Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение асимметричных соматических гибридов в роде Nicotiana и анализ организации их геномов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение асимметричных соматических гибридов в роде Nicotiana и анализ организации их геномов"

академия наук беларуси институт генетики и цитологии

на правах рукописи

короста!!! марина александровна

получше лаагштрпчних ашиштах пшрядоз в РОД8 ШООПАНА и /ШАЛО СВТ.ЧгаДЩП! ИХ ГЕККХЗ

Специальность 03.00.1Б - Генетика

автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ГЬапзк - 1992

Работа выполнена в отделе цитофизиологии и клеточной инженерии Института клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины.

Научный руководитель - академик АН Украины, доктор биологических Наук, профессор ГЛЕБА Ю. КХ

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Ведущая организация - Киевский государственный университет

час на заседании специализированного совета к ооб. 02.и по эашите диссертаций на соискание ученой степени кгндидаиа биологических наук в Институте генетики и цитологии АН Беларуси по адресу: 220734, Г.Минск, ул. Ф. Скоринн, 27

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. ЯКоласа

Автореферат разослан " / " г.

Ученый секретарь ' специализирошнного совета

К 006.02. С1, кандидат биологических наук Е. Е Лобанок

ДАВЫДЕНКО 0. Г. ■ доктор биологических наук ташис к. к.

им. Т. Г. Шэвченко

Залита состоится

fi'Hb.'l'.ä'Ji.:..

общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Создание асимметричных соматических гибридов, т.е. гиоридов, содержащих наряду о полным набором хромосом реципиента небольшую часть генома донора в виде отдельных хромосом или хромосомных фрагментов, находится в центре внимания многих последователей ( iileba etal. , 1933; Vi jbi arid 1 et al., 1SS0; Mälzer, O'Ccnnel, IM")

Для получения «симметричных соматических гиоридов применяют различные химические и физические агенты. Наиболее часто используют предварительное облучение клеток одного из родителеrt рентгеновскими или гамма-лучами. Следовательно, чтобы направлять процесс элиминации хромосом в гибридах, необходимо уточнить идеи представления о тем, ьч-.ким образом воздействует радиация на генетический аппарат растительных клеток. Целесообразным представляется выяснить каков вклад собственно облучения в процесс индуцированной элиминации хромосом при получения асимметричных соматических гибридов, так как известно, что элиминация возможна и в связи с несовместимостью геномов филогенетически отдаленных видов.

Конструирование асимметричных соматических гибридов предоставляет исследователю уникальную возможность сохранять облученные суперлетальными дозами геномы при слиянии облученных клеток с необлученшдш. Известно,что мишенью рентгеновского и гамма-облучения является, в первую очередь, дезоксирибонуклеиновая кислота ( ДНК ), в которой возникают многочисленные перестройки, обусловленные ошибочной репарацией одно- и двунитевьгх разрывов. Обнаружено возникновение внутригеномных рекомбинаций и трансло-кациЛ на хромосомах облученного родителя в гибридных геномах, что нуждается в дальнейиих исследованиях.

Недостаточно изученным у асимметричных соматических гибридов является влияние облученного генома на геном или геномы необ лученного партнера.

Нель и задачи исследования. В связи с вышеперечисленны1'!' проблемами ц°льп данного исследования являлось изучение организации ядерных геномов асимметричных соматических гибридов, полученных с применением гаммасбдучечия в ¡треком диапазона

Для достижения поставленной цели необходимо было р'-гпгге следующие задачи:

Ii Сконструировать м^тг-льные комбинации виутривидзйых и •/■•>>.-рисовых асимм.-трич'-'Ы) егмагг"-: .-ких гнСр>;л;з.

- г -

2) Использовать различные диапазоны доз гамма-облучэния (от минимальных до суперлетальных ) при получении асимметричных соматических гибридов для выявления закономерностей воздействия ра диации на растительный геном.

3) Получить реципрокные межвидовые комбинации с применением аналогичных доз облучения .

4) Изучить количественный и качественый вклад родительских геномов, используемых при соматической гибридизации видов, в гибридный геном.

5) Изучить воздействие облученного донорского генома на ин-тактный геном или геномы вида-реципиента, функционирующие в одном ядерном пространстве.

Научная новизна и практическая ценность исследований. В диссертации получены следующие результаты, представляющие научную новизну:

- обнаружена зависимость между облучением и уменьшением ядерного материала донора в асимметричных соматических гибридах.

- показано, что небольшие дозы облучения вызывают внутри-геномные перестройки (связанные с повторяющейся ДНК в геноме донора) у некоторых линий асимметричных соматических гибридов, в то время как облучение донора суперлетальной дозой 1000 Гр. приводит к подобным перестройкам у всех гибридных линий.

- обнаружено, что облучение одного из партнеров, используемых для гибридизаци, приводит к серьезным изменениям ( амплифи-кациям повторяющихся последовательностей ДНК ) и в организации генома второго необлученного.

Полученные результаты могут быть использованы для подбора оптимальных доз облучения при создании асимметричных соматических гибридов, применимых в качестве исходного селекционного материала. •

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на республиканской конференции "Гаметная и зиготная селекция" ( Кишинев, 1Я87 ); на межлунаплной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" ( Новосибирск," 1988 ); на школе-конференции "Структура и функции биополимеров" ( Львов, 19Я9 ); на VII международном конгресса по кучь-туре растительных клеток и тканей ( Амстердам, j990 ); нч 1-м Кч-соганом симпозиуме " Новые методы и биоте^чохогии г-лтешч"'"

- о -

( Нущино, 1991 ), а тага*? на научных семинарах отдела цитофизио-логии и клеточной ингтенерии института клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в девяти печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, четырех глав - "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Обсуждение полученных-результатов", - выводов, списка использованной литературы, включающего 183 библиографические ссылки. Работа изложена на 109 страницах машинописи, включает 6 таблиц, иллюстрирована 13 ' рисунками.

оолкрканяе работы

Во_введении обоснованы выбор темы и актуальность диссертационной работы, изложены цель и задачи, отражены научная новизна И практическая ценность исследований.

Обзор литературы состоит из четырех частей. В первой части рассматриваются вопросы получения гибридов высших растений путем соматической гибридизации. Во второй - обсуждается наследование генетических детерминант у соматических гибридов растений. Третья часть посвящена анализу организации геномов асимметричных соматических гибридов, полученных с применением облучения. Е заключении обоснована актуальность выбраной темы исследования.

Материалы и методы исследований.

1. Характеристика растительного материала и его культивирование.

В исследованиях использованы различные виды и формы семейства пасленовых (Solanaceas).

. 1) ДеЗйктныэ по нитратредуктаэе линии tlicotiana plurcbaginifolia cnx 20 (дефект в структуре молибденового кофактора) и ша 26 (нарушение в структуре апоферментаКИеггиии et al. , 1983).

2) ХлорофилддефектныЙ мутант Nicotiana sylvestris \'12 (Dirks et al., 1986).

Использованные в работе виды и формы растений выращивали асептически при 16-часовом световом фотопериоде, освещенности 2000 лк и температуре 28°с. Растения культивировали на безгогмо-нальной среде Мурашиге и Скуга - МО (Murashíge, Sckoo?, 1962) и размножали путем черенкования.

2. Характеристика повторяющихся последовательностей, применяемых в качестве зондов для анализа растений.

Для анализа соматических гибридов использовали рекомбинант-ные плазмидные клоны, содержащие видоспецифические для N1 cot lana plumbaginifolia повторяющиеся последовательности ДНК:

pNpl 18 - рекомбинантная плазмида, содержащая диспергированную последовательность из ядерной ДНК Hicotiana plumbaginlfo-1 la В 1090 П. о. (Ковтун, 1991);

pNpl 9 - рекомбинантная плазмида, содержащая кластерирован-ный повтор в 2,1 т.п.о. (Ковтун, 1991);

pNp 21 - диспергированная последовательность из геномной ДНК N. plumbaginifclla в 1.5 т.п. о. (Plastuch Bates G. V. , 1090).

HRS60.1 - единица тандемного повтора из ядерной ДНК Nlcotlana tabacum в 182 п. о. (Koukalova et al. ,1989).

3. Выделение, слияние и культивирование протопластов.

Выделение протопластов осуществляли на основе методов, описанных в работе В.А.Сидорова и др. (1985). В исследованиях использовали ферментную смесь, содержащую 0,52 "0nozuka-R10" (Serva); 0.25Z "Macerozyme R-10"; 0,5 M сахарозу и И мМ CaClg ; рН 5,6.

Перед слиянием протопласты облучачи дозами 10, 100, 250 и 1000 Грей на кобальтовой установке "Исследователь" в солевом растворе W5.

Слияние протопластов производили го методу И. Негруилу для мезофильных протопластов (Negrutiú et al,1986) с некоторыми модификация

Продукты слияния культивировали на среде NH^-SKo с восстановленной формой азота (Marton et al ,1982), спустя 10-14 дней колонии переносили на селективную модифицированную орелу Ш с нитратами в качестве единственного источника азота. Через месяц культ гг.ирсваиия на селективной среде стбчрели зеленые колонии ,

- б -

способные регенерировать стебли. Анализировали полностью регенерировавшие и укорененные растения.

4. Анализ полученных гибридов.

1) Материалом для цитологического анализа служили меристе-матические клетки конуса нарастания молодых корешков ( размером 1-2 см) асептически выращиваемых растений соматических гибридов и исходных родительских видов. Фиксацию и скраску препаратов осуществляли на основе традиционных методов (Паушева,1988). Просмотр и фотографирование метафазных пластинок проводили на микроскопе UNIVAR (Reichert - Jung,Австрия) в проходящем свете при светлопольном освещении.

2) Растительную 1ЩК экстрагировали по методике Шуэ и соавторов (Shure М. et al. ,1953) с последующей очисткой в градиенте плотности хлористого цезия. Для выделения ДНК соматических гибридов, использовали методику минипрепаративного выделения ДНК

De 11 aporta at al. , 1983).

3) Выделение плазмидной ДНК проводили по методу щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979). Фрагменты ДНК выделяли по методу (Wlnberg, Hammazekjold, 1980)

qp

Радиоактивную метку [^РЬдЦТФ ("Изотоп", Ташкент) вводили в ДНК пробы в ходе реакции ник-трансляции, используя набор для меченных ДНК (Anersham, Англия) по рекомендациям поставщика.

4) Анализ ядерной ДНК соматических гибридов методами проводили методами блот-гибридизации по Саузерну и дот-гибридизации (Маниатис и др ., 1984).

Результаты и их обсуждение.

1. Получение и морфологические особенности асимметричных соматических гибридов.

Получение и изучение асимметричных соматических гибридов представляет интерес для многих исследователей ( Gieba et al., 1988; Piastuoh,Bates.1987; Wijbrandl et al, 1990). Взаимосвязь применяемой дозы облучения и степени асимметричности полученных гибридов обсуждается во многих работах. Одни исследователи Не наблюдают корреляции мезду облучением донора и степенью .-элиминации донорских хромосом в гибридах (Faielaer et al. , 1353; Gleba et al., 1988; Bates ot al., 1937; ), другие авторы соответственно такую взаимосвязь обнаруживают (Wijbrandl et al., 1990;

- б -

Malzer, O'Connel, 1992).Так как гибридизация отдаленных видов приводит зачастую к созданию асимметричных гибридов, невозможно оценить вклад собственно облучения в процесс элиминации донорских хромосом.

• Для того, чтобы сохранить облученный геном, избежав явлений несовместимости геномов при гибридизации отдаленных видов , и изучить взаимосвязь применяемой дозы облучения и степени асимметричности гибридов, мы сконструировали :

- внутривидовую комбинацию гибридов Nicotiana plumbaglnifolia,

nia 26 + cnx20 ( протопласты nia 26 облучали дозами 10, 250 и

1000 Гр. ) ;

- межвидовую комбинацию гибридов N. plumbaginifolia nia 26 + N. sylvestris V42 (протопласты nia 26 облучали гамма-лучами в дозах 10, 100 и 1000Гр.)

- реципрокную межвидовую комбинацию N. sylvestris V42 +

N. plumbaglnlfolia cnx 20 ( протопласты V42 облучались дозами 10 100 и 1000 Гр. )

В каждом опыте использовали приблизительно по 10® степени протопластов каддого из родителей. На селективной среде с нитратами в качестве единственного источника азота отбирали 2% гибридов, что составляло, в среднем, 200-300 колоний для кадяого опыта. Для анализа использовали по десять гибридных линий на каждую ' дозу облучения.

Практически все растения, полученные с применением дозы 10 Гр. были морфологически нормальными и походили на одного из родителей или на диплоидные или тетраплоидные растения N. plumbagl-nifolla в случае внутривидовой комбинации гибридов. Большинство гибридных клоное укоренялись в открытом грунте, игели и давали половое потомство .

Гибриды, полученные с использованием доз 100, 250 Гр. представлены ' как морфологически нормальными растениями-регенеранта-ми, так и клонами со сниженным морфогенетическим потенциалом. Последние имели скрученные мясистке листовые пластинки, плохо укоренялись в открытом грунте, не одели, не давали потомства.

Все гибридные клоны, отобранное после облучения супердетальной дозой lOCOrp. , отличались Mopír) логическими аномалиямии.

имели скрученные мясистые листовые пластинки небольшого размера. Укоренились лишь некоторые из отобранных для анализа клонов через -.год после начала культивирования гибридных колоний. Через 1,5-2 года нормализовалась структура листьев. Но растения не цвели и, соответственно, не давали полового потомства.

Я. Фамелэр с сотрудниками (Faimlaer ut al., 1Q37), обсуждая влияние условий культивирования на получение нормальных гибридных растений после облучения суперлетальными дозами,высказывает мнение, что период культуры in vitro долмен быть, по возможности, коротким.

Однако мы полагаем, что морфологическое несовершенство "вы-сокодозовых" гибридов может быть следствием влияния облученного донорского генома на необлученный реципиентный. Косвенным подтверждением этому предположению может служить тот факт, что после облучения дозой ЮООГр. мы отбирали высокополиплоидные гибриды, в которых на облученный донорский геном приходится не менее двух- трех реципиентных. Можно предположить, что гибриды, в которых на один облученный донорский геном приходится один необлу-ченнй реципиентный, вообще не способны к морфогенезу, что н сказывается на результатах селекции.

2. Цитологический анализ гибридов.

Практически все растения внутривидовой комбинации гибридов N. plumbaginifolia cnx20 + nia 26, полученные с применением дозы 10 Гр. были морфологически нормальными. Кариологический анализ этих линий свидетельствует, что они явились продуктами слияния двух- трех клеток(Рис. 1А).

' Внутривидовые гибриды, полученные с использованием дозы 250 Гр., содержали в своем геноме два, три родительских и характеризовались наличием реконструированных и мини-хромосом ( Рис. 1 В,В). "Гамма"-гибриды данной комбинации представлены как морфологически нормальными растениями - регенерантами, так и клонами со сниженной способность» к морфогенезу.

' Гибриды спх 20 + nia 26, отобранные после облучения суперЛетальной дозой ЮООГр., на цитологическом уровне по плоиднсети и количеству реконструированных и мини-хромосом практически не отличается от гибридов, содержащих геном, облученный дозой 250 Гр.(Рис.1Г). Но морфологически все оаи отличается от нормы, медленно регенерируют и плохо укореняются .

Гибриды N. plumbaginifolia + N. sylvestris, полученные после облучения N. plumbaginifolia, представляют собой достаточно однородную в цитологическом отношении группу . растения-регенеранты, полученные с применением до?ы ЮГр., являются симметричными гибридами, содержащими в своем геноме диплоидные наборы хромосом обоих родителей.

Гибриды, отобранные после применения дозы в ЮОГр. являются либо симметриками, в которых на один геном N. plumbaginifolia приходится один геном N. sylvestris, либо сочетают неполные диплоидные или теграплоидные геномы обоих родителей .

. . г* /:•■

.• 'Л *

» <*>

А

tS "

Г-

Г-»*?**

Б #

•Н °Г<г ъ '

, * -Г V

г

Рис. 1. Метафазные пластинки N plutrbaglnlfclia nlaiG х спхПО; г - ЮГр. . Б, В - ЮОГр. , 1' - 10ООГр.

хромосом "ravwa-гибридов" с"см п'.а^ облучался до&ами: А

Применение дозы ЮООГр. ведет к значительной утрате хромосом N. sylvestris, которых остается 4-11 с учетом мини-хромосом, при этом реципиент представлен тетра- и гексаплоидными геномами

Кариологич°ский анализ 10 линий межвидовой комбинации гибридов N. sylvestris N. plurrbaginifolia, содержащих облученный дозой 10 Гр. геном N. sylvestris, выявил 2 линии с 63-64 хромосомами в наборе, из которых 40 соответствовали тетраллсидному набору N. plumbaglnifotla (En - 20), а остальные - диплоидному N. sylvestris (En - 24). Таким образом, возникновение гибридной клетки связано со слиянием диплоидной метки N. sylvest- rls с одной тетраплоидной или двумя диплоидными N. pluinbaginifo- На. Геном двух клонов включал 52-56 хромосом, из которых 24-30 -N. sylvestris и 25-28 - N. plurrbaginlfolia. Один клон содержал 37-38 хромосом: 17-18 N. sylvestris, и диплоидный набор N. plumba-ginifolia. Четыре клона явились, по всей видимости, продуктами слияния диплоидных родительских клеток.

Клоны, полученные при облучении дозой 100 Гр., можно разделить на четыре группы . Четыре клона содержали 54-56 хромосом в наборе - гиподиплоидный набор N. sylvestris и неполный тетрапло-идный N. plumbaglnlfolia. Геном одного клона включал 35 хромосом, из которых 20 - диплоидный набор N. plumbaginlfolla и 16 -N. sylvestris. Два клона с 60-64 хромосомами в наборе имели полный геном N. sylvestris на фоне тетраплоидного N. plumbaglnlfolia. Три клона содержали диплоидный набор хромосом N. plumbaglnlfolia и гиподиплоидный - N. sylvestris.

После облучения дозой ЮООГр можно выделить две группы гибридов: содержание два и три диплоидных набора хромосом N. plunbaginlfolta на 1-5 хромосом N. sylvestris и 3-7 реконструированных или мини- хромосом, оставшихся после облуч.ния суперлетальной дозой .

3. Ала,гее ядерной ДНК асимметричных соматических гибридов с помотьп видоопецифических повторявшихся-последовательностей.

Межвилог1,е гибриды были исследованы с помогаю видоспецифи-ческих для N. i'Juirtoaginlfolia повторов pNpl 18 и pNpl 9, а также мономера тг>ндемного повтора N. t-ibacum, HRS60.1 (Koukalov.i, 1989), kotcjni- интенсивно гибридизовался с ДНК N sylvestris и не давал ciriiai-3 при гибридизации в жестких условиях с обпей ДНК N. plunil-oc; па "öl i-i. Яиспергирорлрпки повтор plipl 18 и кластериро-

ванный рИр1 9, как и ожидалось, имелись у всех гибридных растений. Судя по интенсивности гибридизации, количество повторов у гибридов соответствовало количеству повторов у М..р1шгЪае1гиГоНа (Рис.2).

Й Ь

IIIIII MIII I I I I II ) I I

ДОЮ

&

Рис. 2. Результаты Олот-гибридизации ДНК "гамма-гибридов" N. sylvestris + N. plumbaglriifolla с видоспецифически-ми повторяющимися последовательностями :А - диспергированным повтором pNpl 18;Б - кластернрованным pNpl 9; В - мономером тандемного полтора HRS60.1 .1-3 ,10-13(А,Б,В) -гибриды, полученные после обработки дозой ЮОГр.; 4 (А,Б,В) - N. plumbaglnifolla; 6(А,Б,В) - N, sylvestris; 6,7 (А,Б,В)-1000 Гр. i М(А.Б.В) - ЮГр.

4. Использование вмдоспецифичес1Шх для N. plutrfcaginifol la диспергированных повторяющихся последовательностей ДНК для количественной оценки геномной организации "Гамма-Гибридов".

Достоверность результатов цитологического анализа мы решили оценить при потовй молекулярно-биологических методов. Результаты

- И -

блот-гибридизации по Саузерну подтвердили гибридность полученных клонов и показали элиминацию части генетической инфорации у облученного партнера, в особенности, для суперлетальной дозы.

Интересным представлялось провести количественную оценку облученного донорского генома в гибридном. Полагают, что вычисленное на основании результатов дот-гибридизации процентное содержание повторяющихся последовательностей N. plunb?£inifolta должно отражать реальное содержание генома N. plurtoginifolla в асимметричных соматических гибридах (Imamura et al. ,. 1987; Piastuch, Bates, 1990).

На рисунке 3 представлены примеры дот-блот гибридизации обшей геномной ДНК' гибридов и родительских видов с повторяюпдамися последовательностями pNpl 9 и pNpl 18. Графики на рисунке 4 показывают взаимосвязь между интесиБНОстью гибридизации и концентрацией ДНК N. plumbaginifolia и двух соматических гибридов. Используя калибровочные графики мы смогли подсчитать процентное содержание повторов ДНК N. plumbaginifolla у различных соматических гибридов.

В таблицах 1 и 2 мы попытались сравнить результаты цитологического и молекулярно-биологического анализов. В первой колонке мы указываем дозу облучения, во второй - обозначения анализируемых- клонов. В 3 и 4 колонках хромосомные числа соответствующих родителей. В пятой колонке указано относительное содержание хромосом N. plurrfcaginlfolla в гибридах.

Для вычисления относительного содержания генома N. plumbggi-nifolla в гибридах мы применяли расчеты, аналогичные вычислениям У. Пиастуха и Дж. Бзйтса (Piastuch, Bates., 1990), и использовали формулу:

Р - 0,2ба / (0,2ба + 0,175b) х 1007. , где

Р - относительное содержание генома N. pluirbaglnifolia в гибридах (t);

а - количество хромосом N. plumbaglnlfol1а в гибриде;

b - количество хромосом N. sylvestris в гибриде;

0,26 - .средний расчетный вес одной хромосомы N. plumba-ginlfolia, (нг), (0,26 - 5,21/20, где 5,21 - вес диплоидного генома N. plumbaglnlfoHa, (нг), (Piastuch, Bates. , 1990), а 20 -количество хромссом у диплоидных растения N. plumbaginlfolla);

0,175 - средний расчетный вес одной хромосомы N. sylvestris, (нг), (0,175 - 4,20/24, где -1,20 - вес дишшдного генома N. sylvestris, (нг), (Bennet, Smith., 1G?6), а 24 - количество хромосом диплоидного набора у N. sylvestris.

Как свидетельствует наши результаты (Табл. 1 ), в опытах по слиянию облученного генома N. plumbaginifolia с интактным N. sylvestris увеличение дозы облучения приводит к уменьиению содержания ядерной ДНК N. plurrbaginifol ia. Это подтверждается как результатами дот-гибридизации с диспергированным повтором pNpl 18, так и данными цитологического анализа гибридов.

Для' большинства соматических гибридов, полученных после облучения N. plumbagiriifolia дозами 10 и 100 Гр. , результаты дот-гибридизации с повторяющимися последовательностями pNpl 9 и pNpl 18 согласуются с данными цитологического анализа. Однако у гибридов линии 1NV/21 наблюдается двухкратное увеличение содержания повтора pNpl 9 (Табл.1, рис.3 ) относительно расчетов, полученных на основании цитологического анализа, и результатов дот-гибридизации с pNpl 18 (Табл.1 ).' Этот факт, во-первых, свидетельствует об амплификации повтора pNpl 9 в соматических гибридах, и, во-вторых, что степень этой амплификации коррелирует с дозой облучения, полученной донором перед слиянием клеток.

Так как для гибридов, полученных без облучения, не обнаружено увеличения числа копий pNpl 9, мы предполагаем, что амплификация повторяющихся последовательностей ДНК была индуцирована облучением генома донора, а не является результатом культивирования и гибридизации клеток. Это предположение подкрепляется тем фактов, что увеличение числа копий pNpl 9 связано с увеличением дозы облучения донора.

Таким образом, да,, низких доз облучения амплификация наблюдалась только у гибридов линии 1МУ/Я1, в то № время это явление обнаружено у всех гибридных линий, полученных после облучения N. plumbagiriifolia дозой 1000 Гр. (Табл.1 ).

Для всех линий гибридов, полученных после облучения N. sylvestris, результаты дот-гибридизации с повторами pNpl 9 и pNp 21 хорошо согласуются с данными цитологического анализа ( Тебл. 2}. Однако, ревультяты блоглшг-анализа с диспергированным повтором pNpl 18 не всегда.совпадают с расчетными оценками кариологнчрского анализа относительно содержания ДНК

S3 SB )tO КО BO Tf*)

• >«•••••09 *pt

. Я *yl

Vyfcrld Ilm я sod f re)

• • ЬЩ w»

• * * iomr/t

• • • • 1 ПОТ/3

• • • ♦ 100MV/I « • « * 100*7/7

• • • O tan*/«

• • • ê inotr/10

S) 200 <rv)

• • •• >»c/|

• « • • IKVX

• • »V tftvs

• • • O ttnert

• ИХЖЛ

• • • Ö tarne«

• •90 tcc*v?

Рис. Г. Результаты дот-гибриди?лщнт г°нрмнэл ЛЧК N. plurrbaçri n i fol I .*> (N.pl), N. sylvestris íN.svl) if соматических гибридов с pNp?

Рис. л Калибровочные графики зерисимссти количества связанной радиоактиыюп метки (имп/мкн) от количества (нг) геномной ДНК N. plumbnçlnifolla И гиОрило? Ш/Sl и 1VC/3. График построй по результатам дэт-п^ридипатш с фрагментом pNpl 9 .

Таблица 1. Гибриднне комбинации, полученные при слиянии протопластов N. sylvestris с облученными протопластами N. plutrcagltn-fol ia.

Доза: TUoü : (Гр):' :' Кол-во хромосом N. sylv: N. plum Относит, содержание хромосом N. plum : Процентное содс-р.кание : копий повтора : pNpllß : pNplQ

cot3Z 44-45 20 40,1 4У,Ь 4078

10 INV/1 24 20 55. 4 56. 3 53. 6

10 1UV/3 24 20 55.4 56.1 69. 5

10 1NV/15 24 20 55. 4 61.9 57.1

10 INV/30 24 20 55.4 59.2 58. 1

10 1NV/32 24 20 55.4 62.2 55.9

10 1NY/21 23-24 20-21 56.5 58. 4 110. 4

100 IÖNVTT 45 16 34.6 34.15 83ТЕГ

100 1CNV/2 46 14 31.1 40. 1 38. 8

100 10NV/5 SO 15-16 43.9 56.6 49.6

100 10NV/10 48 14-16 32. 3 33.0 35.6

1C00 100NV/4 34 5-6 19.4 37. 2 51. 6

1000 ГОЖ77 46-48 9-10 22.9 337S 5Ö7S

1000 ГСШ779 40-41 3-4 13. 5 SO' 1Ö4. 7

1000 1ШУ7Т0 44 2 7.4 T57S 5379

Таблица протопластов N.sylvestri Доза: Клон

2. Гибридные комбинации, полученные при слиянии N. pluinbaginlfolia с облученными протопластами

N.:

Кол-во хромосом

Относит, содержание

Процентное содержание копий повтора

10 lVC/1 24 28 N. plum "637Б------ :pNpl 18 : 73.6 _j:,Npl 9: 68. 0 pNp21

10 1 VC/2 24 32 66. 5 105.6 66.3 71.0

10 I7C73 ffiTF 71. 4 69.4

100 IÜVC71 24 34-36 68. 4 TO ?87Ö

100 10VC/2 20 36 72. 8 04. 4 74.0 68.0

100 iüVC/3 16 20 68. 6 1S37T 6475 15575

100 TGVSTB 14 40 85. 3 00. 2 7378

100 10VC/7 ' 12 40 83. 2 80.0 83.7 79.1

100 1OVC/0 23-24 20-24 57. В 60.5 58.4 51.3

1000 100VC/3 8 52 53 90.7 91.1 83. 7 89.0

1000 100VC/4 8 55-56 91.0 84.3 92.1

10С0 100VC/6 0 Б8-59 92.0 85.7 90.7

1000 100VC/2 4-5 35-38 92.2 150.0 91.1 97.3

1D00 ПЙ7С77 ? ■ 40 89. S 157.1 Ш7Е 6575

- 1Б -

N. plumbaginifolia в гибридах. Обнаружена амплификация pttpl 18 у клонов 1VC/2, 1VC73, 100VC/2 и ÍOOVC/7 ( Табл.?. ). После гибридизации с pNpl 18 ДНК из этих гибридов генерирует более сильный гибридизационный сигнал, чем ДНК N. plumbaginifolia ( Рис. 3 ). Тот факт, что не наблюдается увеличения числа копий pNpl 18 у соматических гибридов линии oct 3Z, полученной без облучения ( Табл.1 ), показывает, что амплификация pNpl 18 мотет быть индуцирована в гибридах слиянием облученного генома N. sylvestris с необлученным N. plumbaginifol la.

Таким обгазом, был проведен анализ асимметричных соматических гибридов метлу Филогенетически близкими видамт N. sylvestris и N. plumba^lnlfolla с помощью вчдоспеиифичннх для N. plumbaginifolia диспергированных ( pHpl 18 и оНр 21 ) и клястерировачного ( pNpl 9 ) повторов.

вывода

1.При получении асимметричных соматических гибридов с применением гамма-облучения селективное преимущество имеют полиплоидные гибриды, содержащие диплоидный или неполный диплоидный (несколько хромосом при доге 1000 Гр.)набор хромосом на Фоне тетра-, гексаилоидного хромосомного набора реципиента.

2. Облучение дозами 10, 100, 250 Гр. практически приводит к созданию симметричных гибридов и не Ензывает значительной элиминации хромосом; облучение лозой 1000 Гр. приводит к созданию высокоасимметричных гибридов и взывает значительную элиминацию хромосом донора, которые составляют 4 - 25% диплоидного набора.

3. Увеличение дозы облучения приводит к увеличению степени асимметричности полученных гибридов и уменьшению ядерной ДНК донора, что подтверждается как результатами цитологического анчли-ва гибридов, таг и лот-гибридизаиии с диспергированными видоопе-цифическими для Nlcotlana pluirtrelnlfo) la повторяющимися последовательностями ДЧК.

4. Небольгие лозы облучения (10 Гр. ) вызывает внутриг^номчь'е изменения хромосом донора у некоторых гибридных линий. Е частности, эмллификэиию повторяющихся последовательностей ДНК

Р. Облучэние суперлеталыюй дозой 1000 Гр. вызывает резкое увеличение олиоге из видов повторямпихся погледователмюстс-П (pNol Р) у рсру гибридных лин::й.

R. При исслеловании репнпгокнлР комбинации гиСрилсг оть^чгно

увеличение количества копий диспергированных видоопецифических для N. plunbaginifolia повторяющихся последовательностей ДНК у необлученного партнера после слияния его о облученнш.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Коросташ М. А., Каневский Iii. Асимметричные гибриды Nicotiana, полученные слиянием протопластов // Гаывтнал и виготная селекция растений: Тез. докл. республиканской конф. Кишинев, £3 ИЮНЯ 1986г.- Кишинев: 1987 Г., С. 38.

2. Борисюк Н. В. , Момот R. П. , Коросташ М. А. Организация генов риОосомной РНК в соматических гибридах//Еиология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. междун. конф. Новосибирск, 2-6 августа 1988г. - Новосибирск: 1983г.- С. 281-282

3. Пароконный А. С. , Ыомот В. П. , Коросташ И А. , Котов В. Е , Глеба Kl Ю. Пространственная организация генома в соматических гибридах // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. междун. конф. Новосибирск, 2-6 августа 1988 г. - Новосибирск: 1988 г. - С. 289.

4. Кооостаи М. А. , Пароконный А. С. Асимметричные ядерные гибриды Nicotiana, полученные слиянием нормальных и инактивиро-Еанных гамма-лучами протопласюв // Структура и функции биополимеров: Тез. докл. школы-конф. , Львов, 1989г. - Киев: 1988г. -С. 34.

5. Parokonny Д. S. , Korostash № А. , Butsko Е. V. , Shlumukov L.Fí., Gleba Y. Y.Somatlc hybridisation: a tool for studying nuclear architecture // Abstr. Vllth International Congr. on Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, June 24-29, 1990.- Amsterdam . - 1990. - P. 218.

6. Коросташ M. A., Ковтун E. В., Вуцко E. В., Пароконный A. c. Аналчз организации генома асимметричных соматических гибридов в роде Nicotiana//- Биополимеры и клетки. -1991,- Т.7,- N5, -С. 54-62

' 7. Коростаи М. А.. Ковтун Е. Е , Буцко Е. В. Изучение ядерного генома асимметричных соматических гибридов Nicotiana sylvestris х N. Dl'.iTbnzinlfol ia// Новые методы биотехнологии растений: Тез. локл. 1-го Всесоюзного симпозиума. Пушено. 20 -22 ноября 1991г. -Нулине: 1991.- С. 84 '

8. Ковтун Е. В. , Коростап К. А., Буико Е. П., Глеба Ю. Ю. Использование видоспеиифичесптх повторяпдихся последовательностей для анализа асимм?тричных гибридов Nicotiana sylvestris ' N. plurt>aginifoHa/V Цитология и генетика. - 1992. ( в печати ) 9. Коvtun Y.V. , Korost.ash V. Л. , Rutsko Y. V. , Gieba Y. Y. Atrpliricatlcn of repetltlve DMA fron Nlcotiana plCTteglnlfolta In asymmetrlc sonatlc hybrid? betve°'i tflcotlana sylvestris and Hlcotiana plunibntrlnlfol la // Tb»or. App). Onet. - 1992. (In prpss)

Подп. в печ. 0i3.II.52. Формат 60x84/16. Бумага тип. Офс. печать. Усл. печ.л. 1,16. Усл. кр.-отт. 1,16. Уч.-изд.л. 0,9, Ткра.ч 100 экз. Бак. 31Ц Бесплатно. ■•

Отпечатано л Институте математики АН-Украины,' 25л6С1 1'пев 4, ГСП, ул. Реппла, 3 \ • ; "