Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сцепление, хромосомная и субхромосомная локализация генов у американской норки

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сцепление, хромосомная и субхромосомная локализация генов у американской норки"

* Ы ^ ■ '

ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени А.А.ЖДАНОВА

На правах рукописи УДК 575.12:595.771

СЕРОВ Олег Леонидович

СЦЕГШЕНИЕ, ХРОМОСОМНАЯ И СУБХРОМОСОМНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНОВ У АМЕРИКАНСКОЙ НОШИ

Генетика - 03.00.15

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ленинград - 1989

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

член-корреспондент АМН СССР, доктор биологических наук, профессор В.И.Иванов

Институт медицинской генетики АМН СССР, г.Москва

доктор биологических наук,профессор И.А.Захаров

Институт общей генетики АН СССР, г. Москва

доктор биологических наук,профессор В.А.Гвоздев

Институт молекулярной генетики АН СССР, г. Москва

Институт цитологии АН СССР, г.Ленинград .

Защита состоится " 2 " мЛуУ >7? 1989

г. в

1С

час.

на заседании Специализированного совета Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности "Генетика" при Ленинградском Государственном университете им. А.А.Жданова (Ленинград, Университетская набережная, 7/9, аудитория -1 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ленин -градского Государственного университета.

Автореферат разослан " " 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Н.М.Иркаева

.Jit».'

t'-î. ï. '•'. .'tss'.s | ВВЕДЕНИЕ

i T-'V? " \

"с-^т'-"-.1:дКТ7адЪН0СТЬ проблем». Определение сцепления, хромосомной и субхромосомной локализации генов или по образному спряжению UcKusick исследование "анатомии генома" (îîcKuai ok, 1980) относится к числу фундаментальных проблем генетики н биологии в целом. Это неудивительно, поскольку нет сомненгЗ, что современный прогресс в разнообразных разделах теоретической и прикладной генетики прокариот и некоторых эукарпот во многом связан с созданием подробных генетических и патогенетических карт.

Долгое время, вплоть до начала 70-х годов, картирование генов у млекопитающих было ограничено исследованиями практически одного лабораторного объекта - мыши. Безусловно это связано с трудностями проведения генетических экспериментов у большинства млекопитащих и человека (малоплодие, длительный генеративный период и т.д.) и со слабым развитием частной генетики.

Однако, за последние два десятилетия произошел каче -ственннй скачок в развитии техники картирования генов у человека. Усилиями генетиков и цитологов были разработаны принципиально новые подходы, в основе которых лежат методы генетики соматических клеток, генетической трансформации и молекулярной гибридизации ДНК-ДНК in situ на метафазных хромосомах. Использование этих приемов позволило за последние 15 лет установить хромосомную локализацию дал более 1500 генов и около 2000 анонимных последовательностей ДНК у человека (Frezal, 1987; O'Brien, 1987).

Впечатляющий прогресс в области картирования генов у человека несравненно в меньшей степени коснулся других видов млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных живогных.Лишь в последние 5 лет стали появляться, достаточно регулярно,данные по сцеплению, синтенш, и реке по хромосомной локализа -ции генов у крупного рогатого скота, свиньи и некоторых других с/х ЖИВОТНЫХ (Lalley and McKuaiok, 1985;Lalley et al., 1987).

Следует отметить, что к началу выполнения данной работы (1979-1980 гг), сведения по сцеплению или хромосомной лока -

лизации генов у с/х животных исчерпывались буквально единичными работами (Pearson and Roderick, 1978).

Между тем, не вызывает сомнений необходимость развития частной генетики с/х животных для решения насущных задач практической селекции и животноводства. Более того, зарождающаяся на наших глазах биотехнология будущего животноводства, включающая всевозможные манипуляции с эмбрионами, генетическую трансформацию и даже, в более далеком.будущем, направ -ленное конструирование генотипов, нуждается в детальных ге -нетических картах с/х животных.

Изложенные выше соображения определили выбор направле -ния настоящего исследования, а именно - картирование генов у американской норки, основного объекта пушного промышленного звероводства. Не последнюю роль при выборе объекта исследования сыграло то обстоятельство, что кариотип норки отно -сительно прост ( 2N = 30). Он доступен дая тонкого цитогене-тического анализа современными методами дифференциальной окраски, что позволяет надежно идентифицировать не только индивидуальные хромосомы, но и их фрагменты.

Второй аспект данной работы лежит в области сравнительного картирования генов млекопитающих. Это новая область генетики призвана дать объективную картину эволюции групп сцеплений млекопитающих. Вероятно, одна из самых интригующих проблем в эволюции групп сцеплений может быть внражена в форме дилеммы: "Участвует или не участвует естественный отбор в формировании и поддержании групп сцеплений?".

Филогенетическая обособленность норки от хорошо изученных видов, таких как человек и мышь, позволяла надеяться,что в случае получения достаточно обширной информации о хромо -сомной, субхромосомйой локализации и сцеплении генов у этого вида, увеличится разрешение сравнительного анализа и пополнит наши знания об эволюции груш сцепления у млекопитающих.

Цель и задачи. Целью данной работы являлось определе -ние сцепления, хромосомной и субхромосомной локализации 4-5 десятков генов, кодирующих биохимические признаки у амери -канской норки (Mustela vison).

Конкретными задачами данного исследования были:

I) установить синтенные связи и определить хромосомную

локализацию генов, кодирующих биохимические признаки, с помощью анализа панели гибридных клонов норка-китайский хомячок, норка-мышь и серии клеточных клонов мыши, трансформированных метафазнкми хромосомами норки;

2) определить субхромосомнуга локализацию генов посредством анализа независимых клонов и субклонов гибридных клеток норка-китайский хомячок и норка-мышь, несущие перестройки хромосомы 2 норки;

3) определить субхромосомнуга локализацию генов в хромосоме 8 с помощью метода переноса генов, в котором в качестве вектора используются метафазные хромосомы;

4) оценить характер сцепления генов, основываясь на количественной оценке частоты сопереноса тесно сцепленных генов в опытах по трансформации клеток мыши с помощью интер -фазных ядер клеток норки, заключенных в лишщше оболочки;

5) выявить новые полиморфные системы по биохимическим маркерам в популяции норок и установить генетическую детерминацию этой изменчивости;

6) изучить сцепление полиморфных генов, кодирующих биохимические признаки или регулирующих экспрессию генов. Используя комбинацию методов гибридологического анализа и генетики соматических клеток определить хромосомную локализацию сцепленных генов.

Научная новизна. I) Установлена хромосомная локализа -ция 45 генов в 13 из 14 аутосом и Х-хромосоме американской норки, вида у которого до выполнения этой работы не было информации о хромосомной локализации ни для одного гена; 2) установлена субхромосомная локализация 12 генов во 2-й и 8-41 хромосомах, что поставило норку в ряд 5-ти видов млекопитающих, имеющих цитогенетическую карту; 3) впервые описаны 5 полиморфных систем, что существенно способствует развитию биохимической генетики этого объекта пушного зверо -водства; 4) установлено сцепление, по крайней мере, 4-х генов и определен порядок еще 3-х генов; 5) описано действие цис-контролирующего элемента на экспрессию двух эстераз в сердечной мышце; 6) развито представление об участии естественного отбора в поддержании некоторых консервативных ассоциаций сцепленных генов в процессе эволюции.

Научно-практическое значение. В результате выполненной работы норка заняла лидирующее положение среда с/х животных по степени развития частной биохимической генетики,что должно найти практическое применение в норководстве.

Создание достаточно подробной генетической карты норки внесло заметный вклад в область сравнительного картирования генов у млекопитающих.

В работе использованы методы переноса генов с помощью иетафазных хромосом (дай определения субхромосомной локализации) и интерфазных ядер, заключенных в липидкую оболочку (для оценки физической близости сцепленных генов), что позволяет их рекомендовать в качестве новых способов картирования генов у человека и других животных.

Описанная в работе система эстераз сердечной мышцы, находящейся под контролем цис-контролирущего элемента, может стать перспективной моделью в исследованиях генной регуляции.

АП^АалЧ* работы. Материалы работы докладывались на 1-й, 2-м и 3-м Всесоюзных совещаниях по генетике соматичес -кэх клеток (Звенигород, 1981; 1983; 1986); 1-м Всесоюзном совещании по цитогенетике с/х животных (Звенигород, 1985); Объединенном конгрессе Европейских обществ по культуре тка -вей и ретикуло-эцдотелиальной системе (Будапешт, 1983);14-м Цвздународном генетическом конгрессе по генетике (Нью-Дели, 1983); 5-м Международном конгрессе по изоферментам (о.Кос, 1986); 7-м Европейском коллоквиуме по цитогенетике с/х жи-еотных (Варшава, 1986).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных данных, обсуждения, выводов и списка литературы, изложенных на 264 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 51 рисунком. Список цитируемой литературы включает 340 работ отечественных и зарубежных авторов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 статей.

МАТЕИШ1 И МЕТОДЫ

Определение сцепления, хромосомной и субхромосомной локализации генов у норки проводили с использованием комплекса штодов клеточной биологии и генетики, включавших: гибрида -

зацию соматических клеток норки с клетками китайского хомячка и мыши; перенос генов с помощью метгфазных хромосом; пареное генов с помощью метафазных хромосом; перенос генов с помощью изолированных штерфазных ядер, заключенных в липцд-ные оболочки (лзшосомы); гибридологический анализ сцеплензя генов.

Популяционный анализ около 30 ферментов проводился у животных, разводимых на ферме в Экспериментальном хозяйства СО АН СССР. На базе Экспериментального хозяйства проводи -лись также все генетические эксперименты по сцеплению полиморфных генов.

Определение хромосомной локализации генов проводили,используя: I) панель из 25 гибридных клонов норка-китайский хомячок, полученной Н.Б.Рубцовым в группе цитогенетики животных, руководимой к.б.н. С.И.Радаабли (Rubtsov et al., I98E); 2) набор из 33 гибридных клонов порка-гепатома мыши, полученный к.б.н. Н.С.Ждановой в лаборатории генетических основ онтогенеза (Жданова и др., 1985); 3) серию из 8-ми клеточных клонов мыши, трансфореяированных метафазнкми хро -мосомами норки, выделенных М.А.Сукоян в лаборатории генетических основ онтогенеза (Сукоян и др., 1984).

Определение субхромо'сомной локализации генов в хромосоме 2 осуществляли с помощью 33 гибридных клонов норка-гепа-тома мши (см.выше) и 105 субклонов гибридного клона C0II3 норка-китайский хомячок, выделенных Н.Б.Рубцовым, несущие перестройки хромосомы 2 норм (Жданова и др., 1985).

Определение субхромосомной локализации генов в хромосоме 8 проводили с использованием 8 независимых клонов мыши, трансфорлированннх метафазными хромосомами норки (см.выше). Цитогенетический анализ этих клонов проведен С.Д.Пак в ла -боратории генетических основ онтогенеза.

Оценки физической близости сцепленных генов проводили, используя серию из 14 независимых клонов клеток мыши, которая была получена в опытах по переносу генов норки с помощью метода, предложенного Н.Д.Беляевым и В.Г.Будкером,где в качестве вектора использовались интерфазные ядра, заключенные в липидные оболочки (липосомы) (Сукоян и др., 1985; Серов и Беляев, 1985). Цитогенетический анализ этих клонов проведен С.Д.Пак.

Электрофоретический анализ ферментов и гистохимическое выявление их активности в крахмальном и полиакриламвдном гелях проводили по методам, описанным ранее (Серов и др.,1977), с модификациями.

Глава I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХРОМОСОМНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГЕНОВ С ПОМОЩЬЮ ПАНЕЛИ ГИБРИДНЫХ КЛОНОВ НОРКА-КИТАЙСКИЙ ХОМЯЧОК

В таблице I и рис.1 суммированы данные по определению хромосомной локализации 41 гена, кодирующих биохимические признаки норки. Как можно видеть из рис.1, при локализации 10 генов наблюдалась 100% конкордантность связи маркер-хро-иасома;при локализации 17 генов значение конкордантности было в пределах 95%,при локализации 13 генов было 92%,а при локализации гена РЕРА составляло 88%. На основании полученных данных (рис.1) можно заключить, что хромосомная локализация 27 генов определена с высокой степенью достоверности (уровень конкордантности в пределах 96-100%). Кроме того следует отметить,что правильность хромосомной локализации генов: РР, ЕН01, ТК1, йльк, йОТ1 и НК1 была подтверждена независимыми экспериментами, в которых использовались либо гибридные клетки норка-мышь, либо клеточные клоны мыши, трансформированные метафазными хромосомами норки.

Таблица I

Хромосомная локализация 41 гена у американской норки

Маркер Символ гена Хромосома нотжи

I 2 3

I. Малатдегидрогеназа-1 (НАДФзависимая) (МОД) ГОШ I

2. Супероксид-дисмутаза-2(С0Д2) БОБ2 I

3. Неорганическая пирофосфата-за (ГО) ГР 2

4. Глутамат-оксалоацетат-транс-аминаза-1 (Г0Т1) СОТ1 2

5. П^эин-нуклеозидфосфорилаза ИР 2

6. Аденозинкиназа (АДК) 6 аш 2

I 2 3

7. Гексокиназа-1 (ГК1) нк 2

8. Фосфоглюкомутаза-1 (ФГМ1) pgmi 2

9. Фосфоглкжонатдегидрогеназа(ФГД) pgd 2

10. Энолаза-I (EH0I) ш01 2

11. Биливердин-редуктаза (БР) blvr 3

12. Изоцитратдегидрогеназа-I (ВДГ1) IDH1 4

13. Пептидаза А (ПЕЛА) pepa 4

14. Супероксид-дисмутаза-I (С0Д1) S0D1 5

15. Глутатион-редуктаза (ГР) gr 6

16. Лактатдегвдрогеназа-А (ЛДГА) ldha 7

17. Глюкозофосфатизомераза (ГФИ) gpi 7

18. Кислая фосфатаза-2 (КФ2) АСР2 7

19. Пируваткиназа (ПК) РК1 7

20. Эстераза-3 (ЭСЗ) es3 7

21. Тшидинкиназа-I (TKI) • ТК1 8

22. Галактокиназа (ГАПК) galk 8

23. Эстераза Д (ЭСД) esd 8

24. Альдолаза С (АЛДС) aldc 8

25. Лактатдегидрогеназа-В. (ЛДГВ) ldhb 9

26. Триозефосфатизомераза (ТФИ) tpi 9

27. Глщеральдегид-З-фосфат-де-

гидрогеназа (ГАФД) gapd 9

28. Пептидаза В (ПЕПВ) РЕРВ 9

29. Маннозофосфатизомераза (МФИ) MPI Ю

30. Изоцитратдегидрогеназа-2 (ИДГ2) xdh2 10

31. Малатдегидрогеназа-1

(НАДзависимая) (МОИ) mor1 II

32. Кислая фосфатаза-I (КФ1) аср1 II

33. Инозш1-трифосфатаза (ИТФ) itpa II

34. Аденозин-деаминаза (АДА) ada II

35. Аденилаткиназа-З (АКЗ) АКЗ 12

36. Аконитазa-I (AK0HI) АСОЫ1 12

37. Пептидаза С (ПЕПС) РЕРС 13

38. Глюкозо-6-фосфат-дегвдрогена-

за (Г6ФД) g6pd X

I 2 3

39. Фосфоглицераткшаза-1

(фш1) pgk1 x

40. Альфа-галактозвдаза (ГАИ) gala X

41. Гипоксантин-фосфорибозил-

трансфераза (ГФРТ) X

Установленная хромосомная локализация остальных 14 генов с уровнем конкордантности 88-92$ нами рассматривается как наиболее вероятная, но не окончательно определенная.Это связано с тем, что в большинстве случаев причины дискордантнос-те в гибридных клонах норка-китайский хомячок остались не-Езвестными. Тем не менее в отдельных случаях: например, дис-вордантность в клоне KI4 ЛДГА+; 1ФИ+/хромосома 7~ или в клоне L25 ПЕПС~/хромосома 13+, были выявлены причины дискор -дантности; в первом случае из-за разности чувствительности онтогенетического и биохимического методов, а во втором -повторный цитогенетический анализ прометафазных хромосом в клоне L25 позволил исключить присутствие хромосомы 13 (Serov et al., 1987).

Таким образом, часть генов перешли в категорию, для которой надежно установлена хромосомная локализация. Далее, правильность локализации гена aldc в хромосоме 8 была подтверждена анализом 8-ми трансформированных клеточных клонов мыши.

Рис.1 дает наглядное представление о "высоком качестве" использованной панели гибридных клонов норка-китайский хомячок. Из приведенных 1025 случаев установленных связей маркер-хромосома только 44 (4,3$) относятся к дискордантным, тогда как основная доля (95,7$) отражает конкордантность связей 1юзду маркером и определенной хромосомой.

Таким образом, основным результатом этого раздела работы явилось определение хромосомной локализации 41 гена на 13 из 14 аутосом и Х-хромосоме американской норки (таблица I; рис.1).

Рис.1. Суммарные данные по хромосомной локализации 41 гона,полученные при анализе панели из 25 гибридных клонов норка-китайский хомячок.Слева - обозначения клонов; верхний ряд - символы генов; нижний ряд цифр -- номера хроглосом.Темные квадраты - присутствие хромосомы и маркера; белые - отсутствие хромосом ж саркора; заштрихованные - дискордшштз клоны: • :арг.эр'|"/хрс"оссгл~(+) я !2рхар~/хрогзэсо-ма+(-).

Глава II. СУБХРОМОСОМНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ 8-МИ ГЕНОВ ХРОМО -СОМЫ 2 С ПОМОЩЬЮ ХРОМОСОМНЫХ ПЕРЕСТРОЕК

Наши данные по региональному картированию генов хромо -ее:.!! 2 норки были основаны на использовании хорошо идентифицируемых перестроек этой хромосомы в клетках культуры норки в перестроек, возникших в гибридном клоне coi 13 и его де -рзште С0113-5А.

На рис.2 показан дериват хромосомы 2 норки, обнаружен -es2 в гибридном клоне сопз норка-китайский хомячок; хро -г.осома 2 содераит большую делецкю, захватывающую почти пол -ностыо короткое плечо. Этот клон содержал активность ФГД, Ш.51 и EH0I норки, но в нем отсутствовала активность ГОЛ, ГЭ, ГК1, АДХ и НФ норочьего происхождения (рис.1). Это позволило предположить, что гены pgd, pgií1 п ш01 расположены в районе р11.1—qter, a g0t1, рр, нк1, adk и нр В pter—р11.1. ~

Клон coi 13 был подвергнут субклонированшо и среда 105 исследованных на активность ФГД норки субклонов были найдены два, в которых не определялась активность ФГД, а такие EH0I. Цитогенетический анализ этих двух клонов пока -зал, что в одном клоне отсутствует видимый материал хромо -сомы 2 норки, а в другом (С0113-5А) выявлена дацентричос-кая хромосома, состоявшая из. проксимального района длинного плеча хромосомы 2 норки,. включая центромеру, и хромосомы китайского хомячка. На рис.2 показано, что в клоке с0113-5а произошла делецпя qter—q24.4 длинного плеча. Поскольку эта делеция терминального района длинного плеча хромосомы 2 сопровождалась потерей активности ФГД и EH0I норки, то это позволило заключить,' что гены pgd и enoi локализованы в районе q24.4—qter длинного плеча 2-й хромосомы норки (рис.3).

В субклоне С0113-5А определялась активность Ф1Ш норки, что указывало на локализацию гена pgmi в районе р11.1—q24.4 хромосомы 2 норки (рис.3).

Субхромосомную локализацию генов G0T1, НК1, îîp , рр и adk на коротком плече хромосомы 2 норки мы проводили,использовав хромосомную перестройку, возникшую спонтанно в

Рис.2. Идаограмма интактной хромосомы 2 норки (I) и перестройки ее,обнаруженные в культуре т и ijvtk- клеток норки (2), гибридном клоне С0113 норка-китай -ский хомячок (3) и его субклоне С0113-5А (4).

клетках культуры м\г норки; один из гомологов хромосомы 2 несет делецию pter—р22 (рис.2), при этом делегированный фрагмент транслоцировался на хромосому 7 t(2; 7).

Используя мутантную линию клеток, дефицитную по активности ТК, линия mvtk" (дериват клеток mv ), Н.С.Жданова получила 19 первичных гибридных клона норка-мышь, проведя гибридизацию клеток юттк" норки с клетками гепатомы мыши. Среди этих первичных гибридных клонов норка-мышь, один клон содержал внешне интактную хромосому 2 норки и ее делетиро -ванный вариант - 2del.Причем в отсутствии как интактной,так и перестроенной хромосомы 7, несущей фрагмент хромосомы 2 -t (2; 7). Дополнительное субклонирование позволило выделить 15 вторичных субклонов.

В таблице 2 приведены данные по сегрегации 2del и интактной хромосомы 2 и ее маркеров ГК1, Г0Т1, ПФ, НФ и EH0I

среди 14 гибридных субклонов норка-мышь. Можно видеть, что ПС1, ГОЛ и ГО норки выявляются только в субклонах, содержа-цзх внешне интактную хромосому 2 норки, тогда как в субкло -нах, в которых присутствует 2ае1, эти маркеры норки не оп -редаляются. Такая конкордантная сегрегация терминального участка короткого плеча хромосомы 2 и ГК1, Г0Т1 и ПФ позволила прийти к выводу, что гены НК1, СОТ1 и РР расположены в районе 2pter—р22 (рис.3).

Таблица 2

Распределение интактных и перестроенных хромосом 2 и 7 норки и активности ГК1, Г0Т1, ПФ, ЕНОТ и Ш норки во вторичных субклонах норка-гепатома мыши серии 13 №И

Хромосомы норки Маркеры норки

Субклон —--

2 2del 7 t(2;7) ГК1 ГОИ ® НФ EH0I

13HV1-1 + + - + + + - +

13MV1-2 — - - - - - - -

13MV1-3 + - - + + + + +

13MV1-5 - + - - - - - - +

13MV1-6 - - - - - - + -

13MV1-7 - - - - - - + -

13MV1-8 - - - - - - + -

13MV1-9 - - - - - - - -

13MV1-11 - + - - - - - + +

13MV1-12 - + - - - - - + +

13MV1-16 - + - - - - - + +

13MV1-19 + - - + + + - +

13MV1-21 + + - - + + + + +

13MV1-111 - - - - - + +

Что касается НФ норки, по данным таблицы 2 наблюдается независимая сегрегация в гибридных' клонах серии 1 змл этого маркера относительно как хромосомы 2 и 2ае1, так и остальных маркеров этой хромосомы. Это поставило нас перед альтернативой: либо мы неправильно локализовали ген ЫР на хромосому 2 норки, либо исходный клон 13МУ1 несет микроделецшо, захватывающую ген ИР, но которую не удается выявить при

патогенетическом анализе. Второе прздполояэние было провэрэ-но посредством анализа другой сер*ш из 19 субклонов. Была обнаружена полная конкордантность в сегрегации Ш с оставь -ными маркерами короткого плеча хромосомы 2 (Г0Т1, ГК1, Ш). Совокупность полученных данных позволила заключить, что гол ИР таетз расположен в района ptaг—р22, как п гены НК1, РР и оюп.

На рис.3 сутдорованы наши данные по субхромосомной локализации 8-ми генов в хромосома 2 норкп.

Р

1.} 1.2

1.1

р!*' — р22 КХ1,ООТ1,РР,КР

Р10Г —. рП.1 Л011

X

3.1

3.2

3.3 «

)

т 2 3

4.1 «.2 О М

рил — ч:«« ром1

]

ч2М_ч1.т юо, ЕИО!

«.3

Рис.3. Субхромосомная локализация 8-ми генов в хромосоме 2 норки.

Глава III. РЕГИОНАЛЬНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНОВ ТК1, galК, ALDC и ESD В ХРОМОСОМЕ 8 С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ПЕРЕНОСОВ ГЕНОВ

Сложности С поиском спонтанных in vivo и in vitro хромосомных перестроек заставляет исследователей обращать ываание на другие возможности получения субхромосомных фраг-1ЭНТ0В той или иной интересующей их хромосомы. Одним из та -пах подходов по нашему мнении может быть экспериментальный пареное генов в соматические клетки. В настоящее время перенос генов в соматические клетки осуществляется с помощью ДНК п иэтафазных хромосом. Оба метода переноса генов обеспечивает попадание в реципиентный геном лишь ограниченного количества генетического материала либо в виде небольших фрагмен -?ов хромосом, либо фрагментов ДНК (Серов, 1985).

В серии экспериментов по переносу генов норки с по -12хцью метафазных хромосом в клетки мыши были выделены 18 независимых трансформированных клонов. В таблице 3 дана характеристика трансфор.1антов. Видно, что в 8-ми клонах обнаруживайся видимые фрагменты хромосом норки. Детальный цитогене-тгческий анализ, проведенный С.Д.Пак, показал, что это фраг-онты хромосомы 8 норки. На рис.4 показаны фрагменты хромо -сот 8 норки, обнаруженные в трансформантах.

Наибольший по размеру фрагмент найден в клоне stt-16-З; хромосома 8 норки в этом клоне содержит две терминальные де-деции: одна короткого плеча (pter—р24), а другая длинного (q24—qter ). Хромосома 8 норки в клоне stt-16-8 имеет далецию, захватывающую все длинное плечо, и небольшую, зат -рагивающув терминальную часть короткого плеча (pter—р25) (рис.4). Клон STT-13-1 содержит фрагмент pter—р12 короткого плеча хромосомы 8 норки, без центромеры, но внешне ин-тактным терминальным районом (рис.4). Следует отметить, что остальные 5 трансформантов содержали фрагмент 8-й хромосомы норки сходный с тем, который описан в трансформанте зтт-13-1, то есть часть короткого плеча без центромеры, но нормальной морфологией терминального района.

Как видно из данных таблицы 3, присутствие АДДС норки связано с наличием района pter-p25 короткого плеча. Действительно, в двух клонах stt-16-з и stt-16-8, содержащих

14

фрагменты хромосомы 8 с делениями терминального района pter-р25 и pter-p24, не определяется активность АЛДС норки.Наоборот, в клонах, в которых фрагмент хромосомы 8 имеет терминальный район короткого плеча, этот фермент норки присутствует. На основе этих данных мы пришли к выводу, что ген ALDC расположен в районе pter—р25 хромосомы 8 норки (рис.5).

Таблица 3

Характеристика клонов клеток мыши,трансформированных метафазными хромосомами норки

Транс- Маркеры норки Наличие Средняя скорость

форман- -хромосомных потери ГАТ-резис-

ты ТК1 ГАЖ АДЦС фрагментов тентности, в %

норки клеток за генера-

STT-13-1 + + + + 1,9

STT-16-1 + - - - 1,6

STT-16-2 + - - - 1,4

STT-16-3 + - - + 1,8

STT-16-4 + + + + 2,2

STT-16-5 + - - 0,3

STT-16-6 + - - - 1,0

STT-16-7 + + + + 1,9

STT-16-8 + + - + 0,6

STT-16-9 + + - - 1,2

STT-16-1 О + + + + 0,9

STT-16-11 + - - - 2,8

STT-16-12 + + + + 2,4

STT-16-13 + + + + 2,0

STT-18-1 + - - - 0,0

STT-18-2 + - - - 0,0

STT-18-3 + - - - 7,0

ЗТТ-18-4 + + - . - 0,0

Потеря активности ГАЖ норочьего типа в клоне БТТ-Чб-з, вероятно, связана с делецией, затрагивающей светлый сегмент р24 (рис.4). В остальных клонах, содержащих фрагмент 8-й

цроиосош норки, этот район имеет нормальную морфология. На основании этого было, сделано предположение, что ген вльк Находится в сегменте р24 короткого плеча хромосоьш 8 нор-СЛ (рис.5).

Рас.4. Диаграмма интактной хромосомы 8 норки и ее фрагментов, обнаруженных в трансформантах.

Вышеизложенные данные позволяют также сделать вывод о порядке генов в коротком плече 8-41 хромосомы норки: pteг-д1л5с - йаък - тк1.

Лмеются ряд доводов в пользу того, что гены тк1 и оахк более тесно сцеплены, чем тк1 и аыю. Во-первых, вак это следует из данных таблицы 3, частота сопереноса гена (за1к с тк1 в 1,5 раза выше, чем аъбс и тк1. Все иаоны, содержащие АЛДС норки, содержат такге ГАЖ норочьего яша, тогда как в трех клонах ГАЛК+ норки не определяется

3

2.3 22 2.1

рЮг-ьр25 AI.DC □ р24 <Ш »,!>'(

д24-»д|аг Е50

2

5

Рис.5. Субхромосомная локализация 4гх генов в хромосом 8.

активность АДДС. Если частота сопароаоса загноит от физического расстояния кезду синтеннига гене^а, то следует признать, что дистанция мелду ген ада ЯП я ОАХ2 1.гапьио в 1,5 раза чем та, которая медду тк1 и аыхз. Во-вторых, хотя два трансформанта зтт-16-9 п этт-18-4- но содерзат видимых фрагментов хрсгасо?ш 8 норка, в них присутствует ГАЖ норо-чьего тша,'но не АДЦС (табл.3). Надо огмзтять, что оба клона теряют ТК1 и ГАЛК одновременно при росте клеток в ПРИСУТСТВИИ брОМ-ДеЗОКСИурНДИНа (Эиксзуап вt а1., 1984). Этп результаты указывает, что гены ТК1 и оаък в клонах Э!ГТ-1б-9 я Б?т-18-4 фпзнчэски связаны, причем как в эк-страхромо сомном, так л интегрированном состояниях.

Еще более убедительные доказательства тесного сцепления генов тк1 и оаьк у норки нами были получены в другом эксперименте, в котором перенос генов норки в клетки мыши осуществлялся с помощью интерфазных ядер, заключенных в липид-ную оболочку (липосомы).

Таблица 4

Характеристика ГАТ-резистентных клонов, полученных путем инкубации клеток мыши с интерфазными ядрами клеток норки, заключенных в липосомы

Транс- форлан- ты Маркеры норки ТК1 ГАЖ АЛДС Видимые - фрагменты хромосом норки Скорость потери ТК фенотипа, в % клеток на гене -рацию

ЗТТ-19-1 + + - 0,0

БТТ-19-2 + - - -

ЗТТ-19-3 + - - - 0,9

ЭТТ-19-4 + - - 0,7

БТТ_19_6 + - - - 1,2

ЗТТ-19-7 + - - 1,2

ЗТТ-19-8 + - ' -

ЗТТ-19-9 + _ _ -

ЗТТ-19-1 о + + - - 0,0

ЗТТ-19-11 + - -

ЗТТ-19-14 + + - - 1,0

БТТ-19-15 + - - 0,0

ЗТТ-19-16 + + -

ЗТТ-1 9-17 + + - 1,2

В таблице 4 приведены некоторые данные по характеристике 14 независимых трансформантов, полученных в опытах по трансформации клеток мыши интерфазными ядрами клеток норки, заключенными в липидные оболочки. Как видно из результатов, приведенных в табл.4, в 5 клонах определяется активность не только ТК1, но ГАПК норочьего типа. Следует также отметить, что среди этих 5-ти клонов два имеют стабильный трансформированный фенотип ТК+, тогда как в двух других исследованных трансформантах активность ТК1 норки исчезала при культивировании клеток этих клонов в неселективной среде.

18

Культивирование клеток клонов stt-19-1, stt-19-ю (стабильные клопы) и зтг-19-14 (нестабильный клон) в присутствии бром-дезоксиуридина (обратная селекция на ТК~ фенотип) сопровождалось одновременной утратой активности TKI и ГАЛК норочьсго типа. Эти данные свидетельствуют, что в этих трансфорлантах гены ТК1 и galk норки физически связаны.

Как отмечалось вше, наиболее вероятным местом локализации гена galk норки является район р24 короткого плеча 8-й хромосомы норки (рис.5). Данные по сопереносу генов ТК1 и calk норки в опытах по трансформации клеток мыши как с помощью метафазных хромосом, так и интерфазными ядрами, однозначно показали тесное сцепление этих генов у норки. Следовательно, мы вправе заключить, что ген ТК1 норки также расположен в районе р24 хромосомы 8 норки (рис.5).

Ни в одном из трансформированных клонов, содержащих видимые фрагменты хромосом 8 норки, не было обнаружено активности ЭСД норочьего типа. Эти данные привели нас к выводу, что наиболее вероятным местом локализации гена ESD следует считать район q24—qter, так так он отсутствует во всех исследованных клонах (рис.5).

Таким образом, экспериментальный подход, основанный на ' использовании методов переноса генов, позволил нам устано -вить как порядок генов тк1, galk, aldc п esd, так и местоположение их в хромосоме 8 норки (рис.5).

Глава 1У. КОМПЛЕКСНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГИБРИДОЛОГИЧЕСКОГО

АНАЛИЗА И МЕТОДОВ ГЕНЕТИКИ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Скрининг е популяции норок Экспериментального хозяйства СО АН СССР позволил обнаружить полиморфизм по ряду пар -керов: ЛДГВ, ПЕПВ, ПЕПД, эстеразе-I (3CI), ЗСЗ, постальбу -мину (ПС). Три полиморфные системы (ЛДГВ, ПЕПД и ПС) были описаны ранее Saison (1971; 1973) и Juneja И др.(1982), тогда как остальные обнаружены впервые.

Среди исследованных норок встречаются два злектрофорэ-тическьх варианта ПЕПВ: быстромигрирукзщий рр и медленно -(■титрирующий S3. Генетический анализ показал, что два алле-ля локуса РЕРВ определяют наблюдаемый полиморфизм по ПЕПВ; аллель РЕРВа контролирующий вариант w ПЕПВ, а рервь -вариант ss (табл.5).

Таблица 5

Результаты скрещивания норок, имеющих различные вардаЕтн ПЕПВ

С'снотш Число Варианты ПЕПВ у потомков

родителей ск^зщива- потомков РР РЭ БЗ

РЗ I РР 2 7 3 4 -

РБ х РЗ 2 7 I 3 3

РР х БЭ I 4 - 4 -

РЗ х БЗ 3 15 - 7 8

БЭ х ББ 15 41 - - 41

Как мо&но видеть со дпднкх табл.6, два алектрофоретичес-ких варианта ПЕПД (быстромигрсруиций рр и мэдяенноыигрн -рущий гз ) находятся под контролем пар! аллелеЁ локуса,обозначенного РЕРИ; аллель РЕРБа определяет вариант рр ПЕПД, а РЕРВЬ - вариант бб.

Таблица 6

Результаты скрещивания норок, имеющих различные варианты ПЕЦД

Фенотип родителей Ч И С л 0 Варианты ПЕЦД у потомков

скрещивании потомков РР РБ ББ

РР X РБ 2 7 2 5 _

РБ х РБ 3 17 3 10 4

РБ х ББ 6 38 - 18 20

РР X ББ 2 14 - 14 —

ББ х ББ 8 34 - — 34

При электрофоретическом анализе эстераз в различных органах и тканях норок была отмечена значительная их гетеро -генность и ткане-специфичность. Наше внимание привлекли три мажорные фракции эстераз, обозначенные ЭС1, ЭС2.и ЭСЗ, которые обладали свойствами карбоксклэстеразы (подробнее о типи-ровании эстераз изложено Серов, 1977). Тканевое распределен

ние этих эстераз было следущее: активность ЭС1 обнаруживается в печени, почках, головном мозге, селезенке, семенниках, легком, скелетной и сердечной мышцах, но не определяется в эритроцитах и плазме крови: активность ЭС2 найдена в сердечной мышце, скелетной мускулатуре и семенниках, в остальных исследованных органах и тканях ЭС2 не обнаруживается. Следует также отметить, что активность ЭС2 вдвое выше, чем ЭС1 в сердечной мышце, тогда как в тестис и скелетных мышцах она ниже или равна ЭС1; активность ЭСЗ обнаружена в печени, почках, сердечной и скелетной мышцах, легком, селезенке и плазме крови, тогда как в головном мозге, почке и эритроцитах она отсутствует.

При исследовании популяции норок было обнаружено два электрофоретических варианта ЭС1: быстромигрнругщий г? и медленномигрирукщий ss. Как видно из результатов генетического анализа (табл.7), наблюдаемые варианты ЭС1 находятся под контролем пары аллелей локуса ES1; вариант ff контролируется аллелем ESla, а вариант ss - аллелем ESlb.

Таблица 7

Результаты скрещивания норок с различными электро-форетическими вариантами эстеразы - I

Фенотип родителей Ч И С Л о ■ Варианты эстеразы-1 у потомков

скрещивании потомков -FF PS SS

FF х FF 12 54 54 - —

F3 х FF 21 90 49 41 -

FS х FS 12 52 10 27 15

S3 х FF П SI - 61 -

SS х FS 16 69 - 32 37

3S х SS 3 II - - II

Полиморфизм по ЭСЗ характеризовался наличием .трех фено-типических классов в популяции норок. При визуальной оценке можно было выделить три варианта ЭСЗ: с нормальной активностью, вариант +/+, с промежуточной, вариант -¡-/0 и нулевой активностью, вариант 0/0.

Присутствие таких трех дискретных фенотипичэских классов среди исследований популяции норок послужило поводом дал предположения о генетической детерминации наблюдаемой изменчивости в активности ЭСЗ. В связи с этим, был проведен генетический анализ наследования вариантов ЭСЗ, различающихся по уровню активности. В таблице 8 суммированы результаты анализа ЭСЗ у потомков от скрещивания животных с различными вариантами ЭСЗ.

Из этих данных следует, что пара аллелей аутосомного ло-куса ЕЭЗ контролируют уровент активности ЗСЗ; аллель Е33+ -нормальный уровень активности, а аллель ебз0 определяет вариант ЭСЗ с нулевой активностью; животные генотипа Е33+/ еэз° имеют промежуточный уровень активности этой, эстеразы.

Таблица 8

Результаты семейного анализа по наследованию вариантов эстеразы-3 у норок

Фенотип Число Варианты эстеразы-3

тютгга- У потомков

лей скрещиваний потомков +/+ +/о о/о

+/+ х +/+ 9 38 38 - -

+/+ х оД 13 54 28 26 -

+/о X +/0 10 39 II 19 9

+/о х о/о 7 32 - 15 17

о/о х о/о' 3 21 - - 21

Сложная ситуация сложилась с полиморфизмом по ЭС2. При первичном популяционном анализе (свыше 50 животных) была отмечена совместная изменчивость в электрофоретической подвижности ЭС1 и ЭС2.

Перед нами встал вопрос: "Какова природа ЭС2?".На этот вопрос возможны два альтернативных ответа. Первый - ЭС2 является вторичным изоферментом, благодаря химической или фи -зической модификации ЭС1, и следовательно, она является продуктом гена ES1. Такое предположение, в частности, объяс -няет наблюдаемую совместную изменчивость электрофоретической подвижности 3CI и ЭС2.

Еторсй - 2С2 является отдельны?.! самостоятельным белком, хотя и очень близка по своим свойствам с ЭС1, но которая контролируется независимым генсм, предварительно названным ES2.

Для того, чтобы внести ясность в этот ватенй вопрос,было предпринято дополнительное популяционное исследование 3CI и ЭС2 в сердечной мышце у 400 порок, с целью поиска рэкомби-нантов, присутствие которых явилось бы прямым доказательст -вон существования двух независимых тесно сцепленных гонов е51 ц es2. Однако в ходе этого анализа га не обяаругзла ожидаемых рекомбинантных фенотипов.

Между тем, в процессе популяционного скрининга ЭС1 и ЕС2 в сердечных мшщах наше внимание привлекли необычные гетерозиготные фенотипы по гену es1 (и предположительно по es2 ). Обычный гетерозиготный фенотип при кодоминантном типе .экспрессии аллелей и мономерной структуре фермента характеризуется равным количественным проявлением аллельных вариантов. Действительно, у большинства гетерозигот по esi (es2) (у 94 из 117 исследованных) наблюдались ожидаемые количест -венные соотношения активностей аллельных вариантов f? и ss 3CI и ЭС2 близкие к I : I.

Однако среди гетерозиготных животных по es1(es2) мы обнаружили, так называемые "асимметричные гетерозиготные фенотипы", которые характеризовались тем, что один из аллель -ных вариантов имел существенно более низкую активность по сравнению с другим. Следует также особо подчеркнуть,что снижение активности касалось в большей степени ЭС2, чэм ЭС1. Важно также отметить, что описанная вышо асимметрия возникает благодаря снижению активности одного из вариантов, тогда как другой аллельный вариант сохраняет уровень активности, характерный для обычных гетерозигот по eskes2).

Для объяснения этого необычного проявления аллелей es1 (es2) у некоторых гетерозиготных животных, нами была предложена генетическая гипотеза о цис-действующем элементе, который подавляет экспрессию сцепленного с ним аллеля. Согласно этой гипотезе, цис-действущий элемент, обозначенный esrl, осуществляет свое репрессирующее действие на хромосомном уровне подавляя транскрипцию сцепленного с ним аллеля гена es1 и гипотетического гена es2, а его гомолог esrn поддерживает нормальный уровень активности генов jes1 и е32.

Проведенный генетический анализ подтвердил эту гипотезу. Наиболее отчетливо это было видно в скрещиваниях гетерозигот по генам es1, (es2) и ese с гомозиготами либо esiq (es2a) ese15, либо е31ъ (es2b) esrl. Во всех случаях наблюдалось сцепленное наследование репрессирующего аллеля локуса esr с тем аллелем(ями) гена(ов) es1 (es2), который репрессируется им у одного из родителей. Ограниченный генетический анализ не позволил нам зафиксировать рекомбинацию между цис-действупцим элементом ese и генами es1 или предполагав -мым es2. Однако он достаточно убедительно показал цис-избп-рательное подавление экспрессии одного из аллелей гена es1 и предполагаемого гена es2.

Вся совокупность данных в области биохимической генетики по цис-контролирухсдш факторам у эукариот (Paigen, 1979; SoandalioB and Baum, 19S2 ) свидетельствует, что репрессия eme осуществляется на транскрипционном уровне. Следовательно, для объяснения эффекта ESR на XI и ЗС2 мы вправе предполагать, что они контролируются двумя независимыми тесно сцеп -ленными генами, причем локус E3R расположен ближе к гену ES2, чем ES1, и потому его репрессирующее действие прей -мущесгвенно распространяется на ген ES2 и в меньшей степени на ген ES1. Это согласуется с литературными данными-о "короткой дистанции" действия цис-контролируицих элементов на структурные гены. Как правило, в прямых генетических экспериментах не удается зарегистрировать рекомбинационные события между цис-действующими элементами и генами-мишенями, на которые они оказывают свое репрессирующее воздействие (Paigen, 1979; Scandalios and Baum, 1982).

Как описано выше, ген es3 был нами локализован в хромосоме 7 норки (рис.1; таблица I). Однако с помощью гибридов соматических клеток нам не удалось определить хромосомную локализацию генов es1, es2 и esr, так как они не экспресси-руются в культивируемых клетках.

в связи с этим мы провели генетические эксперименты на сцепление генов es1 и езз. в анализирующем скрещивании гетерозигот Е31 i Es?— с двойными гомозиготами Е51ь'

es1 es3+ es1 • es3

было получено 48 потомков, среди которых было 41 нерекомби -

нант и 7 рекомбинантов. Эти результаты показали, что гены es1 и es3 сцеплены и находятся на расстоянии 14 сМ. Пос -кольку ген es3 расположен в хромосоме 7 норки, то и сцепленные гены es1, es2 и esr также локализуются в этой хромосоме.

Генетический тест на сцепление (анализирущее скрещивание животных генотипа ES1 'РЕР— с особями ES1 « )

es1а; pepda es1a; pepda

показал, что гены es1 и pepd сцеплены и находятся на расстоянии 19 сМ (среди 80 потомков найдено 15 рекомбинантов}. Поскольку ген es1 посредством сцепления с геном езз был локализован в хромосоме 7, то мы заключили, что ген PEPD также находится в этой хромосоме норки.

Таким образом, используя комбинацию методов клеточной биологии и генетики, удалось установить сцепление генов: es1, (es2), es3, esr и pepd и локализовать эту группу сцепления в хромосоме 7 норки.

Глава У. КОНСЕРВАТИЗМ СИНТЕННЫХ ГРУПП ГЕНОВ J МИЕКОШи

ТАЩИХ ~

Сопоставление генетических карт норки и других млеко -питающих выявило II групп сцепленных гомологичных генов, общих у норки и 8 видов животных и человека (без рассмотрения приматов, которые во многом близки к человеку) (табл.9)(Lai-ley et al., 1987).

Отмечая сходство или консерватизм синтенных-групп небольшого числа гомологичных генов при сравнении далеких видов млекопитающих, следует иметь ввиду, что при этом предполагается, что эти гены лишь маркируют (без точных границ) более крупные районы, содержащие многие десятки или сотни генов. В качестве примера можно рассмотреть синтенную группу pgd—enoi —pgm1. По данным генетического анализа эта группа генов маркирует участок генома человека, равный 53 сМ, а у мыши 25 сМ.

Согласно цитогенетическим данным, район, маркированный этими генами, имеет сходный рисунок при g-дифференциаль-ной окраске у человека (короткое плечо хромосомы I), у кошки (короткое плечо хромосомы I), у норки (длинное плечо

25

Таблица 9

Общие синтенные группы генов норки и других видов млекопитающих, включая человека

без приматов (Ьа11еу е1; а1., 1987)

Синтенная группа генов

Вид, хромосомная локализация или синтенная группа

нор- чело-ка век

крыса мышь

Ж"" "»ка

хомячок

кролик

собака

корова

!\Э о>

МОБ1-30С2 1 бЧ 17,9 В2 010 иг

роб-ежм -кит 2ч 1Р 5 4 24 С1 и2,иЗ Ш ,и2 Ш ,иб

РР-НК1 -ЙОП -АБК 2р Ю(я) 10,19,14

ЬБНА-АСР1 -СР1-РЕРБ 7 11р,19 1 7 9 А2 1 Ш4.Ш5 19

ТК1-СА1Ж 8 17q 11 7ч

ЬПНВ-ТР1-САР1)-РЕРВ 9 12 6,10 1,8 В4 4 Ш7 из

1БН2-МР1 10 15а

1ТРА-АБА 11 20р 2 и11

МОГИ -АСР1 1 1 2р АЗ

АКЗ-АС01И 12 9р

НРИТ-СбРС-РОК! -ель X X X X X X X X X

х - синтенные группы обозначаются латинской буквой и и номером группы синтении.

хромосомы 2), у мыши (большой участок акроцентрической хромосомы 4) (Nash and O'Brien, 1982; von Kiel et al., 1985; Гра-фодатский и Билтуева, 1987). Таким образом, гены pgd-enoi-pgmi маркируют гигантский район генома млекопитающих, который сохраняет сходство как в G-рисунке, так и наличии син-тенных генов у разных далеких видов, дивергенция которых насчитывает 70-80 млн лет.

При сравнительном анализе выявляются еще несколько консервативных районов в геномах млекопитающих. Например, син-тенные группы ldhb-tpi-gapd-pepb, tki-galk-erb или gpi-ldha-pepd маркируют консервативные районы размером от 15 до 25 сМ у норки, человека и мыши.

Имеются, однако, и примеры противоположного характера, то есть "дробление" в некоторых фллетических линиях крупных ассоциаций синтенных генов, консервативных в других крупных таксонах. Например, генный комплекс pgm1-pgd-en01 стабильный у приматов (у II из 12 изученных еидов), грызунов (у 3 из 3-х), норки, кошки разрушен у коровы и собаки. В этом случае, не следует отвергать возможность, что консерватизм тех или иных крупных ассоциаций сцепленных генов характерен для одних крупных таксонов, тогда как в других филетических линиях они могут разрушаться.

Помимо существования гигантских консервативных районов у млекопитающих, указывающих на возможную роль естественного отбора в их поддержании, следует обратить внимание на исключительную стабильность некоторых ассоциаций сцепленных генов в эволюции. Например, пары генов pgi -pepd и gdh-pgd сцеплены у рыб, амфибий и млекопитающих (Morizot and siciliano, 1984).

С нашей точки зрения сохранение консервативных районов в геномах далеких видов млекопитающих происходит при участии естественного отбора. Действие отбора может быть связано с некоторыми имманентными свойствами хромосом млекопитающих. По меньшей мере, на два из них следует обратить внимание, в связи с рассматриваемой проблемой. Во-первых, g-позитив-ные и G-негативные структуры хромосом млекопитающих имеют существенно разную молекулярную организацию (различен генный состав, содержат разного типа повторы и т.д.) и скорость

репликации (Holmquist, 1988). Во-вторых, хромосомный ш-принткнг, который является важным свойством генома млэкопк -танцих, определяющим нормальное развитие. Вероятно, как различия в структурной организации G-позитивных е G-негатив-ных элементов хромосом, так и дифференциальное участие раз -личных районов хромосом в формировании нщринтинга могут существенным образом влиять на скорость эволюции разных групп сцеплений или отдельных ассоциаций синтенных генов.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Установлена хромосомная локализация 41 гена, кодирующих биохимические признаки, в 13 аутосомах из 14 и Х-хрс-мосоме американской норки (Musteia vison) с помощью анализа 25 гибридов соматических клеток норка-китайский хомячок. Значения конкордантяости маркер-хромосома были: 100$ при локализации 10 генов, 96$ при локализации 17, 92$ при локализации 13 генов и в одном случае она составляла 88$. Хромосомная локализация 8-ми генов была подтверждена независимым анализом 34 гибридных клонов норка-мышь и 8-ми клонов клеток мыши, трансформированных метафазннми хромосомами норки.

2. Установлена субхромосомная локализация 8-ми генов в хромосоме 2 норки посредством анализа 34 гибридных клонов норка-мышь и 105 субклонов норка-китайский хомячок, несущих различные перестройки хромосомы 2. Показано, что гены, кодирующие пирофосфатазу, нуклеозидфосфорилазу, глутамат-оксало-ацетат-трансаминаэу-I и гексокиназу-I,расположены в районе pter—р22, ген, кодирующий аденозинкиназу, в pter—р11.1, ген, кодирующий фосфоглюкомутазу-I,в р11.1—q24.4i а гены, кодирующие фосфоглюконатдегидрогеназу и знолазу-I, в районе q24.4—qter.

3. Определены порядок и субхромосомная локализация 4-х генов в хромосоме 8 норки посредством анализа трансформированных клонов мыши, полученных в результате переноса генов норки с помощью метафазных хромосом. Установлено, что ген aldo, кодирующий субъединицу С альдолазы, расположен в районе pter—р25, гены ТК1 и galk, кодирующие тимидин-киназу-I и галактокиназу, находятся в р24, а ген esd, кодирующий эстеразу Д, в q24~qter. Показан следующий порядок генов В районе pter—р24 : aldc--ga1k— ТК1--сеп.

4. Установлено тесное сцепление генов тк1 а оаьк норки с помощью нового оригинального метода переноса генов в соматические клетки (шш), в котором в качестве вектора были использованы интерфазные ядра (норки), заюшченпна в липидную оболочку. Позитивный результат такого правка в определении физической близости сцепленных гонов позволяет рэ-комендовать его как новый способ картирования генов.

5. Впервые у норки описаны алактрофорэтпчоскяа вараанто эсте|зазы-1, -2, -3 и пептидазы В. Показано, что обааругеннш варианты зстераз-1,. -2, -3 и пептидазы В находятся под контролем аллелей локусов: ез1 , е32 (предположительно), взз

и РЕЕВ, соответственно.

Анализ экспрессии генов е31, (еб2) и езз в разллч-кых органах и тканях норки позволил вбнаружить цдо-действу-ющий элемент, обозначенный езн, который контролирует экспрессию гена еб1 и предполагаемого ез2.

6. Установлено, что гены еб1 и еэз оцеплены л находяг-ся на расстоянии 14+5 сМ. Показано также, что гена взз я рерб сцеплены и находятся на расстоянии 19+4 сУ.

Установлено, что ген еэз локализован в хромосоме 7 норки, и, следовательно, сцепленные с ним гены: е31, (е32), езй и рерп также находятся в этой хромосома норка.

7. Сравнение синте.пшх связей, хромосомной а оубхроио -сомной локализации генов у норки и других видов ияекопитав-щих показало, что имеется более ^крупных(10}райснов, в которых содержатся сходные гомологичные гены, общих у поркл с далекими вицами. Предполагается, что наблвдаеинй консерватизм некоторых ассоциаций сцепленных генов а эволхщщ шга-копитапцих поддерживается естественный отбором.

По теме диссертации опубликованы дледттаие основнке тпботн:

1. Серов 0.1., Бочкарев М.Н., Хлебодарова Т.Н. Молекулярная гибридизация нативных и модифицированных субъедшшц нзо-ферментов лактатдегидрогеназы и альдолазы А крысц//Езо-химия.-I976.-т.41,-С.886-890.

2. Серов О.Л., Корочкин Л.И., Манченко Г.П. Злектрофорэтл -ческие методы исследования изоферментов//Генетика изо -ферментов.-М., 1977,-С.18-64.

3. Рубцов Н.Б., Радаабли С.И., Градов A.A., Серов О.Л. Полу-ченЕе и характеристика гибридов соматических клеток ки -тайского хомячка и американской норки//ЦЕтология и гене -тйка.-1981. -т .15, -С54-58.

4. Рубцов Н.Б., Радаабли С.И., Градов A.A., Серов ОД. Картирование хромосом американской норки. Сообщение I. Определенна хромосомной локализации локусов Ldh a, Ldh в и Gpi у американской норки//Генетика.-1981.-т.17,-С.1856-1861.

5. Рубцов Н.Б., Радаабли С.И., Градов A.A., Серов О.Л. Кар -тирование хромосом американской норки. Сообщение II. Оп -ределение хромосомной локализации локусов Mod-1, Мог-1

и ldh-1 у американской норки//Генетика.-I981.-г.I7,-С. I862-1866.

6. Сукоян М.А., Матвеева Н.М., Беляев Н.Д., Пак С.Д., Гра -дов A.A., Шилов А.Г., Серов О.Л. Генетическая трансфор -мадия мутантных клеток мыши метафазными хромосомами нор-ки//Докл.АН СССР.-1984.-т.277,-С.219-222.

7. Сукоян М.А., Беляев Н.Д., Будкер В.Г., Градов A.A., Пак С.Д., Серов О.Л. Генетическая трансформация клеток мыши интерфазными ядрами, заключенными в липидную оболочку// Докл.АН СССР.-I985.-t.280.-C.I445-1448.

8. Серов О.Л. Перенос генов в соматические и половые клетки.-Новосибирск.-1985.

9. Жданова Н.С., Градов A.A., Рубцов Н.Б., Серов О.Л. Суб -хромосомная локализация восьми генов на 2-й хромосоме американской норки (Mustela vison) //Докл. АН СССР,-1985.-Т.280,-0.1250-1253.

10. Пак С.Д., Градов A.A., Сукоян М.А., Рубцов Н.Б., Бочка — рев М.Н., Серов О.Л. Субхромосомная локализация четырех генов на 8 хромосоме американской норки (Mustela vison) //Докл.АН СССР.-1985.-т.281, -С.960-963.

11. Rubtsov H.B., Radjabli S.I., Gradov A.A., Serov O.L. Chinese hamater x American mink somatic cell hybrids: characterization of a clone panel and assignment of the genes for malate dehydrogenase, NADP-1 and malate dehydrogenase, HAD-1//Theor.Appl.Genet.-1981.-v.60,-P.99-106.

12. Rubtsov 11.B., Radjabli S.X., Gradov A.A., Sorov O.L. Chromosomal localization of three ayntenic in tho American mink (Mustela vison)//Cytogenet.Cell Genet.-1981.-v. 31,-P. 184-187.

13. Rubtsov II.B., Radjabli S.I., Gradov A.A., Serov O.L.

A biochemical genetic map of the Anerican mink (fiuste-la vison)//Isozyme Bull.-1981. - v.14, - P.48.

14. Rubtsov N.B., Gradov A.A., Serov O.L. Chromosome localisation of the loci C0T1, PP, NP, S0D1, PEPA and PEPC in the Anerican mink (liustela vison)//Theor.Appl.Genet.-

1982. - v.63, - P.331-336.

15. Rubtsov II.B., Radjabli S.I., Gradov A.A., Serov 0»L. Chromosome localization of the genes for isocitrate dehydrogenase^ , isocitrate dehydrogenase-2, glutathione reductase, and phosphoglycerate kinase-1 in the American mink (Mustela vison)//Cytogenet. Cell Genet.-1982.-v.33, - P.256-260.

16. Gradov A.A., Rubtsov N.B., Shilov A.G., Bochkarev M.N., Serov O.L. Chromosome localization of the genes for EN01, HK1, ADK, ACP2, tSFI, ITPA, AC0N1 and GAL in the American mink (Mustela viaon)//Theor. Appl. Genet. -

1983. - v.67, - P.59-65.

17. Mullakandov M.R., Zakijan S.M., Serov O.L. Biochemical polymorphism in the American mink (Mustela vison)//Xoo-zyme Bull. - 1984. - v.17, - P.55.

18. Gradov A.A., Rubtsov N.B., Serov O.L. Chromosome loca -lization of the biochemical loci in the American mini (Mustela vison)//Scientifur. - 1985. - v.9, - P.33-35.

19. Gradov A.A., Pack S.D., Sukoyan M.A., Rubtsov If.B., Bochkarev M.H., Serov O.L. Regional assignment of the genes for TK1 ,• GALK, ALDC, .and BSD on chromosome 8 in the American mink by chromosome-mediated gene , transfer// Mol.Gen.Genet. - 1985. - v.200, - P.433-438.

20. Sukoyan M.A., Matveeva N.M., Belyaev N.D., Pack S.D., Gradov A.A., Shilov A.G., Zhdanova U.S., Serov O.L. Cotransfer and phenotypic stabilisation of syntenic and asyntenlc mink genes into mouse cells by chromoso-

mo-mediated gene transfer//Mol. Gen. Genet. - 1984. -v.196, - P.97-104.

21. Sukoyan U.K., Belyaev M.D., Budker V.G., Gradov A.A., Paok S.D., Serov 0.1. Transfer of mink genes into mouse cells by means ol isolated lipid-encapBulated nuclei// Kol. Gen. Genet. - 19B5. - v.201, - P.437-491.

22. Zhdanova H.S., Gradov A.A., Rubtsov H.B., Pack S.D., Serov O.L. Regional assignments oi eight genes on chromosome 2 in the American mink.//Cytogenet. Cell. Genet.-1985. - v.39, - P.296-298.

23. Kullakandov M.R., Gradov A.A., Zakijan S.M., Rubtsov N.B., Sarov 0.1. Peptidases A, B, C, D, and S in the American mink: polymorphism and chromosome localizati-on//Thoor. Appl. Genet. - 1986. - v.73, - P.272-277.

24. Serov 0.1., Gradov A.A., Rubtsov N.B., Zhdanova N.S., Pack S.D., Sukoyan M.A., Mullakandov M.R., Zakijan S.M. Genetic map in the American mink: gene conservation and organization of chromosomes//Isozyme3s current topics in biological and medical research. Allan R.lise, New York. - 1987a. - v.15, - P.179-215.

25. Serov 0.1., Gradov A.A., Rubtsov N.B. American mink (Miistela viBon)//Genetic-Mapsi New York. Cold Spring Harbor lab. - 19B7b. - P.502-503.