Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез полимерсодержащих сорбентов и их использование для одностадийного выделения ДНК

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Синтез полимерсодержащих сорбентов и их использование для одностадийного выделения ДНК"

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

Простякова Анна Игоревна

СИНТЕЗ ПОЛИМЕРСОДЕРЖАЩИХ СОРБЕНТОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОДНОСТАДИЙНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005536977

Москва - 2013

7 НОЯ 2013

005536977

Работа выполнена в лаборатории «Полимеры для биологии» Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук Научный консультант: доктор химических наук, проф.

Капустин Дмитрий Валерьевич

Зубов Виталий Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф.,

чл.-корр. РАСХН Завриев Сергей Кириакович

доктор химических наук, проф. Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»

Защита состоится « » 2013 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 002.019 01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте бноорганичсской химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, г. Москва, уд. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганичсскои химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « » 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук

•---^^^егЛг----_ В. А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной клинической диагностике наряду с традиционными микробиологическими и иммунологическими методами широко применяются подходы, основанные на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Несмотря на неоспоримые преимущества ПЦР-диагностики (высокая чувствительность, возможность определения некультивируемых видов бактерий, например, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum и ряда вирусов, таких как ВИЧ и возбудители вирусных гепатитов) серьезной проблемой является выбор конкретных методов подготовки анализируемых образцов, содержащих нуклеиновые кислоты (НК), к ПЦР-анализу. Поэтому особенно важной для дальнейшего развития биомедицинского направления биотехнологии является разработка новых материалов и эффективных методов выделения и очистки НК из различных источников. Разрабатываемые методы должны не только обеспечивать сохранение функциональной активности НК, в т. ч. при хранении, но, по возможности, должны быть быстрыми и легко автоматизируемыми.

Реализация сочетания твердофазной экстракции НК в присутствии хаотропных солей и картриджного варианта хроматографии в едином конструкционном элементе [Boom R, et al. (1990) J. Clin. Microbiol. 28(3):495] легла в основу большинства общедоступных наборов для выделения НК. Общий принцип работа предлагаемых систем выделения заключается в сорбции НК сорбентом, за которой следуют отмывка от примесей и элюция очищенной НК, при этом сами наборы различаются лишь природой используемого сорбента. Соответствующие протоколы выделения позволяют получать высокоочищенные препараты ДНК из различных источников, однако эти протоколы, в виду многостадийности, трудоемки и длительны, что отрицательно сказывается на производительности при обработке большого количества биоматериала (например, в практике клинических лабораторий или в рамках проведения масштабных исследовательских работ).

Альтернативный подход, разработанный под руководством проф. В.П.Зубова в лаборатории «Полимеры для биологии» ИБХ РАН, основан на одностадийном выделении и очистке НК: НК-содержащую смесь пропускают через слой специального сорбента, при этом выделяемая (и одновременно очищаемая) НК проходит через слой сорбента, не удерживаясь на его поверхности, в то время как примеси, присутствующие в смеси, эффективно сорбируются. Основные преимущества такого варианта выделения заключаются в скорости процесса (1.5 - 3 мин) и использовании небольшого количества сорбента (100 - 300 мг), достаточного для получения высокоочищенного препарата НК. Реализация одностадийной процедуры

выделения НК достигается при использовании специальных композиционных полимерсодержащих сорбентов, сочетающих в одном материале уникальные сорбционные свойства привитой полимерной фазы с механической прочностью и контролируемой пористостью исходного носителя, например, кремнезема. В качестве полимерных модификаторов, используемых при получении композиционных сорбентов для одностадийного выделения НК, применяют фторполимеры и полианилины (ПАНИ) [Zubov V.P. et al. (2007) Polymer Science, Ser. A. 49 (12): 1247]. Однако описаные методы модификации твердых носителей нанослоями фтор- и ПАНИ-содержащих полимеров либо требуют сложного аппаратурного оформления (как в случае синтеза политетрафторэтиленсодержащих сорбентов методом радиационной постполимеризации), либо сопровождаются многостадийной процедурой отмывки полученного материала (при синтезе ПАНИ-содержащих сорбентов методом окислительной осадительной полимеризации в присутствии немодифицированного кремнезема), что ограничивает широкое применение таких материалов.

При разработке более технологичных методов синтеза фторполимер- и ПАНИ-модифицированных сорбентов большое значение имеет способ предварительной активации поверхности носителя, обеспечивающий локализацию процесса формирования равномерно распределенного полимерного покрытия на поверхности сорбента. В конечном счете, правильный выбор способа активации поверхности носителя с учетом физико-химических свойств полимерного модификатора определяет воспроизводимость сорбционных свойств получаемых сорбентов и высокую селективность при одностадийном выделении НК.

Использование как фторполимеров, так и ПАНИ в качестве модификаторов поверхности сорбентов обеспечивает возможность выделения НК из сложных биологических смесей в одну стадию, однако особый интерес представляет материал, последовательно модифицированный нанослоями фторполимера и полианилина (ФП-ПАНИ-сорбент), т.к. каждый из этих полимерных модификаторов привносит дополнительные особенности в процесс выделения НК. Фторполимерсодержащие сорбенты отличаются исключительной химической стойкостью, низким уровнем необратимой сорбции ДНК и, как правило, обеспечивают наиболее высокий выход ДНК. В свою очередь, ПАНИ-содержащие сорбенты демонстрируют превосходную смачиваемость, высокую поверхностную емкость, и с успехом применяются для выделения ДНК из «сложных» биологических смесей (кровь, лизаты растительной ткани и т.д). Таким образом, можно ожидать, что новый сорбент, одновременно модифицированный нанослоями ФП и ПАНИ, будет проявлять

комплекс свойств, присущих обоим полимерным модификаторам, что позволит расширить область его применения.

Цель настоящей работы заключалась в разработке новых технологичных полимеризационных методов получения фторполимер- и ПАНИ-модифицированных кремнеземов, основанных на принципе активации поверхности носителя; исследовании физико-химических и сорбционных свойств полученных материалов; в разработке эффективных протоколов одностадийного выделения ДНК с помощью полученных сорбентов из различных биологических смесей, в том числе из лизатов растительной ткани и клинических образцов биоматериала.

Для достижения сформулированной цели предстояло решить следующие задачи:

1 - разработать новый технологичный способ получения фторполимерсодержащих сорбентов, различающихся полярностью поверхности, основанный на полимеризации тетрафторэтилена на поверхности кремнезема;

2 - разработать новый способ получения ПАНИ-содержащего сорбента, обеспечивающий локализацию процесса полимеризации анилина и образующегося ПАНИ на поверхности носителя;

3 - исследовать морфологию и сорбционные свойства полученных материалов;

4 - продемонстрировать эффективность применения новых разработанных фторполимерсодержащих сорбентов при разделении НК в зависимости от их вторичной структуры и молекулярной массы;

5 - разработать протоколы одностадийного выделения ДНК из различных биологических смесей с применением разработанного ФП-ПАНИ-сорбента;

6 - продемонстрировать возможность применения разработанного ФП-ПАНИ-сорбента в протоколах пробоподготовки при проведении ПЦР-диагностики различных заболеваний и сравнить эффективность использования предложенных одностадийных протоколов выделения ДНК из клинических образцов биоматериала с коммерческими методиками пробоподготовки.

Научная новизна. Впервые методом полимеризации тетрафторэтилена на поверхности пористого кремнезема, предварительно обработанного озоном, синтезированы фторполимерсодержащие композиционные сорбенты. Показано, что с помощью разработанного метода в состав политетрафторэтилена (ПТФЭ) можно вводить мономерные звенья с различными функциональными группами и получать ПТФЭ-содержащие сорбенты с различной полярностью поверхности, которые позволяют разделять НК в зависимости от их вторичной

структуры и молекулярной массы. Продемонстрирована эффективность применения полученных ПТФЭ-содержащих сорбентов при выделении ДНК из сложных биологических смесей в одну стадию.

Впервые синтезирован ПАНИ-содержащий сорбент (ФП-ПАНИ-сорбент) методом «матричной полимеризации» анилина на поверхности кремнезема, модифицированного фторопластом. Показано, что в разработанном методе фторполимерная фаза выступает в качестве матрицы для формирования ПАНИ-покрытия.

Исследование сорбционных свойств нового синтезированного ФП-ПАНИ-сорбента показало высокую эффективность применения этого материала для очистки ПЦР-продуктов от компонентов мастер-смеси, а также на этапе пробоподготовки в ПЦР-диагностике патогенов человека. На примере выявления ДНК микобактерий туберкулеза впервые показано, что при реализации разработанного одностадийного протокола выделения и очистки ДНК достигается более высокая чувствительность ПЦР-детекции возбудителя заболевания по сравнению с многостадийной методикой выделения, основанной на сорбции и десорбции НК.

Практическая значимость. Разработанные сорбенты могут с успехом применяться как в научных исследованиях, так и в лабораторном анализе для быстрого и качественного выделения ДНК из бактерий, грибов, вирусов, растительной ткани; при разделении одно- и двунитевых НК, а также при очистке ПЦР-продуктов.

Разработанные методики одностадийного выделения и очистки ДНК с помощью синтезированного ФП-ПАНИ сорбента обеспечивают выделение очищенной ДНК из различных образцов биоматериала, в частности, для ПЦР-детекции фитопатогенов, а также для клинической ПЦР-диагностики возбудителей ряда инфекций человека. Предложенные методики значительно упрощают пробоподготовку за счет уменьшения количества операций и позволяют снизить себестоимость и время проведения анализа.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на следующих конференциях: XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Москва, 2007 г), XX Зимняя международная научная школа, (Москва, 2008 г.), III Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2008 г.), 2nd NACBO International Nanobiotechnology Conference (Rome, Italy, 2009), Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2009 г.), V Всероссийская Каргинская Конференция «Полимеры - 2010» (Москва, 2010 г.), Международный конкурс

научных работ молодых ученых в области нанотехнологий, Международный форум по нанотехнологиям (Москва 2010 г.), Second International Conference on Multifunctional, Hybrid and Nanomaterials (Strasbourg, France, 2011 г.).

Связь паботы с научными программами. Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (Государственный контракт № 9411.1003702.13.031 "Разработка и оптимизация высокоэффективной комплексной системы одноэтапного выделения, очистки и концентрирования нуклеиновых кислот для ПЦР-анализа с целью выявления и идентификации микроорганизмов и ДНК-маркеров», шифр "Биопроба"), а также грантов 6-ой рамочной Программы Европейского Союза (FP6): проект NACBO («Новые и усовершенствованные наноматериалы, химические методы и оборудование для нанобиотехнологии», NMP4-CT-2004-500804), проект DIAGNOSIS («Разработка новых и рентабельных методов неинвазивной диагностики патогенных микроорганизмов человека», LSHB-CT-2006-037212).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи из списка журналов, рекомендованных ВАК, и 1 глава в монографии.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 121 наименования. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 19 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез фторполимер- и ПАНИ-содержащих сорбентов.

1.1. Синтез композиционных сорбентов, модифицированных сополимерами тетрафторэтилена, методом «озон-индуцированной полимеризации».

Фторсодержащие полимерные покрытия на поверхности пористого кремнезема получали методом т. н. «озон-индуцированной полимеризации» тетрафторэтилена (ТФЭ) на поверхности носителя (кремнеземы Si-500-Armsorb, Химтех, Армения и Trisopor-500, Proligo, Германия).

Предварительно кремнезем обрабатывали воздушно-озоновой смесью в реакторе, соединенном с озонатором, в результате чего на поверхности носителя образовывались стабильные при комнатной температуре активные центры, которые, как было показано, способны инициировать полимеризацию различных виниловых мономеров. Анализ кинетических кривых образования активных центров в зависимости от условий озонирования, а также исследование их природы методами йодометрического титрования и ИК-

спектрометрии показали, что на поверхности кремнезема образуются пероксидные структуры, способные инициировать как радикальную, так и окислительную полимеризацию. Таким образом, обработанные озоном кремнеземы могут быть использованы в качестве гетерогенных инициаторов полимеризации виниловых мономеров, причем активированный кремнезем одновременно является носителем при получении композиционного сорбента.

Известно, что при полимеризации ТФЭ на концах растущих цепей могут сохраняться активные концевые радикалы, которые приводят к необратимой сорбции биополимеров, поэтому для стабилизации радикалов на концах растущих цепей ПТФЭ кремнеземный носитель модифицировали сополимерами ТФЭ с гексафторпропиленом. С целью введения дополнительных функциональных амино- и гидроксигрупп кремнезем также модифицировали сополимерами ТФЭ с аллиламином (АА) или аллиловым спиртом (АС) (рисунок 1).

СР2—сь

<

'81— О-^СГз—СМ-С?

„ , 8!—О-ИЧ-2—СЫ-Ср

Вариант 1 ^ I- -1п

Р,ст=сь С-о-Ц-сДс -► \ "

<>4('| (Ч- Дср,—с'1'.>—ст,

^—о—|ст 2—СрЛ—с

' ^ п

СН2—СНт-СН.Я

О,

О«

<

XI—о.

С1 ц=а кццк кц-о-|с|ср^снз—снг-сн« и-кн./он п

кремнезем

СР2=СР3 +

(

Вариант 2

-О£ср2—СР^-СР,-

<

а—о-£Ь'з—а-,—ср,

С

СР2=СР, +

:=СМСН;К ^

-о4-гг,—СР;4—сн2—пь—пьк

-0-[с1 !—С'Рг^-СН,-СН2-СН;Я

Рис. 1. Получение композиционных сорбентов, модифицированных сополимерами ТФЭ с ГФП, ТФЭ с АА или ТФЭ с АС.

Сомономеры вводили либо в режиме пост-полимеризации, добавляя второй мономер после завершения полимеризации ТФЭ на первом этапе модификации (вариант 1), либо одновременно в виде смеси ТФЭ с

соответствующим мономером в газовой фазе (вариант 2). Характеристики полученных материалов приведены в таблице 1.

Таблица 1. Содержание полимерной фазы и концентрация поверхностных функциональных групп (ФГ) в ПТФЭ-содержащих сорбентах.

Марка носителя Варнант модификации: Условия процесса: сомономер / время озонирования, ч Содержание полимерной фазы (% масс) ФГ Концентрация ФГ (мкмоль/г)

Trisopor-500 2 ГФП/3 8.0 нет -

2 ГФП/4 11.5 нет -

Si-500-Armsorb 1 АА/3 21.0 амино- 25

2 АА/3 24.8 амнно- 145

2 АА/4 25.5 амино- 280

2 АС/4 24.0 гидрокси- 20

Таким образом, разработан новый метод прямого полимеризационного синтеза фторполимерсодержащих сорбентов на основе кремнезема, предварительно обработанного озоном. Предложенный способ является более технологичным по сравнению с ранее разработанными радиационными методами, и позволяет вводить в состав поверхности полимерной фазы различные функциональные группы.

1.2. Синтез композиционных сорбентов, модифицированных ПАНИ.

В известном способе получения сорбентов на основе макропористых носителей, модифицированных ПАНИ [Капустин Д.В. и др. (2003) Биоорганическая химия 29 (3): 310], значительное количество мономера расходуется на образование частиц ПАНИ, слабо закрепленных на поверхности носителя, что существенно осложняет процедуру очистки готового продукта. Проблему локализации растущих цепей ПАНИ на поверхности носителя удалось решить с помощью проведения т. н. «матричной полимеризации» анилина в присутсвии носителя, предварительно обработанного полисульфокислотами [Yagudaeva E.Yu. et al (2009) Pol.Sci. Ser. A. 51(6):675], Синтезированные материалы оказались эффективны при выделении ДНК из различных источников, в т. ч. из лизатов растительной ткани и крови. Однако существенным недостатком использования таких сорбентов оказалась низкая стабильность выделяемой ДНК при хранении как результат ее взаимодействия с полисульфокислотой в составе сорбента, вследствие чего необходимо было найти более подходящую «матрицу».

Известно, что в процессе полимеризации анилина во время т.н. «индукционного периода» реакции образуются низкомолекулярные гидрофобные феназинсодержащие структуры. Можно полагать, что такие молекулы будут эффективно удерживаться гидрофобными поверхностями, например, фторполимерными покрытиями. Поэтому нами был предложен двухстадийный способ модификации поверхности объемно-пористого кремнезема, заключающийся в предварительном нанесении фторопласта-42Л (ФП) на поверхность неорганического носителя с последующей полимеризацией анилина на полученной фторированной подложке.

Слой фторопласта на поверхности пористого кремнезема формировали методом высаживания ФП из раствора [Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology//edited by H.S. Nalwa (2004) 8: 731]. Метод оптимизировали, введя дополнительные стадии вакуумирования и ультразвуковой обработки суспензии носителя в растворе полимера, которые стимулируют развитие капиллярных эффектов и способствуют максимальному заполнению пор носителя раствором полимера, что обеспечивает однородность распределения макромолекул полимера по внутренней поверхности пор носителя.

При последующем процессе полимеризации анилина, феназинсодержащие структуры анилина сорбируются на поверхности фторполимера и действуют как зародыши дальнейшего роста макромолекул ПАНИ, а фторполимерное покрытие при этом служит «матрицей» для формирования нанослоя ПАНИ.

Таким образом, впервые разработан метод получения кремнеземных сорбентов, модифицированных комбинированным слоем фторполимера и ПАНИ, обеспечивающий локализацию процесса полимеризации анилина на поверхности фторполимерной подложки, причем полимерные частицы в объеме реакционной смеси не образуются.

2. Морфологические характеристики полученных сорбентов.

Необходимым условием для эффективного использования композиционного хроматографического сорбента является бездефектность и равномерность распределения полимерного покрытия по поверхности носителя, что позволяет сохранить исходную пористость последнего, снижает вероятность необратимой сорбции, обеспечивает высокую селективность разделения и повышает химическую стойкость материала за счет экранирования поверхности неорганической матрицы.

На рисунке 2 представлены изображения поверхности стеклянной пластины, последовательно модифицированной слоями ФП и ПАНИ в условиях, моделирующих получение ФП-ПАНИ-сорбента. Изображения

получены методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) с помощью нанотвердомера «НаноСкан-ЗЭ» (ФГУ ТИСНУМ, РФ). Сканирование проводили сразу после завершения индукционного периода полимеризации анилина (1) и после формирования слоя ПАНИ (2).

На рисунке 2 видно, что за время индукционного периода на покрытой ФП поверхности формируются частицы, выполняющие роль зародышей ПАНИ-фазы. Затем в результате автокаталитической полимеризации анилин расходуется на образование сплошного бездефектного ПАНИ-покрытия.

Рис. 2. Изображения поверхности пластины, модифицированной слоями ФП и ПАНИ, полученные с помощью СЗМ. 1- поверхность носителя после завершения индукционного периода полимеризации анилина, 2 - поверхность носителя после завершения полимеризации анилина. А - двухмерное изображение со срезом; Б -трехмерное изображение.

Толщину полимерного покрытия и изменение диаметра пор в полученных ПТФЭ- и ФП-ПАНИ-сорбентах по сравнению с немодифицированным кремнеземом и кремнеземом, покрытым слоем ФП, определяли методом ртутной порометрии. Интегральные и дифференциальные кривые распределения пор по размерам, представленные в качестве примера на рисунке 3 для ФП-ПАНИ-сорбента, свидетельствуют о предсказуемом уменьшении среднего

диаметра пор в модифицированном кремнеземе пропорционально количеству иммобилизованного полимера. При этом исследованные образцы сохраняли высокую пористость. Одновременное уменьшение удельного объема пор и среднего диаметра пор подтвердило наличие полимерного слоя не только на внешней поверхности частиц, но и на внутренней поверхности пор, а сохранение узкого распределения пор по диаметрам свидетельствовало об однородности распределения полимерного покрытия. Эффективная толщина полимерного слоя для материалов, полученных методом озон-индуцированной полимеризации фтормономеров, составила 8.5-9 нм, для кремнезема, покрытого слоем ФП - 4-6 нм, для ФП-ПАНИ сорбента -10-12 нм.

Рис. 3. Ртутные порограммы образцов немодифицированного кремнезема 8|-500 (А) и

ФП-ПАНИ-сорбента (Б).

Дополнительное подтверждение бездефектности полимерных покрытий, сформированных на поверхности кремнезема, получено в результате оценки химической стойкости образцов сорбентов в условиях щелочного гидролиза (при инкубировании в 1М №ОН в течение 15 ч). Анализ спектров надосадочных жидкостей в присутствии молибдата аммония и серной кислоты показал, что скорость растворения немодифицированного кремнезема превышала скорость растворения материала носителя в случае ПТФЭ-содержащих сорбентов, в среднем, в 14 раз и ФП-ПАНИ - в 16 раз.

Таким образом, показано, что в результате проведения синтеза ПТФЭ-содержащих сорбентов и ФП-ПАНИ-сорбента разработанными методами, на поверхности носителя формируются равномерно распределенные устойчивые полимерные нанотолщинные покрытия.

3. Применение фторполимер- и ФП-ПАНИ-содержащих сорбентов.

Одностадийное выделение ДНК из биологических смесей проводили с помощью разработанного ранее в лаборатории «Полимеры для биологии» ИБХ РАН картриджного метода. В пластиковый картридж, упакованный небольшим

10

(100 мг) количеством сорбента и вставленный в пробирку-приемник, вносили модельную смесь или лизат (50 мкл). Картридж инкубировали при комнатной температуре в течение I мин и затем центрифугировали при 2000 об/мин (275 kg) в течение 2 мин. Полученный в результате элюат содержал очищенную ДНК. Состав лизируюших растворов и методику пробоподготовки оптимизировали в зависимости от природы исследуемой смеси.

3.1. Разделение НК в зависимости от их вторичной структуры и молекулярной массы с помощью разработанных ПТФЭ-содержащих сорбентов.

Разработанный способ получения ПТФЭ-сорбентов позволяет получать материалы с различной полярностью поверхности, что может значительно расширить сферу их применения. В частности, нами было предложено использовать такие материалы для разделения НК, различающихся по структуре и массе. Полученные материалы, модифицированные сополимерами ТФЭ с АА и АС, использовали для одностадийного разделения и очистки ДНК и РНК из бактериальных лизатов Agrobaclerium tumefaciens С58 (рисунок 4) и модельных смесей, содержащих одноцепочечную ДНК (оцДНК синтетический олигонуклеотид) (рисунок 5) и фрагментированную двуцепочечную ДНК (дцДНК). Из рисунков видно, что бактериальная РНК или короткие однонитевые синтетические олигонуклеотиды удерживались сорбентом в различной степени, в зависимости от химической структуры полимера, иммобилизованного на поверхности носителя.

Рис. 4. Электрофорез в 0.8% агарозном геле образцов ДНК, выделенных из лизатов агробактерии Agrohactcrium tumefaciens С58 с помощью ПТФЭ-содержащих сорбентов: 1 -исходный лизат; 2 - 4 - элюаты, полученные после пропускания лизата через картриджи, содержащие Si-500-ПТФЭ-ГФП (2), Si-500-ПТФЭ-ТТТФЭ-АА (3), Si-500-ПТФЭ-АС (4).

Рис. 5. Удерживание олигонуклеотида (ADA-праймер, Proligo GmbH, Германия) ПТФЭ-содержащими сорбентами, полученными на основе кремнезема, обработанного озоном (результаты электрофореза в 0.8% агарозном геле): 1 -раствор олигонуклеотида перед нанесением на картридж; 2 -4 - элюаты, полученные с помощью Si-500-ПТФЭ-ГФП-сорбента (2), Si-500-ПТФЭ-АА-сорбента (3) и Si-500-ПТФЭ-АС-сорбеита (4).

При этом выход НК изменяется в зависимости от полярности поверхности сорбента. Как и ожидалось, удерживание РНК и оцДНК возрастает в ряду ПТФЭ-ГФП - ПТФЭ-АС - ПТФЭ-АА. При этом выход дцДНК повышается при использовании сорбента, содержащего гидроксильные группы, по сравнению с материалом, содержащим аминогруппы. Выход дцДНК различной молекулярной массы оценивали, используя раствор 1 кб ДНК-маркера (Gene Ruler1 м, Fermentas, Латвия) в качестве модельной смеси, содержащей фрагменты ДНК различной длины. Было показано, что материал, модифицированный ПТФЭ-АА, удерживает значительную долю даже относительно высокомолекулярных фрагментов дцДНК. Удерживание таких фрагментов сорбентами, модифицированными ПТФЭ-ГФП, как и ожидалось, было незначительным, как в случае материала, полученного с использованием озон-индуцированной технологии, так и в случае использования сорбента, полученного по радиационной технологии (материал был взят для сравнения).

Таким образом, фторполимерсодержащие сорбенты с различным зарядом поверхности можно применять для разделения смесей оцДНК и дцДНК, а также ДНК и РНК, например, при диагностике РНК-содержащих вирусов.

3.2. Одностадннное выделение бактериальной ДНК для ПЦР-аналша с помощью ФТТ-ПАНИ сорбента.

Эффективность применения ФП-ПАНИ-сорбента для одностадийного выделения бактериальной ДНК оценивали, используя специально разработанную в ИБХ РАН модельную систему, основанную на лизисе клеток Agrobacterium tumefaciens С58 с последующей очисткой ДНК на сорбенте и ее детекции в элюате методом ПЦР в реальном времени. При этом использовали праймеры и зонд к гену VirD2 A. tumefaciens С58 (локализованному в Ti-плазмиде).

Зонд и праймеры к гену VirD2 A. tumefaciens С58.

PrAgr 5' -CGA CAT CTC GAT (FAMdT) ATT CCC CTG CCA CC -3' (BHQ1)

AgrF 5' -ATGCCCGATCGAGCTCAAGTT-3'

AgrR 5' -TCG TCT GGC TGA CTT TCG ТС A TAA-31

Оценку эффективности сорбента проводили по трем показателям:

1 - степень очистки ДНК;

2 - выход очищенной ДНК;

3 - стабильность выделенных образцов ДНК при хранении.

Элюат может содержать примеси, ингибирующие ПЦР, по двум причинам: 1) готовый сорбент плохо отмыт, и в элюат попадают побочные продукты синтеза и компоненты реакционной смеси, экстрагируемые в

процессе выделения ДНК, и 2) сорбент неэффективно очищает ДНК от компонентов лизата

Для проверки чистоты сорбента в ПЦР-смесь добавляли ДНК из А. (umefaciens С58, очищенную с использованием набора реагентов «Проба ГС» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», РФ) согласно протоколу производителя, специфические праймеры и зонд, а также ТЭ-буфер, пропущенный через колонки с разработанным сорбентом. В качестве сравнения использовали аналогичную смесь, содержащую ТЭ-буфер, не пропущенный через колонку. Результаты Г11ДР подтвердили отсутствие ингибирующих примесей в составе полученного сорбента (средние значения порогового цикла для обоих случаев не отличались более чем на 0.1 ед.).

Эффективность очистки ДНК от компонентов лизата и ее количественный выход оценивали, анализируя образцы ДНК, выделенные из культуры А. Iumefaciens С58 различными методами. ДНК выделяли на разработанном ФП-ПАНИ-сорбенте, а также фенол-хлороформным методом [Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги (1999) Мир: 307] и с помощью коммерческих наборов. Использовали набор «Проба-ГС» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», РФ), обеспечивающий сорбцию ДНК на кремнеземе в присутствии изотиоцианата гуанидина с последующей отмывкой и десорбцией очищенной ДНК и набор nexttec™ )-Step (NextTec GmbH, Германия), обеспечивающий одностадийную процедуру выделения на полимер-модифицированном сорбенте. Электрофореграмма выделенных образцов ДНК приведена на рисунке 6.

— К a j

Рис. 6. Электрофореграмма образцов ДНК А.

t^oooo lumefaciens С58, выделенных фенол-хлороформным методом (1), с помощью наборов 500 nexttec™ 1-Step (2) и «Проба-ГС» (3, 4), а также с помощью ФП-ПАНИ-сорбента (5, 6).

»-5 О 0

1 2 3 4 5 6

По результатам электрофореза видно, ч то выход ДНК после пропускания лизата через ФП-ПАНИ-сорбент значительно превышает количество ДНК, полученного с применением фенол-хлороформного метода, сорбента пехПес™ и набора «Проба-ГС». В последнем случае в элюате также содержится значительное количество РНК (рисунок 4, дорожки 3-4).

Полученные данные были подтверждены результатами ПЦР в реальном времени (таблица 2). Выход ДНК в случае использования ФП-ПАНИ сорбента примерно на 25% превышал выход ДНК после использования набора «Проба-

ГС» и более чем в 2 раза - после использования набора пехКес™1-51ер и фенол-хлороформного метода.

В ряде случаев возникает необходимость в повторном анализе выделенных образцов НК. Поэтому важной характеристикой качества системы, применяемой при выделении, является стабильность выделенных препаратов ДНК при хранении. Проверку стабильности ДНК-содержащих элюатов проводили через сутки, неделю и через месяц после выделения. Сохранение исходного количества ДНК, амплифицируемой в ПЦР, во всех исследованных элюатах подтвердило высокую степень очистки и отсутствие примесей, вызывающих деградацию НК.

Таблица 2. Сравнение степени очистки ДНК из бактериального лизата на различных сорбентах (среднее значение по двум повторам).

Метод выделения Значение Ср* Относительная концентрация ДНК**

ФП-ПАНИ-сорбент 22.4 1.00

Проба-ГС 22.8 0.76

пехПес™ 1-81ер 23.6 0.44

Фенол-хлорофный метод 24.1 0.31

Неочищенный лизат (отрицательный контроль) 32.3 -

*Ср - значение характеристического цикла амплификации, автоматически определяемое детектирующим амплификатором «ДТ-96» («НПФ ДНК-Технология», РФ).

♦♦Относительная концентрация ДНК в элюате при выделении на сравниваемом образце сорбента: ОК,Лр1,1и = 2(tv Ф|М1А"" с> Содержание ДНК в элюате, полученном

при использовании ФП-ПАНИ-сорбента, принято за единицу.

Таким образом, включение в состав покрытия ФП-ПАНИ-сорбента полимерных нанослоев с различной функциональностью обеспечивает быстрое и эффективное одностадийное выделение ДНК с ее одновременной очисткой от примесей. Высокие выход и степень очистки ДНК делают разработанный тип композиционных сорбентов перспективным для широкого использования в лабораторном анализе.

3.3. Выделение ДНК из растительной ткани при детекции фитопатогенов.

Продовольственная и биологическая безопасность во многом определяется качеством контроля за фитосанигарным состоянием, в первую очередь, сельскохозяйственных растений. Основой такого контроля является высокоспецифичная диагностика фитопатогенов.

ФП-ПАНИ-сорбент использовали в пробоподготовке образцов, содержащих фитопатогенный гриб Fusarium graminearum, для последующей

14

детекции выделенной ДНК гриба методом РЬА8Н-ПЦР. Использовали праймеры и зонд, разработанные в ИБХ РАН.

Зонд и праймеры на ген (еПи К цпшипсагит.

Р^г РАМ 5'-СОСОСССАОТОСООТОСТАТССАСААССССС-5'- ВН(22

5'-СССАЛСС<ХОССОАСАСТ-3' Fg|■R 5'-ОСТТТОТаСОААОАСООСАОА-3'

Поскольку мицелий гриба имеет более плотную структуру, чем бактериальные клетки, методику пробоподготовки оптимизировали, варьируя состав лизирующих растворов и температуру лизиса. Выделение ДНК проводили из двух типов образцов; из мицелия гриба и из зараженных семян пшеницы. Параллельно определяли оптимальный объем лизата, пропускаемого через картридж с сорбентом. На рисунке 7 видно, что увеличение объема наносимого лизата до 100 мкл практически не снижает чувствительность ПЦР, как в случае выделения ДНК из мицелия гриба, так и при выделении из растительной ткани (зараженные семена).

Рис. 7. Результат ЕЬАвН-ПЦР элюатов после выделения ДНК из мицелия Г. цгапипеагит и из зараженных семян пшеницы на картриджах с ФП-ПАНИ-сорбентом. По оси абсцисс отложена интенсивность

флуоресценции, по оси ординат — номера образцов. 100, 54, 30 -объем лизата (мкл), пропускаемый через картридж; м - образец ДНК, выделенный из мицелия гриба; «Л» - неочищенный лизат; «ЛБ» - лизируюший буфер, «-» - вода, «+» — положительный контроль; «Ф» -фон. Черный столбец — внутренний контроль, серый столбец — специфика.

Таким образом, показано, что использование ФГ1-Г1 АНИ-сорбснта в сочетании с оптимизированным протоколом пробоподготовки обеспечивает одностадийное выделение и высокую степень очистки ДНК Ь'.^гаттеагит для ПЦР-детекции указанного фитопатогена.

3.3. Очистка ПЦР-продуктов.

Одним из условий эффективного секвенирования ПЦР-продуктов является удаление сопутствующих компонентов реакции, остающихся после

завершения ПЦР. Поэтому нами было предложено использовать полученный ФП-ПАНИ сорбент на стадии очистки ГТЦР-продуктов для получения высокочистых ампликонов.

Степень очистки ПЦР-продуктов от У'еку-полимеразы исследовали, пропуская раствор фермента (50 мкл, 4.25 мг белка) через картриджи, упакованные ФП-ПАНИ-сорбентом, ПАНИ-содержащим сорбентом, полученным на основе немодифицированного кремнезема, и коммерческим сорбентом из набора nexttec™l-Step. Элюаты анализировали спектрофотометрически (1= 280 нм, таблица 3) и электрофоретически (рисунок 8). Полученные данные свидетельствуют об эффективном удерживании Taq-полимеразы всеми протестированными материалами (следует отметить, что в составе смеси для ПЦР обычно используют в 10 раз меньше 7'ау-поли.меразы).

Таблица 3. Интенсивность поглощения раствора 7я</-полимеразы при 280 нм до и после пропускания через различные сорбенты.

№ п/п Образец (количество белка ~ 4.25 мг) А 280 Удерживание белка, %

1 Исходный раствор 0.105 -

2 Сорбент nexttec™ 0.007 93.3

3 ФП-ПАНИ-сорбент 0.005 95.2

4 ПАНИ-сорбент 0.010 90.5

Рис. 8. Результаты электрофореза в 10% ПААТ. Гель окрашивали Кумасси R250. 1 - раствор 77«/-полимеразы до нанесения, 2-4 - раствор полимеразы, пропущенный через колонки с сорбентами (см. табл. 4), М - маркер (Unstained Protein Molecular Weight Marker, Fermentas, США).

Сорбцию дНТФ оценивали, пропуская 50 мкл раствора смеси дНТФ (по 250 мкмоль/л дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ, метка а32Р-дАТФ) через картриджи, упакованные ФП-ПАНИ-сорбентом, ПАНИ-содержащим сорбентом и сорбентом пехПес™. Собранные элюаты и использованные сорбенты анализировали с помощью сцинтилляционного счетчика (таблица 4).

1 2 3 4 М

Wll6k

• 66 к т

ф 45 к

• '

Сорбент Число импульсов в минуту Сорбированные дЫТФ (%)

Элюат Сорбент

Исходная смесь 278346 - -

ФП-ПАНИ-сорбент 45714 126151 84

Сорбент nexttec™ 87048 102428 69

ПАНИ-сорбент 129112 75920 54

Сорбцию олигонуклеотидов и зонда оценивали с помощью ПЦР. ТТЦР проводили с внутренним контролем (в качестве матрицы использовали ДНК длиной 560 п.о.). Для внутреннего контроля использовали праймеры и зонд, меченные флуоресцентным красителем (HEX, 0.33 пмоль/мкл). После окончания ПЦР в реакционную смесь добавляли FAM-меченый олигонуклеотид (FAM-AGC CGG GCG CGG TGG С, 1 пмоль/мкл). Смесь пропускали через картриджи, содержащие ФП-ПАНИ-сорбент, ПАНИ-сорбент на основе немодифицированного кремнезема и сорбент nexttec™. Собранные элюаты разбавляли в 10, 50 и 100 раз и детектировали уровень флуоресценции с помощью флуориметра «Джин» (ЗАО НПФ «ДНК-Технология», РФ). В случае сорбента nexttec™ и ПАНИ-сорбента детектируемый уровень флуоресценции наблюдали как для неразбавленных элюатов, так и для элюатов, разбавленных в 10 раз. В случае сорбента ФП-ПАНИ флуоресценция элюатов отсутствовала, что указывало на отсутствие олигонуклеотида и зонда в элюатах.

Таким образом, сорбент, модифицированный комбинацией нанослоев ФП и ПАНИ, намного эффективнее сорбирует дНТФ и низкомолекулярные олигонуклеотиды по сравнению с сорбентами, взятыми для сравнения, и может применяться для одностадийной очистки ПЦР-продуктов от компонентов ПЦР-смеси.

3.4 Одностадийное выделение ДНК из клнническнх образцов.

Одним из наиболее сложных объектов исследований в клинической диагностике является кровь. Высокое содержание белков, в том числе нуклеаз, РНК- и ДНК-связываюших белков может приводить к разрушению НК и/или выводить их из водной фазы, например, при фенольной депротеинизации. Кровь также содержит много различных ингибиторов ПЦР. Применяемые коммерческие наборы для выделения ДНК и/или РНК из крови либо не обеспечивают нужной чистоты выделяемой НК для ПЦР (требуется дополнительная стадия очистки), либо отличаются значительными потерями НК в процессе выделения.

Благодаря своим сорбционным свойствам, разработанный ФП-ПАНИ-сорбент оказался перспективным при разработке протоколов выделения ДНК из клинических образцов крови для решения различных диагностических задач.

С целью выделения ДНК из образцов крови были предложены и оптимизированы два протокола лизиса с последующим выделением ДНК картриджным методом на ФП-ПАНИ-сорбентах.

Первый протокол основан на осаждении ядер лейкоцитов с последующей отмывкой от клеточного дебриса и гемоглобина и последующим лизисом очищенных ядер лейкоцитов. Преимущество данной методики состоит в удалении основной части гем-содержащей фракции до стадии лизиса, однако стадия отмывки ядер лейкоцитов от остальных компонентов системы может сопровождаться значительными потерями ДНК и уменьшением объема образца. Кроме того, применение такого протокола нецелесообразно при диагностике возбудителей, содержащихся в плазме.

Второй протокол, основанный на выделении ДНК из цельной крови в результате термической обработки смеси образца крови с лизирующим буферным раствором, требует меньше манипуляций и времени. В данном варианте вы деления не наблюдаются потери материала, но в лизате присутствует значительное количество веществ, ингибирующих ПЦР.

Выделение и очистку лейкоцитарной ДНК с использованием системы детекции ¡С-гена человека из образца крови (500 мкл) в обоих случаях проводили картриджным методом. В качестве материала для сравнения использовали коммерческий набор для выделения ДНК «Проба-ГС» (ЗАО НПФ ДНК-Технология, РФ). Параллельно проводили выделение ДНК двумя описанными способами из образцов крови с добавлением вирусных частиц фага Т4 для более точного определения возможных потерь ДНК при лизисе крови и оценки эффективности выделения вирусной ДНК из образцов.

Из представленных в таблицах 5 и 6 результатов ПЦР в реальном времени следует, что наибольший выход ДНК наблюдается при использовании термического лизиса образца с последующей очисткой лизата с помощью картриджей, содержащих ФП-ПАНИ-сорбент (таблица 5). При этом также удается эффективно детектировать чужеродную вирусную ДНК, что особенно важно при диагностике различных вирусных заболеваний (таблица 6).

Эффективность разработанных протоколов подтверждается также при оценке временных затрат и числа необходимых манипуляций по сравнению со стандартным методом выделения. Так, процедура пробоподготовки с использованием стандартного метода «Проба-ГС» включает 20 элементарных манипуляций, в то время как пробоподготовка с использованием картриджа, содержащего ФП-ПАНИ-сорбент, включает 8 манипуляций, а сам процесс

выделения/очистки ДНК из приготовленного лизата занимает не более 3 мин (более 40 мин при использовании набора «Проба-ГС»),

Таблица 5. Результаты ПЦР-анализа элюатов (среднее по двум повторам), полученных при выделении лейкоцитарной ДНК из крови человека с использованием различных методик лизиса.

. , Методика выделения ДНК Значение Ср* OK ДНК**

Проба-ГС 24.6 1.0

ФП-ПАНИ-сорбент, протокол 1 26.8 0.22

ФП-ПАНИ-сорбент, протокол 2 21.7 7.5

Неочищенный лизат, протокол 1 (отрицательный контроль) 46 -

*Ср - значение характеристического цикла амплификации, автоматически определяемое детектирующим амплификатором «ДТ-96» («НПФ ДНК-Технология», РФ).

♦♦Относительная концентрация ДНК в элюате при выделении на сравниваемом образце сорбента: ОКлра-„,»= 2(Ср "Пр,"аТС"" Ср "р"ца|. Содержание ДНК в элюате, полученном при использовании набора «Проба ГС», принято за единицу.

Таблица б. Результаты ПЦР-анализа элюатов (среднее по двум повторам), полученных при выделении внрусной ДНК из образца крови после добавления частиц фага Т4 (лизис по протоколу 2).

Сорбент ДНК человека ДНК фага Т4

Ср* OK ДНК** Ср* OK ДНК**

Проба-ГС, из 50 мкл крови 27.0 1.0 22.4 1.0

Сорбент nexttec™ 26.3 1.6 18.8 12.1

ФП-ПАНИ-сорбент 26.0 2.0 18.4 16.0

* обозначения те же, что и в таблице 5.

*♦ Содержание ДНК в элюате, полученном при использовании набора «Проба ГС», принято за единицу. ОКобра,1И= 2<Ср",|<"&-|(-'»

На клинических образцах урогенитальных мазков, предоставленных ЗАО «ДНК-Технология» (РФ), сравнивали эффективность использования ФП-ПАНИ-сорбентов и набора «Проба-ГС» при выделении ДНК 4 видов возбудителей урогенитальных инфекций. Для обнаружения и определения ДНК патогенных микроорганизмов (Bacteroides spp, Lactobacillus spp, Ureaplasma urealiticum и Gardnerella vaginalis) проводили ПЦР в реальном времени на приборе ДТ-96. Разница в значениях характеристических циклов амплификации ДСр = СрП110ба"гс - СрфгтдШ1 составила от 4 до 0.8 циклов, что

свидетельствует о высокой эффективности использования ФП-ПАНИ сорбента при диагностике урогенитальных заболеваний.

С практической точки зрения наиболее важными являются данные, полученные в результате сравнения эффективности выделения ДНК при обработке клинических образцов мокроты с целью обнаружения и определения количества специфических фрагментов ДНК микобактерий туберкулезного комплекса. Клинические образцы и необходимая приборная база были любезно предоставлены ЗАО «Синтол» (РФ). Выделение проводили двумя способами: на картриджах, упакованных ФП-ПАНИ-сорбентом, и с помощью автоматического метода выделения, разработанного в ЗАО «Синтол» на основе роботизированной станции Tecan Freedom EVO® PCR, (Tecan Trading AG, Швейцария). В последнем случае процедура выделения ДНК основана на проведении сорбции молекул НК на магнитных частицах, отмывке от примесей и последующей элюции очищенной ДНК. Выделенные препараты ДНК анализировали с помощью ПЦР в реальном времени. В таблице 7 приведено количество фрагментов ДНК микобактерий, полученных в ходе исследования образцов обоими способами. Из данных таблицы следует, что эффективность автоматического выделения ДНК составила от 0.3 до 7% по сравнению с выделением на ФП-ПАНИ-сорбенте. Таким образом, использование сорбента, модифицированного комбинацией нанослоев ФП и ПАНИ, существенно снижает потери ДНК и обеспечивает значительно большую чувствительность выявления ДНК микобактерий туберкулеза по сравнению с системой, основанной на сорбции и десорбции НК.

Таблица 7. Результаты ПЦР-анализа ДПК, выделенной из мокроты с помощью автоматической системы выделения и на колоноках, содержащих разработанный ФП-ПАНИ сорбент.

Образец Количество ДНК, копий на объем

Автомат Колонки

1 3254 4579

2 не обнаружена 65

3 3572 5006

4 не обнаружена не обнаружена

5 23693 733220

6 3 98

7 2 12

8 32 178

Приведенные выше данные позволяют сделать вывод о том, что методики одностадийного выделения ДНК, основанные на использовании разработанных

композиционных полимерсодержащих сорбентов, обладают рядом существенных преимуществ по сравнению с известными многостадийными протоколами выделения ДНК, и могут с успехом применяться в лабораторном и клиническом анализе, в т. ч. при диагностике различных патогенов.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые технологичные способы получения ПТФЭ-содержащих сорбентов с различной полярностью поверхности и сорбента, последовательно модифицированного нанослоями фторопласта и полианилина.

2. Получена серия новых сорбентов на основе пористого кремнезема с равномерно распределенным устойчивым полимерным нанопокрытием, что подтверждено данными сканирующей зондовой микроскопии, ртутной порометрии и оптической спектроскопии.

3. Впервые установлено, что благодаря введению в состав фторполимерной фазы дополнительных функциональных групп с различной полярностью, полученные ПТФЭ-содержащие сорбенты позволяют проводить одностадийное разделение НК в зависимости от их вторичной структуры и молекулярной массы.

4. Показано, что ФП-ПАНИ-сорбент пригоден для выделения ДНК из различных источников, при этом полученная ДНК характеризуется чистотой, необходимой для ПЦР.

5. Продемонстрировано, что полученный ФП-ПАНИ-сорбент эффективен при очистке ПЦР-фрагментов от компонентов реакционной смеси (Тас]-полимеразы, дНТФ, праймеров и зондов).

6. Показано, что разработанные методы одностадийного выделения бактериальной и вирусной ДНК с применением ФП-ПАНИ-сорбента из клинических образцов различного происхождения (урогенитальные мазки, плазма, кровь, мокрота) более эффективны по ряду показателей (чистота выделенной ДНК, количество стадий и время, затрачиваемое на пробоподготовку) по сравнению с используемыми протоколами выделения.

Автор выражает благодарность к.б.н. Д.Ю. Рязанцеву (ИБХ РАН, Москва) за предоставление модельных систем для выделения ДНК и помощь в постановке ПЦР; С В. Прокудину (ФГУБНУ «Технологический институт сверхтвердых и новых углеродных материалов», г.Троицк) за консультации по проведению сканирующей зондовой микроскопии; д.б.н. Д.Ю. Трофимову и д.б.н. Д.В. Ребрикову (ЗАО «ДНК-Технология, г.Москвва), а также Я.И.Алексееву (ЗАО «Синтол», г.Москва) за помощь в проведении клинических исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Ягудаева Е.Ю., Букина Я. А., Простяков л А.И., Зубов В.П., Тверской В. А., Капустин Д.В., Окислительная полимеризация анилина на поверхности кремнезема в присутствии полисульфокислот как способ получения эффективных биосорбентов, Высокомолекулярные соединения, Серия А, Т.56, №6, 2009. С. 1000-1008.

2. Prostyakova А.1., Kapustin D.V. «Development of a new methods of fluoropolymer nanolayers formation on the ozone-treated solid matrices for the preparation of effective bioadsorbents». //Вестник КазНУ. Серия химическая, №4 (60), 2010. С. 187 - 189.

3. Kapustin D.V., Prostyakova А.Т., Ryazantsev D. Yu„ Zubov V P. Novel composite matrices modified with nanolayers of polymers as perspective materials for separation of biomolecules and bioanalysis.//Nanomedicine, Vol. 6, No. 2, March 2011. P. 241-255.

Главы в монографиях:

4. Kapustin D, Prostyakova A., Bryk Y, Yagudaeva E„ Zubov V.. New Composite Materials Modified with Nano-Layers of Functionalized Polymers for Bioanalysis and Medical Diagnostics. // Nanocomposites and Polymers with Analytical Methods. Edited by: Dr. John Cuppoletti, InTech. ISBN 979-953-307-136-6. P. 83-106.

Тезисы докладов:

5. Простякова А.И., Капустин Д.В., Зубов В.П. Модификация пористых кремнеземов фторсодержащими полимерами методом озон-индуцированной полимеризации. // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, г. Москва, 23-28 сентября, 2007 г, Т-2. С. 472.

6. Простякова А.И., Капустин Д.В., Зубов В.П., Модификация пористых кремнеземов фторсодержащими полимерами // Зимняя международная научная школа, г. Москва, 11-15 февраля 2008 г. С. 136.

7. Простякова А.И., Капустин Д.В., Ягудаева Е Ю., Зубов В.П. Полимерсодержащие сорбенты для получения высокочистых препаратов нуклеиновых кислот. // III Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике, г.Москва, 24-28 июня, 2008 г. С. 65.

8. Простякова А.И., Капустин Д.В., Зубов В.П., Полимерсодержащие сорбенты для получения высокочистых препаратов биополимеров // П1 Международная конференция по коллоидной химии и физико-механической механике, г. Москва, 24-28 июня, 2008 г. С. 71.

9. Prostyakova А.Т., Kapustin D.V., Zubov VP., Novel Functionilized Aniline-Containing Nanocoatings for Bioanalysis // 2nd NACBO International Nanobiotechnology Conference, Rome, 7th- 9th July 2009. P. 46.

10. Kapustin D.V., Prostyakova A.I., Zubov V.P., Ozone-Initiated Polymerization as a Novel Approach for Preparation of Polymer-Coated Adsorbents for Bioseparation//2nd NACBO International Nanobiotechnology Conference, Rome, 7th- 9th July 2009. P. 30.

11. Простякова А.И., Д.В. Капустин, В.П. Зубов. Разработка новых полимерсодержащих носителей для биоанализа. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова. Конкурс молодых ученых. г.Москва, 28 сентября - 2 октября 2009. С. 192.

12. Простякова А.И.,.Капустин Д.В., Зубов В.П. «Разработка новых полимерсодержащих носителей для биоанализа». // Тезисы Пятой Всероссийской Каргинской Конференции «Полимеры -2010», г. Москва 21 - 25 июня, 2010. С. 43.

13. Простякова Л.И.,.Капустин Д.В., Зубов В.П. «Разработка нового метода получения композиционных сорбентов, модифицированных нанослоями, для одностадийного выделения ДНК» //Международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологии, Международный форум по нанотехнологиям. г. Москва, 1 - 3 ноября, 2010 (электронный сборник).

14. Prostyakova A.I., Kapustin D.V. «New methods of fluoropolymer layers formation on the ozone-treated solid matrices for the preparation of biocompatible hybrid materials» // Second International Conference on Multifunctional, Hybrid and Nanomaterials, Strasbourg, 6-10 March 2011. (электронный сборник, тезисы № В.2.5.24).

15. D. Kapustin, A. Prostyakova, V. Zubov. «Direct Synthesis of Biocompatible Fluoropolymer- and/or Polyaniline-containing Composites based on Porous and Non-porous Activated Matrices for Bioseparation, Bioanalysis and Medical Diagnostics» // Zing Conferences. Polymer Chemistry Conference. Cancun, Mexico. 12 - 16 November 2012. p. 42

16. A. Prostyakova, Dmitry Kapustin. « Polyaniline as Perspective Modifier of Solid Supports for Bioanalytical Applications » // Zing Conferences. Polymer Chemistry Conference., Cancun, Mexico, 12-16 November 2012. p. 44.

Список используемых сокращений: ПТФЭ - политетрафторэтилен ГФП - гексафторпропилен АА - аллнламин АС - аллиловый спирт ФП - фторопласт 42Л ПАНИ - полианилнн НК - нуклеиновые кислоты

ООО «Хорошая типография» Подписано в печать 28.10.2013, тираж 100 экз. г. Москва, ул. Валовая, д. 14, стр. 8 Тел.: 8(495)940-70-17 e-mail: 2202758@mail.ru www.avantalra.com

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Простякова, Анна Игоревна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

на правах рукописи

04201450309

Простякова Анна Игоревна

СИНТЕЗ ПОЛИМЕРСОДЕРЖАЩИХ СОРБЕНТОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОДНОСТАДИЙНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК

(специальность 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии))

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.х.н. Капустин Д.В.

Научный консультант: д.х.н. проф. Зубов В.П.

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................4

ГЛАВА 1 .ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..........................................................................8

1.1 Методы выделения и очистки нуклеиновых кислот..........................8

1.2 Твердофазная экстракция НК...............................................................13

1.2.1 Коммерческие сорбенты для выделения НК....................................16

1.2.2 Автоматические устройства для выделения и очистки НК.........22

1.2.3 Одностадийное выделение ДНК........................................................24

1.3 Композиционные сорбенты...................................................................26

1.3.1 Выбор носителя...................................................................................26

1.3.2 Основные подходы к модифицированию поверхности кремнезема полимерами...........................................................................................................30

1.3.3 Выбор полимерного модификатора..................................................34

1.4 фторсодержащие полимеры, как модификаторы для получения композиционных сорбентов....................................................................................38

1.4.1 Физико-химические свойства фторполимеров................................38

1.4.2 Преимущества фторполимерсодержащих композиционных сорбентов..............................................................................................................38

1.4.3 Способы получения фторполимерсодержащих покрытий............40

1.4.4 Сорбционые свойства фторполимерсодержащих композиционных сорбентов..............................................................................................................45

1.5 полианилин как альтернативный модификатор для получения композиционных сорбентов....................................................................................49

1.5.1 Формы полианилина и их взаимопревращения.................................49

1.5.2 Получение полианилина.......................................................................51

1.5.3 Формирование покрытий ПАНИ.......................................................54

1.5.4 Сорбционные свойства ПАНИ-содержащих сорбентов................55

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................60

ГЛАВА 2 .РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ...........................................................62

2.1 Композиционные фторполимерсодержащие сорбенты, полученные методом озон-инициированной полимеризации................................................62

2.1.1 Активация макропористого стекла озоном....................................62

2.1.2 Полимеризация тетрафторэтилена на поверхности озонированного кремнезема................................................................................65

2.1.3 Морфологические характеристики ПТФЭ-содержащих композиционных материалов..............................................................................69

2.1.4 Сорбционные свойства ПТФЭ-содержащих композиционных материалов...........................................................................................................72

2.2 Композиционные полианилинсодержащие сорбенты.....................77

2.2.1 Морфологические характеристики ПАНИ-модифицированных сорбентов..............................................................................................................81

2.2.2 Сорбционные свойства ПАНИ-модифицированых сорбентов......83

2.2.3 Применение методики одностадийного выделения ДНК на ФП-ПАНИ-содержащих сорбентах в лабораторном анализе...............................90

2.2.4 Выделение ДНК из растительной ткани при детекции фитопатогенов....................................................................................................95

2.2.5 Одностадийное выделение ДНК из крови.........................................96

2.2.6 Выделение ДНК из клинического материала для определения

возбудителей заболеваний методом ПЦР.......................................................100

ВЫВОДЫ..............................................................................105

ГЛАВА 3.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................106

3.1 Материалы и методы............................................................................106

3.2 Получение ПТФЭ-содержащих композиционных сорбентов методом озон-индуцированной полимеризации..............................................109

3.2.1 Озонирование кремнезема.......................... ......................................109

3.2.2 Модификация озонированного кремнезема сополимерами тетрафторэтилена в режиме пост-полимеризации............... .....................109

3.2.3 Модификация озонированного кремнезема сополимерами тетрафторэтилена в режиме одновременного введения мономеров,........110

3.3 Получение композиционного сорбента, последовательно модифицированного фторопластом и полианилином (ФП-ПАНИ-сорбент). 111

3.3.1 Нанесение фторопласта на поверхность кремнезема методом «кастинг»............................................................................................................111

3.3.2 Полимеризации анилина на поверхности модифицированного фторопластом кремнезема..............................................................................112

3.4 Одностадийное выделение ДНК картриджным методом..............113

3.4.1 Картриджный метод одностадийного выделения ДНК.............113

3.4.2 Выделение ДНК из клеточной культуры Agrobacterium tumefaciens С58. ИЗ

3.4.3 Выделение ДНК из растительной ткани с помощью полученных сорбентов............................................................................................................114

3.4.4 Очистка ПЦР-продукта..................................................................114

3.4.5 Выделение ДНК из клинических образцов биоматериала.............115

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.....................................119

ВВЕДЕНИЕ

Современная биотехнология является одной из наиболее бурно развивающихся научных дисциплин, причем в ее развитии можно выделить несколько основных направлений, таких как химическая, биологическая и медицинская биотехнология. Классическая биотехнология, основанная на достижениях микробиологии, биохимии и химической инженерии, может быть определена как дисциплина, занимающаяся «промышленным производством товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов» [1]. Однако в связи с развитием технологии рекомбинантных ДНК, открытой в конце XX в., сущность биотехнологии радикально изменилась. Ранее биотехнологический процесс включал три ключевых этапа, а именно: обработку (подготовку) сырья с целью его эффективного использования в качестве источника питательных веществ для микроорганизма-мишени, ферментацию и биотрансформацию с целью получения нужного метаболита и очистку конечного продукта (вещества) от компонентов среды и клеточной массы. Поэтому основной целью исследований в данной области являлось повышение эффективности каждого этапа, а также поиск микроорганизмов, используя которые можно получить необходимые вещества (антибиотики, пищевые добавки и т.д.). Технология рекомбинантных ДНК открыла возможность напрямую оптимизировать этап биотрансформации, т.е. не просто проводить селекцию высокопродуктивных штаммов, а создавать новые микроорганизмы и эукариотические клетки, в больших количествах производящие необходимые низкомолекулярные вещества и биомакромолекулы. Стало возможным использовать растения и животные в качестве «биореакторов» для производства новых генных продуктов, которые невозможно получить методами селекции или мутагенеза. Таким образом, на стыке биотехнологии и технологии рекомбинантных ДНК возникла молекулярная биотехнология - новая дисциплина, разрабатывающая методы создания живых систем с новыми функциями и возможностями и основанная на комплексном применении методов молекулярной

и клеточной биологии, микробиологии, генетики, биохимии и химической инженерии [2].

С развитием молекулярной биотехнологии, благодаря эффективным и быстродействующим методам выделения конкретных генов и их введения в организм нового хозяина (микроорганизма, растения или животного), стало возможным существенно повысить урожайность сельскохозяйственных культур (за счет создания растений, устойчивых к воздействию патогенов и условий окружающей среды), создавать новые породы животных с улучшенными наследуемыми признаками, повысить эффективность переработки отходов, загрязняющих окружающую среду, а главное, проводить точную диагностику, профилактику и лечение многих инфекционных и генетических заболеваний методами генной терапии. Появилась возможность не только создавать «биологические реакторы», трансгенных животных, генно-модифицированные растения, но и проводить генетическую паспортизацию - полное исследование и анализ генотипа человека, проводимое, например, сразу после рождения, для определения предрасположенности к различным заболеваниям, возможных аллергических реакций, и даже склонности к определенным видам деятельности. Генетическая паспортизация позволяет прогнозировать и уменьшать риски сердечнососудистых и онкологических заболеваний, исследовать и предотвращать нейродегенеративные заболевания и процессы старения, анализировать нейрофизиологические особенности личности на молекулярном уровне.

В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, наряду с традиционными микробиологическими и иммунологическими методами, широко применяются новые подходы, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий. Применение этих методов не только в научных целях, но и в практической лабораторной диагностике во многом стало возможным благодаря разработке в середине 80-х годов XX в. процесса искусственного многократного копирования ДНК и дальнейшему стремительному развитию этой технологии, в настоящее время известной как полимеразная цепная реакция

(ПЦР). ПЦР сделала рутинным анализ специфических полинуклеотидных последовательностей микроорганизмов, растений, животных и человека. Универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым для прямого обнаружения и идентификации возбудителей заболеваний [3], молекулярного типирования и исследования свойств патогенных микроорганизмов [4], анализа мутаций, связанных с генетическими заболеваниями у человека, идентификации личности

[5].

Однако, наряду со многими преимуществами ПЦР-диагностики (возможность определения некультивируемых видов бактерий, таких как Mycobacterium leprae, Treponema pallidum и многих видов вирусов, например, вируса папилломы человека и гепатита С) серьезную проблему представляет выбор конкретных методов подготовки клинических образцов к исследованию. В настоящее время не существует универсальных подходов к выделению ДНК" разных видов микроорганизмов из различных источников. Быстрые методы подготовки проб, предусматривающие возможность автоматизации, не всегда обеспечивают требуемый уровень чувствительности. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие очистить и сконцентрировать ДНК (РНК) для ПЦР-анализа, оказываются трудоемкими и могут увеличивать риск контаминации образцов.

Таким образом, высокий уровень развития биомедицинского направления биотехнологии определяет актуальность разработки новых эффективных материалов и методов выделения и очистки нуклеиновых кислот, из различных источников (бактериальные и клеточные лизаты, кровь, клинические образцы тканей человека). При этом, кроме сохранения функциональной активности выделенных соединений (в т.ч. при хранении), особое внимание обращается на такой важный фактор, как время, затрачиваемое на очистку и выделения биополимеров; необходимо также оценивать и возможность масштабирования и автоматизации процесса выделения.

Для решения данной проблемы в настоящей работе были разработаны новые композиционные сорбенты на основе макропористых твердых носителей, модифицированных нанослоями функционализованных полимеров, в частности, фторсодержащими полимерами и полианилинами, продемонстрирована высокая эффективность применения полученных материалов как в пробоподготовке при одностадийном выделении ДНК из различных источников для непосредственного использования в ПЦР-анализе, так и при использовании в лабораторной практике для получения и очистки синтетических нуклеиновых кислот.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Методы выделения и очистки нуклеиновых кислот

Разработка эффективных способов выделения и очистки нуклеиновых кислот во многих случаях явилась существенной предпосылкой прогресса биотехнологии, поскольку степень очистки выделяемого образца нуклеиновой кислоты во многом определяет эффективность того или иного протокола исследования.

В настоящее время процедура очистки/выделения НК представлена достаточно широким спектром разнообразных методик, который включает в себя как относительно простые и распространенные коммерчески доступные методики, так и сложные многостадийные схемы. Однако все они базируются на основных физико-химических процессах разделения веществ, представленных в таблице 1.

Таблица 1 - Методы выделения/очистки биополимеров.

Принцип действия Соответствующие методики выделения биополимеров

Экстракция.

Разделение смесей жидкостей или растворенных веществ путем избирательного растворения отдельных компонентов в особых растворителях. Искомое вещество должно преимущественно растворятся в растворителе (экстрагенте), чем в среде. Фенол-хлороформная экстракция нуклеиновых кислот [6]

Осаждение.

Осаждение физическое - за счет нагревания, охлаждения, концентрирования или разбавления - т. е. в результате изменения агрегатного состояния вещества при переходе исходной системы в неустойчивое состояние. Осаждение химическое - за счет образования нерастворимых соединений в результате добавления органических или неорганических веществ. Препаративное ультрацентрифугирование ДНК в градиенте плотности хлорида цезия [7] Переосаждение ДНК в спиртах [8, 9, 10] Осаждение белков сульфатом аммония, сульфатом декстрана [11]

Адсорбция.

Частный случай экстракции. Концентрирование целевого вещества на границе раздела адсорбент-жидкость. Адсорбент может быть как жидким, так и твердым. Очистка ДНК на магнитных частицах [12] Очистка белков и пептидов "Ва1сЬ"-методом на магнитных частицах [13] Очистка нуклеиновых кислот методами адсорбции на поверхности пористых кремнеземов и стеклянных микросфер. [14, 15, 16]

Хроматография.

Метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различиях в скоростях их Разнообразные варианты хроматографии белков и нуклеиновых кислот [17]

перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

Разделение в двух водных полимерных фазах.

Метод разделения клеток, микроорганизмов, макромолекул биополимеров и т.д. в смеси водных растворов полимеров (двухфазная водная система), например в смеси 5% раствора декстрана и 3,5% раствора полиэтиленгликоля [18]. Разделение, очистка и концентрирование биомолекул, клеточных органелл, мембран и клеток [20]

Как правило, на практике, для достижения необходимой чистоты образца или более тонкого разделения смеси биополимеров исследователю приходится использовать многостадийные протоколы, которые сочетают в себе несколько методов (например, щелочная экстракция плазмидной ДНК с последующей адсорбцией на стеклянных гранулах [19]). В первую очередь это касается случаев выделения нуклеиновых кислот при использовании прямых методов анализа (без применения культивирования микроорганизмов на искусственных средах), в частности методами ПЦР, из проб, полученных из окружающей среды или из клинических образцов, для проведения идентификации патогенных микроорганизмов [20, 21].

Конечно, встречаются случаи, когда в исследуемых образцах концентрация примесей достаточно низкая и не влияет на проведение ПЦР [22], или количество исследуемого материала изначально настолько мало (например, при анализе

единичных клеток или бактерий, сконцентрированных имунномагнитным разделением), что любой метод пробоподготовки влечет за собой потерю нуклеиновой кислоты [23]. В таких случаях исследуемый образец предварительно разбавляют для снижения концентрации загрязняющих примесей ниже определенного порога [24]. Однако, большинство проб из окружающей среды или клинические образцы содержат значительное количество примесей (например, хаотропные соли, полисахариды [25]), которые взаимодействуют как с ДНК, так и с ферментами, используемыми для амплификации ДНК (таблица 2), поэтому на первом этапе такого исследования необходимо проводить эффективную очистку и выделение ДНК.

Таблица 2 - Источники ДНК для прямых методов анализа.

Содержание ингибирующих примесей в образцах Метод выделения НК Трудности при выделении

Воздух

Малое количество, источником являются, в основном, частицы пыли Центрифугирование, фильтрация [26] Необходимость переводить микроорганизмы в жидкую среду

Жидкость

В зависимости от природы растворителя/жидкой фазы - хаотропные соли, кислоты. Центрифугирование, фильтрация, адсорбция на носителях, электрофо