Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Консервативные районы хромосом парнокопытных

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Консервативные районы хромосом парнокопытных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

Р Г Б ОД

О" ит 1<~к-,— Нп правах рукописи

, УДК 576.312.32:599.3

БИЛТУЕВА Лариса Семеновна

КОНСЕРВАТИВНЫЕ РАЙОНЫ ХРОМОСОМ ПАРНОКОПЫТНЫХ

Генетика 03.00.15

„АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1995

/

Работа выполнена в Институте цитологии й генетики СО РАН, г.Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук A.C. Графодатский Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А.Ф.Смирнов,

НИИ разведения и Генетики животных, РАСХН, г.Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Н.С.Жданова

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН, г. Москва

Защита состоится " -/'■>" / ') \ I ^ Ркк на {, ¡"' А у-ин чУ.

заседании дисертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01.) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090 г.Новосибирск - 90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " К " ГС и /"-■ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

А .Д. Груздев

Актуальность_проблемы. Результаты наркологических

исследований видов разной степени филогенетической разобщенности представляют основной интерес при изучении эволюции геномов млекопитающих. Долгое время работы по сравнительной цитогенетике сдерживались отсутствием надежных способов идентификации хромосом. Только с внедрением альтернативных методов дифференциальной окраски прометафазных хромосом появилась реальная основа для создания цитологических карт хромосом высокого уровня разрешения окраски, что особенно актуалы") для таких видов как крупный рогатый скот и овца, которые обладают сложными кариотипами, состоящими из большого числа трудно идентифицируемых элементов. Построение GTG- и RBG-цитологических карт хромосом высокого уровня разрешения окраски для данных видов способствует решению многих проблем в числе которых -детальный анализ хромосомных перестроек, произошедших die novo в популяциях домашнего скота или имевших место в эволюции таксона; картирование геномов домашних животных; изучение особенностей кариотштической эволюции парнокопытных.

Методы дифференциального окрашивания хромосом достаточно эффективны, в основном, при сравнительном анализе хромосомных наборов близких видов. Так, внутри семейства полорогих установлены районы хромосомных гомологий и определены перестройки хромосом, имевшие место в ходе эволюции. При попытке же сравнить кариотипы далеко дивергировавших групп из разных подотрядов парнокопытных, например, свиней и полорогих возникают сложности (Графодатский и др., 1990). В качестве дополнительного критерия при анализе кариотипов филогенетически разобщенных видов все чаще привлекают данные по картированию геномов сравниваемых видов (Nash & OlBrien, 1982; Sawyer, 1991). Следует отметить, что физические карты крупного рогатого скота, овец и свиней мало насыщены, и лишь для небольшого числа генов установлена внутрихромосомная локализация. В настоящее время картировано около 350 генов крупного рогатого скота, более 60 генов овцы и свыше 80 генов свиньи (Fries et al.,1993; Echard, 1993; Yerle et al., 1995). При сравнении столь мало изученных геномов появляется необходимость сопоставления их с геномом человека, обладающего наиболее насыщенной физической картой. Сравнительный анализ физических карт геномов человека, крупного рогатого скота и свиньи указал на сохранение у них некоторых групп сцепления гомологичных генов, что позволяет надеяться на возможность идентификации

гомологичных районов в кариотипах данных видов. Помимо изучения эволюционных взаимоотношений в отрядах, наличие гомологичных элементов в кариотипах исследуемых видов представляет возможность экстраполяции данных с более насыщенной физической карты человека на таковые домашних животных.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы является изучение особенностей кариотипической эволюции внутри отряда парнокопытных. Были поставлены следующие задачи:

1. Построить высокого уровня разрешения RBG-цитологические карты хромосом крупного рогатого скота, овцы и свиньи.

2. Провести GTG- и RBG- цитогенетический анализ новой робертсоновской транслокации крупного рогатого скота.

3. Провести детальный анализ малоизученного кариотипа овцебыка.

4. Установить субхромосомную локализацию ряда генов в геномах крупного рогатого скота, овцы и свиньи с помощью метода ДНК/ДНК гибридизации in situ.

5. Провести поиск районов цитологической гомологии, маркированных гомологичными генами, в хромосомных наборах крупного рогатого скота, свиньи и человека.

Научная новизна. Получена цитологическая карта RBG-окрашенных хромосом овцы, превышающая по уровню разрешения все известные. Впервые проведен детальный цитогенетический анализ с использованием GTG- и RBG- методов окраски новой робертсоновской транслокации 8/23 у крупного рогатого скот;а. Представлено подробное описание GTG-окрашенных хромосом овцебыка в сравнении с кариотипом крупного рогатого скота. В кариотипах крупного рогатого скота, овцы и свиньи проведена предварительная внутрихромосомная локализация генов ESD, WARS, К51, а2М и INFpl. Установлено 10 районов цитологической гомологии в хромосомных наборах свиньи и человека; 13 районов цитологической гомологии в хромосомных наборах человека и крупного рогатого скота; 8 районов цитологической гомологии в хромосомных наборах человека, свиньи и крупного рогатого скота.

Практическая ценность. Полученные результаты могут быть использовлны для стандартизации хромосомных наборов крупного рогатого скота, овцы и овцебыка; построения физических карт крупного рогатого скота, овцы и свиньи; изучения особенностей кариотипической эволюции как внутри семейства полорогих, так и на уровне отрядов парнокопытных и приматов.

Аиробация работы. Результаты исследования были представлены на Всесоюзном совещании "Эволюционные и генетические исследования млекопитающих" (Владивосток, 1990); VII Всесоюзном совещании по структуре и функции хромосом (Пущино, 1991); 10-ом Европейском коллоквиуме по цитогенетике домашних животных (Utrecht,1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-X глав, выводов и списка литературы (205 ссылок). Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками.

Материалы и методы.

Объектами наших исследований были 4 вида отряда парнокопытных: крупный рогатый скот (Bos taurus), овца (Ovis aries), свинья (Sus scrofa) и овцебык (Ovibos muchatus). В качестве материала для приготовления хромосомных препаратов служила 3-х суточная культура лимфоцитов периферической крови.

В опытах по ДНК/ДНК гибридизации in situ использованы следующие последовательности: 1) Плазмида pE.SDl4.l-1., содержащая практически полную копию гена эстеразы Д человека (1,2 kb, ESD), предоставлена др.Дж.Сквайром (Госпиталь детских болезней в Торонто, Канада); 2) Плазмида pUC19, содержащая фрагмент гена (0,87 kb) триптофанил-тРНК синтетазы человека (ЕСС 6.1.1.2., WARS), предоставлена Л.Ю.Фроловой (Институт молекулярной биологии, Москва); 3) Плазмида PGM-4, содержащая вставку части гена К51 (2,321 kb), выделенного И.М.Чумаковым из геномной библиотеки крысы, предоставлена Л.Л.Киселевым (Институт молекулярной биологии, Москва); 4) Плазмида pha2ml, содержащая фрагмент гена 0(2-тхроглобулина человека (2,1 kb), предоставлена др.Дж. Бэллом (Chiron Со, Эмервиль, Калифорния); 5) Фрагмент гена ß-интерферона человека (0,6 kb), предоставлен М.И.Ривкиным (ИЦиГ, Новосибирск).

Приготовление препаратов хромосом проводили по стандартным методикам (Графодатский и Раджабли, 1988). Задержка конденсации хромосом в культуре проводилась по методике Икеучи (Ikeuchi,1984). Для С-окраски хромосом использовали метод Самнера (Sumner,1972), для G-дифференциальной окраски хромосом - метод Сибрайт (Seabright,197l). Предфиксационные обработки для получения репликативного бэндинга проводили по рекомендациям Ренне (Ronne,1983). Процедуру RBG-

окрашивания выполняли по модификации Камарго и Червенко (Camargo & Cervenka, 1980).

Процедуру ДНК/ДНК гибридизации in situ проводили согласно методу Герхарда с соавторами (Gerhard et а],1981). Статистическая обработка результатов гибридизации проводилась по критерию yj (Плохинский, 1970).

Поиск районов хромосомной гомологии базировался на данных сравнительного картирования геномов млекопитающих (O'Brien et al. ,1993), дополненных последними данными по физическому картированию крупного рогатого скота (Fries et al.,1993), овцы (Ansari et al.,1993) и свиньи (Yerle et al.,1995).

Автор выражает признательность А.А.Шаршову, совместно с которым проводился анализ Rb 8/23 и кариотипа овцебыка; В.Р.Беклемишевой, вместе с которой отрабатывался RBG-метод окраски и проводились опыты по гибридизации in situ; Т.П.Лушниковой за подготовку проб в экспериментах по гибридизации in situ; Н. Астаховой за совместный анализ результатов гибридизации гена ESD на хромосомах свиньи; А.И.Протопопову, Н.В.Воробьевой, О.В.Саблиной, Н.Б.Рубцову и В.Р.Беклемишевой за ценные замечания, высказанные при прочтении рукописи.

Результаты и обсуждение

Анализ хромосомных наборов парнокопытных

Цитологическая карта RBG-окрашенных хромосом крупного рогатого скота. Получение цитологической карты дифференциально окрашенных хромосом высокого уровня разрешения - основа любого цитогенетического анализз. Сложности с идентификацией хромосом крупного рогатого скота и овцы и отсутствие на момент начала наших работ описания RBG-окрашенных хромосом этих видов, наряду с сообщением о преимуществах использования альтернативных окрасок хромосом в работах по сравнительной цитогенетике (vonKeil et al.,1985), побудили нас приступить к получению RBG-карт хромосом высокого уровня разрешения для наших объектов.

Оптимальным при отработке RBG-метода оказалось использование, с небольшими вариациями, метода, предложенного Камарго и Червенко (Camargo & Cervenka,1982). При этом мы дополнительно вводили в культуру АТ-специфический краситель Хехст 33258 через 1 час после

введения БДУ (Rönne, 1983). Наибольший полученный нами уровень разрешения оценивается приблизительно в 500 бэндов, что соответствует разрешению прометафазных хромосом для известных GTG-и RBA-цитологических карт хромосом этого вида (DiBerardino et ai,1985; Graphodatsky,1989; Чиряева и др,1989). Надо отметить, что при этом варианте окраски достаточно четко различаются пары хромосом 4 и 6; 24 и 25, идентификация которых вызывает затруднения при GTG-окраске хромосом. Иногда среди спорных при RBA-окраске упоминаются 17-ая и 18-ая пары хромосом (DiBerardino & Iannuzzi,1982), которые без труда идентифицируются при RBG-окраске хромосом. Остаются проблемы с идентификацией самых мелких пар хромосом.

Цитологическая карта RBG-окрашенных хромосом овцы. Достаточно сложна ситуация со стандартизацией хромосом овцы, где существуют разногласия относительно номенклатуры ряда хромосом (Ford et al.,1980; Long,1985). В результате которых на последней конференции по стандартизации хромосом овцы не была принята GTG- номенклатура хромосом, а предложена номенклатура для R-окрашенных хромосом (INSDA.1989). Необходимость продолжения работ по получению качественных цитологических карт хромосом для этого вида очевидна (Kaftanovskaya & Serov,1992; Anssari et al.,1994; Iannuzzi et al., 1995). Максимальный уровень разрешения известных GTG- и RBA-цитологических карт хромосом овцы достигает приблизительно 500 бэндов (Graphodatsky,1989; DiBerardino et al.,1989; Kaftanovskaya & Serov, 1992). Уровень разрешения полученной нами карты превосходит все известные для RBA-, GTG- и разработанных позднее Хейэ и Янусси RBG-цитологических карт хромосом овцы (Hayes et al.,1991; Iannuzzi et al., 1995) и оценивается нами приблизительно в 600 бэндов. При этом уровне разрешения бэндинга появляется возможность надежной идентификации всех элементов набора.

RBG-окрашенный кариотии свиньи. Для этого вида одним из первых, наряду с человеком, были построены цитологические карты репликативно окрашенных хромосом (Rönne et al,1987). Нами представлен RBG-окрашенный кариотип свиньи с разрешением приблизительно в 500 бэндов. Прометафазный бэндинг такого уровня достаточен для наших работ по сравнительному анализу.

Таким образом, на первом этапе исследований мы отработали световой вариант репликативного метода окраски и получили RBG-цитогенетические карты хромосом высокого уровня разрешения для

крупного рогатого скота, овцы и свиньи. Введение в собственную цитогенетическую пряктику этого метода наряду с обычным GTG-методом было необходимо как для работ по частной цитогенетике видов, так и для работ по сравнительной цитогенетике.

Робертсоновская транслокация 8/23. Новая робертсоновская транслокация 8/23 найдена у 7 животных в группе серого украинского скота Алтайского экспериментального хозяйства СО РАН. При рутинном анализе хромосом животного с 2п=59, обнаружена дополнительная двуплечая хромосома,1 близкая по размеру и соотношению плеч с X-хромосомой. При окраске на С-гегерохроматин выявляются два четких блока в проксимальных районах обоих плеч. Анализ GTG- и RBG-окрашенных прометафазных хромосом показал, что в слиянии участвуют 8 и 23 хромосомы крупного рогатого скота. Разломы хромосом произошли в коротких плечах этих акроцентряков без видимой потери хромосомного материала. Анализ синаптонемального комплекса транслокантного животного, проведенный Т.Ладыгиной и П.М.Бородиным, подтвердил отсутствие заметной делеции в этих хромосомах (Biltueva et а].,1994).

В основе возникновения робертсоновских транслокаций, вероятно, лежит конъюгация между гомологичными районами разных хромосом, а любой агент, индуцирующий разрывы хромосом, может привести к образованию транслокантной хромосомы (Hsu et id., 1978; Cheung et al.,1990; Gravholt et al.,1992). В зависимости от мест разрыва хромосом различают два типа центрических слияний моноцентрические и дицентрические. Дицентрическая хромосома с двумя' блоками гетерохроматина в прицентромерных районах обоих плеч присуща большинству робертсоновских транслокаций, обнаруженных de novo у человека (Mattel et al.,1979; Gravholt et al.,1992) и у крупного рогатого скота (Long,1985). В кариотипической эволюции полорогих отмечается равномерное уменьшение блоков гетерохроматина у метацентриков по сравнению с акроцентриками (Evans et al, 1973; Buckland & Evans, 1978b); реже встречаются метацентрики, соответствующие робертсоновским транслокациям первого типа, с одним блоком гетерохроматина на одном из плеч. Однако неясно, наблюдаем ли мы истинные места разрывов, либо это результат последующих за слиянием событий (Iannuzzi et al.,1987).

Следует заметить, что при центрических слияниях не нарушается целостность эухроматинового материала, и носители их фенотипически нормальны. Основной негативный эффект выражается в снижении

фертильности гетерозигот из-за неправильного расхождения триваленгов и гибели части зигот. Из-за сложностей с идентификацией хромосом крупного рогатого скота и овец оказалось эффективным использование робертсоновских транслокаций в качестве маркерных хромосом при картировании геномов (Ansari et al., 1993; Hayes et a!., 1993a). В данном случае существенно, что в слиянии участвует 23 хромосома, одна из наиболее трудно идентифицируемых в кариотипе крупного рогатого скота.

Цитогенетический анализ кариотипа овцебыка. Изучаемый нами вид, Ovibos muchatus, принадлежит к трибе Ovibovini подсемейства Caprinae, имеет 6 двуплечих хромосом при 2п=48. При С-окраске хромосом овцебыка мы отмечаем типичные для подсемейства козьих небольшие блоки прицентромерного гетерохроматина у акроцентриков и У-хромосомы. Метацентрики, как и X хромосома, характеризуются полным отсутствием видимых С-блоков. Как уже отмечалась, тенденция к уменьшению количества прицентромерного гетерохроматина характерна для кариотипической эволюции полорогих (Evans et al., 1973; Buckland & Evans, 1978b).

Первое описание дифференциально окрашенных хромосом этого вида, полученное с помощью RBG-метода (Desaulniers et al., 1989), имеет разрешение (приблизительно 300 полос) недостаточное как для соответствующей стандартизации хромосом овцебыка, так и соотнесения их с базовым кариотипом крупного рогатого скота. При построении G-цитологической карты овцебыка мы использовали рекомендации конференции в Ридинге (Ford et al., 1980). Хромосомы расположены в порядке убывания, в соответствии со стандартным кариотипом крупного рогатого скота (1NSCDA.1989). Этот вид имеет типичный для группы козьих рисунок 9-й, 14-й и Х-хромосом. В образовании шести метацентриков овцебыка участвуют следующие пары хромосом базового кариотипа крупного рогатого скота: 1 и 18, 2 и 22, 5 и 27, 11 и 23, 25 и 29, 24 и 28. Слияния прошли без заметной потери эухроматинового материала (Biltueva et a]., accepted). Первые четыре метацентрика овцебыка соответствуют двуплечим элементам в кариотипе такина -наиболее близкого к нему вида (Pasitschniak-Arts" et al,1994).

По сравнению с центрическими слияниями хромосомные перестройки неробертсоновского типа гораздо реже встречаются у полорогих. Известно несколько тандемных транслокаций и пара- и/или перицентрические инверсии 9-й и Х- хромосом (Evans et al., 1973; Buckland & Evans, 1978a; Gallagher et al.,1992). Мы отмечаем отсутствие

прицентромерного района ql.6-ql.8 на хромосоме 8 овцебыка по сравнению с гомологичной хромосомой 4 базового кариотипа. Следует заметить, что хромосомы 14 в кариотипах подсемейств бычьих и козьих также отличаются отсутствием крупного G-позитивного прицентромерного блока в кариотипах бычьих.

Картирование геномов крупного рогатого скота, овцы и свиньи

Нами проводилось картирование 5 генов (ESD, WARS, К51, <х2М и INFpi) на трех видах домашних животных. Установлено 8 предварительных локализаций этих генов. Результаты представлены в таблице.

Таблица.

Локализация генов ESD, WARS, К51, а2М и INFpl на трех видах домашних животных

Ген Вид Сайт локализации r

WARS свинья крупный рогатый скот 7q24-q26 3qll-q21; 3q42-q45 15,4; P<0,001 53,6; P<0,001

сс2М овца 3q26-q35 146,4; P<0,001

К51 свинья крупный рогатый скот 6q27-q28 18ql2-ql5 74,7; P<0,001 62,1; P<0,001

INFpl свинья Iq23-lq26 ' 55,7; P<0,001

ESD свинья овца 13q3.4-q4.4 3p26-p24 172,2; P<0,001 45,6; P<0,001

Следует отметить следующее: существование двух сайтов локализации гена WARS на хромосомах коровы, что предполагает дупликацию гена или наличие псевдогена; локализация гена К51 на хромосоме 18 коровы позволяет предположить, что кератиновые гены у этого вида распределены по четырем хромосомам, а не трем как предполагалось ранее (Fries et al.,1993); пока не подтверждена наша предварительная локализация гена ESD на хромосоме 13 свиньи (Ellegren et al., 1994). Во всех случаях несоответствия нельзя исключить, что это результат использования гетерологичных ДНК проб.

- К -

Анализ районов хромосомной гомологии

Подход, используемый для поиска районов хромосомной гомологии у филогенетически далеких видов отработан еще Нашем и О'Брайеном (Nash & O'Brien, 1982). На первом этапе по данным сравнительного картирования устанавливаются хромосомы, обладающие набором гомологичных генов (O'Brien et al., 1993). Затем проводится сравнительный цитогенетический анализ отобранных хромосом с близким уровнем разрешения бэндинга. Для большей точности сравнительного анализа мы использовали альтернативные методы окрашивания хромосом

(GTG и RBG).

Гомологичные районы хромосом свиньи и человека. Гены LHCGR, АРОВ и MDH1 маркируют район q22-qter хромосомы 3 свиньи, у человека они картированы на коротком плече хромосомы 2 в районе р24-р21. На физической карте свиньи эти гены локализованы с меньшим разрешением; для MDH1, например, неизвестно внутрихромосомное положение (O'Brien et al., 1993).

По результатам, проведенного нами, цитогенетического анализа можно говорить о сходстве почти всего короткого плеча хромосомы 2 человека (р24- р12) и длинного плеча хромосомы 3 свиньи (ql2-qter), при этом сайты локализации гомологичных генов лежат в сходных бэндах. Ген LHCGR у человека локализован в бэнде 2р21, соответствующему по рисунку окраски бэнду 3q23 свиньи; мы можем, по- видимому, ограничить локализацию этого гена у свиньи одним бэндом 3q23 вместо двух описанных (3q23-3q24). Мы предполагаем сужение района локализации гена АРОВ с четырех бэндов 3q24-3qter до двух 3q25-3q26, в соответствии с двумя бандами локализации его у человека - 2р24-23. Оказалось, что именно эти два бэнда указаны как сайты локализации гена АРОВ в последней сводке по картированию генома свиньи (Yerle et al.,1995). Мы предполагаем также субхромосомную локализацию гена MDH1 в бэнде q25 хромосомы 3 свиньи, основываясь на расЬоложении этого гена в бэнде 2р21 у человека. Такие экстраполяции, по нашему мнению, могут быть правомочны при наличии четкой цитологической гомологии крупных районов хромосом, маркированных гомологичными генами.

Расматриваемые гены входят в обширную группу синтении, которая остается консервативной у кошки (хромосома A3), норки (хромосома 11), лисы (хромосома 8) и коровы (синтенная группа 16) (O'Brien et al.,1993).

Для этих видов, за исключением крупного рогатого скота, были определены районы цитологической гомологии внутри указанных хромосом (Nash & O'Brien,1982; Rubtsov et al.,1988). Использование только цитогенетического анализа при отсутствии на тот момент данных сравнительного картирования привело к некоторым неточностям при установлении данного консервативного района на хромосомах норки и свиньи (Графодатский и Билтуева, 1987).

Всего нами найдено 10 районов цитологической гомологии в кариотипах человека и свиньи, включающих 54 гена; 33 из них входят в состав 6 крупных районов строгой цитологической гомологии. Остальные 4 района из-за их небольших размеров отнесены нами к районам предполагаемой гомологии. Как уже отмечалось, в сравнительном анализе с использованием только дифференциального окрашивания хромосом обнаружить районы цитологической гомологии у этого вида с любыми другими видами не удавалось, что давало основание говорить о значительной перестроенности кариотипа свиньи (Графодатский и Раджабли, 1981; Графодатский и Билтуева, 1987). Включение в хромосомный анализ данных сравнительного картирования позволило установить крупные районы цитологической гомологии, зачастую сохранившие более предковый, по отношению к человеку, набор генов и рисунок дифференциальной окраски (Graphodatsky & Biltyeva,1995).

Гомологичные районы хромосом человека и крупного рогатого скота. Наиболее крупный и единственный район строгой хромосомной гомологии расположен на длинных плечах хромосомы 3 человека и хромосомы 1 коровы и маркирован 6 гомологичными генами, субхромосомная локализация которых в геноме коровы не установлена (O'Brien et al., 1993). Участок цитологической гомологии включает почти половину (pter-p32) хромосомы 1 коровы и большую часть (q21-qter) хромосомы 3 человека. Поскольку мы имеем довольно крупный район четкой гомологии, можно предположить внутрихромосомную локализацию этих 6 генов на физической карте коровы, с точностью, известной для физической карты человека: TF-lq45; GAP43- lq32-qter; CP- Iq41-q44; SI- Iq34-q36; FIMS-lq33; SST-lq32. Заметим, что ген TF локализован в районе q3.8-3.10 хромосомы 1 овцы, который гомологичен сайту q44-q46 на хромосоме 1 коровы.

Найдено 13 районов цитологической гомологии, включающих 92 гомологичных гена, для 22 из которых известна субхромосомная локализация; в большинстве своем они невелики и чаще мы говорим о

предположительной гомологии. Сложности с поиском районов цитологической гомологии определены большей, по нашему мнению, перестроенностью хромосомного набора крупного рогатого скота относительно такового человека. Мы согласны с утверждением Вомак и Молл (Womack & Moll,1986) о большей консервативности генома крупного рогатого скота по сравнению с геномом мыши, но отмечаем следующее: - консерватизм проявляется не на уровне групп сцепления, а на уровне синтенных групп. Эти синтенные группы, маркирующие часто всю хромосому, достаточно сложно перекомпонованы внутри .самих себя, что трудно найти протяженные районы цитологической гомологии, как это удается в кариотипах кошки, норки или свиньи.

Гомологичные районы хромосом человека, свиньи и коровы. Сравнительный цитогенетический анализ, проведенный на трех видах, показал существование 8 районов хромосомной гомологии разной протяженности. Присутствие в кариотипах столь филогенетически далеких видов крупных, выявляемых на цитологическом уровне, гомологичных участков хромосом со сходным набором генов отражает общую тенденцию сохранения консервативных сегментов в эволюции генома млекопитающих (O'Brien et al., 1988; O'Brien & Graves, 1991). Нарушения, фиксируемые внутри этих маркерных районов, позволяют оценить особенности кариотипической эволюции таксона.

К достаточно консервативным кариотипам - с 30-35% цитологической гомологией, наряду с хромосомными наборами человека и кошки, мы, на основе проведенного анализа, отнесем и кариотип свиньи. Ранее он слабо привлекался в работы по сравнительной цитогенетике, поскольку считался весьма перестроенным относительно стабильных кариотипов близких к нему жвачных (Графодатский и Раджабли, 1981; Графодатский и Билгуева, 1987).

Геном крупного рогатого скота по результатам сравнительного картирования отнесен к достаточно консервативным, так как содержит крупные группы синтенных генов (Womack & Moll, 1986; Treadgill & Womack, 1990d; Ryan et al., 1993). Однако проведенный нами анализ показал многочисленные нарушения внутри исходных групп сцепления. На цитологическом уровне это выражается в отсутствии протяженных районов хромосомной гомологии. Учитывая высокий уровень хромосомного консерватизма в кариотипах полорогих, можно предполагать, что кариотипическая эволюция в этом таксоне осуществлялась в два этапа: на первом этапе дивергенции у них происходили интенсивные хромосомные

перестройки, изменившие предковые группы сцепления; на втором, осуществлялись главным образом центрические слияния сформировавшихся на первом этапе элементов.

ВЫВОДЫ

1. Получены цитологические карты RBG-окрашенных хромосом следующих видов: крупного рогатого скота с разрешением в 500 бэндов, овцы с разрешением в 600 бэндов и свинья с разрешением в 500 бэндов.

2. С использованием GTG- и RBG-методов дифференциальной окраски высокого уровня разрешения проведен цитогенетический анализ новой робертсоновской транслокации крупного рогатого скота. Установлено, что слияние, в котором участвуют хромосомы 8 и 23, произошло без заметной потери хромосомного материала.

3. Проведен подробный цитогенетический анализ кариотипа овцебыка (Ovibos moschatus Z.), 2п=48, в сравнении с базовым кариотипом крупного рогатого скота; идентифицировано 7 хромосомных перестроек.

4. С помощью изотопного варианта метода гибридизации in situ установлено 8 предварительных локализаций генов ESD, WARS, К51, <х2М и INFßl на хромосомах крупного рогатого скота, овцы и свиньи.

5. С использованием GTG- и RBG- методов дифференциальной окраски высокого разрешения проведен подробный цитогенетический анализ хромосомных районов, маркированных гомологичными генами, в кариотипах человека, свиньи и крупного рогатого скота. Показана высокая степень консератизма хромосомных наборов человека и свиньи. Кариотипы человека и коровы характеризуются меньшей, по сравнению с предыдущей парой видов, цитологической гомологией из-за большей перестроенности хромосомных наборов полорогих.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Графодатский A.C., Билтуева A.C. Гомология G-окрашенных хромосом млекопитающих // Генетика. - 1987. - Т.23. - С.93-103.

2. Графодатский A.C., Шаршов A.A., Билтуева A.C., Попов В.А. Кариотип зубра (Bison bonasus L.). // Цитология и генетика. - 1990. -

Т.24.-С.34-37.

3. Графодатский А.С., Билтуева Л.С., Еремина В.Р., Высочина Е.В. Возможности дифференциальных окрасок хромосом высокого уровня разрешения в филогенетических исследованиях // Сб. Эволюционные и генетические исследования млекопитающих - 1990. - Владивосток. -

С.17-35.

4. Graphodatsky A., Filippov V., Biltueva L., Astachova N.. Eremina V., Lushnikova Т., Ruvinsky A. Localization of the pig gene ESD to chromosome 13 by in situ hybridization // Mammalian Genome. - 1992. -V. 3. - P. 52-53.

5. Biltueva L., Sharshova S., Sharshov A., Ladygina Т., Borodin P., Graphodatsky A. A new Robertsonian translocation 8/23 in cattle // Genet. Sel. Evol. - 1994. - V. 26. - P. 159-165.

6. Graphodatsky A., Biltueva L., Filippov V., Eremina V., Lushnikova Т., Shymny Т., Ermolaev V. Localization of the ESD and A2M genes to sheep chromosome 3 by in situ hybridization // Cytogenet. Cell Genet.-

1993. - V. 62. - P. 156-158.

7. Graphodatsky A., Frolova L., Biltueva L., Eremina V., Lushnikova Т., Sudomoina M., Zinovieva O., Kisselev L. Localization of the tryptophanyl tRNA synthetase gene (WARS) on human and bovine chromosomes by in situ hybridization // Mammalian Genome. - 1993. - V. 4. - P. 183-184.

8. Graphodatsky A.S., Biltueva L.S. Chromosome banding and gene conservation between humans and pigs // J.Anim.Breed. Genet. - 1995. -V. 112. - P. 151-155.

9. Biltueva L., Sharshov A., Graphodatsky A. G-banding homologies in musk ox, Ovibos moschatus, and other bovids // Hereditas. - 1995. - V.122 (accepted).

10. Graphodatsky A., Biltueva L., Sablina O., Beklemisheva V., Lushnikova Т., Vorobieva N., Kisselev L. Localization of rat K51 keratin-like gene to rat chromosome 3, human chromosome 9, cattle chromosome 18, pig chromosome 6 and mink chromosome 1 by in situ hybridization //Cytogenet. Cell Genet, (in press).

11. Графодатский A.C., Билтуева Л.С. Высокий уровень разрешения G-дифференциальной окраски хромосом овцы // Сб. Цитогенетика и биотехнология. - 1989. - Ленинград. - С.88.

- п -

12. Графодатский А.С., Лушникова Т.П., Билтуева Л.С., Еремина В.Р., Саблина О.В., Рубцов Н.Б. Локализация проб ряда генов человека на хромосомах некоторых видов млекопитающих с помощью гибридизации in situ // Материалы 2-й Всесоюзной конференции "Геном человека". -1991. - Переславль. - С.32-33.

13. Графодатский А.С., Саблина О.В., Лушникова Т.П., Еремина В.Р., Билтуева Л.С. Локализация генов WARS и К51 на хромосомах человека / / Материалы 2-й Всесоюзной конференции "Геном человека". - 1991. - Переславль. - С.54-55.

14. Graphodatsky A., Lushnikova Т., Billueva L., Eremina V., Rubtsov N., Filippov V., Astachova N., Rivkin M., Shumny Т., Ermolaev V., Ruvinsky A. Localization of some human genes to mammalian chromosomes by in situ hybridization // Cytogenet. Cell Genet.(abstr) - 1991. - v.58. - p.1983.

15. Billueva L., Sharshova S., Sharshov A., Ladygina Т., Borodin P., Graphodatsky A. A new Robertsonian translocation 8/23 in cattle / / Proc. 10th Europ.Coll.Cytogenet.Domest.Anim. - 1992. - p.32.

16. Graphodatsky A., Biltueva L., Eremina V., Sablina O., Vorobjeva N., Lushnikova Т., Adarichev V., Dymshits G., Shvets Yu., Kisselev L. Localization of some genes to mammalian chromosomes by in situ hybridization // Proc. 10th Europ.Coll. Cytogenet.Domest.Anim. - 1992. -p.6.