Структурные домены белка SUUR, контролирующего позднюю репликацию политенных хромосом Drosophila melanogaster

Юрлова, Анна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурные домены белка SUUR, контролирующего позднюю репликацию политенных хромосом Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурные домены белка SUUR, контролирующего позднюю репликацию политенных хромосом Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

ЮРЛОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

Структурные домены белка 81ДШ, контролирующего позднюю репликацию политенных хромосом ВгояорИИа melanogasíer

Молекулярная генетика - 03.01.07

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004Ь

3-У? <

-2 "ЕК 2010

Новосибирск - 2010

004615397

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск и в группе геномики Учреждения Российской академии наук Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель:

академик РАН, доктор биологических наук профессор Жимулёв ИгорьФедорович Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Омельянчук Леонид Владимирович Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук Елисафенко Евгений Анатольевич Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт Биологии Гена РАН, г. Москва

Защита состоится «_3_» декабря_ 2010 г._ на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.045.02) в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8. e-mail: kokoza@mcb.tisc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «октября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.Б. Кокоза

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Время репликации ДНК в S-фазе клеточного цикла обычно коррелирует с транскрипционной активностью генов из соответствующих районов (Hagele, 1973; Schubeler et al., 2002; MacAlpine et al., 2004; Donaldson, 2005). Как правило, поздняя репликация наблюдается в транскригщионно неактивных районах хромосом, в большинстве случаев представленных прицентромерным гетерохроматином (ПГХ), которые находятся в конденсированном состоянии в интерфазных хромосомах. К поздно реплицирующимся районам относятся также и протяженные участки эухроматина (ЭХ) размером около 200-1000 т.п.н. (White et al., 2004).

У D. melanogaster процесс поздней репликации удобно изучать на политенных хромосомах слюнных желез, образующихся во время модифицированного клеточного цикла - эндоцикла. При эндорепликации отсутствует митоз, и G-фаза следующего цикла начинается до того, как успевает завершиться S-фаза предыдущего, поэтому многие поздно реплицирующиеся последовательности не успевают завершить репликацию к концу каждого эндоцикла и остаются недореплицированными (Gall et al., 1971; Smith and Orr-Weaver, 1991; Lilly and Spradling, 1996). Кроме районов прицентромерного гетерохроматина, есть еще около 240 районов, разбросанных по эухроматиновым плечам хромосом, в которых наблюдается поздняя репликация и часто недорепликация. Эти районы характеризуются не только поздней репликацией, но и некоторыми другими признаками, свойственными гетерохроматину, - это компактное состояние и низкий ровень транскрипции (Zhimulev et al., 2003b). Для таких районов введен ермин интеркалярный гетерохроматин (ИГХ).

Недорепликация в большой степени определяется, продуктом гена SuUR ,Suppressor of Underreplication), который кодирует белок, специфически вязывающийся с районами ПГХ и ИГХ на политенных хромосомах люнных желез личинок конца третьего возраста (Makunin et al., 2002; himulev et al., 2003b). У мутантов по гену SuUR (линия StiUR^) изменяется ремя репликации ДНК в поздно реплицирующихся районах - она аканчивается раньше, чем у мух дикого типа, поэтому уровень олитенизации в районах ИГХ становится таким же, как и в ЭХ районах, роме того, происходит увеличение уровня политенизации многих оследователыюстей из района ПГХ, что сопровождается появлением ополнительного структурированного материала в районе хромоцентра Belyaeva et al., 1998). В свою очередь увеличение доз гена SuUR приводит к величению уровня недорепликации в районах ИГХ (Zhimulev et al., 2003а; elyakin et al., 2005).

Поскольку SuUR на сегодняшний день является единственным звестным геном, способным оказывать влияние на время репликации и едорепликацию в ПГХ и ИГХ политенных хромосом слюнных желез D. elanogaster, было бы интересно понять, в каких еще клетках он работает, у аких видов присутствует и насколько консервативен. Еще один вопрос,

требующий ответа, - это механизм действия гена SnUR; отправной точкой в этом вопросе может служить изучение контроля экспрессии гена.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было изучение влияния белка SUUR и его мутантных форм на процесс репликации ДНК, поиск функционально-значимых районов в белке. Для достижения этих целей были сформулированы следующие задачи:

• Провести детальный молекулярный анализ мутации ShURes

• Провести эволюционный анализ гена SuUR

• Установить связь ортологов SUUR с процессом недорепликации ДНК

• Выявить консервативные районы в белке, получить точечные мутации

в них, проверить влияние полученных мутаций на свойства белка.

• Исследовать влияние SUUR на процессы репликации ДНК в

фолликулярных клетках ооцитов.

Научная новизна. В настоящей работе установлено, что в мутантной линии SuUR™ присутствует два фрагмента РНК SuUR: один до места встройки транспозона, другой - после него. Впервые выявлено, что эктопическая экспрессия SUUR в фолликулярных клетках приводит к стерильности самок, причиной которой является подавление амплификации хорионовых генов. Эволюционный анализ гена SuUR у насекомых показал, что он выявляется только у двукрылых, а белок SUUR принадлежит к группе быстро эволюционирующих белков. Впервые показано, что uORF (upstream Open Reading Frame) SuUR, находящаяся в 5'UTR гена, является более консервативной по сравнению с ORF основного белка SUUR. На основании эволюционного анализа белка SUUR 11 видов рода Drosophila в нем определены консервативные участки, получены точечные направленные мутации в двух консервативных районах, на N- и С- конце белка, проведен анализ их влияния на функцию SUUR.

Положения, выносимые на защиту. На защиту выдвигаются представления о белке SUUR как быстро эволюционирующем, но сохраняющем высокую консервативность в N- и С-концевых участках, а также в uORF, обнаруженной в 5'UTR гена. Функциональная значимость консервативных районов подтверждается с помощью направленных мутаций в N-концевом домене, которые приводят к ослаблению эффектов белка SUUR на процесс репликации и структуру хромосом.

Практическая ценность. Показано, что продукт гена SuUR может влиять на процессы репликации ДНК не только в слюнной железе, но и в фолликулярных клетках яичников. Проведенный анализ белка SUUR позволил выявить эволюционную консервативность его структурно-функциональных доменов. Данные о структуре продукта гена SuUR будут использованы для дальнейшего получения функционально значимых мутаций. Выявление высоко консервативной uORP в 5'UTR SuUR служит базой для изучения механизмов контроля трансляции гена.

Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде постеров на: 45-ой международной конференции по исследованию

дрозофилы (Вашингтон, США, 2004); конференции ЕМБО/ФЕБС по структуре и динамике ядра (Ля Гранд Мот, Франция, 2005); на VIII европейском симпозиуме по изучению белков (Цюрих, Швейцария, 2009); конференции «Контроль экспрессии генов и рак» (Москва, Россия 2010), а также в виде докладов на: 3-й международной конференции «Биоинформатика регуляции и структуры генома» (Новосибирск, Россия, 2002); международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, Россия, 2009).

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа по окраске политенных хромосом выполнена совместно с Т.Д. Колесниковой, клонирование и секвенировани гена SuUR у D. erecta проведено совместно с И.В. Макуниным. Анализ разломов на политенных хромосомах слюнных желез проводили совместно е Е.С. Беляевой.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в которые входит 161 ссылка. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 22 рисунка и приложение на 5 страницах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии мух. Использованные в работе линии мух описаны в справочнике Lindsley, Zimm, 1992, в базе данных FlyBase (flybase.bio.indiana.edu/), а также в стьатьях Belyaeva et al., 1998; Makunin et al., 2002; Yurlova et al., 2009.

Работа с нуклеиновыми кислотами. Все эксперименты, связанные с выделением и анализом нуклеиновых кислот, проводили с использованием методов описанных в руководстве (Sambrook and Russell, 2001) или в соответсвии с рекомендациями фирм-производителей Qiagen, Promega и др.

Работа с бактериями и плазмидами. Работу с бактериями и плазмидами проводили по стандартным протоколам, описанным в сборниках (Маниатис и др., 1984; Мазин и др., 1990), с небольшими модификациями. Конструкции, содержащие точечные замены, были получены ПЦР-опосредованным мутагенезом (Intine andNazar, 1998).

Работа с белками. При иммуноокрашивании политенных хромосом следовали рекомендациям, изложенным в статье Pile and Wassarman (2002), при Вестерн-блот гибридизации - рекомендациям фирмы Amersham.

Компьютерный анализ данных. Для выявления экзон-интронной структуры использовали BLAT. При анализе белков использовали программы: ClustalW, K-Estimator, SAPS, MotifScan, Predict Protein.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика мутации Sul/R1^

Открытие у D. melanogaster Е.С. Беляевой в 1998 мутации SuUR™ дало широкие возможности для изучения структуры и состава

гетерохроматиновых районов, посколько в мутантной линии районы ИГХ практически полностью политенизируются, а район хромоцентра становится более структурированным. Мутация SuUR^ не вызывает летальности, она возникла в результате инсерции ретротранспозона diver (размером около 6 т.п.н.) в 4 экзон гена (Kolesnikova et al., 2006). При проведении Нозерн-блот гибридизации в линии SuURIй продукт гена SuUR не выявляется (Makunin et al., 2002). Для проверки этих данных мы применили более чувствительный метод ОТ-ПЦР, для которого была использована РНК, выделенная из яичников линии w; ru h SuUR£S. Было показано наличие кДНК-ового продукта до встройки транспозона, сплайсированного как и нормальная кДНК SuUR, а также присутствие кДНК SuUR после встройки транспозона. С использованием различных комбинаций праймеров из транспозона и из гена было показано, что как с 5'-, так и с З'-конца гена образуется гибридная кДНК, состоящая из гена и транспозона. Через 100-200 п.н. от начала встройки кДНК обрывается, кДНК, которая образуется с З'-конца, начинается во встройке и идет дальше в ген. Таким образом, в линии SuUlfs присутствуют 2 фрагмента мРНК SuUR, перекрывающие всю мРНК этого гена. Можно предположить, что продукт после встройки ретротранспозона нарабатывается с LTR промотора ретротранспозона. У D. melanogaster количество ретротранспозонов в эухроматиновой части генома намного меньше, чем в известных геномах млекопитающих, но при этом у нее наблюдается большое разнообразие мобильных элементов, среди которых LTR ретротранспозоны являются наиболее представленной группой (Kaminker et al., 2002). Более того, в геноме дрозофилы значительная часть мобильных элементов транскрибируется (Deloger et al., 2009). К сожалению, на вопрос, образуется ли с этой РНК белковый продукт, имеющиеся у нас в наличии антитела не позволяют ответить.

2. Обнаружение гена SuUR у других видов, его эволюционная характеристика

Ранее проведенный поиск по базам данных не выявил гомологов гена SuUR у других организмов (Makunin et al., 2002). При in situ гибридизации фрагмента кДНК SuUR на политенные хромосомы и при Саузерн-блот гибридизации геномной ДНК разных видов дрозофилы с кДНК гена SuUR сигнал был выявлен только у видов подгруппы melanogaster, наиболее отдаленным из которых был D. erecta (Рис. 1А). Мы амплифицировали и определили последовательность геномной ДНК и кДНК SuUR для D. erecta, что позволило установить экзон-интронную структуру. Сайты сплайсинга оказались консервативны между D. melanogaster и D. erecta. Также мы использовали предсказанные последовательности для гена SuUR тех видов, чьи геномы доступны на сайте UCSC Genome Browser: D. simulons, D. sechellia, D. yakuba, D. ananassae, D. pseudoobscura, D. persimilis, D. mojavensis, D. virilis и D. grimshawi (Рис. 1A). Во время работы мы столкнулись с тем, что структура гена SuUR для пяти видов дрозофилы из

девяти отличается в предсказаниях, выполненных разными программами. Для этих видов мы наработали кДНК 5н£/Д и определили экзон-интронную структуру или использовали аннотацию близкородственных видов.

-/У

Drosophila

lila i L

Sophophofa

0.05

A gambiae

-D. mo/avensis ;

- O. vlrilis 4 -■ 0. grimshawi

■ O.persimilis

■ D. pseudoobscura - D. ananassae

D. erecta D. yakuba D. sechellli simulaos '-D. melanogaster

732 -11 61,0

1035 ♦39 114,8

1024 ♦45 114,3

1014 ♦43 112,6

969 +38 110,7

986 ♦41 110,4

959 +34 107,6

962 +46 107.5

965 ♦40 107,5

957 ♦42 107.1

954 ♦44 106,9

962 ♦45 107,6

Рисунок 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа белка SUUR (А), и основные свойства белка у каждого вида (Б). Пунктирным квадратом выделены виды подгруппы melanogaster.

У других видов ген SuUR не аннотирован. Однако поиск по BLAST выявил слабое сходство белка SUUR с белком ENSANGP00000027713.1 комара A. gambiae (мРНК AGAP005819, координаты chr2L:21,832,968-21,835,239, AgamP3 genome assembly). Но гомология очень слабая, около 25% (E-value 7е'6), и ограничивается N-концевой частью (ак 51-276), остальная часть белка сильно изменена, что делает сравнение полноразмерных белков невозможным. При этом белок комара короче, чем белок SUUR дрозофилы, в его средней части отсутствуют заряженные кластеры, а суммарный заряд -11, тогда как у разных видов дрозофилы около +40; в 5'UTR гена, кодирующего белок ENSANGP00000027713.1, не обнаружено uORF. Одним из аргументов в пользу того, что белок ENSANGP000000027713 у A. gambiae - это сильно мутировавший гомолог SUUR, является то, что у D. melanogaster за З'-концом гена SuUR находится ген CG63I0, аналогично у комара за З'-концом ENSANGP00000027713 находится ген ENSANGT00000010378.2 (координаты: chr2L:21,835,318-21,836,802 AgamP3 genome assembly), гомолог CG6310. В свою очередь, поиск по BLAST комариного белка против транслированных ДНК-последовательностей (tBLASTp) выявил с высоким уровнем достоверности (Е value е"25 and е"22) гомологов у комара желтой лихорадки (Aedes aegypti) и южного домашнего комара (Culex quinquefasciatus). У других насекомых, не относящихся к двукрылым, чьи геномы секвенированы, ортолога SUUR найдено не было. Поиск по BLAST белка SUUR некоторых видов Drosophila

и Anopheles выявил также белок млекопитающих ERCC6, который нужен при восстановлении парных разрывов во время транскрипции (Troelstra et al., 1992). Мутации в ERCC6 приводят к синдрому Коккэйна, проявляющемся в атрофии зрительных нервов, глухоте и умственной отсталости (Mallery et al., 1998; Laugel et al., 2008).

3. Эволюционная характеристика консервативной uORF

При сравнении геномной ДНК SuUR D. melanogaster с геномной ДНК других видов Drosophila оказалось, что 5'UTR гена, где предположительно находится uORF, высококонсервативна. Характер замен в этой области соответствует расположению замен в кодирующей части - трехбуквенные делеции и инсерции, замены нуклеотидов по третьей позиции. У разных видов длина предсказанного белка из 5' UTR гена SuUR варьирует от 62 ак у D. mojavensis до 72 ак у D. erecta (у D. melanogaster 68 ак), у всех у них также есть 3 или 4 вложенные более короткие uORF. Для многих организмов (млекопитающие, растения, дрожжи) показана регуляция трансляции с основной рамки считывания за счет uORF. Для D. melanogaster на основании сравнительного анализа геномов 12 видов дрозофилы предсказано лишь 44 гена с консервативными uORF (Hayden and Bosco, 2008).

Для всех 11 видов дрозофилы было проведено попарное выравнивание самого длинного белка из uORF и подсчет числа идентичных аминокислот в нем. Для D. melanogaster, D. simulons и D. yakuba идентичность составляет 100%, это особенно интересно на фоне того, что сам белок SUUR не является консервативным. Если степень идентичности между видами D. melanogaster и D. ananassae для белка SUUR составляет 66,2%, то для uORF эта идентичность 76,5%. Размер межцистронного пространства варьирует у разных видов, от 6 п.н. у D. erecta до 56 п.н. у D. virílis, для D. melanogaster, D. simulons и D. yakuba оно составляет 20 п.н. Длина uORF и межцистронное пространство являются основными параметрами, от которых зависит эффективность реинициации на основной ORF. У гена SuUR эти величины являются средними. Предположительно, контроль уровня экспрессии белка SUUR при помощи uORF может объяснить то, что этот белок присутствует в организме дрозофилы в небольшом количестве.

4. Выявление белка SUUR у других видов дрозофилы

У большинства видов Drosophila на давленых препаратах политенных хромосом слюнных желез присутствуют разломы и слабые точки (Zhimulev, 1998). Это может указывать на то, что в этих районах существует недорепликация и на возможную роль гена SuUR в осуществлении этого процесса. Вестерн-блот анализом было показано наличие белка SUUR у 1-24 часовых эмбрионов эволюционно близкого к D. melanogaster вида D. simulons и отдаленного вида D. ananassae. В качестве контроля использовали линию heat shock SUUR (Н7-Х\ Н7-3), в которой наблюдается мажорный сайт около 130 кДа. Необходимо отметить, что кроме мажорного сайта на

вестерне присутствуют дополнительные слабые сигналы меньшего размера, которые, скорее всего, являются деградированными формами белка. | Согласно ранее полученным данным (Makunin et al., 2002), в С-части белка находятся последовательности, обеспечивающие нестабильность белка.

Локализовать белок SUUR на лолитенных хромосомах слюнных желез личинок третьего возраста нескольких представителей рода Drosophila методом иммуноокрашивания нам не удалось, несмотря на то, что для этого были получены и использованы антитела на наиболее консервативную N-концевую часть (ак 1-197) белка (Рис. 3). Отсутствие белка SUUR на хромосомах других видов представляется достаточно странным, поскольку у D. melanogaster разломы в районах ИГХ связаны именно с недорепликацией ДНК в этих районах, вызванной наличием там белка SUUR (Belyaeva et al., 1998; Makunin et al., 2002; Zhimulev et al., 2000). Можно предположить, что связывание белка с политенными хромосомами слюнных желез других видов ' менее стабильно, т.к. в ядрах фолликулярных клеток в области хромоцентра SUUR выявляется на давленых препаратах как из яичников D. melanogaster, так и D. simulons, в то время как в мутантной линии SuURes сигнала не наблюдается (Рис. 2).

SuUReS __Oregon-R __О. simulans

А у " Б ' Фь. ■ ■ iM ■"ïy в ,ч /

г ' ^f 'i д ..v \ ... Е

Рисунок 2. Иммунодетекция белка SUUR в фолликулярных клетках овариев. А, Г - SuUFc ; Б, Д - D. melanogaster (Огедоп-R); В, Е -D. simulans; А, Б, В - иммуноокрашивание антителами Е45 к белку SUUR; Г, Д, Е -окраска Хёкстом. В линии с мутацией SuUFf8 белок в фолликулярных клетках овариев не выявляется. Стрелкой обозначен хромоцентр (хр).

Для подтверждения влияния SUUR на недорепликацию ДНК у D. simulans, самки линии ABl-GAL4>{JAS-SuURi^ss, которая гомозиготна по драйверу, активному в слюнных железах с раннего развития, и по трансгену, экспрессирующему N-концевой фрагмент SUURM8s, были скрещены с самцами D. simulans. Этот фрагмент (SUURM85) обладает доминантно-

негативным эффектом при экспрессии в слюнных железах с раннего развития (под драйвером ABl) на фоне нормального SUUR, что проявляется в возникновении фенотипа SuURes, а именно полного исчезновения разломов на хромосомах (Kolesnikova et al., 2005). Его экспрессия под драйвером АВ1-GAL4 у гибридов D. melanogaster х D. simulans приводит также к исчезновению разломов на обоих гомологах. Это является свидетельством того, что разломы у этих двух видов появляются вследствие одинакового механизма, в котором задействован белок SUUR.

5. Эволюционный анализ белка SUUR у дрозофилы, скорость замен в белке

С целью выявления консервативных районов в белке было проведено сравнение ортологов SUUR 11 видов Drosophila, которое выявило большое количество аминокислотных замен, делеций и инсерций даже у эволюционно близких видов. Чтобы узнать скорость замен в гене SuUR, было посчитано количество синонимичных (Ks) и несинонимичных замен (Ка) на сайт (кодон) для видов подгруппы melanogaster при использовании пакета программ K-Estimator (Comeron, 1999). Из анализа были исключены отдаленные виды из-за неоднозначности в выравнивании, особенно в средней части белка. Количество н¿синонимичных замен на сайт в гене SuUR между D. melanogaster и D.yakuba составляет 0.052, что очень близко к тому значению Ка, которое характеризует быстро эволюционирующие гены (Schmid and Tautz, 1997). Соотношение количества синонимичных и несинонимичных замен (Ka/Ks) в белке SUUR варьирует от 0,16 до 0,23 внутри подгруппы melanogaster. Значение Ka/Ks для ортологов D. melanogaster и D. simulans равное 0,16 позволяет предположить, что около половины из 1850 дрозофила-специфических белков эволюционируют под ббльшим давлением отбора, чем SUUR (Zhang et al., 2007). В этой же работе показано, что дрозофила-специфические белки подвержены меньшему давлению отбора, по сравнению с белками, у которых есть ортологи в отдаленных видах.

Необходимо отметить, что, несмотря на столь высокую скорость замен, размер и заряд белка SUUR сохраняются практически неизменными в ходе эволюции (Рис. 1). Предсказание вторичной структуры белка, сделанное программой Protein Prediction для двух наиболее эволюционно отдаленных видов D. melanogaster и D. grimshawi, очень сходно. Филогенетическое дерево, построенное для белка SUUR в общем соответствует дереву, полученному на основании анализа всего генома (Stark et al., 2007): D. yakuba и D. erecta группируются вместе, а ветка с D. pseudoobscura короче (Рис. 1).

Сами замены в белке распределены неравномерно (Рис. ЗА). Наиболее консервативным является N-конец SUUR, он содержит минимальное количество замен, в нем отсутствуют делеции и инсерции даже у отдаленных видов дрозофилы. Средняя часть белка SUUR: (у D. melanogaster она представлена ак 280-581), в которой находятся отрицательно и положительно

заряженные кластеры (Рис. 3), является наименее консервативной. У двух эволюционно отдаленных видов О. пкуауеп.ч^х и О. \nrilis, кроме замен в этом районе появились большие инсерции. Важно отметить, что, несмотря на столь высокий уровень замен в первичной структуре этого района, касающихся, в том числе, и заряженных аминокислот, большая часть которых не является консервативными сама по себе, отрицательно и положительно заряженные кластеры у всех проанализированных видов дрозофилы сохраняются. Возможно, это связано с тем, что именно заряд, а не аминокислотная последовательность в этом районе важны для функционирования белка.

SemSem Е45

Б 28-253 271-362 372-580 Э62

€i'e B1 f DFFE-

DSDE-

, Рисунок 3. Эволюционно консервативные домены белка SUUR. А -профиль консервативности, основанный на анализе последовательности белка SUUR 11 видов дрозофилы; прямой линией отмечены фрагменты, против которых были получены поликлональные антитела Е45 и SemSem. Б - доменная организация белка, «SNF-like» - район с гомологией к АТФ-I азному домену, «- -» - отрицательно заряженный кластер, «+ +» -положительно заряженный кластер, NLS - сигналы ядерной локализации. В , - положение точечных мутаций в N- и С-концах белка; на рисунке отмечены j аминокислоты, которые были заменены.

А. В. Пиндюрин с соавторами показали, что в дрожжевой двугибридной системе фрагмент белка SUUR (ак 339-671), большей частью перекрывающийся с заряженным районом, способен взаимодействовать с I другим гетерохроматиновым белком НР1 (Рис. 7 Д) (Pindyurin et al., 2008). Оказалось, что этот район очень быстро эволюционирует. Даже предположительная последовательность, которая имеет гомологию к 1 пентануклеотиду, отвечающему за связывание с НР1 (LRVSL, ак 429-433), остается неизменной только у двух видов дрозофилы - D. yakuba и D. erecta, у остальных она сильно изменена. Поиск в SUUR известных белковых I мотивов, проведенный с использованием программ PredictProtein и MotifScan, выявил в средней части белка сигналы ядерной локализации I или

II типа для всех видов кроме D. mojavensis. Также в средней части белка для 5 видов от D. melanogaster до D. ananassae был предсказан AT-hook мотив.

В С-концевой части белка не было обнаружено известных мотивов, хотя она и является более консервативной, чем средняя часть.

6. Получение точечных мутаций в консервативных районах белка SUUR

На основании результатов множественного выравнивания SUUR были получены точечные замены консервативных аминокислот в двух районах белка SUUR D. melanogaster. В наиболее консервативной N-концевой части я заменила L57 на R57 и G58 на R58, получив белок, в дальнейшем упоминаемый как SUURNmut (Рис. 3 В). Эти две аминокислоты находятся внутри района с гомологией к мотиву Walker А белков группы SW12/SNF2. Мотивы Walker А и В образуют АТФ-связывающий карман, поэтому они высоко консервативны. Несмотря на то, что на сегодняшний день нет экспериментальных данных, показывающих, что SUUR может связывать АТФ, было показано, что эктопическая экспрессия N-концевых фрагментов SUUR способна вызывать доминантно-негативный эффект и удалять эндогенный белок с политенных хромосом слюнных желез (Kolesnikova et al., 2005). Это дает возможность предположить, что в N-конце SUUR может быть заложена структурная или каталитическая функция.

Ранее было показано, что при эктопической экспрессии укороченного фрагмента белка - SUUR1.779 не происходит подавления эндорепликации и возникновения недорепликации в слюнных железах (Kolesnikova et al., 2005); скорее всего это связано с тем, что тот домен белка, который приводит к возникновению недорепликации, находится за пределами фрагмента SUURl-779- Был выбран один из консервативных участков в С-конце белка, в нем заменили две ароматических ак F816 и F817 на маленькие ак S816 и D817, получив, таким образом, SUURcmut-

Конструкции, содержащие мутированную кДНК SuUR в векторе для pUAST, были секвенированы и трансформированы в эмбрионов линии у w вместе с источником транспозазы рте 25.7 wc (так же, как это было ранее сделано для немутированной кДНК SuUR). Несколько независимых трансгенных линий были получены для каждой конструкции.

7. Белок SUUR подавляет амплификацию кластера хорионовых генов в фолликулярных (слетках

Большое количество работ, посвященных белку SUUR, было проведено с использованием системы эктопической экспрессии UAS-GAL4 (Brand and Perrimon, 1993). Например, было показно, что белок SUUR подавляет политенизацию в районах прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина политенных хромосом слюнных желез D. melanogaster, приводя к недорепликации и разломам в этих районах. По-видимому, уменьшение размера слюнных желез при эктопической экспрессии в них SUUR с ранних стадий эмбриогенеза также вызвано влиянием белка на

репликацию во время эндоцикла. Также было выявлено, что эктопическая экспрессия SUUR в фолликулярных клетках яичников приводит к стерильности самок, что может быть вызвано нарушением амплификации хорионовых генов.

Для экспрессии UAS-SitUR в фолликулярных клетках был использован драйвер c323-GMA, экспрессирующий GAL4 активатор с 6 стадии развития овария до того, как начинается амплификация хорионовых генов (Manseau et al., 1997). Большая часть мух с525-GAL4>IJAS-SuUR погибала на стадии личинки, а выжившие взрослые самки были стерильны. Некоторые из них откладывали редкие яйца с сильно разрушенной хорионовой оболочкой или без нее. В работах Спрадлинга с соавторами (Lilly and Spradling, i 996) было показано, что отсутствие хорионовой оболочки на яйце может быть вызван нарушением амплификации хорионовых генов. Одна из линий, содержащих \JAS-SulJR инсерцию, - F9-F9-2 демонстрировала максимальное количество выживших самок при скрещивании с драйверной линией C323-GAL4, она и была использована при проведении последующих экспериментов по выявлению причины стерильности.

А 1 2 3 в 12 3

* . ,* » " ■r:. , '¡¿МШь--" ■

ДМ"** миму {} А^дб

rosy „ лвет»» • rosy • Щф

Рисунок 4. Эктопическая экспрессия UAS-SuUR в фолликулярных клетках подавляет амплификацию хорионовых генов. Количественная Саузерн-блот гибридизация. А - геномная ДНК, выделенная из фолликулярных клеток яйцевых камер на стадии 10В линии Oregon R (1), c323-GAL4 >UAS-SuilR (2) и имагинальных дисков линии Oregon R (3), была гибридизована с фрагментом хорионового гена Ср 15 (chorion). Б - результаты аналогичной гибридизации с фолликулярными клетками со стадий 11-14.

Для оценки влияния эктопической экспресси SUUR в фолликулярных клетках на амплификацию хорионовых генов методом количественной Саузерн-блот гибридизации было проведено измерение уровня амплификации ДНК в районе хорионового локуса на 3 хромосоме (66D) в фолликулярных клетках самок. Измерения проводились на двух стадиях: ЮВ |н 11-14. В качестве зондов были использованы: фрагмент из района хорионового локуса 66D, в котором хорионовые гены амгошфицируются в 60-80 раз (Calvi et al. 1998), и ген rosy (87D9), который не подвергается амплификации. Нормировка проводилась по диплоидным клеткам имагинальных дисков (Рис. 4). Было показано, что на стадии 10В в линии

Oregon-R уровень амплификации ДНК хорионовых генов (chorion) в 9 раз выше, чем у гена rosy, не подвергающегося амплификации, в то время как для самок c323-GAL4>UAS-5,«i//f это значение равно 1,1. На стадиях 11-14 уровень амплификации хорионовых генов составлял 26 для линии Oregon-R и 3 для мух c323-GAL4>UAS-SuUR. Итак, эктопическая экспрессия SUUR в фолликулярных клетках подавляет амплификацию хорионовых генов уже на стадии 10В, в то время, когда у мух дикого типа в хорионовом локусе на хромосоме 3 она только начинается, но не ингибирует ее полностью, так как в яйцевых камерах C323-GAL4>UAS-5«i/7? уровень амплификации хорионовых генов увеличивается от 1,1 на стадии 10В до 3 на стадиях 11-14.

8. Влияние замен в белке SUUR на эндорепликацшо и амплификацию хорионовых генов

Как было сказано выше, для каждой конструкции было синтезировано несколько независимых линий. Для конструкции UAS-SuUR^mM было получено более 10 линий, содержащих встройки во 2-ю, в 3-ю и в Х-хромосому. Мы выбрали три линии, содержащие встройку во 2-ю хромосому и ввели мутацию SuURes в 3-ю хромосому. Для конструкции UAS-SuURCmat было получено 3 независимые линии, две из них содержали встройку во 2-ю хромосому и одна в 3-ю. Эффекты введенных точечных мутаций в белок SUUR были протестированы в системе эктопической экспрессии (/AS-GALA по тому же принципу, что и сам SUUR.

Постоянная сильная экспрессия белка SUUR с ранних стадий развития в слюнных железах под контролем драйвера AB/-CAL4 приводит к супрессии эвдорепликации и маленькой слюнной железе (Volkova et al., 2003). Экспрессия SUURNmut под контролем АВ1-GAL4 вызывает лишь частичное подавление недорепликации: у личинок /i/i/-GAL4>UAS-5i<WiNmut ядра слюнных желез были больше, чем ядра у личинок /iS/-GAL4>UAS-SuUR с эктопической экспрессией нормального белка, , но меньше чем ядра слюнных желез линии дикого типа Oregon R (Рис. 5). Было проверено четыре независимых линии, несущих трансген UAS-SuURNmllb которые оказывали сходный эффект на эндорепликацию в ядрах слюнных желез.

Эктопическая экспрессия UAS-SttUR в фолликулярных клетках под контролем драйвера CJ23-GAL4 вызывает полную стерильность самок за счет подавления амплификации хорионовых генов (Volkova et al., 2003). Эктопическая экспрессия SUURfjmut при этих же условиях вызывает неполную стерильность у самок: было поставлено около 30 скрещиваний, в которых проанализировали 10 линий, в двух скрещиваниях (в разных линиях) появлялись одиночные потомки.

Мутация в N-конце белка вызвала ослабление еще одного эктопического свойства SUUR. При повсеместной экспрессии SUURNraut в 4 из 10 проанализированных линий ito-GAL4>UAS-5'«(//?Nmu, в потомстве появлялись взрослые единичные самки, тогда как повсеместная экспрессия SUUR приводила к гибели всех потомков на 1-2 личиночной стадии.

Рисунок 5. Влияние точечных замен в белке SUUR на его способность супрессировать политенизацию при сверхэкспрессии с ранних стадий развития. Ядра слюнных желез (СЖ) и жирового тела (ЖТ) были окрашены DAPI и сняты при одном увеличении. А-В -Oregon R. Эктопическая экспрессия SUUR в СЖ под контролем драйвера AB1-G AL4 вызывает супрессию полите-низации, что приводит к образованию миниатюрной СЖ (Г), размер ядер в которой намного меньше размера ядер ЖТ (Е) и ядер СЖ дикого типа (Б). Эктопическая экспрессия SUURNmut под драйвером АВ1-GAL4 приводит к частичному подавлению политенизации (Ж). Ядра СЖ у личнок АВ1-GAL4 >UAS-SuUR/to,«, (3) больше, чем у личинок AB1-GAL4>\JAS-SuUR (Д), они такого же размера, как и ядра ЖТ (И).

Действие эктопической экспресии белка SUURcmu не отличается от действия полноразмерного SUUR (К-М).

Что касается белка SUURcmut, наша надежда попасть в функционально значимые аминокислоты, замена которых оказала бы влияние на способность белка влиять на репликацию ДНК, не оправдалась. Сверхэкспрессия SUURcmut под контролем драйвера АВ1-GAL4 приводит к образованию миниатюрной слюнной железы (так же, как и в случае с нормальным SUUR) (Рис. 5 К-М). Эктопическая экспрессия SUURCmut под контролем C523-GAL4 вызывает полную (100%) стерильность у самок. Таким образом, мутации в С-конце SUUR не нарушили способность белка влиять на эндорепликацию в слюнных железах и подавлять амплификацию хорионовых генов в фолликулярных клетках при его эктопической экспрессии.

9. Влияние мутаций на способность белка связываться с хромосомами и изменять структуру хроматина

На хромосомах личинок дикого типа белок SUUR выявляется в поздно реплицирующихся районах. Такую же картину связывания можно наблюдать при слабой мозаичной сверхэкспрессии белка, запускаемой драйвером агт-GAL4. У личинок arm-GAL4>UAS-SuUR; SuURes приблизительно в 20% ядер на политенных хромосомах в районах ИГХ есть разломы, и картина связывания белка с хромосомами соответствует той, которую мы наблюдаем

Слюнные железы Ядра слюнных Ядра

**» • сж- • • * % ■■ X % « * *: * M i s Q

'' * .¿V хт ' | '¡г * д ■ ЦР Е

■ г i ' ' . - " S * ж „--'еж;;.'- , ;л С- ЩЩГ И

- ЖТ ' . ir-cm , i ~ - . М ш ' : it9 ■ #

К /^V«" • т., * ' yt * л м

в ядрах слюнных желез личинок дикого типа (Коквшкоуа й а1., 2005). Это удобная система для экспрессии белка в количестве, близком к тому, которое есть в личинках дикого типа. При сверхэкспрессии 8и1ЖМтц, в этой системе, белка на хромосомах личинок агт-САЫ>\)А$-8и1Шти1; ни в

районах ИГХ и ПГХ, ни в каких-либо других районах выявить не удается. Слабые точки на хромосомах также полностью отсутствуют.

, Ш. :■ .. 2, <? А \ в

Рисунок 6. В белке 81Л1^ти( способность специфически связываться с хромосомами при сверхэкспрессии под контролем драйвера ослабевает. А - на политенных хромосомах 5д53-СА1_4>11А8-5и1/Я; БиС/Р^5 белок выявляется практически во всех дисках, Б - на хромосомах 5дяЗ-СА14>иАЭ-5иБиС/Я" интенивность связывания мутантного белка по дискам заметно слабее. Фотографии сделаны при одинаковой выдержке.

Для того, что бы ответить на вопрос о том, способен ли вообще белок ЗиШм™, связываться с хромосомами, был использован более сильный драйвер, активный в слюнной железе, 5^лЗ-ОАЬ4, который начинает работать с середины третьей личиночной стадии, когда репликация в слюнных железах уже в основном завершена. На хромосомах давленных препаратов личинок %уЗ-ОАЬ4>иА8-.5и[/Л; 5м{/Лв присутствует четкий сигнал во всех дисках и в хромоцентре (Рис. 6 А), что же касается хромосом личинок А Ь4> \JAS-Su ЗиСК^, сигнал также присутствует по

дискам и в хромоцентре, но он довольно слабый и нечеткий, размытый (так, как будто он еще фоном присутствует и в междисках) (Рис. 6 Б). Таким образом, мутации, повреждающие N-конец белка, сильно ослабляют его связывание с хромосомами. Эктопическая экспрессия белка 81 Л!К под драйвером SgsЗ-ClA Ь4 вызывает еще одно интересное свойство - в районах ИГХ политенных хромосом слюнных желез образуются специфические вздутия - «пузыри» (гЫггш1еу е! а1., 2003с). Эктопическая экспрессия белка 8иикКпш( при тех же условиях не приводит к появлению «пузырей» или каких-либо других видимых структурных изменений.

Итак, несмотря на то, что 8иШ попадает в класс быстро эволюционирующих белков и что за пределами двукрылых его гомологи не были обнаружены, в нем можно обозначить несколько высоко консервативных районов и отметить сохранение доменной структуры у представителей рода ОговорЬНа. Замена двух консервативных аминокислот в мотиве с гомологией к АТФ-азному домену, приводящая к такому же эффекту в системе эктопической экспрессии, как и удаление всей 1М-концевой половины белка (ак 1-494), указывает на функциональную значимость этого

Рисунок 7. Белок БииЯ и его мутантные формы, протестированные в системе оверэкспрессии. А - попноразмерный белок виия, Б - мутантные формы белка с заменами аминокислот в консервативных районах, В - укороченные фрагменты белка, полученные ЕМЗ-мутагенезом (Кйеэшкоуа е! а1, 2005), Г - С-концевые фрагменты белка (Ко1езп1коуа е( а1„ 2005), Д - фрагмент белка, для которого показано связывание с НР1 в дрожжевой двугибридной системе (РМуиппе(а!., 2008). Справа представлена таблица с описанием эффектов, которые могут вызывать представленные фрагменты при оверэкспрессии в различных тканях. * - е районах прицентро-мерного и мнтеркалярного ГХ наблюдается сигнал в виде гранул. НД - нет данных.

мотива (Рис. 7). Наличие у гена SitUR uORF, более консервативной чем ORF самого SUUR, на фоне отсутствия в промоторной области известных регуляторных элементов, дает новые возможности для изучения регуляции этого гена.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ белка SUUR 11 видов рода Drosophila показал, что он содержит большое количество делеций и инсерций; соотношение числа синонимичных и несинонимичных замен позволяет отнести его к группе быстро эволюционирующих белков. Не выявлено ортологов SUUR за пределами двукрылых.

2. Последовательность uORF, находящейся в 5'UTR гена SuUR дрозофилы, более высоко консервативна, чем последовательность основной ORF, что предполагает ее роль в регуляции трансляции.

3. Установлено, что основные домены в белке SUUR у исследованных видов рода Drosophila сохраняются, при этом аминокислотные замены среди этих доменов распределены неравномерно: максимальное их количество приходится на среднюю часть белка, содержащую заряженные кластеры, однако суммарный заряд белка остается практически неизменным.

4. Показано, что наиболее консервативным является N-конец белка с гомологией к АТФ-азному домену белков группы хроматинового ремоделинга (SWI/SNF). Направленно полученные точечные замены аминокислот в этом домене, L57R и G58R, приводят к уменьшению интенсивности связывания белка с хромосомами, что в свою очередь ослабляет его влияние на процессы репликации и структуру хроматина.

5. С помощью Вестерн-блот гибридизации показано наличие белка у видов D. simulons и D. ananassae. У D. simulons разломы на политенных хромосомах, являющиеся маркером недорепликации, вызываются белком SUUR по тому же механизму, что и у D. melanogasler.

6. Методом количественной Саузерн-блот гибридизации показано, что стерильность самок дрозофилы при эктопической экспрессии белка SUUR в фолликулярных клетках ооцитов вызвана подавлением амплификации кластера хорионовых генов. Таким образом, белок SUUR способен оказывать влияние на репликацию в различных тканях.

7. - Установлено, что у мутантов SuURа транскрибируется две мРНК: с

нативного промотора до места встройки ретротранспозона в ген и после места инсерции (вероятно, с промотора транспозона). Такие усеченные мРНК не могут обеспечить синтез нормального белка, что и приводит к мутантному фенотипу.

Список публикаций по теме диссертации

1. Volkova, E.I., Yurlova, A.A., Kolesnikova, T.D., Makunin, I.V., Zhimulev, I.F. Ectopic expression of the Suppressor of Underreplication gene inhibits endocycles but not the mitotic cell cycle in Drosophila melanogaster // Molec. Genet. Genomics. 2003. V.270 (5). P.387—393.

2. Колесникова Т.Д., Андреева E.H., Пиндюрин А.В., Ананько Н.Г., Белякин С.Н., Шлома В.В., Юрлова А.А., Макунин И.В., Похолкова Г.В., Волкова Е.И. Заруцкая Е.А., Кокоза Е.Б., Семешш В.Ф., Беляева Е.С., Жимулев И.Ф. Ген SuUR и его участие в организации эпигенетически репрессированных районов хромосом Drosophila melanogaster//Генетика. 2006. Т.42. № 8. С.1013-1028.

3. Жимулёв И.Ф., Беляева Е.С., Андреенкова Н.Г., Андреева Е.Н., Белякин С.Н., Болдырева J1.B., Брусенцова И. В., Волкова Е.И., Демаков С.А., Демакова О.В., Заруцкая Е.А., Зыков И. А., Кокоза Е.Б., Колесникова Т.Д., Комор У.А., Коряков Д.Е., Макунин И.В., Пиндюрин А.В., Похолкова Г.В., Семешин В.Ф., Шлома В.В., Юрлова А.А. Ген SuUR -уникальный инструмент для изучения структуры и организации хромосом и генома дрозофилы // Инф. Вестник ВОГиС. 2008. Т.12. № 1/2, С.127-149.

4. Anna A. Yurlova, Igor V. Makunin, Tatyana D. Kolesnikova, Olga V. Posukh, Elena S. Belyaeva and Igor F. Zhimulev. Conservation of domain structure in a fast-evolving heterochromatic SUUR protein in Drosophilids // Genetics. 2009. V.l83 (1). P.l 19-129.

5. Макунин И.В., Юрлова А.А. LTR транспозоны как источник промоторов в геноме дрозофилы // Генетика. 2010. Т.46. № 9. С. ¡2021204.

6. Юрлова А.А., Макунин И.В., Жимулев И.Ф. Филогенетический анализ быстро эволюционирующего гена SuUR у насекомых // Генетика. 2010. Т.46. №9. 1272-1275.

ЮРЛОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

Структурные домены белка вШШ, контролирующего позднюю репликацию политенных хромосом Юго5орЫ1а melanogaster

Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 27.10.2010. Заказ №85. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юрлова, Анна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Репликация.

1.1.1. Полиплоидия и политения как ее частный пример.

1.1.2. Клеточный цикл и эндоцикл: стадии и механизм регуляции.

1.1.3. Эндорепликация и амплификация хорионовых генов в фолликулярных клетках дрозофилы.

1.1.4. Поли генные хромосомы слюнных желез дрозофилы.

1.2 Хроматин.

1.2.1. Различные состояния хроматина, факторы, определяющие его свойства

1.2.2. Поведение гегерохроматина в эндоцикле.

1.2.3. Нсдорепликация ГХ районов на политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster.

1.3 Ген SuUR.

1.3.1 Влияние мутации SuURes на репликацию.

1.3.2 Характеристика белка SUUR.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Линии дрозофилы и их ведение.

2.2. Список реактивов, наборов реагентов и растворов.

2.3. Выделение и анализ ДНК и РНК.

2.3.1. Выделение геномной ДНК дрозофилы.

2.3.2. Выделение ДНК из ядер фолликулярных клеток.

2.3.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.3.4. Выделение тотальной РНК.

2.3.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), обратная полимеразная реакция (ОТ-ПЦР), список олигонуклеотидов.

2.3.6. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях.

2.3.7. Элюция ДНК из агарозного геля.

2.3.8. Секвенирование плазмидной ДНК и PCR-фрагментов.

2.3.9. Мечение ДНК и количественная Саузерн-блот гибридизация.

2.4. Работа с бактериями и плазмидами.

2.4.1. Приготовление и трансформация химически компетентных клеток

Е. coli

2.4.2. Приготовление и электропорация «электро-компетентных» Е. coli.

2.4.3. Штаммы E. coli, основные этапы клонирования, полученные клоны ДНК, векюра.

2.5. Работа с белками.

2.5.1. Иммунизация кроликов.

2.5.2. Разделение белков в трис-глициновом SDS-полиакриламидном геле

2.5.3. Перенос белков и вестерн-блот гибридизация.

2.5.4. Иммуноокрашивание политенных хромосом.

2.5.5. Приготовление препаратов политенных хромосом для световой микроскопии.

2.6. Трансформация генома дрозофилы.

2.7. Компьютерный анализ данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. SuUR в эволюционном аспекте.

3.1.1. Характеристика гена SuUR и его мутации у D. melanogaster.

3.1.2. Обнаружение гена SuUR у других видов, его эволюционная характеристика.

3.1.3. Эволюционная характеристика консервативной uORF.

3.1.4. Выявление белка SUUR у других видов дрозофилы.

3.1.5. Эволюционный анализ белка SUUR у дрозофилы, скорость замен в белке

3.2. Получение мутаций в консервативных районах белка и их анализ.

3.2.1. Получение точечных мутаций.

3.2.2. Белок SUUR подавляет амплификацию кластера хорионовых генов в фолликулярных клетках.

3.2.3. Влияние замен в белке SUUR на эндорепликацию и амплификацию хорионовых генов.

3.2.4. Влияние мутаций на способность белка связываться с хромосомами и изменять структуру хроматина.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные домены белка SUUR, контролирующего позднюю репликацию политенных хромосом Drosophila melanogaster"

Актуальность проблемы

Время репликации ДНК в S-фазе клеточного цикла обычно коррелирует с транскрипционной активностью генов из соответствующих районов (Hagele, 1973; Schubeler et al., 2002; MacAIpine et al., 2004; Donaldson, 2005). Как правило, поздняя репликация наблюдается в транскрипционно неактивных районах хромосом, в большинстве случаев представленных прицентромерным гетерохроматином (ПГХ), которые находятся в конденсированном состоянии в интерфазных хромосомах. К поздно реплицирующимся районам относятся также и протяженные участки эухроматина (ЭХ) размером около 200-1000 т.п.н. (MacAIpine et al., 2004; White et al., 2004; Berezney et al., 2000).

У D. melanogaster процесс поздней репликации удобно изучать на политенных хромосомах слюнных желез, образующихся во время модифицированного клеточного цикла - эндоцикла. При эндорепликации отсутствует митоз, и G-фаза следующего цикла начинается до того, как успевает завершиться S-фаза предыдущего, поэтому многие поздно реплицирующиеся последовательности не успевают завершить репликацию к концу каждого эндоцикла и остаются недореплицированными (Gall et al., 1971; Smith and Orr-Weaver, 1991; Lilly and Spradling, 1996). Кроме районов прицентромерного гетерохроматина есть еще около 240 районов, разбросанных по эухроматиновым плечам хромосом, в которых наблюдается поздняя репликация. Эти районы характеризуются не только поздней репликацией, но и некоторыми другими признаками, свойственными гетерохроматину, - это компактное состояние и низкий уровень транскрипции (Zhimulev et al., 2003b). Для таких районов введен термин интеркалярный гетерохроматин (ИГХ).

Недорепликация в большой степени определяется продуктом гена SuUR, который кодирует белок, специфически связывающийся с районами ПГХ и ИГХ на политенных хромосомах слюнных желез личинок конца третьего возраста (Makunin et al., 2002; Zhimulev et al., 2003b; Pindyurin et al., 2007). У мутантов по гену SuUR (линия SiiURes) изменяется время репликации ДНК в поздно реплицирующихся районах - она заканчивается раньше, чем у мух дикого типа, поэтому уровень политснизации в районах ИГХ становится таким же, как и в ЭХ районах. Кроме того, происходит увеличение уровня политенизации многих последовательностей из района ПГХ, что сопровождается появлением дополнительного структурированного материала в районе хромоцентра (Ве1уаеуа & а1., 1998; МозЬкш е1 а1., 2001; гЫгтйеу е1 а1., 2003Ь). В свою очередь увеличение доз гена БииЯ приводит к увеличению уровня недорепликации в районах ИГХ (гЫти1еу е1 а1., 2003а; Ве1уакш е1 а1., 2005).

Поскольку БниЯ на сегодняшний день является единственным известным геном, способным оказывать влияние на время репликации и недорепликацию в ПГХ и ИГХ политенных хромосом слюнных желез £>. те.1апо£а$1ег. было бы интересно понять, в каких еще клетках он работает, у каких видов присутствует и насколько консервативен. Еще один вопрос, на который необходимо получить ответ, - это механизм действия гена ЯииЯ; отправной точкой в этом вопросе может служить изучение контроля экспрессии гена.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было изучение влияния белка 81ДЖ и его мутантных форм на процесс репликации ДНК, поиск функционально-значимых районов в белке. Для достижения этих целей были сформулированы следующие задачи:

• Провести детальный молекулярный анализ мутации 8и1ЖЕБ

• Провести эволюционный анализ гена

• Установить связь ортологов 81ДШ с процессом недорепликации ДНК

• Выявить консервативные районы в белке, получить точечные мутации в них, проверить влияние полученных мутаций на свойства белка.

• Исследовать влияние 81ЛЖ на процессы репликации ДНК в фолликулярных клетках ооцитов.

Научная новизна

В настоящей работе установлено, что в мутантной линии БииЛ^ присутствует два фрагмента РЖ БииЯ'. один до встройки транспозона, другой - после нее. Впервые выявлено, что эктопическая экспрессия белка 81ЛШ в фолликулярных клетках приводит к стерильности самок, причиной которой является подавление амплификации хорионовых генов. Эволюционный анализ гена 8и1Ж у насекомых показал, что он выявляется только у двукрылых, а белок Би1Ж принадлежит к группе быстро эволюционирующих белков. Впервые показано, что иОЛР БыИИ, находящаяся в 5'иТК гена является более консервативной по сравнению с (ЖР основного белка ЗиХЖ. На основании эволюционного анализа белка 11 видов рода Дрозофила определены консервативные районы в белке, получены точечные направленные мутации в двух консервативных районах, на К- и С- конце белка, проведен анализ влияния этих мутаций на функцию белка.

Практическая ценность

Показано, что продукт гена БиС/Я может влиять на процессы репликации ДНК не только в слюнной железе, по и в фолликулярных клетках овариев. Проведенный анализ белка 81ЛЖ позволил выявить эволюционную консервативность его структурно-функциональных доменов. Эти структурные данные о продукге гена 8ииЯ будут использованы для дальнейшего получения функционально значимых мутаций. Выявление высоко консервативной иОИР в 5"иТИ БииЯ служит базой для изучения механизмов контроля трансляции гена.

Объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литера I уры, в которые входит 161 ссылка. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 22 рисунка и приложение на 5 страницах.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Юрлова, Анна Александровна

ВЫВОДЫ

4. Показано, что наиболее консервативным является N-конец белка с гомологией к АТФ-азному домену белков группы хроматинового ремоделинга (SW1/SNF). Направленно полученные точечные замены аминокислот в этом домене, L57R и G58R, приводят к уменьшению интенсивности связывания белка с хромосомами, что в свою очередь ослабляет его влияние на процессы репликации и структуру хроматина.

5. С помощью Вестерн-блот гибридизации показано наличие белка у видов D. simulans и D. ananassae. У D. simulans разломы на политенных хромосомах, являющиеся маркером недорепликации, вызываются белком SUUR по тому же механизму, что и у D. melanogaster.

7. Установлено, что у мутантов SuURcs транскрибируется две mPFIK: с нативного промотора до места встройки ретротранспозона в ген и после места инсерции вероятно, с промотора транспозона). Такие усеченные мРНК не могут обеспечить синтез нормального белка, что и приводит к мутантному фенотипу.

Заключение

Итак, механизм клеточного цикла - это сложная машина, в которой- все хорошо продуманно: время репликации, выбор ориджинов, которые должны активироваться в тот или иной момент, белки-маркеры для активных и неактивных ориджинов. И за всеми этими процессами существует строгий контроль -чекпойнты, в которых или происходит исправление ошибок и дальнейшая работа клеток или констатация нарушений, которые невозможно исправить и дальнйая гибель клетки. В эндоцикле - с одной строны все то же самое, а с другой -нарушено несколько важных правил: во-первых, происходит множество циклов репликации генома без последующего клеточного деления; во-вторых. ГХ последовательности не всегда успевают закончить репликацию во время S-фазы и, как следствие, остаются недорешшцированными (как это происходит в слюнных железах); в-третьих, эти нарушения не отслеживаются чекпойтами и не приводят к гибели клеток.

В наших руках оказалась уникальная линия, содержащая мутацию (SuURts), способную изменять скорость завершения репликации ГХ последовательностей в клетках слюнных желез D. melanogaster. Это единственная известная на сегодняшний день мутация в гене SuUR, она не является летальной, в линии, ее содержащей, не удается выявить белок, но не известно, является ли эта мутация нуль-аллелем. Большая часть работ по изучению роли белка была проведена на политенных клетках слюнных желез, таюке было показано слабое влияние белка на диплоидные ткани. Возниакет вопрос, способен ли белок SUUR оказывать влияние и на другие полиплоидные органы, работает ли он только в эндоцикле или и в обычном клеточном цикле. Также нам до сих пор не известен механизм работы белка и то, присутствует ли он у каких-либо других видов, кроме D. melanogaster, и сохраняет ли он у них свою функцию. С этой целью мы провели эволюционный анализ белка SUUR, выявили в нем консервативные районы, которые обычно являю гея функциональными, и попытались ответить на вопрос об их роли в работе белка, вводя точечные мутации в эти районы и анализируя их эффект.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Линии дрозофилы и их ведение

Линии мух Drosophila melanogaster, использованные в работе, перечислены и охарактеризованы в Таблице 1.

Название линии Генотип Источник

Oregon-R линия дикого типа фонд лаборатории yw y'w1 фонд лаборатории xv SuUR" w; SnURts фонд лаборатории w ruh SuURls w~; ru h SuURb* фонд лаборатории

4-bal y' w'; CyO, Cy' dp'vl pr' cn2/1(2) KrIJ'1; MKRS, M(3)76A1 kar1 ryr Sb1 е/ TM6B, Tb' AntpH"-' e1 ca' Cambridge University

1824 (AB1) у U'7 P{w'mWhs=GawB}ABl BSC*

C323 P{w>m" "s=GawB}c323a, w"'H BSC* cla-GA\A w; P{w+"=GAL4-da. G32} UH1 BSC* sgs3-GAL4 w'"H; P{wkmC Sgs3-GAL4.PD} Dr. L. Cherbas arm- GAL4 w~; P{w+ml~=arm-GAL4.} фонд лаборатории

U AS-SuUR У w'; P{w' ™ UASoAbhsp70:SuURJII фонд лаборатории

UAS -SuURVmul У w'; P{w*hs, UASoAihsp 70:Su UR}II Ю.А.А.

UAS-SuURcnu, y' w'; P{w+mlVMs, UASoAihsp70:SuUR}II Ю.А.А. ygs3-GAL4 SuUR1* w'"'\- P{w+mC=Sgs3-GAL4.PD}; SuURb* фонд лаборатории arm- GAL4 SuURts w; P{w+m<J=arm-GAL4}; SuUR" фонд лаборатории

UAS-SuUR SuURt,b y' w1; P{w UASGALhsp70:SuUR}II; SuUR** фонд лаборатории

UAS-SuURymti SuURes У w'; P{w"mn hs, UAScAi.hsp70:SuURJJI; SuURls Ю.А.А

UAS-SuURcmut SuURls У w'; P{w+mWMs, UASGALhsp70:SuUR}Il; SuURl s Ю.А.А - Bloomington Stock Center, Dr. К. Matthews

Наиболее полное описание генетических маркеров, перестроенных и балансерных хромосом приведено во FlyBase (flybase.bio.indiana.edu/). Помимо D. melanogaster в работе были, использованы лабораторные линии рода Drosophila. а именно D. simulans, D. yakuba, D. erecta, D. ananassae, D. pseudoobscura и D. virilis.

Линии мух вели при температуре 25°С (за исключением отдельно указанных случаев) в стеклянных стаканах на стандартном корме состава: агар-агар - 6-12 г, дрожжи (сухие) - 18 г, кукурузная крупа - 62 г, изюм - 40г, пропионовая кислота -0.8 мл, патока - 50 мл на 1 литр воды.

2.2. Список реактивов, наборов реагентов и растворов

В работе были использованы следующие реактивы и наборы: а-[32Р] dATP.Amersham Biosciences, США

EDTA.Sigma, США

Hexanucleotide Mix.Roche, Швейцария

IPTG.BTS GmbH, Германия

Plasmid Midi Kit.Q1AGEN GmbH, Германия

QIAquick Gel Extraction Kit.QIAGEN GmbH, Германия

SDS.Sigma, США

SlowFade® Antifade Kit.Molecular Probes, Нидерланды

TEMED.Reanal, Венгрия

Tris.Sigma. США

Triton Х-100.Serva, Германия

Tween 20.Serva, Германия

X-GAL.BTS GmbH, Германия

Wizard® Plus Minipreps

DNA Purification System.Promega GmbH, Германия

Агар.Difco, США

Агароза.GibcoBRL, Великобритания адъювант Фрейнда (полный).Sigma, США адъювант Фрейнда (неполный).Sigma, США акриламид.Serva, Германия бактотриптон.Difco, США глицерин.Serva, Германия глицин.Merck, Германия диспаза.Roche, Швейцария дрожжевой экстракт.Difco, США

TRIzol® Reagent.

AccessQuick™ RT-PCR System.

ECL Western Blotting Analysis System

I Ioechst 33342.

Voltalef oil 10S. диатомовая земля

Sigma, США .Invitrogen, США .Promega GmbH, Германия .Amersham Biosciences, США .Invitrogen, США .Atochem

Все ферменты были производства NEB (США), MBI Fermentas (Литва), GibcoBRL (Великобритания) или СибЭнзим (Новосибирск).

2.3. Выделение и анализ ДНК и РНК

2.3.1. Выделение геномной ДНК дрозофилы

Выделение геномной ДНК проводили из овариев самок или слюнных желез личинок дрозофилы, изолированных в Эффруси-Бидле (Э-Б: 128 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,5 мМ СаС12) проводили согласно методики М. Лэмб и К. Лэйрд (Lamb and Laird, 1987). К 25 парам овариев или слюнных желез добавляли 700 мкл лизирующего буфера (100 мМ NaCl, 100 мМ Tris-HCl рН=9.1, 50 мМ EDTA, 200 мМ сахароза, 0,5 % SDS) и гомогенизировали инсулиновым шприцем на льду 1-2 минуты. К гомогенату добавляли РНКазу А 100 мг/мл и инкубировали 1 час при 37°С. 3aie\i добавляли активированную диспазу до концентрации 1 мг/мл и инкубировали при 56°С от 2 до 14 часов, после эюго к лизату добавляли равный объем ФХИ (фенол/хлороформ/изоамиловый спирт = 25/24/1), осторожно перемешивали 2 минуты, центрифугировали при комнатной температуре и 14000 об/мин 10 минут. Верхнюю фазу, содержащую водный раствор ДНК, отбирали, переносили в новую пробирку и повторяли процедуру с ФХ (фенол/хлороформ = 1/1) несколько раз до исчезновения интерфазы. Удаление остатков фенола проводили перемешиванием водной фазы с хлороформом с последующим центрифугированием при вышеописанных условиях. ДНК осаждали добавлением 1/10 объема 3 М CH3COONa рН=5.0 и 2,5 объемами 96% этанола. Смесь центрифугировали при 4000 об/мин в течение 5 минут. Осадок промывали 70% и 96% этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в воде.

2.3.2. Выделение ДНК из ядер фолликулярных клеток

Для выделения ДНК из ядер фолликулярных клеток были отобраны 1200 овариев линии c323>VAS-SuUR и 500 овариев линии Oregon-R на стадиях 10А и 11-14. Ядра были выделены и отсортированы согласно протоколу, описанному в статье М. Лили и А. Спрадлинга (Lilly and Spradling, 1996) с некоторыми изменениями. Оварии до выделения хранили при -70°С в ЭБ, потом размораживали на льду, добавляли 1/10 объема раствор коллагеназы (50% глицерин, 10 мМ Tris-НС1 рН=7.5, 2% коллагеназа) и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. После этого супернатант удаляли, осадок промывали ЭБ (и снова удаляли супернатант). К осадку добавляли 425 мкл буфера для выделения ядер (15 мМ Tris-HCl рН=7.4, 60 мМ KCl, 15 мМ NaCl, 250 мМ сахароза, 1 мМ EDTA, 0,15 мМ спермин, 0,5 мМ спермидин) и 75 мкл 10% NP40. В пробирку, содержащую градиент 2,5 М; 1,6 М и 0,8 М сахарозы по 1 мл, наносили через шприц вышеописанный раствор и центрифугировали 20 минут на центрифуге Centricone с использованием ротора А21 при 13700 g, после центрифугирования верхние фракции удаляли, для дальнейшей работы использовали нижнюю фракцию. Качество разделения ядер фолликулярных и питающих клеток было проверено на свстой микроскопии после окраски бромистым этидием. К нижней фракции добавляли РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, инкубировали 15 минут при 37°С. добавляли активированную диспазу до концентрации 1 мг/мл и инкубировали ночь при 56°С. Дальнейшие процедуры проводили как при стандартном выделении ДНК, описанном выше.

2.3.3. Выделение плазмидной ДНК

ДНК плазмид выделяли методом щелочного лизиса, подробно описанным в ряде методических сводок (Маниатис и др., 1984; Мазин и др., 1990). 3 мл ночной культуры клеток осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 2 минут. Осадок клеток суспендировали в 200 мкл ресуспепдирующего раствора (50 мМ Tris-HCl рН=7.5, 10 мМ EDTA, 100 мкг/мл РНКаза А). После этого добавляли 200 мкл лизирующего раствора (0,2 N NaOH, 1% SDS) и осторожно перемешивали до iex пор, пока клеточная суспензия не становилась прозрачной и вязкой. Затем добавляли 200 мкл нейтрализирующего раствора (1,32 М СНЗСООК рН=4.8), перемешивали до формирования творожистого осадка и центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин. Супернатант переносили в новую пробирку, при наличии примесей осадка центрифигуривали повторно, при их отсутствии к супернатанту добавляли для связывания ДНК 1 мл хорошо перемешанной смолы Wizard® Minipreps DNA purification resin (Promega) и оставляли на 5 минут. Иногда вместо смолы мы использовали диатомовую землю (66,84 г гуанидин хлорида растворяли в 33,3 мл нейтрализующего раствора в стеклянном стакане, находящемся на магнитной мешалке со слабым подогревом, полученый раствор титровали NaOH до рН=5.5, доводили водой конечный объем до 100 мл, перемешивали 5 минут, фильтровали через 0.4 мм фильтр в стеклянную колбу, содержащую 1,5 г диатомовой земли и хранили в темном месте при комнатной температуре). Полученную смесь наносили в шприц с микроколонкой (Wizard microcolumn, Promega) на конце, продавливали все это, после чего промывали колонку 2 мл раствора для промывания колонок (20mM NaCl, 20тМ Tris-HCl рН=7.5, 5тМ EDTA, 50% С2Н5ОН). После этого колонку помещали в 1,5 мл пробирки eppendorf и центрифугировали 30 секунд при 14000 об/мин для удаления остатков раствора. ДНК с колонок смывали водой (при 70°С) - 50 мкл наносили на колонку, оставляли на 1 минуту и 30 секунд центрифугировали. Выделенную таким способом ДНК использовали для клонирования и прочего.

Для получения больших количеств высокоочищенной плазмидной ДНК использовали Plasmid Midi Kit (Qiagen) и следовали рекомендациям производителей.

2.3.4. Выделение тотальной РНК

Выделение РНК проводили с использованием тризола (Invitrogen), согласно рекомедациям производителей. К 20 парам яичников добавляли 150 мкл тризола, суспендировали инсулиновым шприцем (50-100 раз) и инкубировали при комнатной температуре 5 минут. После этого добавляли 30 мкл хлороформа, резко встряхивали, инкубировали 2-3 минуты при комнатной температуре и центрифугировали 10 минут при 4°С на 10000 об/мин. Отбирали верхнюю бесцветную водную фракцию, добавляли 75 мкл изопропанола, перемешивали до помутнения, инкубировали 10 минут при комнатной температуре и центрифугировали при вышеописанных условиях. Супсрнатант удаляли, осадок промывали 75% этанолом, подсушивали и растворяли в воде.

При этом все, используемое при работе с РНК, было подвергнуто анти-РНКазной обработке.

2.3.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), обратная полимеразная реакция (ОТ-ПЦР), список олигонуклеотидов

ПЦР проводили на амплификаторе Eppendorf Mastercycler personal с использованием Vent- или Taq-полимеразы согласно протоколам, описанным в руководстве Д. Сэмбрука и Д. Рассела (Sambrook and Russell, 2001). Реакционная смесь состояла из 1/10 объема Юхбуфера С1 (20 мМ MgC12, 650 мМ Tris-HCl pl 1=8.8, 160 мМ (NH4)2S04. 0,5% Tween 20) или Vent-буфера, 0,2 мМ эквимолярной смеси четырех dNTP, по 10 пмоль двух праймеров, 0,05-1 мкг ДНК-матрицы, 0,2-5 е.а. соответствующей полимеразы. Реакцию проводили при следующих условиях: 3 мин - денатурация ДНК при 95°С, после этого 25-35 циклов: 0,5 мин - денатурация при 94°С; 1 мин - отжиг праймеров при соответствующей температуре (50-62°С); 1-3 мин - синтез при 72°С, по завершении последнего цикла 3 мин при 72°С было для окончательного достраивания всех цепей.

Обратную полимеразную цепную реакцию проводили с использованием набора AccessQuick™ RT-PCR System (Promega). Реакцию проводили в 50 мкл, для одной реакции необходимы: AccessQuick™ Master Mix 2Х - 25 мкл, по 0,1 - 1 мкМ двух праймеров, 1 пг - 1 мкг РНК. Реакционную смесь инкубировали 45 минут при 48°С, после чего проводили стандартный ПЦР, по вышеописанному протоколу.

В работе были использованы стандартные плазмидные праймеры. соответствующие ТЗ и Т7 для pBluescript, HSP7 и SV40 для PUAST, а также следующие специфические праймеры, представленные в Таблице 2:

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юрлова, Анна Александровна, Новосибирск

1. Aggarwal B.D. and Calvi B.R. Chromatin regulates origin activity in Drosophila follicle cells // Nature. 2004. - Vol. 430. - № 6997. - P. 372-376.

2. Arbeitman M.N., Furlong E.E., Imam F., Johnson E., Null B.H., Baker B.S., Krasnow M.A., Scott M.P., Davis R.W. and White K.P. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster // Science 2002 - Vol. 297. - P. 2270-2275.

3. Ashburner M. Insect Cytogenetics. Tenth Symposium of the Royal Entomological Society. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1980. - 278c.

4. Austin R.J., Orr-Weaver T.L. and Bell S.P. Drosophila ORC specifically binds to ACE3, an origin of DNA replication control element // Genes Dev. 1999. - Vol. 13. - № 20. - P. 2639-2649.

5. Avedisov S.N., Rogozin I.B., Koonin E.V. and Thomas B.J. Rapid evolution of a cyclin A inhibitor gene, roughex, in Drosophila // Mol. Biol. Evol. 2001. - Vol. 18. -№ 11.-P. 2110-2118.

6. Bannister A.J., Zegerman P., Partridge J.F., Miska E.A., Thomas J.O., Allshire R.C. and Kouzarides T. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain // Nature. 2001. - Vol. 410. - № 6824. - P. 120-124.

7. Beall E.L., Manak J.R., Zhou S., Bell M., Lipsick J.S. and-Botchan M.R. Role for a Drosophila Myb-containing protein complex in site-specific DNA replication // Nature. 2002. - Vol. 420. - № 6911. - P. 833-837.

8. Beall E.L., Bell M., Georlette D. and Botchan M.R1 Dm-myb mutant lethality in Drosophila is dependent upon mipl30: positive and negative regulation of DNA replication // Genes Dev. 2004. - Vol. 18. - № 14. - P. 1667-1680.

9. Belyaeva E.S., Andreyeva E.N., Belyakin S.N., Volkova E.I. and Zhimulev I.F. Intercalary heterochromatin in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster // Chromosoma. 2008. - Vol. 117. - № 5. - P. 411-418.

10. Berezney R., Dubey D.D. and Huberman J.A. Heterogeneity of eukaryotic replicons, replicon clusters, and replication foci // Chromosoma. 2000. - Vol. 108. - № 8. - P. 471-484.

11. Beye M., Hasselmann M., Fondrk M.K., Page R.E. and Omholt S.W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein // Cell. 2003. - Vol. 114. - № 4. - P. 419-429.

12. Bopp D., Horabin J.I., Lersch R.A., Cline T.W. and Schedl P. Expression of the Sex-lethal gene is controlled at multiple levels during Drosophila oogenesis // Development. -1993. Vol. 118. - № 3. - P. 797-812.

13. Bosco G., Du W. and Orr-Weaver T.L. DNA replication control through interaction of E2F-RB and the origin recognition complex // Nat. Cell. Biol. -2001. Vol. 3. - № 3. - P. 289-295.

14. Boutanaev A.M., Kalmykova A.I., Shevelyov Y.Y. and Nurminsky D.I. Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome // Nature. 2002. - Vol. 420.-№6916.-P. 666-669.

15. Brand A.H. and Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes // Development. 1993. - Vol. 118. - № 2. - P. 401-415.

16. Brendel V., Bucher P., Nourbakhsh I.R., Blaisdell B.E. and Karlin S. Methods and algorithms for statistical analysis of protein sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1992. - Vol. 89. - № 6. - P. 2002-2006.

17. Budirahardja Y. and Gonczy P. Coupling the cell cycle to development // Development. 2009. - Vol. 136. - № 17. - P. 2861-2872.

18. Burge C. and Karlin S. Prediction of complete gene structures in human genomic DNA // J. Mol. Biol. 1997. - Vol. 268. - № 1. - P. 78-94.

19. Calvi B.R., Lilly M.A. and Spradling A.C. Cell cycle control of chorion gene amplification // Genes Dev. 1998. - Vol. 12. - № 5. - P. 734-744.

20. Calvi B.R., Byrnes B.A. and Kolpakas A.J. Conservation of epigenetic regulation, ORC binding and developmental timing of DNA replication origins in the genus Drosophila // Genetics. 2007. - Vol. 177. - № 3. - P. 1291-1301.

21. Calvo S.E., Pagliarini D.J. and Mootha V.K. Upstream open reading frames cause widespread reduction of protein expression and are polymorphic among humans // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2005. Vol. 106. - № 18. - P. 7507-7512.

22. Capdevila J. and Guerrero I. Targeted expression of the signaling molecule decapentaplegic induces pattern duplications and growth alterations in Drosophila wings // EMBO J. -1994. Vol. 13. - № 19. - P. 4459-4468.

23. Cherbas L., Hu X., Zhimulev I., Belyaeva E. and Cherbas P. EcR isoforms in Drosophila: testing tissue-specific requirements by targeted blockade and rescue // Development. 2003. - Vol. 130. - № 2. - P. 271-284.

24. Chintapalli V.R., Wang J. and Dow J.A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease // Nat. Genet. 2007. - Vol. 39.- № 6. P. 715-720.

25. Cho S., Huang Z.Y., Green D.R., Smith D.R. and Zhang J. Evolution of the complementary sex-determination gene of honey bees: balancing selection and trans-species polymorphisms // Genome Res. 2006. - Vol. 16. - № 11. - P. 13661375.

26. Claycomb J.M., MacAlpine D.M., Evans J.G., Bell S.P. and Orr-Weaver T.L. Visualization of replication initiation and elongation in Drosophila // J. Cell Biol. -2002. Vol. 159. - № 2. - P. 225-236.

27. Claycomb J.M., Benasutti M., Bosco G., Fenger D.D. and Orr-Weaver T.L. Gene amplification as a developmental strategy: isolation of two developmental amplicons in Drosophila // Dev. Cell. 2004. - Vol. 6. - № 1. - P. 145-155.

28. Claycomb J.M. and Orr-Weaver T.L. Developmental gene amplification: insights into DNA replication and gene expression // Trends Genet. 2005. - Vol. 21. - № 3. - P. 149-162.

29. Comeron J.M. K-Estimator: calculation of the number of nucleotide substitutions per site and the confidence intervals // Bioinformatics. 1999. - Vol. 15. - № 9. -P. 763-764.

30. Danis E., Brodolin K., Menut S., Maiorano D., Girard-Reydet C. and Mechali M. Specification of a DNA replication origin by a transcription complex // Nat. Cell Biol. 2004. - Vol. 6. - № 8. - P. 721-730.

31. De Cuevas M., Lilly M.A. and Spradling A.C. Germline cyst formation in Drosophila //Annu. Rev. Genet. 1997. - Vol. 31. - № - P. 405-428.

32. Dej KJ. and Spradling A.C. The endocycle controls nurse cell polytene chromosome structure during Drosophila oogenesis // Development. 1999. - Vol. 126. - № 2. - P. 293-303.

33. Deloger M., Cavalli F.M., Lerat E., Biemont C., Sagot M.F. and Vieira C. Identification of expressed transposable element insertions in the sequenced genome of Drosophila melanogaster // Gene. 2009. - Vol. 439. - № 1-2. - P. 5562.

34. Deng W.M., Althauser C. and Ruohola-Baker H. Notch-Delta signaling induces a transition from mitotic cell cycle to endocycle in Drosophila follicle cells // Development. 2001. - Vol. 128. - № 23. - P. 4737-4746.

35. Diffley J.F. Regulation of early events in chromosome replication // Curr. Biol. -2004. Vol. 14. - № 18. - P. R778-786.

36. Donaldson A.D. Shaping time: chromatin structure and the DNA replication programme // Trends Genet. 2005. - Vol. 21. - № 8. - P. 444-449.

37. Drysdale R.A., Crosby M.A., Gelbart W., Campbell K., Emmert D., Matthews B., Russo S., Schroeder A., Smutniak F., Zhang P., et al. FlyBase: genes and gene models // Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33. - № Database issue. - P. D390-395.

38. Ebert A., Schotta G., Lein S. et al. Su(var) genes regulate the balance between euchromatin and heterochromatin in Drosophila // Genes Dev. 2004 - Vol. 18. -P. 2973-2983

39. Edgar B.A. and Orr-Weaver T.L. Endoreplication cell cycles: more for less // Cell. 2001. - Vol. 105. - № 3. - P. 297-306.

40. Gaba A., Jacobson A. and Sachs M.S. Ribosome occupancy of the yeast CPA1 upstream open reading frame termination codon modulates nonsense-mediated mRNA decay // Mol. Cell. 2005. - Vol. 20. - № 3. - P. 449-460.

41. Gall J.G., Cohen E.H. and Polan M.L. Reptitive DNA sequences in drosophila // Chromosoma. -1971. Vol. 33. - № 3. - P. 319-344.

42. Ganier O. and Mechali M. New cell or new cycle? // Genes Dev. 2008. - Vol. 22. -P. 2908-2913.

43. Grewal S.I. and Jia S. Heterochromatin revisited // Nat. Rev. Genet. 2007. - Vol. 8. - № 1. - P. 35-46.

44. Hagele K. Complementary DNA replication patterns in Drosophila melanogaster. // Chromosoma. 1973. - Vol. 41. - № 2. - P. 231-236.

45. Hammond M.P. and Laird C.D. Control of DNA replication and spatial distribution of defined DNA sequences in salivary gland cells of Drosophila melanogaster// Chromosoma. 1985a. - Vol. 91. - № 3-4. - P. 279-286.

46. Hammond M.P. and Laird C.D. Chromosome structure and DNA replication in nurse and follicle cells of Drosophila melanogaster // Chromosoma. 1985b. -Vol. 91. - № 3-4. - P. 267-278.

47. Havas K., Whitehouse I. and Owen-Hughes T. ATP-dependent chromatin remodeling activities // Cell Mol. Life Sci. 2001. - Vol. 58. - № 5-6. - P. 673682.

48. Hayden C.A. and Bosco G. Comparative genomic analysis of novel conserved peptide upstream open reading frames in Drosophila melanogaster and other dipteran species // BMC Genomics. 2008. - Vol. 9. - № - P. 61.

49. Hochstrasser M. and Sedat J.W. Three-dimensional organization of Drosophila melanogaster interphase nuclei. I. Tissue-specific aspects of polytene nuclear architecture //J. Cell Biol. -1987. Vol. 104. - № 6. - P. 1455-1470.

50. Huynh J.R. and St Johnston D. The origin of asymmetry: early polarisation of the Drosophila germline cyst and oocyte // Curr. Biol. 2004. - Vol. 14. - № 11. - P. R438-449.

51. Intine R.V. and Nazar R.N. PCR-mediated mutagenesis in sequences recalcitrant to homogeneous amplification // Biotechniques. 1998. - Vol. 25. - № 3. - P. 364366.

52. Kent WJ. BLAT-the BLAST-like alignment tool // Genome Res. 2002. - Vol. 12. - № 4. - P. 656-664.

53. King R.C., Riley S.F., Cassidy J.D., White P.E. and Paik Y.K. Giant polytene chromosomes from the ovaries of a Drosophila mutant // Science. 1981. - Vol. 212.-№4493.-P. 441-443.

54. Kokoza E.B. and Zhimulev I.F. In situ hybridization of DNA of the Su(UR)ES gene in polytene chromosomes of several species of Dipterans // Drosophila information service. 2000. - Vol. 83. - № - P. 22.

55. Kozak M. A short leader sequence impairs the fidelity of initiation by eukaryotic ribosomes // Gene Expr. -1991. Vol. 1. - № 2. - P. 111-115.

56. Kozak M. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes // Gene. 1999. -Vol. 234. - № 2. - P. 187-208.

57. Lachner M., O'carroll D., Rea S., Mechtler K. and Jenuwein T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins // Nature. 2001. - Vol. 410. - № 6824. - P. 116-120.

58. Lamb M.M. and Laird C.D. Three euchromatic DNA sequences under-replicated in polytene chromosomes of Drosophila are localized in constrictions and ectopic fibers // Chromosoma. 1987. - Vol. 95. - № 4. - P. 227-235.

59. Leach T.J., Chotkowski H.L., Wotring M.G., Dilwith R.L. and Glaser R.L. Replication of heterochromatin and structure of polytene chromosomes // Mol. Cell Biol. 2000. - Vol. 20. - № 17. - P. 6308-6316.

60. Lee H.O., Davidson J.M. and Duronio R.J. Endoreplication: polyploidy with purpose // Genes Dev. 2009. - Vol. 23. - № 21. - P. 2461-2477.

61. Leievre G. A photographic representation and interpretation of the polytene chromosomes of Drosophila melanogaster salivary glands. London; New York. : Academic Press., 1976.

62. Lewis P.W., Beall E.L., Fleischer T.C., Georlette D., Link A.J. and Botchan M.R. Identification of a Drosophila Myb-E2F2/RBF transcriptional repressor complex // Genes Dev. 2004. - Vol. 18. - № 23. - P. 2929-2940.

63. Lilly M.A. and Spradling A.C. The Drosophila endocycle is controlled by Cyclin E and lacks a checkpoint ensuring S-phase completion // Genes Dev. 1996. - Vol. 10. -№ 19.-P. 2514-2526.

64. Lilly M.A. and Duronio R.J. New insights into cell cycle control from the Drosophila endocycle // Oncogene. 2005. - Vol. 24. - № 17. - P. 2765-2775.

65. Lin H. and Spradling A.C. Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria // Dev. Biol. 1993. - Vol. 159. -№ 1. - P. 140-152.

66. Lopez-Schier H. and St Johnston D. Delta signaling from the germ line controls the proliferation and differentiation of the somatic follicle cells during Drosophila oogenesis // Genes Dev. 2001. - Vol. 15. - № 11. - P. 1393-1405.

67. MacAlpine D.M., Rodriguez H.K. and Bell S.P. Coordination of replication and transcription along a Drosophila chromosome // Genes Dev. 2004. - Vol. 18. - № 24. - P. 3094-3105.

68. Madigan J.P., Chotkowski H.L. and Glaser R.L. DNA double-strand break-induced phosphorylation of Drosophila histone variant H2Av helps prevent radiation-induced apoptosis // Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30. - № 17. - P. 3698-3705.

69. Margolis J. and Spradling A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary // Development. 1995. - Vol. 121. - № 11. - P. 3797-3807.

70. Mata J., Curado S., Ephrussi A. and Rorth P. Tribbles coordinates mitosis and morphogenesis in Drosophila by regulating string/CDC25 proteolysis // Cell. -2000. Vol. 101. -No 5.- P. 511-522.

71. Mechali M. DNA replication origins: from sequence specificity to epigenetics // Nat. Rev. Genet. 2001. - Vol. 2. - № 8. - P. 640-645.

72. Mehrotra S., Maqbool S.B., Kolpakas A., Murnen K. and Calvi B.R. Endocycling cells do not apoptose in response to DNA rereplication genotoxic stress // Dev. -2008. Vol. 22. - P. 3158-3171.

73. Mehta A., Trotta C.R. and Peltz S.W. Derepression of the Her-2 uORF is mediated by a novel post-transcriptional control mechanism in cancer cells // Genes Dev. -2006. Vol. 20. - № 8. - P. 939-953.

74. Mishra A. and Lakhotia S.C. Replication in Drosophila chromosomes. VII. Influence of prolonged larval life on patterns of replication in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster // Chromosoma. 1982. - Vol. 85. - №2. P. 221-236.

75. Narbonne-Reveau K., Senger S., Pal M., Herr A., Richardson H.E., Asano M., Deak P. and Lilly M.A. APC/CFzr/Cdhl promotes cell cycle progression during the Drosophila endocycle // Development. 2008. - Vol. 135. - № 8. - P. 14511461.

76. O'neil M.T. and Belote J.M. Interspecific comparison of the transformer gene of Drosophila reveals an unusually high degree of evolutionary divergence // Genetics. 1992. - Vol. 131. - № 1. - P. 113-128.

77. Oliver B., Kim Y.J. and Baker B.S. Sex-lethal, master and slave: a hierarchy of germ-line sex determination in Drosophila // Development. 1993. - Vol. 119. - №3. P. 897-908.

78. Park S.Y. and Asano M. The origin recognition complex is dispensable for endoreplication in Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2008. Vol. 105. -№ 34. - P. 12343-12348.

79. Pile L.A. and Wassarman D.A. Localizing transcription factors on chromatin by immunofluorescence // Methods. 2002. - Vol. 26. - № 1. - P. 3-9.

80. Richards E.J. and Elgin S.C. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects // Cell. 2002. - Vol. 108. - № 4. - P. 489-500.

81. Richards G. The polytene chromosomes in the fat body nuclei of Drosophila melanogaster // Chromosoma. 1980. - Vol. 79. - № 2. - P. 241-250.

82. Robinson P.J., Fairall L., Huynh V.A. and Rhodes D. EM measurements define the dimensions of the "30-nm" chromatin fiber: evidence for a compact, interdigitated structure // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006. Vol. 103. - № 17. - P. 6506-6511.

83. Rost B., Yachdav G. and Liu J. The PredictProtein server // Nucleic Acids Res. -2004. Vol. 32. -Web Server issue. - W. 321-326.

84. Royzman I., Austin R.J., Bosco G., Bell S.P. and Orr-Weaver T.L. ORC localization in Drosophila follicle cells and the effects of mutations in dE2F and dDP // Genes Dev. -1999. Vol. 13. - № 7. - P. 827-840.

85. Rubin G.M. and Spradling A.C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors // Science. 1982. - Vol. 218. - № 4570. - P. 348353.

86. Rudkin G.T. Non replicating DNA in Drosophila // Genetics. 1969. - Vol. 61. -№ 1. - P. Suppl: 227-238.

87. Rudkin G.T. Replication in polytene chromosomes // Results Probl. Cell Differ. -1972. Vol. 4. - № - P. 59-85.

88. Sachs M.S. and Geballe A.P. Downstream control of upstream open reading frames // Genes Dev. 2006. - Vol. 20. - № 8. - P. 915-921.

89. Sambrook J. and Russell D. V. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001. New York.

90. Sancar A., Lindsey-Boltz L.A., Unsal-Kacmaz K. and Linn S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints// Annu. Rev. Biochem. -2004. Vol. 73. - P. 39-85.

91. Sauer K., Knoblich J.A., Richardson H. and Lehner C.F. Distinct modes of cyclin E/cdc2c kinase regulation and S-phase control in mitotic and endorcduplication cycles of Drosophila embryogenesis // Genes Dev. 1995. - Vol. 9. - № 11. - P. 1327-1339.

92. Schmid K.J. and Tautz D. A screen for fast evolving genes from Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997. Vol. 94. - № 18. - P. 9746-9750.

93. Schwaiger M. and Schubeler D. A question of timing: emerging links between transcription and replication // Curr. Opin. Genet. Dev. 2006. - Vol. 16. - № 2. -P. 177-183.

94. Schwed G., May N., Pechersky Y. and Calvi B.R. Drosophila minichromosome maintenance 6 is required for chorion gene amplification and genomic replication // Mol. Biol. Cell. 2002. - Vol. 13. - № 2. - P. 607-620.

95. Schotta G., Ebert A., Krauss V., Fischer A., Hoffmann J., Rea S., Jenuwein T., Dorn R. and Reuter G. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing // EMBO J. 2002. - Vol. 21. -P. 1121-1131.

96. Sigrist S., Jacobs H., Stratmann R. and Lehner C.F. Exit from mitosis is regulated by Drosophila fizzy and the sequential destruction of cyclins A, B and B3 // EMBO J. 1995. - Vol. 14. - № 19. - P. 4827-4838.

97. Sigrist S.J. and Lehner C.F. Drosophila fizzy-related down-regulates mitotic cyclins and is required for cell proliferation arrest and entry into endocycles // Cell. 1997. - Vol. 90. - № 4. - P. 671-681.

98. Sinha P., Mishra A. and Lakhotia S.C. Chromosomal organization in Drosophila tumours. I polytene chromosome organization and DNA synthesis in ovarian pseudonurse cells in otu mutants of D. melanogaster. // Chromosoma. 1987. -Vol. 95. - №-P. 108-116.

99. Smith A.V. and Orr-Weaver T.L. The regulation of the cell cycle during Drosophila embryogenesis: the transition to polyteny // Development. 1991. -Vol. 112. - № 4. - P. 997-1008.

100. Spellman P.T. and Rubin G.M. Evidence for large domains of similarly expressed genes in the Drosophila genome // J. Biol. 2002. - Vol. 1. - № 1. - P. 5.

101. Spradling A.C. The organization and amplification of two chromosomal domains containing Drosophila chorion genes // Cell. 1981. - Vol. 27. - № 1 Pt 2. - P. 193-201.

102. Stokes D.G. and Perry R.P. DNA-binding and chromatin localization properties of CHD1 // Mol. Cell. Biol. 1995. - Vol. 15. - № 5. - P. 2745-2753.

103. Swanhart L., Kupsco J. and Duronio R.J. Developmental control of growth and cell cycle progression in Drosophila // Methods Mol. Biol. 2005. - Vol. 296. - №- P. 69-94.

104. Traas J., Hulskamp M., Gendreau E. and Hofte H. Endoreduplication and development: rule without dividing? // Curr. Opin. Plant. Biol. 1998. - Vol. 1. -№ 6. - P. 498-503.

105. Travers A. The location of the linker histone on the nucleosome // Tiends Biochem. Sci. 1999. - Vol. 24. - № 1. - P. 4-7.

106. Vogelauer M., Rubbi L., Lucas I., Brewer B.J. and Grunstein M. Histone acetylation regulates the time of replication origin firing // Mol. Cell. 2002. -Vol. 10. - № 5. - P. 1223-1233.

107. Wallace J.A. and Orr-Weaver T.L. Replication of heterochromatin: insights into mechanisms of epigenetic inheritance // Chromosoma. 2005. - Vol. 114. - № 6. -P. 389-402.

108. Wodarz A., Hinz U., Engelbert M. and Knust E. Expression of crumbs confers apical character on plasma membrane domains of ectodermal epithelia of Drosophila // Cell. 1995. - Vol. 82. - № 1. - P. 67-76.

109. Wong H., Victor J.M. and Mozziconacci J. An all-atom model of the chromatin fiber containing linker histones reveals a versatile structure tuned by the nucleosomal repeat length // PLoS One. 2007. - Vol. 2. - № 9. - P. e877.

110. Woodage T., Basrai M.A., Baxevanis A.D., Hieter P. and Collins F.S. Characterization of the CHD family of proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. US A.-1997. Vol. 94. - № 21. - P. 11472-11477.

111. Yuri ova A.A., Makunin I.V., Kolesnikova T.D., Posukh O.V., Belyaeva E.S. and Zhimulev I.F. Conservation of domain structure in a fast-evolving heterochromatic SUUR protein in drosophilids // Genetics. 2009. - Vol. 183. - № 1. - P. 119-129.

112. Zacharias H. Tissue-specific schedule of selective replication in Drosophila nasutoides // Roux's Archives of Developmental Biology. 1986. - Vol. 195. - № -P. 378-388.

113. Zhang G., Wang H., Shi J., Wang X., Zheng H., Wong G.K., Clark T., Wang W., Wang J. and Kang L. Identification and characterization of insect-specific proteins by genome data analysis // BMC Genomics. 2007. - Vol. 8. - № - P. 93.

114. Zhang H. and Tower J. Sequence requirements for function of the Drosophila chorion gene locus ACE3 replicator and ori-beta origin elements // Development. -2004. Vol. 131. - № 9. - P. 2089-2099.

115. Zhimulev I.F. Polytene chromosomes, heterochromatin and position effect variegation. Academic press, 1998. - 566c.

116. Zhimulev I.F., Makunin I.V., Volkova E.I., Pirrotta V. and Beliaeva E.S. Effect of four doses of the Su(UR)ES gene on intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster. // Genetika. 2000. - Vol. 36. - № 8. - P. 1061-1070.

117. Zhimulev I.F. and Belyaeva E.S. Intercalary heterochromatin and genetic silencing // Bioessays. 2003. - Vol. 25. - № 11. - P. 1040-1051.

118. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Semeshin V.F., Koryakov D.E., Demakov S.A., Demakova O.V., Pokholkova G.V. and Andreyeva E.N. Polytene chromosomes: 70 years of genetic research // Int. Rev. Cytol. 2004. - Vol. 241. - № - P. 203275.

119. Zielke N., Querings S., Rottig С., Lehner С. and Sprenger F. The anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) is required for rereplication control in endoreplication cycles // Genes Dev. 2008. - Vol. 22. - № 12. - P. 1690-1703.

120. Коряков Д.Е. и Жимулев И.Ф. Хромососы. Структура и функции -Новосибирск: Издательство СО РАН, 2009. 258с.

121. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C., Холодилов Н.Г., Блинов А.Г., Кузьминов A.B., Головин С.Я., Наякшин A.M., Соловьев В.В., Ямщиков

122. B.Ф., и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. -Новосибирск: Наука. Сибирское отделение, 1990. 248с.

123. Маниатис Т., Фрич Э. и Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984. - 480с.

124. Прокофьева-Бельговская A.A. Гетерохроматические районы хромосом. -Москва: Наука 1986. 432с

125. Жимулев И.Ф. Политенные хромосомы: морфология и структуры. -Новосибирск: Новосибирск: "Наука" сибирское отделение, 1992. 480с.

126. Жимулёв И.Ф., Беляева Е.С., Андреенкова Н.Г., Андреева E.H. Белякин

Информация о работе

Юрлова, Анна Александровна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.01.07

Диссертация

Структурные домены белка SUUR, контролирующего позднюю репликацию политенных хромосом Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы