Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картрирование генов свиньи с помощью различных типов межвидовых клеточных гибридов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Картрирование генов свиньи с помощью различных типов межвидовых клеточных гибридов"

На правах рукописи УДК 575.116.4:575.222.7:636.4

ИВАНОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ СВИНЬИ С ПОМОЩЬЮ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ МЕЖВИДОВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ГИБРИДОВ

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

РГ6 од

1 з ДЕК 7ппа

Новосибирск 2000

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, в лаборатории генетических основ онтогенеза, г. Новосибирск

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Жданова Н.С.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

член-корреспондент РАН Корочкин Л.И.

Институт биологии гена РАН, г. Москва

кандидат биологических наук Саблина ОБ.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН,

Г. Москва

Защита диссертации состоится « £~у> А^___2000 года

на утреннем заседании диссертационного обвета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в конференц-зале Института цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10. Тел. 33-12-78, факс: 33-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « » О/С; 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук " Груздев А.Д.

EW-M.O.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Эра интенсивного картирования хромосом млекопитающих началась более 30-ти лет назад с открытия явления сегрегации хромосом в межвидовых гибридах соматических клеток. Специальные наборы клеточных гибридов, названные панелями, позволяли картировать на хромосомы маркеры различных типов, проявлявшие межвидовой полиморфизм, а гибриды с хромосомными перестройками использовались для субхромосомной локализации генов.

На сегодняшний день свинья домашняя (Sus scrofa domestica L.) является одним из наиболее интенсивно картируемых видов. В отличие от цитогенетических карт большинства вовлеченных в картирование видов, которые были построены на основе панелей гибридов соматических клеток, к началу данного исследования основные локализации на хромосомы свиньи были сделаны с помощью гибридизации in situ (Yerle et al., 1995). Это было связано с тем, что имеющиеся соматические гибриды свиньи с традиционными партнерами -мышью и китайским хомячком - имели нестабильный хромосомный состав и содержали множественные хромосомные перестройки (Rettenberger et al., 1S94; Yerle et al., 1996; Zijlstra et al., 1996).

Решение проблемы было найдено в применении современных методов молекулярной цитогенетики для описания перестроек в гибридах свинья - грызуны, и сегодня более половины генов нанесено на цитогенетическую карту свиньи с помощью гибридов соматических клеток. Однако, для большинства из них локализации следует рассматривать как предварительные, т.к. они получены на одной панели гибридных клеток (Yerle et al., 1996). Кроме того, по-видимому, не все присутствующие перестройки хромосомного материала свиньи, особенно небольшого размера, были выявлены в силу особенностей метода обратной гибридизации in situ, использовавшейся для идентификации хромосом в этой панели. Поэтому по-прежнему существует необходимость, во-первых, в создании более стабильных и менее склонных к перестройкам клеточных гибридов свиньи, и, во-вторых, в более тонких и точных методах анализа хромосомных перестроек в гибридах.

В лаборатории генетических основ онтогенеза был получен новый тип клеточных гибридов свинья-американская норка, имеющих достаточно стабильный хромосомный состав и

небольшое число перестроек и фрагментации хромосом (Астахова и др., 1994; Zhdanova et al., 1994). Среди полученных гибридов выделялся малохромосомный класс, позволивший создать уникальный набор клеточных линий, содержащих единственную хромосому свиньи (Zhdanova et al., 1996). Он перспективен для работ по картированию, получению хромосомо-специфических библиотек свиньи или позиционному клонированию. Одной из возможностей использования таких линий, надежно охарактеризованных цитогенетическими и молекулярными методами, также является проведение радиационного картирования отдельных хромосом свиньи или их районов (Сох et al., 1990; James et al., 1994). Этот подход базируется на создании панелей гибридных клонов (РГ панелей), полученных от слияния радиационно-облученных донорских клеточных линий с необлученными клетками реципиента.

В последние годы метод межвидовой соматической гибридизации получил буквально «второе рождение» в связи с активным вовлечением в картирование радиационных клеточных гибридов. Метод позволяет проводить локализации с точностью до нескольких сот п.н., не требуя внутривидового полиморфизма маркеров и, таким образом, обеспечивая интеграцию в единую карту высокополиморфных и эволюционно-консервативных маркеров и, в итоге, создание единой карты вида.

К началу настоящего исследования РГ панели существовали только для человека и мыши (Sefton et al., 1992; Hudson et al., 1995; Gyapay et al., 1996). Геномная РГ панель свиньи, как и нескольких других видов млекопитающих, была создана позднее (Yerle et al., 1998). Однако на нее, как и на генетическую карту свиньи, до сих пор нанесены в основном гипервариабельные маркеры. Создание таких «микросателлитных» карт важно для планирования маркер-опосредованной селекции, но оно не позволяет проводить сравнительное картирование. Таким образом, насыщение геномной карты свиньи генами, определение их порядка в хромосомах и установление минимальных эволюционно-консервативных районов геномов млекопитающих сегодня является наиболее актуальной задачей.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлось расширение области применения межвидовых гибридов соматических клеток для картирования хромосом свиньи.

Непосредственной задачей исследования было пополнение коллекции монохромосомных клеточных гибридов свиньи, развитие способов идентификации генетического материала картируемого вида в клеточных гибридах, а также создание панели РГ клонов для картирования у свиньи маркеров из высоко консервативного района, гомеологичного 11р1ег<|1.3 району генома человека.

Для достижения цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1). Получить клеточную гибридную линию, содержащую единственную хромосому свиньи на фоне хромосом норки, и провести ее полную цитогенетическую характеристику.

2). Провести идентификацию генетического материала свиньи в гибридном клоне Э\/36, используя микродиссекцию перестроенных хромосом, создание пейнтинг проб и их супрессионную гибридизацию на хромосомы свиньи. Использовать охарактеризованный клон для региональной локализации нескольких генов и микросателлитов свиньи.

3). Получить радиационную гибридную панель клонов путем слияния облученных клеток гибридной линии, содержащей одну хромосому 2 свиньи, с клетками китайского хомячка.

4). Охарактеризовать полученную РГ панель методами молекулярной цитогенетики для выявления закономерностей сохранения фрагментов хромосомного материала донора в РГ линиях. Отобрать клоны с небольшим числом фрагментов хромосомы 2 свиньи для субхромосомного картирования.

5). С помощью полученной панели локализовать на радиационную карту р плеча хромосомы 2 свиньи ряд микросателлитных и генных маркеров. Провести сравнение генетической, радиационной и цитогенетической карт этого района генома свиньи.

6). Провести сравнительный анализ порядка генов в исследуемом районе генома свиньи и гомеологичном районе генома человека.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые получена клеточная линия, содержащая единственную хромосому свиньи 9 на фоне хромосом норки и пополнившая уникальную коллекцию монохромосомных клеточных гибридов свиньи. Линия охарактеризована цитогенетически и с помощью ПЦР-маркера.

Впервые для идентификации хромосомных перестроек в клеточных гибридах использован метод микродиссекции

перестроенных хромосом с последующей обратной in situ гибридизацей ПЦР продукта диссектированного материала на хромосомы свиньи, что позволило провести региональную локализацию генов ТК1 и UMPH2 и одного микросателлита в 12pter-p1.5 район генома свиньи.

Впервые создана РГ6000 панель для физического картирования хромосомы 2 свиньи, состоящая из 118 РГ клонов. Панель охарактеризована цитогенетически с помощью методов гибридизации in situ с суммарной ДНК свиньи и норки, а также обратной гибридизации in situ. Отобраны 3 клона с надежно идентифицированными фрагментами хромосомы 2 свиньи для регионального картирования.

Впервые построена РГ карта р плеча хромосомы 2 свиньи, включающая 15 микросателлитов и 5 генов: CAPN1, FSHB, LDHA, MYOD1 и РТН, и проведено сравнение порядка генов в этом районе и гомеологичном районе генома человека 11pter-q1.3. Установлена идентичность порядка генов с инверсией относительно теломеры и изменением положения центромеры.

Практическая ценность построения радиационой карты, упорядочивающей микросателлитные и генные маркеры, состоит в повышении возможностей позиционного клонирования экономически важных локусов и оптимизации селекционно-генетических работ. Картирование генов LDHA, CAPN1, FSHB, MYOD1 и РТН, дефекты которых вызывают тяжелые наследственные заболевания, связанные с нарушениями обмена веществ, репродуктивных функций и злокачественными новообразованиями у человека имеет большое экономическое значение и у сельскохозяйственных животных.

Материалы диссертации используются при чтении учебного курса «Цитогенетика» в Новосибирском государственном университете.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на 12-ом Европейском коллоквиуме по цитогенетике домашних животных (Сарагоса, Испания, 1996), на 10-ом Североамериканском коллоквиуме по генетическому картированию и цитогенетике человека и домашних животных (Апалачикола, США, 1997), на 6-ой Международной конференции по геному человека и животных (Сан-Диего, США, 1998), на 2-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000), на 8-ой Международной конференции по

геному человека и животных (Сан-Диего, США, 2000), на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН.

По материалам диссертации опубликовано 10 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18-тью рисунками и содержит 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы следующие линии: 1) перевиваемая линия MVTIC эмбриональных фибробластов американской норки (Mustela vison), дефицитная по активности тимидинкиназы (ТК); 2) лейкоциты свиньи, полученные от годовалых особей породы Ландрас или взрослых особей породы мини; 3) перевиваемая линия Ад17-1 фибробластов китайского хомячка, дефицитная по активности гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HPRT).

Фибробласты норки и лейкоциты свиньи сливали по методике Девидсона и Джеральда (Davidson and Gerald, 1976) с модификациями. РГ клоны получали по методу Кокса с соавторами (Сох et al., 1989). Цитогенетические исследования проводили по стандартным методикам. Выделение высокомолекулярной ДНК из клеток печени свиньи или клеточных культур делали по общепринятой методике (Маниатис и др., 1984). Зонды метили биотином-11-дУТФ или дигоксигенином-11-дУТФ методом ник-трансляции с использованием ДНК полимеразы 1/ДНК-азы 1 по протоколам кита (Kit No.Nick-1, Nick translation system, Sigma). Мечение зондов биотином в Inter-SINE ПЦР и получение Cotí ДНК свиньи проводили согласно методике Томсена и Ждановой (Thomsen and Zhdanova, 1995). Прямую и обратную гибридизацию in situ проводили по известной методике (Lichter et al., 1988) с рядом модификаций. Для статистической обработки РГ данных использовали пакет программ RHMAP (версия 3.0) (http://www.sph.umich.edu/group/statgen/software/).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и анализ гибридной клеточной линии с одной хромосомой свиньи

Один из полученных в результате слияния клеток норки MVTK- с лимфоцитами периферической крови свиньи клон SV50 по данным гибридизации in situ с 3Н-меченой суммарной ДНК

свиньи содержал пять хромосом картируемого вида. В результате нескольких этапов субклонирования этой линии в ростовой среде и среде с добавлением 5-бром дезоксиуридина был получен гибридный клон Б\/50В12-2-1, несущий практически во всех клетках единственную хромосому 9 свиньи (рис. 1А).

А Б В

Рис. 1. Гибридная клеточная линия SV50B12-2-1. Стрелками указана хромосома 9 свиньи. (А) GTG-окрашивание, (Б) гибридизация in situ биотинилированной суммарной ДНК свиньи на хромосомы клона, детекция щелочной фосфатазой, (В) обратная гибридизация in situ на нормальные хромосомы свиньи, детекция FITC.

Чтобы подтвердить присутствие в клеточной линии единственной хромосомы 9 и исключить наличие других хромосом свиньи или их фрагментов была проведена гибридизация in situ с биотинилированной суммарной ДНК свиньи на хромосомы клона (рис. 1Б) и обратная гибридизация Inter-SINE ПЦР продукта ДНК клона на хромосомы свиньи (рис. 1В). Было показано, что клеточная линия SV50B12-2-1 действительно содержит только 9-ую хромосому свиньи. Следует отметить, что мечение хромосом 9 после обратной гибридизации in situ было практически равномерным по всей длине хромосом.

Кроме того, в клоне было установлено наличие микросателлита SW1349, локализованного крайним на генетической карте свиньи USDA-MARC2 в хромосоме 9 (Rohrer et al., 1996, http://sol.marc.usda.gov/). Этим подтверждается интактность теломеры q плеча хромосомы 9 в клоне.

Таким образом, имеющийся в лаборатории генетических основ онтогенеза набор монохромосомных гибридных клеточных линий свинья-норка, содержащий единственные 2, 5, 8, 12 и t(1;13) хромосомы свиньи, был пополнен еще одним гибридным

клоном с интактной хромосомой 9 свиньи. Использование этих клонов позволило картировать ряд новых генов свиньи и получить независимые данные по локализации ранее картированных генов (Thomsen and Zhdanova, 1995; Zhdanova et al., 1996, Кузнецов и др., 1998; Koroleva et al., 1998). В этом случае локализации были переведены из разряда «предварительных» в «окончательно установленные». Пейнтинг пробы, полученные в результате Inter-SINE ПЦР ДНК клонов, могут быть использованы для выявления перечисленных выше хромосом и их фрагментов в любых клеточных гибридах.

Использование нового подхода для анализа сложных хромосомных перестроек в гибридах соматических клеток

Цитогенетический анализ клона SV36 показал, что во всех его клетках кроме стандартных для культуры MVTK хромосом норки присутствуют две отличающиеся по размеру небольшие акроцентрические хромосомы. В 30% клеток клона встречалась микрохромосома. Гибридизация in situ 3Н-меченой суммарной ДНК свиньи на хромосомы гибридного клона показала, что упомянутые выше хромосомы содержат ДНК свиньи. Анализ GTG-дифференциальной исчерченности этих хромосом не давал однозначного ответа на вопрос об их происхождении. Однако, можно было предположить, что меньшая из акроцентрических хромосом представляет собой короткое плечо 12-ой хромосомы свиньи.

Для анализа перестроек был использован нетрадиционный подход, сочетающий микродиссекцию перестроенных хромосом, создание пейнтинг проб и их супрессионную гибридизацию на хромосомы свиньи (Рубцов и др., 1998). Он показал, что в состав большей акроцентрической хромосомы входит 5 различных хромосомных районов свиньи: 15q1.0-q2, 6q21-q23; 13q21; 13q22, 7q25-qter, меньшей - 3: 4p12-p13; 16q12-14 и 12pter-p15, a микрохромосома происходила из Xp11-q11. Связь генаТК1, также как и тесно сцепленного с ним в геноме человека гена UMPH2, с р плечом хромосомы 12 свиньи была установлена ранее (Zhdanova et al., 1994; Thomsen and Zhdanova, 1995). В клоне SV36 и его субклонах наличие активной ТК коррелировало с сохранением меньшего акроцентрика, аналогичная корреляция наблюдалась и при анализе клонов на присутствие гена UMPH2 свиньи. Использованный нами метод выявил в составе меньшего акроцентрика лишь небольшой район хромосомы 12,

происходящий из терминального бэнда ее короткого плеча. Эти данные свидетельствуют о возможной локализации генов ТК1 и UMPH2 свиньи в pter-p15 районе хромосомы 12. Проведенный анализ 6-ти микросателлитов с генетической карты свиньи USDA MARC2 (http://sol.marc.usda.gov/): SW2490, S0143, SW957, SW874, S0090 и S0106, подтвердил правильность идентификации данного района и позволил локализовать в него микросателлит S0143.

Идентификация в клеточных гибридах сложных хромосомных перестроек, а особенно "псевдохромосом", ранее часто находилась за пределами возможностей экспериментатора. Приведенный здесь анализ является первым случаем успешного решения этой проблемы. Кроме того, в ходе проведения работ такого рода собирается коллекция ДНК-библиотек различных хромосом и их районов, которые могут найти широкое применение как при изучении организации хромосомных районов, так для анализа и скрининга соматических гибридов и их субклонов.

РГ картирование р плеча хромосомы 2 свиньи

Р плечо хромосомы 2 свиньи представляет собой высоко консервативный район, по данным гетерологичного пейнтинга гомеологичный 11pter-q1.3 району генома человека (Goureau et al., 1996). В настоящее время на эту хромосому свиньи нанесено 35 генов и 27 микросателлитных маркеров (http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/cyto/genmar/htm/2GM.HTM). Большинство из них картированы регионально с помощью гибридизации in situ и гибридов соматических клеток. Однако, из-за перекрывания районов локализаций и недостаточного разрешения гибридной клеточной панели (Yerle et al., 1996), использовавшейся для регионального картирования, очень малое число локализованных на этой хромосоме маркеров может быть упорядочено. В то же время, для создания подробных карт и нанесения на них локусов количественных признаков, имеющих большое практическое значение, а также для целей сравнительного картирования необходимо установление точного порядка генов. Для выявления минимальных эволюционно-консервативных районов необходимо было провести сравнение гомеологичных районов геномов свиньи и человека, опираясь на порядок генов, полученный путем РГ картирования (Иванова и ДР., 2001).

Для создания РГ панели гибридную линию SV27B1, содержавшую единственную хромосому свиньи 2 на фоне хромосом норки, облучали дозой 6000 рад и сливали с клетками

китайского хомячка линии Ад 17-1, дефицитными по HPRT. В результате было получено 118 независимых клеточных гибридов.

Для составления РГ карты р плеча хромосомы 2 свиньи были отобраны 17 микросателлитных и 5 генных маркеров. Микросателлиты и ген FSHB были ранее локализованы на генетической карте свиньи USDA MARC2 (http://sol.marc.usda.gov). Они почти равномерно покрывали 2р плечо, среднее расстояние между маркерами составило 3,9 сМ. Четыре гена - РТН, LDHA, MY0D1 и CAPN1 - были локализованы только на цитогенетической карте хромосомы 2 свиньи (http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/cyto/genmar/htm/2GM.HTM). Все проанализированные гены картированы в районе хромосомной гомеологии 11pter-q1.3 генома человека

(http://www.ncbi.nim.nih.gov/genemap99). ПЦР анализ маркеров показал, что 61 из 118 клонов был позитивным хотя бы по одному из них. Результаты ПЦР анализа с праймерами, специфичными для генов FSHB и MY0D1, представлены на рисунке 2.

бООп.н

А

200п н.

н 27 с

л н 27 с х

Рис. 2. Результаты ПЦР анализа части клонов из РГ панели со специфическими праймерами для генов FSHB (А) и MY0D1 (Б). Обозначения: с -свинья, н - норка, х - хомяк, 27 - клон SV27B1, + -положительный клон, -- отрицательный клон, л - линейка по 100 п.н.

Средняя частота сохранения маркеров составила 18.3%, причем она колебалась от 12.7% для маркера SW2167 и до 31.4% - для маркера SW256 (рис. 3).

Для цитогенетической характеристики РГ панели в 8 клонах была проведена флуоресцентная in situ гибридизация с суммарной ДНК свиньи, и в 3-х из этих клонов - с ДНК норки. Для определения происхождения хромосомного материала свиньи в этих клонах была проведена обратная гибридизация Inter-SINE ПЦР продукта каждого клона на хромосомы свиньи.

Как показал цитогенетический анализ, хромосомный состав свиньи в половине клонов, а норки - во всех, гетерогенен, что

сМ о -

SW2443

~SWC9 SW2516

■ SW2623

■ SW256

— SWR783 SWR1910 SW2445

SW575

SO 141

SW2513

— SW1201 SW1686

■ SW240

■ SW2167 -SO 170

SW1564

- CA PNI

- PT1I

■ LDHA

■MYOD1

—I—

02

—I—

0 3

говорит об идущей сегрегации хромосомных фрагментов донора.

Фрагменты хромосом свиньи в основном присутствовали в клонах в транслоцированном состоянии. Только в одном клоне во всех клетках присутствовал полностью меченый фрагмент ДНК свиньи, сохранившийся, по-видимому, за счет собственной центромеры.

Отсутствие феномена избирательного сохранения центромеры в полученных РГ клонах подтверждают также данные о частоте сохранения микросателлитов: мы не наблюдали повышения

частоты сохранения маркеров в центромерном и теломерном районах (рис. 3). Аналогичная ситуация

наблюдалась в геномной РГ панели свиньи (Hawken et al., 1999), где не было замечено избирательного сохранения маркеров, кроме района, содержащего селективный маркер. В то же время для РГ панелей человека (Kumlien et al., 1996) и коровы (Schlapfer et al., 1997) показано повышение частоты сохранения маркеров из центромерных и теломерных районов почти в два раза по сравнению со средней. Проведенная для одного из клонов двухцветная FISH, т.е. одновременная гибридизация ДНК и свиньи, и норки, показала, что, скорее всего, фрагменты генетического материала свиньи интегрируют с фрагментами хромосом другого донорского вида - норки.

Для подтверждения правильности идентификации фрагментов хромосомы 2 свиньи, сохранившихся в клонах, в этих восьми клонах было дополнительно проанализировано 12 микросателлитов из карты USDA MARC2, равномерно распределенных по q плечу хромосомы 2 свиньи.

Стабильные по хромосомному составу свиньи клоны R23

Рис. 3. Частота сохранения маркеров в РГ6ооо панели (по оси абсцисс), положение маркера на генетической карте иЭОА МАЯС2 (по оси ординат).

(рис. 4), Р?26 и Р28 могут быть использованы для регионального картирования этой хромосомы свиньи. В них число, размер и

А Б

Рис. 4. РГ клон R23. (А) FISH с меченой биотином суммарной ДНК свиньи на хромосомы клона, (Б) обратная гибридизация in situ. Стрелками указаны районы мечения.

происхождение фрагментов, установленные методом обратной гибридизации in situ, были подтверждены данными ПЦР анализа микросателлитов. Панель соматических гибридных клеток свиньи, полученная Йерль с соавторами (Yerle et al., 1996), содержит 4 гибридных клона с 5-тью фрагментами хромосомы 2 свиньи. Добавление к ним трех детально описанных клонов из РГбооо панели может существенно повысить степень разрешения регионального картирования хромосомы 2.

Двухточечный анализ данных с помощью программы RH2PT (первая часть программы RHMAP) показал, что при LOD score > 2 все локусы формируют единую группу сцепления. При LOD score > 3 маркеры распались на две группы сцепления: в первой находились четыре микросателлита, расположенных на генетической карте ближе к теломере, во второй - одиннадцать микросателлитов и все пять генов. Микросателлиты SW256 и SW575 остались не сцепленными (рис. 5).

Сравнение порядка микросателлитов, полученного путем многоточечного анализа с помощью программы RHMAXLIK, с их порядком на генетической карте (рис. 5А) показало, что для 15-ти из 17-ти маркеров их относительное расположение совпадает. При этом порядок микросателлитов в первой группе сцепления был определен с высокой степенью вероятности (большей, чем 1000 к 1 по сравнению со следующим) и больше не

анализировался. Для микросателлитов Э\Л/2513 и 5\Л/240, локализованных в позиции 42 сМ на иэОА MARC2, по-видимому, панель гибридных клонов оказалась недостаточно информативной, их положение не соответствовало порядку маркеров на генетической карте. Согласно многоточечному анализу порядок для этих микросателлитов должен был быть следующий: 1ек..-3\Л/256-8)Л/240^2513-5\Л/Р783-...-сеп. Для анализа ситуации был применен «квази-филогенетический» метод сравнения различных порядков на РГ картах с помощью необработанных данных (Вагепйэе е! а1., 2000). Он показал, что порядки микросателлитов на РГ и генетической картах на самом деле одинаковы, но во избежание дальнейших конфликтов при многоточечном анализе совместного распределения микросателлитов с генами, маркеры 5\/\/2513 и были

исключены из дальнейшего анализа.

ЭИШ 6/ 50170

1.1

В

А Б

Рис. 5. Генетическая (А), радиационная (Б) и цитогенетическая (В) карты р плеча хромосомы 2 свиньи.

Определение порядка маркеров во второй группе сцепления и оценка расстояний между ними были проведены с помощью многоточечного анализа двумя способами (табл. 1). В первом случае маркеры внутри группы сцепления анализировались с помощью программы КИМ^ВИК, которая ранжировала все возможные порядки локусов по возрастанию

Табл. 1. Порядки локусов во второй группе сцепления РГ6000 карты 2р-района генома свиньи, полученные двумя способами многоточечного анализа программы ИНМАР.

№ Ш* Отнош. Кол. раз Порядок локусов

вероят. рывов

полученный с использованием программ РНМ1ЫВКК и Р^НМАХиК (первый способ)

1 0,0000 1,0 66 САРЖ-5У\/К783,5\Л/Н1910-РТН-8\Л/2445-80141 -8\Л/1201 -8\Л/1686-Р8НВ-8\Л/1564-

ШНА,8\Л/2167-80170-МУ001

2 1,2946 19,7 68 CAPN1-SWR783,SWR1910-PTH-SW2445-S0141-SW1201-SW1686-SW1564-FSHB-

ЬРНА, б\Л/2167-50170-МУСЮ1

3 1,3938 24,8 68 САРЫ1-8\Л/Р783,8\/\^1910-РТН-8\Л/2445-80141 -8\Л/1201-РЗНВ-8\Л/1686-5\Л/1564-

LDHA,SW2167-S0170-MYOD1

4 1,5821 38,2 70 SWR783,SWR1910-CAPN1-PTH-SW2445-S0141 -Э\ЛМ 201-SW1686-FSHB-SW1564-

1_ОНА,8\Л/2167-80170-МУСЮ1

5 1,9427 87,6 68 САРЫ1-SWR783,SWR1910-PTH-SW2445-80141-FSHB-SW1201-SW1686-SW1564-

LDHA,SW2167-S0170-MYOD1

полученный с использованием программы Е^НМАХИК (второй способ)

1 0,0000 1,0 41 CAPN1-SWR783,SWR1910- 8\Л/2445-50141-8\Л/1201-8УУ1686- SW1564- SW2167-S0170

2 1,9325 85,6 45 SWR783, SWR1910-С АР N1 - SW2445-S0141-SW1201-SW1686- 8\Л/1564- SW2167-S0170

1 0,0000 1,0 45 SWR783,SWR1910-PTH-SW2445-S0141-SW1201 -8\Л/1686- SW1564-SW2167-80170

2 1,2550 18,0 43 PTH-SWR783,SWR1910- 3\Л/2445-80141 -8\Л/1201 -Б\Л/1686- SW1564-SW2167-S0170

3 1,3086 20,3 43 SWR783,S\A/R1910-Э\/У2445-80141-SW1201-SW1686- в\Л/1564-5\Л/2167-в0170-РТН

1 0,0000 1,0 42 SWR783,SWR1910- SW2445-S0141-SW1201-SW1686-FSHB-SW1564-SW2167-S0170

2 1,4041 25,4 44 SWR783,SWR1910- 8\Л/2445-80141-8\Л/1201-Р5НВ-3\Л/1686- SW1564- SW2167-S0170

3 1,4456 27,9 45 5У\ЛЧ783,8\Л№?1910- SW2445-S0141-SW1201-SW1686-SW1564-FSHB-SW2167-S0170

4 1,9464 88,4 44 SWR783,SWR1910- SW2445-S0141-FSHB-SW1201-SW1686- SW1564- Э\Л/2167-80170

1 0,0000 1,0 46 SWR783,SWR1910- SW2445-S0141-SW1201-SW1686-SW1564-SW2167-S0170-MYOD1

2 2,1314 135,3 52 8\ЛШ83,3\Ш1910- SW2445-S0141-SW1201 -3\Л/1686~8\Л/1564- 8\Л/2167-МУСЮ1 -Б0170

- 1одю функции правдоподобия

числа обязательных хромосомных разрывов. Двадцать лучших полученных порядков были включены в анализ с использованием программы КНМАХЫК. В качестве стратегии упорядочения локусов в программе был применен параметрический метод максимума правдоподобия. При использовании второго подхода к рамке из микросателлитов по одному добавляли гены и выбирали для каждого гена порядок с наилучшей функцией правдоподобия (табл. 1).

Итоговый порядок генов относительно микросателлитов совпал с лучшим порядком, полученным при использовании первого подхода (рис. 5Б). Длина карты оказалась равной 71.2сР для первой группы сцепления и 414.4сР - для второй. Следует отметить, что длины групп сцепления, полученные при суммировании расстояний, определенных двухточечным анализом, не сильно отличались от приведенных выше (69.5сР и 447.4сР, соответственно).

На РГ карте разделились две пары маркеров, локализованных на генетической карте в одном месте: маркеры Э\/\/2443 и 8\Л/2516 (ОсМ на генетической карте) находились на расстоянии 31.8сР; маркеры 8\Л/2445 и Э0141 (9.8сМ) - на расстоянии 2.1сР. И, напротив, по микросателлитам 8\Л/К783 и 8\Л/Р1910 в панели не было дискордантных клонов, и они не разделялись на РГ карте, в то время как на генетической карте они находились на расстоянии 1сМ (рис. 5А, Б).

Положение гена РЭНВ на генетической карте было подтверждено нашими данными. С высокой точностью была определена локализация гена ШНА: он не имел дискордантных клонов с микросателлитом 8\Л/2167 и не разделялся с ним на РГ карте. Достаточно надежно установлен порядок остальных генов, за исключением РТН. Статистический анализ показал лучшее положение гена между микросателлитами 8\Л/Р783(8\Л/1Ч1910) и 8\Л/2445, однако, был установлен еще один порядок, всего в 20 раз менее вероятный, при котором РТН локализовался в районе центромеры, последним во второй группе сцепления (табл.1). РТН являлся единственным геном, локализованным в 2р-районе геномной радиационной карты свиньи (На\л/кеп е* а!., 1999), где он также находился в прицентромерном районе. Использование "квази-филогенетического" метода обсчета необработанных данных нашей панели указало на более вероятное положение гена РТН крайним во второй группе сцепления.

р

PGA IGF2

На цитогенетической карте РТН был локализован только с точностью до хромосомы (Rettenberger et al., 1996). Положение генов CAPN1, FSHB и LDHA не противоречило их локализации на цитогенетической карте (рис. 5В). Ген MYOD1 на ней был картирован в районе р1.4-1.7 (Cepica et al. 1999), однако эта локализация является предварительной, как полученная только одним методом и одной группой исследователей. Исходя из наших результатов, нам кажется более вероятным положение гена ближе к центромере, в районе хромосомного бэнда р1.1 (рис. 5В).

Сравнение итогового

порядка генов с таковым в гомеологичном районе генома человека, установленном также методом РГ картирования, показало, что они идентичны (рис. 6). Привлечение к этому сравнению генов, локализованных на цитогенетических картах человека и свиньи, позволяет сделать предположение о наличии точки разрыва - слияния между генами IGF2 и PGA на SSC2 относительно HSA11 и произошедшей инверсии

относительно теломеры.

Необходимо отметить, что для теломерных районов была показана более высокая скорость эволюционных перестроек, чем для остальных участков генома (Larsen et al., 1999; Rubtsov et al.,

CAPN1 —

FSHB LDHA MYOD1

PTH

?cen->-

\

q

-■PGA

• CAPN1

-<-cen

FSHB

LDHA

MYOD1

PTH

q

SSC2

IGF2 P

HSA11

Рис. 6. Сравнение порядка генов в 2р районе генома свиньи и гомеологичном районе генома человека. ББСг - хромосома 2 свиньи, НБАИ -хромосома 11 человека.

2000).

ВЫВОДЫ

1. Получена и охарактеризована цитогенетически и с помощью ПЦР-маркера гибридная клеточная линия, содержащая единственную хромосому свиньи 9 на фоне хромосом норки. Пополнена уникальная коллекция монохромосомных клеточных линий свинья - норка, являющаяся ценным инструментом в картировании хромосом свиньи.

2. Впервые для идентификации хромосомных перестроек в клеточных гибридах использован метод микродиссекции перестроенных хромосом с последующей супрессионной in situ гибридизацей ПЦР продукта диссекгированного материала на хромосомы свиньи. В результате проведена региональная локализация генов ТК1 и UMPH2 и микросателлита S0143 в pier-pi .5 район хромосомы 12 свиньи.

3. В результате слияния облученной клеточной линии, содержащей хромосому 2 свиньи на фоне хромосом норки, с клетками китайского хомячка получена состоящая из 118 клонов РГ6ооо панель для радиационного картирования хромосомы 2 свиньи.

4. Панель охарактеризована цитогенетически с помощью методов гибридизации in situ с суммарной ДНК свиньи и норки, а также обратной гибридизации in situ. Отобраны 3 клона, которые могут быть использованы для регионального картирования.

5. Построена РГ карта р плеча хромосомы 2 свиньи, включающая 15 микросателлитов и 5 генов: CAPN1, FSHB, LDHA, MYOD1 и РТН. Проведена интеграция генетической, радиационной и цитогенетической карт этого района.

6. Сравнение полученного порядка генов в 2р-районе генома свиньи с порядком генов в гомеологичном районе генома человека показало их идентичность, а привлечение литературных данных позволило сделать предположение об инверсии этого района, произошедшей относительно теломеры.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Zhdanova N.S., Thomsen P.D., Astakhova N.M., Kuznetsov S.B., Plyusnina (Ivanova) E.V., Serov O.L. Production of pig-mink cell hybrids with single pig chromosomes 2, 5, 12 or t(1;13) // Mammalian Genome. 1996. V.7. P.613-615.

2. Zhdanova N.S., Thomsen P.D., Plyusnina (Ivanova) E.V, Astakhova N.M., Kuznetsov S.B., Jorgensen C.B., Serov O.L. Partial collection of pig-mink cell hybrids with single pig chromosomes. // 12th European Colloquium on Cytogenetics of Domestic Animals. Archivos de zootechia. 1996. V.45. P.367-370.

3. Zhdanova N.S., Kuznecov S.B., Plyusnina (Ivanova) E.V., Rybtsov N.B., Larkin D.M., Serdyukova N.A., Graphodatsky A.S. Regional localization of three genes on porcine chromosome 12 // 10th North American Colloqium on Gene Mapping and Cytogenetics in Human and Domestic Species Abstract Booklet. 1997. P.35.

4. Рубцов Н.Б., Плюснина (Иванова) Е.В., Сердюкова H.A., Астахова Н.М., Билтуева Л.С., Кузнецов СБ, Графодатский A.C.. Жданова Н.С. Новые возможности анализа сложных хромосомых перестроек в клеточных гибридах // Генетика. 1998. Т.34. С.46-53.

5. Кузнецов С.Б., Ларкин Д.М., Кафтановская Е.М., Иванова Е.В., Астахова Н.М., Черяукене О.В., Жданова Н.С. Хромосомная локализация и анализ синтении некоторых генов у свиньи, коровы и овцы (отряд Artiodactyla). // Генетика. 1998. Т.34. С. 1-5.

6. Denis М. Larkin, Sergei В. Kuznetsov, Helen Kaftanovskaia, Helen Ivanova, Natalia Zhdanova. Mapping of several HSA17 genes in pigs, cattle, and sheep // Plant and Animal Genome VI abstracts guide, 1998, P. 109.

7. Koroleva I.V., Malchenko S.N., Shukri N.M., Ivanova E.V., Kuznetsov S.B., Zhdanova N.S, Bendixen C. Assignment of five porcine genes by pig-mink cell hybrids to pig chromosomes 2, 5, 8, 12 // Mammalian Genome. 1998. V.9. P.913-914.

8. Ivanova E.V., Kuznetsov S.B., Koroleva I.V., Bendixen C., Zhdanova N.S. A radiation hybrid map of porcine chromosome 2p // Plant and Animal Genome VIII Conference, January 2000, San-Diego.

9. Жданова H.C., Иванова E.B., Кузнецов С.Б., Аксенович Т.И., Свищева Г.Р., Астахова Н.М. Картирование хромосомы 2 свиньи // II съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, тезисы докладов. 2000. Т.2. С.37.

10. Иванова Е.В., Кузнецов С.Б., Королева И.В., Свищева Г.Р., Аксенович Т.И., Жданова Н.С. Радиационная карта короткого плеча хромосомы 2 свиньи // Генетика. 2001. Т.37. №2.

Подписано к печати 28.09.2000г.

Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 121.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.