Экспрессия гомологичных генов у гибридов млекопитающих

Закирян, Сурен Минасович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия гомологичных генов у гибридов млекопитающих
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гомологичных генов у гибридов млекопитающих"

■V. ■ \>Ч\.

российская академия наук Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова

на правах рукописи / УДК 576.16:699.323.4'

3 а к и я н сурен минасович

ЭКСПРЕССИЯ ГОМОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ У ГИБРИДОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Генетика - 03.00.15

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва 1992

Работа выполнена в,Институте цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

Оффвциальные оппоненты: доктор биологических наук

А.А.Нейфах

Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН, г.Москва

доктор биологических наук И.А.Прудовский

Институт молекулярной биологии РАН, г.Москва

доктор биологических наук И.А.Захаров

Институт общей генетики РАН, г.Москва

Ведущее учреждение:' Кафедра генетики и селекции Московского

Государственного Университета имени М.В.Ломоносова, г.Москва

Защита состоится 1992 г. на

tjfcä

заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 002.85.01 в институте биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН по адресу: II7808, г.Москва, ул.Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН

Диссертация в форме научного доклада разослана (м^лг^Ук 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета | кандидат биологических наук Е.М.Протопопов:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из наиболее актуальных задач современной генетики эукариот является исследование закономерностей экспрессии индивидуальных генов и поиск конкретных регуляторных систем, подавляющих или активируших проявление структурных генов. Как правило, первым этапом изучения конкретных генетических систем является поиск внутривидового полиморфизма по тому или иному индивидуальному белку. На втором этапе исследуют взаимодействие выявленных генов и регуляцию их активности с помощью генетических и биохимических методов. Млекопитающие в этом плане являются одними из наиболее интересных объектов для такого рода исследований. Представители этого класса имеют сложно организованную систему регуляции генной экспрессии, включающую в себя целый ряд своеобразных механизмов поддержания дифференциальной активности генов в развитии. Одним из наиболее ярких примеров дифференциальной активности генов в онтогенезе млекопитающих является компенсация дозы генов, локализованных в Х-хромосоме. Под дозовой компенсацией подразумевают явление, при котором одна доза сцепленных с полом генов у гетерогаметного пола приводит к появлению такого же фенотипа, как и две дозы у гомогаметного пола. Для объяснения механизма этого явления в 1961 г. Лайон (Lyon, 1961;1964) была высказана гипотеза, согласно которой дозовая компенсация Х-сцепленных генов обеспечивается благодаря случайной инактивации одной из Х-хромосом в каждой соматической клетке у самок млекопитающих. В настоящее время в литературе накоплено большое количество фактов, однозначно доказывающих существование феномена инактивации и описывающих свойства неактивной x-хромосомы (Gartier Я Rlggs, 1983; Grant t Chapnan, 1988). Предложен также ряд моделей, в которых предпринимаются попытки объяснить молекулярный механизм инактивации Х-хромосомы, однако на сегодняшний день ни одна из них не дает исчерпывающего объяснения этому феномену и, в то же время, взаимно не исключает одна другую. Поэтому любые факты, выявленные при изучении инактивации Х-хромосомы у

самок млекопитающих и полученные на традиционных, а, в особенности, на новых экспериментальных моделях, углубляют знания в этой области и вносят определенный вклад в понимание механизмов регуляции экспрессии генов, локализованных в Х-хромосоме, в онтогенезе млекопитающих.

Свои научные интересы мы связали с изучением механизмов инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих. Мы пошли по пути выявления видоспецифических маркеров, дифференцирующих исследуемые виды на основании результатов сравнительного электрофоретического анализа белков и ферментов у разных видов. Это позволило, в свою очередь, исследовать взаимодействие гомологичных аутосомных и сцепленных с полом генов у межвидовых гибридов млекопитающих. Актуальность и новизна выбраного направления определяется не только тем, что взаимодействие гомологичных генов у межвидовых гибридов млекопитающих мало изучено, но также и тем, что при этом удается сопоставить закономерности взаимодействия аллельных генов при внутривидовой гибридизации с закономерностями взаимодействия гомологичных генов у межвидовых гибридов. Результаты данного исследования предоставляют возможность приблизиться к решению вопроса об универсальности подобного .типа взаимодействий генов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работ^ является изучение молекулярно-генетических механизмов экспрессии гомологичных генов у гибридов млекопитающих. Для достижения этой цели в работе были использованы два подхода. Первый заключался в поиске внутривидового полиморфизма на основании результатов анализа электрофоретических спектров белков и ферментов у исследуемых видов (поскольку спектры изоферметов для многих исследованных в работе видов описаны нами впервые, был осуществлен ряд методических разработок) и выявлении видоспецифических маркеров, дифференцирующих исходные виды, в результате сравнительного электрофоретического анализа описанных белков и ферментов. Второй подход связан с изучением явления дозовой компенсации сцепленных с полом генов у гибридов млекопитащих.

Конкретные задачи данной работы состояли в следующем: 1.Описание электрофоретических спектров . изоферментов у

песцов (Л1орех 1адорив) И ЛИСИЦ (Уи1рев уи1рев), У обыкновенных полевок группы Шсгогия агуаив (Шсгогиа

аггаПв И М1сго1ив виЬаГУаНа) И ПОИСК ВНУТРИВИДОВОГО

полиморфизма у исследуемых видов;

2.сравнительный электрофоретический анализ биохимических маркеров (изоферментов), кодируемых аутосомными и сцепленными с полом генами, у песцов (А1орв* 1адорив) и ЛИСИЦ (Уи1рев Уи1рев), осла (Едиив ав1пив) И ЛОШЭДИ (Еаиив саЬаНив 1 , у обыкновенных полевок группы М1сго1ив агуаНа, У мышей (М.ш йошевМсив И М.га Ьас1:г1апив) И ВЫЯВЛвНЕв видоспецефических маркеров;

3.Изучение генетического контроля вариантов гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (нрит), некоторых их биохимических свойств и выяснение четвертичной структуры этого фермента у домовых мышей м.и.аотевмсив;

4.Исследование закономерностей экспрессии генов, локализованных в Х-хромосоме, у песцово-лисьих гибридов и самок мулов;

5.Изучение характера инактивации родительских Х-хромосом у межвидовых гибридов самок полевок группы щеголе агуаПа;

6.Выяснение влияния гетерохроматина на процесс инактивации Х-хромосомы у самок гибридов полевок группы Шсгс^ив

агуаИз.

Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые описаны электофоретические спектры 35-ти структурных белков и ферментов эритроцитов и плазмы крови у песцов и лисиц, и 52-х у полевок рода Шсгогив. С помощью сравнительного электрофоретического анализа выявлены видоспецкфические маркеры, дифференцирующие исследованные виды, что позволило нам сопоставить закономерности взаимодействия аллельных генов при внутривидовой гибридизации с закономерностями взаимодействия гомологичных генов у межродовых и межвидовых гибридов и подойти к вопросу об универсальности подобного типа взаимодействия.

На основании анализа сегрегации хромосом и биохимических маркеров лисицы в панели клонов гибридов соматических клеток лисица х китайский хомячок построена цитогенетическая карта серебристо-черной лисицы, включающая

зо генов, кодирующих биохимические признаки. Наличие таких карт у изучаемых видов имеет большое теоретическое и практическое значение как для исследования эволюции кариотипа, так и для изучения частной генетики вида.

Сформулировано положение о том, что на параметры двух клеточных популяций с активными разными Х-хромосомами у млекопитающих существенное влияние оказывают случайно складывающиеся в раннем периоде развития соотношения между двумя типами клеток с активными разными Х-хромосомами в группах инициаторных (стволовых) клеток, из которых развиваются дефинитивные ткани. Дана оценка количества инициаторных клеток для эритроцитарного кроветворения: 5-е у песцово-лисьих гибридов и 6-7 у мулов.

Предложена гипотеза о влиянии гетерохроматина на процесс инактивации Х-хромосом у межвидовых гибридов полевок рода Шсго^в.

Практиче екая ценность. Полученные результаты представляют интерес для решения некоторых практических задач. Они существенны для практики медицинской генетики. Использованный нами подход к анализу пенетрантности и экспрессивности сцепленных с полом признаков может быть применен в медико-генетическом консультировании, при определении степени риска для заболеваний, которые детермируются генами, локализованными в Х-хромосоме. Полученные результаты имеют важное значение для развития теории экспрессии генов при отдаленной гибридизации и для изучения механизмов дозовой компенсации генов, локализованных в Х-хромосоме у млекопитающих. Полученные результаты также используются при чтении курсов лекций и проведении практических занятий в ряде вузов страны (Новосибирский Государственный Университет).

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и представлены на съездах ВОГИС (1977, 1982, 1987), на 14 Международном генетическом конгрессе (1978), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" ({1989), Всесоюзных симпозиумах, конференциях и совещаниях: эмбриологов (1975), Генетика и адаптация клеточных популяций

(1975J, Популяционная изменчивость и проблемы охраны генофонда млекопитающих (1983), Генетика соматических клеток в культуре (1986, 1989), Цитогенетикэ сельскохозяйственных животных (1985, 1988), Эволюционные и генетические исследования млекопитающих (1990), Генетика и селекция животных (1989); 1, 2 и з Школах-семинарах по генетике и селекции животных (1982, 1985, 1989), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

Структура и объем работы. Диссертация изложена в форме научного доклада. По теме диссертации опубликована 31 работа в журналах Генетика, Доклады академии наук, - Biocheaicei Genetics, Cytogenetics and Cell Genetics, Genetlcal Research

и других отечественных и зарубежных изданиях. Общий объем публикаций - 14 печатных листов. Ссылки на список публикаций даны в тексте цифрами в скобках. Представленный в них научный материал, включающий в себя методическую разработку электрофоретического разделения белков и ферментов, описание видоспецефических маркеров у исследованных видов, анализ характера экспрессии аллелей эутосомных генов у гибридов, а также анализ закономерностей экспрессии генов, локализованных в Х-хромосомах у самок межродовых и межвидовых гибридов, получен лично автором.

Автор приносит свою . благодорность Т.Б.Нестеровой, Н.А.Мазурок, М.Н.Бочкареву, Н.Г.Холодилову, В.И.Майорову за участие в эксперементах, Н.Б.Рубцову за патогенетическую часть работы, а также всем сотрудникам лаборатории биохимической генетики животных, студентам, выполнившим дипломные работы в стенах лаборатории, сотрудникам других лабораторий Института, оказавшим помощь автору на различных этапах исследования.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ (3.5.7.12-14,18,20.24,25,28)

Использованные нами в работе методы подробно описаны в публикациях, основные из них - условия электрофоретического разделения белков и ферментов эритроцитов и плазмы крови у исследованных видов (см табл. 1,2). За основу были взяты

методы предложенные Харрисом и Хопкинсоном (Harris в Hopkinson, 197в) с некоторыми нашими модификациями.

В работе в качестве эксперементальной модели были исследованы: серебристо-черные лисицы, голубые песпы, разводимые в экспериментальном хозяйстве СО РАН, и межродовые песцово-лисьи гибриды. Также исследования были проведены на 74 мулах, содержащихся в частных хозяйствах Дашкесанского района Азерб.ССР, 35 ослах и ю лошадях, на двух подвидах мышей M.m.bactrianua И M.m.domeatlcus и на полевках рода Microtus. Мыши подвида M.m.bactri&nus были

Таблица 1

Перечень исследованных структурных белков и ферментов

У Vulpas vulpes И Alopex lagopue

Символ Описание ферментов и белков Хромое., исследовано ЖИЯПТИНУ

гена лок-ция

V.v | А.1.

ACPI кислая фосфатаза l, эритроцитов 8 80 20

АСР2 кислая фосфатаза 2 плазмы — 190 30

ACY1 аминоацилаза 1 9 — —

ADK аденозин киназа 4 — —

АК1 аденилат киназа 2 45 30

ALDOC альдолаза с 2 - -

APRT аденин фосфорибозилтрансфераза 12 - -

BLVR биливердин редуктаза 5 - -

CAT каталаза — 240 30

DIA1 диафораза 1 - 100 30

EHOl енолаза 1 12 - -

BSD эстераза Д 6 60 60

G6PD глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа X 260 30

GLA галактозидаза, альфа X 50 50

GOT1 глутамат-оксалоацетат-

трансаминаза 1, растворимая 15 60 60

G0T2 глутамат-оксалоацетаттранс-

аминаза 2, митохондриальная глюкозофосфатизомераза 2 - —

GPI 1 240 30

GSR глутатион редуктаза 7 - —

HPRT гипоксантин-

фосфорибозилтрансфераза X 80 80

IDH1 изоцитратдегидрогеназа i 16 60 60

IDH2 изоцитоатдегидрогеназа 2 — 60 60

ITPA инозинтрифосфатаза а 14 - -

LDHA лактатдегидрогеназа а 11 260 30

LDHB лактатдегидрогеназа в 8 260 30

MDH1 малатдегидрогеназа 1, 30

NAD-зависимая (растворимая) 16 240

HDH2 малатдегидрогеназа 2, NAD- 40

зависимая (митохондриальная) 3 60

Прололж.Таблицы 1

Символ Описание ферментов и белков гена Хромое. лок-ция исследовано животных V.V | А.1

МЕ1 малик фермент 1, растворимый i 60 60

MPI маннозофосфатизомераза 15 - -

NP нуклеозидфосфорилаза 10 - -

PEPA пептидаза А 5 — —

PGD фосфоглюконатдегидрогеназа 2 260 30

PGK1 фосфоглицераткиназа 1 — 60 60

PGM1 (юсфоглюкомутаза 1 12 30 во

PGP Фосфогликолатфосфатаза 3 - -

РР пирофосфатаза (неорганическая) 4 40 40

AC ацетилэстераза эритроцитов - 260 30

AR арилэстераза эритроцитов - 260 30

CA карбоксилэстераза эритроцит. — 260 30

Саг карбо ангидраз а - 26 30

AR арилэстераза плазмы — 210 30

LAP лейцинариламинопептидаза - 210 30

CE холинэстераза плазмы — 210 30

НЬ гемоглобин — 260 30

GA гаптоглобин - 190 30

TF трансферрины - 190 30

AL альбумины — 45 30

Pa постальбумины - 190 30

Pra преальбумины - 190 30

Б-1 белок 1 — 260 30

Б-2 белок 2 - 260 30

указана хромосомная локализация генов лисицы

Перечень исследованных структурных белков и

У ШсгоЪив агуаИв И ЩсггоЪив виЬагуаНз

Таблица 2 ферментов

Символ гена Ферменты и белки Иссле- дуемад, ткань Буферная си стема Исследованс - животных М.аг. M.s.

ACON—1 Аконитаза-i По в 60 60

ACON—2 Аконитаза-2 По 6 20 20

АСР Кислая фосфатаза эритроцитов Э 6 30 30

ADH Алкогольдегидрогена з а Пе 1 20 20

АК Аденилаткиназа Э 2 30 30

ALD-A Альдолаза А Мы 1 30 30

ALD-B Альдолаза В Пе 1 20 20

ALD-C Альдолаза С Мо 1 20 20

CAT Каталаза П 5 20 20

DIA Диафораза Э 3 80 80

ESD Эстераза Д Э 5 60 60

FH Фумаратгидратаза По.Пе в 20 20

Продолж. Таблицы 2

Символ гена

Ферменты и белки

Иссле- Буфер- Исследовано дуема£„ ная си- животных ткань стема

М.аг. М.8.

30 30

125 125

20 20

50 50

20 20

50 50

40 40

20 20

50 50

40 40

30 30

50 50

40 40

20 20

100 100

20 20

60 60

30 30

60 60

30 30

60 60

30 30

а-Са1

р-ви1

(ЮТ

ОРО

вР1

вРН

вви

абРОН

НЬ

НК

НРКТ

ЮН-1 ЮН-2 ЬБН-А ЬОН-В МОН-1 МОН-2 НЕ-1

НЕ-2

РЕРА

РвО

РОК

РвИ

РР

воо

ЗОРОН

СА

АС

АК

Саг

1.АР

АСР

СЕ

АН

АС

6А

ТГ

АЬ

Ра

Рга

Р-1

а-Галактозидаза

р-Галактозидаза

Аспартатаминотрансфераза

Глшозо-в-фосфатдегидрогеназа

Глккозофосфатизомераза

Глвкозодегидрогеназа

Глютатионредуктаза

а-Глицерофосфатдегидрогеназа

Гемоглобин

Гексокиназа

Гипоксантинфосфорибозилтран-сфераза

Изоцитратдегидрогеназа-1 Изоцитоатдегидрогеназа-2 Лактатдегидрогеназа А Лактатдегидрогеназа В Малатдегидрогеназа-1 Малатдегшфогеназа-2 Малатдегшфогеназа-2 НАДФ-за-висимая

Малатдегидрогеназа-2 НАДФ-за-

висимая

Пептидаза А

Фосфоглюконатдегидрогеназа Фосфоглицераткиназа Фосфоглюкомутаза Неорганическая пирофосфатаза Супероксиддисмутаза Сорбитолдегидрогеназа Карбоксилэстераза Ацетилэстераза

даламинопептидаза Кислая фосфатаза плазмы Холинэ'стераза Арилэстераза Ацетилэстераза Гаптоглобин Трансферрины Альбумины Постальбумины Преальбумины Белок-1

Мо

По

Пе

Э.По

Пе

Мы Э

По ПО По По По По По

По

Э Э Э Э

Пе.По

Пе

2 2 4 3 3 3 3 2 3 2 2

2 3 3 3 6

3 1 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

4 3

| 1- о,1и трис-цитратная,рн 8.0; г- о.ги фосфат-цитратная, рн 7.4: 3-0.9Н ТрИС-ЭДТА-бОрНЭЯ КИСЛОТЭ, рН 8.6; 4- 0.05М ТрИС-ЭДТА-борная кислота рН 8.в; 5- О.ЗМ борат-наон, рН 8.0; 6-,о.1Н трис-ЭДТА-малеиновая кислота, рн 7.4. Пе-печень,По-почка,П-плазма,Э-эритроциты,Мо-мозг,Мы-мышцы

отловлены' в Туркменской ССР. Полевки рода Microtue были отловлены в Ленинградской области, в Туркменской и в Казахской ССР и разводились в виварии Института цитологии и генетики СО РАН.

Число исследованных структурных белков и ферментов каждого вида и число исследованных животных представлены в табл.1 и 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительный электрофоретический анализ структурных белков и ферментов

При электрофоретическом анализе белков и ферментов крови у исследованных видов мы не ограничились только сравнением спектров изоферметов и выявлением видоспеци-фических маркеров, но также проводили направленный поиск внутривидового полиморфизма по анализируемым белкам и изучали генетический контроль и некоторые биохимические свойства выявленных нами новых электрофоретических вариантов белков, ранее не описанных в литературе.

Alopex lagopuB И Vulpoo vulpea (3,8-13.18,21-24).

Сравнительный электрофоретический анализ 35 белков и ферментов крови песцов и лисиц показал, что семь из них (аденилаткиназа (лш, диафораза <diaj, карбоксиэстераза (est), глюкозо-е-фосфатдегидрогеназа (gspdj, альбумин (А1Ы, трансферрины (Trf) и преальбумин (PAib)j имеют различную электрофоретическую подвижность, что указывает на различия в структуре этих гомологичных белков у исследованных видов. Полученные данные свидетельствуют о существовании набора ферментов и белков, дифференцирующих исследованные виды. Следеут отметить, что у лисиц по диафоразе, по глюкозофосфатизомеразе (gpi), лактатдегидрогеназе (ldh) и по гаптоглобину нами был обнаружен и описан внутривидовой полиморфизм, в то время как у песцов внутривидового полиморфизма нами не обнаружено.

Лисица является одним из представителей семейства Canidae, охарактеризованым как цитогенетически (g-, R—бэндинг), так и биохимически (изоферменты). По мере накопления цитогенетических и биохимических данных появилась

перспектива провести хромосомное картирование генов, кодирующих конститутивные биохимические маркеры. Совместно с лабораторией патогенетики животных была проведена хромосомная локализация зо генов серебристо-черной лисицы на основании анализа панели клонов гибридов соматических клеток серебристо-черная лисица х китайский хомячок (Рис.1). Картированные гены маркировали 15 аутосом и X хромосому лисицы. 24 из зо локализованных генов образовали ю групп синтеных генов, что позволило провести сравнительный анализ цитогенетиче ских карт лисицы и других изученных видов млекопитающих. Картирование генома серебристо-черной лисицы имеет большое значение для исследования эволюции кариотипов млекопитающих по ряду причин. Лисица является единственным представителем семейства Сап1<1ае с известной хромосомной локализацией ряда генов. Лисица оказалась очень интересным объектом с точки зрения сравнительной цитогенетики: у этого вида происходит нарушение многих консервативных групп сцепления генов, сохраняющихся у большинства изученных видов

1 2 3 4 5 I 7 19

gpi ак1 мош adk bj.vr eso gsr acpi acy

me« aldoc pgp рр pepa lohb coti pgd

10 np

ldha

aprt ENOI PC MI

ITPA

coti MPI

16 X

iohi c»po

mdh1 gla kprt

e o

Рис.1 Цитогенетическая карта серебристо-черной лисицы

млекопитающих. Кроме того, серебристо-черная лисица - ценный объект пушного звероводства и развитие ее частной генетики в дальнейшем может иметь значение при селекционно-генетической работе.

Mlcrotus arvallo И Mlcrotua subarvalla (5,28,29).

H.arvalls И M.eubarvalle - ВИДЫ-ДВОЙНИКИ, peПРОДУКТИВНО

изолированные, морфологически мало различимые, но четко дифференцируемые цитогенетически. Они занимают общий ареал. В пределах ареала обнаруживаются симпатрические популяции. В природных популяциях гибриды не найдены. В лабораторных условиях гибридизация идет легко, но гибриды стерильны (Мейер И др. 1972, 1981).

С помощью электрофореза в крахмальном и полиакриламидном гелях исследовали 52 белка и фермента у полевок двух видов. Семь из проанализированных белков -глюкозо-е-фосфатдегидрогеназа, диафораза, лактатдегидрогена-за (ldh), е-фосфоглюконатдегидрогеназа (pgd), аденилат-киназа, «-галактозидаза («gal) и гемоглобин (нь) -. имели различную электрофоретическую подвижность у M.arvaiie и н.subaгvalis > что составляет 13* от всех исследованных белков. Обнаруженные различия между двумя видами по электрофоретической подвижности gbpd, «gal, ак, нь, а также отсутствие внутривидового полиморфизма по перечисленным белкам, позволяют рассматривать их как надежные видоспе-цифические маркеры, дифференцирующие вид H.arvalls от н.subarvalis. Следует отметить, что по pod, ldh и día у H.arvaiis выявлен внутривидовой полиморфизм, в то время как у м.subarvalla эти белки мономорфны и тождественны по электрофоретической подвижности одному из вариантов H.arvalls. Следовательно, видоспецифическими свойствами обладает только один из аллельных вариантов pgd, ldh, и día.

H.n.bactrlanua И H.M.donestlcuB (2,7,19,20).

При сравнительном электрофоретическом анализе белков крови у двух подвидов мышей нами были обнаружены различия по гипоксантин-фосфорибозилтрансферазе, 6-фосфоглюконатдегидро-геназе, аденин-фосфорибозилтрансферазе (aprt), малатде-гидрогеназе (me). Обнаруженный нами новый вариант гена, кодирующего aprt, который ранее методами генетики

соматических клеток был картирован в 8-ой хромосоме мыши (Kozak et ai, 1975), позволил провести локализацию этого гена на генетической карте 8-ой хромосомы мыши. Был установлен следующий порядок генов относительно центромеры 8-ой хромосомы: ueHTpoMepa-26cM-Ea-i-25cM-Aprt. Новый вариат по гену Aprt был нами веден в конгенную линию на основе линии dd.

Для сравнения обнаруженного нами нового электрофорети-чвского варианта hprt у мышей M.n.bactrianus с ранее описанным электрофоретическим вариантом hprt у домовой мыши и.в.castaneus мы изучили некоторые биохимические свойства (уровень активности hprt в зависимости от рн среды; изменение активности hprt в зависимости от концентрации HgCi2; динамику температурной инактивации) варианта hprt у мышей M.a.bactrianua. Вопрос о субъединичном составе молекулы hprt в литературе оставался спорным. По данным ряда исследователей молекула hprt является либо димером, либо тримером, либо тетрамером. Одним из простых и эффективных подходов для выяснения этого вопроса является электро-форетический анализ фермента у животных, гетерозиготных по изучаемому гену. В этом случае о четвертичной структуре молекулы белка можно судить по количеству и характеру распределения активности гомо- и гетерополимерных изоферментов. Мы провели эксперемент по слиянию in vitro клеток линии lmtk с клетками селезенки самца M.n.bactrianus. В клетках одного из полученных гибридных клонов при электрофорезе в крахмальном геле выявлены пять фраций hprt: две из них соотвествуют по электрофоретической подвижности фракциям родительских вариантов фермента и три имеют промежуточную электрофоретическую подвижность. Соотношение активности этих пяти фракций hprt близко к биноминальному распределению. Такой спектр характерен для ферментов, имеющих тетрамерную четвертичную структуру. Мы предполагаем, что спектр изоферментов hprt гибридных клеток представлен двумя гомотетрамерами и тремя гетерополимерными формами.

1 Учитывая, что обнаруженный новый вариант по гену hprt отсутствует во всех лабораторных линиях мышей мы ввели этот вариант в инбредную линию мышей dd и получили конгенную

линию, содержащую новый вариант нркт на фоне генома мышей линии оо.

Описанные видоспецифические биохимические маркеры позволили нам в дальнейших экспериментах проследить за поведением гомологичных генов у межвидовых и внутривидовых гибридов. При этом были выявлены определенные закономерности проявления гомологичных аутосомных генов Ак, Ор, Гр, нь, А1, Аргч, тг, Ра, мал, Рд(1 и генов вра, нрп и о-са1, сцепленных с половыми хромосомами. Показано, что взаимодействие гомологичных аутосомных генов соотвествует кодоминантному типу, и это находится в соотвествии с данными о кодоминантном проявлении аллельных генов при внутривидовой гибридизации, когда генетический анализ проводится на уровне первичных продуктов действия генов.

Исследование закономерностей экспрессии генов, локализованных в Х-хромосоме у самок песцово-лисьих

гибридов и мулов (15-17,26,27) При исследовании электрофоретического спектра серо в эритроцитах самок мулов и песцово-лисьих гибридов нами отмечено, что количественное выражение родительских форм фермента у исследованных гибридов значительно варьирует от гемизиготного проявления материнского аллеля до гемизигот-ного проявления отцовского эллеля. Среди исследованных самок мулов и песцово-лисьих гибридов наиболее часто встречаются животные, имеющие соотношение в проявлении родительских аллелей, близкое к 1:1 или 1:2.

Распределение частот особей с различным количественным проявлением родительских локусов ера в эритроцитах самок мулов и песцово-лисьих гибридов свидетельствует об отсутствии селективного преимущества одной популяции клеток относительно другой. Полученные данные по количественному выражению родительских форм ■ фермента у исследованных гибридных самок свидетельствуют в пользу случайной инактивации родительских Х-хромосом. Эти же результаты показывают, что в популяции клеток эритроцитов крови у самок песцово-лисьих гибридов и мулов не обнаружно селективного преимущества клеток с активной Х-хромосомой матери или отца.

Можно предположить, что фенотипическое разнообразие проявления родительских аллелей связано со случайно складывающимся соотношениями в раннем развитии между клетками с активной Х-хромосомой матери или отца в группе инициаторных клеток, из которых развивается та или иная дефинитивная система. Исследования на аллофенных мышах показали, что детерминация происходит в раннем периоде развития в очень небольших группах инициаторных (стволовых) клеток, из которых развиваются те или иные дефинитивные органы и ткани (М1п(г, 1971). По аналогии с данными, полученными на аллофеннных мышах, можно предположить, что наблюдаемое фенотипическое разнообразие проявления генов вр«1 у самок песцово-лисьих гибридов и самок мулов определяется разным исходным соотношением числа клеток, из которых развивается система эритроцитарного кроветворения. На основе распределения частот особей с различным количественным проявлением родительских аллелей ввРП в эритроцитах самок мулов и песцово-лисьих гибридов была проведена оценка числа инициаторных клеток .для системы эритроцитарного кроветворения. Проведенная оценка для песцово-лисьих гибридов дала значение 6-е клеток, а для мулов в-7, что сходно с числом таких клеток у человека (СашНп1 ег в1.,1968>. это указывает на то, что количество инициаторных клеток для эритроцитарного кроветворения у млекопитающих определяется достаточно консервативными механизмами. Полученные нами данные свидетельствуют о случайной инактивации родительских Х-хромосом и могут быть объяснены при допущении отсутствия отбора между клетками с разными активными Х-хромосомами. Предпологается, что фенотипическое разнообразие родительских алллелей Ор<1 связано со случайно складывающимся соотношением между клетками с активной хромосомой матери или отца в группе инициаторных клеток в раннем развитии.

Происхождение фенотипических классов с преобладанием I одной из родительских форм (1:в-ю) у самок мулов остается неясным. Как.видно из гистограммы (27), такое соотношение встречается в трех случаях, причем у одного животного преобладает выражение материнского аллеля, тогда как у двух других самок - отцовского. Маловероятно, чтобы появление

этих фенотипических классов было связано с селективным преимуществом одной из популяций клеток, хотя исключить это нельзя. Селективное преимущество может иметь место у некоторых животных за счет гена или генов, локализованных в Х-хромосоме и понижающих жизнеспособность клеток, либо снижающих темп роста. Однако при этом необходимо допущение редкости такой ситуации и присутствия таких генов в Х-хромосомах матери и отца.

При исследовании спектра бвро у двух самок мулов (сестер) у одной самки сотношение родительских форм фермента веро оценено нами как 1:8-ю с преобладанием материнской формы, а у другой 1:1. Можно допустить что количество иницаторных клеток может варьировать в исследованной популяции самок мулов. В этом случае число инициаторных клеток (6-7) нужно рассматривать как среднестатистическую величину, и возможно как уменьшение, так и увеличение их за счет либо разной продолжительности периода детерминации (у отдельных индивидумов), либо разной скорости деления инициаторных клеток в момент детерминации.

При исследовании ряда тканей у самок песцово-лисьих гибридов нами обнаружено значительное разнообразие по фенотипическому проявлению родительских аллелей вра3 и Ор<1в. Показано, что у одного и того же животного проявление аллелей враа и Срс1в неодинаково в разных органах. Если в печени и головном мозге сотношение родительских аллелей вра соответствует отношению 1:1, то в почках, в сердечной и скелетных мышцах отмечены отдельные случаи гемизиготного выражения родительских форм серп, чего не обнаружено в головном мозге и в печени. С позиций клональной гипотезы развития можно легко объяснить наблюдаемый феномен различного проявления родительских аллелей ввРБ в разных органах и тканях у самок песцово-лисьих гибридов. Поскольку разные ткани и органы развиваются из разных инициаторных клеток, вполне естествено, что складывающиеся количественные соотношения между клетками с активными Х-хромосомами песца или лисицы в одной группе инициаторных клеток определяют характер фенотипического проявления родительских алллелей только в тех тканевых структурах, которые развиваются из

этих инициаторных клеток.

Таким образом, количественное проявление признаков, сцепленных с полом у мелфодовых песцово-лисьих гибридов и самок мулов формируется на тканевом уровне за счет различной численности клеточных популяций с разными активными Х-хромосомами.

Описанный механизм экспрессии генов, локализованных в Х-хромосомах, целесообразно учитывать в практике медицинской генетики и прикладной генетики сельскохозяйственных животных. Экспрессивность и пенетрантность генов, локализованных в Х-хромосомах и обуславливающих ту или иную патологию, будет зависеть от вида ткани, в которой фенотипически проявляется ген, и вероятности того или иного количественного соотношения между клетками с разными активными Х-хромосомами в группе инициаторных клеток. Вероятность гемизиготного проявления одного из аллельных генов у гетерозиготных самок составляет 2(1/2)" где п - число инициаторных клеток, из которых развивается та или иная ткань.

Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что полученные данные свидетельствуют о случайном характере инактивации родительских Х-хромосом у самок песцово-лисьих гибридов и мулов. У большинства исследованных самок мулов и песцово-лисьих гибридов не обнаружено селективного преимущества среди клеток крови какой-либо из популяций, имеющих в активном состоянии Х-хромосому матери или отца. Проведена оценка числа инициаторных клеток для системы эритроцитарного кроветворения у самок мулов и песцово-лисьих гибридов. Выдвинуто предположение о том, что число инициаторных клеток может варьировать у отдельных самок гибридов за счет различной продолжительности процесса детерминации или разной скорости деления инициаторных клеток в период детерминации.

Изучение механизмов экспрессии родительских аллелей локуса Нргг у самок гибридов Н.в.аоаевИсив х И.а.Ьас1г1апив

У большинства исследованных самок гибридов соотношение между родительскими формами нркт соотвествовало отношению 1:1.' У некоторых самок наблюдалось смещение активности

фермента в сторону дикого типа, т.е. варианта нрйт M.m.bactrianua. Такое смещение в сторону дикого типа можно объяснить наличием у мышей аллелей Хсе локуса (x-chroaosose controlling element), ОПИСЭННОГО КатаначеМ (Cattanach ft Issaacson, 1967; Cattanach 1975). МОЖНО ПрвДПОЛОЖИТЬ, ЧТО мыши H.a.bactrianuQ несут наиболее сильный аллель Хсос, вызывающий наибольшую вероятность экспрессии Х-хромосомы с этим аллелем по сравнению с более слабыми аллелями Хсаа и хсоь, присутствующими на X хромосомах лабораторных линий мышей.

Изучение характера инактивации родительских Х-хромосом у межвидовых гибридов самок полевок рода nicrotua (1.4.0.30.31) В работе исследовали четыре вида обыкновенной полевки рода Hlcrotuo: M.arvallB, Н.subarvallo, И.blrgloorun, M.transcaopicus, отловленных в природных популяциях и в дальнейшем разводимых в виварии Института, а также гибриды, полученные между этими четырьмя видами. В диплоидном наборе у всех четырех видов полевок, используемых в анализе, половые хромосомы цитологически хорошо идентифицируемы. Х-хромосомы родительских видов различаются по величине и, кроме того, по размеру и расположению на хромосоме блоков гетерохроматина (Рис.2). Если у M.subarvaiis гетерохроматин занимает приблизительно половину Х-хромосомы и расположен в теломерном районе, то у М.transcasplcuu И H.klrgloorua, блоки гетерохроматинана на Х-хромосомах меньше по размеру и находятся в прицентромерном районе хромосомы. У H.tranocas-picus гетерохроматин занимает примерно треть длины хромосомы. У H.kirgisorun выявлен лишь небольшой прицентромерный гетерохроматин. На Х-хромосоме M.arvaiis не удается выявить даже прицентромерный гетерохроматин. Учитывая особенности расположения блоков гетерохроматина на Х-хромосомах исследуемых полевок, мы получили гибридных самок, содержащих различные комбинации родительских Х-хромосом. Обнаруженные различия по электрофоретической подвижности, по крайней мере, по одному из ферментов (g6pd или o-gal), гены которых локализованы в Х-хромосоме, позволили проследить проявление изучаемых генов у

М. виВАЯУАив

/Лч

М.ТКАМЗСАЗРЮиБ

м.кигызояим

МЮНОТиЭ АНУАИБ

Рис.2 Комбинации скрещивании полевок, имеющих различные блоки гетерохроматина на X хромосомах. Стрелкой указано направление скрещивания.

исследуемых гибридных самок. Гибриды от скрещиваний м.виьаг-у>11| со всеми остальными исследованными видами полевок были проанализированы по электрофоретическому спектру глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах, легком, печени, сердце, почке, мозге, селезенке, мышце. Гибриды, полученные в скрещиваниях м.агуаИв с остальными видами обыкновенной полевки, а также гибриды между м.1гапвсавр1сив и м.к1гд1во-гиш были проанализированы по электрофоретическому спектру ' а-галактозидазы в мозге.

При анализе спектров ввРП и а-вль у самок гибридов, полученных от реципрокиных скрещиваний к.атпв и м.виЬаг-уаИв, а также от скрещивания м.к1гд1вогиш х м.агуаИв, нами

была высказана гипотеза, что наблюдаемая преимущественная инактивация Х-хромосомы у этих гибридов связана с наличием блока гетерохроматина в Х-хромосомах M.subarvalls и M.klrgl-sorua. Для проверки этой гипотезы мы привлекли в анализ еще один вид обыкновенной полевки - М.transcaaplcua. Интерес к этому виду вызван прежде всего наличием в Х-хромосоме большого блока гетерохроматина, сравнимого по размерам с блоком гетерохроматина у H.subarvaiia, но расположенного прицентромерно. Если наша гипотеза верна, то у гибридных самок от скрещиваний H.tranacaeplcua х M.arvalls мы должны ожидать, как и в случае с гибридами M.arvalls х H.subarvaiia и M.arvalls х м.kirgiaorum, преимущественную инактивацию Х-хромосомы, содержащей блок гетерохроматина, т.е. Х-хромосомы м.transcaaplcua. Действительно, при анализе электрофоретических спектров g6pd и/или a-gal во всех случаях, когда в гибридизации в качестве одного партнера участвовал вид, содержащий на Х-хромосоме блок гетерохроматина, а в качестве другого - M.arvalls, Х-хромосома которого не содержит такого блока, мы наблюдали преимущественную экспрессию Х-хромосомы M.arvalls. Эти же гибриды нами были подвергнуты цитогенетическому анализу по методу Канда (Kanda, 1973), который позволяет дифференциально выявлять в клетке активную и неактивную Х-хромосомы. Неактивная Х-хромосома M.arvalls встречается у гибридов в относительно небольшом проценте клеток. В большинстве же клеток (79-88*) Х-хромосома M.arvalls активна, а в неактивном состоянии находится Х-хромосома, содержащая блок гетерохроматина (см.Таб.з). Наблюдаемые соотношения метафазных пластинок с активными и неактивными Х-хромосомами родительских видов подверждают данные биохимического анализа.

Перед нами встал вопрос, во всех ли тканях будет подвержена преимущественной инактивации Х-хромосома, несущая блок гетерохроматина, или у исследуемых гибридных самок полевок существуют исключения, аналогичные описанным в экстраэмбриональных тканях некоторых высших млекопитающих? Известно, что в экстраэмбриональных тканях грызунов происходит неслучайная инактивация отцовской Х-хромосомы (Takagl & Sasaki, 1975). В ЖеЛТОЧНОМ МеШКв, ХОрИОНв

наблюдается экспрессия Х-хромосомы, полученной от матери, в связи с этим нас заинтересовало поведение материнской Х-хромосомы, содержащей блок гетерохроматина, в желточном мешке самок гибридных полевок. Какой механизм будет преобладающим - неслучайной инактивации отцовской Х-хромосомы или преимущественной инактивации, вызванной присутствием блока гетерохроматина? С этой точки зрения наиболее интересными являются гибриды между самками н.виЬаг-valls, M.transcasplcus, М.klrgisorum с самцами H.arvalls, т.е. гибриды, получающие от матери Х-хромосому с блоком гетерохроматина, а от отца - без такого блока. Мы провели электрофоретический анализ спектра g6pd в желточных мешках 14-дневных эмбрионов гибридных самок от скрещиваний н.виЬаг-vaiie х Hlarvaiis и обнаружили преимущественную экспрессию материнской формы gbpd, т.е. экспрессию гена Х-хромосомы H.oubarvaiis. При анализе же спектра gbpd в амнионе, печени, легком, сердце, мозге, и мышцах этих же эмбрионов мы наблюдали преимущественную экспрессию Х-хромосомы H.arvaiio, т.е. точно также, как и в органах и тканях взрослых животных. Чем можно объяснить эти данные? Мы считаем, что полученный результат укладывается в рамки существующей гипотезы о неслучайности инактивации родительских Х-хромосом В экстраэмбриональных тканях грызунов (Gartler ft Rlggs, 1982). Авторы полагют, что система неслучайной инактивации отцовской Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях грызунов, возможно, отличается на молекулярном уровне от случайного механизма, характерного для соматических клеток млекопитающих. Достигается это путем импринтинга родительских хромосом во время гаметогенеза. В результате различного метилирования отцовской и материнской Х-хромосом они оказываются не идентичны во время оплодотворения и это приводит к тому, что отцовская Х-хромосома предпочтительно инактивируется в тех тканях, которые рано дифференцируются. В эмбрионе происходит метилирование de novo и к тому времени, когда начинается инактивация Х-хромосомы в примитивной эктодерме, импринтинг путем гипометилирования стирается. Таким образом, результаты нашего эксперемента показали, что гетерохроматин не оказывает влияния на инактивацию Х-хромосом в экстраэмбрио-

Таблица з

Суммарные данные относительной экспрессии X хромосом, полученных от матери и от отца (х" и хр).

Скрещивания (самка х самец)

Маркер Неактивная X хромосома

Ткани взрослых Эмбрион Желточный самок мешок

arvalia я

subarval1 в

Kanda

G6PD

GALA

ХР»Х" {779 Хр) ХР>Х" ХР>Х*

ХР>Х" ХР>Х"

aubarvall3 х

arval1 в

Kanda Х">ХР (85S X")

G6PD Х'>ХР Х">ХР

GALA Х">ХР Х">ХР

Х»Х

subarvalls я

transcasplcus

Kanda _Х"=ХР (543 X") G6PD Х"=ХР

transcasplcus я ( subarvalIs

Kanda G3PD

Х"=ХР (478 X") Х"=ХР

klrglsorun*x

arvalIs

Kanda X">XP (895 X") GALA X">XP

klrglsorun я

suharvnlIs

transcaspicus*x

arvalIs

GBPD

Kanda GALA

X iX

X">XP (7ЭХ X") X">XP

transcasplcus x

klrglsorun

GALA

X =X"

х хромосома имеет блок конститутивного гетерохроматхгаа.

нальных тканях гибридов полевок, которое мы наблюдали в соматических тканйх. Наши данные свидетельствуют в пользу предположения, что механизм поддержания инактивации в экстраэмбриональных и соматических тканях отличается скорее всего на молекулярном уровне.

Привлечение в эксперементы полевок вида M.transcaspicus позволило нам изучить поведение родительских Х-хромосом у гибридных самок в случае, когда оба вида, участвующие в гибридизации, содержат на Х-хромосомах блоки гетерохро-матина. Мы предположили, что в этом случае ожидается случайная инактивация каждой из родительских Х-хромосом. Для проверки этого предположения были получены гибриды между H.subarvalls х И.trsnscacsplcus, H.klrglsorua х H.transcas-plcua И M.subarvalla x M.klrglsorua. При анализе спектров g8pd и a-gal у полученных гибридов мы не обнаружили такого значительного смещения активности в сторону одной из родительских форм ферментов, какие мы наблюдали в скрещиваниях с M.arvaiis. Соотношение родительских форм gbpd У самок гибридов H.transcaaplcus х H.subarvalls примерно равное. Аналогичную картину мы наблюдали у гибридов H.trans-caspicus х M.klrglsorua при анализе a-gal в мозге. Соотношение родительских форм gbpd у гибридов M.klrglsorua х H.subarvalls заметно смещено в сторону преобладания родительской формы .gbpd H.subarvalls. Измерение специфической активности g6pd в эритроцитах исходных видов выявило значительное отклонение удельной активности фермента у M.klrglsorua от удельной активности g6pd у остальных видов. ЕСЛИ у H.arvalls, H.subarvalls И Н.transcasplcus удельная активность фермента g6pd почти равна, то активность H.kirgi-sorua примерно в 1.5 раза меньше. Таким образом, наблюдаемое неравное выражение родительских форм фермента у гибридов H.klrglsorua х H.subarvalls вызвано скорее всего не преимущественной инактивацией Х-хромосомы одного из родителей, а различиями в удельной активности фермента у родительских форм. Результаты цитологического анализа по выявлению активных и неактивных Х-хромосом на метафазных пластинках у гибридных самок приведены в Таб.з. Неактивные Х-хромосомы H.subarvalls И М.transcasplcus встречаются примерно в равных соотношениях. Эти результаты согласуются с биохимическими данными.

Таким образом, резюмируя вышеизложенное, можно заключить: í.Bo всех случаях, когда блок гетерохроматина содержит только одна из родительских хромосом у гибридных самок

полевок наблюдается неслучайный характер инактивации Х-хромосомы, несущей гетерохроматиновый блок.

2.В том случае, когда гетерохроматиновые блоки находятся на обеих родительских Х-хромосомах, у гибридных самок инактивация носит, скорее всего, случайный характер.

3.Гетерохроматин не оказывает влияния на инактивацию Х-хромосом в экстраэмбриональных тканях самок гибридов полевок, которое мы наблюдали в соматических тканях.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют в пользу высказанной гипотезы о влиянии гетерохроматина на процесс инактивации Х-хромосом у межвидовых гибридов полевок рода Microtus.

Перед нами встал вопрос, какие факторы явлются причиной наблюдаемого феномена? Объяснение результатов осложняется тем, что нам приходится одновременно изучать две, в общем-то, разные проблемы, накладывающиеся одна на другую, -инактивацию Х-хромосомы и функцию гетерохроматина в этом процессе. В этой главе мы ограничились лишь описанием наблюдаемого феномена. Возможным механизмам влияния гетерохроматина на процесс инактивации Х-хромосом у самок гибридов полевок рода Hicrotuo посвящена следующая глава диссертации.

Выяснение роли гетерохроматина в процессе инактивации Х-хромосомы у исследованных самок гибридов полевок рода Microtus (4,в.30,31)

В настоящем разделе диссертационной работы мы хотим обсудить возможные механизмы влияния гетерохроматина на процесс инактивации X хромосом, привлекая для этого некоторые гипотетические модели, предложенные в литературе. № не ставим перед собой задачу разобрать все известные механизмы, поскольку они достаточно полно обсуждены (см.обзоры Gartler ft Rlggs, 1983; Grant a Chepnan,1988), а

рассматриваем здесь только те факты и гипотезы, которые могут в какой-то мере объяснить наши данные, полученные при изучении инактивации X хромосом у самок гибридов полевок рода Microtus. Для полноты и объективности обсуждения нам бы хотелось прежде всего оценить вероятность того, что причиной

наблюдаемого феномена неслучайной инактивации X хромосом у самок гибридов полевок является не гетерохроматин, а какие-то иные факторы. Неслучайность инактивации в этом случае может быть вызвана: а) селекцией клеток с активной X хромосомой, содержащей блок гетерохроматина; ь)последствиями отдаленной гибридизации; сшаличием цис-действунхцих генетических факторов, типа Хсе локуса (X-chroaosome controlling elecent), ОПИСаННОГО У МЫШвй (Cattanach, 1367; .1975; Kreltsch, 1986).

Селекция. Исследование вероятности селекции клеток с активной Ххромосомой M.aubarvalls у СЭМОК ГИбрИДОВ M.arvalls х H.oubarvaiis в раннем эмбриогенезе было предметом нашего детального анализа. Было показано, что спектры анализируемых ферментов идентичны у 6.5-, 7.5-, 9.5-дневных эмбрионов и у взрослых особей. Учитывая, что сравнение темпов эмбрионального развития между мышью и полевками M.arvaiiE и и.Bubarvaiis не выявило существенных различий между ними, мы использовали в своем обсуждении схему эмбрионального развития мыши (McLaren, 1976). Маловероятно, чтобы наблюдаемые смещения родительских X хромосом от соотношения 1:1 у гибридов могли возникнуть в результате селекции за 1-2 клеточных цикла с момента инактивации X хромосомы. Кроме того, в этом случае возникает вопрос, почему отсутствует клеточная селекция у гибридов между видами, имеющими блоки гетерохроматина на X хромосомах?

Отдаленная гибридизация. Можно предположить, что полученные нами данные по неслучайной инактивации X хромосом, несущих блоки гетерохроматина в случае скрещивания с M.arvalls, являются результатом отдаленной гибридизации. Для оценки степени генетического родства между видами, используемыми в экспериментах, был проведен анализ рестрикционного полиморфизма по мтДНК, в основу которого был положен критерий учета изменчивости сайтов рестрикции митохондриального генома ' для определенных рестриктаз. Математическая обработка результатов этого анализа с использованием формул, предложенных Неем (Nei, 1972, 1976), выявила следующие филогенетические взаимоотношения между 4 видами полевок данной группы:

M.klrglsorum

0.86

M.transcasplcus M.subarvalla

0.45

0.36

0.05

M.arvalis

0.41

Эти данные свидетельствуют о том, что наиболее близкие родственные взаимоотношения - МвВДУ M.arvalla И M.aubarva-îis, а наиболее отдаленные - у всех видов с M.kirgisorua. Предполагая влияние отдаленной гибридизации на вероятность инактивации той или иной родительской X хромосомы и опираясь на полученные данные по мтДНК можно было бы ожидать более сильное отклонение от случайной инактивации X хромосом у всех гибридов с м.klrglsorum по сравнению с остальными комбинациями скрещиваний. Однако, неслучайная картина инактивации родительских X хромосом наблюдалась всегда у ГИбрИДНЫХ СаМОК при скрещивании Между M.subarvalls, H.trane-casplcus, M.klrglsoruD С M.arvalla, И Случайная При скрещивании первых трех видов между собой (см.Табл.з). Следовательно, генетические дистанции между этими тремя видами полевок никоим образом не сказываются на случайности инактивации родительских X хромосом у их гибридов. Кроме того, предполагая влияние отдаленной гибридизации на неслучайность инактивации родительских X хромосом, следовало бы ожидать аналогичную, даже более ярко выраженную картину и у самок межродовых гибридов. Однако, наши данные опровергают это предположение. При анализе экспрессии родительских аллелей Gpd у межродовых гибридов между лисицей (Vuipee fuivuBj и песцом (Alopex lagopus] были обнаружены вариации от гемизиготного проявления материнского аллеля до гемизиготного выражения отцовского аллеля, что свидетельствует о случайном характере инактивации родительских X хромосом у самок этих отдаленно родственых гибридов. Аналогичные результаты были получены и при анализе экспрессии родительских генов Gpd у мулов. Небезынтересно отметить, что на С-окрашенных X хромосомах песцов и лисиц гетерохроматин ограничен небольшими центромерными блоками. X

хромосомы лошади (Equus caballus) И ОСЛа (Equuo aslnus) имеют плотноокрашенные С-полосы в длинных плечах, кроме того на X хромосоме лошади находится центромерный блок гетерохро-матина, отсутствупций на X хромосоме осла (Графодатский & Радаабли, 1988). Т.е. отдаленность гибридизации как при отсутствии дополнительных блоков гетерохроматина на X хромосомах обоих родительских видов, так и при их присутствии не оказывает влияния на случайность инактивации X хромосом.

Xce-локус. У мыши, как известно, описано три аллеля Xce-локуса, вызывающие в гетерозиготных комбинациях неслучайную инактивацию той или иной родительской X хромосомы (Johnston A Cattanach, 1981). МОЖНО предположить, что у исследуемых полевок рода Hicrotus существует межвидовой полиморфизм по гипотетическому хромосомо-контро-лирупцему локусу. В ЭТОМ случае X хромосома M.arvalla должна нести самый сильный аллель хсе локуса, позволяющий этой хромосоме экспрессироваться с наибольшей вероятностью, а X хромосомы других видов Hicrotus - более слабый аллель локуса Хсе и, следовательно, наиболее часто инактивироваться у их гибридов с H.arvaiis. К сожалению, стерильность гибридов F5 между всеми 4 видами полевок не позволяет в настоящее время проверить это предположение. Однако, весьма маловероятно эволюционное сохранение идентичного аллеля Хсе локуса у M.subarvallB, М.tranacasplcus И M.klrglsorun И сильная дивергенция этого локуса у наиболее близкого к M.subarvaiis вида.

Т.о. анализ влияния возможных факторов, вызывающих наблюдаемый эффект, позволяет прийти к заключению, что ни один из них, вероятнее всего, не подходит на роль кандидата для объяснения причин этого феномена. В настоящий момент наиболее подходящим кандидатом, по нашему мнению, для которого показана положительная корреляция с инактивацией той или иной родительской X хромосомы, является гетерохро-матин, локализованный блоками различной величины в прицен-тромерном (М.tranacasplcus, М.klrglsorum) ИЛИ теломерном (M.subarvaiis) районах Х-хромосом (см. Рис.2). Механизм, осуществляющий это воздействие, остается пока неизвестным.

Неясно также, прямое ли это воздействие, т.е. вызванное именно наличием гетерохроматина на хромосоме, или оно опосредовано через какие-то внутриклеточные процессы. Переходя к этому вопросу, нам бы хотелось коснуться некоторых общих проблем, рассмотрение которых необходимо для обсуждения закономерностей инактивации X хромосом у полевок, в частности, проблемы центра инактивации. Центр инактивации. Изучая поведение аномальных X хромосом, полученных в результате Х-аутосомных транслокаций у человека Терман с соавт. (Thernan et ai, 1974, 1979) и Маттей с соавт. (Mattel et ai, 1981) предположили существование специфического цис-действуюдего локуса на X хромосоме человека, который контролирует процесс инактивации X хромосомы в раннем эмбриогенезе. В случае потери этого локуса хромосома или отдельный ее сегмент не могут быть ИНЭКТИВИрОВаНЫ. МаНДвЛ С СОаВТ. (Mandel et al., 1989) локализовали этот локус (xic) в районе Xqi2-qi3 вблизи локуса pgki. Центр инактивации X хромосомы мыши также был локализован вблизи локуса pgki. Сравнительное картирование показало синтению xic-районов у этих двух видов (Raetan а Brown, 1990).

Большое сходство в организации геномов высших млекопитающих позволяет предположить, по аналогии с мышью и человеком, наличие центра инактивации X хромосомы у всех видов млекопитающих, у которых дозовая компенсация осуществляется за счет инактивации одной из родительских X хромосом. Из-за отсутствия прямых доказательств существования и локализации центра инактивации (xio на X хромосомах полевок рода Microtus нам тоже придется пока ограничиться лишь его постулированием.

Сравнение конститутивного гетерохроматина с факультативным, который представлен инактивированной X хромосомой у млекопитающих, выявляет много общих черт и свойств в их поведении. В частности, для гетерохроматина характерны высококонденсированное состояние на протяжении всего клеточного цикла, поздняя репликация в s фазе и генетическое молчание. Одной из причин высококонденсированного состояния для конститутивного гетерохроматина является молекулярная

организация основной ДНК гетерохроматина из повторяющихся нуклеотидных последовательностей. Т.к. по многим свойствам инактивированная х хромосома ведет себя как конститутивный гетерохроматин, то не исключена возможность,, что хотя бы участок (или участки) хромосомы, из которого начинается процесс инактивации и распространяется далее на всю X хромосому, имеет какие-то фундаментальные свойства гетерохроматина (как матрица-затравка при репликации ДНК).

Нам представляется справедливым предположение, высказанное Оно (Ohno, 1973), о том, что гипотетический ■оператор", или сайт, регулирующий активацию/инактивацию X хромосомы, вероятнее всего находится внутри или рядом с районом, богатым повторяющимися последовательностями ДНК. По мнению Оно (Ohno, 1973) не исключено, что сам операторный сайт содержит в себе уникальный класс повторяющейся последовательности ДНК. Идею о существовании специфических Х-хромосомных повторяющихся последовательностей рассматривали также Гартлер И Риггс (Gartler ft Rlggs, 1983) при обсуждении модели инактивации X хромосомы »остановка в пути». Присутствие специфических последовательностей на X хромосоме человека, участвующих в установлеюш неактивного состояния участка хромосомы, содержащего такие последовательности, предполагают и Мохандас с соавт. (Mohandas et ai, 1987) при обсуждении своих результатов по изучению характера инактивации X хромосомы с дупликацией района Xq26.3-Xqter и делецией Xp22.3-Xpter. Не постулируя наличие таких последовательностей трудно объяснить, как волна инактивации может "перескакивать" через избегающие инактивацию районы X хромосомы человека (Gartler 6 Andina,1976; Shapiro et al, 1979; Bedln et al, 1981) И ЭУТОСОМНЫе раЙОНЫ При X-ауТОСОМНЫХ транслокациях у МЫШИ (Cattanach, 1974) и инактивировать лежащие за ними районы X хромосомы, не имеющие центра инактивации. По мнению Мохандас с соавт. (Mohandas et al,1987) такие участки могут быть лишены подобных специфических последовательностей и не инактивиро-ваться, хотя способны передавать сигнал инактивации вдоль хромосомы. Мы также предполагаем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая центр инактивации, включает в себя

повторяющуюся ДНК, которая могла бы в определенных условиях выполнять функцию центра конденсации хромосомы.

В литературе появились некоторые свидетельства в пользу данного предположения. Анализ молекулярной структуры X хромосомы мыши, проведенный Назир с соавт. (Nasiг et ai

1990), выявил необычные, нехарактерные для изученных до настоящего времени генов структуры в Гимза-позитивном банде хаз, которые представляют собой островки Х-специфических повторенных последовательностей ДНК, интегрированные с высокоповторяющимися последовательностями ДНК и обладающими большим сродством к lime повторам. При анализе последовательности гена Xlet у мыши Борсани С соавт. (Boreanl et al.,

1991) обнаружили последовательность ДНК, состоящую из 24 пар нуклеотидов и повторяющуюся 8 раз. Сравнение этой последовательности с описанными ранее не выявило значительного сходства ни с одной из них. Конечно, этих фактов недостаточно для того, чтобы делать выводы о роли повторяющихся последовательностей в инактивации X хромосомы самок млекопитающих, но мы полагаем, что с течением времени будет накапливаться все больше экспериментальных данных в пользу этого предположения.

Учитывая видовые особенности наличия гетерохроматиновых блоков на X хромосомах у полевок рода Miorotus, мы провели направленный поиск таких последовательностей. При сравнительном анализе картин рестрикции геномной ДНК полевок нами было показано, что количество и характер распределения полос, соотвествующих повторяющимся фрагментам ДНК, индивидуальны для каждого вида. Два фрагмента, обозначенные нами как mel (общий для всех четырех видов полевок) и Ms2 (выявляемый ТОЛЬКО у Mlcrotus subarvalls), С ПОМОЩЬЮ электроэлюции были выделены из геля, встроены в плазмиду puci9 и проклонированы в е.coii. Для установления хромосомной локализации клонированных фрагментов провели гибридизацию in situ на препаратах метафазных хромосом полевок рода Microtus. Результаты гибридизации in situ показали, что фрагмент Mal рассеян по всему геному, хотя преимущественная локализация наблюдается на х и у хромосомах. Для идентификации фрагмента hsi мы провели поиск.

в банке последовательностей и обнаружили гомологию около 70% с и-элементом мыши, lim<i-a2.

Результаты гибридизации in situ фрагмента Ms2 однозначно показали, что этот фрагмент является специфическим для гетерохроматиновых районов половых хромосом Microtus subarvaiis. Мы полагаем, что наличие таких фрагментов как Mel и Ив2 открывает перспективы для дальнейшего исследования роли повторяющихся последовательностей ДНК в инактивации Х-хромосомы.

Каким образом гетерохроматин может влиять на процесс инактивации X хромосом в соматических тканях у исследованных самок гибридов шлевок рода Microtus? Опираясь на свойства гетерохроматина, а также на известные эффекты гетерохро-матина в клетках дрозофилы и млекопитающих при Х-аутосомных транслокакациях рассмотрим некоторые из возможных механизмов его воздействия на инактивацию X хромосом у полевок, рода Microtus.

Эффект положения. Как уже было сказано, обнаружив у межвидовых гибридов полевок преимущественную инактивацию X хромосом с блоком гетерохроматина по сравнению с их Х-партнером, у которого отсутствует такой блок, и проанализировав возможные причины этого явления, мы пришли к выводу, что наиболее вероятным фактором, вызывающим наблюдаемый эффект, является локализованный на X хромосомах гетерохроматин. Предположение, что наблюдаемый феномен является не чем иным., как эффектом положения мозаичного типа, аналогичным обнаруженному у D.neianogaster, выглядело очень заманчивым. Следует отметить, однако, что как у дрозофилы, так и у млекопитающих все известные до сих пор случаи эффекта положения мозаичного типа возникали исключительно при хромосомных перестройках, когда в хромосомах дрозофилы нарушалась естественная граница между гетерохроматиновым и эухроматиновым участками хромосом, а у млекопитающих аутосомный участок оказывался вовлеченным в процесс инактивации (гетерохроматинизации) X хромосомы. И если рассматривать с этой точки зрения данные наших экспериментов, то, конечно, их невозможно объяснить эффектом положения в его классическом виде. У гибридных полевок

хромосомные перестройки не возникают, следовательно граница (стоп-сигнал) между гетерохроматиновым и эухроматиновым участками хромосом не нарушается. Но хромосома с гетерохроматиновым блоком у гибридов все-таки преимущественно инактивируется. Причем, по всей видимости, гетерохроматин не оказывает подавляющего воздействия на экспрессию генов активной X хромосомы, поскольку в этом случае мы наблюдали бы пониженный уровень активности анализируемых ферментов s видов с гетерохроматиновыми блоками по сравнению с M.arva-lis, у которого такой блок отсутствует. Действительно, сравнение уровня активности gspd у всех четырех исследуемых видов полевок не выявило сколь либо существенных отклонений В уровне аКТИВНОСТИ фермента между M.arvalla, M.cubarvalla и и.tranacaapicua. Единственный вид с пониженным примерно в 1.5 раза уровнем активности G6PD был M.klrglsorua. Но у этого вида самый небольшой по размеру блок гетерохроматина, поэтому маловероятно, что он оказывает сильное подавляющее воздействие на экспрессию генов обеих X хромосом. Кроме того, наличие добавочных гетерохроматиновых блоков на половых хромосомах очень широко распространено у млекопитающих, и в особенности у полевок рода Microtua (Ohno, 1966; Cooper & Hsu, 1972; Burgos et al, 1988). Вряд ли гетерохроматин был бы так широко представлен у разных видов, если бы он оказывал негативное воздействие на клеточные процессы.

С учетом_ вышесказанного, более правдоподобным выглядит предположение, что гетерохроматин оказывает воздействие не на всю X хромосому, а только на центр инактивации и исключительно в момент инициирования этого процесса. В этом случае удаленность центра инактивации от блока гетерохроматина на X хромосоме является существенным фактором в инициировании инактивации той или иной хромосомы. Это предположение, в случае его реальности, могло бы объяснить тот факт, что у гибридов между M.subarvaiis и н.kirgisorum, имеющих контрастные по размеру и расположению блоки гетерохроматина, инактивация носит случайный характер, а в некоторых случаях даже имеет тенденцию к смещению в пользу м.kirgisorum. Хотя размер гетерохроматинового блока у

м.к1гд1вог1ш меньше, чем у м.виЬагуаИв, одинаковое или более близкое расположение центра инактивации к гетерохроматину у и.к1гдг1вогиш может вызвать равновероятную ИНакТИВаЦИЮ С X ХРОМОСОМОЙ М.виЬагуа11в.

Итак, мы рассмотрели на хромосомном уровне, каким образом структурный гетерохроматин, локализованный на X хромосоме, может влиять на инактивацию X хромосом у самок млекопитающих. Попытаемся теперь обсудить, какие молекулярные механизмы могли бы опосредовать это влияние. Негистоновые белки. Учитывая поток работ о регуляторной роли негистоновых белков в клеточном метаболизме, обратимся к группе моделей инактивации X хромосом, рассматривающих в качестве ключевого события инактивации связывание негистонового белка с центром инактивации. Эти модели являются одними из наиболее старых, но не потерявшими актуальности и по сегодняшний день. Наиболее подробно модель из этой группы была сформулирована Оно (01шо, 19731. Он предположил, что белки-регуляторы продуцируются аутосомами в ограниченном количестве и обладают очень высокой кооперативностью связывания с регуляторным центром. Первая регуляторная молекула присоединяется случайно, а все остальные оказываются вынужденными связываться с регуляторным центром этой же хромосомы из-за свойства высокой кооперативное™ этих молекул. Синтезируемый позднее репрессор инактивирует все хромосомы, не имеющие регуляторного центра, защищенного белками-активаторами. Основная ошибка всех этих построений заключалась в том, что ключевым событием инициации рассматривалась активация одной из двух неактивных X хромосом. В остальном эта гипотеза имеет право на существование и сегодня. Наша экспериментальная модель, на наш взгляд, может послужить аргументом в пользу такой гипотезы.

Известно, что процесс структурирования интерфазного ядра идет на ранних стадиях эмбрионального развития. На стадии четырех бластомеров у всех хорошо изученных на ранних стадиях эмбриогенеза объектов (лосось, форель, ряд амфибий, мышь, пашенная полевка) в ядре еще не выявляются оформленные гетерохроматические структуры (см.Прокофьева-Бельговская, 1986). По мере клеточных делений происходит оформление

блоков гетерохроматина, которое связывают с повышением синтеза в ядре гистонов и негистоновых белков. Подобно тому, как присутствие в клетках D.neianogaster дополнительных блоков гетерохроматина приводит к супрессии эффекта положения (Dlnltrl в Plzano, 1989), ВПОЛНв ВОЗМОЖНО, ЧТО ОТТОК

гистонов и негистоновых белков на упаковку реплицированной X хромосомы, содержащей блок гетерохроматина, приводит к недостатку белков при упаковке других хромосом, в частности, X хромосомы, не содержащей аналогичного блока.

Каков же возможный механизм этого процесса? В настоящее время хорошо установлена существенная роль линкерных гистонов в поддержании высокоупорядоченной структуры хроматина (Renz et al, 1977). Кроме того, показано, что линкерные гистоны находятся постоянно в динамике, обмениваясь местами между высокоаффинными сайтами. Они также поддерживают транскрипционную активность специфических генов дифференциальным связыванием внутри хроматина (Hannon et al, 1984). В 1986 году ХЭНОН С СОЭВТ. (Hannon et al, 1986) В эксперименте in vitro продемонстрировали, что не только линкерные гистоны, но и РНК-полимераза E.coii может свободно мигрировать между отдельными линкерными сегментами на хроматине в поисках специфического сайта связывания. Совершенно неожиданной оказалась эффективность, с которой фермент находил свой инициаторный сайт на хроматине. Результаты этого эксперимента позволили авторам высказать гипотезу о -том, что механизм наблюдаемой облегченной диффузии заключается в "скольжении" или "прыжках" белка вдоль хроматина (Hannon et al, 1986). Эти работы натолкнули нас на мысль, что негистоновые белки, участвующие in vivo в упаковке ДНК в высококонденсированные гетерохроматические структуры могут действовать аналогичным образом. На первом этапе происходит неспецифическое связывание белков по всей длине интерфазной хромосомы. На втором - белки диффундируют вдоль хромосомы в поисках специфических сайтов связывания. Достигнув центра конденсации гетерохроматического района, белок связывается специфически, удаляясь из равновесия, определяемого константой диссоциации этого белка с хроматином. В результате равновесие связывания слабо ассоциирован-

ных молекул будет устанавливаться вновь, и белки будут вновь удаляться из ядра. Поскольку у млекопитающих на ранних стадиях эмбриогенеза происходит упаковка гетерохроматических районов хромосом в оформленные блоки, то вдоль хромосом, имеющих такие районы, будет наблюдаться направленный поток белков, участвующих в упаковке. Мы предполагаем, что гетеро-хроматин на X хромосоме у полевок работает как "магнит", оттягивая на себя негистоновые белки и обеспечивая статистически более частое обновление белкового пула вдоль этой хромосомы. Кроме того, скручивание ДНК гетерохроматина в процессе упаковки и специфического связывания негистоновых белков с ДНК может вызвать суперспирализацию и изменение конформации хромосомы. В результате в какой-то момент времени последовательность ДНК в центре Х-инактивации оказывается в конформации, необходимой для связывания с ней высокоаффинных молекул белка, ответственного за конденсацию X хромосомы. Молекулы белка, диффундирующие в направлении гетерохроматического района хромосомы в какой-то момент времени попадают в район центра инактивации, находящегося в необходимом для связывания конформационном состоянии, и специфически связываются с ним (Рис.з). Тем самым повышается вероятность связывания белков с центром инактивации этой хромосомы по сравнению с хромосомой, лишенной блока гетерохроматина. С другой стороны, X хромосома без блока гетерохроматина может не получить достаточного количества белков для инициации инактивации, и как следствие этого наблюдаемая неслучайность инактивации родительских X хромосом.

Рассмотренный выше механизм инактивации, по нашему мнению, достаточно обоснованно может объяснить результаты, полученные в наших экспериментах на межвидовых гибридных самках полевок рода нюгош, несущих блоки гетерохроматина на X хромосомах. Тем не менее из-за недостатка экспериментальных данных в настоящее время мы не можем исключить и альтернативные механизмы инактивации, объясняющие этот феномен, базирующиеся на других свойствах гетерохроматина, в частности, на поздней репликации гетерохроматических районов хромосом.

Сел

^22галлл-

в|

АЛ АЛЛА

Рис.з Модель инактивации X хромосомы.

А - изменение конформации ДНК в центре инактивации в результате скручивания ДНК в ' процессе упаковки гетерохроматического района X хромосомы (упаковывающиеся последовательности изображены зигзагом). В - инициация инактивации в результате связывания негистонового белка с центром инактивации (Х1С). V - негистоновые белки, участвующие в упаковке ДНК; Сеп - центромера, нсь - гетерохроматиновый район X хромосомы. Стрелками указаны возможные перемещения белков 'вдоль хромосомы по механизму -облегченной диффузии"

Поздняя репликация и конденсация. Известно, что высококон-денсированные гетерохроматические районы хромосом, как правило, поздно реплицирующиеся. Хааф и Шмид (НааГ а йоты, 1989) в экспериментах с деконденсацией гетерохроматина на X хромосомах пашенной полевки ЩсгоЪив адгев^а получили дополнительные доказательства тесной взаимосвязи между репликацией и хромосомной конденсацией. Была показана

строгая корреляция между деконденсацией факультативного гетерохроматина и деконденсацией конститутивного гетерохро-матина, а также высказана гипотеза, что наблюдаемый феномен относится к большей части X хромосомы, а именно, ингибиро-вание конденсации начинается в районе "конститутивного гетерохроматина и затем прогрессивно распространяется в факультативный гетерохроматин (Haar a Schmid, 1989). Эти данные позволяют предположить, что процессы конденсации этих районов неактивной X хромосомы взаимосвязаны и, следовательно, волна конденсации конститутивного гетерохроматина может индуцировать при благоприятных условиях конденсацию (и, следовательно, инактивацию) эухроматического района данной X хромосомы. Кроме того, в литературе накоплены факты, свидетельствующие о строгой корреляции между репликацией в ранней s фазе и экспрессией для различных генов. Обобщение этих данных позволило Гранту и Чепману (Grant & chapman, 1988) предложить модель репликации-экспрессии регуляции генов применительно к механизму Х-хромосомной инактивации. Согласно этой модели гены, реплицирующиеся рано в а фазе, имеют наибольшую возможность связывания факторов транскрипции и, как следствие этого, имеют наибольшую возможность экспрессии. Эта модель, однако, не рассматривает ключевого события инактивации - инициации этого процесса, вызывающего асинхронность репликации и общую репрессию всех генов одной X хромосомы. Мы предполагаем, что в клетках существует естественная, возможно, небольшая асинхронность в репликации гомологичных хромосом (или генов), достаточная для того, чтобы X хромосома, реплицированная раньше, осталась активной, а другая (или другие) были инактивированы. Как известно, гетерохроматин реплицируется поздно в s фазе, поэтому задержка во времени репликации хромосомы, несущей блок гетерохроматина, может быть - фактором, провоцирующим инактивацию данной X хромосомы. В том случае, когда обе X хромосомы содержат гетерохроматиновые блоки, они оказываются в равных условиях и здесь уже играет роль фактор случайности.

заключение

Суммируя полученные результаты хотелось бы выделить основную стратегию и направленность данной работы. Как было отмечено, мы пошли по пути выявления видоспецефических маркеров на основе результатов сравнительного электрофорети-ческого анализа ферментов и структурных белков у изученных видов. Это в свою очередь позволило нам использовать выявленные видоспецифические маркеры (изоферменты) в качестве маркеров генной активности для изучения закономерностей экспрессии некоторых гомологичных генов у межвидовых и межродовых гибридов млекопитающих. К поиску таких биохимических маркеров, кодируемых аутосомными и сцепленными с полом генами, собствено и свелась первая часть нашей работы. Как уже было сказано, мы не ограничились только сравнением спектров изоферментов и выявлением видоспеиифических маркеров, но также провели направленный поиск внутривидового полиморфизма, изучили генетический контроль и некоторые биохимические свойства выявленных нами новых электрофорети-ческих вариантов белков, ранее не описанных- в литературе.

Используя полученные данные, установили, что регуляция фенотипического выражения генов, локализованных в Х-хромосо-ме, на тканевом уровне может осуществляться за счет генетической детерминации размеров групп инициаторных клеток, определяющих вариабельность количественных параметров клеточных популяций с различными родительскими Х-хромосомами в активном состоянии, от чего в свою очередь, прямо зависит экспрессивность и пенетрантность генов, локализованных в Х-хромосоме.

Обнаружив у межвидовых гибридов полевок преимущественную инактивацию Х-хромосом с блоком гетерохроматина по сравнению с их Х-партнером, у которого отсутствует такой блок, и проанализировав возможные причины этого явления, мы пришли к выводу, что наиболее вероятным фактором, вызывающим наблюдаемый эффект, является локализованный на Х-хромосомах гетерохроматин. Мы сделали попытку обобщить разрозненые данные, касающиеся возможной роли гетерохроматина в процессе инактивации, и обсудить некоторые гипотетические механизмы такого влияния на примере инактивации Х-хромосом у самок

гибридов полевок рода шсгоъив. Хотелось бы отметить, что некоторые из рассмотренных здесь механизмов инактивации Х-хромосом в некоторых деталях противоречат один другому. Нельзя исключить и возможность того, что наблюдаемый феномен обусловлен суммарным действием нескольких факторов, а также вероятность того, что на практике реализуется иной механизм, не расмотренный в данной работе. В любом случае, накопление данных в этой области и выяснение возможной роли гетерохро-матина в процессе инактивации Х-хромосом у самок млекопитающих, учитывая сходство многих свойств неактивной Х-хромосомы со структурным гетерохроматином, может послужить существенным шагом в понимании механизмов, лежащих в основе инактивации.

ВЫВОДЫ

1.Впервые осуществлено сравнительное изучение структурных белков и ферментов у хищных (песцы и лисицы), непарнокопытных (лошади и ослы) и грызунов (четыре вида полевок и два подвида мышей). Исследовано зэ структурных белков и ферментов у песцов и лисиц и 53 - у полевок М1сго1ив агуаПб И Mlcrot.ua виЬагуаНа. Обнаружен

межвидовой полиморфизм по карбоксилэстеразе, диафоразе, аденилаткиназе, глюкозо-б-фосфатдегидрогеназе, преальбу-мину, трансферрину, альбумину у лисиц и песцов и по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе, гемоглобину, лактатдегидро-геназе, о-галактозидазе, аденилаткиназе, диафоразе, 6-фосфоглюконатдегидрогеназе у полевок М1сгогив атИв и М1сгоЪив виЬагуаНв. 2.Описан внутривидовой полиморфизм по уровню активности лактатдегидрогеназы и по электрофоретической подвижности диафоразы, кислой фосфатазы эритроцитов, глюкозофосфатизо-меразы и гаптоглобина лисицы. У песцов внутривидовой полиморфизм не обнаружен. У полевки М1сго1ив виЬагуаПв выявлен и описан внутривидовой полиморфизм по лактатдегид-рогеназе, диафоразе, 6-фосфоглюконатдегидрогеназе, лейцин-ариламинопептидазе. У полевок Microt.ua агуаНв полиморфизма по исследованным белкам не обнаружено. з.На основании сравнительного электрофоретического анализа

структурных белков и ферментов у песцов и лисиц, а также у двух видов полевок с учетом внутрививидового полиморфизма по проанализированным белкам, установлено, что карбоксил-эстераза, аденилаткиназа, глюкозо-в-фосфатдегидрогеназа, преальбумин, трансферрины, альбумин являются видоспецифи-ческими маркерами, дифференцирующими песцов и лисиц. Для полевок видоспецифическими маркерами являются глюкозо-в-фосфатдегидрогеназа, гемоглобин, а-галактозидаза и аденилаткиназа. Для лактатдегидрогеназы, диафоразы и в-фосфо-глюконатдегидрогеназы только один из электрофоретических вариантов может быть рассмотрен как видоспецифический маркер для исследованных полевок.

4.Выявлены определенные закономерности проявления гомологичных аутосомных генов при отдаленной гибридизации млекопитающих. Установлено, что взаимодействие гомологичных аутосомных генов у межродовых гибридов песца и лисицы, у межвидовых гибридов полевок Н1сго1ив вгувИв и МсгоЪив

виЬагуаИв И у ГИбрИДОВ ДОМОВЫХ МЫШвЙ М.а.Ьас1г1апив И м.т.аотевмсив, соотвествуют кодоминатному типу наследования, что находится в соотвествии с данными о кодоминнатном проявлении аллельных генов при внутривидовой гибридизации.

5.На основании анализа сегрегации хромосом и биохимических маркеров лисицы в панели клонов гибридов соматических клеток китайский хомячок х лисица впервые построена цитогенетическая карта серебристо-черной лисицы, включающая зо генов, кодирующих биохимические признаки. Картированные гены маркируют 15 аутосом и Х-хромосому лисицы. 24 из зо локализованных генов образовали ю групп синтенных генов.

6. Впервые описаны электрофоретические варианты у мышей м.га.ьас!г1апив по гипоксантин-фосфрибозилтрэнсферазе, б-фосфоглюконатдегидрогеназе и по аденинфосфорибозил-■грансферазе. Обнаруженные новые аллели генов, кодирующих аденинфосфорибозилтрансферэзу и гипоксантинфосфорибозил-трансферазу, были введены в конгенную линию на основе линии оо. Проведена локализация гена, кодирующего аденин-фосфорибозилтрансферазу, на генетической карте 8-ой хромосомы мыши, ' и установлен следующий порядок генов

относительно центромеры 8-ой хромосомы: центромера - 26 см - Е«-1 - 25 см - Аргг. Впервые установлено, что четвертичная структура молекулы гипоксантинтинфосфорибозилтранс-феразы - тетрамер.

7.Установлено, что у хищных (песцы, лисицы) и у непарнокопытных (лошади, ослы) структурный ген глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы локализован в X хромосоме. На основании распределения частот особей, с различным количественным проявлением родительских локусов вра в эритроцитах самок мулов и песцово-лисьих гибридов сделан вывод о случайном характере инактивации родительских Х-хромосом у самок песцово-лисьих гибридов и мулов.

8.При анализе экспрессии генов вера и а-са1, у межвидовых гибридов полевок рода Шсгс^ив установлен неслучайный характер инактивации Х-хромосомы, несущей блок гетеро-хроматина в том случае, когда только одна родительская Х-хромосома содержит гетерохроматиновый блок-, когда гетерохроматиновые блоки находятся на обеих родительских Х-хромосомах инактивация у гибридных самок носит случайный характер.

э.На основании полученных данных впервые высказана гипотеза о влиянии гетерохроматина на процесс инактивации X хромосом. Рассмотрены возможные механизмы этого феномена. Предложен гипотетический механизм, согласно которому в процессе упаковки гетерохроматического района хромосомы негистоновыми белками происходит изменение конформации хроматина в центре инактивации. Молекулы белка, диффундирующие по механизму "облегченной диффузии" вдоль Х-хромосомы в направлении гетерохроматического района, попадают в район центра инактивации, находящегося в необходимом для связывания конформационном состоянии, и специфически связываются с ним. Тем самым повышатся вероятность связывания белков с центром инактивации хромосомы с гетерохроматйном по сравнению с хромосомой, лишенной блока гетерохроматина.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бородин П.М., Саблина О.В., Закиян С.М., Нестерова Т.Б., Мейер М.Н. Морфология и поведение в мейозе половых хромосом у четырех видов полевок рода Hlcrotus //

ГенеТИКЭ, 1991, Т.27, Н в, СТр. 1059-10в5

2. Бочкарев М.Н., Кульбакина H.A., Закиян С.М., Рубцов Н.Б., Серов О.Л. Генетическое и биохимическое изучение аллельных вариантов гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы у домовых мышей. // Доклады Академии наук СССР, 1986,

Т.289, N4, СТр.989-991

3. Закиян С.М., Посух О.Л., Серов О.Л. Генетический контроль электрофоретических вариантов диафоразы эритроцитов серебристо-черной лисицы // Генетика, 1979, т.15, то,

СТр.1837-1840

4. Закиян С.М., Кульбакина H.A., Серов О.Л. Избирательная инактивация Х-хромосом у самок межвидовых гибридов Hlcrotus subarvallsi х Mlcrotus arvalls // ДАН СССР, 1984, Т.278, N8, СТр.1477-1478

5. Закиян С.М., Кульбакина H.A., Серов О.Л.. Мейер М.Н., Жарких A.A. Оценка степени генетической дивергенции ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ обыкновенной полевки Hlcrotus arvalls, Hlcrotus subarvalls (Rodentla) // Генетика, 1984, Т.20, N8, СТр. 1365-1373

6. Закиян С.М., Нестерова Т.Б., Черяукёне О.В., Бочкарев М.Н. Гетерохроматин как фактор, влияющий на инактивацию X хромосомы у гибридов обыкновенной полевки (Hicrotidae, Rodentla) // ГенеТИКЭ, 1991, Т.27, N3, СТр.425-433

7. Нестерова Т.Б., Бородин П.М., Закиян С.М. Локализация гена, кодирующего аденин-фосфорибозилтрансферазу, на генетической карте 8-ой хромосомы мыши // Генетика, 1988, Т.24, N5, СТр.829-835

8. Нестерова Т.Б., Никитина И.В., Закиян С.М., Рубцов Н.Б., Матвеева В.Г. Картирование генома серебристо-черной лисицы. Сообщение iii. Определение хромосомной локализации генов G0T2, aki, aldoc, acpi, itpa, pgp, BLVR // Генетика, 1990, T.26, Nil, стр.2028-2036

9. РубцовН.Б., Матвеева В.Г., Раджабли С.И., Кульбакина H.A., Нестерова Т.Б., Закиян С.М. Создание панели клонов гибридов соматических клеток лисица х китайский хомячок и определение хромосомной локализации генов ldha, ldhb, gpi, eso, G6PD, hprt, gala у серебристо-черной лисицы // Генетика, 1987, т.гз, и 6, стр.ювв-юэе

ю.Рубцов Н.Б., Графодатский A.C., Матвеева В.Г., Нестерова Т.Б., Кульбакина H.A., Закиян С.М. Картирование генома серебристо-черной лисицы. Сообщение I. Определение хромосомной локализации восьми генов лисицы и поиск гомеологичных районов хромосом лисицы и человека // Генетика, 1988, Т.24, HI, стр.69-79

11.Рубцов Н.Б., Нестерова Т.Б., Закиян С.М., Матвеева В.Г., Графодатский A.C. Картирование генома серебристо-черной лисицы. Сообщение и. Синтенные отношения генов у хищных // Генетика, 1989, Т.25, Н 12, СТр. 2199-2208

12.Серов О.Л., Хлебодарова Т.М., Закиян С.М. Злектрофоретические варианты гаптоглобина плазмы крови у серебристо-черных и красных лисиц // Генетика, 1973, т.9, N 11, стр. 79-81

13.Серов О.Л., Закиян С.М., Хлебодарова Т.М., Корочкин Л.И. Экспрессия гомологичных генов у межродовых песцово-лисьих гибридов (Alopex lagopus х Vuipes vuipos). Сообщение I. Сравнительный электрофоретический анализ белков и ферментов крови песцов и лисиц // Генетика, 1975, т.и, ы 8, СТр. 40-48

14.Серов О.Л., Закиян С.М., Корочкин Л.И., Владимиров A.B., Помытко В.Н. Экспрессия гомологичных генов у межродовых ПеСЦОВО-ЛИСЬИХ ГИбрИДОВ (Alopex lagopus х Vuipes vuipes).

' Сообщение Ii. Электрофоретический анализ преальбумина, альбумина и трансферринов у песцово-лисьих гибридов // ГеНеТИКа, 1976, Т.12, N 2, СТр. 110-115

15.Серов О.Л., Закиян С.М., Куличков В.А., Корочкин Л.И., Владимиров A.B. Экспрессия гомологичных генов у межродовых песцово-лисьих гибридов (Alopex lagopus X Vuipes vuipes). Сообщение in. Изучение механизмов выражения аллелей локуса gpd, локализованного в Х-хромосоме // Генетика, 1976, т.12, Nil, стр.44-50

16.Серов О.Л., Закиян С.М., Куличков В.А. Изучение механизмов экспрессии родительских аллелей локуса Gpd в эритроцитах мулов // Генетика, 1977, т.1з, ню, стр. 1761-1766

17.Серов О.Л., Закиян С.М., Куличков В.А. Использование маркерных генов, локализованных в Х-хромосомах, для анализа развития хрусталика у песцово-лисьих гибридов // Онтогенез, 1982, т.1з, N2, стр.152—161

18.Хлебодарова Т.М., Серов о.л., Закиян С.М. Изучение механизмов генной регуляции спектра изоферментов лактатдегидрогеназы в эритроцитах серебристо-черных лисиц // Генетика, 1978, Т.14, N2 стр.250-255

19.Bochkarev М.Н., Kulbaklna N.A., Zakljan S.M., Zhdanov* M.S., Rubtsov N.B., Serov O.L. Evidence for tetraaerlo structure of aaaaallan hypoxanthlne phosphorlbosyltrana-Гегаае // Blochem. Genet. 1987, v.25, N 1/2, pp.153-159

20.Nesterova T.B., Borodin P.M.,Zaklan S.N., Serov O.L. Assignment of the gene for adenine phosphorlbosyltran*-ferase on the. genetic nap of ■ouse chroaosoae 8 // Blochem. Genet., 1987, v.25, N 7/8, pp.563-568

21.Nesterova T.B., Rubtsov N.B., Zaklan S.M., Matveeva V.G., Graphodatsky A.S. Mapping of the silver fox genes: asslgnnents of the genes for ME1, ADK, PP, PEPA, GSR, MPI and GOT1 // Cytogenet. Cell Genet., 1991, v.58, p.125-127

22.Nesterova T.B., Nlkltlna I.V., Zaklan S.M., Rubtsov N.B., Matveeva-V.G., Radjabll S.I. Mapping'of the silver fox genes: chromosomal localization of the genes for GOT2, AK1, ALDOC, ACPI, ITPA, PGP and BLVR // Cytogenet. Cell Genet., 1991, v.56, p.185-188

23.Rubtsov N.B., Graphodatsky A.S., Matveeva V.G., Radjabll S.I., Mesterova T.B., Kulbaklna N.A., Zaklan S.M. Silver fox gene mapping: conserved chroaosoae regions In the Carnlvora // Cytogenet. Cell Genet., 1988, v.48, pp.95-98

24.Serov O.L., Zakljan S.M., Khlebodarova Т.Н., Korochkln L.I. Allelic expression In lntergenlc fox hybrid (Alopex lagopus x Vulpes vulpes). I.Comparative electrophoretlc studies on blood enzymes and proteins In Arctic and silver foxes // Blochem. Genet. 1976, v.14, N 11/12,

p.1091-1103

25.Serov O.L., Zakljan S.M. Allelic expression lntergenlc fox hybrid (Alopex lagopus x Vulpes vulpes). II. Erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase In Arctic and silver foxes: purification and properties // Blochea. Genet., 1977, v.15, p.137-146

26.Serov O.L., Zakljan S.N., Kullchkov V.A. Allelic expression In lntergenlc fox hybrid (Alopex lagopus x Vulpes vulpss). III. Regulation of the expression of the parental alleles at the Gpd locus linked to the X chroaosoae // Blochea. Genet., 197Ba, v.16, N 1/2, p.145-157

27.Serov O.L., Zakljan S.M., Kullchkov V.A. Analysis of aechanlsas regulating the expression of parental alleles at the GPD locus In aule erythrocytes // Blochea. Genet., 1978b, v.16, N 6/6, p.379-386

28.Zakljan S.M., Kulbaklna N.A., Serov O.L., Meyer M.N., Zharklkh A.A. An eatlaatlon of the degree of the genetic divergence of albllng species Mlcrotus arvails and Mlcrptus subarvalls (Rodentla) based on electrophoretlc analysis » Blochea. Genet. 1984, v.22. p. 1081-1091

29.ZaklJan S.M., Jiulbaklna N.A., Serov O.L. Blochealcal polyaorphlsa In voles Mlcrotus arvalla (Rodentla) // Isozyae Bulletin, 1985, v.18, p.79

30.Zaklan S.M., Kulbaklna N.A., Meyer M.N., Seaenova L.A., Bochkarev M.N., Radjabll S.I., Serov O.L. Non-randoa lnactlvatlon of the X-chroaosoae In Interspecific hybrid voles // Genet. Research, 1987, v.50, pp.23-27

Sl.Zaklan S.M., Nesterova T.B., Cheryaukene O.V., Bochkarev M.N. Heterochroaatln as a factor, affecting the lnactlvatlon of the X-chroaosoae In Interspecific hybrid voles (Mlcrotldae, Rodentla) // Genet. Res., 1991, v.58. p.105-110

Информация о работе

Закирян, Сурен Минасович
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.15

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Экспрессия гомологичных генов у гибридов млекопитающих ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гомологичных генов у гибридов млекопитающих"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия гомологичных генов у гибридов млекопитающих
ВАК РФ 03.00.15, Генетика