2012 г.; The Materials Research Society (MRS) Spring Meeting, Materials Research Society. Symp. 2012 April 9-13, San Francisco, California, USA; Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», Москва 20-22 марта 2012 г.; Юбилейной Всероссийской научной конференции "Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека" Санкт-Петербург 19-20 апреля, 2012; Conference "Colloids and Nanomedicine 2012" 15-17 July 2012 г., Amsterdam, The Netherlands; International conference "Options for the Control of Influenza VIII", Cape Town, South Africa, 5—10 September 2013; 8-м Международном симпозиуме «Молекулярный Порядок и Подвижность в Полимерных Системах», 2-6 июня 2014 г., Санкт-Петербург, XII "International Conference on Nanostructured Materials", Moscow, 1318 July, 2014; на ХП международной специализированной выставке «Мир биотехнологии - 2014», Москва, 2014 г. (работа была отмечена дипломом и медалью).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 4 статьи в реферируемых и рекомендованных ВАК российских научных журналах, 2 статьи в американском и английском журналах, также 14 публикаций по материалам докладов в сборниках российских и международных конгрессов, и конференций. Оформлена 1 заявка на изобретение№2013117675 от 17.04.2013 РФ.

Структура и содержание диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 5 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список литературы включает 89 отечественных и 100 зарубежных источников. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, включая 24 таблицы и 26 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы и методы исследования

Вирусы. Использованы 15 эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В двух эволюционных линий В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88- подобных, циркулировавших в России и в мире в период с 1999 по 2013г.; в том числе, пандемические штаммы A(HlNl)pdm 09. Вирусы получены из Государственной коллекции вирусов, из коллекции вирусов ЦЭЭГ, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ, а также из справочных центров ВОЗ; вирусы гриппа птиц; реассортанты A(H5N1), A(H5N2) любезно предоставлены сотрудниками лаборатории физиологии ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ (заведующий лабораторией д.м.н., проф. Каверин Н.В.); вирус полиомиелита — сотрудниками лаборатории онтогенеза ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ ( заведующий лабораторий д.м.н. проф. Носик H.H.)

Клеточные линии: клетки культуры ткани MDCK предоставлены Международным центром по гриппу, сотрудничающим с ВОЗ, Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (CDC&P) г. Атланта, США. Клетки

культуры ткани Vero получены из коллекции клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ.

Культивирование вирусов гриппа проводили на 10-11 дневных развивающихся куриных эмбрионах (КЭ) и на клетках культуры ткани MDCK по методу Davies H.W. et al., 1978 ; Бурцева Е.И., 2002.

Гемагглютинирующую активность (ГА) вирусов гриппа определяли в реакции гемагглютинации (РГА) по общепринятой методике, рекомендованной ВОЗ, с использованием 0,75% взвеси эритроцитов 0(1) группы крови человека.

Определение инфекционного титра вирусов гриппа проводили на 9-10 дневных КЭ и клетках культуры ткани MDCK, используя 10 кратные разведения в ФР вируссодержащей жидкости до и после взаимодействия с сорбентом. Расчет инфекционных титров проводили по методу Рида и Менча.

Концентрированные и очищенные препараты вирусов гриппа получали дифференциальным центрифугированием в ультрацентрифуге фирмы Бекман L5-50 v=25000 об./мин., t=l4ac.

Культивирование вируса полиомиелита (вакцинный штамм Сэбина тип 1) проводили в культуре клеток Vero при 34°С в течение 48-72 часов. Для индикации вируса в растворе использовали титрование его в 96 луночных панелях, содержащих клетки Vero, по полному цитопатическому действию.

Сорбция и десорбция вирусов, фрагментов ДНК, белков проводили согласно Иванова В.Т., Курочкина Я.Е. и др . (2008).

Электрофорез белков до и после сорбции на сорбенты проводили в 12% ПААГе по методу Laemmli U.K. (1976).

Определение антител в иммунных сыворотках до и после их контакта с сорбентами и их комплексами с вирусами гриппа проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) согласно ВОЗ.

Ампликоны — фрагменты ДНК, полученные при амплификации РНК вирусов гриппа А и В в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-системы «ДНК технология».

Электрофорез фрагментов ДНК до и после сорбции на сорбенты проводили в 2% агарозном геле (Остерман Л.А.,1981).

Изменения в клетках культуры ткани MDCK in vitro после внесения 10 кратных разведений суспензий сорбентов определяли по состоянию монослоя с помощью инвертированного микроскопа и по ГА активности вируса гриппа в РГА.

Влияние сорбентов на гемопоэз изучали на лабораторных животных —белых крысах. Препарат вводили трижды внутрибрюшинно по 3 мг/животное с интервалом три недели. Формулу крови до и после введения препаратов животным определяли используя атлас клеток (Козинц Г.И. 1998).

Электронную микроскопию выполняли совместно с д.б.н., проф. Маныкиным A.A. (НИИ вирусологии МЗ РФ) и к.х.н., ст.н.с. Сапуриной И.Ю. (Институт высокомолекулярных соединений РАН, СПб),

Статистическую обработку результатов проводили стандартным методом Стьюдента, который включал вычисление средних квадратичных отклонений согласно Белякову В.Д. и др. (1981).

Сорбенты. Всего в работе было исследовано 17 сорбентов: детонационные наноалмазсодержащие материалы ( шихта и модифицированые наноалмазы, и композиты ДНА с (ПАНИ)), получены от предприятия «Синта» (Минск, Беларусь), модифицированы в Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, Москва, д.х.н. Спицыным Б.В.; углеродные нанотрубки (УНТ) из фирмы «Таунит», г. Тамбов; органические — ПАНИ композиты с содержанием Ag и без него приготовлены в Институте высокомолекулярных соединений РАН, СПб в.н.с., к.х.н. Сапуриной И. Ю.

Взаимодействие вирусов гриппа и фрагментов ДНК с наноалмазными и полимерными материалами

Факторами, обусловливающими выбор наноразмерных материалов и композитов на их основе, были их размеры, структура (углеродсодержащие и полимерные материалы), структура поверхностного слоя адсорбентов, форма,

включение ионов металла. Из результатов электронно-микроскопического анализа сорбентов, представленных на рис. 1, следует, что в водной суспензии ДНА и шихта представляют набор различной формы агрегатов — кластеров в размере от 10 до 300 нм. Их поверхность имеет вид зернистой структуры. Композиты ДНА с ПАНИ, нанотрубки ПАНИ имеют форму хаотично переплетенных толстых гладких нитей с разным диаметром, нанотрубки ПАНИ с Ag30% имеют шероховатую поверхность, композиты ПАНИ с А§70% находятся в гранулярной форме с варьируемыми размерами диаметра от 50 и до 100 нм .

Рис. 1. Электронная микроскопия: а) наноалмазов, б) шихты, в) композитов ПАНИ с ДНА, ПАНИ нанотрубок без Ag (г) и с (д), е) ПАНИ гранул с Ag

Результаты адсорбционной активности представителей оболочечных вирусов - вирусов гриппа А и В с вышеуказанными материалами представлены в табл. 1, 2, 3. Анализ полученных данных показывает, что после контакта с сорбентами регистрировали уменьшение ГА титра от 8 и до 2000 раз. Сорбционную активность наблюдали у вирусов гриппа с разными подтипами НА и ЫА, то есть она не зависела от антигенной формулы вирусов.

в 100нм

Таблица 1

Взаимодействие вирусов гриппа А и В с ДНА содержащими сорбентами при 22 °С

№ Сорбент Вирус/ степень очистки /система культивирования ГА титр

до сорбции после сорбции 'после десорбции

1 ДНА А/Новая Каледония/20/99 (НШ1) очищ,конц. КЭ 128000 256

2 А/Перт /16/09 (НЗЫ2) конц. КЭ 128000 16 _

3 В/Сичуань/379/99 очищ, конц. КЭ 128 <2

3 В/Флорида/04/06 конц. КЭ 128 2 <2 ГАЕ

4 А/Капифорния/04/09 (Н^1)р<1то9 аллантоисный КЭ 32 2 <2ГАЕ

5 В/Флорида/04/06 аллантоисный КЭ 32 8 _

6 В/Москва/03/2010 МОСК 128 <2 _

7 ДНАТ А/Перт/16/09 (НЗЫ2) конц. КЭ 128000 8 _

8 В/Флорида/04/06 конц. КЭ 128 2 <2ГАЕ

9 В/Москва/03/2010 МОСК 128 <2 _

10 Шихта А/Новая Каледония/20/99 (НШ1)очищ, конц. КЭ 2048 2 -

11 В/Флорида/04/06 конц. КЭ 2048 16

12 А/Перт/06/09 (НЗЫ2) аллантоисный КЭ 64 2 _

13 В/Флорида/04/06 аллантоисный КЭ 128 32 _

14 В/Москва/6/11 МОСК 64 <2 -

Примечание: *-ГА титр вируса после десорбции в ФР в течение 48ч. Т=22° С. .** - десорбция не изучалась

Таблица 2

Адсорбция вирусов гриппа А и В на модифицированные ДНА

№ Сорбент Вирус/антигенная формула/очистка ГА титр

до сорбции после сорбции ♦после десорбции

1 ДНАграф А/Перт/06/09 (H3N2), конц. в ФР 4096 256

В/Флорида/04/06, конц. в ФР 128 32

2 ДНАамин А/Перт/06/09 (H3N2), конц. в ФР 4096 128 -

А/Висконсин/67/05 (H3N2), очищ., конц. в ФР 2048 8

В/Флорида/04/06, конц. в PBS 128 16 _

А/Южная Каролина/02/2010 (HI Nl)pdm09, концен. в ФР 128-256 32 -

3 ДНАхл А/Перт/06/09 (H3N2), конц в ФР 4096 4 _

В/Флорида/04/06, конц. ФР 128 32 _

А/Висконсин/67/05 (H3N2), очищ., конц. в ФР 2048 4 _

4 ДНАТ В/Флорида/04/06, конц. ФР 128 2 <2

5 ДНАТ+ ПАНИ В/Сичуань/379/99 очищ, конц 64 8 <2

6 ДНАТ+ ПАНИ А/Калифорния/4/09 (HlNl)pdm09 аллантоисн. 32 4 -

7 ДНАТ+ ПАНИ А/Новая Каледония/20/99 конц 8192 8 2

Примечание: * ГА титр вируса после десорбции в ФР в течение 48ч; сорбция и десорбция при Т=22° С.** -десорбция не изучалась

Таблица 3

Сорбция вирусов гриппа на ПАНИ композиты

ГА титр

№ Сорбент Вирус ДО сорбции после сорбции после десорбции Т= 22 °С

1 ПАНИ нанотрубки В/Флорида/04/06 концентрированный 128 2 2

2 ПАНИ нанотрубки Ав 30% 128 4 2

3 ПАНИ нанотрубки А/Южная Каролина/02/2010 (НШ1) р<1т09 концентр. 128 8

4 ПАНИ нанотрубки Ай 30% 128 8 -

5 ПАНИ нанотрубки А/Утка/Приморье/2621 /01 (Н5Ш) аллантоисный 128 64-128 -

6 ПАНИ нанотрубки Ай 30% 128 4 -

7 ПАНИ нанотрубки 512 128 -

8 ПАНИ нанотрубки Ай 30% А/Виктория/361/11 (НЗЫ2) аллантоисный 512 8 -

Примечание *- десорбция не изучалась

Наибольшее падение ГА титров регистрировали у концентрированных и очищенных вирусов гриппа с высокими начальными титрами. При изменении способа получения ДНА из шихты или модифицировании поверхности ДНА при хлорировании, аминировании и графитизации взаимодействие вирусов с ДНА меняется, что подтверждается изменением ГА титров вирусов в растворах после контакта с сорбентами. Наибольшая активность была отмечена у шихты и модифицированных ДНА, что связано с увеличением количества атомов N. О, Н, С1 на поверхности ДНА и возникновением различного типа связей (ионных, донорно-акцепторных, Ван-дер-Ваальсовских и других) с функциональными группами аминокислот на поверхности НА и ЫА. Наименьшее падение ГА титров наблюдали у вирусов гриппа в растворах аллантоисной жидкости КЭ и культуральной среде клеток МОСК. Это объясняется как более низкими начальными ГА титрами, типичными для вирусов, выращенных в этих системах, так и наличием в растворах белков невирусного происхождения: аллантоисного белка КЭ и белков из телячьей сыворотки. При исследовании взаимодействия аплантоисных вирусов гриппа с ПАНИ композитами, содержащими А§, было выявлено , что введение серебра в состав композита ПАНИ ведет к увеличению его сорбционной активности в >10 раз. Эти данные свидетельствуют о взаимодействии вирусов не только с функциональными группами поверхности нанокомпозитов ПАНИ, но и с А§.

Антибактериальные свойства серебра известны достаточно давно, в настоящее время предложено несколько объяснений механизма взаимодействия бактерий с серебром (Щербаков Ф.Б. и др., 2006).

Падение ГА титров вирусов после их сорбции на ДНА и ПАНИ содержащие сорбенты сопровождалось падением инфекционного титра вирусов гриппа А(НЗ№) в КЭ и клетках культуры ткани МЛСК в диапазоне от 2 до 6 ^ЭИД50 (табл. 4). Наименьшее падение 2 ^ТЦИДзо отмечено для ДНАжид фМ. Во всех других случаях оно было >4.0 что соответствует критериям хорошей сорбционной активности вирусов и соответственно эти сорбенты могут быть рекомендованы в качестве материалов при разработке противовирусных фильтров. Исследование инфекционной активности комплекса иммуносорбента (комплекса ДНА + вирус гриппа ) показало наличие вируса в аллантоисной жидкости КЭ с титром 128 ГАЕ.

Таблица 4

Падение инфекционного титра концентрированных вирусов гриппа А(НЗЫ2)

после сорбции на ДНА и ПАНИ содержащие сорбенты

Система ДНА сорбенты ПАНИ нанотрубки Ag 30%

Шихта ДНАамин ДНА жид фаз

КЭ вг»; 4.5^ЭИД50 вг** б.О^ЭВДо не проводили ВГ** ЭИД50

МБСК вг**; 5 ^ТЦИД» вг** 4,26 ^ТЦИДм вг** 2 ^ТЦИД» вг** 4.5 ^ТЦИДзо

Примечание: вирусы гриппа ( вг)*- А/Перт/06/09 , вг**А/Виктория/361/11 (НЗШ)

Проведено исследование зависимости сорбции концентрированных вирусов гриппа штамм А/Перт/0б/09 (ИЗ N2) от следующих параметров эксперимента — концентрации сорбентов (от 5 до 50 мг/мл), времени контакта вируса с сорбентом от 15 мин до 2 ч. и температуры Т (от 4 до 37°С). Интенсивность сорбции зависела от концентрации сорбента в растворе и его структуры. Сравнительные исследования показали, что сорбционная емкость для шихты составляла 500 ГАЕ/мг, ДНА — 200 ГАЕ/мг. Это коррелирует с различием в величинах удельной поверхности. У шихты она равняется 450 м2/г, у ДНА —300 м2/г. Наиболее активная адсорбция происходила в первые 10-15 мин. контакта сорбента с вирусом. Интенсивность сорбции не зависела от температуры. Сорбция вирусов из

различных растворов происходила при температуре в диапазоне 4-37 °С в течение 20 мин. Десорбцию вирусов в ФР при 4 и 22°С не регистрировали в течении <48 часов. Эти исследования проводили при обычных условиях, максимально приближенных к действительности в периоде времени до 48 часов. Возможно получение других результатов при очень высоких рН или ионной силе, но изучение поведения комплексов вирусов с сорбентами в экстремальных условиях не входило в нашу задачу.

Проведение исследований по взаимодействию фрагментов ДНК с сорбентами обусловлено как теоретическим интересом - рассмотреть, происходит ли взаимодействие исследуемых материалов с нуклеиновыми кислотами, так и практическим - в связи с актуальностью проблемы загрязнения ампликонами (фрагментами ДНК) помещений, где проводится ПЦР диагностика. Электрофоретический анализ фрагментов ДНК в растворе до и после сорбции на разные сорбенты представлен на рис. 2.

- « ■ ЗННН1

В1тшшщ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 17 19 21 23 24

А Б В

Рис. 2. Исследование сорбции фрагментов ДНК на наноалмазные материалы (шихту, ДНА и их модификации, ПАНИ нанокомпозиты и УНТ)с помощью электрофореза в 2% агарозе Дорожки: 1,8,15, 24 - плазмида Р11С19; 3, 9,16- ДНК до сорбции; А.ДНК после сорбции на 4,5-

ДНАпифаз, 6,7 шихту; Б. 10 ДНА граф т°с, 11 - ДНК ДНА граф8оо°с,12 ДНА фаф юоо°с, 13 - ДНА ами„, 14 ДНА хл.,; В. 17 ПАНИ нанотрубки 30%, 18 ПАНИ, 19 УНТ+ ПАНИ, 20 ПАНИ нанотрубки, 22 УНТ, 23 полож. контроль.

Результаты экспериментов по сорбции фрагментов ДНК на ДНА содержащие материалы показали, что фрагменты ДНК с размерами больше 560 п.н. удалялись

из растворов шихтой - полностью и ДНА-частично. Фрагменты меньшего размера (около 200 п.н.) связывались полностью обоими сорбентами. При анализе модифицированных ДНА наибольшую сорбцию наблюдали в случае шихты и графитизированных при разных температурах ДНА. В опытах с ПАНИ композитами наибольшую активность наблюдали у композитов, содержащих Ag. Эти данные показывают, что сорбционная активность ДНА зависит от размеров фрагментов ДНК и от состояния поверхности сорбентов. Создание композитов с включением атомов Ag в состав усиливает их взаимодейстие с фрагментами ДНК.

Деконтаминация водных растворов, инфицированных вирусом полиомиелита, с помощью современных углеродсодержащих материалов и полимерных композитов

Выбор представителя безоболочечных вирусов — вакцинного штамма полиомиелита типа 1 Сэбина обусловлен распространением энтеровирусов в человеческой популяции, водным путем передачи инфекции, устойчивостью вириона к физико-химическим воздействиям, присутствием этого штамма в списке вирусов, рекомендованных при изучении активности дезинфицирующих средств. Результаты исследования взаимодействия этого вируса с выбранными сорбентами показали, что он способен сорбироваться как на ДНА, так и ПАНИ содержащих материалах (табл. 5).

Падение инфекционных титров вируса после контакта с сорбентами составило от 1 до 2.5 ^ ТЦИД50. Введение Ag в состав композита приводило к увеличению сорбционной активности вируса. Как и в случае вируса гриппа иммуносорбенты (комплексы вируса полиомиелита с сорбентами) обладали инфекционной активностью, титр вируса в комплексе варьировал в зависимости от сорбента от 2.5 до 4 ^ ТЦИД50 в 0.2 мл. Таким образом, установлено, что вирус полиомиелита (вакцинный штамм полиомиелита типа 1 Сэбина) способен адсорбироваться на выбранных сорбентах, однако эффективность сорбции зависит

от структуры самих сорбентов. Наиболее активное взаимодействие выявлено при контакте вируса с шихтой, ДНАграф и композитами ПАНИ с серебром.

Таблица 5

Инфекционная активность вирусов полиомиелита и их комплексов с сорбентами после взаимодействия с сорбентами разной природы

Вид № Сорбент Титр вируса, 0,2мл,% Титр вируса полиомиелита, ^ ТЦИДо после сорбции

материалов ТЦИДзо до сорбции надое адок иммуносорбент *

1 Шихта 4.5 2,0 3,5

2 ДНА (немодифицированный) 3,5 2,5 3,2

* § 5 3 ДНА гртф при Т= 800°°С в Аг 3,5 2,5 2,5

4 ДНА „.4 при Т= 900 °С в Аг 3,5 1,5 2,7

О О- 5 ДНА п»ф при Т= 1000° С в Аг 3,5 1,5 2,5

II о 6 ДНА обработанный водородом в течении б часов 3,5 2,0 3,0

5 >> 7 ДНА „ор 3,5 1,5 2,5

8 УНТ 4,5 3,0 2,5

5 8 9 Нанотрубки ПАНИ 4,5 3,5 4,0

10 Нанотрубки ПАНИ + Ад 30% 4,5 2,5 3,5

|| и и Гранулы ПАНИ + 70% 4.5 2,5 3,0

Примечание : комплекс вирус + сорбент, после осаждения У=3000 об/мин

Изучение взаимодействия альбумина и иммуноглобулинов с ДНА содержащими материалами и композитами ПАНИ с Ag и без Ag.

Выявленный на примерах представителей оболочечных и безоболочечных вирусов эффект уменьшения сорбционной активности в растворах, содержащих белки невирусной природы, явился основанием для проведения исследования взаимодействия белков невирусной природы (альбумина) с выбранными сорбентами и их возможной конкуренции с вирусами за места связывания на сорбентах. Исследование проводили в три этапа. На первом этапе исследуемые сорбенты обрабатывали раствором альбумина с концентрацией 1 мг/мл. Результаты электрофоретического анализа содержания альбумина в растворе после сорбции на ДНА содержащие сорбенты показали, что альбумин с исходной концентрацией 1

мг/мл после контакта с шихтой отсутствует в растворе, после контакта с ДНА концентрация белка в растворе снизилась до 0.3 мг/мл ( Рис.3).

ЦЦ ШШ

1 2 3 4 5

Рис. 3. Электрофорез различных концентраций бычьего сывороточного альбумина до и после сорбции на шихту и ДНА

Дорожки: 1. альбумин С= 1 мг/мл до сорбции, альбумин :2- С= 0,5 мг/мл; 3- С= 0.25мг/мл: альбумин после сорбции : 4-на шихту, 5. - ДНА мкифа.

На втором этапе образцы сорбентов обрабатывали сначала растворами альбумина Сага,5=1-4 мг/мл, а затем вирусосодержащей жидкостью (вирус гриппа А(НЗ№). Было установлено, что активная конкуренция за места связывания на сорбенте имела место до СалЬб= 4 мг/мл (снижение ГА титра с 4096 до 256 ГАЕ), при Саг,ьб=1 мг/мл вирус полностью связывался с шихтой (снижение ГА титра вируса с 4096 ГАЕ до 2ГАЕ), т.е альбумин не мешал взаимодействию вируса с сорбентом. Сходные результаты были получены при конкурентном исследовании вирусов гриппа с альбумином на ПАНИ композитах. Третий этап включал исследование взаимодействия специфических антител из сывороток крыс, иммунизированых вирусом В/Флорида/04/06 с комплексами вирус+сорбент. Установлено, что после контакта разведенной 1:10 в ФР сыворотки к вирусу гриппа В/Флорида/04/06 с ДНА

и ДНАТ сорбентами, титр сыворотки в РТГА с вирусом В/Флорида/04/06 падал с 1280 до < 40. Результаты эксперимента дают основание полагать, что ДНА материалы могут быть использованы в качестве иммуносорбентов как относительно вирусов, так и антител при разработке диагностических тест-систем.

Исследование влияния сорбентов на биологические объекты в опытах in vitro и in vivo

Для исследования влияния выбранных сорбентов (ДНА материалов, УНТ и ПАНИ композитов) на биологические объекты in vitro было использовано два подхода. Сначала сорбенты наносили на монослой клеток культуры тканей MDCK в концентрации от 1 мг/мл до 1х10'8мг/мл и через 48 часов проводили оценку его состояния. Результаты показали, что при концентрации сорбентов <1 мг/мл не выявлено визуально нарушения клеточного монослоя клеток MDCK для всех изученных сорбентов, кроме УНТ, для которого монослой сохранялся при концентрации С < 0.01 мг/мл и менее.

Второй подход заключался в оценке сохранности клетками культуры ткани MDCK способности к репродукции вирусов гриппа после их контакта с сорбентами в течение 24 часов. В исследование были включены два вируса А/Москва/212/2014(H3N2) и В/Москва/3/2014, и три сорбента (шихта, ДНАами„ и ПАНИ нанотрубки с 30%Ag ), показавшие в предыдущих опытах максимальную эффективность. Начальный титр вирусов составлял 128 и 64 ГАЕ/0.2 мл соответственно. Вирусы вносили в двух разведениях: 10"' и 10"2, для каждого сорбента эксперимент повторяли дважды. Концентрация сорбентов шихты, ДНАа„„„„ ПАНИ нанотрубок с 30%Ag в опыте была в диапазоне от 1 до 10 "6 мг/мл. Результаты опыта показали, что ЦПД вируса гриппа на клетки регистрировали при концентрации сорбентов 0,1 мг/мл и меньше, что было подтверждено результатами РГА. Таким образом, было показано, что клетки MDCK, содержащие наночастицы, сохраняли способность репродуцировать вирусы гриппа А и В после 24 часового контакта с сорбентами в концентрации 0,1 мг/мл и менее.

Определенный интерес представляло рассмотреть влияние изучаемых наноматериалов на гемопоэз крыс как один из показателей токсичности материалов на макроорганизмах. С этой целью крысам были введены нанотрубки ПАНИ и ПАНИ с Ag30% внутрибрюшинно, трехкратно, разовая доза составляла 3 мг сорбента на одно животное ( по две крысы в каждой группе). Спустя неделю после третьего введения был произведен забор крови. Результаты анализа показали увеличение концентрации моноцитов от 4 до 7 раз и эозинофилов - в 2 раза. В случае ПАНИ с Ag 30% отмечено уменьшение концентрации лейкоцитов в 2 раза.

Кроме того была изучена способность сорбированного вируса сохранять имунногенные свойства. С этой целью животные (три крысы в группе) были иммунизированны по общепринятой схеме комплексом ДНА + вирус гриппа А/Южная Каролина/02/2010 (HlNl)pdm09. Результаты показали что комплекс индуцировал выработку антител которые достигли титра 1:80 в то время как при иммунизации аллантоисным вирусом титр сыворотки составил 1:640. Результаты проведенной иммунизации говорят о возможности использования ДНА в комплексе с вирусами при разработках тест - систем для диагностики вирусных инфекций.

В настоящее время не выработаны единые критерии для оценки токсичности наноматериалов и нет необходимого набора методов исследования (De Stefano D. et al, 2012), поскольку нанотоксикология —молодая наука и токсичность наночастиц зависит от многих факторов. Наши исследования - первые шаги в этом направлении. Накопление и анализ совокупности данных и сопоставления результатов in vitro и in vivo позволят получить точную картину токсичности наноматериалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа была посвящена изучению взаимодействия оболочечных и безоболочечных вирусов с наноразмерными материалами, различающимися между собой по составу, структуре, и физико-химическим свойствам. Была произведена комплексная оценка этого взаимодействия по качественным и количественным показателям. Объектами нашей работы явились следующие вирусные модели:

вирусы гриппа человека и птиц, вирус полиомиелита, а также фрагменты ДНК , полученные в результате амплификации РНК вирусов гриппа. В результате проведенных исследований было установлено, что вирусы гриппа человека и птиц, независимо от антигенной структуры, вирус полиомиелита, а также фрагменты ДНК способны образовывать комплексы с углеродными материалами — детонационными наноалмазсодержащими сорбентами, полимерными материалами (полианилиновыми композитами — нанотрубками, содержащими А§ и без него, полианилиновыми гранулами, содержащие Ag), что приводит к их полному или частичному удалению из воды или растворов, и, как следствие, к деконтаминации водной среды. Это, в свою очередь, позволяет рассматривать использованные в нашей работе наноматериалы в качестве потенциальных компонентов очистительных систем. Наиболее перспективными по совокупности всех характеристик для производства фильтров являются детонационные наноалмазсодержащие материалы (шихта, модифицированные наноалмазы) и композиты —полианилиновые нанотрубки, содержащие А§ (30% по весу). Взаимодействие вирусов с данными сорбентами было активнее, чем с остальными, изученными в данном исследовании. И что особенно важно для практического применения цена на их производство является относительно низкой, особенно это касается шихты.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлено эффективное сорбционное взаимодействие оболочечных (на примере вируса гриппа) и безоболочечных (на примере вируса полиомиелита) вирусов с детонационными наноалмазными материалами, а также композитами на основе полианилина.

2. Показано, что антигенные свойства вирусов гриппа А и В, а также их принадлежность к восприимчивым хозяевам (человек, птицы, свиньи) не оказывали влияния на эффективность сорбционного взаимодействия вирусов с изученными наноматериалами: детонационными наноалмазами и их модификациями, шихтой, композитами полианилина в виде гранул и нанотрубок.

3. Установлено, что размеры фрагментов ДНК определяют эффективность их сорбции на детонационные шихту и наноалмазы.

4. Впервые показано увеличение степени сорбционного взаимодействия фрагментов ДНК, аллантоисных вирусов гриппа и полиовируса (вакцинного штамма Сэбина типа 1) с композитами полианилина при введении в состав композитов атомов серебра, что приводит к достоверному снижению гемагглютинирующих и инфекционных титров.

5. Процесс сорбционного взаимодействия вирусов гриппа с наноматериалами наиболее активно протекает в течение первых 15 минут контакта и не зависит от изменений температуры в пределах от 4° до 36°.

6. Выявлена конкуренция между вирусами гриппа и бычьим сывороточным альбумином за места связывания на сорбенте. При концентрации альбумина 1 мг/мл и менее, наблюдали наибольшее падение гемагглютинирующей активности вируса гриппа в растворе, обусловленное образованием иммуносорбентов — комплексов вирусов с сорбентами, содержащими наноалмазы.

7. Клетки культуры тканей MDCK сохраняли способность к репродукции вирусов гриппа при концентрации сорбентов 0,1 мг/мл и менее. Введение иммуносорбента (комплекса вирус гриппа + сорбент) лабораторным животным (крысам) вызывало у них индукцию антител к этому вирусу.

8. Для деконтаминации воды от вирусов (как оболочечных, так и безоболочечных) наиболее перспективными материалами для создания фильтров являются: детонационная шихта, модифицированные наноалмазы и композиты полианилина, содержащие серебро.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК

1. Иванова, В.Т. Взаимодействие вирусов гриппа А и В с сорбентами на основе наноалмазов / Иванова В.Т., Иванова М.В., Бурцева Е.И., Гарина Е.О., Трушакова C.B., Шевченко Е.С., Маныкин A.A., Исакова A.A., Корженевский А.П., Спицын Б.В. // Вопросы вирусологии. — 2012. —№2. — С. 9-13.

2. Урываев, JI.B. Вирусы как объекты и инструменты нанобиотехнологий / Урываев JI.B., Альховский C.B., Самохвалов Е.И., Беляев A.M., Бурцева Е.И., Воркунова Г.К., Гребенникова Т.В., Гущина Е.А., Забережный А.Д., Иванова М.В. и др. // Вопросы вирусологии, Прил.1. — 2012. — С. 52-65.

3. Иванова, В.Т. Деконтаминация водных растворов, контаминированных полиовирусом, с помощью современных углеродсодержащих материалов и полимерных композитов / Иванова В.Т., Иванова М.В, Носик H.H., Бурцева Е.И., Кондрашина Н.Г. и др. II Биотехнология. — 2014. — №3. С. —67-72.

4. Сапурина, И.Ю. Полианилин и его композиты в качестве сорбентов вирусов гриппа / Сапурина И.Ю., Иванова М.В., Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Трушакова C.B. , Исаева Е.И. , Кириллова Е.С., Курочкина Я.Е., Маныкин A.A., Урываев JI.B. II Высокомолекулярные соединения. Серия А. — 2014 — Т. 56. — №4. — С. 389-398.

Патенты

5. Иванова, В.Т Сорбенты — детонационные наносодержащие материалы; способы получения иммуносорбентов на их основе и иммуносорбции / Иванова В. Т., Иванова М. В., Спицын Б. В., Трушакова C.B., Бурцева Е.И., Исакова A.A., Корженевский А. П., Денисов С.А., Олесик Ф.Н. — Заявка на патент РФ N2013117675 от 17.04.13.

Публикации в других изданиях

6. Ivanova, V. Т. Interaction of nanodiamonds materials with influenza viruses.IV Nanotechnology International Forum (Rusnanotech 2011) / Ivanova V. T., Ivanova M. V., Spitsyn B.V., Garina К. O., Trushakova S. V., Manykin A A., Korzhenevsky A.P., Burseva E. I. // IOP Publishing Journal of Physics: Conference Series 345 .-2012,012019.

7. Ivanova, M. V. Adsorption of influenza A and В viruses on detonation nanodiamonds materials / Ivanova M. V., Burtseva E. I., Ivanova V. T., Trushakova S. V., Isaeva E.I. et al.// Materials Research Society. Symp. Proc.-2012.- V. 1 -.DOI: 10.1557/opl.2012.

8. Иванова, M.B. Сорбция пандемических вирусов гриппа А( HlNl)v наноразмерными алмазами и их комплексами с полианилином / Иванова М.В.,

Исакова A.A., Спицин Б.В. и др. // VI Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Материалы конгресса. -

2011.- Часть 1, Т.2.- С.424-425.

9. Ivanova, M.V. Nanobiotechnology in study influenza viruses: Virus sorption at carbon nanoparticles in solution / Ivanova M.V.// "Young scientist work shoping". Booklet. Methods to study influenza viruses. Berlin. Freie Universität.- 2011,- P. 23-24

10. Ivanova, V.T., The interaction of influenza A and В viruses with carbon nanomaterials/ Ivanova V.T., Isakova A.A., Ivanova M.V., et al.// "6th Nanosmat conference", Krakov, Poland, Abstract book.- 2011.-P. 114-115.

11. Иванова, B.T. Современные подходы обеспечения биобезопасности водной среды / Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Иванова М.В., Трушакова С.В., Шевченко Е.С. и др. // "Юбилейная Всероссийская научная конференция "Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека ".СПб. / Труды конференции.-2012,- С.163-164.

12. Иванова, М.В. Деконтаминация растворов, содержащих вирусы гриппа, с помощью сорбентов / Иванова М.В., Сапурина И.Ю., Бурцева Е.И., Трушакова С.В. и др. // Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, Москва.-2012.-С. 159.

13. Исакова, A.A. Многофункциональные полимерные композиции на основе полианилина для определения биологических объектов / Исакова A.A., Райтман O.A., Иванова М.В., Тверской В.А., Ванников A.B. // Международная научно-практическая конференция "Фармацевтические и медицинские биотехнологии" Москва.- 2012,- С. 342-343.

14. Ivanova, V. Т. Adsorption of influenza viruses on polyaniline and carbon nanotubes / Ivanova V. Т., Sapurina I.Yu., Ivanova M.V., Trushakova S.V., Burtseva E.I. // "Colloids and Nanomedicine 2012" Amsterdam, The Netherlands. Abstracts.-

2012.-Colin2012_006.-Pl. 14. wwwcolloidsanomedicine.com.

15. Ivanova, M., Adsorption of Influenza A and В viruses on nanodiamonds materials / Ivanova M., Burtseva E., Ivanova V., Trushakova S. et al. // MRS Spring

Meeting Symposium "Nanodiamond Particles and Related Materials". San Francisco, California USA.- Abstract.- 2012.

16. Ivanova, M.V. Detonation nanodiamond materials as the sorbents for influenza human and bird viruses / Ivanova M.V., Burtseva E.I., Trushakova S.V., Isakova A.A. et al. // International conference "Options for the Control of Influenza VIII". Cape Town, South Africa. Abstracts.- 2013,- P.l-419.

17. Trushakova, S. Monitoring of influenza viruses in Moscow region, 2009-2013/ Trushakova S., Mukasheva E., Krasnoslobotsev K., Siluyanova E., Lavrischeva V., Kirillova E., Breslav N., Oskerko Т., Kolobukchina L., Vartanyan R., Merkulova L., Ivanova M. и др. // International conference "Options for the Control of Influenza VIH" Cape Town, South Africa. Abstracts - 2013. - P2-641.

18. Исакова, A.A. Влияние природы детонационного наноалмаза на адсорбцию вирусов гриппа / Исакова А.А., Иванова М.В., Костина Ю.В. и др. // XIX Всероссийская конференция "Структура и динамика молекулярных систем " Яльчик. Респ. Марий-Эл., Сборник тезисов докладов. Москва- Йошкар-Ола- Уфа-Казань.- 2012.- С. 78.

19. Иванова, В.Т. Современные подходы обеспечения биобезопасности водной среды / Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Иванова М.В., Трушакова С.В., Шевченко Е.С. и др. // Юбилейная Всероссийская научная конференция "Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека". Труды конференции. СПб -2012.- С.163-164.

20. Shishov, М.А., Polyaniline Based Sorbents For Removing Viruses From Solvents / Shishov M.A., Ivanova M.V., Burceva E.I., et al. /8-th International Symposium " Molecular Order and Mobility in Polymer Systems", Book of Abstracts St. Peterburg.- 2014.-P.193.

21. Isakova, A. A. The study of physic-chemical properties of the nanodiamond materials and their interaction with different viruses / Isakova A. A., Ivanova M.V., Burtseva E.I., Nosik N.N. // XII "International Conference on Nanostructured Materials" . Abstracts. Moscow.- 2014.-P.836.

Список сокращений

ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения

ЦЭЭГ — Центр экологии и эпидемиологии гриппа

НА — гемагглютинин

NA — нейраминидаза

ГА — гемагглютинирующий ( титр)

ГАЕ — гемагглютинирующая единица

РГА — реакция гемагглютинации

РТГА — реакция торможения гемагглютинации

КЭ — куриные эмбрионы

MDCK —перевиваемая линия культуры клеток почки собаки породы спаниель

Vera — перевиваемая линия культуры клеток почки зеленой мартышки

ЦОД — цитопатическое действие

ТЦИД50 — 50% тканевая цитопатическая инфекционная доза

УНТ — углеродные нанотрубки

ПАНИ — полианилин

ДНА — детонационные наноалмазы.

ФР — физиологический раствор

ПААГ — полиакриламидный гель

WER — Weekly Epidemiologic Record

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю доктору медицинских наук Бурцевой Елене Ивановне за научное руководство. Основные результаты получены в соавторстве с к.б.н. Исаевой Е.И., к.м.н. Кирилловой Е.С., к.б.н.Трушаковой C.B., с.н.с Оскерко Т.А. д.б.н., проф. д.б.н. Маныкиным А.А; автор благодарен за внимание и ценные консультации при выполнении работы проф. д.м.н. H.H. Носику, а также коллегам за советы и моральную подцержку (ФГБУ Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ); за предоставление сорбентов и консультативную помощь д.х.н. Спицыну Б.В. (Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, Москва), к.х.н. Сапуриной И.В. (Институт высокомолекулярных соединений РАН, СПб). Автор глубоко признателен и благодарен своим соавторам.

Подписано в печать: 25.08.13 Тираж: 100 экз. Заказ № 1192 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Марина Викторовна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

04201460961

Иванова Марина Викторовна

Взаимодействия вирусов с детонационными наноалмазными материалами и

композитами на основе полианилина

03.02.02 - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор медицинских наук Е.И.Бурцева

Москва 2014

Оглавление............................................................................................2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение............................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................12

Глава 1. Вирус гриппа птиц как источник возможных пандемических штаммов

1.1 Роль водной среды в распространении вирусных инфекций..........................12

1.2 Структура, свойства, распространение вирусов гриппа АиВ..........................13

1.3. Распространение вирусов гриппа птиц в мире.............................................18

1.4. Интродукция вируса гриппа птиц в человеческую популяцию........................19

Глава 2. Вирус полиомиелита, распространение, структура, свойства.............22

Глава 3. Сорбенты, взаимодействие их с вирусами, белками и нуклеиновыми кислотами и области применения..............................................................26

3.1. Сорбция как метод удаления веществ из разных средств.................................26

3.2. Взаимодействие микро и наноразмерные сорбентов с вирусами и другими биологическими объектами, иммуносорбенты..................................................27

3.3. Наноалмазы, структура и свойства, перспектива использования в качестве сорбентов для вирусов..............................................................................................33

3.4. Влияние наночастиц на клетки in vitro и in vivo...........................................38

Глава 4. Взаимодействие белков, нуклеиновых кислот, вирусов с материалами, содержащими Ag; использование препаратов в медицине, биологии и для дезинфекции воды; исследования их токсичности...........................................40

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ............................................45

Глава 1. Материалы и методы исследований.................................................45

1.1. Вирусы гриппа АиВ..........................................................................................45

1.2 Вирус полиомиелита, вакцинный штамм Сэбина тип 1................................46

1.3 Клеточные линии.................................................................................46

1.4. Сорбенты...........................................................................................46

1.4.1 неорганические - шихта и детонационные наноалмазы......................46

1.4.2. композиты ДНА содержащих материалов с полианилином.................46

1.4.3 углеродные нанотрубки...............................................................48

1.4.4. органические-полианилиновые трубки...........................................48

1.4.5. композиты--полианилиновые нанотрубки с содержанием Ag 30% и полианилиновые гранулы с содержанием Ag 70%.......................................48

1.5. Иммунные сыворотки к эталонным штаммам вируса гриппа.................. 48

1.6. Культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах..........................48

1.7 Культивирование вирусов гриппа на культуре клеток MDCK.................. 48

1.8. Реакция гемагглютинации (РГА).......................................................48

1.9. Определение инфекционного титра вирусов гриппа................................48

1.10. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)......................................49

1.11. Получение концентрированных препаратов вирусов гриппа.................... 49

1.12. Метод изучения взаимодействия биологических материалов с сорбентами..........................................................................................49

1.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле....................................49

1.14. Получение фрагментов ДНК.............................................................54

1.15. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле...................................54

1.16. Влияние сорбентов на биологические объекты in vitro............................54

1.17. Влияние сорбентов на биологические объекты in vivo............................54

1.18. Определение формулы крови иммунных животных.................................54

1.19 .Электронная микроскопия сорбентов....................................................55

1.20 Инфракрасная спектроскопия (ИК спектроскопия)....................................55

1.21. Элементный анализ ДНА материалов.........................................................55

1.22. Статистическая обработка результатов...........................................................55

Глава 2. Взаимодействие вирусов гриппа и ДНК с наноалмазными и полимерными материалами..................................................................56

2.1 Свойства наноалмазных сорбентов.........................................................56

2.2 Взаимодействия вирусов гриппа и ДНА с наноалмазными материалам и их модификациями........................................................................................58

2.3 Взаимодействие вирусов гриппа с ДНА содержащими материалами в зависимости от различных параметров..................................................................................60

2.4. Взаимодействие вирусов гриппа и фрагментов ДНК с модифицированными наноалмазами.............................................................................................................................66

2.5. ИК-спектры ДНА с разной сорбционной активностью по отношению к вирусам....70

2.6. Взаимодействие вирусов гриппа с ДНА материалами, покрытыми ПАНИ..........71

2.7. Сравнительное исследование УНТ и полимерных композитов, содержащих наночастицы Ag и без Ag, в качестве сорбентов вирусов гриппа А и В и к ДНК...... 74

Глава 3. Деконтаминация водных растворов, содержащих вирусом полиомиелита, с помощью современных углеродсодержащих материалов и полимерных композитов............................................................................................. 85

Глава 4. Изучение взаимодействия альбумина и иммуноглобулинов с ДНА содержащими материалами и композитами полианилина с Ag и без Ag....... 90

Глава 5 . Исследование влияния сорбентов на биологические объекты опытах in vivo и in vitro.................................................................................................. 98

5.1.Влияние сорбентов на клетки MDCK и репродукцию вирусов гриппа............. 98

5.2 Влияние ПАНИ-нанотрубок на гемопоэз животных.....................................101

5.3.Исследование влияние введения животным комплексов ДНА+вирусы гриппа.....103

Обсуждение результатов................................................................................107

Заключение.......................................................................................... 119

Выводы............................................................................................... 120

Список литературы............................................................................................121

Список публикаций по теме диссертации...................................................... 135

Список сокращений и условных обозначений................................................138

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение

Актуальность темы исследования. Циркуляция в биосфере патогенных микроорганизмов среди восприимчивых организмов - человека, млекопитающих, птиц определяет актуальность разработки средств и методов их дезактивации и удаления из среды. Распространение вирусных инфекций может осуществляться несколькими путями, среди которых наибольшую опасность по масштабности вовлечения в эпидпроцесс представляют воздушно-капельный и водный [43]. Водная среда поддерживает жизнеспособность в природе энтеровирусов, вирусов гепатита А, аденовирусов, а также вирусов гриппа птиц. Инфицирование в начале XXI века людей и животных вирусами гриппа птиц А(Н5№), А(Н7Ш), А(Н7№), А(Н9Ы2), а с 2013г. -А(Н7Ы9) представляет риск формирования нового пандемического варианта [120,184,185,186,187]. Одним из примеров стало появление в апреле 2009г. вируса гриппа свиней - тройного реассортанта А(Н1Ш)рс1т 09 вирусов гриппа птиц, свиней и человека. Его широкое распространение среди людей вынудило ВОЗ объявить уже в июне 2009 г. 6-ую фазу пандемии [43,120,144]. Массовые заболевания полиомиелитом у людей, вызываемого полиовирусом, обусловили проведения исследований с вакцинным штаммом вируса полиомиелита Сэбина типа 1, поскольку он присутствует в списке вирусов, необходимых при исследовании эффективности вирулицидного действия дезинфицирующих средств [53]. Удаление биологических патогенов из водных растворов может быть осуществлено с помощью фильтров, состоящих из веществ, способных адсорбировать микроорганизмы.

Состояние научной разработанности проблемы. Наиболее древними в истории человечества были угольные сорбенты, в состав которых входил древесный уголь. В дальнейшем в качестве сорбентов для вирусов гриппа были предложены: силикатные пористые сорбенты [19], соли Ва804 [20], анионообменные смолы [63], макропористое стекло из расплава кремниевого и борного ангидридов [78], модифицированный гидротермической обработкой графит [27]. В настоящее время актуальным является поиск новых методологических решений для усовершенствования защитных мер (высокоэффективных сорбентов) с привлечением современных достижений различных областей науки, в том числе и быстро развивающейся нанотехнологии. Как показали исследования, наноразмерные материалы обладают физико-химическими свойствами (оптическими, магнитными, электрическими, сорбционными и др.) отличными от своих макроскопических аналогов [60]. Так, например, для применения в сорбционных процессах были разработаны нанопористые адсорбенты с серосодержащими функциональными

группами. Открытые в России в 60-е годы 20 века детонационные наноалмазы (ДНА) и их аналоги синтезируют, исследуют и некоторые из них используются в промышленности [64,168]. Они также представляют интерес для биологов за счет наличия на них поверхностных радикалов, содержащих атомы неуглеродной природы (О, Н, N, S), обуславливающей способность сорбировать биологические объекты [161]. Эти свойства позволяют рассматривать применения ДНА в качестве медицинских средств в терапии -как носителей лекарств к пораженным клеткам, комплексы ДНА с ферментами - для создания новых тест систем, для сорбции бактерии, например, Е. coli [86, 136]. К началу наших исследований по взаимодействию ДНА с вирусами было известна только работа по возможности использовать ДНА, соединенных с конковалином А, при создании вакцины против ВИЧ инфекции [111]. Это обусловило наш интерес по исследованию ДНА материалов с вирусами, отнесенными к другим семействам. Интерес к другому классу соединений - полимерных композитов был обусловлен открытием способности полианилина сорбировать вирусы [29]. Создание из полианилиновых нанотрубок композитов с включением ионов Ag представило для нас интерес относительно их взаимодействий с вирусами. Исследование композитов полианилиновых нанотрубок с Ag обусловлено известными антибактериальными свойствами этого материала [83], то есть возможно получение материалов, как с антивирусными, так и антибактериальными свойствами. Одно из современных течений в нанотехнологии является создание соединений композитов, материалов, в состав которых добавлены ионы Au, Fe, Ag, Ti, Ni металлов, которые, возможно, изменяют их физико-химические свойства [93, 89,151,173]. Магнитные сорбенты, содержащие ионы Fe, предлагалось использовать для селективного концентрирования вирусов гриппа A/H5N1 [17], для детекции гемагтлютинина вирусов гриппа A/H5N1 [128]. Недавно появившаяся новая отрасль науки нанотоксикология ставит своей задачей изучение влияния на биологические объекты наноматериалов. Исторически углеродсодержащие материалы рассматриваются как инертные с минимальной реактивностью для клеток тела [110]. Наноразмерные формы углерода имеют свои особенности. Исследования in vitro на разных клетках показали, что наноалмазы более толерантны к клеткам, чем многие другие углеродсодержащие материалы - нанотрубки и фуллерены [161]. Исследования влияния ДНА-содержащих материалов на жизнеспособность животных (белых мышей и белых крыс), количество лейкоцитов в их крови, изменения органов после перорального введения или инъекций показало, что эти показатели зависят от количества, частоты и способа введения ДНА-содержащих проб [59]. Однако, этот вопрос требует дальнейшего изучения. Представляло интерес изучить некоторые аспекты этой проблемы относительно взятых для исследования сорбентов.

Таким образом, является актуальным получение новых данных по взаимодействию вирусов с разными представителями углеродных и полимерных материалов. Это создает основу для создания в будущем современных высокоэффективных противовирусных фильтров и сорбентов, а также устройств для создания новых тест-систем для диагностики вирусных инфекций.

Цель исследования. Изучить способность и условия сорбции вирусов гриппа человека и птиц, полиовируса (вакцинного штамма Сэбина типа 1) фрагментов ДНК, бычьего сывороточного альбумина на современные детонационные наноалмазные материалы, их модификации и полимерные композиты полианилина различной структуры, содержащие серебро и без него.

Задачи исследования:

1. Изучить взаимодействие эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа человека и птиц с рядом новых материалов различной природы, состоящих из микро- и наноразмерных частиц на основе: 1) углеродных материалов в виде детонационных наноалмазных частиц и их производных, углеродных нанотрубок, 2) проводящих полимеров на основе полианилиновых нанотрубок, композитов - полианилиновых нанотрубок и гранул, содержащих серебро.

2. Исследовать влияние ряда физических (температуры и времени воздействия), и биологических (систем культивирования и степени очистки вирусов) факторов на эффект сорбции вирусов гриппа на модифицированными различными методами детонационные наноалмазные материалы.

3. Изучить сорбцию фрагментов ДНК на различные наноалмазные и полимерные наносорбенты.

4. Исследовать взаимодействие вируса полиомиелита на модели вакцинного штамма Сэбина типа 1 с наноалмазными и полимерными наносорбентами.

5. Установить возможность использования выбранных сорбентов для удаления из растворов белков невирусной природы - бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулинов из иммунных сывороток.

6. Оценить влияние выбранных сорбентов на биологические объекты в опытах in vivo и in vitro.

Объект исследования. Эталонные, эпидемические, пандемические штаммы вирусов гриппа А и В, циркулировавшие в России и в мире в период с 1999 по 2013 годы; вирусы гриппа птиц с гемагглютинином Н5 (реассортанты A(H5N1) и A(H5N2)); полиовирус вакционного штамма Сэбина тип 1, фрагменты ДНК (полученные в результате амплификации РНК вирусов гриппа), иммуноглобулины.

Предмет исследования. Изучение взаимодействия вирусов гриппа человека, птиц, реассортантов, полиовируса, иммуноглобулинов, фрагментов ДНК с современными наноразмерными сорбентами различной природы (наноалмазными материалами и полимерными композитами) в зависимости от различных факторов: структуры биологических объектов, степени их очистки и методов культивирования, времени контакта объектов с сорбентами, температуры среды, концентрации вирусов и сорбентов в растворе. Изучение влияния сорбентов на состояние культуры клеток и животных, используемых для вирусологических исследований.

Теоретические и методологические основы исследования. В основу научно-квалификационного исследования легли вопросы вирусологии, дезинфектологии. В работе применяли общенаучные и специальные методы исследования (методы культивирования вирусов и лабораторной медицинской диагностики, молекулярно-биологические методы изучения структуры и свойств вирионов).

Информационная база исследования. В качестве информационных источников использовали научные публикации российских и зарубежных исследователей, представленных в журналах и книгах, материалы конгрессов и конференций, состоявшихся в РФ и за рубежом, методологические инструкции и указания, инструкции к использованным в работе тест системам.

Основные научные результаты исследования, полученные лично автором.

Автором разработан метод удаления вирусов из водных растворов с помощью детонационных наноаламазных материалов. Проведена оценка влияния температурных, временных, количественных параметров, состава среды и антигенных свойств вирусов гриппа на сорбционное взаимодействие вирусов с изучаемыми сорбентами, проведена модификация наноалмазов (хлорирование, графитизация), изучено взаимодействие наноматериалов с вирусами полиомиелита, изучено влияние присутствия Ag в ПАНИ нанотрубках на сорбцию вирусов гриппа, полиомиелита, фрагменты ДНК. Проведена иммунизация животных, рассмотрено влияние исследуемых наноматериалов на клетки культуры тканей MDCK и гемопоэз лабораторных животных. Проведены анализ и интерпретация полученных данных.

Впервые установлена способность детонационных наноматериалов (шихты, наноалмазов, их модифицированных аналогов), композитов полианилина полианилиновых нанотрубок, полианилиновых нанотрубок и гранул, содержащих серебро, сорбировать вирусы гриппа А и В из растворов (физиологического раствора, раствора культуральной питательный среды Игла MEM, аллантоисной жидкости куриных эмбрионов).

Впервые обнаружена способность детонационных наноматериалов (шихты, наноалмазов, их отобранных модифицированных аналогов, композитов полианилина -полианилиновых нанотрубок, полианилиновых нанотрубок и гранул, содержащих