Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и характеристика ориджинов репликации центра инактивации X-хромосомы полевки Microtus levis

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и характеристика ориджинов репликации центра инактивации X-хромосомы полевки Microtus levis"

На правах рукописи

Шерстюк Владимир Владимирович

ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОРИДЖИНОВ РЕПЛИКАЦИИ ЦЕНТРА ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ ПОЛЕВКИ MICROTUS

LEVIS

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005570351

Новосибирск 2015

005570351

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук в лаборатории эпигенетики развития, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Закиян Сурен Минасович

Официальные оппоненты: Демаков Сергей Анатольевич

доктор биологических наук, заведующий лабораторией хромосомной инженерии, ФГБУН Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Жарков Дмитрий Олегович

доктор биологических наук, доцент, руководитель группы взаимодействий биополимеров, ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт биологии и биофизики Томского государственного университета '

Защита диссертации состоится <'Jrt» и/а Л. 2015 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: пр. академика Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090 тел: (383) 363-49-06 (1321); факс: (383) 333-12-78; .. e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН и на сайте Института: www.bionet.nsc.ru. Автореферат разослан «2$> ма 15 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Репликация ДНК - это основной процесс S фазы клеточного цикла. Точка начала репликации или ориджин репликации (от англ. origin of replication) - это последовательность нуклеотидов в геноме, на которых осуществляется инициация репликации. В отличие от прокариот, геном которых содержит, как правило, один ориджин репликации, геном эукариот реплицируется с большого количества ориджинов (Gao, Zhang, 2007). В одной из первых работ по изучению репликации ДНК у эукариот было показано, что для репликации генома млекопитающих используется 30,000-50,000 ориджинов (Huberman, Riggs, 1966). При этом данное количество - лишь малая часть от всех ориджинов в геноме. На сегодняшний день в результате развития полногеномных технологий были картированы ориджины репликации в геномах мыши и человека (Besnard et al., 2012; Cayrou et al., 2011). Установлено, что геном человека содержит 200,000-250,000 ориджинов. Данные работы также свидетельствуют о наличии в геноме зон инициации репликации, состоящих из множества ориджинов репликации. Таким образом, встает вопрос о том, как происходит выбор ориджинов, на которых произойдет инициация репликации в каждом конкретном клеточном цикле. Считается, что выбор ориджина репликации в пределах зоны происходит случайно с определенной вероятностью или эффективностью. Каждый ориджин репликации имеет определенную эффективность, которая, в свою очередь, регулируется множеством эпигенетических факторов и механизмов. Полногеномный анализ ориджинов репликации позволяет выявить корреляцию между расположением и эффективностью ориджинов и определенными эпигенетическими характеристиками. Однако, такой анализ не дает полного представления о механизмах и факторах, непосредственно участвующих в регуляции эффективности отдельных ориджинов в пределах зон инициации репликации. Таким образом, изучение ориджинов репликации и их эпигенетических характеристик в пределах отдельных зон инициации репликации необходимо для понимания и установления механизмов их регуляции.

Малоизученными также остаются изменения в эффективности ориджинов, происходящие в ходе клеточной дифференцировки. Сравнение паттерна инициации репликации в различных типах клеток будет способствовать решению данного вопроса, а также установлению определяющих эффективность ориджинов факторов.

Кроме того, на сегодняшний день практически отсутствуют данные по консервативности ориджинов репликации в ортологичных участках геномов близкородственных видов. В данном исследовании планировалось картировать ориджины репликации в центре инактивации Х-хромосомы в трофобластных стволовых (ТС) клетках, клетках экстраэмбриональной эндодермы (XEN) и в фибробластах полевки Microtus levis. Также планировалось локализовать районы связывания комплекса распознавания ориджинов, который необходим для функционирования ориджина репликации и определяет его месторасположение, и провести анализ нуклеотидных последовательностей и эпигенетических характеристик выявленных ориджинов репликации в данном локусе в

фибробластах полевки. Центр инактивации Х-хромосомы М. levis представляет собой протяженный район размером около 60 т.п.н., в состав которого входят четыре гена: Enox, Xist, Tsix, SIc7a3, первые три из которых кодируют длинные некодирующие РНК и участвуют в процессе Х-инактивации у самок млекопитающих.

Ранее были выявлены ориджины репликации в центре инактивации X-хромосомы мыши Mus musculus (Gomez, Brockdorff, 2004; Rowntree, Lee, 2006). Таким образом, поиск и характеристика ориджинов репликации в центре инактивации Х-хромосомы полевки М. levis позволит установить степень консервативности ориджинов в данном локусе у двух данных видов млекопитающих, а также выявить общие механизмы регуляции их эффективности.

Цель работы — выявить и охарактеризовать ориджины репликации в центре инактивации Х-хромосомы у самцов полевки М. levis.

Задачи:

1. Выявить расположение активных ориджинов репликации в центре инактивации Х-хромосомы в трофобластных стволовых клетках, клетках экстраэмбриональной эндодермы и в фибробластах самцов полевки М. levis;

2. Определить локализацию сайтов связывания комплекса распознавания ориджинов (ORC) в центре инактивации Х-хромосомы в фибробластах самцов полевки М. levis;

3. Провести анализ нуклеотидного состава районов связывания ORC в центре инактивации Х-хромосомы полевки М. levis;

4. Провести анализ плотности распределения гистона НЗ и его варианта НЗ.З в центре инактивации Х-хромосомы в фибробластах самцов полевки М. levis;

5. Определить паттерн следующих модификаций гистонов: ацетилированного НЗК9, монометилированного Н4К20 и триметилированного НЗК27 в центре инактивации Х-хромосомы в фибробластах самцов полевки М. levis;

6. Провести сравнительный анализ расположения и активности ориджинов репликации в центре инактивации Х-хромосомы М. levis и М. musculus.

Научная новизна работы. Впервые выявлены ориджины репликации в центре инактивации Х-хромосомы полевки М. levis. Показано, что центр инактивации Х-хромосомы М. levis представляет собой зону инициации репликации, в состав которой входит как минимум пять ориджинов репликации. Локализованы сайты связывания комплекса распознавания ориджинов в данном локусе, что подтверждает наличие ориджинов репликации. Кроме того, выявлен один потенциальный ориджин репликации. Показано, что эффективность обнаруженных ориджинов изменяется в зависимости от типа клеток. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей в районах ориджинов, а также

эпигенетических характеристик в исследуемом локусе. Проведен сравнительный анализ ориджинов репликации в данном локусе у М. musculus и М. levis. Выявлены консервативные и вариабельные ориджины в данном локусе у данных видов.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты данной работы вносят вклад в понимание локализации ориджинов репликации и их регуляции в геноме млекопитающих и будут интересны для исследователей, занимающихся изучением организации генома млекопитающих и процесса инициации репликации.

Основные положения работы, выносимые на защиту.

1. Центр инактивации Х-хромосомы полевки М. levis представляет собой зону инициации репликации, в составе которой можно выделить пять ориджинов репликации;

2. Наиболее эффективный ориджин репликации в центре инактивации X-хромосомы полевки М. levis ассоциирован с модификациями гистонов, характерными для открытой структуры хроматина.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2011 г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2013 (Москва, 2013 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН. По материалам диссертации опубликованы три статьи - в рецензируемых отечественном и зарубежных журналах из списка ВАК.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Культивирование трофобластных стволовых клеток осуществлялось совместно с к.б.н. Е.А. Васьковой. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводилось совместно с к.б.н. А.И. Шевченко.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 137 страницах, содержит 31 рисунок и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Объект исследования. Для картирования ориджинов репликации в центре инактивации Х-хромосомы была выделена нсДНК размером от 750 до 1500 п.н. из культур фибробластов, ТС клеток и клеток XEN самцов М. levis. Модификации хроматина в центре инактивации Х-хромосомы были исследованы в культуре фибробластов самцов М. levis. Используемые линии клеток были получены и охарактеризованы в лаборатории эпигенетики развития ИЦиГ СО РАН и имеют кариотип 54 XY. Нуклеотидная последовательность центра инактивации Х-хромосомы полевки М. levis определена (Nesterova et al, 2001) и зарегистрирована в базе данных EMBL под регистрационным номером [AJ310130],

2. Методы работы с клеточными культурами

2.1 Условия культивирования. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа. Пересев фибробластов, ТС клеток и клеток XEN проводили каждые 2-4 дня, в зависимости от плотности клеток. Фибробласты и ТС клетки промывали буфером PBS, после чего добавляли 0,05% для ТС клеток и 0,25% для фибробластов раствор трипсина, соответственно. Через 2-3 мин. трипсин нейтрализовали ростовой средой, ресуспендировали клетки и переносили суспензию в новую культуральную емкость в соотношении от 1:3 до 1:5. Клетки XEN снимали с культуральной поверхности механически и рассаживали в соотношении 1:3. Для ТС клеток и клеток XEN культуральную поверхность предварительно обрабатывали раствором 0,1% желатина в течение 10 мин. при комнатной температуре.

3. Получение нсДНК из асинхронно делящейся культуры клеток. Для

выделения нсДНК использовали от 20 до 100 миллионов клеток. Клетки дважды промывали PBS при 4°С и снимали с помощью трипсина в случае фибробластов и ТС клеток или механически в случае XEN клеток. Полученную суспензию клеток центрифугировали (1000 об./мин., 3 мин.) и ресуспендировали в PBS, содержащем 10% глицерина. Затем суспензию клеток наносили в 1,2% агарозный гель, содержащий 50 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА и лизировали в течение 10 минут (Gerhardt et al., 2006). Электрофорез смеси проводили в течение шести часов при 5°С и напряжении 1,5 В/см в щелочном буфере. Одновременно с образцом в соседней дорожке проводили электрофорез маркера молекулярного веса ДНК. После электрофореза полоски геля с геномной ДНК и маркером инкубировали в течение 30 мин. в нейтрализующем буфере, маркер и геномную ДНК отдельно (Staib, Grummt, 1997). Для маркера использовали нейтрализующий буфер с бромистым этидием, в концентрации 0,5 мкг/мл. Маркер молекулярного веса ДНК визуализировали с помощью УФ света и фотографировали рядом с линейкой. На геле с геномной ДНК определяли положение фракций ДНК, содержащих фрагменты размером от 750 до 1500 п.н. и вырезали их из геля. Необходимую для работы фракцию нсДНК (750-1500 п.н.) выделяли из геля с помощью набора QIAquick gel extraction kit, согласно инструкции производителя с некоторыми модификациями.

4. Иммунопреципитация хроматина (СЫР). ChIP проводили согласно протоколу (Lee et al., 2006), с некоторыми модификациями. Для получения хроматина из культуры фибробластов самцов М. levis клетки (~107 клеток) снимали с помощью трипсина и промывали два раза PBS. Клетки осаждали при 1000 об/мин., 5 мин. и ресуспендировали в 9 мл ростовой среды. К суспензии клеток добавляли 270 мкл 37% формальдегида, инкубировали в течение 5 мин. при постоянном перемешивании. Добавляли 1 мл 1,25 М раствора глицина, инкубировали в течение 5 мин. при постоянном перемешивании и центрифугировали 5 мин. при 400xg и 4°С. Полученный осадок дважды промывали PBS, 4°С, осаждали 5 мин. при 700*g и 4°С. Клетки лизировали до ядер добавлением 1 мл лизирующего буфера №1 для ChIP в течение 10 мин. на льду при постоянном перемешивании. Ядра осаждали 5 мин. при 1350xg и 4°С, ресуспендировали в лизирующем буфере №2 для ChIP, инкубировали в течение 5 мин. при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Осаждали, как написано выше, и ресуспендировали в 300 мкл лизирующего буфера №3 для

ChIP. Ядра клеток обрабатывали ультразвуком на приборе Vibra-Cell VCX130 (Sonics) при следующих параметрах: амплитуда 30%, 4 цикла по 30 сек. Между циклами образец инкубировали на льду 30 сек. В результате получали фрагменты хроматина размером от 100 до 500 п.н. К полученному хроматину добавляли 1/10 объема 10% Triton Х-100 и центрифугировали в течение 10 мин. при 16,000 xg и 4°С. Супернатант переносили в чистую пробирку. Для одной реакции ChIP использовали количество хроматина соответствующего 2 миллионам клеток (в случае реакций с антителами против гистона НЗ, НЗ.З и модификаций гистонов), либо 10 миллионам клеток (в случае реакции с антителами против ORC4). Реакцию проводили в 500 мкл лизирующего буфера №3, содержащего 1% Triton Х-100. К хроматину добавляли антитела и инкубировали в течение 16 часов при 4°С и постоянном перемешивании. Для положительного контроля параллельно проводили реакцию с антителами против гистона НЗ, а для отрицательного - реакцию без антител. Отбирали количество хроматина, соответствующего 2 миллионам клеток, и очищали как описано далее (Input хроматин). Затем к образцам добавляли 20 мкл магнитных шариков, дважды промытых в 1,5 мл блокирующего буфера для ChIP. Инкубировали 6 часов при 4°С. Образцы промывали 5 раз в 1 мл отмывочного буфера для ChIP и 1 раз в 1 мл буфера ТЕ, содержащем 50 мМ NaCl. Магнитные шарики центрифугировали 3 мин. при 960*g и 4°С, отбирали остатки буфера и добавляли 200 мкл буфера для элюции. Элюцию проводили в течение 30 мин. при 65°С, периодически перемешивая. Магнитные шарики осаждали центрифугированием в течение 1 мин. при 16,000xg. Супернатант переносили в чистую пробирку и инкубировали от 6 до 15 часов при 65 С. К Input хроматину добавляли 3 объема буфера для элюции и далее инкубировали вместе с остальными образцами. К образцам и Input хроматину добавляли РНКазу А, конечная концентрация 200 мкг/мл, протеиназу К, конечная концентрация 400 мкг/мл, и инкубировали 2 часа при 55°С. Образцы очищали с использованием набора MinElute PCR Purification Kit в соответствии с инструкцией производителя. ДНК, полученную в результате ChIP реакций с антителами против ORC4, амплифицировали с использованием набора GenomePlex® Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit в соответствии с инструкцией производителя. Амплификацию проводили на приборе GeneAmp* PCR System 9700 (Applied Biosystems).

5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени. Для

проведения одной реакции (30 мкл) смешивали: 10х буфер для ДНК-полимеразы Taq №2 - 3 мкл; dATP, dTTP, dCTP, dGTP (2,5 мМ каждый) - 3 мкл; праймеры (10 мМ каждый) - 0,9 мкл; зонд (10 мМ, 5' - Tamra, 3' - BHQ2) - 0,75 мкл; матрица - 5 мкл выделенной и разбавленной до 1 мл нсДНК; ДНК-полимераза Taq (1 ед./мкл) - 0,6 мкл; Н20 до 30 мкл.

Реакцию проводили на амплификаторе iQ5 (Bio-Rad), либо LightCycler 480 (Roche) в течение 40 циклов. Каждый цикл состоял из двух стадий: 95°С — 15 сек., 60°С - 1 мин. Анализ полученных данных проводили в программах Bio-Rad iQ5 Software v2.0 (Bio-Rad), LightCycler 480 SW 1.5 (Roche), Microsoft Excel 2013. При анализе нсДНК представленность целевой ДНК последовательности определяли сравнением значения Ct в каждом образце со стандартной кривой,

полученной из 7 точек серийного разведения рекомбинантной ДНК (множитель разведения 10х). При анализе ДНК, полученной в реакции иммунопреципитации хроматина, представленность целевой ДНК последовательности определяли сравнением значения Ср в каждом образце со стандартной кривой, полученной из 4 точек серийного разведения Input ДНК (множитель разведения 5х). Все ПЦР-реакции были повторены два раза. В качестве отрицательного контроля вместо матрицы в реакцию добавляли Н20. Статистический анализ результатов ПЦР анализа ChIP реакций проводили с использованием метода однофакгорного дисперсионного анализа и критерия Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.1. Картирование активных ориджинов репликации методом NSAA в ТС клетках, клетках XEN и фибробластах самцов полевки М. levis

Картирование активных ориджинов репликации в локусе XIC М. levis было проведено в ТС клетках, клетках XEN и фибробластах. Данные линии клеток были получены ранее в лаборатории эпигенетики развития ИЦиГ СО РАН из эмбрионов М. levis и имеют кариотип 54 XY. Таким образом исследуемый локус представлен одной копией на геном, что дает возможность быть уверенными в том, что выявленные активные ориджины репликации, а также модификации гистонов, не представляют совокупность таковых на двух гомологичных Х-хромосомах. Картирование активных ориджинов проводили методом анализа количества новосинтезированных нитей ДНК (NSAA: nascent strands abundance assay). Анализ количества нсДНК длиной 750-1500 п.н. в различных участках локуса XIC М. levis проводили методом количественной ПЦР в реальном времени, детекцию продуктов амплификации осуществляли с использованием зондов TaqMan. На свободные от повторенных последовательностей ДНК районы XIC М. levis было подобрано тридцать пар праймеров. НсДНК размером от 750 до 1500 п.н. выделяли из асинхронно делящихся культур клеток. Количество нсДНК в каждой точке определяли по методу стандартной кривой. Для ее построения использовали рекомбинантные ДНК на основе фагмиды pBluescript II SK (+), содержащие в качестве встроек фрагменты ДНК локуса XIC М. levis, известной концентрации (Nesterova et. al., 2001). При построении гистограмм количество копий нсДНК в каждой точке нормировали на сайт, содержащий наименьшее количество копий нсДНК для каждого типа клеток в отдельности. В качестве критерия для ориджина репликации использовали относительное обогащение нсДНК превышающее минимальный уровень в 4, 20, 10 раз для ТС клеток, клеток XEN и фибробластов, соответственно. В результате анализа паттерна нсДНК в локусе XIC в ТС клетках было выявлено четыре активных ориджинов репликации, которые расположены в районе гена Епох (сайты 1-4), в первом экзоне гена Xist (сайты 7-9, 11), в четвертом экзоне гена Xist (сайт 15), в районе промотора гена Tsix (сайт 25) (Рисунок 1 А, Б). В клетках XEN было выявлено четыре активных ориджина репликации, которые расположены в первом экзоне гена Xist (сайты 79, 11), в четвертом экзоне тепа. Xist (сайт 15), в первом интроне гена Tsix около 700 п.н. ниже сайта старта транскрипции гена Tsix, в районе 4 т.п.н. выше сайта старта транскрипции гена Tsix (сайты 24, 26), в районе гена Slc7a3 (сайт 29)

(Рисунок 1 А, В). В фибробластах выявлен один наиболее активный ориджин репликации, расположенный в первом экзоне и в районе промотора гена Xist (сайты 6-12) (Рисунок 1 А, Г)- Кроме того, в фибробластах выявляется активность ориджинов, расположенных в районе гена Епох (сайт 2), в четвертом экзоне гена Xist (сайт 15), в первом интроне гена Tsix (сайт 24) и в районе гена Slc7a3 (сайт 28). Эффективность данных ориджинов значительно ниже по сравнению с эффективностью ориджина в первом экзоне и в промоторе гена Xist. Таким образом, инициация репликации в локусе XIC М. levis наблюдается в протяженных районах размером до 6 т.п.н. При этом в зависимости от типа клеток различные участки в пределах одного ориджина инициируют репликацию с различной эффективностью. Большое количество участков, в которых происходит инициация репликации, позволяет предположить, что локус XIC М. levis представляет собой зону инициации репликации, в составе которой можно выделить пять ориджинов репликации. При этом данные ориджины репликации, за исключением расположенного в четвертом экзоне гена Xist, по-видимому, имеют множество точек инициации репликации. 1.2. Локализация сайтов связывания ORC в локусе XIC в фибробластах самцов М. levis

ORC - основной компонент pre-RC, который определяет локализацию ориджинов (Dififley et al., 1994). Поиск сайтов связывания данного комплекса позволяет, во-первых, подтвердить наличие ориджинов репликации, картированных методом NSAA, а во-вторых, выявить потенциальные ориджины, которые неактивны в данных типах клеток при данных условиях культивирования. Сайты связывания ORC выявляли методом ChlP с использованием антител против компонента данного комплекса - 0RC4 в фибробластах самцов М. levis. Полученную в результате ChlP реакции с антителами против 0RC4 ДНК амплифицировали с использованием набора GenomePlex* Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit и анализировали при помощи ПЦР в реальном времени. Результаты ПЦР анализа в реальном времени этой и всех последующих ChlP реакций представлены в виде гистограмм, относительное количество ДНК в каждой точке определяли в процентах от общего количества хроматина, использованного для реакции ChlP (Input хроматин). В качестве отрицательного контроля проводили ChlP реакцию без использования антител. Отрицательный контроль также амплифицировали с использованием WGA Kit. Статистический анализ проводили с использованием метода однофакторного дисперсионного анализа и критерия Фишера. Связывание ORC определяли в сравнении с соседними районами.

В результате анализа в фибробластах М. levis было выявлено 12 сайтов связывания ORC. Данные сайты располагаются в районе гена Епох (сайты 1, 3), в промоторе (сайт 6), в первом экзоне (сайт 8), в третьем интроне (сайт 14), в четвертом экзоне (сайт 15), в седьмом интроне (сайт 16) гена Xist, два сайта в первом интроне гена Tsix: около 10 т.п.н. и 3 т.п.н ниже сайта старта транскрипции гена Tsix (сайты 19 и 23), в промоторе гена Tsix (сайт 25), в районе гена Slc7a3 (сайты 28 и 29) (Рисунок 2).

ТС клетки

XEN клетки

240

О ?00

3 о 5 160

¡= Я 120

£ 1С 80

40

Фибробласты

О.

2

4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Номер сайта

□ _

28 29 30

Рисунок 1. Картирование ориджинов репликации методом NSAA в локусе XIC в ТС клетках, клетках XEN и в фибробластах самцов М. levis.

(А). Схема расположения ориджинов репликации в локусе XIC М. levis в трех типах клеток. Экзоны генов отображены прямоугольниками, направление транскрипции показано стрелками, оранжевые точки - CGI. Цифрами внизу обозначено расположение пар праймеров, используемых в работе. Активные ориджины репликации обозначены зелеными звездочками, ориджины, показывающие низкую активность в фибробластах, - красными звездочками. (Б-Г). Результаты количественного ПЦР анализа нсДНК длиной 750-1500 п.н в ТС клетках (Б), клетках XEN (В) и в фибробластах (Г). По оси абсцисс расположены сайты, ограниченные парами праймеров, по оси ординат относительное обогащение нсДНК по сравнению с сайтом, показавшим наименьшее количество копий нсДНК в данном типе клеток.

Девять из двенадцати районов связывания (ЖС совпадают с сайтами, демонстрирующими инициацию репликации хотя бы в одном из типов клеток (сайты 1, 3, 6, 8, 14, 15, 25, 28, 29). Расположение сайтов связывания О КС подтверждает наличие ориджинов репликации, картированных методом ШАА в данных районах._

ORC4

1

0,5 О

О

Гт

Оп

Л Гг 1 ]''г

пп П 1 П

8 9 10 13 14 15 16 1? 18 19 22 23 24 25 26 _Номер сайта_

□

:8 29 30

Рисунок 2. Локализация ORC в локусе XIC в фибробластах М levis.

Результаты ПЦР анализа в реальном времени реакций СЫР с использованием антител против ORC4. По оси абсцисс расположены сайты, ограниченные парами праймеров. по оси ординат количество ДНК выраженное в процентах от Input хроматина. Темно-оранжевые столбики -отрицательный контроль (СЫР реакция без антител). Звездочками обозначены точки, демонстрирующие достоверное увеличение количества ДНК по сравнению с соседними районами, Р <0,05 (однофакторный дисперсионный анализ, критерий Фишера) 2. Анализ нуклеотидного состава ориджинов репликации в локусе XIC М. levis

Несмотря на отсутствие консенсусной последовательности ориджинов репликации у высших эукарисгг, в ряде исследований было показано, что многие ориджины локализуются в районах с повышенным содержанием АТ-нуклеотидов и присутствием poly(dA)-poly(dT) трактов (Aladjem, 2007; Altman, Fanning, 2004; Karnani et al., 2011). Проведен анализ последовательности ДНК в пределах от -500 до +500 п.н. от праймерных пар, которые демонстрируют связывание ORC. Практически во всех районах связывания ORC не наблюдалось значительного изменения процентного содержания AT и ОС нуклеотидов по сравнению со всем локусом (процент АТ-пар около 56), за исключением сайтов, расположенных в районе гена Епох (сайт 1, процент АТ-пар около 65) и в районе гена Slc7a3 (сайт 29, процент АТ-пар около 47).

Poly(dA)-poly(dT) тракты представляют собой последовательности из повторяющихся нуклеотидов (А на одной цепи ДНК, Т на другой) длиной от 10 п.н. Данные тракты препятствуют формированию нуклеосом. что приводит к образованию свободных от нуклеосом районов длиной до 300 п.н. (Segal, Widom, 2009). ORC преимущественно связывается в районах с низкой нуклеосомной плотностью (Berbenetz et al., 2010; Eaton et al., 2010, 2011; Lubelsky et al., 2011; MacAlpine et al., 2010; Petesch, Lis, 2008: Yin et al., 2009). В локусе XIC М. levis было выявлено 27 poly(dA)-poly(dT) трактов, при этом 10 из них расположены на расстоянии менее 600 п.н. от ближайшего сайта связывания ORC. 6 из 12 районов связывания ORC, расположены на расстоянии менее 600 п.н. от poly(dA)-poly(dT) трактов.

Проверку случайности расположения poly(dA)-poly(dT) трактов вблизи сайтов связывания ORC и наоборот проводили методом статистического бутстрэпа с использованием программы Microsoft Excel. При случайном распределении poly(dA)-poly(dT) трактов в локусе XIC среднее количество трактов, расположенных вблизи сайтов связывания ORC, составляет 3 тракта (SD=1,57; 1000 итераций). Фактическое количество poly(dA)-poly(dT) трактов, расположенных вблизи сайтов связывания ORC, (10 из 27, 37%) превышает случайное в 3,33 раза. При случайном распределении районов связывания ORC, вблизи poIy(dA)-poly(dT) трактов располагается в среднем 2 района (SD=1,27; 1000 итераций). Фактическое количество сайтов связывания ORC, расположенных вблизи poly(dA)-poly(dT) трактов, (6 из 12, 50%) превышает случайное в 3 раза. Таким образом, можно предположить, что расположение ORC вблизи poly(dA)-poly(dT) трактов в локусе XIC полевки неслучайно.

3. Анализ ассоциации ориджинов репликации с G4 мотивами

В ряде работ было показано, что около 70% ориджинов репликации в геноме мыши и 90% в геноме человека ассоциированы с мотивами, способными формировать G-квадруплексы (Besnard et al., 2012; Cayrou et al., 2012). Для того, чтобы выяснить наблюдается ли ассоциация ориджинов в локусе XIC М. levis с G4 мотивами, последовательность локуса была проанализирована на наличие данных мотивов. Анализ был проведен с использованием программы QGRS mapper (Kikin et al., 2006). Для определения G4 мотивов была выбрана следующая последовательность: G3Ni_i5G3Ni_i5G3Ni_i5G3 (Besnard et al., 2012; Cayrou et al., 2012). В локусе XIC M. levis было выявлено 25 G4 мотивов. Установлено, что в районах активных ориджинов репликации в локусе XIC М. levis, за исключением ориджина в четвертом экзоне гена Xist, выявляются G4 мотивы. Большое количество G4 мотивов и районов, инициирующих репликацию, в локусе XIC М. levis может быть причиной того, что ассоциация ориджинов с G4 мотивами случайна. Для того, чтобы проверить данное предположение, был проведен анализ методом статистического бутстрэпа с использованием программы Microsoft Excel. При случайном распределении G4 мотивов в локусе XIC среднее количество мотивов, ассоциированных с ориджинами репликации, составляет 12 мотивов (SD=2,4; 1000 итераций). Фактическое количество G4 мотивов, ассоциированных с ориджинами (15 из 25, 60%), превышает случайное в 1,25 раза. При случайном распределении сайтов, демонстрирующих инициацию репликации, в локусе XIC полевки количество сайтов, ассоциированных с G4 мотивами, составляет 7 сайтов (SD=2,03; 1000 итераций). Фактическое количество сайтов, демонстрирующих инициацию репликации и ассоциированных с G4 мотивами, составляет 7 сайтов и не превышает случайное. Данные результаты указывают на случайную ассоциацию G4 мотивов с ориджинами репликации в локусе XIC полевки.

4. Статус экспрессии генов в локусе XIC в фибробластах самцов М. levis

В одной из работ было показано, что ориджины преимущественно ассоциированы с генами, транскрибирующимися на умеренном уровне (Martin et al., 2011). С другой стороны, анализ расположения ориджинов, картированных методом bubble-trap, показал ассоциацию значительной части ориджинов с неактивными генами в клетках человека (Mesner et al., 2013). Показано, что

активность ориджинов репликации в локусе XIC мыши не зависит от активности ассоциированных с ними генов (Gomez, Brockdorff, 2004: Rowntree. Lee, 2006). В ТС клетках и клетках XEN на активной Х-хромосоме самки и единственной X-хромосоме самца гены Enox, Tsix и Slc7a3 активны, а ген Xist неактивен (Shevchenko et al., 2011). С помощью ПЦР анализа с обратной транскрипцией установлено, что в используемой линии фибробластов самцов М. levis данные гены имеют аналогичное состояние. Ориджины репликации в локусе XIC М. levis располагаются в транскрибируемых районах и промоторах генов, за исключением сайта инициации репликации, расположенного на расстоянии 5 т.п.н. выше сайта старта транскрипции гена Tsix (сайт 26). Однако, активность некоторых ориджинов значительно изменяется в зависимости от типа клеток, при неизменном статусе экспрессии ассоциированных с ними генов. Таким образом, активность ориджинов репликации в локусе XIC М. levis не зависит от транскрипционного статуса прилежащего хроматина. 5. Распределение гистона НЗ и его варианта НЗ.З в локусе XIC М. levis

Как известно, ORC, зачастую, связывается в районах, для которых характерна пониженная плотность нуклеосом и наличие варианта гистона НЗ.З (Deal et al., 2010; Eaton et al., 2011; MacAlpine et al., 2010; Roy et al., 2010: Stroud et al., 2012). В данной работе был проведен анализ распределения гистона НЗ и его варианта НЗ.З в исследуемом локусе в фибробластах самцов М. levis. Установлено, что значимое снижение плотности гистона НЗ наблюдается в первом экзоне гена Xist (сайт 10) (Рисунок 3). Статистический анализ здесь и далее проводили с использованием метода однофакторного дисперсионного анализа и критерия Фишера. Снижение плотности гистона НЗ определяли в сравнении со средним значением в локусе.

Вариант гистона НЗ - гистон НЗ.З наблюдается вблизи гена Епох (сайт 4), в промоторе и первом экзоне гена Xist (сайты 6-9), в первом и третьем интронах гена Xist (сайты 13-14), на расстоянии около 6 т.п.н. ниже сайта старта транскрипции гена Tsix (сайт 20) (Рисунок 4)._

ё- 0.6 I I I I I I I I I * I I

ё" 0.4 I I I I I I I I I Ш I

0,2 I I

0 ■ ■ ■ ■ И ■ ■ ■ Ш Ш я Я Л Ш ■ ■ ■ ■ ■ Ш Я И-Б ИЛ III

1 2 3 4 5 б 7 6 9 10 и 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Номер сайта

Рисунок 3. Паттерн распределения гистона НЗ в локусе XIC в фибробластах М. levis. Результаты ПЦР анализа в реальном времени реакций ChIP с использованием антител против НЗ. По оси абсцисс расположены сайты, ограниченные парами праймеров, по оси ординат -количество ДНК, выраженное в процентах от Input хроматина Звездочками обозначены точки, демонстрирующие достоверное снижение плотности гистона НЗ по сравнению со средним значением в локусе, Р <0,05 (однофакторный дисперсионный анализ, критерий Фишера).

НПО

ODD

Т

OD п п IJ ml D П LI Do on П

10 11 12 13 14 lî 16 17 IS 19 20 2! 22 23 24 25 Номер caftra

Рисунок 4. Паттерн распределения гистона НЗ.З в локусе XIC в фибробластах М. levis. Результаты ПЦР анализа в реальном времени реакций ChIP с использованием антител против НЗ.З. По оси абсцисс расположены сайты, ограниченные парами праймеров, по оси ординат -количество ДНК, выраженное в процентах от Input хроматина. Темно-оранжевые столбики -отрицательный контроль (ChIP реакция без антител). Звездочками обозначены точки, демонстрирующие достоверное увеличение уровня НЗ.З по сравнению со средним значением в локусе, Р <0,05 (однофакторный дисперсионный анализ, критерий Фишера).

Таким образом, в районах связывания ORC не наблюдается снижение плотности гистона НЗ. и лишь для части из них характерно наличие гистона НЗ.З (сайты 6, 8, 14). Наиболее эффективный ориджин репликации в фибробластах М. levis ассоциирован с минимальной плотностью гистона НЗ, наблюдаемой в первом экзоне гена Xist (сайт 10) и с протяженным участком длиной около 3 т.п.н., содержащем гистон НЗ.З.

6. Модификации хроматина в локусе XIC в фибробластах самцов М. levis. Паттерн ацетилирования НЗК9, монометилирования Н4К20 и триметилирования НЗК27

Модификация N-концевых остатков гистонов - один из механизмов регуляции структуры хроматина, которая влияет на эффективность ориджинов репликации. Был проведен анализ паттерна НЗК9ас, H4K20mel и НЗК27теЗ в локусе XIC в фибробластах самцов М. levis методами ChIP и ПЦР в реальном времени. Известно, что ацетилирование гистонов НЗ, в частности НЗК9ас, и Н4 характерно для открытого хроматина и ассоциировано со многими ориджинами репликации (Cadoret et al.. 2008; Sequeira-Mendes et al., 2009). H4K20mel участвует в регуляции лицензирования ориджинов репликации, кроме того для нескольких ориджинов в геноме человека показан повышенный уровень данной модификации (Tardai et al., 2010). H3K27me3 участвует в репрессии генов и свойственно неактивному хроматину. Данная модификация и белки группы Polycomb играют важную роль в регуляции репликации ДНК. в частности, в средней и поздней S фазе у дрозофилы, человека и мыши (Aoto et al., 2008; Lo Sardo et al., 2013; Posfai et al, 2012). Кроме того, наблюдается высокий уровень ассоциации ориджинов, активирующихся в средней S фазе, с НЗК27шеЗ (Picard et al., 2014). Достоверное увеличение уровня НЗК9ас, H4K20mel и НЗК27теЗ определяли в сравнении со средним значением в локусе с использованием однофакторного дисперсионного анализа и критерия Фишера.

НЗК9ас наблюдается в промоторе, первом экзоне и первом интроне гена Xist (сайты 6, 8-11, 13) (Рисунок 5). Таким образом, район наиболее эффективного ориджина в фибробластах самцов М. levis характеризуется

присутствием гистона НЗ.З и НЗК9ас, причем максимальный уровень НЗК9ас наблюдается в промоторе гена Xist. H4K20mel наблюдается во всем локусе XIC М. levis (Рисунок 6). Однако в районе, содержащем активный ориджин в фибробластах М. levis, уровень данной модификации, по сравнению с остальными участками в локусе, значительно снижен (сайты 5-12). Снижение уровня Н4К20ше 1 в первом экзоне и промоторе гена Xist также свидетельствует об открытой структуре хроматина, на что указывает присутствие гистона НЗ.З и НЗК9ас. В результате анализа паттерна НЗК.27шеЗ установлено, что данная модификация локализуется в 3' районе первого экзона (сайты 11 -12) и в седьмом интроне гена Xist (сайты 16-18), в промоторе, первом экзоне и первом йнтроне гена Tsix, а также в участке 5 т.п.н. выше сайта старта транскрипции гена Ts ix (сайты 21-26), в 5? области гена Slc7a3 (сайт 30) (Рисунок 7)._

о.з

0,25

--п п

10 11 12 13 14 15 16 17 IS 19 Помер Liiitra

Рисунок 5. Паттерн ацетилирования НЗК9 в локусе XIC в фибробластах М levis. Результаты ПЦР анализа в реальном времени реакций ChIP с использованием антител против НЗК9ас. По оси абсцисс расположены сайты, ограниченные парами праймеров, по оси ординат — количество ДНК, выраженное в процентах от Input хроматина. Темно-оранжевые столбики -отрицательный контроль (ChIP реакция без антител). Звездочками обозначены точки, демонстрирующие достоверное увеличение уровня НЗК9ас по сравнению со средним значением в локусе, Р <0,05 (однофакторный дисперсионный анализ, критерий Фишера) _

Н4К20ше1

I 2 3 Л 5 6 7 8 о 10 II 12 13 14 15 16 17 IS 19 20 2 ! 22 23 24 25 2Ь 27 Z& 2Р 30 __Номер сайта

Рисунок 6. Паттерн монометилирования Н4К20 в локусе XIC в фибробластах М. levis. Результаты ПЦР анализа в реальном времени реакций ChIP с использованием антител против H4K20mel. По оси абсцисс расположены сайты, ограниченные парами праймеров, по оси ординат - количество ДНК, выраженное в процентах от Input хроматина. Темно-оранжевые столбики - отрицательный контроль (ChIP реакция без антител). Звездочками обозначены точки, демонстрирующие достоверное снижение уровня H4K20mel по сравнению со средним значением в локусе, Р <0,05 (однофакторный дисперсионный анализ, критерий Фишера).

H3K27mc3

1 ,1. , II.I .

1 . R 1 9 а - а 1. и 11 3.1 ill Sill! Illhlll

j4 I? ie J? IS |Q Номер cafiia

Ы XT 29 ли

Рисунок 7. Паттерн триметилирования НЗК27 в локусе XIC в фибробластах М. levis. Результаты ПЦР анализа в реальном времени реакций ChIP с использованием антител против НЗК27шеЗ. По оси абсцисс расположены сайты, ограниченные парами праймеров, по оси ординат - количество ДНК, выраженное в процентах от Input хроматина. Темно-оранжевые столбикй - отрицательный контроль (ChIP реакция без антител). Звездочками обозначены точки, демонстрирующие достоверное увеличение уровня НЗК27шеЗ по сравнению со средним значением в локусе, Р <0,05 (однофакторный дисперсионный анализ, критерий Фишера).

Расположение ориджинов репликации и всех модификаций гистонов в локусе XIC отображено на Рисунке 8. Таким образом, для наиболее эффективного ориджина репликации в локусе XIC в фибробластах самцов М. levis характерно наличие НЗК9ас и НЗ.З, низкий уровень H4K20mel, и отсутствие в значительной области ориджина НЗК27теЗ. Вероятно, данный набор модификаций гистонов может способствовать повышению эффективности

данного ориджина.

□ 5am шхю imjto

^^J, 'см-

H4K20me1

Рисунок 8. Схема расположения ориджинов репликации, гистона НЗ.З и исследованных модификаций гистонов в локусе XIC М levis.

Вверху: Схема локуса XIC. Экзоны генов отображены прямоугольниками, направление транскрипции показано стрелками, оранжевые точки - CGI. Цифрами внизу обозначено расположение пар праймеров, используемых в работе. Ориджины репликации обозначены желтыми звездочками, сайты связывания ORC - желтыми кружками.

Внизу: Схематичное расположение модификаций гистонов и гистона НЗ.З в локусе XIC М.

levis.

7. Сравнение расположения ориджинов репликации в локусах XIC М. musculus и М. levis

Несмотря на значительное количество картированных в последние несколько лет ориджинов репликации в геномах мыши и человека, вопрос о консервативности расположения и активности ориджинов в ортологичных участках геномов млекопитающих остается открытым. Ранее в части локуса XIC М. musculus размером около 80 т.п.н. были картированы ориджины репликации в

ЭС и соматических клетках (Gomez. Brockdorff, 2004; Rowntree. Lee, 2006). Данная область локуса XIC мыши имеет значительное сходство с локусом XIC полевки (Nesterova et al., 2001; Shevchenko et al, 2011). Как у мыши, так и у полевки в локусе XIC были выявлены ориджины репликации, которые располагаются в районе гена Епох, в первом экзоне и промоторе гена Xist и в районе промотора гена Tsix (Рисунок 9). Однако, в расположении и активности ориджинов репликации в локусах XIC полевки и мыши наблюдаются и некоторые различия. Так, в четвертом экзоне гена Xist М. levis расположен активный ориджин. который не был выявлен у мыши. В седьмом интроне гена Xist мыши расположен активный ориджин и сайт связывания ORC. В данном районе гена Xist М. levis выявляется связывание ORC, однако, инициация репликации в данном районе не наблюдалась ни в одном из исследованных типов клеток. Таким образом, в локусах XIC М. levis и М. musculus выявляются как консервативные, так и вариабельные ориджины репликации, что может быть связано с механизмами регуляции генов в данном локусе, которые имеют как сходства, так и различия у данных видов млекопитающих.

н

DxpBs34-iika

ЯI I ¡ Ь.1 I ' I

Sh7a3 «-1

-А- -

4h

Tsix «

-f -f Рисунок 9. Сравнение расположения ориджинов репликации в локусе XIC М. levis (вверху) и М musculus (внизу).

Экзоны генов отображены прямоугольниками, направление транскрипции показано стрелками, оранжевые точки - CGI. Ориджины репликации обозначены желтыми звездочками, сайты связывания ORC - желтыми кружками, серыми стрелками обозначены сайты гиперчувствительные к ДНКазе I (Gomez, Brockdorff, 2004; Rowntree, Lee, 2006; Tsai et al., 2008).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ориджины репликации представляют собой важный элемент генома и необходимы для инициации процесса репликации ДНК. Отсутствие консенсусной последовательности ориджинов у высших эукариот ставит перед исследователями нетривиальную задачу по их выявлению и изучению. Развитие технологий полногеномного секвенирования позволило исследователям выявить множество ориджинов репликации в геномах мыши и человека. В ряде исследований было продемонстрировано, что значительная часть ориджинов организованна в зоны инициации репликации. Однако, механизмы, определяющие локализацию и активность ориджинов, остаются малоизученными. Полногеномные исследования позволяют определить ассоциацию определенной части ориджинов с теми или иными факторами в геноме. Тем не менее, для выявления факторов непосредственно осуществляющих регуляцию ориджинов необходимо изучение отдельных ориджинов и зон инициации репликации. В настоящей работе был проведен

поиск ориджинов репликации в центре инактивации Х-хромосомы полевки М. levis. В результате было установлено, что данный локус представляет собой зону инициации • репликации. В данном локусе было выявлено значительное количество районов связывания ORC, что также свидетельствует в пользу данного предположения. Основным фактором регуляции эффективности ориджинов репликации считается структура хроматина. Наиболее эффективный ориджин в центре инактивации Х-хромосомы полевки М. levis характеризуется открытой структурой хроматина, что свидетельствует в пользу данной гипотезы.

На данный момент в геномах млекопитающих, за исключением мыши и человека, картировано незначительное количество ориджинов репликации. Проведенный сравнительный анализ ориджинов в центре инактивации X-хромосомы полевки и мыши позволил выявить консервативные и вариабельные ориджины репликации. Различия в модификациях гистонов и эффективности различных ориджинов репликации у мыши и полевки в данном локусе, в частности в первом экзоне гена Xist, указывают на влияние данных модификаций на эффективность ориджинов репликации. Дальнейшие работы по полногеномному сравнению локализации и характеристик ориджинов репликации у близкородственных видов млекопитающих, таких как мышь и полевка могут пролить свет как на принципы локализации ориджинов репликации в геномах млекопитающих, так и на их регуляцию.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что центр инактивации Х-хромосомы полевки М. levis представляет собой зону инициации репликации, в состав которой входят пять ориджинов репликации, представленных множеством точек инициации репликации.

2. Показано, что относительная эффективность ориджинов репликации в локусе XIC М. levis зависит от типа клеток.

3. Расположение комплекса распознавания ориджинов подтверждает наличие ориджинов репликации в установленных районах. Показано, что на каждый ориджин приходится в среднем по два комплекса распознавания ориджинов.

4. Наиболее эффективный ориджин репликации в локусе XIC в фибробластах М. levis расположен в промоторе и первом экзоне гена Xist. В районе данного ориджина выявляются гистон НЗ.З и ацетилированный НЗК9, а также наблюдается сниженный уровень монометилирования Н4К20 по сравнению со всем локусом.

5. Ориджины репликации, расположенные в районе гена Епох, в промоторе и первом экзоне гена Xist и в районе промотора гена Tsix консервативны у М. levis и М. musculus. Ориджин в четвертом экзоне гена Xist выявляется только у полевки. Ориджин в седьмом интроне гена Xist активен у мыши, а у полевки в данном районе наблюдается связывание комплекса распознавания ориджинов, но отсутствует активность ориджина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Orishchenko К.Е., Pavlova S.V., Elisaphenko E.A., Sherstyuk V.V., Prinz A.V., Shevchenko A.I., Dementyeva E.V., Zakian S.M. A regulatory potential of the Xist gene promoter in vole M. rossiaemeridionalis // PLoS ONE. - 2012. - V. 7. - № 5. - P. e33994

2. Шерстюк B.B., Шевченко А.И., Мазурок H.A., Закиян С.М. Активность ориджинов репликации в центре инактивации Х-хромосомы полевки в различных типах клеток//Доклады академии наук. - 2013. - Т. 450. - № 5. - С. 606-608

3. Sherstyuk V.V., Shevchenko A.I., Zakian S.M. Epigenetic landscape for initiation of replication // Chromosoma. - 2014. - V. 123. - № 3. - P. 183-199

4. Шерстюк B.B. Картирование сайтов инициации репликации в центре инактивации Х-хромосомы полевки Microtus rossiaemeridionalis II Материалы XLIX международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», г. Новосибирск, 2011, стр. 264

5. Шерстюк В.В. Эпигенетическая характеристика сайтов связывания комплекса белков распознавания ориджинов репликации в центре инактивации Х-хромосомы полевки Microtus levis II Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2013, секция «биология», г. Москва, 2013, стр. 95

Подписано к печати 16.02.2014 г. Формат бумаги 60x90 1/16 Печ, л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 168

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10