Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белки ядерного матрикса, специфически связывающиеся с сателлитными ДНК

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лобов, Иван Борисович, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи

ЧАЩ

ЛОБОВ Иван Борисович

БЕЛКИ ЯДЕРНОГО МАТРИКСА, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С САТЕЛЛИТНЫМИ ДНК.

УДК 576.315.4; 576.316.32 специальность: 03.00.25 - клеточная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук О.И. Подгорная

Санкт-Петербург 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................................10

1. История открытия сателлитных ДНК....................................................................................10

2. Организация стДНК................................................................................................................................11

3. Эволюция стДНК........................................................................................................................................13

4. Роль стДНК в формировании центромера..........................................................................16

5. Примеры консервативности последовательностей стДНК..............................19

6. Белки, специфически связывающиеся с стДНК.....................................................20

7. Консервативность структуры стДНК.........!................................................................23

8. Эпигенетические механизмы формирования гетерохромашна и центромера..............................................................................................................................................................26

9. Эффект положения и эктопическая конъюгация........................................................29

10. Ядерный матрикс и скэффолд. Ассоциация стДНК с ядерным матриксом и скэффолдом..........................................................................................................................30

11. МАК/БАЯ-элементы. Белки, связывающиеся с МАИ/ЗАЯ-элементами..............................................................................................................................................................32

12. Вероятные функции стДНК..........................................................................................................38

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................................................................................................................40

1.Клонированные последовательности........................................................................................40

2. Выделение плазмидной ДНК, электрофорез ДНК и введение концевой метки в ДНК................................................................................................................................40

3. Выделение ядер и ядерного матрикса из клеток печени..........................................41

4. Экстракция белков ядерного матрикса и ионообменная хроматография белков на БЕАЕ- и СМ-сефарозе..............................................................42

5. Метод замедления в геле и выявление специфических антител при помощи метода замедления в геле..................................................................................................43

6. ДНК-футпринтинг......................................................................................................................................44

7. Получение антител к ДНК-белковым комплексам....................................................44

8. Окрашивание белков в полиакриламидном геле..........................................................45

9. Иммуноблотшнг........................................................................................................................................45

10. Аффинная очистка антител..............................................................................................................46

11. Саузвестерн-блотшнг............................................................................................................................46

12. Иммунофлуоресцентное окрашивание и гибридизация in situ....................47

13. Определение величины изгиба фрагментов ДНК....................................................48

14. Другие методы..............................................................................................................................................49

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ................................................................................................................50

1. Выявление ДНК-связывающей активности, специфичной к мажорному сателлиту мыши........................................................................................................................50

2. Идентификация белка, специфически связывающегося с мажорным сателлитом................................................................................................................................................................56

3. Факторы, обусловливающие специфичность связывания р 120 с ДНК мажорного сателлита..........................................................................................................................................60

4. Определение участков связывания р 120 в составе мажорного сателлита....................................................................................................................................................................66

5. Идентичность р 120 белку ядерного матрикса и скэффолда

SAF-A/SP120/hnRNP-U..............................................................................................................................68

6. Специфичность связывания белков ядерного матрикса с мажорным сателлитом и MAR гена иммуноглобулина к мыши........................72

7. Специфичность связывания белков ядерного матрикса с центромерными и прицентромерными стДНК мыши и человека....................74

8. Определение внутриклеточной локализации р 120......................................................80

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ......................................................................................................................85

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................................................99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................................101

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

стДНК - сателлитная ДНК п.н. - пар нуклеотидов т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

MAR (Matrix Associated Regions) - участки ДНК, связанные с ядерным матриксом

SAR (Scaffold Attachment Regions) - участки ДНК, связанные со скэффолдом

интерфазных и митотических хромосом

БСА - бычий сывороточный альбумин

EDTA - этилендиамин тетрауксусная кислота

SDS - додецилсульфат натрия

ВВЕДЕНИЕ

История изучения тандемно организованных повторяющихся последовательностей - сателлитных ДНК (стДНК) - насчитывает более тридцати лет, однако роль этих последовательностей до сих пор остается далека от понимания. СтДНК являются одним из наиболее изменчивых в эволюции классов последовательностей генома, но они также его непременный, свойственный всем эукариотам, компонент (Беридзе, 1982).

СтДНК преимущественно локализованы в области центромера и теломеров - основных структурных элементов, обеспечивающих стабильность хромосом. В течение последнего десятилетия значительный прогресс был достигнут в изучении организации, механизмах формирования и функционировани теломера позвоночных. Показано, что теломеры позвоночных сформированы высоко консервативной простой тандемно организованной последовательностью ДНК (Moyzis et al., 1988). Среди стДНК, локализованных в области центромера, консервативный элемент, необходимый и достаточный для формирования функционального центромера, отсутствует. Таким образом^вариабельность стДНК находится в очевидном противоречии с функциональной консервативностью центр о мер а, в формировании которого они принимают участие (Tyler-Smith et al., 1998). До последнего времени общепринятой была гипотеза, что в основе формирования центромера лежат сиквенс-специфические ДНК-белковые взаимодействия. Так, в составе центромерных стДНК различных видов млекопитающих был выявлен общий мотив 17 п.н., который является сайтом связывания белка центромера CENP-B (Masumoto et ak., 1989). Высокая консервативность CENP-B позволила предположить, что он играет ключевую роль в формировании центромера. Однако отсутствие CENP-B в некоторых функционирующих центромерах и, напротив, его присутствие в составе участков хромосом, не выполняющих

функций центромера, противоречат данной гипотезе (Earnshaw et al., 1989; Moens, Pearlman, 1990; Broccoli et al., 1990). Вероятно, не определенная последовательность в составе стДНК центромера, а особенности ее структуры или структуры хроматина определяют формирование центромера. Однако, роль такого рода механизмов формирования центромера еще не исследована.

Несмотря на разнообразие последовательностей стДНК, для участков хромосом, содержащих стДНК? характерна особая структура хроматина -гетерохроматин. Гетерохроматиновые участки хромосом способны ассоциировать между собой специфичным для каждого типа клеток образом, образуя так называемые хромоцентры (Hsu et al, 1971; Куличков, Жимулев, 1976; Прокофьева-Бельговская, 1986). Этот процесс, получивший название эктопической конъюгации, может играть ключевую роль в пространственной организации хромосом в интерфазном ядре (Comings, 1980; Manuelidis, Borden, 1988). Конститутивный гетерохроматин может непосредственно влиять на экспрессию генов не только при хромосомных перестройках, когда ген переносится близко к гетерохроматину, но и в результате эктопической конъюгации участка эухроматина, с гетерохроматином в интерфазном ядре. Показано, что инактивированные (не транскрибируемые) гены в интерфазном ядре ассоциированы с гетерохроматином, в то время, как те же гены, находящиеся в активном состояние в клетках других типов, расположены независимо по отношению к гетерохроматину (Brown et al., 1997). Взаимодействие гетерохроматиновых районов хромосом между собой и с определенными участками эухроматина может играть ключевую роль в пространственной и функциональной организации хромосом в интерфазном ядре.

Структурные особенности молекулы ДНК так же, как и определенные нуклеотидные последовательности в ее составе могут служить сигналом для специфического взаимодействия с белками. Было показано, что стДНК имеют общие структурные характеристики (Martinez-Balbas et al., 1990; Fitzgerald et al.,

1994) и что некоторые белки способны распознать особенности структуры стДНК (Saitoh et. al., 1989). Таким образом, наличие у стДНК общих консервативных свойств позволяет предположить существование белков, специфически связывающих различные негомологичные стДНК, что может обеспечивать консервативность.

Различия в характере ассоциации хроматина с ядерным матриксом и скэффолдом - основной скелетной структурой ядра и митотических хромосом -могут определять различия в структуре эухроматина и гетерохроматина (Saitoh, Laemmli, 1994). СтДНК имеют ряд общих характеристик с последовательностями, участвующими в прикреплении петельных доменов хроматина к ядерному матриксу/скэффолду - MAR- (Matrix Associated Regions) или SAR- (Scaffold Attachment Regions) элементами. Также есть свидетельства обогащения остаточной ДНК в составе ядерного матрикса и скэффолда повторяющимися последовательностями (Matsumoto, 1981; Яровая, Разин, 1983; Strissel et al., 1996). Вероятно, белки, специфически связывающиеся с MAR/SAR-элементами, также способны взаимодействовать с стДНК. Однако, к настоящему моменту о характере взаимодействии стДНК с ядерным матриксом известно немного.

ДНК в составе эухроматина гетерогенна по своей природе, и лишь некоторые участки в ее составе связаны с ядерным матриксом/скэффолдом, подразделяя хромосомы на топологически независимые петльные домены со средней длиной около 75 т.п.н. СтДНК в силу их тандемной организации, напротив, гораздо более однородны, что может обусловливать совершенно иной, чем для эухроматина, тип взаимодействия с ядерным матриксом/скэффолдом и, как следствие, особую структуру хроматина. Было показано, что стДНК в составе ядерного матрикса представлена весьма протяженными фрагментами длиной около 10 т. п. н. (Яровая, Разин, 1983). Картирование участков прикрепления альфоидного сателлита человека к скэффолду (SAR) также показало примерно в 25-50 раз большую частоту

встречаемости этих участков по сравнению со средней для генома величиной (Strissel et al., 1996).

В данной работе для поиска белков ядерного матрикса, специфичных к стДНК, был использован мажорный сателлит мыши. Он составляет 5-10% от всей геномной ДНК Mus Musculus, и для него характерен исключительно низкий уровень дивергенции между отдельными мономерами (Vissel, Choo, 1989). Таким образом, характеристики отдельно взятой (клонированной) последовательности свойственны блокам данной стДНК в целом. С другой стороны, мажорный сателлит по ряду характеристик, таких как: прицентромерная локализация, наличие в составе последовательности олиго(А) блоков и изогнутая конфигурация молекулы, - сходен с стДНК различных видов млекопитающих. Таким образом, мажорный сателлит представляет собой адекватный объект для поиска и изучения ДНК-связывающих белков, специфичных по отношению к стДНК, и основные характеристики ДНК-белкового взаимодействия, определенные для мажорного сателлита, могут быть аналогичными в случае других стДНК.

Анализ локализации стДНК в составе хромосом или интерфазного ядра позволил приблизиться к пониманию их роли в организации и функционировании генома. Но последовательности ДНК функционируют лишь в комплексе со специфическими белками, таким образом, роль стДНК может быть понята лишь в связи с изучением ДНК-белковых взаимодействий, отвечающих за формирование специфической структуры гетерохроматина.

Конкретные задачи настоящей работы состояли в следующем:

1. Разработать метод частичной солюбилизации ядерного матрикса в условиях, не приводящих к денатурации белков.

2. Идентифицировать белки ядерного матрикса, специфически связывающиеся с мажорным сателлитом мыши.

3. Сравнить специфичность связывания белков ядерного матрикса с различными сателлитными ДНК.

4. Определить характеристики сателлитных ДНК, обусловливающие их специфическое связывание с белками ядерного матрикса.

5. Изучить внутриядерную локализации одного из выявленных белков.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Некодирующие последовательности ДНК составляют более 90% генома млекопитающих (Manuelidis, 1990). К их числу относятся два класса повторяющихся последовательностей: длинные и короткие рассеянные по геному (диспергированные) повторы и тандемно организованные сателлитные ДНК (стДНК). Поскольку функция этих последовательностьй до сих пор неизвестна, их зачастую относят к "эгоистической" или "мусорной" ДНК. Однако в последние годы значительный прогресс в понимании роли стДНК был достигнут в результате изучения основных структурных элементов хромосом - теломеров и центромера, в формировании которых стДНК принимают непосредственное участие, а также в связи с изучением структурно-функциональной организации интерфазного ядра.

1. История открытия сателлитных ДНК

СтДНК были впервые обнаружены Китом в 1961 году (Kit, 1961, 1962) как сателлитная фракция геномной ДНК, выявляемая при равновесном центрифугировании в градиенте плотности раствора хлористого цезия благодаря отличию в ее плавучей плотности от остальной ядерной ДНК. Использование ДНК-итеркалирующих красителей и солей тяжелых металлов (ртути и серебра) позволило увеличить разрешающую способность данного метода и обнаружить стДНК у большинства видов эукариот (Беридзе, 1982). Исследования по кинетике реассоциации ДНК показали, что геном эукариот помимо уникальных также содержит быстро ренатурирующие повторяющиеся последовательности (Britten, Kohne, 1968), и стДНК представляет собой фракцию высокоповторяющихся последовательностей, которая может составлять до нескольких десятков процентов от всей ядерной ДНК. Блоки стДНК длиной до нескольких миллионов пар нуклеотидов сформированы относительно короткими последовательностями - от нескольких до нескольких сот пар нуклеотидов, - которые объединены по принципу "голова к хвосту" -

тандема. СтДНК преимущественно локализованы в области ценромерного и теломерного конститутивного гетерохроматина (Pardue, Gall, 1970; Yasmineh, Yunis, 1970), который выявляется в составе митотических хромосом при помощи метода дифференциального С-окрашивания красителем Гимзы - С-сегменты (Прокофьева-Бельговская, 1986). В отличие от рассеянных или диспергированных повторов, которые активно траскрибируются в клетке,

стДНК как правило траскрипционно инертны. Значительные различия в количествах различных стДНК в геноме, а также обнаружение тандемно организованных последовательностей в составе эухроматина - мини- и микросателлитов - расширило рамки термина "сателлитная ДНК". Этим термином теперь обозначают любые тандемно организованные повторяющиеся последовательности. Однако для "классических" стДНК наиболее характерны следующие три признака: 1) тадемная организация последовательности; 2) 103-10б и более копий последовательности на гаплоидный геном; 3) локализация в области конститутивного гетерохроматина.

2. Организация стДНК

СтДНК принято различать по длине повторяющейся единицы

(мономера): стДНК с простой последовательностью, имеющие мономер длиной

несколько нуклеотидов, например сателлит Ш человека с повторяющейся единицей GGAAT, и стДНК, не имеющие короткой повторяющейся единицы (длина мономера более ста нуклеотидов), - сложные стДНК. Ко второму классу относится наиболее досконально изученная стДНК - альфоидный сателлит (а-сателлит) человека, а также мажорный и минорный сателлиты мыши.

Отдельные мономеры в составе стДНК могут различаться по нуклеотидной последовательности заменами, делециями или инсерциями нескольких нуклеотидов. Несколько различных мономеров объединяются в блоки - повторы высшего порядка, которые в свою очередь повторяются в виде тандема. Так, альфоидное семейство стДНК человека представлено сильно

дивергировавшими последовательностями с общим уровнем гомологии между отдельными мономерами 60-80% (Willard, Waye, 1987). От 2 до 18 мономеров альфоидного сателлита длиной