Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансгеномные растения в роде LYCOPERSICON, полученные методом "Гамма-гибридизации" протопластов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Трансгеномные растения в роде LYCOPERSICON, полученные методом "Гамма-гибридизации" протопластов"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛОРУССКОЙ ССР ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи

РАТУШНЯК Шов Иванович

ТРА1ЮШЮМНЫЕ РАСТЕНИЯ В РОДЕ 1УС0РЕ1?51С0М, ПОЛУЧЕННЫЕ МЕТОДОМ "ГАММА-ГИБРИДИЗАЦИИ" ПРОТОПЛАСТОВ

03. 00. 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соистние ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1091

Работа выполнена в отделе цитофизиологии и клеточной инженерии Института клеточной биологии и генетической инженерии АН УССР.

Научный руководитель - академик АН УССР, доктор биологических наук, профессор ГЛЕБА Ю. Ю.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук ДАВЫДЕНКО О. Г.

доктор биологических наук КУНАХ Е А.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский инс-} титут растениеводства им. Н. И. Вавилова

Защита состоится "(О" О,\р.ч. 1991 г. , в I Ч час на заседании специализированного совета К 006.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Институте генетики и цитологии АН БССР по адресу: 220734, Г.Минск, ул. Скорины, 27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в Центральной научной библиотеке им. Я Коласа

Автореферат разослан " ли^У 1991 г.

Ученый секретарь \

специализированного совета /

К 006.02.01, кандидат био- 0 /V 1

логических наук Ур'Ь' г Е. В. Лобанок

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Как известно, томат является одной из наиболее важных сельскохозяйственных овощных культур, этим и объясняется повышенный интерес к этому виду многих исследователей. Разработайте в последнее время Сиотехнологические приемы генетической модификации растений позволяют устранить целый ряд ограничений в традиционной селекции томата. К таким ограничениям относятся, например, однородительское наследование цитоплазматических признаков в половом потомстве, или половая несовместимость томата с малочисленными другими представителями родов Lycopersicon и Solanum.

С развитием методов культуры клеток растений in vitro стал практически доступен принципиально новый способ скрещивания растений - соматическая гибридизация. Основное отличие этого способа от половой гибридизации - использование соматических клеток Еместо половых, что, как оказалось, позволяет преодолевать естественные барьеры несовместимости при скрещивании. Методы соматической гибридизации открывают новые перспективы для манипулирования как ядерными, так и цитоплаэматическими генетическими детерминантами, что позволяет значительно расширить наследственную изменчивость в селекции различных видов растений. Исследования, проведенные рядом авторов и выполненные главным образом на видах рода Nicotiana, убедительно доказывает возможность создания новых форм растений, ценных для селекционно-генетической работы.

Вместе с тем в настоящее время работы по соматической гибридизации томата ограничиваются лишь получением гибридных форм с немногими дикими сородичами. Это объясняется, во-первых, отсутствием генетически маркированных линий, удобных для селекции ядерных или цитоплазматических гибридов, во-вторых, - значительными методическими трудностями, связанными с использованием клеточных технологий применительно к данной культуре.

Практически все сорта культурного томата несут цитоплазмон Lycopersicon esculentum. Это обусловлено, во-первых, лишь односторонней совместимостью культурного томата при скрещивании с большнством диких видов томата, т.е. когда L. esculentum исполь-вуется в качестве материнской формы и, во-вторых, - однородитель-ским, материнским, наследованием цитоплазматических генов в половом процессе. Дикие же виды томата обладают вндоспецифическим ци-топлазмоном, а под контролем генов цитоплазмы, как известно, на-

1-эаказ Ш1

т

.:- в -

холится целый ряд полезных признаков, таких как интенсивность фо-тосинтеаа, устойчивость к различным патогенам, факторам внешней среды, гербицидам, антибиотикам, цитоплазматичеекая мужская стерильность (ЦМС) и др. Следовательно, вовлечение в селекционный процесс различных диких видов томата путем соматической гибридизации (для которой характерно двуродительское наследование плаз-могенов) открывает возможность использования полезных, в том числе и комплекса хозяйственно ценных, признаков, кодируемых цитоп-лаэмоном этих видов. Использование метода гибридизации томата, получившего название асимметрической гибридизации (синонимы "гамма-гибридизация", "гамма-слияние протопластов"), когда клетки до-норного вида (дикого томата) подвергаются радиоактивному облучению в суперлетальных дозах кроме того, позволяет более целенаправленно влиять на перенос тех или иных ядерных генетических структур и (apriori) получать высокофункциональные (фертильные) асимметричные ядерные гибриды и цибриды.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы была разработка эффективной системы селекции соматических гибридов и иаучение возможности получения фертильных асимметричных гибридов и цибридов томата.

Необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать приемы соматической гибридизации культурного томата с рядом видов пода Lycopersicon и Solanum при использовании инактивации одного из партнеров гамма-облучеиием.

2. Провести оценку эффективности различных доз гамма-облучения протопластов для получения гибридов различной степени асимметрии, включая цибриды.

3. Оценить генетическую конституцию отобранных растений и их пригодность для практической интрогрессии генов дикого вида культурному томату.

Научная новизна. Разработана эффективная система селекции соматических гамма-гибридов в роде Lycopersicon, основанная на использовании в качестве реципиента пластомного хлорофиллдефект-ного мутанта культурного томата, а в качестве донора - ряда диких видов Lycopersicon и Solanum, обработанных летальными дозами гамма-облучения.

Впервые в роде Lycopersicon получены фертильные гамма-гиС ридные растения.

•Впервые с помощью гамма-гибридизации получены цитоплазмати-Ч(*ские гибридные растения томата (цибриды,).

Впервые получены соматические гибриды томата с участием ди-юго вида L. hirsutum var. dentatum.

Доказано, что метод "гамма-слияния" протопластов позволяет 1реодолевать барьеры половой несовместимости при гибридизации L. jsculentum с другими представителями рода Lycopersicon и Solanum i получать соматические гибриды с широким спектром генетической юменчивости.

Практическая ценность. Разработанный нами способ селекции соматических гибридов в роде Lycopersicon позволяет применять сехнологию клеточной инженерии для получения ценного исходного селекционного материала у томата.

Полученные нами трансгеномные растения культурного томата с участием диких видов L. peruvianum var. dentatum, L. penne lili И 5. ríckíi, большинство из которых обладают высокой регенерацион-аой способностью, могут использоваться в клеточной селекции для получения новых форм, устойчивых к неблагоприятным факторам среды К грибным патогенам. Некоторые из этих растений, идентифицированные нами как фертильные, могут быть прямо использованы в селекционном процессе на ряд хозяйственно-ценных признаков. Полученные трансгеномные растения томата переданы в Институт экологической генетики АН ССРМ для полевых испытаний в климатических условиях республики Молдова и. включения их в селекционно-генетические исследования.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), II съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990), VII Международном конгрессе "Культура клеток и тканей растений" (Амстердам, Нидерланды, 1990), VIII Международном симпозиуме по протопластам (Упсала, Швеция, 1991), а также на научных семинарах отдела цитофизиологии и клеточной инженерии Института клеточной биологии и генетической инженерии АН УССР.

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в девяти печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Обсувдение полученных результатов", выводов и списка использованной литературы, включающего 143 библиографические ссылки, из которых 122 иностранные. Работа изложена на 158 страницах

машинописи, содержит 14 таблиц и 31 рисунок, включающих 120 фотографий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В исследованиях использовали различные виды родов Lycopersicon и Solanum семейства пасленовых (Solanaceae L.).

1. Культурный томат, Lycopersicon esculentum Mill., сорт немецкой селекции 'Quedlinburger Frühe Liebe'. Имеет картофельную форму листа (мутация типа с, 6-я хромосома), индетерминантный рост и красные средней величины плоды. Семена любезно предоставлены доктором X Леманном (Институт генетики, г. Гатерслебен, ГДР).

2. Пластомный хлорофиллдефектный мутант Pl-alb 1 L. esculentum MUI. Получен на основе сорта 'Frühe Liebe' Самсоновой (1970, 1972). Семена получены от т. А. Гавриленко (Всесоюзный НИИ растениеводства им. а И. Вавилова, г. Ленинград).

3. Дикий вид томата L. peruvianum var. dentatum Dun. (линии 3667, 3772). Имеет изрезанные доли листа, индетерминантный рост и зеленые мелкие плоды. Линии различаются между собой по морфологии листа.

4. Дикий вид томата L. pennellii Corre 11., самонесовместимая форма. Имеет слабо изрезанные доли листа, индетерминантный рост и зеленые мелкие плоды.

5. Дикий вид томата L. hirsutum var. g labrat um Hunto. et Bonpl. Семена всех дикорастущих видов томатов любезно предоставлены А. А. Жученко и IL Ф. Бочарниковой (Институт экологической генетики АН ССРМ, г. Кишинев).

6. Дикий вид S. rickii. Семена любезно предоставлены профессором Ч.Риком (Калифорнийский университет, г. Девис, США).

Протопласты выделяли из асептически выращиваемых растений по методикам разработанным в Институт© клеточной биологии и генетической инженерии (Сидоров и др., 1985). Слияние протопластов индуцировали по методу Менцеля и др. при помощи ПЭГ, ионов Саг+ и высокого pH (Menczel et al. ,1981). Культивирование протопластов и регенерацию растений проводили как описано ранее (Shahin, 1985).

Предварительное гамма-облучение протопластов «опорного вида в дозах 100, 200, 400 и 800 Гр проводили на установке "Исследователь", используя в качестве источника облучения 60Се с удельной активностью 10 Гр/мин.

Отбор асимметричных гибридов проводили по признаку позеленения и/или высокой регенерационной способности, поскольку протопласты растений-доноров были неспособны к делению вследствие обработки гамма-лучами, тогда как каллусы мутанта L esculent™ отличались белой окраской, слабым ростом и низким регенерационным потенциалом.

В полевых условиях в течение двух вегетационных периодов у гибридных растений и исходных родительских партнеров изучали общую морфологическую характеристику куста, листьев, соцветий, цветков и плодов, используя "Международный классификатор рода Lyoopersicori" (1979). Результаты морфологического анализа систематизировали в виде таблиц.

Гибридологический анализ проводили в полевых условиях путем возвратных скрещиваний некоторых соматических гибридов с исходными родительскими видами. Завязавшиеся плоды проверяли на присутствие жизнеспособных зародышей и семян, которые высаживали на среды для культивирования зародышей томата (Thomas a Pratt, 1981; Heal S Topoleski, 1983). Полученные растения Fj выращивали in vitro.

Онтогенетический и биохимические анализы проводили по методикам, применяемым в том же Институте (Биохимический анализ в клеточной биологии растений - Киев. - 1988. - Препринт/АН УССР, Институт ботаники; 88.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Главными преимуществами соматической гибридизации высших растений являются возможности а) манипулировать цитоплазматичес-кими генами, б) создавать цибриды, и в) получать асимметричные, ядерные гибриды. Для достижения этих целей с помощью слияния протопластов удобно использовать, с одной стороны, пластомные хлоро-филлдефектные мутанты, а, с другой, ¡«активированные гамма-радиацией протопласты с хлоропластами дикого типа (Aviv et al., 1984; Msdtryesy et al. , 1985; Gl ino 11us S Bonnett, 1986; Sldorov et al. , 1981). Таким способом можно довольно легко вести селекцию соматических гибридов с необычной генетической конституцией по признаку их способности к фотосинтезу и высокой регенерадионной способности. Теоретически, мсчно предположить возможность получения за счет гамма-гибридизации трех новнх и интересных ядерно-пластомиых комбинаций: гибридное ядро + пластом дикого вила; ядро культл?ио-

Î-MI »1

го томата + пластом дикого вида (циОриды) и гибридное ядро + пластом культурного томата (Рис. 1). Количество вариантов заметно возрастет, если при этом также учесть судьбу возможных ядерно-ми-тохондриальных взаимоотношений (Рис. 2). Реальные предпосылки для такой работы на томатах существуют, поскольку пластомные мутанты у томата и способы их получения описаны (Самсонова, 197С; Hagemann, 1982; Hosticka S Hanson, 1984). В последние годы также разработаны и усовершенствованы высокоэффективные методики быстрой регенерации растений из протопластов L. esculentum, L. peruvianum и L. peruvianum var, dentatum (Shahin, 1985; Tan, 1987; Пивень и Махорина, 1985; 1986). Опробован для Lycopersicon и метод "гамма-слияния" протопластов (Wijbraridi, 1989; O'Connell 8 Hanson, 1987). Особый практический интерес в получении отдаленных гибридов у томата связан с использованием в качестве доноров генов видов подрода Erlopersicon (эеленоплодные томаты), в частности L. peruvianum var. dentatum, L. hlrsutum var. glabratum и L. pennel-lli, а также видов секции Petota, в частности S. rickii. Несмотря-на то, что симметричные ядерные соматические гибриды С участием культурного томата были получены в 8 различных видовых комбинациях, фертильные растения удалось выявить только среди соматических гибридов L. esculentum Mill. -+ L. peruvianum Mill. (Kinsara et al., 1986; Wijbrandi, 1989; San et al. , 1990). У соматических гибридов L. esculentum Mill. + L. peruvianum var. dentatum Dun. (Пивень и др., 1986) лишь у одного тетраплоидного клона формировались плоды с единичными нежизнеспособными семенами. Поэтому применение нами метода "гамма-слияния" в избраьных 4 видовых комбинациях, с одной стороны увеличивало выход гибридных клонов в процессе селекции на клеточном уровне, а с другой, способствовало получению более кирокого спектра гибридов по их генетической конституции. Apriori, при таком подходе значительно возрастает вероятность получения фертилъных соматических гибридов в роде Lycopersicon. Используя изложенный в наших исследованиях подход, нам удалось достичь реальных успехов в получении и изучении соматических гамма-гибридов для всех испытанных комбинаций слияния протопластов.

1. Соматические_гиб£ЩЫ_ entumí L-jaeni;-

vianum var. dentatum.

В пяти экспериментах, названных нами в, С, D. F и II, было

олучено 170 гибридных колоний, из которых у 68 ¡тонов регенери-ованы растения. Исходя из морфологического, биохимического и ци-ологического анализов, полученные нами соматические гибриды Ь. аси1епЬиш + Ь. рептапит уаг. йег^аСит можно разделить на 7 фе-отипических групп (типов). Формообразование зтих групп могло за-исеть от целого ряда факторов, б том числе и от дозы облучения и спользуемой линии 1_ реги71апигп уаг. (¡епЬаЬит. Нам бы хотелось бсудить 4 наиболее интересные группы растений, получение которых меет принципиальный характер.

Одна из наиболее многочисленных групп представлена растения-и ¡слонов Ю-5Ь, 70, 80, 1Ю-130 (используемая линия донора - Ь. ептапит уаг. депЬа^т, 3772, доза облучения - 200 Гр). Все они мели тетраплоидный, или близкий к нему, набор хромосом (43-48), ромежуточную морфологии листьев. По большинству морфологических ризнаков, характерных для стеблей, цветков, соцветий, плодов и бщего габитуса куста, растения всех клонов были более сходны с идом-донором, «ежели с и еэсиЬпШт. По ряду признаков (опушен-ость стебля и чашелистиков, форма куста и гофрированность листь-в) гибриды больше напоминают растения-реципиенты, нежели донрр-ый вид. Следует также отметить появление новых, не свойственных одительским формам, признаков, таких как несросшаяся тычиночная олонка и зазубренность края лепестков на цветках. Анализ изофер-ентов эстеразы и глутаматоксалоацетаттрансаминазы (ГОТ) подтверил гибридность по ядру всех исследуемых клонов этой группы, месте с тем, изучение спектра множественных молекулярных форм ММФ) кислой фосфатазы (КФ), в частности по локусу КФ-1 (6-я хро-осома), показало отсутствие специфических полос I. рептапшп аг. dentatцn] у всех исследованных гибридных клонов. Возможно, то асимметричность соматических гибридов по этому локусу, а так-е несбалансированность количества хромосом (Табл. 1). могут при-одить к проявлению новых признаков. Анализ хл- и мтДНК показал, то растения клонов 10-40 обладают пластомом и регну(алии уаг. еп1аЬит, тогда как митохондрион представлен, по-видимому, сме-анной популяцией митохондрий родительских форм (Рис. 2, Табл. ). Вместе с тем, для клонов 70, 80, 110-130 на ряду с пластомом иного томата обнаружен рекомбинантний тип мтДНК (Рис. 2, Табл. ).

Другой наиболее многочисленный тип растений состоит из 6 лонов - 2С, ЗС, 5С, 7С и 8С (используемая линия донора - I.. ре-иу^апит уаг. аегиаПит, 3767, доза облучения - 200 Гр). Практи-

чески по всем морфологическим показателям они сходни с культурным томатом. Особый интерес представляет морфология листа с искривлением центральной жилки по типу мутации entire (е), локализованной в 4-й хромосоме. Это новый признак, такте не свойственный исходным родительским формам. Поскольку . вид-реципиент L. esculentum обладает картофельным типом листа (мутация с или potato leaf, локализована в б-й хромосоме) и поскольку уже описана возможность вааимодействия между генами е и с (Butler. 1951), мы не исключаем вероятности такого взаимодействия и в нашем случае. Анализ изо-ферыентов эстераэы показал, что ядерный геном этих растений является гибридным. Число хромосом у различных клонов находилось в пределах 54-60. У растений данного типа рестриктные спектры хлДНК оказались идентичными спектрам хлДНК L. peruvíanum var. dentatum, а рестриктные спектры мтДШ соответствовали спектру мтДНК L esculentum (Табл. 1).

Растения клона 1С (используемая линия донора L. peruvíanum var. dentatum - 3767, доаа облучения - 200 Гр), близкие по своей морфологии ко второй группе, отличались от нее картофельным типом листа без искривления центральной жилки. За исключением светло-зеленой окраски листьев, очень мелких плодов и слишком медленного роста и развития, клон 1С полностью походил на растения культурного томата. Анализ изоформ эстераэы, ГОТ. КФ и рестриктных спектров хлоропластной ДНК показал, что форма 1С имеет ядро L. osculentum и пластом L. peruvíanum var. dentatum. Метафазные клетки корешков содержали 2п-24 хромосомы (Табл. 1). Все эти данные указывают на то, что растения- 1С являются цитоплазматическими гибридами (цибридами). Слишком медленный процесс роста растений этого клона и их частичная хлорофиллдефектность могут быть свяаа-ны с ограниченной совместимостью ядра реципиента и цитоплазмы (хлоропластов) донора.,Если это так, то становится понятной причина столь низкого выхода цибридов при системе селекции, которая, казалось бы, очень удобна для их эффективного получения. Следует, подчеркнуть и тот факт, что пока нет работ по соматической гибридизации L. esculentum Mill. + L. peruvíanum var. dentatum Dun. или L. esculentum Mill. + L. peruvíanum MUI., в которых сообщалось бы о получении цитоплазматических гибридов.

К 4-му типу соматических гибридов можно отнести хлорофиддде-фектные растения кЛона 16D (используемая линия донора L. peruvíanum var. dentatum - 3772, доза облучения - 200 Гр), которые но своей морфологии и скорости роста в условиях in vitro очень

похожи на гибриды 1 группы. Этот клон также имеет количество хромосом, близкое к тетраплоидному уровню, а анализ изоферментов эс-терааы показал присутствие у этого растения специфических форм от обоих родителей. Рестриктный анализ хлДНК подтвердил наличие пластид культурного томата. Мы также наблюдали у ядерного гибрида 15D проявление точечных зеленых пятен, описанных Самсоновой и Беттхером (1972) для исходной родительской формы L. esculentum как обратные мутации, что еще раз подтверждает наследование клоном 15D пластома от вида-реципиента.

"Результаты анализов для остальных групп растений-гибридов (5-й - клонов 111 и 12С, используемая линия донора L. peruvianum vaг. dentatum - 3767, доза облучения - 200 Гр; 6-й - клонов 1Н И ЗН, используемая линия донора L. peruvianum var. dentatum - 3772, доза облучения - 100 Гр; 7-й - клонов IF, 2F и 5F, используемая линия донора L. peruvianum var. dentatum - 3767, доза облучения -100 Гр) представлены в таблице 1.

В полевых условиях большинство соматических гибридов характеризовалось высокой жизнеспособностью, обильно цвели и завязывали большое количество плодов красной, оранжевой, желтой и желто-зеленой окраски. Средний вес и размер одного плода был промежуточным между весом и размером плодов родительских видов (L. esculentum - 30-60 г и 40 мм, L. peruvianum var. dentatum - 3 Г И 16 мм) и составлял от 2-5 г и 18 мм до 25 г и 30 мм, соответственно.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о асимметричной природе геномов полученных нами соматических гибридов с преобладанием у них генетического материала L. esculentua Плоды большинства гамма-гибридов, полученных нами, как и плоды растений, полученные с помощью "гамма-слияния" Vi jbrandí (1989L были партенокарпическими и имели абортивные семена (клоны IB, 2С, ЗС, БС, 8С, 12С, 1D-3D, 7D, 11D-13D), или не имели их вовсе (клонн IF, 2F, 6F и ЗН). Растения клонов 4D и 8D оказались фертильными после самоопыления. Из нескольких незрелых плодов клонов 4D и 80 и из двух зрелых плодов клона 8D нам удалось получить семена Ц растения F^ с высокой жизнеспособностью в культуре in vitro. Следует отметить, что фертильные гамма-гибридные растения в комбинации L. esculentum Mill. + L. peruvianum var. dentatum Dun. получены впервые. Wijbrandi (1989), проводившему гамма-слияние протопластов в комбинации L. esculentum Mill. + L. peruvianum МЩ. при малых (50 Гр), средних (300 Гр) и высоких (1000 Гр) дозах облучения дикого томата фертильные растения получить не удалось.

Нами не установлено какой-либо зависимости эффективности слияния протопластов от генотипа донорной линии. Этот показатель определялся в какой-то мере дозой облучения: гибридные растения были получены только при дозах облучения 100 и 200 Гр. Среди "полученных зеленых каллусов только 30-40% регенерировали побеги. Скорость регенерации растений отдельных гибридных клонов была почти такая же как я для L. peruvianum var. dentatum. Сравнительно низкий выход гибридных клонов в нашей работе (до 6%) связан, по-видимому, с тем, что в наших экспериментах были использованы меэофильные протопласты, которые, как известно, весьма чувствительны к обработке ПЭГ. Однако использование мезофильных протопластов, т.е. регулярных эуплоидных клеток в качестве родительских при слиянии увеличивает вероятность получения более регулярных в генетическом отношении растений-гибридов. Во всяком случае, уменьшается вероятность асимметричности и анеуплоидии аа счет гетерогенности родительских каллусных клеток, что имело место в предыдущих экспериментах с данной комбинацией видов (Пивень И др., 1986). Следовательно, генетическое разнообразие полученных нами соматических гибридов определяется не столько исходной генетической композицией обеих партнеров при слиянии, сколько гамма-облучением протопластов L. peruvianum var. dentatum. Таким рб-разом, соматическая гибридизация методом "гамма-слияния" позволяет по-иному комбинировать гены родительских форм, что существенно отличает гамма-гибриды как от половых, так и ст соматических гибридов, полученных беа гамма-облучения.

К числу фактов, подтверждающих вышеуказанное, можно отнести вариабельность и анеуплоидию кариотипических наборов гамма-гибридов, содержащих, например, 43 или 47 хромосом (клон 8D), или же ровно 47 хромосом (клон 13D). Цитологический анализ материнских клеток пыльцы (МКЦ) соматических гибридов L. seculentum + L. peruvianum var. dentatum (клонов IB и 6G) показал, что на всех стадиях мейоза происходят нарушения, типичные для отдаленных гибт ридов томата (Косова и Кику, 1986; Грати, 1986).- В профазе обнаружено около 98% мейоцитов с мульти- и унивалентами. Наблюдаема^ аномальность развития 1ЛЩ на стадии анафазы 1 и II была связанная с отставанием отдельных хромосом или хромосомных пар и образованием хроматидных и хромосомных мостов, трехполюсных мейозов. Подобные нарушения у половых межвидовых гибридов томата происходят с гораздо более низкой частотой и их резкое увеличение у соматических гибридов может быть одним из последствий воздействия гам-

ма-облучения. Вероятно, из-за этих аномалий и формируется микроспоры с нарушенным хромосомным балансом, что и приводит к образованию абортивной пыльцы. Вместе с тем ряд соматических гибридов обладает стабильным эуллоидннм числом хромосом на тетраплоидном и пентаплоидном уровне (клоны 4D, 12D и ЗС). 5ги растения обладают высокой лизнеспособностью и хорошей уксрекяемостью in vit.ro и в почве. Кроме того, гибрид клона 4D оказался фертильным.

2. Соматические гибриды L. esculentum * L. ponnelin, L. es-culentum L. hlrsutum var. glabratum и L. esculentum 4- S. rlckll.

Значительно меньший успех достигнут по получению соматических гибридов в комбинациях L. esculentum + L. pennellil. L. esculentum + L. hlrsutum vai-. glabratum и L. esculentum + S. rickii, чем при соматической гибридизации L. esculentum + L. peruvianum var. den-tatum. Это связано в первую очередь с отсутствием эффективных технологий регенерации растений из протопластов этих видов, что в какой-то мере объясняет те методические трудности, с которыми нам пришлось столкнуться при изучении возможности соматической гибридизации этих видов с культурным томатом.

Наибольшие проблемы, связанные с низкой эффективностью слияния протопластов, у нас возникали с комбинацией L. esculentum + L. pennellil. Мы отбирали лишь единичные зеленые каллусы (до 10). Следует сказать, что и в работе O'Connell & Hanson (1987) при использовании трех различных генотипов культурного томата, как при обычной соматической гибридизации, так и при "гамма-слиянии" получили лишь 13 гибридных каллусов без облучения и 8 гибридных каллусов при облучении дикого томата В конечном итоге этими авторами были регенерированы 6 гибридных и 3 гамма-гибридных растения. В отличие от O'Connell 3 Hanson (1987), обнаруживших гамма-гибридное растение с числом хромосом близким к тетраплоидному уровню (2п -44) и жизнеспособностью пыльцы 4%, нами получены пентаплоидная и гексаплоидная формы, одна из которых (клон 1S) содержала жизнеспособную пыльцу (около 1Ш. К сожалению, хорошо сформированные семена этого клона были нежизнеспособными. Оба клона, 1S и 2S, содержали хлДНК L. pennellil и специфические маркерные полосы эсте-ра?ы и ГОТ обоих родительских форм, что подтверждало их гибрид-ность по ядру (Табл. 1).

В комбинации гамма-слияния протопластов L. esculent u/ч + L. hlrsutum 'var. glabratun нами получены гибриды на уровне каллусных

Таблица 1. Морфологическая, цкгогенетжеская я биохимическая

некоторых аомспрмяа гмбрмдов.

Н° клона

морфо- Коли- Ферггиль- Жизнеело-|ЕюххмичесяиЯ ЯНтШВ?

логия чество ность соОность - -1

листа хромосом пыльцы пыльцы Эстераза|хлДНК |мтДИК

Б 24 89.0 86,0 В в В

Р 24 90.1 87.2 Р р Р

Н 68,70 5,9 0 В + Р р -

Н 68,70 3,1 0 В + Р р -

Н 70 8.9 0 В + Р р -

н 42.45,48 1.7 0 Е + Р р Е

8 24 38,4 0 В р -

№ 56.58 0 0 В + Р р В

№ 60 0 0 В + Р р 8

МВ 96,58,60 0 0 В + Р р В

IS 54.56 0 0 В * Р р В

UB 56 0 0 В + Р р В

н - 2.1 0 В + Р р

я _ 0 0 В + Р р -

н 68,70,72 0,7 0 В + Р р -

я 44.46 29.3 1.1 В + Р р В *Р

я 46 20,4 8,1 Е + Р р В + Р

я 46.47 41,2 1.9 В + Р р В + Р

и 48 2,1 1.5 В + Р р В + Р

н 48 1,2 0 К + Р р к

н 43.47 41.0 7.9 К + Р р R

н 44,46.47 28,3 0.8 В + Р р R

я 48 52,0 11.1 К + Р р R

я 47 18,7 7.0 В + Р р R

И 46,48 - - В + Р в -

РМ 24 80,5 78,9 РХ РН РМ

н 70 42,3 11,3 В + РН РМ _

н 60 - - В + РМ РМ -

L esculentum Mili-, сорт "Fruhe Liebe' _

L. peruvianua var. dentatua Dun., jooom 3767 и 3772

L. esculentua + t_ peruvíanu» v. dentatua (3667. 100 Гр) 1F

2F 5F

L. esculentua + L peruviana v. dentatua (3667. 200 Гр) IB

1С 2C 3C 5C 7C SC 12C

L esculentua + L. peruvianua r. dentatua (ЗУД. 100 Гр) 1H

3H _

L esculentua + L. peruvianua v. dentatua (3772, 200 Гр)

ID

2D 3D 4D 70 ВО' 11U 22D 13D 1SD

!_ pennellii Corre11

1_ esculentua + L. pennellii ( ZOO Гр)

1S 2S

Примечание. E - L. esculentua тип; P - L. perurianu» тип; Я - промежуточный гибридаый лог, МВ - мутаятиая вариация культурного типа; РН - 1_ pemellil тищ R - рекомбтаганый ТИП.

шний. Следует отметить, что публикации по соматической гибридиза-дии с участием вида L. hirsutum var. glabratum отсутствуют, что, скорее всего, связано с практически полной неспособностью к реге-)ерации данного дикого томата Нам не удалось регенерировать поОе-'и из отобранных зеленых каллусов. Вместе с тем, получены длитель-го пассируемые клеточные линии, которые содержат наборы ММФ эсте-газы и ГОТ и реципиента, и донора. ХлДНК у таких клонов унаследо-¡ана от L. hirsutum var. glabratum. Эффективность слияния протоп-шстов в этой комбинации зависела от применяемой дозы гамма-облу-кния донорной линии. Тем не менее, нам удалось получить зеленые фотоклоны для каждой из четырех используемых доз- радиоактивной шактивации протопластов L. hirsutum var. glabratum, чего нельзя 5ыло достичь при соматической гибридизации L, esculentum + L. ре-"uvlanum var. dentatum.

Асимметрическая гибридизация оказалась успешной и в четвертой сомбинации видов L. esculentum + S. rickii. В частности, нами полена регенерация побегов при дозах гамма-облучения протопластов Шора 400 и 800 Гр, чего не удавалось достичь ни при одной другой сомбинации слияния. Видимо, генотипы L. hirsutum var. glabratum и j. rlckil способны выдерживать более высокую радиационную нагрузку 'амма-лучей, чем генотипы L. peruvianum var. dentatum и L. penne 1-[11. Вместе с тем, регенерация побегов из гибридных протоклонов L. îsculentum + S. rickii при дозах облучения 100 и 200 Гр не наблю-тлась. Кроме того, в комбинации L. esculentum + S. rickii достиг-ijrra наивысшая эффективность слияния протопластов (более 18%). Зместе с тем, и здесь отмечена зависимость эффективности слияния 1ротопластов от применяемой дозы гамма-облучения донора. В отличие )Т O'Connell s Hanson (1986), получивших при обычной соматической ■ибридизации в аналогичной комбинации лишь один гибридный каллус- ' 1Ый клон, нами отобраны 53 зеленых протоклона, 4 из которых оказа-шсь способными к регенерации побегов. Из 12 биохимически изучении зеленых каллусов все содержали гибридное ядро и хлДНК S. чеки.

Таким образом, в результате слияния мезофильных протопластов ¡ластомного хлорофиллдефектного мутанта L. esculentum Pl-alb 1 с Слученными высокими дозами гамма-радиации мезофильнши протопластами диких видов L. peruvianum var. dentatum, L. pennellii, L. iirsutum var. glabratum и S. rickii нами получены асимметричные щернне гибриды с новыми соотношениями ядерных и цитоплазматичес-

ядериЛ гиЗркд цхкшяазматическхй ядерный гибрид дикого типа габрю дикого типа цутамгяого типа

Рис. 1. Возможные пути сегрегации ядерного и швстомяых геномов при "гажа-слиякхи" нормальны» и хлоре-

Рис. 2. Один КЗ возжшпд результатов асюметричесхсЯ гибридизация: гибрдоюе ядро + пластиды джого «па + сегвегапия или рекомбинация юттотокдоА

ких генных детерминант. Использование такой системы селекции оказалось весьма эффективным. Как и ожидали, нам удалось получить гибридные растения на примере комбинации L. esculentum + L. peru-vianum var. dentatum трех различных ядерно-цитоплазматических конструкций: гибридное ядро + пластом дикого вида; ядро культурного томата + пластом дикого вида (цибриды) и гибридное ядро + пластом культурного томата (Рис. 1). Причем, последние два типа растений для рода Lycopersicon получены впервые. В целом, полученные в экспериментах гамма-гибриды характеризовались широким спектром изменчивости по целому ряду изученных признаков. Вместе с трм, нами получены относительно регулярные формы гамма-гибридных растений (клоны 4D и 8D), которые после самоопыления давали жизнеспособные семена Следует отметить, 'что фертильные гамма-гибриды в роде Lycopersicon получены впервые нами.

Резюмируя, необходимо сказать, что с помощью межвидовой соматической гибридизации методом "гамма-слияния" возможно получить асимметричные гибриды, в том числе и фертильные, идиотип которых представляет собой различные наборы генетического материала культурного томата и видов-доноров. В результате такой гибридизации возникают необычные комбинации генов, которые могут приводить к инЬму сочетанию признаков. А это в свою очередь должно способствовать расширению генетической изменчивости в селекции томата

ВЫВОДЫ

1. Предложена эффективная система селекции соматических гибридов томата, основанная на использовании, с одной стороны, мезо-фильных протопластов пластомного хлорофиллдефектного мутанта L. esculentum и, с другой, мезофильных протопластов дикого вида ' Lycopersicon и Solanum, инактивированных летальными дозами гамма-облучения, что позволяет впоследствии проводить отбор гибридных клонов на уровне каллусных колоний по признакам позеленения (биосинтеза хлорофилла) и/или высокой регенерационной способности. С помощью предложенной системы селекции можно целенаправленно получать гамма-гибридные растения с чужеродным пластомом.

2. Разработаны приемы соматической гибридизации с применением различных доз гамма-облучения вида-донора. Показано, что L. hirsutum var. glabratum и S. rickll при гамма-гибридизации с L.. esculentum способны переносить более высокие дозы гамма-радиации, нежели L. peruvianum var. dentatum и L. pennellii.

3. Получены асимметричные ядерные соматические гамма-гибриды в комбинациях: L. esculentum + L. peruvianum var. dentatum, L. esculentum * L. permellii, L. esculentum t L hirsutum var. glab-ratum, L. esculentum + S. rickii. На основе биохимического (изучение изоферментов, хл- и мтДНК), цитологического (подсчет количества хромосом) и фенотипического (оценка формы куста, морфологии листьев, соцветий, циетков и плодов) анализов показана возможность получения широкого спектра генетической изменчивости гибридных растений в роде Lycopersícon при использовании метода гамма-слияния протопластов. У полученных этим методом трансгеномных форм отмечена высокая степень нарушений на различных стадиях мейоэа материнских клеток пыльцы.

4. Среди полученных асимметричных соматических гибридов L. esculentum + L. peruvianum var. dentatum обнаружены клоны с различной генетической конституцией, сочетающей гибридное ядро с хлДНК дикого вида или культурного томата и видоспецифичной или рекомбинантной мтДНК. Среди этих клонов тыкяе выявлены фертильные гамма-гибридные растения и цитоплазматический гибрид (цибрид, аналог L. esculentum).

5. Соматическая гибридизация методом "гамма-слияния" протопластов позволяет преодолевать барьеры половой несовместимости и получать трансгеношше формы растений L. esculentum с видами Lycopersícon и Solanum, в том числе и фертильные асимметричные гибриды. Полученные этим методом гамма-гибридные растения обладают новой необычной генетической конституцией, создание которой невозмоюю гак при половом скрещивании, так и при обычной соматической гибридизации без использования гамма-облучения протопластов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Латшов С. А. , Ратушняк а И., Махорина O.K. , Пивень Н. М. Ианипуляции в роде Lycopersícon методами генетики соматических клеток // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. Мевдун. конф. 2-6 авг. 1988 г. - Новосибирск, 1988. - С. 189.

2. Ратушняк Я. И., Рудас В. А. , Пивень IL М. Селекция соматических гибридов томата с использованием пластомных хлорофиллде-Íwkthux мутантов // Ыатер-лы И-го съезда Всесоюз. об-ва физиологов растений. - Минск, 24-28 сент. 1990 г.

3. Piven N. М. , Ratushnyak Y. I. , Samoylov A. M. , Cherep N. N., Gieba Y.Y. Somatic hybridization in tomato using "gamma-

irradiated protoplasts" // Abstracts V11th Internl Congress on Plant Tissue and Cell Culture. - Amsterdam. - 1990. - P. 218.

4. Ratushnyak Y. I. , Latypov S. A., Samoylov ft. M. , Piven N. M. , Gleba Y. Y. Int.regressive hybrydlzation of tomatoes by "ganma-fusion" of the Lycopersicon esculentum Mill, and Lycopersicon peruvianum var. dentatum Dun. protoplasts //Plant Science. - 1991. - V. 73. N 1. - P. 65-78.

5. Piven N. M. , Ratushnyak Y. I. . Rudas V. A. , Latypov S. A., Zavgorodnya G. V. , Gleba Y. Y. Selection cf somatic hybrids in Lycopersicion and Solanum using chlorophyll-deficient mutants and gansna-irradiation // Abstracts VIП th Internl Protoplasts Symposium. - Uppsala- 1991,- P. 28.

6. Ратушняк Я И. , Латыпов С. А., Самойлов А. М. , Завгородняя А. В. , Пивень Н. М.. Глеба КХ Ю, Изменение генетической структуры томата методом "гамма-слияния" протопластов Lycopersicon esculentum Mill, и Lycopersicon peruvianum var. dentatum // Биополимеры и клетка. - 1991.

7. Латыпов С. А., Ратушняк Я И. Цитогенетическоб изучение аномалий мейоза у соматических межвидовых гибридов томата // Экологическая генетика растений, животных, человека: Тез. 4-й Всесоюз. конф. 20-21 нояб. 1991 г. - Кишинев.

8. Ратушняк Я. И., Латыпов С. А., Завгородняя А. В., Пивень ЕМ. Особенности формообразования межвидовых соматических гибридов L. esculentum и L. peruvianum var. dentatum Dun. , полученных при гамма-облучении дикого вида// Экологическая генетика растений, животных, человека: Тез. 4-й Всесоюз. конф. 20-21 нояб. 1991 г. - Кишинев.

9. Ратушняк Я И., Латыпов С. А. , Завгородняя A. а , Шрень Е М. Создание трансгеномных растений томата с новыми сочетаниями ядерных и цитоплазматических генов// Новые методы биотехнологии ■ растений: Тез. 1-го Всесоюз. симп. 20-22 нояб. 1991 г. - Пущино.