Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Последовательности эндогенных ДНК, специфично связывающиеся с поверхностью эндотелиальных клеток

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Последовательности эндогенных ДНК, специфично связывающиеся с поверхностью эндотелиальных клеток"

На правах рукописи

ЧЕРНОНОСОВА ВЕРА СЕРГЕЕВНА

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЭНДОГЕННЫХ ДНК, СПЕЦИФИЧНО СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ПОВЕРХНОСТЬЮ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

03.01.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

Лактионов Павел Петрович, к.б.н., зав. лабораторией

Официальные оппоненты:

Шульц Эльвира Эдуардовна, д.х.н., профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН, зав. лабораторией

Таранин Александр Владимирович, д.б.н., Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, зав. лабораторией

Защита состоится« 26 » июня 2014 г. в 12 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru.

Автореферат разослан « //» мая 2014 г.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что на поверхности клеток различного происхождения постоянно присутствуют эндогенные внеклеточные нуклеиновые кислоты (внНК) [Rykova Е. et al„ 2012]. Показано, что часть внНК может быть элюирована с клеточной поверхности в результате обработки клеток реагентами, связывающими двухвалентные ионы металлов, а оставшаяся часть внНК, более "прочно" связанных с клеточной поверхностью, может быть элюирована в составе нуклеопротеиновых (НП) комплексов после обработки клеток трипсином [Morozkin Е. etat., 2004].

В современной научной литературе информация о составе последовательностей ДНК, элюируемых с поверхности клеток (скпДНК), очень ограничена. Показано, что при развитии опухолевого процесса на поверхности клеток крови появляется небольшое количество ДНК из опухолевых клеток [Fleischhacker М. et al., 2007], а ДНК, "прочно" связанные с поверхностью первичных и трансформированных клеток, обогащены фрагментами ДНК прицентромерного района хромосомы 9 [Морозкин Е. и др., 2010]. При этом биологические причины/последствия такого связывания, равно как и биологические функции скпДНК в целом практически не известны. Данные о биологически активных ДНК (антисмысловые олигонуклеотиды (ОДН), экспрессирующие антигены ДНК-конструкции, CpG-богатые ДНК) [Goodchild J., 2011], позволяют предположить, что взаимодействие внНК с белками клеточной поверхности может влиять на клеточные процессы, такие как матричный биосинтез, опосредованный РНКазой Н гидролиз РНК, синтез иммуномедиаторов и молекул адгезии. Кроме того, ДНК и скпДНК могут конкурировать с другими биополимерами (например, сульфатированными полисахаридами) за связывание с их рецепторами или влиять на транспорт других молекул внутрь клеток. Поскольку эффективность связывания нуклеиновых кислот с поверхностью клеток определяет эффективность их транспорта в клеточные компартменты, и, таким образом, их взаимодействие с внутриклеточными мишенями, скпДНК могут транспортироваться в клетку (в частности, в результате сопереноса связанных с мембраной молекул), взаимодействовать с внутриклеточными ДНК-связывающими белками (DAI, H1N-200) и индуцировать каскады клеточных реакций.

Следует отметить, что "прочное" связывание ДНК с клеточной поверхностью может быть обеспечено разными способами: 1) сиквенс-специфичным взаимодействием поверхностных связывающих сайтов с соответствующей ДНК; 2) многоточечным связыванием длинных молекул ДНК с клеточной поверхностью; 3) связыванием молекул посредников с ДНК и плазматической мембраной; 4) суперпозицией этих взаимодействий. Известно, что с поверхностью эукариотических клеток связаны молекулы НК разного размера. Если в случае длинных молекул их "прочное" связывание может быть обеспечено многоточечным взаимодействием с поверхностью клеток, то короткие нуклеиновые кислоты могут быть связаны "прочно"

только благодаря специфическому взаимодействию с поверхностными структурами клеток.

Известно, что связывание ДНК и ОДН с клетками и набор белков, связывающих ДНК, зависит от типа клеток. При этом разные типы трансформированных или иммортализованных клеток сильно отличаются по связыванию ДНК, и ДНК-связывающим белкам, а данные полученные на этих клетках трудно адаптировать для анализа процессов реально протекающих в организме. В представленной работе для исследования скпДНК были выбраны первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НиУЕС). Благодаря своему физиологическому расположению между кровотоком и тканью клетки эндотелия сосудов выполняют ряд важных функций: барьерную, гемостатическую, вазомоторную, сосудообразующую, транспортную, рецепторную и секреторную \Rajendran Р. е/ а!., 2013]. Для этих клеток исследована динамика изменения концентрации внДНК и скпДНК [Морозкин Е. и др., 2009]. Кроме того, эти клетки непосредственно контактируют с кровью и могут влиять на циркуляцию диагностически значимых ДНК-мишеней. Такой набор свойств делает эндотелиальные клетки удобной моделью для исследования молекул ДНК, "прочно" связанных с их поверхностью. Данные о последовательностях ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью эндотелиоцитов, позволят найти мишени для ДНК, связанных с поверхностью клеток, выявить процессы, в регуляцию которых могут быть вовлечены скпДНК, а так же механизмы влияния скпДНК на эти процессы.

Цель работы. Целью представленной работы являлось выделение и идентификация последовательностей ДНК, "прочно" связанных с поверхностью первичных эндотелиальных клеток человека. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) определить размер фрагментов ДНК, "прочно" связанных с поверхностью эндотелиальных клеток человека; 2) разработать метод выделения фрагментов ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью эндотелиальных клеток; 3) идентифицировать последовательности, участвующие в "прочном" связывании ДНК с поверхностью эндотелиоцитов; 4) исследовать связывание с клетками и транспорт в клетки олигонуклеотидов, содержащих выявленные последовательности ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. В представленной работе разработан метод выделения коротких фрагментов ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью эукариотических клеток, из нуклеопротеиновых комплексов, элюируемых с поверхности клеток в результате обработки трипсином. Для определения последовательности коротких одноцепочечных ДНК (оцДНК) из НП комплексов разработан протокол лигирования фланкирующих олигонуклеотидов к оцДНК в низкой концентрации (>10 пМ).

Используя разработанную методологию, идентифицированы фрагменты скпДНК длиной 6-14 нуклеотидов, связанные с поверхностью клеток НиУЕС.

Впервые обнаружены мотивы ATGCAT, CTACGT, GATCCA, встречающиеся в составе скпДНК с частотой 24.1%, 21.7% и 10.8%, соответственно. Исследовано связывание и проникновение ОДН, содержащих идентифицированные мотивы ДНК, а так же их транспорт внутрь эндотелиальных клеток. Обнаружено, что процесс связывания ОДН с клеточной мембраной зависит от комбинации идентифицированных мотивов ДНК в их последовательности и вторичной структуры ОДН. Продемонстрировано, что ОДН транспортируются путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, причем выявленные мотивы ДНК определяют их внутриклеточную локализацию. Таким образом, последовательность скпДНК является одним из основных факторов, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью эндотелиальных клеток и внутриклеточный транспорт НК.

Учитывая тот факт, что связывание ДНК с клеточной поверхностью является определяющим фактором их транспорта к клеточным мишеням, идентификация последовательностей ДНК, обеспечивающих "прочное" связывание с поверхностью клеток, может быть использована для эффективной и направленной доставки НК в клеточные компартменты. Полученные в работе данные о нуклеотидном составе коротких фрагментов ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью HUVEC, могут быть использованы для поиска белков-мишеней, экспонированных на поверхности клеток и связывающих НК, а так же для исследования биологических функций скпДНК.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 2 печатные работы и 2 патента РФ. Результаты работы были представлены на международных конференциях: "International Conference on Chemical Biology" (Новосибирск, 2005); "Физико-химическая биология" (Новосибирск, 2006); 32nd FEBS Congress "Molecular Machines" (Вена, 2007); "Circulating Nucleic Acids in Plasma/Serum -V" (Москва, 2007); "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, 2007); "IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов" (Новосибирск, 2008).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов, Списка сокращений и Списка цитированной литературы. Работа изложена на 134 страницах, содержит 22 рисунка и 15 таблиц. Библиография включает 217 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Культивирование и харакгеризация эндотелиальных клеток человека

Эндотелиальные клетки (HUVEC), выделяли из пупочной вены человека при помощи коллагеназы 4 по модифицированному протоколу [Jaffe Е. et al., 1973]. Полученные клетки характеризовали при помощи фазово-контрастной микроскопии, ОТ-ПЦР и флуоресцентной гибридизации in situ.

По данным фазово-контрастной микроскопии культура НиУЕС представлена типичным монослоем из полигональных клеток размером в среднем 15x50 микрон, которые обладают свойством контактного торможения (рис. 1А). Методом ОТ-ПЦР показано, что в клетках НИУЕС экспрессируются мРНК генов Е-селектина и фактора фон Виллебранда (рис. 1Б, дор. 2 и 3, соответственно), в то время как в клетках А431 не наблюдается экспрессии этих генов (рис. 1Б, дор. 5 и 6, соответственно), т.е. полученные клетки

Рисунок 1. Характеризация эндотелиальных клеток. А. Фотография НиУЕС в фазовом контрасте при помощи микроскопа

Ахюуеп 200 М. Б. Экспрессия тканеспеци-фических генов в клетках НиУЕС и клетках линии А431. Продукты ОТ-ПЦР анализировали в иативном 6% ПААГ с последующей визуализацией ДНК бромистым этидием. Дор. 1 и 4 - ПЦР-фрагмент (3-актина (298 п.и.), дор. 2 и 5 - ПЦР-фрагмент Е-селектина (205 п.н.), дор. 3 и 6 - ПЦР-фрагмент фактора фон Виллебранда (475 п.н.).

2. Исследование низ ко мол е кул арных ДНК, связанных с поверхностью эндотелиальных клеток человека

Для исследования состава "прочно" связанных низкомолекулярных скпДНК из трипсинового элюата (ТЭ) с поверхности эндотелиальных клеток были выделены внНК. После выделения и денатурации во внНК при помощи Т4-полинуклеотидкиназы вводили [32Р] и анализировали полученные НК при помощи электрофоретического анализа (рис. 2). Показано, что обработка образца внНК ДНКазой I, свободной от РНКаз, приводит к гидролизу полинуклеотидов (рис. 2, дор. 2), т.е. основную часть низкомолекулярных внНК из ТЭ НиУЕС составляют фрагменты ДНК длиной менее 30-34 нуклеотидов (рис. 2, дор. 1).

Рисунок 2. Анализ низкомолекулярных НК, выделенных из ТЭ с поверхности эндотелиальных клеток. НК были выделены коммерческим набором "ВюБШса" и фосфорилированы в присутствии [у-32Р]-АТФ при помощи Т4-лолинуклеотидкиназы. Радиоавтограф денатурирующего 16% ПААГ. Дор. 1 - НК из ТЭ с поверхности клеток НиУЕС, дор. 2 - НК из ТЭ клеток НиУЕС после обработки ДНКазой I.

действительно являются эндотелиальными. А Б

Л' 12,1 56

Ж-кН ««

На основании литературных и полученных в работе данных можно предположить, что короткие молекулы ДНК могут напрямую взаимодействовать с белками-мишенями клеточной поверхности, и такое взаимодействие может быть достаточно "прочным" и, возможжх сиквен -специфичным. Поэтому выделение и идентификация коротких ДНК из НИ комплексов, "прочно" связанных с поверхностью эндотелиальных клеток, стали задачами очередного этапа работы.

3. Разработка метода выделения коротких ДНК, "прочно" связанных с

поверхностью клеток

Для выделения последовательностей ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с клеточной поверхностью, был предложен подход, основные этапы которого представлены на рисунке 3.

Л,

Обработка клеток раствором РВЭ-ЕОТА

ш ^

Щт

Обработка клеток трипсином

Инкубация нуклеопротеиновых комплексов с ВгСЫ-сефарозой

/

Кинирование выделенных фрагментов ДНК и анализ в ПААГ с последующим _ X выделением оцДНК 7/ О^^

Отмывка смолы от неспецифически связанных биополимеров

Элюция прочно связанных фрагментов ДНК

Рисунок 3. Схема выделения последовательностей ДНК, обеспечивающих "прочное" связывание ДНК с поверхностью клеток.

Особенности этого подхода заключаются в том, чтов качест исследуемого биоматериала используются эндогенные внДНК, которые постоянно присутствуют на поверхности клеток. Во-вторых, используется не ~ скпДНК, а только те ДНК, которые элюированы с поверхности клеток с помощью трипсина в составе НП комплексов. В-третьих, НН ТЭ ковалентно присоединяют к ВгСН-сефарозе, преимущественно через белковую компоненту комплексов, затем удаляют с сорбента неспепифически связанные НК, после чего элюируют ДНК, находящиеся в комплексах с белками, ковалентно связанными с сорбентом.

На стадии разработки предложенного подхода были подобраны условия связывания НП комплексов из ТЭ с активированной BrCN-сефарозой (рис. 4А). Было показано, что активированная BrCN-сефароза не формирует ковалентных комплексов с очищенной ДНК из ТЭ (рис. 4А, дор. 3), но эффективно связывает ДНК в составе НП комплексов из ТЭ.

А Б Рисунок 4. Оптимизация условий выделения

1 2 3 1 2 3 А скпДНК препаратов из ТЭ с HUVEC.

Радиоавтографы денатурирующего 16% ПААГ. А. Связывание скпДНК препаратов из ТЭ с BrCN-сефарозой. Очищенный препарат скпДНК или скпДНК в составе НП комплексов инкубировали с BrCN-сефарозой, сорбент j0 nt. j|| отмывали, ДНК элюировали с сорбента,

21 „|. выделяли набором "BioSilica" и

"i! фосфорилировали при помощи Т4-поли-

■нуклеотидкиназы в присутствии [у-32Р]-АТФ. Дор. 1 - контроль, скпДНК из ТЭ, не ю ш ■ Ш - Jt А. инкубированная с BrCN-сефарозы, дор. 2 -| * Ч'ЯРЧР' скпДНК в составе НП комплексов ТЭ клеток

после связывания/элюции с BrCN-сефарозы, дор. 3 -предварительно очищенные спкДНК из ТЭ клеток после связывания/элюции с BrCN-сефарозы. Б. Оптимизация условий выделения спкДНК из состава НП комплексов с поверхности клеток. ТЭ инкубировали с BrCN-сефарозой, полученный сорбент отмывали для элюции низко- и высокоаффинных ДНК, выделяли ДНК из предварительно прогретых элюатов или прогретых сорбентов, затем фосфорилировали ДНК при помощи Т4-полинуклеотидкиназы в присутствии [у-32Р]-АТФ. Дор. I - ДНК, связанные с сорбентом, после отмывки сорбента PBS, дор. 2 - ДНК, связанные с сорбентом после отмывки раствором PBS-ЭДТА, дор. 3 - ДНК, связанные с сорбентом после его отмывки последовательно раствором PBS-ЭДТА и раствором PBS с 0.5М NaCl, дор. 4 - ДНК, элюированные с сорбента 50 мМ раствором NH3/HCOOH (рН 2.5).

Были отработаны условия удаления низкоаффинно-связанных ДНК и условия выделения "прочно" связанных с сорбентом скпДНК. Эффективность удаления низкоаффинных ДНК оценивали по уменьшению количества ['2Р]-меченого полинуклеотидного материала, связанного с сорбентом. Из рисунка 4Б видно, что обработка сорбента раствором PBS с ЭДТА (дор. 2) и последовательные отмывки сорбента растворами PBS с ЭДТА и PBS с 0.5М NaCl (дор. 3) приводят к ступенчатому удалению основной части ДНК, связанных с сорбентом, по сравнению с исходным образцом ДНК (дор. 1). Тот факт, что обработка сорбента раствором PBS с 0.5М NaCl не приводит к элюции ДНК, свидетельствует о том, что такие ДНК достаточно "прочно" связаны с сорбентом. Показано, что фрагменты скпДНК, "прочно" связанные с сорбентом, могут быть элюированы при помощи обработки сорбента 50 мМ раствором NHj/HCOOH (рН 2.5) (рис. 4Б, дор. 4). Таким образом, были подобраны условия выделения скпДНК из НП комплексов с поверхности HUVEC.

4. Разработка протокола лигирования фланкирующих ОДН к оцДНК в условиях низких концентраций оцДНК-мишеней

Для определения последовательностей коротких фрагментов ДНК, полученных из состава НП комплексов с поверхности HUVEC, необходимо иметь достаточное количество исходного материала для последующих манипуляций, таких как клонирование и секвенирование. Количество фрагментов оцДНК (по оценочным данным не более 10"" моль), полученных в результате выделения, не позволяло напрямую лигировать их в одноцепочечные вектора для последующего клонирования. Для определения последовательностей оцДНК было необходимо амплифицировать полученные фрагменты оцДНК. Для амплификации таких оцДНК было необходимо лигировать фланкирующие олигонуклеотиды к 5'- и 3'-концам этих молекул. После лигирования продукт, состоящий из неизвестной последовательности оцДНК, фланкированной олигонуклеотидами известных последовательностей, мог бы быть амплифицирован при помощи ПЦР с праймерами, комплементарными фланкирующим ОДН.

Была предложена следующая схема лигирования фланкирующих ОДН к 5'- и 3'- концам оцДНК при помощи Т4 ДНК-лигазы (рис. 5).

5Р-2as**-он* + ----* F;°flH

с-одн

Лигирование, Т4 ДНК-лигаза

ЬР_í_dea3

degVWSA_ОН

{Выделение продукта 'i»-Deg3*

с-ОДН

JjS —шм

| Лигирование, Т4 ДНК-лигаза deg*

прямой лраимер

обратный праймер |пЦР-амплификация, Taq ДНК-попимераза

Рисунок 5. Схема лигирования к 3'- и 5'-концам [32Р]-меченых оцДНК (обозначены красным цветом) фланкирующих ОДН из состава адапторов, состоящих из фланкирующего (F-ОДН) и сближающего (С-ОДН) олигонуклеотидов, с амплификацией продукта лигирования. Фланкирующий ОДН обозначен синим цветом -З'-Р-ОДН, а зеленым цветом обозначен - S'-F-ОДН, deg - диэтиленгликоль.

В случае ферментативного присоединения фланкирующего ОДН к З'-концу [32Р]-меченых оцДНК адаптор состоит из двух ОДН: З'-Р-ОДН, несущего 5-фосфатную группу и З'-блокатор (deg), и другой ОДН, называемый сближающим (С-ОДН), частично комплементарен фланкирующему З'-Р-ОДН, имеющий на З'-конце выступающую рандомизованную последовательность из 5/6 нуклеотидов и блокатор (deg). Продукт лигирования З'-Р-ОДН к З'-концу [32Р]-меченых оцДНК f [52Р]-оцДНК-Р-ОД11) выделяли после

электрофоретического анализа при помощи электроэлюции. Затем к 5'-концу [ Р]-оцДНК-Р-ОДН лигировали фланкирующий ОДН из адаптора, который состоит из 5'-Р-ОДН с гидроксильными группами на 3'- и 5'-концах, С-ОДН, с З'-блокатором (deg) и выступающей рандомизованной последовательностью из 5/6 нуклеотидов на 5'-конце. В результате лигирования получали продукты [32Р]-меченых оцДНК фланкированных по 3'- и 5'-концам ОДН известной последовательности, которые могут быть использованы для ПЦР-амплификации.

Была исследована зависимость эффективности лигирования З'-Р-ОДН от концентрации адаптора и фермента в реакции лигирования адапторов, состоящих из двух ОДН, к модельному дезоксирибоолиго-нуклеотиду (Т-ОДН, 20 нуклеотидов). Адаптеры 1 и 2 отличались только длиной рандомизованной последовательности в составе С-ОДН (5 и 6 нуклеотидов, соответственно). Из рисунка 6А видно, что количество фермента в реакционной смеси имеет принципиальное значение - при использовании 150 ед.акт. Т4 ДНК-лигазы эффективность реакции возрастает в несколько раз (минимум в 3 и максимум в 6 раз) по сравнению с лигированием в присутствии 5.5 ед.акт. фермента. Показано, что эффективность лигирования увеличивается при повышении избытка адаптора: при 1000 кратном молярном избытке адаптора реакция идет в 2 раза более эффективно, чем при 100 кратном молярном избытке адаптора и 50-150 ед.акт. Т4 ДНК-лигазы. Кроме этого, удлинение рандомизованной последовательности С-ОДН на один нуклеотид приводит к увеличению эффективности лигирования приблизительно на 10% при использовании 1000 кратного избытка адаптора 2.

Результаты исследования зависимости эффективности лигирования от температуры и времени инкубации приведены на рисунке 6Б и 6В. Полученные данные демонстрируют, что выход продукта реакции увеличивается со временем инкубации реакционной смеси и понижением температуры реакции при концентрации Т-ОДН = 10 пМ. При инкубации в течение 27 ч выход продукта лигирования модельного Т-ОДН с З'-Р-ОДН из состава адапторов 1 и 2 при температуре 13°С в среднем выше на 21% и 29%, соответственно, по сравнению с 22°С. Очевидно, что повышение температуры приводит к уменьшению стабильности комплексов ДНК, являющихся субстратом для фермента.

А

ГЛ [адаптор 1] = 1 нМ ¿3 [адаптер 2] = 1 нМ [адаптер 1] = 10 нМ Г~~1 [адаптер 2) = 10 «М

адаптер I

5'p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3' deg- (N) s-TGCATCATCACCCITCTTCCTAGGICC

адаптер 2

5p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3 deg- (N) 6-TGCATCATCACCCTTCTTCCTAGGTCC

5,5еджт. 16,7eftata. SO едлгт 150едасг.

Количество T4 ДНК-лигазы 8 реаюри

Время инкубации реакции { log ,ч)

Время инкубации реакции ( 1од3,ч}

Рисунок 6. Зависимость выхода продукта лигирования от концентрации адаптера и концентрации фермента Т4 ДНК-лигазы (А). Инкубация реакции в течение 20 часов при 13°С с 10 пМ концентрацией Т-ОДН. Фланкирующий ОДН выделен подчеркиванием. Зависимость эффективности лигирования от температуры и времени инкубации (Б и В). Условия лигирования: концентрация Т-ОДН = 10 пМ, концентрация адаптера = 10 нМ (Б - адаптер 1. В - адаптер 2) в присутствии 150 ед.акт. Т4 ДНК-лигазы.

При исследовании эффективности лигирования фланкирующих ОДН к 5'- и 3'- концам модельного Т-ОДН было обнаружено (рис. 7), что выход продукта реакции возрастает с увеличением молярного избытка адаптора 2 и составляет 55±6% при 1000 молярном избытке адаптора. Однако для 5'-концевого адаптора 3 наблюдается колокообразная зависимость выхода продукта реакции от молярного избытка адаптора с максимумом 57±8% при 250 молярном избытке адаптора 3. Полученные результаты согласуются с данными других работ [/Vg P. et al., 2004], где показано, что сайт связывания фермента Т4 ДНК-лигазы с субстратом является ассиметричным.

ШШ [адаптор] = WO пМ FKnI [адаптор] = 500 пМ

■■ [адаптор] = 2.5 иМ

У7<~\ [адаптор] = 10 нМ

5' р -ACGTAGTAGT GGGAAGAAGGATCCAGGdeq3' deg- (N) 6-TGCATCATCACCCTTCTTCCTAGGTCC

5'ttcgaattctacctcgcgcsatctac3'

deg-AAGCTTAAGATGGAGCGCGCTAGATG- (N)

5'

5'

адаптор Э

адаптор 2

Рисунок 7. Зависимость эффективности лигирования Т-ОДН (10 пМ) с фланкирующим ОДН от концентрации адапторов 2 и 3. Реакционные смеси инкубировали в течение 27 часов при 13°С в присутствии 150 ед.акт. Т4 ДНК-лигазы. Количественные данные получены при помощи оцифровки данных радиоавтографа денатурирующего 16% ПААГ. Фланкирующий ОДН выделен подчеркиванием.

При использовании подобранных условий лигирования фланкирующих ОДН из состава адапторов 2 и 3 к 5'- и 3'- концам ОДН-мишени, в концентрации менее 10 пМ, выход продукта лигирования составляет 46±6%. После клонирования продуктов лигирования в pBIueScript 11 K.S и секвенирования плазмидной ДНК было обнаружено, что 70% продукта лигирования представлено димерами фланкирующего 3'-F-OflH, несмотря на наличие защитной группы на З'-конце. Вполне вероятно, что в используемых условиях Т4 ДНК-лигаза, кроме основной активности, проявляет флеп-нуклеазную активность, как это было обнаружено в работе [Цытович А. и др., 1988], которая и приводит к появлению нежелательных продуктов реакции

Для увеличения специфичности лигирования были использованы комбинированные адапторы, состоящие из трех ОДН (таблица 1). Вместо одного сближающего олигонуклеотида в составе адаптера используются два ОДН, которые тандемно-комплементарны фланкирующему ОДН. Сближающий олигонуклеотид (Ст-ОДН) состоит из выступающей рандомизованной последовательности на 5'- или З'-конце и частично комплементарен части фланкирующего ОДН. Эффекторный олигонуклеотид (Е-ОДН) комплементарен оставшейся части фланкирующего ОДН и предназначен для стабилизации комплекса сближающего ОДН с фланкирующим ОДН.

Таблица 1. Структуры адаптеров для лигирования З'-Р-ОДН к Т-ОДН.

Структуры адапторов, состоящих из 2 ОДН (эффективность лигирования, %) Структуры адапторов, состоящих из 3 ОДН (эффективность лигирования, %)

s'p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3' deg- (N) 5-TGCATCATCACCCTTCTTCCTAGGTCC (37±5)

2 5'p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3' deg- (N) 6-TGCATCATCACCCTTCTTCCTAGGTCC (55±6)

4 s'p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3 deg- (N) s-TGCATCATCA (18±4) 8 deg-CCCTTCTTCC '' p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3 deg- (N) j-TGCATCATCA (39±4)

5 5'p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3' deg- (N) ,-TGCATCATCA (23±4) 9 deg-CCCTTCTTCC Б' p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3' deg- (N) 6-TGCATCATCA (71±6)

6 5' p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3' deg- (N) 5-TGCAT (0) 10 deg-CATCACCCTT 5' p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3' deg- (N) s-TGCAT (0)

7 5' p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3' deg- (N) 6-TGCAT (0) » deg-CATCACCCTT 5' p-ACGTAGTAGTGGGAAGAAGGATCCAGGdeg3' deg- (N) 6-TGCAT (7±3)

В таблице 1 приведены результаты лигирования фланкирующего З'-Р-ОДН, состоящего из комбинированных адапторов к модельному [32Р]-меченому Т-ОДН в концентрации 10 пМ с использованием Т4 ДНК-лигазы. Обнаружено, что адапторы 6 и 7 не способны образовывать достаточно стабильные комплексы фланкирующего ОДН с модельным Т-ОДН для реакции лигирования, катализируемой Т4 ДНК-лигазой. Однако добавление 10-нуклеотидного эффекторного ОДН в состав адаптера 7 с образованием адаптера 11 приводит к появлению незначительного количества продукта реакции (7±3%). Выход продукта лигирования составил 18±4% и 23±4% для адапторов 4 и 5, содержащих 15- и 16-нуклеотидные сближающие ОДН, соответственно. В то же время добавление эффекторных ОДН в состав этих адапторов с образованием адапторов 8 и 9 способствует увеличению эффективности лигирования, что свидетельствует о повышении стабильности субстратного дуплекса для Т4 ДНК-лигазы. Таким образом, увеличение длины рандомизованной последовательности сближающего ОДН на один нуклеотид способствует повышению выхода продукта реакции в 1.8 раз, аналогичное увеличение эффективности лигирования было обнаружено и при использовании адапторов 1 и 2, состоящих из двух ОДН. При использовании адаптера 9 (10 нМ) в условиях реакции лигирования (150 ед.акт. Т4 ДНК-лигазы, 27 ч при 13°С) и модельного Т-ОДН в концентрации 10 пМ образуется продукт реакции с эффективностью 71±6%. Эти условия были использованы в дальнейшей работе при лигировании фланкирующих ОДН из состава адапторов к фрагментам оцДНК, выделенным из НП комплексов с поверхности эндотелиальных клеток.

5. Выделение, амплификация, клонирование и секвенирование коротких ДНК с клеточной поверхности эндотелиоцитов

Образец для выделения фракции НП комплексов, локализованных на поверхности НЦУЕС, был получен в результате обработки 80 млн. эндотелиальных клеток трипсином. НП комплексы были иммобилизованы на активированной ВгСМ-сефарозе. Из исходного ТЭ и элюатов с сорбента, внНК были выделены с использованием наборов для выделения коротких внНК "ВюБШса", затем мечены [32Р] и проанализированы при помощи гель-электрофореза (рис. 8). Показано, что количество внНК в исходном ТЭ с НиУЕС (дор. 1) отличается от количества внНК из НП комплексов, "прочно" связавшихся с ВгСТ^-сефарозой (дор. 2). В качестве отрицательного контроля использовали образец, который был получен в результате инкубации сорбента с 0.125% раствором трипсина (рис.8, дор. 5). Обработка образца внНК, "прочно" связанных с поверхностью эндотелиальных клеток, РНКазой А и ДНКазой I (рис. 8, дор. 3 и 4, соответственно) свидетельствует о том, что в составе образца присутствуют в основном короткие фрагменты оцДНК длиной до 14 нуклеотидов.

Рисунок 8. НК из ТЭ с поверхности эндотелиальных клеток. НК были элюированы с сорбента (дор. 2-5), выделены и фосфорилировали при помощи Т4-полинуклеотидкиназы в присутствии [у-32Р]-АТФ. Радиоавтограф денатурирующего 16% ПААГ. Дор. 1 - внНК из ТЭ клеток НиУЕС, дор. 2 - внНК, "прочно" связанные с белковыми компонентами сорбента, дор. 3 - внНК, "прочно" связанные с белковыми компонентами сорбента после обработки РНКазой А, дор. 4 -внНК, "прочно" связанные с белковыми компонентами сорбента после обработки ДНКазой I, дор. 5 - НК, полученные в результате инкубации сорбента с раствором трипсина.

Фрагменты [32Р]-меченых оцДНК из обозначенной области геля (рис. 8, дор. 2) были выделены при помощи электроэлюции, и к их 3'- и 5'-концам были последовательно лигированы фланкирующие ОДН из состава адапторов 9 и 12. Полученные в результате лигирования конструкции ДНК, состоящие из оцДНК, фланкированных по концам З'-Б-ОДН и 5'-Р-ОДН известных последовательностей, амплифицировали, выделяли ПЦР-продукты из геля при помощи электроэлюции и клонировали в плазмиду рВ1ие8спр1 II К8 по сайтам рестриктаз ЕсоШ и ВашН1. Последовательности ДНК вставок были определены секвенированием по Сэнгеру в Центре секвенирования ДНК СО РАН. Последовательности коротких фрагментов ДНК, "прочно" связанные с клеточной поверхностью клеток НЛУЕС, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Последовательности ДНК, выделенных из ТЭ эндотелиальных клеток

человека.

Последовательность Комплементарная последовательность Длина (н.) Встречаемость последовательности

5'-GTCTACGTCTTCA-3' 5'-TGAAGACGTAGAC-3' 13 3

5'-TACGGGGGGC-3' 5'- GCCCCCCGTA -3' 10 2

5'- CTACffft ! ; -3' 5'- AAGACGTAG -3' 1

5'- gTAGGT< ( i -3' 5'- AGGACGTAG -3' 1

5'- CTACQTCGT -3' 5'- ACGACGTAG -3' 2

5'- TGTCATCAT -3' 5'- ATGATGACA -3' 9 2

5'- GCATGCATT -3' 5'- AATGCATGC -3' 5

5'- AGTAGTGGG -3' 5'- CCCACTACT -3' 1

5'- AGTCGTGGG -3' 5'- CCCACGACT -3' 2

5'- CATGCATT -3' 5'- AATGCATG -3' 4

5'- GCATGCAT -3' 5'- ATGCATGC -3' 5

5'- CI ACGTI -3' 5'- CGACGTAG -3' 2

5'- GGGAAGAA -3' 5'- TTCTTCCC -3' 1

5'- CGGAAGAA -3' 5'- TTCTTCCG -3' 1

5'- GTAGATCC -3' 5'- GGATCTAC -3' 2

5'- CTGGATCC -3' 5'- :GATCCA> ; 8 1

5'- CGTGGTCT -3' 5'- AGACCACG -3' 2

5'- CGTCCGGC -3' 5'- GCCGGACG -3' 3

5'- GATCCAGG -3' 5'- CCTGGATC -3' 2

5'- CTACGT1C -3' 5'- GAACGTAG -3' 4

5'- ATGCGTGT -3' 5'- ACACGCAT -3' 2

5'- GTACGT \t -3' 5'- GTACGTAG -3' 6

5'- TCCGTAC -3' 5'- GTACGGA -3' 2

5'- EATCdK -3' 5'-ATGGATC -3' 3

5'- AGCTGGA -3' 5'- TCCAGCT -3' 7 1

5'- AGCGGGA -3' 5'- TCCCGCT -3' 1

5'- CGTAGTA -3' 5'- TACTACG -3' 2

5'- TGGCTT -3' 5'- AAGCCA -3' 1

5'- TGTCTT -3' 5'- AAGACA -3' 1

5'- ACGAGT -3' 5'- ACTCGT -3' 3

5'- AGAAGG -3' 5'- CCTTCT -3' 6 2

5'- CGGCTT -3' 5'- AAGCCG -3' 1

5'- CGTCTT -3' 5'- AAGACG -3' 1

5'- ATGCAT -3' 5'- ATGCAT -3' 6

S'-^BA-T 5'- TGGATC -3' 3

5'- CGGGA -3' 5'- TCCCG -3' 5 2

Анализ последовательностей ДНК, полученных в результате секвенирования, показывает, что наиболее часто встречаются мотивы АТССАТ (24.1%), |!ШШ (21.7%), @АТС€}| (10.8%). Следует отметить, что последовательность ТУСОТ (где У=А/С/С) встречается в исследуемом пуле внеклеточных ДНК с частотой 25.3% и, в случае, когда V является аденином, представляет собой укороченный вариант последовательности СТАСОТ. Мотив АТССАТ (24.1%) чаще всего встречается в пуле секвенированных ДНК в виде последовательности С АТССАТ (16.9%). Последовательность йАТСС представлена в пуле скпДНК клеток ЬЮУЕС с частотой 13.3%. Полученные нами последовательности ДНК отличаются от ранее опубликованных

последовательностей ДНК [1Уи С. е( а/., 2003; \1ende М. е! а1„ 2007], найденных методом БЕЬЕХ и характеризующихся эффективным связыванием с мембраной клеток.

6. Исследование связывания коротких олигонуклеотидов с эндотелиальными клетками

Для исследования связывания ОДН с клетками и их транспорта в клетки, были синтезированы ОДН, содержащие наиболее часто встречающиеся ДНК-мотивы, и комплементарные им ОДН (таблица 3). В качестве контрольного олигонуклеотида был выбран К7-ОДН, выявленный в результате метода 8ЕЬЕХ \Mende М. е/ а!.. 2007], а также комплементарный ему К8-ОДН.

Таблица 3. Короткие ОДН, исследуемые в связывании с клетками Н1ГУЕС.

Последовательность ОДН (5'-3') Частота встречаемости в пуле скпДНК (%) % связанного ОДН с 10* клетками, от добавленного ОДН*

60 вМ" 250 нМ" 1 мкМ**

К1-ОДН рСАТвСАТ 16.9 0.48±0.06 0.41±0.04 0.25±0.04

К2-ОДН рАТССАТв 1.11±0.08 0.51±0.09 0.23±0.04

кз-одн рОАТССА 10.8 0.51±0.06 0.25±0.03 0.18±0.04

К4-ОДН рТОвАТС 0.39±0.05 0.29±0.03 0.12±0.03

К5-ОДН рТАССГ 21.7 0.77±0.07 0.23±0.05 0.14±0.03

К6-ОДН рАСОТЛ 0.41±0.08 0.16±0.04 0.12±0.04

К7-ОДН рТСвТОТ - 0.55±0.06 0.36±0.0 3 0.23±0.04

К8-ОДН рАСАСвА 0.37±0.05 0.12±0.04 0.10±0.03

* -Данные трех независимых экспериментов представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

** -Концентрация ОДН в инкубационной среде клеток.

Для исследования связывания олигонуклеотидов с клетками, [32Р]-меченые короткие ОДН в различной концентрации инкубировали в течение 30 минут с клетками Ни"УЕС. Из данных приведенных в таблице 3 видно, что более представленные последовательности (К2-ОДН и К5-ОДН) эффективнее связываются с клетками НиУЕС при 60 нМ концентрации ОДН в культуральной среде. Показано, что К5-ОДН и К7-ОДН эффективнее связываются с клетками, чем комплементарные им ОДН (К6-ОДН и К8-ОДН). Известно, что ОДН и ДНК, содержащие динуклеотиды Срв, эффективнее связываются с клетками. Наличие динуклеотида Срв в последовательностях ОДН (К5-ОДН - К8-ОДН) не оказывало явного влияния на связывание ОДН с плазматической мембраной НиУЕС в диапазоне концентраций ОДН 0.25—1 мкМ. Следует отметить, что в литературе отсутствуют данные о взаимодействии коротких ОДН длиной до 8 нуклеотидов с клетками.

7. Компьютерный анализ геномной ДНК человека и выявление участков ДНК, содержащих кластеры идентифицированных мотивов ДНК

Известно, что внДНК имеют эндогенное происхождение [Rykova Е. et al., 2012]. Очевидно, что источником выделенных на первом этапе работы фрагментов оцДНК является геномная ДНК, для дизайна синтетических ОДН был использован подход, основанный на поиске участков генома, содержащих идентифицированные мотивы ДНК и их повторы в высокой плотности. Для поиска таких последовательностей ДНК были использованы доступные данные о геноме человека (2006 г) и компьютерная программа поиска таких участков ДНК, разработанная Воробьевым Д. Г. (ИЦиГ СО РАН). В результате анализа генома человека было обнаружено 4410 фрагментов ДНК размером до 150 нуклеотидов, содержащих выявленные нами мотивы ДНК и их повторы.

Полученные данные демонстрируют, что в основном процентное распределение по хромосомам соответствует их размерам, однако наблюдается ряд исключений. Для акроцентрических хромосом (хромосом 13, 14 и 15) средних размеров характерно в 1.3 раза пониженное содержание фрагментов ДНК, содержащих идентифицированные мотивы ДНК, по сравнению с маленькими субметацентрическими хромосомами 16 и 17. В то же время в хромосоме 19 - одной из самых маленьких метацентрических хромосом, количество фрагментов ДНК, обогащенных выявленными мотивами ДНК, такое же, как и в существенно больших по размеру хромосомах 16 и 17. Из распределения последовательностей ДНК-"предшественников" по хромосомам видно, что 64% фрагментов ДНК длиной порядка 150 нуклеотидов распределены в эухроматиновых участках генома. Эти результаты согласуются с литературными данными о том, что пул свободно циркулирующей апоптотической ДНК в среде эукариотических клеток так же обогащен последовательностями ДНК эухроматиновых районов. Связывание коротких ДНК с поверхностью клеток, вероятно, происходит после гидролиза апоптотической ДНК. С другой стороны, обогащенность скпДНК последовательностями эухроматиновой ДНК позволяет предположить, что такая ДНК может быть функционально активна.

Анализ 463 последовательностей ДНК, входящих в состав характерных пиков, содержащих наибольшее удельное количество последовательностей ДНК на единицу длины хромосомы, при помощи общедоступной базы данных повторяющихся последовательностей генома Dfam 1.2 показал, что наиболее часто последовательности ДНК локализованы в областях обогащенных простыми повторами и LTR-ретротранспозонами (LTR - long terminal repeat). Следует отметить, что последовательности ДНК представляют собой фрагмент MLT1K из класса LTR-ретротранспозонов, содержащего следующие мотивы ДНК: TGGATC (К4-ОДН), G АТС С А (КЗ-ОДН), TACGT (К5-ОДН). В нашем случае количественное содержание в последовательностях ДНК повторов семейств LINE (long interspersed elements) и SINE (short interspersed elements) практически одинаковое и составляет не более 3.9%, что согласуется с

литературными данными о содержание ЫКЕ-элементов в пуле свободно циркулирующих ДНК \Morozkin Е. аа\„ 2012; Ьгоип М. е1 а1„ 2001\.

8. Взаимодействие с эндотелиоцитами олигонуклеотидов, содержащих секвенированные мотивы ДНК

8.1. Исследование взаимодействия ?2Р]-меченых ОДН с клетками ШУЕС

На основании данных по связыванию коротких ОДН и компьютерного анализа, а так же учитывая результаты других исследователей, были выбраны и синтезированы 14 ОДН (таблица 4). Ддя повышения стабильности ОДН к действию нуклеаз они содержали на З'-конце "инвертированньш тимидин

(г'т>Т).

Таблица 4. Последовательности ОДН для исследования их транспорта в НЦУЕС.

№

Последовательность ОДН (51-

>3')

ртсотсттсототтсот*оттсстоттсототтсотот,т.т

,СТОСАТСССАОАОСАТфАТСС^ОАООТОООААОА,„1

,стасотсоатосототт*ссг.тасстасотстт,>д

Входящий короткий ОДН

Локализация в геноме человека

рСТССАТОСАТ1ТССТ*тстосаттссасстоса„„т рОАТССАОООАТССАСООАТССАС.СОАТСДО^ '

II ИИ

рСасстоссаЬатссаоатсс^отоаатстоа^ ртсааостасааооаатсссоосстодио; т

10

расстоасаатосатосстстоасаатосатосстсс^т"

„ААТТДААТОСАТОССААТАААТТАААТОСАТОССТА,,„.Т

—___________„„.-^т-,-Т

11

12

13

14

)ААТТАААТвСАТиСС А А1ААА1 I для ""

рОСАТОСАТГОСАТОСАТТС,САТОСАТТОСАТОСАТ1,„,_

рТСАТАТАСЖАТОСАТТТАТОСАТОСАТТТТОААААС,,,,.Т рТСАТСТСОТССАТОСАТГТТСССАТОСАТГТСГГОТ^Т

К7-ОДН

КЗ-ОДН

К5-ОДН

К1-ОДН

кз-одн

кз-одн

кз-одн

К2-ОДН

К2-ОДН

К1-ОДН

К1-ОДН

ра1асстс^шатас0т01^илтатст,,„т

р^^НАХАЩГС^^ИАХАСОТСШЖт

К1-ОДН

К5-ОДН

кз-одн

К5-ОДН

кз-одн

ТсЬг16]

[сЬг7]

[сЬг9]

[сЬг!9]

ГсНгЗ]

[сЬг8]

[сЬг!2]

[С11Г17]

[сЬг 6]

[сЬг 6]

т* - флуоресцентно-меченый тимидин в экспериментах для флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Из рисунка 9 видно, что ОДН4, содержащий в своей последовательности один мотив К1-ОДН, эффективнее связывается с клеточной мембраной и накапливается внутри клеток по сравнению с ОДНЮ (содержащим 4 повтора К1-ОДН) ОДН 11 И ОДН12 (содержащими по 2 повтора К1-идн]. Обнаружено, что связывание ОДН с клетками зависит от длины стебля шпильки и природы оснований в петле. ОДН8 и ОДН9 (содержащие К2-ОДН), ОДНИ и ОДН12 (содержащие К1-ОДН), имеющие в последовательностях по 2 повтора мотива АТОСАТ, практически одинаково связываются с мембраной НиУЕС Отсутствие разницы в связывании этих ОДН с клеточной мембраной по сравнению с К1-ОДН и К2-ОДН, вероятно связано с образованием вторичных структур длинными ОДН. Следует отметить, что увеличение повторов мотива ОАТССА (КЗ-ОДН) в последовательностях олигонуклеотидов (ОДН5-ОДН7, ОДН13, ОДН14) приводит к уменьшению

количества ОДН, связанного с клеточной мембраной, и ОДН, проникшего внутрь НиУЕС, по сравнению с ОДН2, в котором такой мотив встречается 1 раз. Обнаружено, что наличие двух мотивов ТАССТ (К5-ОДН) в последовательности ОДНЗ улучшает связывание ОДН с клеточной мембраной, однако взаимное расположение этих мотивов и наличие внутренних последовательностей играет важную роль в этом процессе. Действительно, ОДНИ и ОДН 14, имеющие в своем составе по два мотива ТАССТ, намного хуже связываются с клетками НиУЕС. В последовательностях ОДН13 и ОДН 14 эти мотивы сближены по сравнению с ОДНЗ и в их составе есть мотивы КЗ-ОДН, которые, как уже ранее было замечено, уменьшают связывание ОДН с эндотелиоцитами. Полученные данные демонстрируют, что связывание ОДН с поверхностью клеток зависит от комбинации идентифицированных ДНК мотивов в его последовательности.

лизировали в лизис-буфере с получением клеточной фракции. Количество ОДН во фракции определяли исходя из радиоактивности аликвот и объема фракций. Данные трех независимых экспериментов представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Были определены кажущиеся константы ассоциации для ОДН, обладающих наилучшими характеристиками связывания с клеточной поверхностью HUVEC: для ОДНЗ и ОДН4 составляют 1.7Х105М"', что больше по сравнению с ОДН2 (5.4±2.1хЮ4М"') и контрольным ОДН1(8.3±4.2х104М"1).

8.2. Исследование взаимодействия ОДН с клетками флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлюорометрии

При помощи проточной цитометрии было показано, что эффективность проникновения ОДН, модифицированного флуоресцеином (Flu), в клетки зависит от времени инкубации с клетками и от последовательности ОДН. Обнаружено, что наиболее эффективно в клетки проникают ОДН 1-Flu и ОДНЗ-Flu, что совпадает с данными, полученными при помощи радиоизотопного метода (рис. 9).

По данным флуоресцентной микроскопии было обнаружено (рис. 10), что ОДНЗ-Flu проникают в ядра клеток в течение первых 30 минут, а при увеличении времени инкубации ОДН с клетками до 2 ч ОДНЗ-Flu

5 U

1 Я 1 4 5 б 1 8 5 Ш 11 12 U 54 ОДН

Рисунок 9. Взаимодействие

[32Р]-меченых ОДН с клетками НиУЕС. Клетки инкубировали с 40 нМ раствором [32Р]-меченого ОДН в течение 1 ч в С02-инкубаторе, по окончанию инкубации удаляли культуральную среду, отмывали клетки средой и РВ8-ЭДТА, элюат с поверхности клеток получали обработкой трипсином (ТЭ), а клетки

накапливаются не только в ядре, но и в цитоплазме клеток в виде четко различимых флуоресцентных гранул. При инкубации клеток с 0.2 мкМ ОДН1-Р1и наблюдается накопление флуоресцентного сигнала в ядрах клеток с увеличением времени инкубации ОДН с клетками. Олигонуклеотид ОДН4-Р1и проникает преимущественно в цитоплазму клеток с образованием флуоресцентных гранул, интенсивность которых практически не зависит от времени инкубации ОДН с клетками.

30 мин инкубация Р1и-меченого ОДН с клетками Н11УЕС 120 мин инкубация с клетками Р1и-меченого ОДН с НиУЕС

3 Е К § И И ЕоКЙ

ОДНЗ-Пи | ш и

3 Е 4 Ж э

Рисунок 10. Локализация Р1и-меченых ОДН в эндотелиоцитах. Препараты клеток после инкубации с Р1и-меченым ОДН (зеленый канал), фиксировали 3.7% формальдегидом, затем окрашивали ОАР1 (ядра клеток, синий канал) и РЬа11о!с1т-ТМТС (актин, желтый канал). Белыми стрелками обозначен флуоресцентный сигнал от Р1и-меченого ОДН.

В работе было исследовано влияние потенциальных ингибиторов эндоцитоза и конкурентов транспорта ОДН на накопление ОДНЗ-Р1и и ОДН4-Р1и в эндотелиальных клетках при помощи флуоресцентной микроскопии. Обнаружено, что полианионы (гепарин, плазмидная ДНК и декстран сульфат) сильно ингибировали (как минимум в 9 раз) транспорт ОДН4-Р1и в клетки, по сравнению с ОДНЗ-Р1и. Рибосомная РНК, по сравнению с гепарином и плазмидной ДНК, слабо влияла на транспорт в НиУЕС и внутриклеточную локализацию обоих исследуемых ОДН (в 1.5 и 2.3 раза для ОДНЗ-Р1и и ОДН4-Р1и, соответственно).

Было обнаружено, что обработка клеток гипертоническим раствором сахарозы (ингибитор клатрин-зависимого и кавеолин-зависимого эндоцитоза) снижала в среднем в 3 раза эффективность ядерного накопления ОДНЗ-Р1и и накопления ОДН4-Р1и в цитоплазме клеток. Окадаевая кислота - известный ингибитор серин/треонин-протеинфосфатаз, практически не влияла на транспорт ОДНЗ-Р1и в клетки, но снижала эффективность транспорта ОДН4-Р1и в эндотелиальные клетки в 1.6 раз. Вортманин (ингибитор

эндоцитоза) не влиял на эффективность транспорта ОДНЗ-Р1и, но понижал более чем в 5 раз эффективность транспорта ОДН4-Р1ц в РШУЕС. Нистатин -полиеновый антибиотик, встраивающийся в участки плазматической мембраны богатые холестерином, преимущественно транспортируемых путем кавеолин-зависимого транспорта, сильно ингибировал транспорт обоих ОДН в клетки. В случае ОДН4-Р1и эффективность накопления олигонуклеотида в клетках уменьшалась в 8 раз, а для олигонуклеотида ОДНЗ-Р1и - в 2.4 раза.

Суммируя полученные результаты можно сделать заключение о том, что ОДНЗ-Р1и транспортируется в эндотелиальные клетки преимущественно по кавеолин-зависимому механизму эндоцитоза. Данные о том, что вортманин и окадаевая кислота практически не влияют на транспорт ОДНЗ-Р1и, позволяют предположить, что основная часть ОДНЗ-Р1и транспортируется в клетки рецепторами, преэкспонированными на клеточной поверхности, и их дополнительная рециркуляция не требуется. Олигонуклеотид ОДН4-Р1и так же проникает в клетки по эндоцитозному пути, однако, в отличие от ОДНЗ-Р1и, для транспорта ОДН4-Р1и необходима рециркуляция рецепторов, поскольку ингибиторы киназ и фосфатаз сильно ингибируют транспорт этого ОДН в клетки (в 5.7 и 1.6 раза, соответственно). С другой стороны, ингибирование транспорта обоих Р1и-меченых ОДН в клетки под действием полианионов связано, по-видимому, как с конкуренцией за связывание ОДН с рецепторами, так и с конкуренцией за энергозависимый транспорт, каким и является эндоцитоз.

Обнаружено, что К1-ОДН, входящий в состав ОДН4, ингибировал транспорт ОДНЗ-Р1и в ядра клеток как минимум в 2 раза, в то время как ОДН4 слабо влиял на эффективность накопления ОДНЗ-Р1и в клеточные ядра эндотелиоцитов. Данные об ингибировании ядерного транспорта под действием К1-ОДН позволяют предположить наличие специфических цитоплазматических белковых факторов, которые необходимы для транспорта ОДНЗ-Р1и в ядра клеток. Однако связывание ОДН с этими молекулами является необходимым, но не достаточным условием для его транспорта в ядра клеток. Поскольку ОДН4-Р1и, содержащий в своем составе К1-ОДН, не проникает в ядра клеток и практически не конкурирует с ОДНЗ-Р1ц.

Таким образом, полученные при помощи радиоизотопного анализа и флуоресцентной микроскопии данные свидетельствуют о специфичном взаимодействии коротких олигонуклеотидов, обнаруженных в результате реализации предложенного подхода для поиска спкДНК, и более протяженных олигонуклеотидов, содержащих последовательности этих коротких мотивов ДНК, с поверхностью первичных эндотелиоцитов человека.

выводы

1. Разработан новый метод выделения последовательностей ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с белками, экспонированными на поверхности клеток. Этот подход основан на связывании белковых компонент нуклеопротеиновых комплексов, элюируемых с поверхности клеток обработкой трипсином, с BrCN-сефарозой, с последующим выделением и идентификацией фрагментов ДНК из состава этих комплексов.

2. Разработан протокол лигирования фланкирующих олигонуклеотидов из состава адапторов к 5'- и З'-концам одноцепочечных ДНК, присутствующих в образцах в концентрации до 10 пМ. Показано, что конструкция адаптора влияет на эффективность и специфичность лигирования фланкирующих олигонуклеотидов из адаптора к концам одноцепочечных ДНК.

3. Впервые обнаружено, что на поверхности первичных эндотелиальных клеток человека присутствуют короткие фрагменты ДНК длиной до 34 нуклеотидов. Показано, что основная часть этих фрагментов ДНК находится в составе нуклеопротеиновых комплексов и "прочно" связана с клеточной поверхностью.

4. При помощи разработанной методологии выделены одноцепочечные ДНК длиной 6-14 нуклеотидов, связанные с поверхностью первичных эндотелиоцитов человека, и определены их последовательности. Показано, что мотивы ATGCAT, CTACGT, GATCCA встречаются в последовательностях одноцепочечных ДНК с частотой 24.1%, 21.7% и 10.8%, соответственно.

5. Методом радиоизотопного анализа обнаружено, что олигонуклеотиды, содержащие идентифицированные мотивы ДНК, "прочно" связываются с поверхностью эндотелиальных клеток, и процесс связывания ОДН с клеточной мембраной зависит от комбинации идентифицированных мотивов ДНК.

6. При помощи флуоресцентной микроскопии и ингибиторов/конкурентов транспорта продемонстрировано, что олигонуклеотиды транспортируются путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, причем за их связывание отвечают разные рецепторы, а идентифицированные мотивы ДНК определяют их внутриклеточную локализацию.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Мальшакова B.C., Лактионов П.П., Пышный Д.В., Власов В.б. Внутриклеточная локализация природных и модифицированных олигонуклеотидов в первичных эндотелиальных клетках человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2007. -Т. 143. -№ 2. -С. 163-165.

2. Mal'shakova V.S.. Pyshnyi D.V., Bondar A.A., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Isolation and sequencing of short cell-surface-bound DNA // Ann. N. Y. Acad. Sei. -2008.-V. 1137.-P. 47-51.

3. Лактионов П.П., Мальшакова B.C., Морозкин E.C., Пышный Д.В., Власов B.B. Способ анализа неизвестных последовательностей одноцепочечных нуклеиновых кислот. Патент РФ на изобретение № 2322508. Приоритет от 20.09.2006.

4. Мальшакова B.C., Черепанова A.B., Бушуев A.B., Лактионов П.П., Власов В.В. Способ селекции фрагментов ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности и обладающих иммуномодулирующей активностью. Патент РФ на изобретение № 2393230. Приоритет от 17.03.2009.

Подписано в печать 15.04.2014 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 120 экз. Заказ № 73.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07