Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли генов, индуцируемых в клеточном цикле млекопитающих, в процессах репликации ДНК

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли генов, индуцируемых в клеточном цикле млекопитающих, в процессах репликации ДНК"

Санкт-Петербургский химико-фармацевтическип институт

ЖУЧЕНКО Ольга Петровна

УЖ 577. 21: 576. 3

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ГЕНОВ, ИНДУЦИРУЕМЫХ В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, В ПРОЦЕССАХ РЕПЛИКАЦИИ ДНК

03. 00. 04 - биохимия

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1992

Работа выполнена в Отделе молекулярной и радиационнной биофизики Санкт-Петербургского

Института ядерной физики им. Б.П.Константинова.

Научные руководители: ведущий научный сотрудник доктор биологических наук Л. А. Носкин, старший научный сотрудник кандидат биологических наук Н. А. Тимченко.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Глебов 0. К., доктор медицинских наук Гайцхоки В. С. Ведущая организация: Институт онкологии им. проф. Н. Н. Петрова РАН, Санкт-Петербург.

Защита состоится мая 1992 г. в Ж час. на заседании специализированного Совета К 084. 63.01 при Санкт-Петербургском химико-фармацевтическом институте по адресу: 197022, Санкт-Петербург, ул. праФ. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат диссертации разослан 2 £ г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

> ' , х Н. В. Кириллова

Актуальность проблемы.

Изучение механизмов инициации репликации ДИК является важным, так как регуляция этого процесса определяет такие существенные проявления жизни в норме и патологии, как рост, эмбриогенез, регенерация, канцерогенез. Репликация ДНК хорошо изучена у прокариот, поскольку для них известен участок ДНК -• - origin, на котором осуществляется инициация синтеза ДНК.

Несмотря на огромное количество исследования, посвященных проблемам поиска orí репликации и белков - инициаторов репликации, для млекопитающих, пока не удалось однозначно доказать, что проклонированные потенциальные orí высших эукариот являются orl in vivo. Также мало известно о клеточных белковых Факторах, связывающихся с этими последовательностями. В литературе отсутствуют данные об инициации репликации ДНК млекопитающих и о механизмах, контролирующих этот процесс.

Одним из основных моментов в цепи событий, приводящих к репликации ДНК,является изменение экспрессии некоторых геноь (Fausto, N., 1984), По-видикому, некоторые из этих генов кодируют полипептиды, необходимые для инициации репликации ДНК. Для идентификации таких белков и их генов была использована клонотека кДНК з-периода регенерирующей печени крысы.

К настоящему времени имеется только одна работа, опубликованная В 1984 Г- CFrledaan J. et al. ,1984), в которой авторы, используя библиотеку кДНК регенерирующая печени крысы, идентифицировали три клона, усилэнно экспрессирующиеся в s-периоде, и показали, что они содержат фрагмента к ДНК фибриногена. Показана также усиленная экспрессия в регенерирующей печени нескольких онкогенов, актина и белков "острого ответа".

Таким образом, роль индуцибельных генов в процессах репликации ДНК млекопитающих в настоящее время мало изучена.

Цель работы.

Идентифицировать гены, усилэнно экспрессирующиеся в s-периоде регенерирующая печени, и исследовать возможность иг. участия в репликации ДНК. Провести поиск белков, специфически взаимодействующих с orl подобной последовательностью darc 1.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Идентифицированы пять новых клонов кДНК, усиленно экспрессирующихся в регенерирующей печени. Показано, что в составе комплексной формы ДНК-по'лимеразы а в s-периоде находятся два индуцибельных белка, один из которых обладает ДНК-по лимеразной активностью. Показано, что Фрагмент ДНК, входящий в состав а-полимеразного комплекса из покоящихся гепатоцитов и обладающий способностью к автономной репликации,. содержит участок связывания с Oct-l- белком. Экспрессия Oct-1-белка, как оказалось, резко возрастает непосредственно перед синтезом ДНК в регенерирующей печени крысы.

Структура работы.

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и- содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен репликации ДНК эукариот и связи этого процесса с экспрессией генов>, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы. Материал работы иллюстрирован I таблицей и 26 рисунками. Библиографический указатель включает - 196 источников.

Апробация работы.

Материалы диссертации опубликованы в двух печатных работах, представлены в тезисе« на Всесоюзном совещании "Геном человека 90". Материалы и методы.

В раооте использовали штамм E.coli Z8b, любезно предоставленный Е. Н. Зайц' чым! D качестве векторов для клонирования использовали плазмиды pBR322 и рис19.

Препараты мембранного <*-полимеразного комплекса были любезно предоставлены Т. П. Кравецкой. Иммунизацию кроликов препаратом комплекса и выделение антител проводили, как указано н работе Г'аяцхоки и соавт. , 1979 . Специфичность антител определяли методом иммуноблотинга CTombin и. et al., 198-1). Ннд^л^нив полисом проводили по методу, описанному в работе Palm iter п., 1Э74 , селекцию индивидуа льных мРНК-по методу Rlcciatdi et al., Т979 . Гибридизацию колоний, выделение

плазмидной ДНК, рестрикционный анализ, определение размеров мРНК, гибридизацию РНК и ДНК в пятнах проводили как указано в книге Маниатиса Т. и соавт., 1984 . Лизат ретикулоцитов кролика получали по методу, описанному в работе 1Paimiter r.d., 1973,', анализ ДНК-полимеразной активности проводили по методу Spanos a. et al.,1983-. Определение нуклеоткдной последовательности ПРОВОДИЛИ МеТОДОМ ХИМИЧеСКИХ модификаций Махав А.Н. and Gilbert W., 1977 .

Частичную очистку бежа, связывающего darci последовательность проводили следующим образом. Клетки регенерируюцеп печени крысы гомогенизировали в буфере А <20 мМ Трис-HCi, рН 7,6, ISO мМ Haci, I кМ ДТТ, 1мМ PMSF). Ядра осаждали и промывали тем *е буфером. Затем ядра ресуспендировали в буфере А, содержащем 10% сахарозу и замораживали в жидком азоте. Осадок ядер оттаивали и смешивали с равным объемом 3,4 Н Nací, приготовленном на буфере А. Экстракт центрифугировали при 15000 об. /мин., 2 часа, 4°С. Белки осаждали сульфатом аммония - 50 г/ 100 г и диализовали 16 часов против буфера а. После диализа пробы наносили на колонку с фосфоцеллюлозоя, уравновешенной буфером Б < 20 мМ Трис-HCI, рН 7,6, I кМ ДТТ, 0,5 мМ ЭДГА, I мМ PMSF, 10% глицерин). Несвязчыпмеся белки наносили затем на колонку с ДЭАЭ-сефацел, уравновешенную тем же буфером. Солки элюировали градиентом 0,05-0,5 М Nací, приготовленном на буфере Б. Каждую фракцию анализировали на наличие darci связывающей активности. Нужные Фракции объединяли и хранили при -20°С.

Для определения darc1 связывающей активности белковые образцы предиикубировали с I мкг ДНК лосося в буфере для связывания <20 мМ Трис, рН 7,6, 150 мМ KCI, I мМ ДТТ 0,5 мМ ЭДТА, 10% глицерин), при 4°С, 30 мин. Затем добавляли 1-2 нг р-darci вставки, инкубировали I час при 4°С и анализировали электрофорезом в 10% полиакриламидном геле. Для проведения футпринт анализа частично очищенный darci , связывающий белок, инкубировали с "Р-меченнм Фрагментом ДНК в услопиях, описанных выше, после чего в пробу добавлялась ДНКазз! до концентрации I мкг/мл. Реакция останавливалась экстракции« смесью фенол-хлороформ <1:1) и ДНК осаждали этанолом и анализировали в

• - 6 -

ОХ сиквенирующем геле. Компьютерный анализ производили на 1ВМ-РСАТ с использованием банка "вепеРго".

Результаты, и обсуждение. I. Идентификация генов, усиленно экопрессирующихся в з-периоде клеточного цикла в регенерирующей печени крысы. 1.1. Скрининг библиотеки кДНК. Для отбора интересующих нас генов была использована клонотека кДНК, полученная на ыРНК середины з-периода регенерирующей печени крысы. Клонотека кДНК представляла собой набор различных к ДНК, встроенных по РзЫ-саяту в векторную ДНК рви 322.

Для поиска усиленно экопрессирующихся в з-периоде мРНК, были выделены препарата полисомноя РНК из покоящихся гепатоцитов и из гепатоцитов, синтезирующих ДНК. Из этих препаратов полисомноя РНК хроматографией на о11доС<зт) целлюлозе получали полиСА>-содержащую мРНК, на матрице которой синтезировали "Р-кДНК в реакции обратной транскрипции.

350 клонов библиотеки анализировали дифференциальной гибридизацией с ыР-гДНК-со и "Р-кДНК-э- периодов клеточного цикла методом гибридизации колония. На рис. I показан фрагмент радиоавтографа нитроцеллюлозных фильтров.

А Б • • ........

...... • • •

• • V .

•.....V

Рис. I. Дифференциальный скрининг клонотеки.

СА)-Г1'/бридкзация с згР-кДНК-5, <Б>- с згР~кДНК-(Зо. Стрелками указаны клоны, гибридизуюииеся преимущественно с кДНК з-периода.

» • • • • •

»• • • • •

Как видно из рис. I, основное количество различных мРНК одинаково представлено в оо и з - периода«. Однако удалось обнаружить клоны, гибридизующиеся преимущественно с кДНК делящихся гепатоцигов. Всего было отобрано 5 клонов, мРНК которых более представлена в з-периоде по сравнению с оо. в дальнейшем такие клоны обозначаются как ряь.

Мы оценили содержание нуклеотидных последовательностей рчь в геноме крысы. Нуклеотидные последовательности ркь 2, 25, 35, 67, 79 представляют собой уникальные гены с копийностью от I до 10 на геном.

Для определения размеров мРНК риь, мРНК регенерирующей печени фракционировали электрофорезом в агарозном геле и после переноса на Фильтр гибридизовали с ник-транслиованными ДНК рпь МРНК. ряь 2 имеет протяженность приблизительно 1600 Нуклеотидов, мРНК рвь 25 - 3900 нуклвотидов, а мРНК рйь 35 -3200 нуклеотидов. Учитывая нетранслируемые зоны мРНК, можно оценить приблизительный размер соответствующих белков рнь. Так, мРНК рйь 2 кодирует белок, молекулярная масса которого не превышает 40 кДа. Два другие мРНК могут кодировать белки до 100 кДа.

I. 2. Характер экспрессии генов ркь в течение клеточного цикла регенерирующих гепатоцитов.

Для выяснения периода клеточного цикла, в котором необходимо участие белков рйь, была исследована экспрессия генов риь в различные периоды регенерации печени. С этой целью через различные интервалы времени <6. 12, 18, 24 часа> после частичной гепатэктомии была выделена мРНК и методом гибридизации в пятне определена концентрация мРНК риь. Результаты экспериментов представлены на рис 2.

Как видно из рисунка, характер экспрессии мРНК р"Ь зависит от времени регенерации и эта зависимость неодинакова для разных мРНК. Так, для рйь 2 увеличение содержания мРНК начинается с 13 часов и резко возрастает к 24 часам. В то же время, концентрация мРНК рк(. 79 плавно растет, начиная с б часон до 12 часов^ и затем концентрация этой мРНК практически но меняется до 24 часов. Содержание мРНК ркь 35 резко возрастает в

0 6 \г a 24 . 0 6 {Z iZ 24

pW-2 • e • o* © о « pRL.23

pRL3S . © ее* • « » fr pRU?

s i» pRLT?

pBR322 о e о * • о Ц

Рис. 2. Экспрессия мРНК pRL после частичной гепатэктомии. Вверху указаны интервалы времени <в часах> после гепатэктомии, через которые выделяли мРНК. pbr 322 и pRTf включены в качестве контроля.

первые б часов, а затем заметно снижается, хотя и остается достаточно высокой в пределах изученного времени. Следует отметить, что характер индукции мРНК pRL 35 напоминает динамику экспрессии с-вус онкогена, но перекрестная гибридизация ДНК отобранных pRL с плазмидой, содержащей кДНК с-вус онкогена, показала отсутствие гомологичных с-шус гену последовательностей среди изучаемых pRL.

Привлекает внимание тот факт,' что максимальное содержание мРНК pRi. 2, 67 и 79 наблюдается непосредственно перед и во время синтеза ДНК в регенерирующей печени. Такой характер экспрессии характерен для мРНК белков - участников процесса репликации ДНК, например, для а-полимеразы и циклина (Wahl A.F. et al, 1983). Это позволяет предположить, что мРНК pRL 2, 67, 79 ¡.»гут кодировать белки, участвующие в репликации ДНК.

Характер экспрессии pRL 35 свидетельствует о том, что со белковый продукт может играть роль при переходе из сц в G^, т. е. может относиться к группе белков " самого раннего ответа" (AlMvndral J.H. et al., 1988 ).

Совокупность приведенных выше физико-химических и функциональных данных может свидетельствовать в пользу следующего: идентифицированные гены, усиленно экспрессирующиеся на определенных стадиях клеточного цикла, кодирующее различные по молекулярному весу белковые продукты, могут быть необходимы для регуляции процессов биосинтеза ДНК. Исходя иу современных представления о мультиэнзимноя организации репликазы, можно предположить, что идентифицированные последовательности Кодируют регуляторные белкь или Ферменты, относящиеся к активному репликативному комплексу. Поэтому задачей дальнейших исследований явилось изучение возможной принадлежности пептидов, кодируемых генами pRt,, к "-полимеразному комплексу из гепатоцитов крысы.

2. Идентификация индуцибельных генов, белковые продукты которых входят в состав а-полимеразного комплекса.

Известно, что репликация ДНК осуществляется сложным мультиферментным комплексом CTubo R.A. and Berezney R.,1987). В лаборатории биосинтеза ДНК < ЛИЯФ АН СССР/ был выделен и охарактеризован комплекс а-полимеразы с другими белками репликации - в дальнейшем обозначенный как а-полимеразный комплекс СКлейнер Н. Е. и соавт. , 1988). Были проведены эксперименты по изучению взаимосвязи белков этого комплекса и белков, кодируемых генами pRL. С этой целью были получены антитела к «-полимеразному комплексу из наружной ядерной мембраны гепатоцитов крысы, выделенному в период синтеза ДНК. Антитела анализировали на специфичность связывания с белками методом "иммуноблотинга". Белки а-полимеразного комплекса из наружной ядерной мембраны гепатоцитов разделяли в 7,5% полиакриламидном геле по методу ьаевяН, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и инкубировали с антитолами к а-полимераэному комплексу, а затем с ""i -белком А.

На рис. 3, А представлены результаты этих экспериментов. Из рис. 3, А видно, что получонные антитела взаимодействуют с большинством белков «-полимеразного комплекса гепатоцитов крыс.

Охарактеризованные выше антитела были использованы дня выделения полисомных мРНК, кодирующих белки а-полиморааного

- 10 -

А а <7 Б

434 кД.

2

<1

Со 5

67«Д _1Щ 1

а

рВЯ322

45«Д_х-4 р^2-

Рис. 3. А- иммуноблотинг Оелков а-полимеразного комплекса. I- окраска кумасси 6-250, 2- радиоавтограф иммуноблотинга. Слева положение маркерных белков.

Б- Гибридизация ДНК клонов рЕ*Ь2, 27 и рВ1Я322 с"*Р-кДНК, синтезированной на мРНК а-полимеразного комплекса из покоящихся <о > и делящихся <зу гепатоцитов.

комплекса. Основным методом выделения специфических мРНК является метод " двойных антител " или непрямой иммунопреципитации. Суть метода состоит В том, что при трансляции мРНК на полирибосомах синтезируются белки, обладающие антигенными детерминантами. При взаимодействии с антите,.^ми такие полисомы образуют комплекс антиген-антитело и могут быть отделены от суммарных полисом с помощью вторых " антител. Используя этот метод, мы выделили полисомы, синтезирующие полипептиды «-полимеразного комплекса. Затем с помощью о11до<<ЗТ)-хрокатографии была получена Фракция мРНК.

На матрице полученной мРНК синтезировали "Р-кДНК, которую использовали для скрининга 500 клонов клонотеки генов, экспрессируюшихся в г-периоде, методом гибридизации колония. После первичного скрининга были отобраны семь клонов, давши* сигнал гибридизации. Среди этих клонов два клона р!?ь 2 и 6 содержат Фрагменты генов, усиленно экспрессирующихоя

з—периоде. Кроме рИЬ 2 и 67, еще 5 клонов рйЬ 27, 274, 277, 296 и 319 обнаружили свою принадлежность к генам белков а-полимеразного комплекса.

Сильные гибридизационные сигналы, которые давали вновь отобранные клоны ркь 27, 274, 277, 256 и 319, свидетельствовали о высокой концентрации гибридизующихся с ними кДНК, а. следовательно, и мРНК в регенерирующей печени. Можно было ожидать, что и среди приблизительно 500 проанализированных клонов библиотеки, эти мРНК могут быть представлены более, чем одной копией. Методом перекрестной гибридизации мы изучили возможность наличия гомологии среди этих клонов, и оказалось, что все эти плазмиды содержат Фрагменты ДНК, гомологичные одной и той же мРНК.

Этот вывод подтверждается двумя другими независимыми методами. Для плазмид рКЬ 27, 274, 277, 296 и 319 опредилили размер комплементарных им мРНК. мРНК Фракционировали электрофорезом в денатурирующих условиях, переносили на фильтр и гибридизовали с мечеными плазмидами. Оказалось, что все эти плазмиды гибридизуются с мРНК одинакового размера. Размер данной мРНК составляет приблизительно 5000 п. н. Также был проведен рестриктазный анализ хромосомных генов, гомологичных изучаемым плазмидам. Хромосомную ДНК крысы обрабатывали рестриктазами е.соеп и рзьг, Фракционировали электрофорезом, переносили на фильтр и гибридизовали с ник - транслирован ными плазмидами. Используемое рестриктазы образуют по одному Фрагменту хромосомной ДНК, гомологичному изучаемой последовательности. Размеры Фрагментов составляют 4,7 и 5,4 тыс. п. н. По-видимому, хромосомный ген, гомологичный ДНК рки?7, представлен в геноме одной - двумя копиями. Таким образом, суммируя приведенные выше данные, мы можем заключить, что рекомбинантные плазмиды ряс- 27, 274, 277, 296 и 319 содержат вставки кДНК, гомологичные одной и той же мРНК. Эта мРНК имеет размер порядка 5 тыс. п. н. и кодирует полипептид а- по лике разно го комплекса. По данным гибридизации колоний,ее концентрация в полирибосомальной Фракции мРНК из з-периода составляет примерно IX.

- 12 -

3. Сравнение экспрессии рнь 2 и 27 в покоящихся и

регенерирующих гепатоцитах. Среди обнаруженных клонов, кодирующих белки «-полиме-разного комплекса, наибольший интерес с точки зрения индукции экспрессии представляет мРНК, гомологичная ДНК рки 2. Была предпринята попытка в одном эксперименте изучить усиление экспрессии мРНК ркь 2 и содержание ее белкового продукта в «-полимеразном комплексе. Для этого методом непрямой иммунопреципитации из покоящихся Са^ и делящихся <з> гепатоцитов выделили мРНК. На этих двух препаратах мРНК, в реакции обратной транскрипции, синтезировали меченые зонды кДНК. Клоны ряь 2, 27 и рви 322 помещали на Фильтр и гибридизовали с а2Р-кДНК-б0 и а2Р-кДНК-3. На рис. 3, Б показаны результаты гибридизации. Концентрация мРНК, гомологичной рйЬ 27, при переходе клеток к пролиферации не меняется, а уровень мРНК рки. 2 резко возрастает, что подтверждает данные, полученные на суммарной полисомной РНК. Таким образом, полипептид, кодируемый мРНК ркь 2, входит в состав а-полимеразного комплекса и синтез этого полипептида резко возрастает непосредственно перед я -периодом- Кроме того, существуют , белки репликации, имеющие стабильный уровень экспрессии во время клеточного цикла < в нашем случае это белок, кодируемый мРНК ркь 27>.

4. Определение ДНК-полиморазной активности белков,

кодируемых генами рЕИ. В представленных выше экспериментах выявлены три клона, кодирующие белки а-полимеразкого комплекса ркь 2, 27 и 67. В следующих экспериментах мы попытались определить, обладают ли продукты трансляции соответствующих мРНК ДНК-полимеразной активностью? С этой целью селективной гибридизацией выделили индивидуальные мРНК, гомологичные вставкам рКЬ, и транслировали их в лизаге ретикулоцитов кролика. Продукты трансляции анализировали и "активном" геле. Результаты этого эксперимента представлены на рис. Л. '

Выяснилось, что мРНК, гомологичная вставке рйЬ 67, кодирует полипептид, обладающий ДНК-полимеразной активностью

а Я

_ 154 иДа

„_6?кДа

Рйс. 4. Электрофоретический анализ продукта трансляции мРНК Р!'Ь 67 (а) и а-полимвразного комплекса <б> в активном геле. Стрелками указано положение мономера (67> и димора <Т34> Ьычьего сывороточного альбумина.

< до рожка а >. Молекулярная масса этого полипептида приблизительно равна 140 кДа. По-видимому, этот полипептид является Д11К-полимеразой-а, поскольку в параллельной дорожке б, где был нанесен а-полимераэнип комплекс, аналогичная зона белковой дорожки проявляет ту ж» активность. Однако, совпадение молекулярных масс каталитически активных полипептидов из а-полимераз-ного комплекса и синтезированного на мРНК риь 67 но является строгим доказательством идентичности этих белков. Так, Д11К-лолимораза <5 имоот близкий к 140 кДа размер и также может Находиться в репликагивном комплокое. Таким образом, можно только утверждать, что кодируемый ркь 67 полипептид обладает ДИК-полимераэной активностью и входит в состав <*-полимеразного комплекса в з периода.

5. Нуклоотиднно последовательности кДПК рВЬ 2, 27 и 67.

Используемый в нашей работа подход к идентификации индуцибельных гонов включает в себя как обязательный момент сравнение нуклеотидннх последовательностей обнаруженных генов с

банком нуклеотидных последовательностей. Размер вставки кДНХ для prl 67 составлял примерно 370 п.н. , а для prl 2 и 27 -около 150 п. н. Вставки кДНК метили по 3'-концу и определяли нуклеотидные последовательйости методом химического секвенирования (махао a.m. and Gilbert и.,1977). Нуклеотидные последовательности для prl 2, 27 и 67 приведены на рис. 5.

pRL 2. CGGAGGACAA CACCAGGCCC CAAGGGCCGG CGGGAACATC GGTCAACCTC

CGCTAACTCT GCTTCTTCCA ACGGTACATC TCGTTGTCGG TCTCGAAGTG

CTGCCGCCCT GGACCCGCTC CTGGAGG

pRL 27. TAGCCAGTGC CACCCCCAGA CGACGGCTGC CATCAATTTC CGGCTTACCA

AATAAACGAA TCTGCAAATC TACGCCTACG GCTTCTGCAC ATTATCAAAC

GTGACATTCT GACTGGTCGG TTGTGGCGAG TTACGGCGAG CG

pRL 67. TGTGCTTCAG AAGAGAGGGG ACTTGGAGGT GAAAGGGGGA GTGGGAGGGG

GGTTTGAGGA CCTAGCTGAA AGATTTTAGG CTGAAAGAAC TTCCTTGATT

CAAAGACATA TGTCAGTAGA CCCAACAATG AGAATGAATG TGAGGGCCAT

GAAAACTTGT GGGAATCAGT CTCAAGACAG AAACAGAGAA AGAAAGAAAA

GTGGATAGGA CTCAGATTGG GAACCTGGGT AGACGGAGTG GCAAGGGAAG

AAGAAGGGAT CTTGGGTTAC CACAGTTTGA GAATATATCT GGTGTTCGGC

CATATCCCCA GAAGCCACAG AGATGTTGCT TACACGTCTC TAGATTGGTC

CTGAGGTCCT CCTGGGAAA

Рис. 5. Нуклеотидные последовательности pRL 2, 27, 67.

Последовательности pRL 2, 27, 67 представлены в геноме одной или несколькими копиями. Мы провели скриннинг банка данных кДНК <~сеыерно":> на присутствие этих или высоко гомологичных последовательностей. Компьютерный анализ показал, что в составе банка нет последовательностей гомологичных ркь 2, 27, 67. При снижении поиска гомологии до 60% также не удалось обнаружить в этом банке гомологичных последовательностей.

Поскольку клонированные кДНК являются копиями мРНК, мы

провели поиск открытой рамки считывания для н у клеотидных последовательностей pRL 2, 27, 67. Последовательность pSL 2 имеет открытую рамку считывания, последовательность pRL 27 во всех трех вариантах содержит стоп-кодоны, это свидетельствует о том, что клонированный участок мРНК представляет собой некодируему» зону, вероятнее всего 3'-концевую. Обнаруженные в библиотека гены pRL представлены относительно короткими Фрагментами кДНК. Из них последовательность pRL 67 наиболее протяженная, в этой последовательности была обнаружена открытая рамка считывания, оканчивавшаяся стоп-кодоном. По-видимому, Фрагмент кДНК pRL 67 сооть гствует участку мРНК, где 3'-кодируемая зона переходит в 3'- нетранслируемую область мРНК. В целом, результаты компьютерного анализа свидетельствуют о том, что нами идентифицированы гены, нуклеотидные последовательности которых ранее не были известны.

Поскольку ключевым моментом, запускающим весь процесс синтеза ДНК, является инициация репликации, далее были предприняты исследования по идентификации экспрессирующихся белков, участвующих в регуляции процессов инициации репликации ДНК.

б.Поиск белков, специфически взаимодействующих с orí-подобной ДНК.

6.1. Нуклеотидная последовательность Фрагмента ДНК darc i.

Инициация репликации ДНК млекопитающих начинается с определенных поледовательностей - orí. в настоящее время для млекопитающих не обнаружено нуклеотидных последовательностей, для которых было бы строго доказано, что они являются orí репликации в хромосомной ДНК. Тем не менее, существует ряд клонированных ДНК, обладающих основным свойством ort -поддерживать репликацию векторной ДНК в клетках млекопитающих. Такие последовательности ДНК называют ars элементами. Очевидно, что молекулярные события, протекающие на этих участках ДНК, могут служить хорошей моделью для изучения инициации репликации Хромосомной ДНК. Многочисленные данные, полученные на вирусных системах, позволяют считать, что белок - ДНК взаимодействие в Области orí репликации является важным моментом инициации

репликации. Таким образом, идентификация и изучение белков, специфически взаимодействующих с ARS элементами, является необходимым этапом в изучении инициации репликации ДНК.

Ранее была клонирована последовательность ДН1С крысы -- рокi 32, которую выделили из а-полимеразного комплекса. Клонированный фрагмент ДНК обеспечивал автономную репликацию ллазмиды в клетках млекопитающих <Тимченко H.A. и савт., 1990>. Эта последовательность была использована для поиска белков, специфически взаимодействующих с ог1-подобноя ДНК.

Плаэмида pori 32 содержала вставку ДНК - 540 п. н., которая .имеет сайт для рестриктаэы Шп<5 III, образующиеся Фрагменты ДНК составляют 200 и 340 п. н. Эти Фрагменты были субклонированы в вектор pWR 34. Полученные рекомбинантные ДНК трансфецировали в клетки V 79 и изучали их автономную репликацию с помощью BudR замещения. Плаэмида, содержащая Фрагмент ДНК,в 340 п. н. сохранила способность к автономной репликации в клетках млекопитающих. Эта плаэмида была обозначена -pDARCl.

С помощью метода Максама-Гилберта была определена нуклеотидная последовательность Фрагмента cdauc1), которая представлена на рис. 6. Эта последовательность в дальнейшем использовалась для поиска специфически связывающихся с ней белков.

darc 1.

tgtgctcgcc atgatcgcgt agtcagtagt ggctccaagt agcgaagcga

gcaggactgo gcggcggcca aagcggtccg cacagtcctc cgagaacggg

tgcgcataga aattcgcatc aacgcatata gcgctagcag gcacgccagt

ccgotttcgg gtttaatcca ттаасасттт aaactcagag ctatttctta

ctgagtgacc аттссссаса atatgtcaga ctgatagtgt tacttttagg

attaaataga тттаалтста ttaaagatac cttatg" 'at tttaagagat

сасассасас ttagtggctt gacagagta.

Рис. 6. Нуклеотидлая последовательность dakc 1.

- 17 -

6. 2. Анализ связывания белков с оляс1 методом "торможения" в геле.

Для идентификации возможных ДНК-белковых взаимодействий в первых экспериментах был использован метод "торможения" в геле. С этой целью вставку ДНК 340 п. н. метили по 3'-концу, инкубировали с различными белковыми препаратами и разделяли в 4Х. полиакриламидном геле свободную ДНК и комплекс ДНК-белок с последующей радиоавтограФиэй. В суммарном ядерном экстракте обнаружить 0анс1-связывак>1дую активность не удалось. Сложность эксперимента заключалась в том, что в суммарном ядерном экстракте присутствует много ДНК-связываюших белков, которые создают большой Фон неспецифического взаимодействия. Поэтому ядерные белки Фракционировали на хроматиновую фракцию, высокосолевой экстракт и ядерный матрикс, и каждую Фракцию анализировали м<. годом торможения в геле. Оказалось, что в хроматиновой Фракции присутствует белок, связывающий бАКС! последовательность. Связывание данного белка с оакс1 является специфическим, поскольку конкурентное взаимодействие с немеченым олкс1 фрагментом приводит к вытеснению р-оле?с1 из комплекса ДНК-белок. Количество "р оаяс1 в комплексе с белком составляет малую долю от свободного Фрагмента. Вероятно, количество 0АЛС1, связывающего белка в хроматиновой фракции Невелико, поэтому в дальнейшем этот белок был частично очищен с помощью хроматографии на колонках с ДЭАЭ - сефацелем и ДНК-целлюлозой. Фракции, элюированные с колонки, анализировали методом торможения в геле на наличие оайс 1 связывающей активности.

6. 3. Футпринт анализ взаимодействия ОАКС1 и ядерного белка.

С целью определения нуклеотидов, участвующих в связывании с ядерным белком, был проведен Футпринт анализ. Фрагмент-340 п. н. метили по 3'-концу, инкубировали с частично очищенным ядерным белком, комплекс отделяли электрофорезом, элюировали и обрабатывали 2 мин. ДНКаэой I. Параллельно поводили обработку свободного э'гР-рОАцс1 фрагмента. Фрагмент ДНК осаждали этанолом и разделяли в сиквснируюыом геле. Результаты Футпринт анализа предета»лены на рис. 7.

Рис. 7. Футпринт анализ взаимодействия фрагмента олйС1 с ядерным белком. Первые пять дорожек - сиквенс ВАИС!., + и -присутствие или отсутствие ядерного белка в пробе, при обработке ДНКазой I. Справа указаны нуклеотиды, взаимодействующ из с бе жом.

Как видно из рисунка, ядерный белок взаимодействует с П9Следовательностью атсттаттттаасасат. Наблюдается также частичная протекция нуклеотидов и в других участках последовательности рГ>аис1. Участок связывания сравнили с известными последовательностями ДНК млекопитающих. Как показал компьютерный анализ, в банке данных за 1988 год аналогичная последовательность не представлена. Участок связывэяия с ядерным белком был также изучен относительно содержания известных сигнальных последовательностей для взаимодействия с белками. Выяснилось, что участок связывания содержит октамерный мотив - потенциальный сайт связывания с ос1 <1олками.

Классический вариант октамера, обнаруженного в orí репликации аденовирусов - это последовательность atgataat. Участок связывания pDARCl содержит мотив, отличающийся двумя заменами А на Т. С точки зрения необходимости расплавления этого участка ДНК в orí репликации такие замены несущественны. Следует отметить, что участок связывания с Oct - белками не является строгим. Известны примеры, когда Oct - белки связываются с сильно измененной кононической последовательностью.

6. 4. Взаимодействие darc1 связывающего белка с синтетическим олигонуклеотидом, содержащим природный октамер. В настоящее время известен ряд oct-связывающих белков: Oct-i, oct 2в, oct 2А, oct 3-7. Белок Oct-i присутствует во всех клотках, белки oct 2В и 2А синтезируются только в лимфоцитах, a oct 3-7 - обнаружены при эмбриональном развитии. Основным методом, позволяющим отличить связывающие октамер белки друг от друга, является определение электрофоретической подвижности комплекса oct-ДНК, где ДНК - синтетический олигонуклеотид размером 20-30 п. .ч. , содержащий октамер. Относительная подвижность комплекса ДНК-белок в стандартных условиях - r£ - 0,3-0,35 CVecryzer с.р. et al.,1990). Для дальнейшего выяснения природы darci связывающего белка был использован синтетический олигонуклеотид HS3oct <рис. 8) и его комплементарная нить. Данный олигонуклеотид предоставлен Томилиным Н. В. HS3oct является частью сателлитной ДНК человека и также проявляет ars активность в клетках млекопитающих. Этот олигонуклеотид содерж!<гг октамер atgataat, который полностью идентичен октамеру, расположенному в or i аденовирусов.

5' tccatccatttcaatttcatgataattccattcgtttcaattcga 3' Рис. 8. Нуклеотидная последовательность HSoct3. Октамер подчеркнут. На рис. 9, А представлен анализ Фракция, элюированных с ДЭАЭ- сефацел,- на октамер связывающую активность. Фракции, которые содержат Darc x связывающий белок, содержат также и октамер связывающую активность.

МНС —МИ . с • I I I I I I I 1 >

MW

-и,-

0.3

нз> ост

1 234 б

Рис. 9. Анализ связывания синтетического олигонуклеотида HSoct3

с darc 1 связывающим белком. А- Фракции ядерного экстракта, элшрованные с колонки ДЭАЭ-сеФацел, анализировали методом торможения в геле. Вверху - С darc 1, ВНИЗУ - С HSoct3. Б- определение rf darc i связывающего бежа. С- комплекс ДНК-белок, F- свободный фрагмент ДНК. 1-дорожка - свободный Фрагмент, 2- +белок, 3- +белок 1 5 мкг pwr 34, 4- +белок + I мкг darc 1, 5- + белок + 5 мкг darc 1.

Затем было изучено взаимодействие HS30ct с darci связывающим белком. Результаты представлены на рис. 9, Б. Относительная подвижность комплекса ДНК-белок равна 0,3, - это указывает на то, что связывающий белок, действительно является Oct-i белком. Конкурентное взаимодействие с избытком немеченого darc1 фрагмента <340 п.н.> приводит к исчезновению комплекса, имеющего подвижность R£ - 0,3. Таким образом, конкурентное взаимодействие свидетеле /гвует о том, что Oct-1 белок связывается как с олиг )уклеотидом HS3oct, так и с darci последовательностью, т. е. эти последовательности имеют ок -тамерные высокоаффинные сайты связывания. В целом, проведенные эксперименты показали, что darc 1 связывающий белок является -

oct-i белком.

7. Экспрессия мРНК, кодирующей 0сЬ-1 белок, в делящихся гепатоцитах. Результаты диссертационной работы показывают, что

°r 1-подобная последовательность ДНК содержит высокоаффинный сайт для связывания с Oct-l белком. Это обстоятельство позволяет предположить участие Oct-i бежа в инициации репликации ДНК млекопитающих. Если это так, то уровень этого белка в период синтеза ДНК или перед репликацией должен быть достаточно высок. Мы изучили экспрессию мРНК, кодирующей Oct-l белок, в делящихся гепатоци. х. В качестве зонда использовали • плазмиду pes octl, - содержащую 2,4 кЬ кДНК octl С stürm £?.?.. and Herr w., 1988). Плазмида предоставлена доктором Herr. Суммарную РНК, выделенную из регенерирующей печени крысы, фракционировали электрофорезом в 1,4% агарозном геле с 6% формальдегидом, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с 2Р-рВЗ octl. Результаты показаны на рис. 10.

Рис. 10. Экспрессия мРНК, кодирующей Ос^-1 белок в делящихся гепатоцитах. Врерху указаны интерпалы времени (в часах) после гепатэктомии,через которые выделялась мРНК. Стрелка указывает положение мРНК Ос^1 белка.

О 6 14 24

28s—

18s—

- 22 -

мРНК Oct-i в покоящихся гепатоцитах не обнаруживается. Через 6 часов после операции гепатэктомии уровень мРНК Oct-l резко возрастает, к 14 часам снижается, а через 22 часа данная мРНК не обнаруживается. Таким образом, экспрессия мРНК Oct-l индуцируется непосредственно перед s-периодом. Установленный характер экспрессии мРНК Oct-l подтверждает предположение о возможном участии Oct-l белка в инициации репликации ДНК млекопитающих.

Участие факторов транскрипции в репликации ДНК млекопитающих в настоящее время широко обсуждается, однако, экспериментальных данных, подтверждающих данное предположение, в литературе пока нет. Результаты диссертационной работы прямо не доказывают участие oct-l белка в репликации ДНК, но дают основания для дальнейшего изучения молекулярных взаимодействия Oct-l бежа с ori-подобными структурами ДНК.

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что при переходе покоящихся гепатоцитов к пролиферации наблюдается усиление экспрессии 1,4% мРНК. Обнаруженные индуцйбельные мРНК представлены в геноме одной или нескол,кими копиями.

2. Среди индуцибельных мРНК обнаружены мРНК, кодирующие белки а-полимеразного комплекса, выделенного из гепатоцитов, синтезирующих ДНК.

3. Компьютерный анализ показал, что индуцибельные гены pRL 2 и 67, входящие в состав о-полиморазного комплекса S периода, в банке данных отсутствуют.

4. Установлена нуклеотидная последовательность Фрагмента ДНК - darci, выделенного из «-полиморазного комплекса и обладающего способностью автономно реплицироваться в клотках млекопитающих. В банке данных гомологичных последовательностей не обнаружено.

5. Обнаружен ядерный белок, специфически связывающий DARC1 последовательность. По данным Футпринт анализа и измерения подвижности комплекса белок-DARCi идантич.тированный белок является Oct-l белком. Oct -1 белок инициирует репликацию

ДНК аденовирусов.

6. Установлено, что в регенерирующей печени крысы, уровень мРНК, кодирующей 0сЬ-1, белок резко возрастает в пред-репликативный период. Это подтверждает предположение о возможном участии ОсЪ-Х белка в инициации репликации ДНК млекопитающих.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Тимченко Н. А., Тимченко Л. Т., Белобров С. В., Еученко 0. П., Крутиков В. М. Идентификация и характеристика мРНК, содержание которых повыше1./- в период репликации ДНК.//' Молекулярная биология. - 1987. - т. 21. - вып. 3. - с. 640-546.

2. Жученко 0. П., Тимченко Л. Т., Тимченко Н. А. Повышенная экспрессия генов, кодирующих белки репликации, в период синтеза ДНК. // Молекулярная биология. - 1990. - т. 24. -вып. 3. -о. 824-831.

3. Тимченко Н. А., Жученко 0. П., Игучи-Арига С., Арига X., Божков В., Томилин Н. 0 присутствии высокоаффинных сайтов для транскрипционного ось-1, обладающих Апг-активностью, ' в гетерохроматине человека и в ДНК крысы, ассоциированной с репликативными комплексами. // Первая Всесоюзная конференция "Геном человека". - Переславль-Залесский, 1990.- с. 139-140.

РТП ПИЯФ,зак.281,тир.100,уч.-изд.л.1,0^09/04-1992г. Еесплатно