Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гибриды соматических клеток свинья-норка: картирование генов свиньи

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Гибриды соматических клеток свинья-норка: картирование генов свиньи"

_ С »П Г5

0 ¡иН ъьо

Л'

На правах рукописи УДК 575.155:575.116.4:(599.742.4+599.731.1)

Астахова Наталья Михаиловна

ГИБРИДЫ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК СВИНЬЯ-НОРКА: КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ СВИНЬИ.

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1998

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

Научны;: руководитель: кандидат биологических паук

ЛСданоиа И.С. Институт цитологии н геиетшш СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Стсгний В.Н. Институт биологии и биофизики Томского государственного университета, г.Томск

кандидат биологических наук

Хл&бодарова Т.М. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Институт общей генетики РАК, г. Москва

Защита диссертации состоится ' Ла/Ьеи^_1998

года на заседании диссертационного совета по

защиту/диссертаций па соискание ученой степени доктора наук ( Д-092.11.01 ) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института но адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и геиетшш СО РАН.

Ведущее учреждение:

Автореферат разослан

-Л.

1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Груздев А.Д.

АКТУАЛЬНОСТЬ. В настоящее время картирование хромосом млекопитающих является одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений современной генетики. Интерес к этим исследованиям обусловлен как их вкладом в теоретическую разработку основных проблем генетики, таких как изучение структуры генома и роли хромосомных перестроек в эволюции карио-типа млекопитающих, так и необходимостью решения частных вопросов генетики и селекции животных.

По данным Комитета по сравнительному картированию млекопитающих в настоящее время в картирование вовлечено 55 видов из 9 отрядов (Comparative Genome Organization of Vertebrates, 1996). Наибольший прогресс достигнут в картировании геномов человека, мыши и некоторых сельскохозяйственных животных.

С развитием работ по картированию сельскохозяйственных животных появилась возможность изучения экономически важных количественных признаков. В связи с этим ведется поиск полиморфных маркеров, тесно сцепленных с генами, вносящими главный вклад в формирование количественных признаков и, в перспективе, облегчающих процесс селекции. В основе всех этих направлении в картировании лежит создание генетических и физических карт высокой степени разрешения. Можно считать, что настоящий этап в картировании характеризуется именно переходом к созданию карт второй генерации, с расстоянием между маркерами в несколько сотен п.н.

Несомненным достижением картирования геномов млекопитающих можно считать выявление крупных ассоциаций генов, сохранивших синтению в течении многих миллионов лет. Эти данные позволили выдвинуть гипотезу о блочном характере перестроек хромосом в процессе эволюции млекопитающих. Развитие сравнительного картирования видоз в настоящее время достигло такого уровня, что полученные данные могут быть использованы для предсказания локализации генов у слабо картированных видов, тем самым ускоряя и удешевляя процесс их картирования.

Принципиальные достижения в области картирования хромосом млекопитающих, как правило, связаны с внедрением в эту область новых методических подходов. Современный этап в картировании начался с использования

парасексуального подхода, основанного на изучении сегрегации хромосом картируемого вида и маркеров в межвидовых гибридах соматических клеток. Несмотря на то, что в настоящее время для картирования используется обширный арсенал генно-инженерных методов, межвидовые гибриды соматических клегок не потеряли своего значения при создании цитогенетических карт видов, в дсле-ционном картировании, а также при построении физических карт высокого уровня разрешения.

Домашняя свинья (Sus seroja domestica L.), отряд Artiodactyla, относится в настоящее время к интенсивно картируемым видам, как важный сельскохозяйственный объект и как объект для сравнительного картирования. Кроме того, благодаря физиологическим особенностям, свинья является ценной биологической моделью, для медико-генетических исследований.

К началу данного исследования на цпгогенетическую карту свиньи было нанесено 84 гена (Ehard et al., 1992), и лишь немногие гены были картированы регионально. В отличие от большинства вовлеченных в картирование видов, подавляющее количество локализаций на хромосомы свиньи было сделано с помощью гибридизации in situ специфических ДНК проб. Это было связано с тем, что имеющиеся соматические гибриды свиньи с традиционными партнерами - мышью и китайским хомячком- имели нестабильный хромосомный состав и содержали множественные хромосомные перестройки. Отсутствие в то время надежных молскулярно-цитогенетических методов идентифицикации мелких или сложных перестроек хромосом затрудняло, а часто делало и невозможным применение этих гибридов для картирования. Все это сдерживало насыщение цитогенетической карты свиньи маркерами, особенно маркерами типа I, пригодными для сравнительного картирования видов, а так же переход к созданию физических карт высокого уровня разрешения.

Цели и задачи исследования.

Целью данного исследования являлось создание гибридных клеточных линий, пригодных для картирования хромосом свиньи, и пополнение с их помощью цитогенетической карты вида генами маркерами типа I. При этом предполагалось сделать акцент на получении гибридных линий, содержащих одну

или несколько хромосом свиньи. Наличие подобных линий позволяет использовать подход "генов-кандидатов" для картирования генов свиньи.

Для достижения цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Получить набор клеточных гибридов свинья-норка путем слияния лейкоцитов свиньи с мутантной клеточной линией норки MVTK-. Охарактеризовать полученные гибриды цитогенетически, используя методы гибридизации in situ с меченой радиоактивно или с помощью биотина суммарной ДНК свиньи и GTG-днфференциальной окраски хромосом.

2. Составить набор из первичных клоноз свинья-норка и свинья-китайский хомячок, и их субклонов, для картирования хромосомы 12 свиньи и локализовать на неё 4 гена свиньи.

3. Получить и охарактеризовать цитогенетически гибридные клеточные линии, содержащие одну хромосому свиньи на фоне хромосом норки.

4. Используя гибридные монохромосомные линии свиньи, провести локализацию ряда генов-маркеров типа I свиньи методами гель-электрофореза белков, блот-гибридизацин с гетерологичными ДНК зондами и методом анализа ПЦР продуктов гибридных клонов, полученных в результате амплификации со специфическими пранмерами.

5. Провести сравнительный анализ синтенных групп генов свиньи и других видов млекопитающих.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые получен нетрадиционный тип клеточных гибридов свинья-норка, отличающийся стабильностью и невысоким числом хромосомных перестроек. Клоны охарактеризованы с помощью классических цитогенетических методов, а также методов молекулярной цитогенетики.

2. Впервые с помощью специально подобранного набора гибридных клонов и субклонов свинья-норка установлена хромосомная, а затем субхромосомная локализация генов ТК1 и UMPH2 свиньи.

3. Впервые получены и охарактеризованы гибридные клеточные линии с одной хромосомой свиньи: 2, 5, 8, 12 и t(l;13).

4. Впервые с использованием набора гибридных клонов свинья-норка методом блот-гибридизации с гетерологичным зондом кДНК мыши установлена хромо-

сомная локализация гена RAD52 свиньи; методом ПЦР- амплификации со специфическими праймерами - локализация генов NF1, EVI2A, MGF и MLR свиньи. Для двух генов сшшьи (LDHA и LDHB) получены независимые данные о хромосомной локализации, что позволило перевести их в категорию "окончательно установленных".

5. На основе анализа синтенных групп генов подтвержден консерватизм генного состава выявленных ранее гомологичных сегментов хромосом свиньи и человека. Показано сохранение синтении ряда генов свиньи н других видов млекопитающих.

Практическая ценность насыщения цитогенегической карты свиньи маркерами типа I состоит в создании консенсусной карты генома свиньи, необходимой для оптимизации селекционно-генстических работ и картирования генов количественных признаков. Картирование генов RAD52, NF1, EVI2A, MGF и MLR, дефекты которых вызывают тяжелые наследственные заболевания, связанные с нарушением обмена веществ и злокачественными новообразованиями у человека, имеет важное экономическое значение и для сельскохозяйственных животных. Кроме того, локализация у свиньи ряда генов, обуславливающих наследственные заболевания человека, послужит созданию биологической модели для изучения этих генетических болезней.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 10-ом симпозиуме по генетике и разведению сельскохозяйственных животных (Германия, 1992), на 17-ом Международном Генетическом Конгрессе (Великобритания, 1993), на 24-ой Международной конференции по генетике животных (Чехия, 1994), на 2-ом Европейском конгрессе по млекопитающим (Англия, 1995), на 12-ом Международном коллоквиуме по цитогенетике домашних животных (Испания, 1996), на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем paüon.i. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах. Содержит 18 рисунков и 7 таблиц. Список литературы содержит 197 работ отечественных и зарубежных авторов.

Материалы и методы исследования.

В работе были использованы следующие клеточные линии: 1) перевиваемая линия MVTK" эмбриональных фибробластов американской норки (Mustela vison), дефицитная по тимидинкиназе1 (TKI); 2) лейкоциты крови свиньи; 3) культура первичных фибробластов кожи свиньи; 4) набор гибридов соматических клеток свинья-американская норка серии SV, полученный путем слияния клеток MVTKT с лимфоцитами периферической крови свиньи; 5) набор субклонов клеточных гибридов свинья-норка, полученный двумя способами: а) обычным субклонированием первичных гибридов в селективной среде ГАТ (например, SV1-1), б) селекцией первичных гибридов в культуральной среде с добавлением 30 мкг/мл 5-бромдезоксиуредина (5-БДУ). В аббревиатуру названия "обратных" субклонов введена буква В (например, SV1-B5); 6) гибридный клон свинья-китайский хомячок 8990; 7) набор субклонов клеточной линии 8990 свинья-китайский хомячок;

Цитогенетические исследования проводили с помощью стандартных методов приготовления и окраски препаратов (Раджабли, Крюкова, 1973). Для получения GTG-дифференциальной окраски хромосом использовали методику Сибрайт (Seabright, 1971) с модификациями. Для получения прометафазных хромосом свиньи и норки использовали метод Икеучи (Ikeuchi,1984). Выделение высокомолекулярной ДНК из культур клеток свиньи проводили по общепринятой методике (Маниатис и др., 1984). Мечение зондов ДНК тритием проводили с использованием статистического набора олигонуклеотидов в качестве затравок. Включение биотинилированного уридин трифосфата (Bioll-dUTP) проводили методом ник-трансляции с помощью ДНК-полимеразы-1/ДНК-азы 1. Реакцию гибридизации in situ проводили по методике Рапполда с модификациями (Rappold., 1985). Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле и Саузерн блот-гибридизацию проводили по методикам (Маниатис и др., 1984), с рядом модификаций. Электрофоретический анализа ферментов проводили по стандартным методикам. Выявление зон локализации ферментов проводили по методикам (Manchenko, 1994). Амплификацию ДНК свиньи, норки и гибридов соматических клеток свинья-норка со специфическими праймерами проводили по методике Эрлих с модификациями (Erlich, 1989). Секвенировали ПЦР продукты

свиньи, используя набор реактивов "Thermo Sequenase fluorescent labelled praimer cycle sequencing kit" (Amersham).

Результаты и обсуждение.

ХАРАКТЕРИСТИКА ГИБРИДНЫХ КЛОНОВ СВИНЬЯ-НОРКА.

В работе по картированию генома свиньи мы использовали новый тип соматических гибридов, впервые полученный методом слияния лейкоцитов свиньи с фибробластами норки линии MVTK-. Нами было выделено 46 независимых первичных клонов серии SV. Кроме того, в дальнейших опытах было получено 50 вторичных субклонов на среде ГАТ и 43 клона обратной селекции в присутствии 5-бромдезоксиуридина (5-БДУ).

Все выделенные клоны были проанализированы с помощью гибридизации ш situ либо с 3Н- меченой суммарной ДНК свиньи, либо меченой биотином в качестве зонда. Этот этап цитогенетического анализа выявил, что 67% от общего количества выделенных клонов составляли гибриды (31 клон). Цитогене-тнческнй анализ окрашенных по Гимза препаратов шести гибридных клонов позволил выявить фрагментацию хромосом свиньи более чем в 10% клеток. Эти шесть клонов (19% от общего числа) были отбракованы.

Рис. 1. Гистограмма распределения гибридных клонов свинья -норка по количеству, содержащихся в них хромосом свиньи. Абсцисса - количество хромосом свиньи в клоне; ордината • количество клонов.

Цитогенетический анализ с использованием метода СТС-дифференциальной окраски хромосом 17 гибридных клонов выявил перестрой-

ки хромосом свиньи в трех из них. Причем две транслокации идентифицированы и используются для субхромосомного картирования генов свиньи.

Все выделенные клоны по количеству содержащихся в них хромосом свиньи распределились следующим образом (Рис.1). Шесть клеточных линий из 24 гибридных содержали от 1 до 5 меченых хромосом, два клона содержали 6-10 меченых хромосом, а остальные 16 клонов были "многохромосомными", т.е. содержали от 16 до 30 меченых хромосом на фоне одного или нескольких наборов хромосом норки. Таким образом, было выявлено, что, в основном, клоны распределились по двум классам: 1) "малохромосомные"- гибриды, содержащие от 1 до 5 меченых хромосом; 2) "многохромосомные", гибриды, содержащие более 16 хромосом свиньи (п=18).

Отличительной особенностью полученных гибридов является высокая стабильность их хромосомного состава, т.е. во всех изученных клонах хромосомы свиньи были представлены с одинаково устойчивой и высокой частотой после длительного процесса культивирования и многократных пассажах крио-консервации.

Рис.2.Метафазная пластинка клона ЭУ!, ны. наличие клеток с небольшим после гибридизации т зИи с 3Н-меченой ЧИС1ЮМ хромосом свиньи послужи-тотальной ДНК свиньи. Стрелками ука-

лучения монохромосомных гибридных линий, ценного инструмента для картирования хромосом свиньи.

Таким образом, было показано, что в клеточных гибридах свинья-норка сегрегируют хромосомы свиньи, и почти отсутствуют фрагменты и транслокации между хромосомами свиньи и норки. Однако характер сегрегации хромосом свиньи в них таков, что для составления из них картирующей панели потребовались бы дополнительные затраты. С другой сторо-

заны хромосомы свиньи.

ло исходным материалом для по-

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНОВ ТК1 И UMPH2 С ПОМОЩЬЮ НАБОРА ГИБРИДНЫХ ЛИНИЙ СВИНЬЯ-НОРКА.

Для получения гибридных клеток свинья-норка была использована линия клеток норки, дефицитная по гену ТК1, поэтому'клетки, выживающие на селективной среде ГАТ, должны сохранять хромосому свиньи, содержащую ген ТК1. При культивировании в условиях обратной селекции хромосома, несущая ген должна теряться. Для определения локализации гена ТК1 свиньи были отобраны первичные клоны SV1 и SV11 с небольшим количеством хромосом свиньи.

На рис.2 приведена метафазная пластинка клона SV1, на которой видны 3 меченые хромосомы на фоне одного набора немеченных хромосом норки.

mink chromosomes

!

f* fir VU U

2 del(2)

Ьй à

ы li nv и

в t(2i7) 7 8 9

U à en л *■ V ÎJ w •• О * M

ii 12 13 l(14q)

PiO chromosomes

ъ *

г в

10

12

Рис.3. Хромосомный состав гибридного клона 5У1, содержащего хромосомы 8, 9, 12 свиньи. Хромосомы норки идентифицированы как набор хромосом линии клеток М\ТК" . вТС- дифференциальное окрашивание.

Цитогенетический анализ клона 5У1 показал, что практически все клетки этого клона содержат интактные 8, 9 и 12-ю хромосомы свиньи на фоне одного набора хромосом норки (рис.3). Путем субклонирования в стандартной среде (стандартные субклоны) и в среде с 5-бромдезоксиуридином (5-БДУ резистентные субклоны) было выделено по 4 субклона каждого типа, проанализированных с помощью ОТО-окрашивания. Все проанализированные стандартные субклоны содержали интактные 8, 9 и 12-ю хромосомы свиньи, а 5-БДУ резистентные субклоны - только хромосомы 8 и 9.

Аналогичным образом были получены субклоны первичного гибридного клона БУИ, который содержал хромосомы 8 и 12 свиньи в 100% и хромосому 14 в 30% клеток клона. Стандартные субклоны этого клона имели такой же хромосомный состав, а резистентные к 5-БДУ субклоны содержали на одну хромосому

Табл. 1. Хромосомный состав и анализ ТК1 и ЦМРН2 в гибридных клонах свинья-норка БУ! и БУИ и их субклонах.

Клоны и субклоны Число меченых хромосом Присутствие хромосом и нзоферментов свиньи

8 9 12 14 ТК1 иМРН 2

ЭУ1 3 + + + - + +

стандартные

8У1-5 3 + + + - + +

8У1-12 3 + + + - + +

8У1-19 3 + + + - + +

8У1-23 3 + + + - + +

5-БДУ-резнстентные

8У1-В1 2 + + - - - -

вУ1-В2 2 + + - - - -

8У1-В11 2 + + - - - - -

8У1-В12 2 + + - - - -

БУИ 2-3 + - + + + +

стандартные -

8У11-5 3 + - + + + +

8У11-13 3 + - + + + . +

8У11-1 2 + - + - + +

8У11-2 2 + - + - + +

5-БДУ-резистентные

8У11-В5 2 + - - + - -

8У11-В13 2 + - - + - -

ЭУП-ВЗ 1 + - - - - -

8У11-В12 1 + - - - - -

меньше, т.е. содержали либо хромосомы 8 и 14, либо единственную хромосому 8 свиньи. Из первичных гибридных линий 5У1 и ЭУ11 и их субклонов был составлен набор (Табл. 1).

При проведении электрофоретического анализа гибридных клонов был выявлен полиморфизм по подвижности фракций изоферментов ТК1 свиньи и норки. Электрофоретический анализ клонов ЭУ1 и БУИ и их стандартных субклонов выявил у них экспрессию изофермента ТК1 с подвижностью, характерной для фермента свиньи. В 5-БДУ-резистентных субклонах, как и ожидалось, активности изофермента ТК1 выявлено не было (Табл.1; Рис.4). Таким образом, в данном наборе клонов экспрессия фермента ТК1 с подвижностью, характерной для фермента свиньи, коррелировала с наличием в этих линиях хромосомы 12 свиньи, что позволило локализовать ген ТК1 на хромосому 12.

Известно, что ген ТК1 входит в крупную консервативную группу генов, сохраняющих синтению у многих видов млекопитающих. У человека эти гены

Рис.4. Спектр изоферментов ТК1 фибробластов норки (1) и свиньи (2), положительных по активности ТК1: клона БУИ и стандартного субклона (3, 4), отрица-тельных-5-БДУ резистентных субклонов (5, 6); положительного клона 5У1 (7), его отрицательного - 5-БДУ резистентного субклона (8), смесь фибробластов свиньи и норки (9)

локализованы в хромосоме 17, у мыши в 11-ой, у норки в 8-ой хромосоме. Мы предположили, что и другие члены этой консервативной группы, в том числе ген иМРН2, могут быть локализованы в хромосоме 12 свиньи. Нам удалось провести локализацию гена иМРН2 по разделению гомополимеров родительских

видов. В клонах SV1 и SV11 и их стандартных субклонах была выявлена активность фермента UMPH2 с подвижностью, характерной для норки и свиньи, а в 5-БДУ резистентных субклонах - только с подвижностью, характерной для норки. Другими словами, экспрессия UMPH2 свиньи коррелировала с наличием в гибридных линиях хромосомы 12 свиньи.

Анализ сегрегации изоферментов ТК1 и UMPH2 и хромосомы 12 свиньи показывает, что они сегрегируют со 100% конкордантностью (табл.1). Таким образом, можно заключить, что гены, кодирующие ферменты ТК1 и UMPH2, синтенны, входят в состав крупной консервативной группы генов и локализованы на хромосоме 12 свиньи.

РЕГИОНАЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ХРОМОСОМЫ 12 СВИНЬИ.

Для локализации генов ТК1 и UMPH2 с точностью до плеча была использована гибридная клеточная линия свинья-китайский хомячок 8990, которая содержала в качестве компонента свиньи iso-p хромосомы 12. В выделенных нами 5-БДУ- резистентных субклонах данного клона мы наблюдали отсутствие iso-12p хромосомы свиньи.

Электрофорез ферментов UMPH2 показал, что изоформы свиньи и хомячка имеют разную электрофоретическую подвижность. Анализ фореграмм выявил, что изоферменты ТК1 и UMPH2 свиньи в 5-БДУ резистентных субклонах, клона 8990 не экспресснруются.

Таким образом, изоферменты ТК1 и UMPH2 сегрегировали конкордант-но с iso-12p хромосомой свиньи. Это позволило нам сделать вывод о синтении этих генов и о локализации ТК1 и UMPH2 в коротком плече хромосомы 12 свиньи.

ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРИДНЫХ ЛИНИЙ С ОДНОЙ ХРОМОСОМОЙ СВИНЬИ.

Для получения монохромосомных линий свиньи были отобраны клоны SV27, SV29, SV35 и SV38 с небольшим количеством хромосом свиньи по данным гибридизации in situ с Н3 -меченой суммарной ДНК свиньи. Клон SV35 содержал только одну меченую хромосому на фоне немеченных хромосом норки, а клоны SV27, SV29 и SV38 содержали по две полностью меченые хромосомы свиньи.

Дифференциальной ОТО- окраской определили (Табл.2) наличие хромосом 2 и 12 свиньи в клоне 8У27, хромосом 5 и 12 в клоне 8У38. Клон 8У29 содержал две хромосомы свиньи: интактную 12-ую и маркерную (перестроенную) хромосому. В 5У35 определили наличие одной интактной хромосомы 12 свиньи.

Табл. 2. Результаты анализа гибридных клонов с небольшим числом хромосом свиньи с помощью СТС-окрашивання (* - двойной набор хромосом).

Клоны н Число Модальное Число метафаз с хромосомами сви- Двойные

проанал. число НЫ1

субклоны метафаз хромосом 2 5 12 t(l;13) фрагменты

SV27 21 30 20 - 18 -

SV27-B1 34 29 34 - - - -

SV29 39 30 - - 37 37 -

SV29-B1 37 29; 58« - - - 35 -

SV35 27 29 - - 23 - -

SV38 28 30; 60* - 28 26 - -

SV38-B3 20 58 - 20 - 1

SV38-B4 26 29 - 24 - - -

Транслокацию в клоне SV29 идентифицировали с помощью дифференциального окрашивания и уточнили методом FISH reverse painting как t( 1; 13)( 1 Зсеп-13q4.9:: lp 1.1 -pter).

Путем селекции гибридных клеток на среде с 5-БДУ из дисомных клонов были получены моносомные линии, в которых отсутствует хромосома 12 свиньи. Таким способом получены пять моносомных гибридных клеточных линий свинья-норка, содержащих 2, 5, 8, 12, и t(l,13) хромосомы свиньи. Все моносомные гибридные линии были дополнительно проанализированы с помощью FISH reverse painting. Результаты гибридизации во всех исследованных субклонах совпали с результатами GTG-дифференциального окрашивания хромосом и гибридизации in situ с 3Н -меченой суммарной ДНК свиньи. В полученных моносомных линиях специфическое мечение выявило только хромосому 2 свиньи-в субклоне SV27-B1, t(l,13)- в субклоне SV29-B1, хромосому 5 свиньи - в субклонах SV38-B3 и SV38-B4, хромосому 12 - в клоне SV35.

Для дальнейшей характеристики клеточных линий с одной хромосомой свиньи, а также для косвенного подтверждения их хромосомного состава, нами был проведен электрофоретический анализ нескольких биохимических маркеров.

Ген фермента LDHA свиньи относился к группе генов с несовпадающей-локализацией. Электрофоретический анализ гибридного клона, содержащего единственную хромосому 2 свиньи, выявил наличие LDHA свиньи в этом клоне. Таким образом, нами была уточнена локализация гена LDHA в хромосоме 2 свиньи.

В субклонах SV38-B3 и SV38-B4, которые содержали только одну хромосому 5 свиньи, не было выявлено экспрессии гена LDHB, который был предварительно картирован на эту хромосому. Поэтому были использованы специфические ПЦР-праймеры, полученные с к-ДНК LDHB последовательностей Xenopus (шпорцевой лягушки), свиньи и крысы (Tsuji et. а!. 1994). Методом амплификации с праймерами получили специфический продукт ДНК свиньи в 175 п.н. в клоне SV38-B4, тем самым подтвердив наличие гена LDHB.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ С ОДНОЙ ХРОМОСОМОЙ СВИНЬИ ДЛЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНОВ.

В данной работе для локализации на хромосомы свиньи из списка якорных локусов были выбраны следующие: ген репарации RAD52, нейрофиброма-тоза типа 1 (NF1), эктопического 2А сайта интеграции онковируса (EVI2A), фактора молочной железы (MGF) и минералокортикоидного рецептора (альдостеронового рецептора) (MLR).

Для локализации данных генов был использован набор клеточных гибридных линий свинья-норка. Монохромосомные гибридные клоны содержали: хромосому 2 свиньи - SV27-B1, хромосому 5 - SV38-B4, хромосому 8 - SV11-B4 и хромосому 12 свиньи - SV35. Гибридный клон SV4I содержал девять хромосом свиньи: 3, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 16 и 18. Гибридный клон SV23, содержал весь набор хромосом свиньи.

Для локализации гена репарации RAD52 у свиньи был использован вектор pGBT9, несущий фрагмент кДНК RAD52 мыши размером 827 п.н. (0,8 т.п.н.).

Саузерн-блот анализ EcoRl гидролизатов геномной ДНК, выделенной из клеток фибробластов свиньи и норки, выявил фрагменты размером 11 т.п.н., 4,7 т.п.п., 0,5 т.п.н. у свиньи, а у норки - 11 т.п.н. и 4,7 т.п.н. при гибридизации с фрагментом к-ДНК RAD52 мыши (Рис.5). Гибридные клоны, в которых при

гибридизации выявились фрагменты ДНК размером 0,5 т.п.н., считались положительными по гену ЯАЭ52 свиньи - это клоны 8У23, 5У38-В4 и ЙУ41. Все эти клоны содержали хромосому 5 свиньи, причем гибридный клон 8У38-В4 являлся моносомным по этой хромосоме. На основании полученных данных можно сделать вывод о локализации гена ЯАВ52 в хромосоме 5 свиньи.

Для локализации генов №1,

1 2 3 4 5 6 7

wi*-?«

■ ща? « ma

EVI2A, MGF и MLR на хромосомах

свиньи были использованы специ-

. фические праймеры, позволяющие

j.". 4.7Kb

^vPlxJ идентифицировать сами гены у ши-

рокого спектра видов (Lyons et al., 1997).

Амплификацию с праймерами к гену NF1 соответствующей последовательности с использованием в качестве матрицы геномной ДНК, выделенной из культуры фиброблас-тов свиньи и норки, а также из гиб-

Рис.5. Саузерн-блот гибридизация EcoRl- РИДНЫХ клонов «инья-норка, прово-гидролизатов ДНК с фрагментом гена к- дили в условиях, когда амплифици-ДНК RAD52 мыши. Отрицательные

клоны: SV27-B1 (1), SV11-В4 (2), положи- ровались только последовательности тельные: SV38-B4 (3), SV41 и SV23 (4,5), днк свиньи (Рис б} Электрофорез в фибробласты свиньи, норки (6,7).

1,5% агарозном геле ПЦР продуктов выявил три положительных клона: монохромосомный клон SV35, содержащий хромосому 12 свиньи, гибридный клон SV23, содержащий все хромосомы свиньи, и SV41, содержащий хромосомы 3, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 16 и 18 свиньи. Размер ПЦР продукта ДНК свиньи составил 390 п.н., из них было отсеквенировано 370 п.н. Сравнение нуклеотидной последовательности ПЦР продукта свиньи с данными GenEMBL банка выявило 84,9% гомологии с фрагментом гена NF1 человека. Это доказывает, что ПЦР продукт с использованием специфических праймеров является частью гена NF1 свиньи. Таким образом, мы можем считать, что геи NF1 локализован в хромосоме 12 свиньи.

Аналогичным образом с использованием специфических прайме-ров были определены локализации генов: EVI2A свиньи в хромосоме 12, MGF - в хромосоме 5 свиньи и MLR -в хромосоме 8 свиньи. СРАВНЕНИЕ ГОМОЛОГИЧНЫХ СЦЕПЛЕНИЙ В ГЕНОМАХ СВИНЬИ И ДРУГИХ ВИДОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ. Сопоставляя данные о локализации 9 генов свиньи, картированных в настоящей работе, с таковыми у других видов можно заключить, что почти все они входят в состав высокоСогласно данным гетеродошчного пейнтинга хромосома 12 свиньи гомологична хромосоме 17 человека. В настоящей работе мы картировали 4 гена на эту хромосому, все они (ТК1, UMPH2, NF1 и EVI2A) были ранее локализованы в q плече хромосомы 17 человека. Нами было показано, что гены ТК1 и UMPH2 у свиньи располагаются вр плече хромосомы 12.

Гены LDHB, RAD52, MGF и РЕРВ, локализованные в хромосоме 5 свиньи, входят в другой большой консервативный блок (у свиньи пока локализовано 7 генов), сохраняющий полную гомологию с хромосомой 12 человека.

Гены РЕРВ, LDHB и RAD52, синтенные у свиньи и человека, также сцеплены у норки (Mouse Genome Inf.;. Связь локусов PEPB-LDHB установлена для кошки и овцы, а у мыши, крысы, коровы и кролика она нарушена.

Ген MLR, картированный нами на хромосому 8 свиньи, входит также в крупный зволюционно консервативный блок генов, сохраняющих синтению у ряда видов. Вес пять генов (ALB, KIT, PDGFRA, SPP1 и MLR), локализованных в хромосоме 8 свиньи, гомологичны генам хромосомы 4 человека.

Суммируя полученные данные по сравнительному картированию видов,

Г

390 I

bp

-> • . О ÖCS

1234 56739

Рис.6. Электрофорез ПЦР продуктов, полученных с помощью специфических прай-меров к гену КП. Маркер молекулярного веса (1), фибробласты свиньи, норки (2, 3), положительные клоны: 5У23, Б\'41 (4, 5) и 5У35 (9), отрицательные клони- 5У27-В1 (6), 5У38-В4 (7), БУ11-В4 (8).

консервативных районов хромосом.

можно отметить поразительный факт сохранения гомологии генного состава хромосом, не претерпевших изменений со времени дивергенции видов, относящихся к разным отрядам млекопитающих.

ВЫВОДЫ

1. Получен нетрадиционный тип гибридов соматических клеток свинья-американская норка, характеризующийся стабильным хромосомным составом и отсутствием фрагментации хромосом свиньи. Хромосомный состав более 130 клонов и субклонов проанализирован с помощью: гибридизации ш situ с 3Н- и биотин меченой тотальной ДНК свиньи, более 30 клонов и субклонов свинья-норка с помощью GTG-дифференциальной окраски хромосом.

2. Впервые с использованием набора клонов свинья-норка и свинья-китайский хомячок определена хромосомная локализация генов ТК1 и UMPH2 на 12р свиньи.

3. Получены и цитогенетически охарактеризованы 5 уникальных монохромосомных гибридных клеточных линий, содержащих хромосомы 2, 5, 8, 12 и t(l;13) свиньи на фоне хромосом норки.

4. С помощью монохромосомных гибридных клеточных линий свиньи уточнены данные о локализации 2-х генов свиньи: гена LDHA - на хромосоме 2 и гена LDHB - на хромосоме 5 свиньи.

5. С помощью набора клонов свинья-норка, включающего монохромосомные линии свиньи, определена локализация генов (маркеров типа I): RAD52 и MGF - на хромосоме 5 свиньи, MLR - на хромосоме 8, NF1 и EVI2A - на хромосоме 12 свиньи.

6. Сравнительный анализ синтенных групп генов хромосом 2, 5, 8 и 12 свиньи с хромосомами человека подтвердил сохранение консерватизма генного состава протяженных районов гомологии между этими видами. Кроме того показано сохранение синтении ряда генов свиньи и некоторых видов млекопитающих.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Astakhova N.M., Zhdanova N.S., Serov O.L. Preliminary data on gene mapping in the pig by use of pig-mink cell hybrids. 10 symposium Genetische Grundlagen und ihre Umsetzung in der Tierzucht. Leipzig. 1992. P.l-3.

2. Астахова Н.М., Н.С. Жданова, Е.М. Кафтаиовская, С.Б. Кузнецов, О.Л. Серов. Предварительная локализация генов ТК1 и UMPH2 на хромосому 12 свиньи. // Генетика. 1994. Т. 30. С. 832-838.

3. Zhdanova N.S., N.M.Astakhova, S.B.Kuznetsov, L.Schuler, O.L.Serov. Characterization of pig-mink cell hybrids: assignement of the TK1 and UMPH2 genes to pig chromosome 12 // Mammalian Genome. 1994.V. 5.P. 781-784.

4. Zhdanova N. S., P.D.Thomsen, N.M. Astakhova, S.B. Kuznetsov, E.V.Plyusnina, O.L.Serov. Production of pig-mink cell hybrids with single pig chromosomes 2, 5, 12 or t( 1.13) // Mammalian Genome. 1996. V.7. P. 613-615.

5. Zhdanova, N.S., P.D.Tonsen, E.V.Plyusnina, N.M.Astakhova, S.B.Kuznetsov, C.B.Yorgensen, and O.L.Serov. Partial collection of pig-mink cell hybrids with single pig chromosomes. 12 European Coiloquum on Cytogenetics of Domestic Animals. Archivos de zootecnia, 1996. V. 45. P. 367-370.

6. Рубцов H.B., Плюснина E.B., Графодатский A.C., Сердюкова Н.В., Астахова Н.М., Кузнецоз С.Б., Жданова Н.С. Новые возможности анализа сложных хромосомных перестроек в клеточных гибридах. Генетика. 1998. Т34.С.46-53.

7. Кузнецов С.Б., Ларкин Д.М., Кафтановская Е.М., Иванова Е .В., Астахова Н.М., Черяукене О.В., Жданова Н.С. Хромосомная локализация и анализ син-тении некоторых генов у свиньи, корозы и овцы (отряд Artiodactyla). Генетика (принято в печать).