Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение компонентов комплексов белка SUUR Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Определение компонентов комплексов белка SUUR Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

ПОСУХ Ольга Витальевна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕКСОВ БЕЛКА 81Ш 0П080РНИА МЕ1Л/\OGASTER

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 МАЙ 2013

005058654

Новосибирск 2013

005058654

Официальные оппоненты:

Работа выполнена в лаборатории молекулярной иитогенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск и в лаборатории геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Научные руководители: Жимулёв ИгорьФедорооич

академик РАН, доктор биологических наук профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Омельянчук Леонид Владимирович

доктор биологических наук, заведующий лабораторией генетики клеточного цикла, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Шевченко Александр Игоревич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории элигенетики развития, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», г. Томск

Защита диссертации состоится «¿2» 2013 г. на утреннем заседании

диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, по защите на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, д. 10, тел. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан « /2 » /)/)_/> (?/} д 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

Ведущее учреждение:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Реализация эпигенетической программы в развитии эукариотических организмов является на данный момент одной из наиболее изучаемых проблем современной биологии. То или иное состояние отдельных участков генома (эухроматиновое или гетерохроматиновое) эпигенетически наследуется в ряду клеточных поколений. Было показано, что эухроматановые и гетерохроматиновые районы реплицируются неодновременно (Schubeler et al., 2002; MacAJpmc et al., 2004). Параметры пространственно-временной картины репликации генома четко контролируются в клеточном цикле (Berezney et al., 2000; Blow and Dutta, 2005; DePamphilis et al., 2006; Groth et al., 2007; Gilbert et al., 2010). Однако многие аспекты регуляции такой дифференцированной программы остаются невыясненными.

У Drosophila melanogaster временная картина репликации в политенных тканях имеет свои характерные особенности: в силу укороченного общего времени S-фазы, поздно реплицирующиеся гетерохроматиновые районы политенных хромосом слюнных желез не успевают завершить свою репликацию до конца S-фазы и последовательности ДНК в них остаются недопредставленными (Gall et al., 1971; Smith and Orr-Weaver, 1991; Lilly and Spradling, 1996). У D. melanogaster фактором, влияющим на регуляцию времени репликации таких районов в политенных хромосомах слюнных желез личинок, является белок SUUR (Suppressor of Underreplicatiori). Он способен связываться с районами прицентромерного и интеркалярного (расположенного в плечах хромосом) гетерохроматина (Makunin et al, 2002, Zhimulev et al., 2003). В мутации SuUR эти районы хромосом заканчивают репликацию раньше в S-фазе, вследствие чего, недореплицированные в норме районы становятся полностью политенизированными (Belyaeva et al., 1998). В экспериментах на культуре клеток дрозофилы для белка SUUR было показано, что его геномные мишени соответствуют транскрипционно неактивным типам хроматина (Pindyurin et al, 2007; Filion et al., 2010). Кроме того, была продемонстрирована способность SUUR замедлять скорость движения вилок репликации при амплификации хорионовых генов в фолликулярных клетках яичников (Sher et al., 2012). Однако остается открытым вопрос - как именно SUUR осуществляет свою функцию? Связано ли это с прямым воздействием на машину репликации или же основное влияние SUUR оказывает на структуру хроматина, что, в свою очередь, уже регулирует скорость репликационной вилки?

Чтобы исследовать механизм работы SUUR, необходима информация о его взаимодействиях с другими белками. К настоящему моменту, единственным белком, для которого было показано физическое взаимодействие с SUUR, является гетерохроматиновый белок НР1 (Pindyurin et al, 2008). Однако, этой информации недостаточно, чтобы объяснить эффект белка SUUR в разных тканях.

В данной работе, чтобы приблизиться к пониманию механизмов действия SUUR, был осуществлен поиск новых белков, с которыми SUUR может взаимодействовать. Была создана система для выделения и очистки белковых комплексов, в которые входит SUUR, на основе метода двойной аффинной очистки (ТАР - tandem affinity purification). Эта система была использована для выделения комплексов SUUR-TAP из белковых экстрактов, полученных из линии культуры клеток S2 дрозофилы, и их состав был проанализирован при помощи масс-спеетрометрических методов. После обработки данных масс-спектрометрии был получен список вероятных белков-партнеров SUUR и проведены эксперименты по исследованию функциональности этих взаимодействий генетическими методами. Кроме того, система экспрессии химерного белка SUUR-TAP была использована для проверки гипотезы взаимодействия SUUR и репликационной машины методом коиммунопреципитации белков из эмбриональных экстрактов дрозофилы. Результаты данной работы указывают на возможное участие SUUR в процессе ремоделинга хроматина во время репликации. Дальнейшая биохимическая проверка обнаруженных взаимодействий позволит построить конкретную модель механизма работы SUUR.

Основная цель данной работы - прояснить роль белка SUUR в процессе репликации у D. meîanogaster через выявление белков, способных взаимодействовать с SUUR, методом двойной аффинной очистки белковых комплексов.

Задачи данного исследования:

1. Создать систему экспрессии функционального химерного белка SUUR-TAP в организме и в культуре клеток дрозофилы.

2. Проверить взаимодействие SUUR с PCNA, как с основной струиурной компонентой репликационной машины, в эмбрионах дрозофилы.

3. Выделить комплексы белка SUUR-TAP из экстрактов культуры клеток S2 дрозофилы при помощи метода двойной аффинной очистки белковых комплексов. Идентифицировать компоненты комплекса при помощи масс-спектрометрии.

4. Проверить обнаруженные потенциальные взаимодействия SUUR генетическими методами.

Научная новизна работы. Создана система для выделения комплексов белка SUUR дрозофилы при помощи метода двойной аффинной очистки. Выявлены ранее не описанные взаимодействия SUUR: установлено физическое взаимодействие SUUR и PCNA (структурной основой репликационной машины) в эмбрионах дрозофилы; определены потенциальные компоненты комплексов SUUR-TAP в культуре клеток дрозофилы S2, среди которых оказались белки, участвующие в процессах регуляции клеточного цикла, репликации, репарации двуцепочечных разрывов ДНК и ремоделинга хроматина. Первичный анализ обнаруженных взаимодействий выявил генетические взаимодействия StiUR с генами Ssrpl, CG12018

(ss Dpol 5) и hd, что позволяет предположить участие SUUR в ремоделинге хроматина во время репликации.

Научно-практическая ценность работы. Результаты данного исследования вносят вклад в фундаментальные знания о процессе репликации у дрозофилы и дают серьезные предпосылки для изучения роли SUUR в таких процессах, как ремоделинг хроматина, контроль репликации и репарации ДНК. В ходе работы была создана система экспрессии SWR-ТАР и проведен ряд необходимых проверок функциональности этого химерного белка. Полученную систему можно эффективно использовать не только для дальнейшего изучения белок-белковых взаимодействий SUUR, но и в качестве более удобного и точного инструмента для цитологического анализа функции SUUR в клетке.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Белок SUUR физически взаимодействует с PCNA, структурной основой репликационной машины, что отражает связь SUUR с процессом репликации ДНК.

В культуре клеток дрозофилы S2 SUUR ассоциирован с белками, связанными с процессами регуляции клеточного цикла и репликации, ремоделинга хроматина, детекции и репарации двуцепочечных разрывов ДНК, а также гетерохроматиновым белком НР1.

Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Эксперименты по трансформации культуры клеток дрозофилы конструкцией SuUR-TAP были проведены при участии к.б.н. A.A. Горчакова и к.б.н. A.A. Алексеенко. Анализ локализации SUUR и PCNA на политенных хромосомах слюнных желез был проведен при участей к.б.н. Т.Д. Колесниковой. Анализ частот разломов на политенных хромосомах слюнных желез был проведен совместно с д.б.н. Е.С. Беляевой. Фракционирование экстрактов проведено при участии C.B. Кулемзина.

Апробация работы. Результаты работы представлены на российских и международных конференциях в устных докладах: на 44-ой Международной научной студенческой конференции (Новосибирск, Россия, 2006 г.), на 1-ой Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007 г.), на 12-ой Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, Россия, 2009 г.), на 10-й Международной конференции по гетерохроматину дрозофилы (Губбио, Италия, 2011 г.); а также в стендовых сообщениях: на 1-ой Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007 г.), на 8-м Европейском симпозиуме по изучению белков (Цюрих, Швейцария, 2009 г.), на 51-ой конференции по изучению дрозофилы (Вашингтон, США, 2010 г.), на 72-м симпозиуме лаборатории Колд Спринт Харбор «Метаболизм и заболевания» (Колд Спринт Харбор, США, 2011 г.), на 3-ей конференции

Европейского общества молекулярной биологии «The EMBO Meeting» (Вена, Австрия, 2011 г.).

Публикации. По теме исследования опубликовано 3 статьи и 14 тезисов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в которые входит 126 ссылок. Работа изложена на 121 странице печатного текста, содержит 3 таблицы и 12 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии мух. В работе использовали линии мух, полученные из Bloomington Stock Center, описанные в базе данных FlyBase (http://flybase.org/'), а также линии н>/ ru h SuURes и w;UAS-SuUR; ru h SnURES, описанные в Belyaeva et al., 1998. Линии с конструкциями для РНК-интерференции были получены из Vienna Drosophila RNAi Center (http://stockcenier.vdrc.at/).

Молекулярное клонирование и работа с нуклеиновыми кислотами. Выделение и анализ ДНК и РНК проводили по стандартным протоколам или в соответствии с рекомендациями фирм-производителей (QIAGEN, Invitrogen, Promega). Эксперименты с бактериями и плазмидами также проводили по стандартным протоколам. Плазмида pZome-C предоставлена фирмой CELLZOME (vvwvv.cellzome.corn).

Культура клеток. Трансфекцию культуры клеток S2 конструкцией SuUR-TAP проводили кальций-фосфатным методом по протоколу Invitrogen.

Цитологический анализ политенных хромосом. Приготовление и окрашивание препаратов слюнных желез для подсчета числа разломов политенных хромосом проводили по методике, описанной в Zhimulev et al., 1982. Подробности методики иммуноокрашивания политенных хромосом, использованной в этой работе, описаны в Kolesnikova et al., 2013.

Работа с белками. Белковые экстракты из эмбрионов и культуры клеток дрозофилы получали согласно методике, описанной в Soeller et al., 1988 с небольшими модификациями. Иммунопреципитации белков проводили по протоколу, описанному в Puig et al. 2001, а также согласно инструкциям фирм-производителей SIGMA, Invitrogen, Stratagene. FPLC-фракционирование белковых экстрактов проводили с использованием реактивов и оборудования GE Healthcare. Вестерн блот анализ проводили по стандартной методике.

Масс-спектрометрический анализ. Обработка белковых образцов трипсином и масс-спеирометрический анализ проводился на базе центра Taplin Biological Mass Spectrometry Facility (г. Бостон, США, https://taplin.med.harvard.edu). Спектральные данные анализ!гровали при помощи программного обеспечения Mascot (http://wvvw.matrixscience.com).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Создание системы для экспрессии химерного белка SUUR-TAP.

Использование химерных белков с аффинными эпитопами является одним из наиболее эффективных подходов к изучению белок-белковых взаимодействий. Для создания химерного SUUK был выбран аффинный эпитоп ТАР для выделения целых белковых комплексов методом двойной аффинной очистки (Tandem Affinity Purification) (Pilig et a!., 2001). Аффинные свойства этого эпигопа также позволяют проверять потенциальные взаимодействия SUUR методом коиммунопреципигации.

Первым этапом этой работы было создание векторных конструкций для экспрессии химерного белка SWR-ТАР в клетках дрозофилы. В таком химерном белке ТАР-эпитоп расположен на С-конце и содержит аффинные домены СВР (кальмодулин-связывающий) и ProtA (IgG-связывающий), разделенные сайтом для разрезания TEV-протеазой (Рис. 1А). Для условий экспрессии химерного белка, наиболее приближенных к нативным, была создана конструкция SuUR-TAP (Рис. 1Б), обеспечивающая экспрессию под контролем промотора гена SuUR. Кроме того, была создана конструкция UASSuUR-TAP (Рис. 1В) для контролируемой экспрессии SUUR-TAP в различных органах и тканях дрозофилы при помощи GAL4-UAS системы. Использование такой схемы экспрессии позволяет получать достаточно большое количество белка в клетке в зависимости от целей эксперимента.

Следующим этапом работы было внедрение полученных конструкций в геном дрозофилы. Для решения поставленных задач а полном объеме оптимально было добиться экспрессии SUUR-TAP и в культуре клеток, и в целом организме дрозофилы. Культура клеток S2 была трансформирована смесью векторной конструкции SuUR-TAP и плазмиды, несущей устойчивость к гигромицину. После поддержания культур на селективной среде при помощи Вестерн благ анализа отбирали те клоны клеток, где стабильно экспрессировался SUUR-TAP. Помимо трансформированной линии культуры клеток, мы получили трансгенные линии мух, содержащие геномные встройки конструкций SuUR-TAP и UAS-SuUR-TAP.

SUUR-TAP функционален в организме дрозофилы. Для дальнейшей работы необходимо было убедиться, что и SWR и ТАР-эпитоп являются функциональными в составе химерного белка SUUR-TAP. Критерием функциональности SUUR в составе SUUR-TAP является восстановление до нормы (или «спасете») мутантного фенотипа SuUR. Фенотипом мутации является супрессия недорепликации в клетках слюнных желез дрозофилы и, как следствие, исчезновение разломов на полигенных хромосомах (Belyaeva et ah, 1998). Для проведения теста на «спасение» в линии мух, содержащей встройку конструкции SuUR-TAP, аллели нормального гена SuUR были заменены на мутатные из линии y'w67; ru h SuUR®. Из слюнных желез личинок полученной линии SuUR-TAP; ru h SuURö были сделаны препараты политенных хромосом и посчитаны частоты разломов в девяти тестовых хромосомных районах. На рисунке 2А видно, что в линии, где эндогенный SWR заменен на SUUR-TAP,

разломы хромосом в тестовых районах встречаются не реже, чем в диком типе (биномиальный тест, Р < 0,05). В линии с мутацией БиШ частоты разломов в этих районах равны нулю (Ве1уаеуа е/ с/., 1998). Ранее для белка БХИЖ был показан характерный паттерн его локализации на политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы (Макипт с/ «/., 2002). Методом иммунолокализации мы показали, что 8ТЛЖ-ТАР способен связываться с хроматином полигенных хромосом слюнных желез. Мы также показали, что БШЛ-ТАР в условиях эктопической экспрессии с различными ОА14-драйверами дает такие же эффекты, как и беяок 5 и и И (Уо1ко\'а с! а!., 2003).

Чтобы оценить функциональность ТАР-эпигопа в составе 81ЛЖ-ТАР, мы использовали белковые экстракты из линии клеточной культуры 82 с экспрессией БТЛЖ-ТАР. Клеточные экстракты инкубировали с аффинным !§С-матриксом, затем отмывали матрикс от несвязавшегося материала. Матрикс был раздаче! г на две равных части, к одной из которых был добавлен буфер с ТЕУ-прогеазой, а к другой буфер без протеазы. Вестерн блот с полученными элюатами представлен на рисунке 2Б. Видно, что в образцах без добавления ТЕУ-протеазы полноразмерный белок БШП-ТАР связан с 1§С-агарозой (Рис. 2Б). Это свидетельствует о функциональности домена РгсМ. в ТАР-эшггопе. После добавления ТЕУ-протеазы полноразмерная форма ЯииК-ТАР на матриксе пе детектируется (Рис. 2Б), это означает, что сайт узнавания ТЕУ стсрически доступен в составе ТАР-эиигопа химерного белка 81ЛЛ1-ТАР и успешно расщепляется ТЕУ-протеазой.

Таким образом, мы создали систему для выделения белковых комплексов 81)1Ж-'ГАР методом двойной аффинной очистки. Были получены трансгенные линии мух и трансформированная клеточная линия с экспрессией полностью функционального химерного белка. Такая система значительно расширяет методические возможности изучения 81!1Ж.

вШЖ взаимодействует с репликационпой машиной. Предыдущие исследования функции 8111111 указывают на его участие в регуляции процесса репликации ДНК (7Ылш!еу ег а1., 2003; Уиг1оуа еГ о/., 2009). В одной из последних работ было показано, что 81ЛЖ способен замедлять движение репликационной вилки при амплификации хорионовых генов (5Ь,ег е/ а!., 2012). Однако не было ясно, связан ли этот эффект БШЖ с изменением структуры хроматина или же с непосредственным взаимодействием БиШ с вилкой репликации. Параллельно с данной работой, в нашей лаборатории были проанализированы паттерны хромосомной локализации в клетках слюнных желез для исследования его

динамики в клеточном цикле. В качестве маркера стадий эндощжла использовались паттерны локализации белка PCNA, струюурной основы репликационной машины. Сигналы иммунолокализации РСКА точно показывают, какие районы хромосом реатицируются в данный момент -фазы. При совмещении паттернов БШЖ и РСЫА была обнаружено, что, начиная с середины Б-фазы, эти белки почти полностью колокализуются на полигенных хромосомах (Ко1с8гнко\'а е/ а!., 2013).

А

SUUR-TAP

Рго1 А сайт для разрезания протеазой ТЕУ

SuUR-TAP (pWhiteRabbit)

UAS'SuUR-TAP (pUAST)

hsp70

SuUR

P5 miniwhite 5xUAS I кДНК SuUt

-Hitt1—ШШ

Рис. 1. Создание химерного белка БЦиЯ-ТАР. (А) Структурные элементы химерного белка 81ЛЖ-ТАР. (Б) Схема генетической конструкции БиШ^-ТАР на основе геномного клона и вектора рШЬнеКаЬЬй. (В) Схема генетической конструкции С/АЗ-БииЯ-ТАР на основе вектора риАЭТ и кДНК 5и1Л1. СВР - кальмодулин-связывакмций домен, РпЛА -1§0-связывающий домен, ттм/ИНе - репортерный ген, 5хиА5 - пятикратно повторенная последовательность илв, - промотор гена теплового шока. Последовательность ТАР-эпитопа взята из плазмиды р2оше-С. Треугольниками обозначены фрагменты Р-элемента.

□ Oregon R

□ SuUR-TAP; ги h SuUR> ''

м

(кДа) 180115-

ЗС 11А 19Е 39Е 42В 64С 75С 89Е 59D районы хромосом

SUUR-TAP + lgG-агароза -TEV +TEV

< SUUR-TAP

Рис. 2. 81ДЖ и ТАР-эпитоп функциональны в составе химерного белка ЗиЦИ-ТАР. (А) Частоты разломов в тестовых районах политенных хромосом в линии с экспрессией 51ЛЖ-ТАР на фоне мутации БиС/И и в линии дикого типа. Для каждого района было оценено 40-50 ядер. * - биномиальный тест, Р<0,05. В линии с мутацией БиС/Я частоты разломов в тестовых районах равны нулю (Ве1уаеуа е1 в/., 1998). (Б) Детекция химерного белка $1ЛЖ-ТАР в элюатах с ^С-агарозы после инкубации с ТЕУ-протеазой и без добавления ТЕУ-протеазы. Вестерн блот с РАР-конъюгатами (а-ТАР). Образцы использовали в нескольких разведениях (10%, 5%, 2%, 1 %).

Эти наблюдения коллег позволили нам предположить, что корреляция динамики йиик и РСЫА в 8-фазе может быть следствием их физического взаимодействия. Биохимически показать взаимодействие между 81ЛЖ и РСЫА можно при помощи коиммунопреципитации. Наиболее доступным материалом для приготовления белковых экстрактов служат эмбрионы дрозофилы. Известно, что и РСЫА и БииЯ оба присутствуют в эмбрионах во время 5-фазы (Макишп е/ о/., 2002; Ко1е5шко\ае/а/., 2013; FlyBa.se, http://flybase.org).

Чтобы убедиться, что белковый комплекс 8ииЯ/РСЫА в принципе может существовать, мы проанализировали профили элюции этих белков в ходе РРЬС-фракционирования всех белковых комплексов в нативных эмбриональных экстрактах (Рис. ЗА). Всего было отобрано 11 фракций (пронумерованы от тяжелых к легким), образцы из которых были затем использованы для Вестерн блот анализа с антителами против 81ЛЖ и РС1ЧА. На рисунке ЗА видно, что фракции, содержащие 8ШЖ и РСЫА, перекрываются: во фракциях 7 и 8 присутствуют оба белка. Это свидетельствует о том, что 81ЛЖ и Р01А могут входить в состав общего, достаточно крупного (~232 - 440 кДа) белкового комплекса в эмбрионах дрозофилы. Стоит отметить, что в этом эксперименте впервые удалось оценить размер комплексов, образуемых 81ЛЖ.

Чтобы продемонстрировать физическое взаимодействие 81ДЖ и РСЫА, из РРЬС-фракции 7, содержащей оба белка, были иммунопреципитированы комплексы РСЫА (при помощи высокоэффективных антител к РСЫА). Вестерн блот с антителами против 81ДЖ показал, что полноразмерный 81ЛЖ (~130 кДа) присутствует в иммунопреципитированных комплексах РСИА (Рис. ЗБ). Это указывает на то, что 8ШЛ1 и РСЫА входят в состав общего комплекса в эмбрионах дрозофилы.

Для подтверждения специфичности такого взаимодействия был необходим реципрокный эксперимент по коиммунопреципитации, где белком-мишенью был бы 8ииЯ. Чтобы повысить эффективность иммунопреципитации и повысить уровень полноразмерного 81ЛЖ в эмбриональных экстрактах, было решено использовать полученную нами ранее систему контролируемой экспрессии химерного белка 81ЛЖ-ТАР (мы использовали повсеместную экспрессию трансгена иЛЗ-8и IIК-ТАР в эмбрионах с драйвером с!а-СЛЬ4). Используя первый этап метода двойной аффинной очистки (Рис. 4Б), белковые комплексы 8ШЖ-ТАР были иммунопреципитированы из полученных эмбриональных экстрактов при помощи ^О-матрикса (Рис. ЗВ). После серии отмывок 81ЛЖ и связанные с ним белки были элюированы добавлением в образцы ТЕУ-протеазы (Рис. 4В, Г). Анализ полученных элюатов при помощи Вестерн блот с антителами против РСЫА подтвердил взаимодействие 81ЛЖ и РОМА (Рис. ЗВ).

Чтобы дополнительно убедиться, что в предыдущем эксперименте РСЫА взаимодействует именно с 81ЛЛ*, а не с ТАР-эпитопом в ЗШЖ-ТАР, мы провели

контрольные эксперименты по иммунопреципитации. При ТАР-иммунопреципитации контрольных образцов неспецифического взаимодействия PCNA с аффинным матриксом или с ТАР-эпитопом (без участия SUUR) обнаружено не было (Рис. ЗГ). PCNA является структурной основой для различных клеточных процессов и может связываться с множеством белков, обладающих разнообразными функциями. Большинство этих белков взаимодействуют с PCNA посредством канонических пептидных мотивов, называемых PCNA interacting peptides (PIPs) (Naryzhny, 2008). Анализ пептидной последовательности SUUR не выявил подобных мотивов, что может указывать на вероятное непрямое взаимодействие с PCNA.

ВБ:

a-SUUR ВБ:

a-PCNA

М экстр.

FPLC фракции

кДа

кДа кДа

мишень)

М

a PCNA ИП

ИП ИП

экстр, без ProtA +

В

SUUR-TAP ИП

lgG-аг. IgG-ar. М экстр, без + +TEV (кДа) экстр, экстр, элюат

ВБ: a-PCNA

SUUR-TAP (белок-мишень)

29Г 170130 7055 -

ВБ:

MSL3-TAP

(белок-

мишень)

ВБ:

a-PCNA

MSL3-TAP ИП

lgG-аг. „по IgG-ar. М экстр. + tag" без (кДа! 2% экстр, контр, экстр.

10070

Рис. 3. SUUR взаимодействует с PCNA в эмбрионах дрозофилы. (A) FPLC-фракционирование нативных эмбриональных экстрактов. Индивидуальные фракции окрашены при помощи Вестерн блот (ВБ) антителами против SUUR и PCNA. Стрелками обозначен молекулярный вес фракций. (Б) SUUR коиммунопреципитируется с PCNA из FPLC-фракции 7. Стрелками отмечен полноразмерный SUUR (-130 кДа). (В) PCNA коиммунопреципитируется с SUUR-TAP из эмбриональных ядерных экстрактов генотипа da-GAL4>UAS-SuUR-TAP. PCNA детектируется в TEV-элюатах, содержащих связанные с SUUR белки. Стрелкой обозначен полноразмерный SUUR-TAP. (Г) PCNA не взаимодействует с IgG-агарозным матриксом («по tag») и ТАР-эпитопом отдельно от SUUR (MSL3-TAP экстракты (Alekseyenko et al., 2006)).

Выявление компонентов комплексов втЖ-ТАР. Одним из ключевых экспериментов данной работы являлось собственно выделение комплексов белка 81ДЖ-ТАР из ядерных экстрактов методом двойной аффинной очистки. Схема эксперимента е/ ей., 2001) представлена на рисунке 4.

Б

1дСматрикс

в

1дй матрикс

Щг I

И МЭ5СОГ

белок 5соге

5ииЯ 52

55РР1 27

СусПпА 22

В1М 20

НО 18

ежа 13

ЯАЭ51 17

НР1 16

НМ02 16

16

1 % 5?

квяьмвдули»

Рис. 4. Схема экспериментов по двойной аффинной очистке белковых комплексов 81ЛЖ-ТАР. (А-Г) Аффинная очистка на 1§0-матриксе. (Д-Е) Аффинная очистка на кальмодулиновом матриксе. (Ж-И) Анализ состава комплексов ¿ЩЖ-ТАР. М - маркер молекулярного веса белков. Подробности этапов описаны в тексте.

Основные этапы были следующими:

• Полученные из клеток ядерные белковые экстракты (Рис. 4А) были добавлены к предварительно промытому ^О-агарозному матриксу. После аффинного связывания комплексов вТЯЖ-ТАР с ^О-агарозой несвязавшийся материал был удален промывкой (Рис. 4Б).

• Для специфической элюции комплексов 81ЛЖ-ТАР к матриксу была добавлена ТЕУ-протеаза в активирующем буфере (Рис. 4В).

• После разрезания ТЕУ-протеазой, супернатант, содержащий 81ЛЖ-ТАР (без Рго1А домена) и связанные с ним белки, был отделен от матрикса (Рис. 4Г).

• К полученному на предыдущем этапе элюату добавляли буфер с СаС12 и наносили на аффинную колонку, содержащую кальмодулиновый матрикс. На этом этапе СВР-домен в вЦИЯ-ТАР обеспечивает специфическое связывание комплексов с матриксом. Комплексы повторно отмывали от контаминантов (Рис. 4Д).

• Комплексы SUUR-TAP элюировали, удаляя коны кальция (Рис. 4Е).

• Дважды очищенные комплексы преципитировали 30% ТХУ и растворяли в буфере для нанесения. Компоненты комплексов разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле. Бэнды, соответствующие белкам, выявляли окраской нитратом серебра (Рис. 4Ж).

• Так как на предыдущем этапе было детектировано довольно большое для индивидуальной диссекции количество белковых бэндов (Рис. 4Ж), мы решили анализировать фрагменты геля, соответствующие целым дорожкам. Белки в образцах геля (опытном и контрольном - экстрагаы из клеток без экспрессии SUUR-TAP) расщепляли трипсином и полученные наборы коротких пептидов анализировали при помощи масс-спеетрометрии (Рис. 43).

• Из общего пула сигналов доя образца SUUR-TAP были вычтены неспецифические сигналы («шум») го контрольного образца. При помощи программного обеспечения Mascot (http://www.matrixscience.com/) был идентифицирован набор пептидов в образце SUUR-TAP. Список предполагаемых белков-партнеров SUUR получали в результате поиска совпадений всех коротких пептидов в белковых базах данных через Protein ELAST (Рис. 4И).

Полученный в итоге список наиболее вероятных взаимодействий SUUR приведен в таблице 1. Белки в таком списке проранжированы в зависимости от относительной представленности в спектре (Табл. 1). Первую строку в зтом списке, как и ожидалось, занимает сам белок SUUR. D итоговом списке мы обнаружили и гетерохроматиновый белок НР1, взаимодействие SUUR с которым было показано ранее (Pindyurin et al., 2008).

Таблица 1. Белки, обнаруженные масс-спектрометрически при выделении комплексов

SUUR-TAP методом двойной аффинной очистки.

Белок Размер (ак.) количество совпадений пептидов (шт.) покрытие белка пептидами относительная представленность в спектре*

SUUR 962 55 50% 57.17256

HMGZ 111 6 49% 54.05405

НР1 213 11 52% 51.64319

Cyclin А 491 22 35% 44.80652

SSRP1 723 32 40% 44.26003

HD 568 24 42% 42.25352

RAD51 336 14 58% 41.66667

ORC1 924 35 36% 37.87879

Ss Dpol ô 431 15 35% 34.80278

BLM 1487 50 33% 33.62475

* Относительная представленность белка в спектре отражает количество совпадений пептидов на 1000 аминокислот.

Анализ данных о клеточных функциях белков го списка (взяты го базы данных FlyBase, http://flybase.org) показал, что вместе с SUUR, в основном выявились белки, участвующие в таких процессах как: контроль клеточного цикла и репликация (Cyclin А, малая субьединица ДНК полимеразы S, ORC1, белковый продукт гена humpty durnpty), репарация двуцепочечных разрывов ДНК (RAD51, BLM), ремоделинг хроматина (SSRP1, HMGZ) и поддержание гетерохроматанового состояния (НР1) (Lehner, O'Farrell, 1989; Adams et al., 2003; Shimojima et al, 2003; Staeva-Vieira et al., 2003; Bandura et al, 2005; DePamphilis, 2005; Ragab et al, 2006)! Интересно отметить, что такой набор клеточных процессов, так или иначе, коррелирует с известными на данный момент эффектами SUUR.

Анализ литературы и баз данных о белковых взаимодействиях (BioGRID http://wwvv.thebiogrid.org/, DroID http://www.droidb.org/) показал, что для большинства этих белков (Табл. 1) ранее были показаны те или иные варианты взаимодействия друг с другом, а также с обнаруженным в этой работе белком-партнером SUUR -PCNA.

Анализ генетических взаимодействий SUUR. Для подтверждения обнаруженных потенциальных взаимодействий SUUR, мы решили проверить, поачияет ли нарушение экспрессии белков-кандидатов в партнеры SUUR на его хромосомную локализацию. Так, если исследуемый белок взаимодействует с SUUR и участвует в механизме его действия, то серьезные изменения экспрессии такого белка (супрессия или оверэкспрессия) с большой вероятностью приведет к нарушениям функции SUUR, а значит и нарушению его связывания с хромосомами.

Наиболее удобной для работы системой супрессии генов является РНК-интерференция (RNAi супрессия). Мы подобрали доступные в Vienna Drosophila RNAi Center линии мух со встройками конструкций, кодирующих RNAi-шпильки прошв интересующих нас генов из списка (Табл. 1). Для запуска RNAi супрессии такие линии скрещивают с САЬ4-драйверпыми линиям! и эффект наблюдают в потомстве.

Для запуска повсеместной экспрессии RNAi-шпилек мы использовали драйвер da-GAL4. Скрещивания и культивацию личинок проводили при повышенной температуре (29°С), затем диссектировали слюнные железы личинок третьего возраста и анализировали цитологические препараты целых желез и иммуноокрашенные препараты полигенных хромосом. В таблице 2 приведены эффекты RNAi супрессии исследованных генов-кандидатов (кроме Su(var)2-5 (НР1). так как его взаимодействие с SUUR уже было показано биохимически (Pindyurin et al., 2008). Супрессия некоторых генов (HmgZ, Orel, hd) в такой системе приводила к образованию маленькой слюнной железы. Такой эффект часто свидетельствует о нарушениях процесса репликации (Park and Asano, 2008). ¡Интересно отметать, что к подавлению репликации и образованию маленькой слюнной железы приводит и

нарушение экспрессия SuUR, но не супрессия, а оверэкспрессия с драйвером АВ1-GAL4 (Volkova et al„ 2003).

Чтобы понять, влияет ли супрессия исследуемых генов на хромосомную локализацию SUUR, препараты политенных хромосом слюнных желез были окрашены антителами против SUUR и PCNA (для визуализации репликации). В качестве контроля была использована линия Oregon R в тех же температурных условиях. В Таблице 2 приведены данные этих экспериментов. При супрессии генов Rad5l и В 1т нарушений репликации и локализации SUUR на хромосомах обнаружено не было. Для некоторых генов {Ssrpl, HmgZ и Orel) в таких условиях не удалось получить пригодных для цитологического анализа препаратов полигенных хромосом, поэтом>' мы провали дополнительные скрещивания всех RNAi линий с драйвером AB1-GAL4, специфическим для слюнных желез, при 29°С (Табл. 2).

Таблица 2, Эффекты RNAi супрессии кандидатов в партнеры SUUR, наблюдаемые в слюнных железах (СЖ).

¡!а-ОАЬ4 29°С АП1-САЬ4 29°С

Ssrpl RNAi Летальность тонкие хромосомы; есть РСЫА, почти нет виш

HmgZRNAi маленькие СЖ _

hdRNAi Маленькие СЖ; тонкие хромосомы; нет РСЫА, нет ЗиШ. -

CG12018 RNAi (мал су б. ДНК палимеразы S) нарушения морфологии ядер и хромосом; есть РСЫА, нет 81ЛЖ нарушения морфологии хромосом; есть РСТчтА, нет вЦШ

Orel RNAi маленькие СЖ, нарушения морфологии ядер тонкие хромосомы; есть РСКА, есть БЦШ

CyclinA RNAi рыхлые хромосомы; есть РСОД, есть нет эффекта

RadSl RNAi нет эффекта нет эффекта

BlmRNAi нет эффекта нет эффекта

Суммируя эти данные, можно утверждать, что то или иное нарушение общей морфологии слюнных желез и политенных хромосом наблюдалось в большинстве скрещиваний (Табл. 2), кроме случаев Яас151 и В1т, возможно в связи с низкой эффективностью РНК-ингерференции. Однако, возможность взаимодействия ЭШЖ с белками репарации двуцепочечных разрывов ДНК (ВЬМ и RAD51) нельзя исключать. В политенных хромосомах слюнных желез сайты локализации 8ШЖ в недореплицированных районах обогащены двуцепочечными разрывами (/\ndreyeva е1 а.1, 2008). Влияние же на хромосомную локализацию 81ЛЖ мы наблюдали в следующих скрещиваниях:

• АП1-САЬ4>ЯЫ/И Бзгр1 - 8ШЖ в малом количестве присутствует только в хромоцентре при нормальной репликации в плечах хромосом;

• da-GAL4>RNAi CG12018 (ss DNA pol 5) - нет сигналов SUUR при нормальной репликации в плечах хромосом;

• da-GAL4>RNAi hd - нет сигналов SUUR, нет сигналов PCNA, что свидетельствует об отсутствии репликации.

RNAi супрессия гена CG12018, кодирующего малую субъединицу ДНК полимеразы 5, привела к одному из самых удивительных эффектов на структуру хромосом и фенотип SUUR. ДНК полимераза 5 - один из ключевых ферментов синтеза ДНК, состоящий из двух субъединиц: большой каталитической и малой регуляторной (Aoyagi et al., 1994). При такой важной клеточной функции, супрессия ее активности с большой вероятностью могла привести к летальности. Однако, даже при множественных морфологических нарушениях структуры хромосом и ядер, репликация в слюнных железах при супрессии малой субъединицы ДНК полимеразы 5 все же происходит. При этом SUUR на хромосомах не выявляется, что указывает на необходимость полимеразы 8 для функциональной хромосомной локализации SUUR. Известно, что полимераза 8 напрямую взаимодействует с PCNA (Naiyzhny, 2008). Таким образом, малая субъединица полимеразы 8 может быть промежуточным звеном в обнаруженном нами в этой работе взаимодействии SUUR и PCNA, что может объяснил, отсутствие PCNA в сшкже белков, выявляемых с SUUR-TAP в культуре клеток.

В коллекциях линий мух Bloomington Stock Center мы обнаружили две линии, которые содержат встройки ЕР-конструкций (UAS-hsp70 последовательность) в промоторные области генов Ssrpl и HmgZ. Скрещивание таких линий с GAL4-драйверами может запускать оверэкспрессию этих генов. Для проверки влияния оверэкспрессии SSRP1 и HMGZ в слюнных железах на хромосомную локализацию SUUR мы использовали драйвер Sgs3-GAL4 при 29°С. Оказалось, что оверэкспрессия SSRP1 в таких условиях приводит к полному исчезновению сигналов SUUR при абсолютно нормальной репликации. При скрещивании Sgs3-GAL4/EP-HmgZ локализация SUUR на хромосомах и репликация не были нарушены.

Итак, в этой работе проведены эксперименты по исследованию функциональных взаимодействий SuUR с обнаруженными генами генетическими методами: установлены генетические взаимодействия SuUR с генами Ssrpl, CG12018 и Ы. В дальнейших исследованиях мы планируем провести масштабную работу по биохимическому подтверждению взаимодействий SUUR со всеми белками, выявляемыми вместе с SUUR при двойной аффинной очистке его комплексов из клеточной культуры. Это позволит построил, конкретную модель механизма работы SUUR в клетках дрозофилы.

Весьма интересным представляется взаимодействие SUUR с факторами ремоделинга хроматина (SSRP1 и HMGZ) с одной стороны, и с машиной репликации (с PCNA, например, через ре1уляторную субъедшшцу ДНК полимеразы 8) с другой стороны. Это означает, что SUUR может оказаться частью механизма регуляции

пострепликационного ремоделинга гетерохроматиновых районов. Например, было показано, что в мутации SuUR в большинстве районов, которые в норме маркированы метилированием НЗК27, эта гетерохроматиновая гистоновая метка исчезает. В контексте тормозящего влияния SUUR на вилку репликации, показанного в работе Sher et al., 2012, можно предположить, что в этих районах SUUR контролирует процесс пострепликационного восстановления НЗК27теЗ метки. А поскольку, вероятно, процесс поставки таких модифицированных гистонов в вилку репликации требует времени, SUUR через физическое взаимодействие может замедлять скорость этой вилки, чтобы НЗК27теЗ метка успела полностью восстановиться для обеих молекул ДНК. Конечно, эта перспективная гипотеза нуждается в специальной экспериментальной проверке, которая, обязательно будет проведена в будущей работе.

ВЫВОДЫ

1. Создана система для выделения комплексов белка SUUR дрозофилы методом двойной аффинной очистки.

2. Установлено, что химерный белок SUUR-TAP является полностью функциональным.

3. Показано, что белок SUUR входит в состав крупных белковых комплексов с размерами -232 - 440 кДа.

4. Было установлено, что SUUR и PCNA входаг в состав общего белкового комплекса в эмбрионах дрозофилы.

5. Определены белки, выявляемые вместе с SUUR при выделении комплексов SUUR-TAP в культуре клеток дрозофилы. Эти белки участвуют в процессах регуляции клеточного цикла, репликации, репарации двуцепочечных разрывов ДНК и ремоделинга хроматина. Также в составе комплексов SUUR-TAP был обнаружен белок НР1, взаимодействие с которым было установлено ранее.

6. Показаны генетические взаимодействия SuUR с генами Ssrpl, CG12018 (ss Dpol 5) и hd.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

Статьи:

1) Посух О.В.. Юрлова A.A., Беляева Е.С., Жимулев И.Ф. Система для очистки комплексов хромосомного белка SUUR Drosophila melanogaster II Докл. Акад. Наук. 2007. Т. 416. N.4. С. 550-554.

2) Anna A. Yurlova, Igor V. Makunin, Tatyana D. Kolesnikova, Olga V. Posukh. Elena S. Belyaeva and Igor F. Zhimulev. Conservation of domain structure in a fast-evolving heterochromatic SUUR protein in Drosophilids // Genetics. 2009. V.183 (1). P. 119-129.

3) Tatyana D. Kolesnikova, Oiga V. Posukh. Eugeniya N. Andreyeva, Darya S. Bebyakina, Anton V. Ivankin, Igor F. Zhimulev. Drosophila SUUR protein associates with PCNA and binds chromatin in a cell cycle-dependent manner // Chromosoma. 2013. V.l 22 (1-2). P. 55-66.

Тезисы конференций:

1) Посух O.B. Конструкции для выделения комплексов белка SUUR Drosophila melanogaster // Сборник трудов МНСК. Новосибирск. 2006. С. 54.

2) Посух О.В.. Горчаков А.А., Алексеенко А.А., Юрлова А.А. Система для выделения комплексов хромосомною белка SUUR Drosophila melanogaster // Сборник трудов I Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». 9-12 мая, 2007. Томск. С. 145.

3) Посух О.В., Горчаков А.А., Алексеенко А.А., Юрлова А.А. Определение компонентов комплекса белка SUUR Drosophila melartogasterll Сборник трудов V Съезда ВОГиС. Москва. 2009. С. 93.

4) D. Koryakov, Е. Andreyeva, Е. Belyaeva, S. Belyakin, L. Bo'dyreva, Т. Kolesnikova, I. Makunin, A. Pindyurin, G. Pokholkova, O. Posukh. V. Shloma, A. Yurlova, I. Zhimulev. The SUUR protein plays key role in DNA late replication and underreplication in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster // Abstracts of the VIII European Symposium of The Protein Society. June 14 - 18, 2009. Zurich, Switzerland. P. 133.

5) Посух O.B., Горчаков A.A., Алексеенко A.A., Юрлова А.А. Компоненш комплекса белка SUUR Drosophila melanogaster // Сборник трудов Международной конференции «Хромосома 2009». 31 августа-6 сентября, 2009. Новосибирск. С. 150.

6) Юрлова А.А., Макунин И.В., Колесникова Т.Д., Посух О.В.. Беляева Е.С., Жимулев И.Ф. Доменная консервативность быстро эволюционирующего гетерохроматинового белка SUUR дрозофилы // Сборник трудов Международной конференции «Хромосома 2009». 31 августа - 6 сентября, 2009. Новосибирск. С. 55.

7) Посух О.В.. Горчаков А.А., Алексеенко А.А., Юрлова А.А. Определение компонентов комплекса белка SUUR Drosophila melanogaster И Сборник трудов ХП Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии. 7-14 сентября, 2009. Владивосток. С. 60.

8) Olga Posukh. Andrey Gortchakov, Igor Zhimulev. SUUR copurifies with proteins involved in replication, DSB repair, cell cycle control, and heterochromatin maintenance // Proceedings of 51st Annual Drosophila Research Conference. April 7-11, 2010. Washington, DC, USA. P. 106.

9) Tatiana D. Kolesnikova, Darya S. Bebyakina, Olga V. Posukh. Evgenia N. Andreyeva, Dmitri E. Koryakov. Cell cycle-dependent binding of SUUR to Drosophila melanogaster polytene chromosomes // Proceedings of 51st Annual Drosophila Research Conference. April 7-11,2010. Washington, DC, USA. P. 105.

10) Посух О.В. Белки, выявляемые в комплексах белка SUUR Drosophila melanogaster II Сборник научных статей П Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии». 6 - 10 сентября, 2010. Одесса, Украина. С. 60.

11) Posukh О.. Koryakov D., Kolesnikova Т., Zhimuiev I. Genetic analysis of SUUR protein interactions // Proceedings of 52nd Annual Drosophila Research Conference. March 30 - April 3,2011. San Diego, CA, USA. P. 209.

12) Olga Posukh. Tatyana Kolesnikova, Igor Zhimuiev. SUUR protein regulates heterochroraatin replication timing by physical interaction with replication machinery in Drosophila melanogaster // Abstracts of 72nd Symposium "Metabolism and Disease". June 1 - 6,2011. Cold Spring Harbor, NY, USA. P. 98.

13) Kolesnikova T.D., Posukh O.V.. Andreyeva E.N., Belyaeva E.S., Zhimuiev I.F. SUUR protein physically interacts with replication machinery in Drosophila melanogaster // Abstracts of the X International Conference on Drosophila Heterochromatin. June 12-18, 201 l.Gubbio, Italy. P.3.

14) Olga Posukh. Dmitriy Koryakov, Igor Zhimuiev, Stepan Belyakin. The role of ORC1 in regulation of DSB repair in drosophila salivaty gland cells // Abstracts of the EMBO Meeting 2011. September 10-13, 2011. Vienna, Austria. P. 94.

Подписано к печати 1.04.2013 г. Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. 1. Уч.-изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ ЛЬ 28

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Посух, Ольга Витальевна, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕКСОВ БЕЛКА виШ

ИЯОБОРШЬА МЕЬАЫОСА8ТЕЯ

На правах рукописи

04201357520

ПОСУХ ОЛЬГА ВИТАЛЬЕВНА

Генетика-03.02.07

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАН Жимулёв Игорь Фёдорович

Новосибирск - 2013

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ........................................................................3

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................10

1.1. Регуляция репликации.........................................................................................................10

1.1.1. Регуляция общей продолжительности Б-фазы в клеточном цикле....................11

1.1.2. Регуляция эндоциклов....................................................................................................12

1.1.3. Контроль временной картины репликации..................................................................14

1.2. Организация хроматина.......................................................................................................15

1.2.1. Типы состояния хроматина...........................................................................................16

1.2.2. НР1-зависимый гетерохроматин...................................................................................17

1.2.3. Ро1усошЬ-зависимый гетерохроматин..........................................................................19

1.3. Регуляция времени репликации в контексте хроматина..................................................20

1.3.1. Влияние хроматиновых факторов на скорость репликации......................................22

1.3.2. Белки ремоделинга хроматина......................................................................................22

1.3.3. Гистоновые шапероны...................................................................................................24

1.4. Недорепликация....................................................................................................................27

1.5. Белок 81ЛЖ в контексте репликации и хроматина..........................................................30

1.5.1. 81ДЖ - хроматиновый белок........................................................................................31

1.5.2. Участие 81ЛЛ1 в регуляции репликации......................................................................33

1.6. Подходы к выявлению белковых взаимодействий и изучению белковых комплексов 36

1.6.1. Применение различных методов для обнуружения новых белковых взаимодействий................................................................................................................37

1.6.2. Метод двойной аффинной очистки белковых комплексов........................................39

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................42

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ...............................................................................................................57

3.1. Создание системы для изучения взаимодействий белка БТЛЖ......................................57

3.1.1. Создание конструкций для экспрессии 81ЛЖ-ТАР...................................................58

3.1.2. Получение линий мух и клеточной линии, экспрессирующих 81ЯЖ-ТАР.............60

3.1.3. Анализ функциональности химерного белка 81ЛЖ-ТАР..........................................62

3.2. 81ДЖ взаимодействует с репликационной машиной.......................................................70

3.2.1. Проверка физического взаимодействия 81ЛЖ и РСНА.............................................72

3.2.2. Связывание 81ЛЖ с политенными хромосомами не зависит от РСИА...................75

3.3. Выделение белковых комплексов 81ДЖ-ТАР..................................................................77

3.3.1. Выявление компонентов комплексов 8ШЖ-ТАР......................................................78

3.2.2. Идентификация белков ассоциированных с 81ДЖ-ТАР............................................79

3.4. Анализ генетических взаимодействий БТ-ЛЖ....................................................................85

3.4.1. Поиск влияния на хромосомную локализацию 81ДЖ...............................................86

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................................................93

ВЫВОДЫ...................................................................................................................................103

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................105

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ак. - аминокислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖТ - жировое тело

ИП - иммунопреципитация

кДНК - комплементарная ДНК

М - маркер молекулярного веса

мРНК - матричная РНК

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

СЖ - слюнные железы

ТХУ - трихлоруксусная кислота

СВР - calmodulin binding protein

Cdk - cyclin dependent kinase

FPLC - fast protein liquid chromatography

ORC - origin recognition complex

PCNA - proliferating cell nuclear antigen

TAP - tandem affinity purification

UAS - upstream activating sequence

RNAi - RNA interference

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Реализация эпигенетической программы в развитии эукариотических организмов является на данный момент одной из наиболее изучаемых проблем современной биологии. То или иное состояние отдельных участков генома (эухроматиновое или гетерохроматиновое) эпигенетически наследуется в ряду клеточных поколений.

Было показано, что эухроматиновые и гетерохроматиновые районы реплицируются неодновременно. Параметры пространственно-временной картины репликации генома четко контролируются в клеточном цикле. Однако многие аспекты регуляции такой дифференцированной программы остаются невыясненными.

У Drosophila melanogaster временная картина репликации в политенных тканях имеет свои характерные особенности: в силу укороченного общего времени S-фазы поздно реплицирующиеся гетерохроматиновые районы политенных хромосом слюнных желез не успевают завершить свою репликацию до конца S-фазы и последовательности ДНК в них остаются недопредставленными.

У D. melanogaster фактором, влияющим на регуляцию времени репликации таких районов в политенных хромосомах слюнных желез личинок, является белок SUUR {Suppressor of Underreplication). Он способен связываться с районами прицентромерного и интеркалярного (расположенного в плечах хромосом)

гетерохроматина. В мутации SuUR эти районы хромосом заканчивают репликацию раньше в S-фазе, в следствие чего недореплицированные в норме районы становятся полностью политенизированными.

В экспериментах на культуре клеток дрозофилы для белка SUUR было показано, что его геномные мишени соответствуют транскрипционно неактивным типам хроматина. Также, была продемонстрирована способность SUUR замедлять скорость движения вилок репликации при амплификации хорионовых генов в фолликулярных клетках яичников. Однако остается открытым вопрос, как именно SUUR осуществляет свою функцию? Связано ли это с прямым воздействием на машину репликации или же основное влияние SUUR оказывает на структуру хроматина, что в свою очередь уже регулирует скорость репликационной вилки?

Чтобы исследовать механизм работы SUUR, необходима информация о его взаимодействиях с другими белками. К настоящему моменту, единственным белком, для которого было показано физическое взаимодействие с SUUR, является гетерохроматиновый белок НР1. Однако, этой информации недостаточно, чтобы объяснить эффект белка SUUR в разных тканях.

В данной работе, чтобы приблизиться к пониманию механизмов действия SUUR, был осуществлен поиск новых белков, с которыми SUUR может взаимодействовать. Была создана система для выделения и очистки белковых комплексов, в которые входит SUUR, на основе метода двойной аффинной очистки (ТАР - tandem affinity purification). Эта система была использована для выделения комплексов SUUR-TAP из белковых экстрактов, полученных из линии культуры клеток S2 дрозофилы, и их состав был проанализирован при помощи масс-спектрометрических методов. После обработки данных масс-спектрометрии был

получен список вероятных белков-партнеров 81ЛЖ и проведены эксперименты по исследованию функциональности этих взаимодействий генетическими методами. Также, система экспрессии химерного белка 81ЛЖ-ТАР была использована для проверки гипотезы взаимодействия 8ТДЖ и репликационной машины методом коиммунопреципитации белков из эмбриональных экстрактов дрозофилы. Результаты данной работы указывают на возможное участие 81ДЖ в процессе ремоделинга хроматина во время репликации. Дальнейшая биохимическая проверка обнаруженных взаимодействий позволит построить конкретную модель механизма работы 81ДЖ.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - прояснить роль белка 81ЛЖ в процессе репликации у О. melanogaster через выявление белков, способных взаимодействовать с 81ЛЖ, методом двойной аффинной очистки белковых комплексов.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Создать систему экспрессии функционального химерного белка 81ДЖ-ТАР в организме и в культуре клеток дрозофилы.

2. Проверить взаимодействие 81ДЖ с РСИА, как с основной структурной компонентой репликационной машины, в эмбрионах дрозофилы.

3. Выделить комплексы белка 8ШЖ-ТАР из экстрактов культуры клеток 82 дрозофилы при помощи метода двойной аффинной очистки белковых комплексов. Идентифицировать компоненты комплекса при помощи масс-спектрометрии.

4. Проверить обнаруженные потенциальные взаимодействия SUUR генетическими методами.

Научная новизна

Создана система для выделения комплексов белка SUUR дрозофилы при помощи метода двойной аффинной очистки. Выявлены ранее не описанные взаимодействия SUUR: установлено физическое взаимодействие SUUR и PCNA (структурной основой репликационной машины) в эмбрионах дрозофилы; определены потенциальные компоненты комплексов SUUR-TAP в культуре клеток дрозофилы S2, среди которых оказались белки, участвующие в процессах регуляции клеточного цикла, репликации, репарации двуцепочечных разрывов ДНК и ремоделинга хроматина. Первичный анализ обнаруженных взаимодействий выявил генетические взаимодействия SuUR с генами Ssrpl, CGI2018 (ss Dpol 5) и hd, что позволяет предположить участие SUUR в ремоделинге хроматина во время репликации.

Научно-практическая ценность

Результаты данного исследования вносят вклад в фундаментальные знания о процессе репликации у дрозофилы и дают серьезные предпосылки для изучения роли SUUR в таких процессах, как ремоделинг хроматина, контроль репликации и репарации ДНК. В ходе работы была создана система экспрессии SUUR-ТАР и проведен ряд необходимых проверок функциональности этого химерного белка. Полученную систему можно эффективно использовать не только для дальнейшего

изучения белок-белковых взаимодействий SUUR, но и в качестве более удобного и точного инструмента для цитологического анализа функции SUUR в клетке.

Апробация работы

Результаты работы представлены на российских и международных конференциях в устных докладах: на 44-ой Международной научной студенческой конференции (Новосибирск, Россия, 2006 г.), на 1-ой Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007 г.), на 12-ой Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, Россия, 2009 г.), на 10-й Международной конференции по гетерохроматину дрозофилы (Губбио, Италия, 2011 г.); а также в стендовых сообщениях: на 1-ой Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007 г.), на 8-м Европейском симпозиуме по изучению белков (Цюрих, Швейцария, 2009 г.), на 51-ой конференции по изучению дрозофилы (Вашингтон, США, 2010 г.), на 72-м симпозиуме лаборатории Колд Спринг Харбор «Метаболизм и заболевания» (Колд Спринг Харбор, США, 2011 г.), на 3-ей конференции Европейского общества молекулярной биологии «The ЕМВО Meeting» (Вена, Австрия, 2011 г.).

Публикации

По теме исследования опубликовано 17 работ, из которых 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК и 14 тезисов конференций.

Вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Эксперименты по трансформации культуры клеток дрозофилы конструкцией SuUR-TAP были проведены при участии к.б.н. A.A. Горчакова и к.б.н. A.A. Алексеенко. Анализ локализации SUUR и PCNA на политенных хромосомах слюнных желез был проведен при участии к.б.н. Т.Д. Колесниковой. Анализ частот разломов на политенных хромосомах слюнных желез был проведен совместно с д.б.н. Е.С. Беляевой. Фракционирование экстрактов проведено при участии C.B. Кулемзина. Масс-спектрометрический анализ проводился на базе Taplin Biological Mass Spectrometry Facility (Бостон, США, https://taplin.med.harvard.edu/).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Регуляция репликации

У эукариот синтез ДНК происходит во время S-фазы клеточного цикла и этот процесс очень четко регулируется, чтобы обеспечить геномную стабильность, точную передачу генетической и эпигенетической информации (Blow, Dutta, 2005; DePamphilis et al., 2006; Groth et al., 2007).

Участки генома реплицируются в определенном порядке и по определенному расписанию (Gilbert et al., 2010). Паттерны репликации могут варьировать в зависимости от клеточного типа, что отражает различия эпигенетического состояния (Hiratani et al., 2008; Schwaiger et al., 2009).

У дрозофилы, за исключением первых делений дробления в эмбрионе, во всех типах клеток в S-фазе реализуется дифференцированная программа репликации: транскрипционно активные районы (эухроматин), как правило, реплицируются в первой половине S-фазы, а «молчащие», или репрессированные, районы (гетерохроматин) реплицируются позже (Gilbert, 2002; Hiratani et al, 2009; Shermoen et al2010; Su, 2010). В этой части литературного обзора будут рассмотрены общие принципы регуляции репликации в контексте клеточного цикла.

1.1.1. Регуляция общей продолжительности S-фазы в клеточном цикле

В клеточном цикле эукариот происходит чередование стадии деления клеток (М-фаза или митоз) и интерфазы. Интерфаза включает последовательно сменяющие друг друга стадии: стадию подготовки к репликации (Gl-фаза или gap), стадию синтеза ДНК (S-фаза) и стадию подготовки к делению (С2-фаза), где происходит контроль целостности генома после репликации и клетка исправляет обнаруженные ошибки. В клеточном цикле есть два ключевых момента контроля, когда клетка принимает решение о дальнейшем прохождении цикла (check point control). Первая точка контроля определяет переход от Gl-фазы к репликации, а вторая определяет начало митоза. Существует также внутренний контроль прохождения репликации (intra- S-phase check point control), однако, у дрозофилы он недостаточно хорошо изучен.

Переход от одной фазы клеточного цикла к другой осуществляется определенным типом белковых комплексов - это комплекс циклинов (Cyclins) и циклин-зависимых киназ (Cdk, Cyclin dependent kinases). Каждому фазовому переходу соответствует свой тип комплекса Cyclin/Cdk. Активность такого комплекса зависит от концентрации необходимого циклина и от пострансляционных модификаций циклин-зависимых киназ. После осуществления перехода комплекс специфически инактивируется протеолитической деградацией комплексами SCF (Skpl/Cullin/F-box protein) в S-фазе или АРС/С (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) в митозе (Nakayama et al., 2001).

У дрозофилы ключевым регулятором перехода G1-S является циклин Е (Cyclin Е). Циклин Е образует комплекс с Cdk2 (Cdc2c), что запускает каскад фосфорилирования, который приводит к активации транскрипционного фактора E2F1-DP. E2F1-DP запускает транскрипцию генов необходимых для нормального прохождения S-фазы (Du, 2000).

После вступления клетки в S-фазу комплекс Cyclin E/Cdk2 деградирует и происходит накопление комплекса активного Cyclin A/Cdk2. К концу S-фазы циклпн А активирует Cdkl, что служит сигналом к переходу S-G2 (Moroy, Geisen, 2004).

Продолжительность S-фазы не всегда одинакова. Так, например, у дрозофилы на ранних стадиях дробления эмбриона циклы очень короткие. При этом нет четко выраженных G1- и в2-фаз и короткие S-фазы сменяются митозами (Shermoen et al., 2010). Для такой быстрой репликации генома все ориджины репликации активируются одновременно (ориджинами репликации называются распределенные по геному специфические сайты, с которых начинается репликация ДНК). Важно отметить, что такой режим сохраняется вплоть до 10-го цикла, когда начинаются первые различия во времени репликации гетерохроматиновых районов и общее время S-фазы начинает удлиняться (Shermoen et al., 2010). К 14-му циклу, когда проходит целлюляризация, на хромосомах уже отчетливо выявляются метки репрессированного хроматина и S-фаза становится длиннее практически в 10 раз по сравнению с S-фазами стадии дробления эмбриона (Shermoen et al., 2010; Su, 2010).

Еще одним вариантом клеточного цикла с измененной продолжительностью S-фазы является цикл эндорепликации (эндоцикл).

1.1.2. Регуляция эндоциклов

В эндоциклах, в отличие от нормальных митотических клеточных циклов, S-фазы чередуются с G-фазами, клетки умножают количество своей геномной ДНК, но не происходит деления клеток (Smith, Orr-Weaver, 1991; Royzman, Orr-Weaver, 1998). Эндоциклы широко распространены у протист, растений, у многих

животных, включая артропод, моллюсков и млекопитающих, но наиболее хорошо изучены и описаны у дрозофилы. Эндоциклы дрозофилы обнаружены в таких органах и тканях, как кишечник, эпидермис, жировое тело, мальпигиевы сосуды, трахеи и слюнные железы. В некоторых клетках взрослой особи, таких как фолликулярные клетки и питающие клетки яичников, сенсорные нейроны крыла, тоже обнаружены эндоциклы.

В эмбрионах D. melanogaster при переключении с митотического цикла на эндоцикл в некоторых клетках прекращается экспрессия ге