Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная селекция мутантов растений и их использование

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клеточная селекция мутантов растений и их использование"

ш

ОРДЕНА ЛШИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ у /

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР /

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТНШ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

СИДОРОВ Владимир Анатольевич

УДК 575.1+575.2

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ МУТАНТОВ РАСТЕНИЙ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

03.00.15 - гонотика

Дассэртацпя на соаскапаз учеяоЗ степени доктора бпологпчоскях наук в форао научного доклада

Клев-- 1289

Работа выполнена в Отделении клеточной биологии и инженерии Института ботаники Академии наук Украинской ССР.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С.С.Малюта, доктор биологических наук, член-корреспондент АН БССР

H.A.Картель,

доктор биологических наук С.И.Демченко.

Ведущая организация - Институт цитологии и генетики СО АН СССР.

Защита диссертации состоится "_" _ 1989 г,

в _ часов на заседании Специализированного совета

Д OI6.57.OI по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии растений и генетики АН УССР по адресу: 252022, г. Киев,22, ул. Васильковская, 31/17.

С ваучнш докладом ыоано ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений и генетики АН УССР.

Научный доклад разослан "_" _ 1989 года

Учений секретарь

Специализированного совета ,, /;"

доктор биологических наук j/fXiijl'iy А.М.Силаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы все с большей остротой ощущается необходимость внедрения в сельское хозяйство нетрадиционных технологий, KOTOpje позволили бы поднять на новый уровень производство необходимых для человека продуктов питания. Огромные перспективы для селекционного процесса может иметь использование технологии клеточной селекции, при которой отбор клеточных линий и растений с новыми наследственными признаками производится на уровне культивируемых in vitro клеток. Перечень прикладных вопросов, реиаешх при помощи клеточной селекции, не ограничивается созданием ценного селекционного материала. Методы клеточной селекции лежат в основе рада технологий промышленного шращивания клеточных культур, являются важными элементами работ по генетической инженерии растений. Наряду с биотехнологическими аспектами применения ногых подходов в сачекции неоценимо значение отих работ для развития фундаментальных вопросов мутагенеза, генетики, молекулярной биологии, физиологии и биохимии растений.

Благодаря развитию нового направления в селекции мутантов растений были получены разнообразные генетически маркированное клоточ- " tejo линии и растения, которое патл и широкое использование а прикладных и, в первую очередь, теоретических исследованиях. В середина 70-х годов применение прямого метода селекции на уровне ;;ял-дусных тканей позволило отделить перше цитоплаяматичеекир мутанта устойчивости к антибиотикам ( Malina at ni., 1973,1975). Их наличие з значительной степени способствовало дальнеПаечу развитim цито-атазматическсй генетики растений. Широкие гозм,обнести но«ого подхода в селекции мутантов били продемонстрировав в исслрдпрониях по выделении клеточшх линий и растений устойчивых к аналогам аминокислот и основания нуклеиноппх кислсг ("idhota, 1972; пьугъмн, 1^76), стрессошм фактора.*.! (НаЬегз ot ni., ЮТ5; Dix, strnçt, 1975; Meredith, 1978), патотоясинам (Congenhach, Groen, 1975), герби-ЦЯДвм (Radia, Carinen, 1978), а такте хлорофнллд^екгнчх (ЯсМ«-der, 1976; XxumMagel, 1979) я нитратродуктазнчх (Hiiibr, <?гпГе, 1978) мутантов.

Разработка методов выделения и культивирования in vitro больших однородных популяций индивидуальных растительных клеток -протопластов дала возможность использовать в отнотпнии росте ,тЧ эффективные микробиологические ггриеет селекции мутантов. Вместе с тем(

несмотря на огромные перспективы данного направления, до последнего времени многие вопросы клеточной селекции оставались нерешенными. До последнего времени ощущается острый недостаток в различных генетически маркированных линиях растений, необходимых в теоретических и прикладных исследованиях по генетической инженерии растений. Наличие селективных маркеров по ядру и цитоплазме особенно важно для направленного манипулирования ядерными и цитоплаз-матическими генетическими детерминантами путем слияния протопластов и создания принципиально новых форм растений, получение которых невозможно традиционными методами скрещивания. В связи с этим развитие нового экспериментального направления - клеточной селекции растений представляется особенно актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы Было изучение особенностей экспериментального мутагенеза культивируешх растительных клеток и селекции мутантов In vitro, создание эффективных клеточных технологий выделения генетически маркированных растений и получение на их основе новых форм растений. В связи с этим в задачи исследований входило:

1. Изучить потенциальные возможности манипулирования с индивидуальными растительными клетками, протопластами, как мутабельны-ми единицами для отработки эффективных приемов получения ядерных

и цитоплазматических мутантов. Разработать альтернативные приеш выделения in vitro генетически маркированных линий.

2. ЕЫделить и охарактеризовать различные типы мутантов, необходимые для работ по генетическому конструированию растений. На их основе разработать эффективные схеш селекции соматических гибридов и цибридов растений.

3. Изучить ядерную генетическую конституцию и поведение плаз-магенов у растений, полученных при "гамма-слиянии" и оценить возможности создания функциональных высокоасимметричных гибрвдов и цибридов в несовместишх комбинациях видов.

4. Использовать полученные мутанта и предложенные технологии •для создания ценного селекционного материала важных сельскохозяйственных культур.

Научная новизна и практическая ценноееь. Вперше показана рсчч'ожнпеть получения путем клеточной селекции широкого спектра ауксотрг^кнх мутантов у шсиих рас-тений. На основе предложенных технологий 1г.,т,,?-.:г!а: ранее не изеест>ые для растений аукеотрофн по трлоГ.г.ш-у, .-'.-¡'лп-пу, и р-спу.кну. Спргпелечз биохгс'ическля

природа данных мутационных изменений. Установлено, что в ряде случаев ауксотрофность совместима с нормальными процессами развития растений.

Предложены различные альтернативные подходы шделения in vitro линий растений, маркированных по ядру и цитоплазме. На их основе выделены и впоследствии изучены ядерные и цитоплазматичес-кие хлорофшгдефектные мутанты Nicotians. Получены и охарактеризованы мутанты пшеница, устойчивые к аминоэтилцистеину и лизину + треонину. Создана коллекция цитоплазматических мутантов различных сортов картофеля; путем генетическгй трансформации получены генетически маркированные линии картофеля с устойчивостью к антибиотикам.

Вперше для генетического изучения мутантов растениА предложено использовать комплементационнмй анализ, основанный на слиянии протопластов. Установлено,'что комплементация, приводящая к образованию прототрофных линий, происходит как во внутривидовых, так и межвидовых комбинациях слияний. В экспериментах по слиянию-комплементации мутантов, дефектных по нитратредуктазе, были идентифицированы ноше тиги ?.«утачтоп с дефектностью молибденсодержа-шего кофактора ( с.пхС и cnxD ).

Наличие генетически маркированных линий растений, впервые позволило провести детальное изучение поведения ядерных и цитоплазматических генетических детерминант при "гамма-гибридизапии". Вперше показано, что "облучение-слияние" протопластов позволяет преодолевать барьер половой несовместимости и получать морфологически совершенные растения, асимметричные по ядру и цитоплазме. С помопьго "гамма-гибридизации" вперше получетч фертильные отдаленные гибриды, сочетание генетический ядерный материал видов, . ' принпдлежапих к различным трибам. Также вперше продемонстрирована возможность переноса отдельных ядерных и цитошгапматичсских селективных признаков и получения таким путем генетически локированных растений.

Разработана принципиально новая технология направленного переноса плазмагенов из диких сородичей картофеля и получгпия сортов с замененной цитоплазмой. Вперше получещ сведения о совместимости генома культурного картофеля и цитогипэмона различал клубненосных и ноклубноносных видов пасленошх.

Прямую практическую значимость имеют наделенные протгклочял1~ *ие вариалты картофеля, которые успешно проходят конкурсное слч'с-

исштание. Ценный исходный селекционный материал представляют собой мутанты пшеница, устойчивые к аминоэтилцистеину и лизину + треонину, обладающие рядом ношх ваших сельскохозяйственных признаков, а также гибриды картофеля, полученные в результате соматической гибридизации с различными дикими видами Solanum. Особое значение в селекции ношх сортов картофеля имеют цибриды, обладающие геномом сорта культурального картофеля и цитоплазмоном диких видов Solanum. Этот материал передан для дальнейших испытаний в Укр.КИИ КХ ЮО ВАСХНИЛ и ВНИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова.

Апробация работы. Материалу диссертации докладывались на II, 1У, У Всесоюзных конференциях по культуре изолированных клеток растений (Киев, 1975; Кишинев, 1983; Новосибирск, 1988), III Всесоюзном совещании по генетике соматических клеток (Звенигород, IS86), Х1У Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978), Всесоюзной конференции по биотехнологии злакошх культур (Алма-Ата, I98Q), Первой национальной конференции по клеточным и тканевым культурам (София, НРБ, 1985), Мевдународном объединенном конгрессе ET cs и re3 (Будапешт, ВНР, 1983), XI Совещании Европейского общества ядерных методов в селекции (ESHA НДебрецен, ВНР, 1980), Международном симпозиуме по индуцированным мутациям как источника улучшения сельскохозяйственных растений (Вена, Австрия, 1931), XII Конгрессе euoarpia (Геттинген, ФРГ, 1989), 40-м Ежегодном совещании ассоциации тканевых культур (Орландо, США, 1989), ряде других всесоюзных и региональных конференциях и симпозиумах, а также на научных семинарах Института ботаники All УССР, Института физиологии растений и генетики АН УССР, Укр.НИИ КХ ЮО ВАСХНИЛ, Биологического научно-исследовательского центра ВАН (ВНР), Свободного Брюссельского и Гентского университетов (Бельгия), Гронинген-ского университета и Международного сельскохозяйственного центра, Вагенинген (Нидерланды).

Результата и методы исследований неоднократно демонстрировались на ВДНХ СССР. За цикл работ "Разработка фундаментальных основ клеточной (генетической) инженерии растений" диссертанту в составе группы ученых йлла присуждена Государственная премия СССР за 1984 г.

Структура гаОоты. Диссертация изложена в форме научного доклада I. шсда-.ает 1С таблиц и список опубликованных по теме циссер-тц|«н н.чучшх работ (2 монографии, 40 ciaieii, 7 ангорских спиде-

тельств на изобретения и 20 тезисов научных докладов), ссылки на которде приведены в тексте в квадратных скобках.

На защиту шнесены следующие основные положения;

1. У высших растений возможно индуцировать широкий спектр условно летальных (в частности ауксотрофшх) мутаций и ъутаций устойчивости к аятиметаболитам.

2. Для целенаправлегшого получения различных ядерных и цито-гаазматических мутантов, а также создания на этой основе ценного селекционного материала могут быть эффективно использованы метода клеточкой селекции.

3. При "гагата-гибридизации" возможен стабильный перенос отдельных ядерных селективных маркеров и получение функциональных аси!«метриишх ялер'гчх гибридов ме*ду близко- и дальнеродственными вилами растений.

4. Соматическая гибридизация может быть использована в качестве ноной технологии в селекции растений для переноса генов цитоплазм!, в частности, от филогенетически отдаленных видов и получения яллоплязпатических линий, а также поиска практически наиболее цепных источников цитоплаз»«.

ЭДЛЕЯШИК ПШИЧЕШ! МАГКИР0ВА1ШХ ЛИНИЙ РАСТЕНИЙ И ИХ ХЛГА 1<Ткптстикл

Первая часть исследований была направлена на изучение потен-ципль'ых возможностей клеточной селекции для получения генетически маркированных растений к цепного селекционного материала, Ссо-бнП интерес представляло получение ауксотрофов, наиболее редких мутантов у шеших растений, которые являются уникальным материалом для исследований го клггочней инженерии. Перше погктки применить методология уикроСи.элмюй генетики для получения ауксотрофлых растений закончились неудачей (Cn.rlnon, 1970; Aviv, ßalun, I^V). Большое распространенно в работах по соматической гибридизации такте нааши пигмянтдг.}октше мутштм, возможность наделения кето-pjx через культуру протопластов бкла продемонстрирована 0.Лидером (1977). Учитывал необходимость наличия селоктивнчх генетических маркеров у К. rlu-nbagialfolia, который является перспектив!*'- модельным объектом для исследований в области генетической инженерии растений, яачк стадилась конкретная задачи неумения ;?л<"-точных подходов сслокцкк яухсстро^ъгх и хгсроф^"де['-''сг;»гг "утп:г:г>ч, их п.1-

деление и анализ. Также исходя из того, что до последнего времени большая часть экспериментов была выполнена на модельных объектах, представлялось важным применить возможности экспериментального мутагенеза и селекции ±n vitro для выделения генетически маркированных растений таких важных сельскохозяйственных культур как картофель и пшеница и оценить перспективы их практического использования.

Опыты с Hicotiana . в основу технологии выделения ауксотро-фов был положен метод тотального тестирования, ранее используемый для этих целей в отношении Heurospora (Beadle, latum, 1945), печеночника ( Schieder, 1976) и мха ( Aaton, Cove, 1977). Схема эксперимента включала выделение гаплоидных протопластов мезофилла Н. plumbaginifolia, обработку их ^-лучами, культивирование протопластов на обогащенной среде, идентификацию потенциальных ауксотрофов путем тестирования индивидуальных колоний на минимальной и полной питательных средах и определение конкретной пищевой потребности выделенных клонов. В результате тестирования более чек 14 тыс. клонов были изолированы 3 каллусные линии,-которые характеризовались абсолютной потребностью в изолейцине, лейцине и урациле и соответственно обозначенные Не 401, Leu 403 и Vra 401. Результаты изучения влияния различных доз облучения на выживаемость протопластов и частоту возникновения ауксотрофов представлены в табл. I. Они свидетельствовали о возможности эффективной селекции ауксотрофов при использовании довольно высоких доз мутагена.

Таблица-I. Частота возникновения ауксотрофных и пигментдефект-ных клонов после ^-облучения гаплоидных протопластов Н. plumbaginifolia

Доза ' Выживае- * _Количество (частота)

11'р) ; М0(СГ ' тестируемых " : клонов : ауксотрофов : пигментдефектных : клонов

о. 100 282900 0 16(5,7-КГ5)

13 57 3727 ' 0 3(8-Ю-4)

16 23 '"• 3705 0 - . 8(2- КГ3)

19 15 • 2377. 0 7(3-Ю-3)

- 23 - II . . ' 4420 з - 36(8- КГ3)

^Эффективность высева необлученных протопластов составляла 70%

Из Не" и Ьей- линий были регенерированы растения. Наиболее полно был изучен Не-мутант. Растения характеризовались диплоидным набором хромосом, но погытхи получить потомство оказались безуспешными. Тестирование мутанта на способность расти в присутствии первого промежуточного продукта биосинтеза, а именно, а-аминобути-рата (он конвертируется in viro в 2-оксобутират - продукт трео-ниндезаминазы) показало нормальное функционирование остального пути биосинтеза Не , о чем свидетельствовал нормальный рост ткани. Биохимические пробы на активность треониндезаминазы в грубых экстрактах Не- мутанта показали ее полное отсутствие. Таким образом, эти данные свидетельствовали о блокировании первого этапа биосинтеза Не [1б].

В последующих исследованиях налги был предложен оригинальный способ преселекции ауксотрофов [57] . Идея данного подхода заключалась в разделении путем центрифугирования в сахарозе деляшихся (дикий тип) и неделячшхся клеток (потенциальные ауксотрофы) при культивировании в течение небольшого отрезка времени протопластов на минимальной среде, и была основана га результатах предварительных оштор по реконструкции с ранее выделенными ауксотрофвми. Всего из 61 выявившей колонии была выделена одна ауксотрофная по гис-тидину линия. Абсолютная потребность в г и стили не была характерна для растений-регечерпнтоп. Изучение биосинтетического пути Шя у денного мутанта свидетельствовало о дефектности одного фермента-имидазолглицеролфпгфат-легидрч''азы. Растения этой линии были способы к pocty в естественных условиях при внекорневой подкормке их Hia, что позволило провести их генетическое изучение. Семена от сауоогмлечия на минимальной сродр дяволи нежизнеспособные проростки, а в потомстве наблюдалось характерное для рецессивно. го признака мендслевсков расцепление. Твким образом, на примере П. Сило прпдемонс гриропгшо, что пуксотрофчость

совместима г. нормальными процессами развития растений. Эч и и последующие эксперименты других авторов, в которых Г|-'ли выделен!,: ранее не известные для растений мутанты подтвердили принципиальную возможность существования у высших растений кпрокого спектра ауксотрофиых мутаций.

Этот же материал использовали для выделения хлорг^иллдг; ?кт-ных (мутантов, селекцию которых проводили на стадии клеточных колоний. В результате проведенных экспериментов получе;гч длн.чые, которые резюмированы в табл. I. Частота возникновение ччких vyra-

ций довольно высокая и для получения морфологически нормальных растений следует использовать относительно низкие дозы мутагена (16-19 Гр). Из многих клонов были регенерированы различные пигмент-дефектные растения, которые впоследствии были детально исследованы.

Для генетического изучения хлорофиллдефектных и ауксотрофных мутантов было предложено использовать комгиементационный анализ, о сновал май на слиянии протопластов [22]. Результаты слияния-комплементации ауксотрофных и пигментдефектных линий (А28, А25, А27, А44, Х32) N. р1итЬае!п1£о11а , представленные в табл. 2, свидетельствуют о рецессивном характере ауксотрофных и большинства хлорофиллдефектных ¡мутаций, которые являются не аллельными.

Таблица 2. Результаты слияния-комплементации ауксотрофных

И ПИГмеНТДефеКТНЫХ ЛИНИЙ Н. р1итЪа21и±:Го11а

Комбинации слияний * Комплементация : Растения

Ига 4-01 + А28 + +

Ura 401 + А44 + +

lie 401 + А28 + +

Leu 403 + А28 + +

Leu 403 + А44 + +

Не 401 + Ura 401 + +

А28 + А25 + +

А28 + А27 + +

А28 + Х32 + +

Х32 + А25 + +

132 + А27 + +

А25 + SRI-A15 + +

А44 + 3RX-AI5 - -

Примечание. Частота комплементации равна 9-15%; в комбинациях слияний с линией А44 часто обнаруживались химерные (бело-зеленые) клоны. ЗН1-АТ5- ранее идентифицированный цитоплазматический хлорофиллдефектный мутант.

Данные экспериментов по слиянию-комплементации с линией А44 ука-а<вали на возмо».г»уи" цигоплазмлткческую природу хлорофшглдефект-нос;,". у данного мутанта. Внеядерная природа хлорофиллдефектносги у м>"1АН1а /.44 ?ыла подтверждена при генетическом анализе пестро-

листных растений, полученных в результате слияния протопластов Н. р1таЛае1п1£о11а дикого типа и линии А44 [44]. Данный гомо-ггааствдный цитоплазматический мутант предложено использовать в качестве универсального тестера для определения природы хлорофиллде-фектности у других мутантов.

Значимость комплементационного анализа, основанного на слиянии протопластов, была продемонстрирована при изучении других типов мутантов. В частности, в экспериментах по слиянихькомплемента-ции различных мутантов, дефектных по нитратредуктазо, были идентифицированы ноше типы мутантов с дефектностью молибденсодертащого кофактора, а именно, мутанты слтИ и емсС [21,2б] . В этих и других экспериментах с ядерными рецессивными мутантами было показано, что комплементация, приводящая к образования прототрофных линий, происходит как во внутривидовых так и межвидовых комбинациях слияний.

Огыты с картофелем. Необходимой предпосылкой исследований, связанных с развитием ношх биотехнологий применительно к картофелю, явилась разработка высокоэффективных методов выделения, культивирования протопластов и регенерации из них растений. Результатом этих исследований явились эффективаше клеточные технологии [ЗЗ,48,49] , позволяющие проведение работ по клеточной селекции, соматической гибридизации и трансформации картофеля. Также представлялось вашим изучить перспектиш сомаклонапьной изменчивости у картофеля, которая может служить мочтам источником генетического разнообразия у растений. В задачи этих исследований входило изучение спектра изменчивости среди растений картофеля, полученных из протопластов, а также отбор наиболее ценных вариантов длй практического использования.

В качестве источника мезофилыих протопластов использовали асептически шращиваешб растения картофеля сорта Зарево, дигап-лоидпой линии Ш9Г сорта Гатчинский и дикого вида ;>. ^птНао*-

( 2пе>24 ). Еыло получено и проанализировано более 320 растений картофеля сорта' Зарево, регенерировавших из независимых клеточных клонов (протоклонов). Примерно такое »о количество рас: гений выбраковано из-за аномальной морфологии, замедленного роста, или отсутствия нормального ризогенеза. Изменчивость в популяции протоклоноп по морфологическим и хозяйственно ценным признакам бала изучена в полевых условиях (табл. 3) [29}. Среди протокчонов морфологически идентичными исходной форме сказалось 20^ р^сгечнМ.

10 '

Таблица 3, Изменчивость среди протоклонов картофеля по основным количественным признакам (сорт Зарево)

Изучаеше признаки ' ж

Статистические показатели

з: - • тах . х ' : а ' V

Урожай клубней, г/куст • 933 1041 70 478 268 56,1

Количество клубней, шт/куст 23,7 43,0 6,0 15,0 7.9 52,4

Средняя масса одного клубня, г 39,3 68,6 10,2 35,2 16,9 48,1

Содержание сухого вещества, % 26,8 33,5 16,0 27,7 3,6 13,1

Содержание крахмала, % 18,9 24,5 8,0 39,5 3,6 18,3

Содержание сырого . протеина, % 2,1 2,9 2,1 2,4 0,22 9,1

Примечание. Коэффициент вариации у данного сорта по урожайности находится в пределах 5-10$. х - значение признака у исходного сорта, Хщаз- и - максимальное и

минимальное значение признака, х - среднее арифметическое, в стандартное отклонение, V - коэффициент вариации.

По данным цитологического анализа около половины всех растений-регенерантов были регулярными тетраплоидами, тогда как остальные оказались анеуплоидами или миксогоюидами. Значительная, хотя и меньшая, чем у сорта Зарево, вариабельность многих признаков наблюдалась среди протоклонов дигапловда 859Г. В данном, случае обнаружены несколько иные кариотипические изменения; приблизительно 55$ растений оказались тетраплоидами, тогда как остальные -дигаплоидами, доля анеуплоидных форм была незначительной. Спектр фенотипических и хромосомных вариаций ,был минимальным среди про-, токлонов дикого вида 3» рПппа^еоиот. Наблвдаемая шсокая спонтанная вариабельность у культурного тетрапловдного картофеля очевидно обусловлена сложной гибридной природой этого вида и присущим ему шсоким уровнем гетерозиготноети, который поддерживается благодаря вегетативному способу размножения. ' ■

В Укр.НШ КХ 1С ВАСХНИЛ г протоклональными вариантами сортов Ьарего и Гвтчинский были проведены полевые испытания, которые

■ Табяэда 4. Харситораспиа отдельных протоадонов сорта Зарзво

■. 1»» гармаита

Урогай

клубнаЯ,

г/куст

Товарность клубней,

Средняя пасса одного клубня, г

К рожала, %

Сырого :Виташ-проте- .на С, ша, % \VJffo

Содерааниэ в клубнях :Индекс :Устой- :Пора-полевой чивоеть .жение устой- :к меха» 'клуб-чиюсти ническим:ней ;к фитоф-шагруз- .мокрой : то розу кш 'гнилью при пс- : :при

кусс?- . .искус-

венной * •ствен-

:зараае- : :ноы

ни» : ■ :зара-: :&ении

Стандарт с.Зарою . 1180 84,7 63 22,7 2,0 12,4 0 14,4 5

85.188 845 45,9 20 21,1 2,3' 13,9 0 12,3 6

85,191 1140 .75 27 22,5 2,3 11,8 5,7 13,2 6

85.195 1460 72,3 40 23,2 2,6 15,8 1,7 14,5" 5

85.185 ' 1253 93 48 21,8 2,5 12,6 7,5 14,3 6

Примечание. Учетная делянка - 25 кустов, гматорпость

- 3-х кратная.

позволили идентифицировать линии с более высокими хозяйственно-ценными показателями, которые сохранялись в потомстве при их клубневом размножении. Некоторые характеристики отобранных протокло-; нов сорта Зарево представлены в табл. 4. К настоящему времени по одной линии от каадого сорта успешно прошли трехлетние конкурсные сортоиспытания. Таким образом, показана возможность практического применения спонтанной вариабельности in vitro как эффективного источника получения новых форм растений, что предлагается непосредственно использовать для сортоулучтения сельскохозяйственных культур.

Важным этапом работ по генетическому конструированию картофеля было выделение линий, генетически маркированных по ядру и цитоплазме. Положительные результаты по селекции мутантов in vitro были получены при использовании в качестве исходного материала для цутагенеза изолированных протопластов и семян линий картофеля, размножаешх половым путем [38]. Особенно интересным представляется предложенный нами способ наделения цитоплазматических цутан-тов, основанный на мутагенной обработке.(3 мМ нитрозометилмочеви-на, 2-3 ч) пазушных почек, растущих in vitro растений, при котором вначале получают химерные растения, которые впоследствии рас-химеривают in vitro [52,6б] . Данный способ позволяет сохранять специфическую гетерозиготность исходных сортов картофеля и не приводит к возникновению зирокого разнообразия сомаклональных вариантов. Возникновение хлорофильных мутаций обнаруживалось во всех . оштах с различными сортами картофеля. Частота появления пестролистных форм (учитывалось отношение количества пестролистных растений к общему числу высаженных после катагенеза черенков с одной пазушной почкой) для сорта Темп равнялось 17,6%, Ласунок - 53,7%, Лошицкий,- 42,5%, Белорусский ранний - 15,6%, Белорусский 3 -10,3%, Вярба - 43,5%, Дезирей - 16,4$ и Зарево - 25%. Уже во втором вегетативном потомстве ( ) из почек, расположенных в па-еухе химерного листа, часто наблвдалось шщепление генетически „однородных хлорофиллдефектных побегов. В случае с сортом Темп, навдпление чисто белых побегов наблюдалось в потомстве vi.ii (растения, возникшие из пазушных почек, обработанных мутагеном). При. возникновении пестролистных побегов их подвергали дальнейшему расхимеряванию в vM^, и т.д., используя известные и

предложенные нами [53] приеш микроразмножения. Таким путем выделены ли'лш с различными типами мутаций,, например, апьбина, вири-

Лис, лютесценс и др. Для дальнейших исследований отбирали от 3 до 7 морфологически нормальных альбиносных форм каждого сорта. Проведенный комплементационный анализ данных линий с хлорофиллдефект-ным мутантом И.р1гваЬае1п1го11а А44 подтвердил внеядерную природу хлорофиллдефектности у выделенных мутантов картофеля. .

В результате этих исследований создана коллекция цитоплазма-тических мутантов картофеля, представляющих уникальный материал для работ по соматической гибридизации и прежде всего для получения сортов картофеля с замещенной цитоплазмой.

Для получения генетически маркированных линий картофеля по ядру применялись методы генетической трансформации с помощью А. 1ягае£ас1епз и прямого переноса генов с использованием плазмти-ной ДНК С Кевги'И.и <зъ а1., 1997). Как доминантные селективные маркеры были взяты чужеродные гены устойчивости к антибиотикам. Для трансформации сорта Зарево и Дезирей использовали плазмвды рАВД1 с геном устойчивости к канамицину под промотором 153 гена И ШЦК и рНД1 с устойчивостью к гигромицину под промотором 353 из НЗД(. При прямой трансформации протопластов плазыидной ДЖ частота возникновения трансформантов достигала 0,7-2%. Во всех оштах получены растения, устойчивые к соответствующим антибиотикам» Ко- . культивирование листошх дисков и стеблешх сегментов с А. Ъгаа-:Гас1ог.а позволило получить трансгеншв растения з. ълегоэия, 8. р1ллаЪ1вес(иа1, л1$гти), 3. гЗскИ • и 3-, еЬасоепэо. Донорами чужеродной ДНК были плазмвды рПА472 и . рЯУЗВ50-пео, несущие ген иесмкцинфосфотрансфераш IX. Встраивание чужеродных генов в геном растений и их экспрессия изучались методом блот-гибридизации и анализом активности неомиципфосфотрансферазы. Идентифицированные трансгенные растения, обладающие устойчивостью к антибиотикам нашли применение в огытах по соматической гибридизации.

Сгаты с пшеницей. Исследования на пшенице были связаны с наделением и характеристикой мутантов, устойчивых я аминоэтилцистеи-ну (АЗЦ) и лизин + треонину (ЛТ). Селекция на устойчивость к аминокислотам и их аналогам может иметь прямую практическую значимость, поскольку даст возможность идентифицировать мутанты с нарушенной регуляцией биосинтеза. отделымх незаменимых аминокислот, что ведет к их сверхпродукции у растений. На пшенице детальнее исследования в этом направлении ранее не проводились.

Для выделения мутантов устойчивых к АЭЦ использовали зародыши потомства двух сортов озимой гга^ниц* Чайка и Киянка, а для

Таблица 5. Характеристика некоторых количественных признаков вд-тантов пшеницы, ..."..•..• ' устойчивых к АЭЦ (Ш)

Исходный сорт, ¥ мутанта :Средняя вы-:сота расте-:ний, см « :Срздаяя : :длина ко- : :лоса, см : :Среднее коли-:чество зерен в колосе,шт. : :Средняя мас-:са колоса, : г *

Чайка 91,0+2,19 ' 8,58+0,13 31,10+0,72 1,06+0,04

8403-1 > 89,76+2,92 0,25 12,4%0,П 22,40 38,70+1,40 4,82 1,82+0,12 2,0

8406-1 ' 73,08+4,02 3,91 9,80+0,11 7,18 36,92+1,05 4,57 1,73+0,06 9,3

84С6-2 ; 69,71+1,27 8,41 9,90+0,13 7,78 Зб,8%2,29 2,40 1,44+0,20 1,86 1

8406-3 71,21+1,95 6,75 9,85+0,20 5,42 37,31+1,08 4,79 1,46+0,07 4,94 Ь-1

8082-1 67,20+1,42 9,11 10,10+0,20 6,33 36,79+1,20 4,07 1,57+0,06 7,08

Киянка' ■ 86,11+2,39 _ 9,79+0,21 32,73+1,26 1,33^0,06

8072-1 66,12+2,37 5,95 10,00+0,29 0,61 32,33+1,36 0,22 1,24+0,05 1,15

8072-2 67,01+1,81 6,39 9,62+0,29 ; 1,08 37,50+2,04 1,99 1,54+0,09 1,94

8075-1 . С 64,91+2,47 6,16 9,29+0,17 1,85 33,92+1,37 0,64 1,38+0,08 0,50

Примечание: ъ - критерий достоверности по Стьюденту

отбора мутантов устойчишх к ЛГ - первичную каллусную ткань 6 различных сортов пшеница. Более полно изучены мутанты устойчивости к АЭЦ. Всего было идентифицировано 5 устойчишх линий от сорта Чайка, обозначенных 8403-1, 8406-1, 8406-2, 8406-3 и 8082-1, а также 3 устойчише линии от сорта Киянка (8072-1, 8072-2 и 8075-1). В зависимости от исходных линий частота^возникновения устойчишх форм варьировала от 4-10"^ до 1,2«10~°. Детально мутанты были изучены в М^ поколении. Характеристики данных линий . приведены в табл. 5. Сравнение с исходными сорт шли с высокой достоверностью показало, что за исключением линии 8403-1, средняя высота полученных растений была меньше и они отличались устойчивостью к полеганию. Также для всех линий сорта Чайка показатели средней длила колоса, среднего количества зерен в колосе и среднего веса зерен с одного колоса достоверно выше по сравнению с исходным сортом. Результаты тестирования зародышей второго потомства от самоогыления мутантов Ш^) свидетельствовали о том, что они представляет собой гетерозиготные линии и что признак устойчивости обусловлен доминантной мутацией. Статистическая обработка результатов похсазала соответствие полученных и ошдаешх частот расщепления на устойчлшо и чузстветелькые форш для линий 8403-1, 8406-1 и 8406-3 сорта Чайка и линии 8072-1 сорта Киянка (табл. 6).

ТабЛ!ща б. Характер расцепления мутантов озимой пшэницр . Чайка' п Киянка по устойчивости и АсЦ в поколении М^

Наименование исходного сорта, 1? мутанта •. : Число Лепотипов : • общее:устой-:чурстви-. ;ЧИШХ .ТеЛЬШХ; Теоретически ожидаемое расщепление (5:3) : х2 Р

Чайка

8403-1 34 23 II 21,25. : 12,75 0,Б©1 0*5

8405-1 54 . 6,0 34 58,75 : 35,25 0,071 0,7

8405-2 - 35 19 '■ = 16 . : 81,86': 13,14 1,008 0,3

8406-3 104 66 38 65,00 : 39,00 0,041 0,8

8082-1 33 16 17 20,62 : 12,28 2,766 0,3

Киянка /

8072-1 33 §2 II 20,63 : 12,37 0,244 0,5

8072-2 7Б 44 ' 31 4б,8Г7 : 28,13 0,470 0,3

8075-1 110 62 48 68,75 : 41,25 1,767 0,1

Проводятся дальнейшие исследования по получению гомозиготных линий и анализу аминокислотного состава белка у выделенных мутантов. Имеющиеся результаты уже. сейчас свидетельствуют о том, что шде-ленные мутанты существенно отличаются от родителей по ряду важных сельскохозяйственных признаков и независимо от данных о сцеплении этих признаков с устойчивостью к АЭЦ, несомненно представляют ценный исходный селекционный материал.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАНТОВ В КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ

Вторая часть исследований была непосредственно связана с применением генетически маркированных линий растений в работах по генетическому конструированию растений. Используеше до последнего времени методы конструирования растений цутем соматической гибридизации имели существенные недостатки. Несмотря на то, что были получены разнообразные гибриды мевду филогенетически отдаленными (нескрещиваешми половым путем) видами растений, оказалось, что большинство из них обнаруживают генетическую нестабильность и неспособность к образованию нормальных растений. В связи с зтим представлялось важным разработать Ноше клеточные технологии, направленного переноса ядерных и цитотаазматических детерминант, изучить их судьбу при соматической гибридизации, а также использовать данные подходы для получения генетически маркированных растений и создания ценного селекционного материала. Для проведения систематических исследований в этом направлении были необходима выделенные ранее линии растений с селективными генетическими маркерами.

Слияние протопластов и перенос плазмагенов. Возможность переноса цитоплазматических генетических детерминант и связанных с ними признаков из одних видов растений в другие стала очевидной после открытия Ю.Ю.Глебой с соавт. (1975, 1978) явления двуродитель-ского наследования плазмагенов в продуктах слияния протопластов. Хотя цибриды могут возникать при соматической гибридизации спон-'танно, направленная элиминация генома одного из партнеров может Сыть кндуцировага в результате предварительного облучения его протопластов Х- или ^-лучами ( 2е1сег е! аа., 1978).

Для получения после слияния протопластов преимущественно ци-бридов нами был предложен метод двойной инактивации, который поз-. волчя осуществить перенос признака хлорофиллдефектности из цито-

17 .

плазматического хлорофиллдефектного мутанта Я^аЬасит в СТ.р1ит-Ъ(^1п1:Го11а [17] . В данном эксперименте протопласты пластомного эдутанта табака подвергали ^-облучению дозой 60 Гр, а протопласта П.р1«аЪае1п1£о11а перед слиянием инактйвировали 30 мМ йод-ацетатом (20 мин, 7°С), который используется в качестве необратимого биохимического ингибитора. После слияния протопластов в соотношении 1:1 было получено 47 каллусных клонов, 40 из которых дали растения. Ядерная конституция растений-регенерантов изучалась на основе изоферментного анализа зстераз, а тип хлоропластов определялся визуально по окраске листьев и путем реетрикционного анализа хлДНК. В результате анализов растения разных линий были классифицированы следующим образом (табл. 7). 23 клона дали гибридные растения, 15 клонов - и.р1шЪав1д1:СоИа , а из 2 клонов были получены гибриды и растения рЗлппЪаеЫГоИа. При этом II линий растений, которые согласно аяализу множественных молекулярных форм эстераз были классифицированы как 11.р1гшЪая1п1^о11а и имели типичное для данного вида число хромосом, характеризовались присущим для табака рестрикцис-нным спектром хлДНК и были хлоро-филлдефектными. При сравнений полученных данных с результатами экспериментов по механической изоляции продуктов слияния без предварительной инактивации партнеров показана значительно большая ■ эффективность предложенного нами способа переноса хлоропластов, основанного на метаболической комплементации между облученными и обработанными йодацетатом протопластами.

Таблица 7. Классификация растений-рсгенерантов по их ядерной конституции и типу хлоропластов, полученных, в эксперименте по двойной инактивации

Ядерная : конституция : Тип рь§ хлооопластов 1;Ье *pbg+tbc • Общее коли: чество кло-. нов

ЗТ,р1ищТзав1п1Хо11а I II Г 3 15

Гибрады 2 20 • • I . 23

Гибриды и Н.р1игаЪа- - - - 2 ■ 2*

„

я - Гибриды имели £Ъо , рЬд ГЦГаСТЦВЫ.

Предложенный метод "облучения-слияния" протопластов был использован в экспериментах по соматической гибридизации между s.tuberosum и различными нескрещивавдимися видами для создания ношх трансгеномных форм картофеля, обладающих ношми комбинациями генетических детерминант ядра и цитоплаэш. Основной задачей было получение цибридов картофеля с чужеродным пластомом от диких видов Solanum и геномом культурного картофеля, которые могут играть важную роль в селекции ношх сортов. Для селекции цибридов применялось облучение протопластов донорского типа и использование в качестве реципиента выделенных нами цитоплазматических хлорофилл-дефектных мутантов S.tuberosum. Помимо клубненосных видов .Solanum в качество доноров чужеродной цитоплазщ были использованы дикий вид S.riokü, а также s.nigrura (атразину стойчишй биотип AR4 ), ii.plurahasinifolia (тербутринустойчишй мутант TBR2 ) И H.tabacum (стрептомицинустойчивый мутант зн-1 ), мутации которых кодировались цитоплазмоном (табл. 8). Перед слиянием протопласты доноров подвергали ^"-облучению в дозах 2С0-250 Гр. Для доказательства цибрадной природы растений-регенерантов, полученных в различных комбинациях слияний, проводилось изучение множествен-шх молекулярных форм ферментов, подсчет количества хромосом, а также рестрикционный анализ хлДНК. В каждой комбинации слияний

Таблица 8. Цибридные и гибрвднао растения, полученные

в результате слияния протопластов картофеля с у-облученными протопластами различных видов пасленошх

Комбинации слияний : Полученные трансгеномные фогш

: гибриды : цибрвды

...... , 1 ■ t' ' .•........ ■ .......... ......................

3. tuberosum + S.phuraja +

S. tuberoatm + S.piimatiaeotum + +

S.tuberosum ■«• S.bulbooaatanun + ' +

S.tuberosum +■ S.berthaultii + +

S, tuberosum + 8.chacoense +

8,tuberosum + S.nclcii • + , +

Si.tubos-osi® + S.nigrum +■ -

0, tuberosum + К .plmibaginif olia +

S.tuberosum + K»tabaoua + -

+

+

изучали от 20 до 50 линий растений. Во всех случаях балл выделены гибриды с различной степенью асимметрии генома; з более близкородственных комбинациях видов было идентифицировано от 3 до 10 цнбрщных линий (табл. 8). Большинство цибридов по фенотипу не отличались от растений-реципиентов. Отсутствие цибриддв в ряде комбинаций может свидетельствовать о несовместимости генома 3.tube-rosum и цитоплазмона филогенетически более отдаленных видов пасленовых. В настоящее время выделенные цибрида картофеля с цитоплазмой различных ввдов Solanura переданы для полевых исщтаний в УкрНИИ КХ ЮО ВАСХШ1Л и Всесоюзный НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности привлечения в селекционный процесс генофонда клубненосных и неклубненосных видов Solanum, в частности, для создания аллоплазматических линий, получение которых ранее было невозможным. Сравнительное изучение аллоплазматических линий картофеля позволит установить эффекты взаимодействия ядерных генов и плазма-генов, влияние чужеродной цитоплазмы на признаки и сзойства растений, идентифицировать сельскохозяйственно важные признаки, кодируемые цитоплазмоном, а также-шявить среди диких видов картофеля наиболее ценные источники цитоплаэш.

Возвращаясь к вопросу о получении генетически маркированных растений путем переноса уже существующих цитоплазматических (лута-ций из одних растений в другие, можно рекомендовать для этого использовать в слияниях близкородственные ввды.

Слияние протопластов и перенос ядерных- генетических детерминант . Метод "гамма-слияния", при котором один тип протопластов перед слиянием инактивируют суб- или летальными дозами облучения, оказался эффективным для переноса отдельных ядерных признаков и получения высокоасимметричных ядерных гибридов. Хотя выделение гибрвдов таким путем было описано в ряде публикаций ( Dudita et al., 1980; Gtipta et al., 1982,1984; Batea, et al., 1987), детального анализа процессов происходящих при это'к не проводилось. Наши исследования были направлены на получение различных асимметричных гибридов в семействе паслено&ах, изучение боемоености регуляции степени генетической асимметрии у гибридов, а таюке возможности стабильного переноса отдельных, признаков из филогенетически отдаленных видов. ', ,

- 20 -

В первой серии экспериментов были проведены слияния между дефектным по нигратредукгазе (ГО".) мутантом с ах 20 N.plianbasini-folia (реципиент) и Н.sylvestris (донор), протопласты которых обрабатывали различными сублетальными дозами (60, 100, 300, 500, 1000 Гр) [58,65]. В одном из оштов с целью изучения возможности переноса доминантного ядерного признака устойчивости к АЭД в качестве донора был взят мутант и.sylvestris» устойчивый к данное аналогу лизина. Соответственно, селекция гибридных клонов проводилась на среде с нитратом или с АЭД. Частота образования гибридов была равной около 10%. Из выделенных клонов были регенерированы растения, которые характеризовались различной степенью асимметричности. При относительно низких дозах 60-100 Гр, наряду с асимметричными гибридами (2-22 хромосома донора) были обнаружена симметричные ядерные гибриды. При дозах 500-1000 Гр количество хромосом в линиях варьировало от I до 6, что соответствовало 8-50% гаплоидного., генома N.sylveatria . Оценивая в целом результаты данных опытов можно отметить, что селективное преимущзств° имели гибриды, содержащие полиплоидный набор хромосом реципиента плюс гаплоидную часть хромосомного материала облученной клетки. Причем, кроме хромосом родительских типов, у гибридов обнаруживалось значительное количество мелких хромосом - мини-хромосом, а иногда -реконструированных хромосом, являющихся производными хромосом Н.sylvestris, возникших в результате облучения.

Зо второй серии экспериментов в результате "гамма-слияния" &ши получены асимметричные ядерные гибриды мевду n.plumbaglni-folia (eme 20) и A.belladonna (100 , 300 , 500, 1000 , 2000 Гр) 61,62 . Частота образования гибридов, у которых в результате комплементации с облученным ик+ партнером наблюдалось восстановление функций ГО , была значительно меньше по сравнению с предыдущей комбинацией и равнялась 0,7-3,7%. Анализ первичных регене-рантов показал, что все гибриды обладают множественным (обычно тетра- или гексаплоидным) набором ir.plumbeirt.nifo7.lfi хромосом с 6-29 хромосомами Atropa, некоторые из которлх делетированы (табл. 9). Хотя морфология растений была близкой к N.piumtmcini-folia, растения всех линий.имели различные аномалии и были стерильными. У растений одной линии (34 хромосом,! H.piunbnKinifoHn + 4-7 хромосом Atropa ) метод спасения зародышей in vitro позволил получить потомство после Секкросса с диким типом H.plraliaEinJ-folia . Цитологическое изучение растений потомства показало, что

Таблица 9. Кардалогический анализ "гамма-гибридов" И.р1ит-Ъая1п1Го11а(Ир) + А.ЪеПайогта (АЪ), а также растений, полученных после возвратных скрещиваний с диким типом N.р1ииЪаз±г\1го!1а '

Клон/доза, 1 Количество хромосом : Число про-

Га ' ............. ' анализиро-

: Общее : Нр : АЬ : ванных мэ-

: : : : тафаз

а) "гамма-гибриды"

1/100 74-76 56-58 18-19 9

12/100 84-85 55-57 28-29 6

39/100 92-95 74-75 18-20 3

46/100 88-89 68-69 20-21 6

159/100 67-72 48-52 19-20 5

12/300 73-74 49-51 23-24 5

150/300 64-75 58-63 8-12 15

156/300 52-56 41-42 П-14- 12

200/300 33-43 34-36 4-7 XI

4/500 76-77 53-56 16-18 4

5/500 56-58 38-40 16-18 5

13/500 81-82 ' 55 24-26 4 .

3/100 60-62 40 ' 20-22 8 •

б) бенкросс I

(200ВТ х"Р1)Т1 А/300 30-31 28-29 '2 4

(200ВТ х Р^Т^В/ЗОО 29-31 28-29 1-2 ' 4

(200ВТ х Р: 5^0/300 30-31 28-29 .2 2 .

(200ВТ х Р^Е/ЗОО ' 30-32 28-33 2 6

. (200СТ х Р1)Т1/300 31-32 29 2-3 19

в) беикросс 2 '

(200ВТ х ?!)Т1А/300 х Р2 21-23 21-23 I 19

(200ВТ х Рх >1^4/300 х Р2 22-23 21 , 1-2 . • ' . 3

(200ВТ х Р1 »^И/ЗОО х Р2 21 20 ' ... I / 8

(200ВТ х Рт)ТтСЗ/г00 х Р? 21^22 20-21 I '4

у них обнаруживается значительное уменьшение количества хромосом Atropa (1-3) и, что геном H.plunbaglnifolia находится на (гипо) триплоидном уровне (это следовало ожидать при опылении гипотетра-плоида обычным диплоидом). Эти асимметричные триплоидные гибридные растения были снова беккроссированы с диким типом, что.привело к нормализации фенотипа растений и значительному увеличению их фертильности и самофертильности. Цитологический анализ показал, что эти растения содержат диплоидный набор íí.plwnbaginifolia с 1-2 дополнительными хромосомами Atropa (табл. 9). '

Данные исследования показали, что при гибридизации нормальных соматических клеток и облученных сублетальными дозами (300-2000 Гр) клеток гибриды являются генетически асимметричными, т.е. они содержат полный набор хромосом одного родителя (реципиента) и часть гаплоидного генома, подвергнутого облучению (донор) родителя. В этих дозах не обнаружено прямой корреляции меаду дозой облучения и степенью асимметрии. "Гамма-гибридизация" вместе с 1-2 возвратными скрещиваниями позволяет эффективно шходить на линии с одной чужеродной хромосомой. Также установлено, что в различных комбинациях видов частота переноса ядерных генетических маркеров может значительно отличаться; при отом облучение сублетальными дозами не влияет заметным образом на поведение плазмагенов в процессе соматической гибридизации. ,

В третьей серии экспериментов по "гамма-слиянию" мееду tf.plu-mbagjnifolla (реципиент) и P.fcybrlda или L.eeoulentura (доноры) изучалась возможность переноса отдельных Селективных ядерных маркеров в комбинациях видов, которые являются несовместишми.

Растения-доноры были получены в результате трансформации и несли ядерный доминантный признак устойчивости к канамицину. Протопласты донора облучали дозой 1000 Гр и после слияния через 2-3 недоли переносили на среду с 50 мг/л канамицина. Из устойчивых клонов регенерировали растения, которые проверяли на устойчивость к канамицину путем тестирования листошх дисков. Результаты слияний представлены в табл. 10. Всего1в первой комбинации слияний било выделено 23 линии растений, во второй - 21 линия растений. Экспрессия чужеродного гена (ов) неомицинфосфотрапефсразы II у полученных .растений также подтверждалась в результате биохимических тестов на активность данного фермента. Цитологический анализ всех ■ линий растений йе -выявил дополнительных хромосом или минихромосом доноров. Большинство линий растений обладало типичным тетраплоид-

Таблица 10. Результаты асимметричных слияний I) н.рЗлгаЪа-21п1?о11а (реципиент) + Х.езси1еп1;щп (донор) и 2) Н.р1ипЪав1п1£о11а (реципиент) + Р.11уЪг1аа (донор) ' .

Количество протопластов ' Количество (час-

• • тлтп ^

донора ; реципиента ' ¿лотов

Коли^е^тво Ьт

регенерантов

1) 2,03-Ю6 2,03-Ю6 77(3,79-Ю-5) 23

2) 0,77-Ю6 0,77-Ю6 86Ц.12-10-4) 21

нам набором хромосом и.р1чтЪв2±п1£о11з, хотя в обеих комбинациях также были выявлены линии с диплоидным уровнем хромосом (2п=20), морфологически вденэтгчяыми хромосомам дикого зада табака, Феноти-шчески растения также были идентичны 11.р11пЪае1п1£о11а,

Таким образом, получены доказательства, что метод "гамма-слияния" позволяет осуществить перенос ограниченного количества ядерного материала в комбинациях видов, которые являются несовместимыми, и получать при этом нормальные фертильше растения. Эти данные также указывают, что.при этом методе слияния возможен стабильный перенос отдельных генов из одних растений в другие, который, очевидно, осуществляется в результате их интрогрессии в геном реципиента.

^'-облучение протопластов З,р1лпа«аес1пта было использовано для реконструкции генома картофеля [59]. Облучение клеток дикого клубнеобразующего вида дозой 200 Гр проводилось. В качестве реципиента была взята хлорофиллдефектная .(ядерная ь^тация) диплоидная линия картофеля ХтГ841-1. Донором служила диплоидная линия 3.р1ппа1;1веои'1т, обладающая высокой устойчивостью к фитофторе, а таккз А и У вирусам картофеля. Селекция гибрадов была основана на восстановлении у них фотосинтетической способности. Всего было получено 380 индивидуальных фотосинтезирующих клеточных линий, 30% из которых дали растения. Среди них было обнаружено 2 основных типа фенотипически отличающихся форм растений. Растения одного типа были ярко зелеными, у других обнаруживалась фиолетовая пигментация стебля и листьев. В обоих случаях среди растений отмечалось широкое разнообразие по многим признакам, включая морфологии растений, силу роста, способность к спонтанному образовать 1п тгПго клубней и т.п. Подробно было проанализировано 24 линии растений. Роди-

тельские хромосош были сходш по размеру и морфологии, поэтому цитологический анализ ограничивался подсчетом хромосом. Большинство растений характеризовалось тетрапловдным уровнем хромосом. Морфологически нормальными были как тетраплоиды, так и растения с 60 и 72 хромосомами. Для доказательства гибридной природы реге-нерантов проводился биохимический анализ изоферментных форм эс-. тераз и аспартатаминотрансфераз. Все линии растений с фиолетовой пигментацией бь(ли классифицированы как ядерные гибриды, а рестрик-ционный эндонуклеазный анализ хлДИК показал,.что большинство этих линий имеют хлоропласта типа S.pinrmtisectum.

Результаты данных исследований показали, что метод "гамма-слияния" является эффективным не только для переноса ограниченного количества ядерного материала из одних видов растений в другие, но также может служить инструментом для получения широкого разнообразия соматических гибридов и использован для селекции растений с новыми комбинациями генов. Этот подход позволил получить генетически различные симметричные и асимметричные гибриды, KOTopje найдут применение в селекции ношх сортов картофеля.

; ВЫВОДЫ

1. Изолированные протопласты являются уникальной модельной системой для изучения мутагенеза, а также селекции in vitro разнообразных ядерных и цитоплазматических мутантов. Мутационные изменения, возникающие в индивидуальных клетках-, могут экспрессиро-ваться при их культивировании in vitro и соответственно проявляться на уровне целых-растений.

2. У высших растений может быть индуцирован широкий спектр ауксотрофных мутаций. В наших опытах впервые изолированы и охарактеризованы мутанты с дефектностью биосинтеза изолейцина, лейцина, гистидина и урацила.

3. Комплементационный анализ, основанный на слиянии протопластов, может быть использовал для генетического изучения мутантов. Комплементация, приводящая к образованию прототрофных линий, происходит как во внутривидощх, так и межвидовых комбинациях видов.

В частности, с помощью этого подхода нами вперше обнаружены ношо типы мутантов с .дефектностью молибде.нсодержащего кофактора.,

4. Сомаклонольная изменчивость является мощным источником

генетического разнообразия у растений и может служить ценным эле- I : .

ментом селекционно-генетических программ ряда культурных растений. Изучение протоклональных вариантов картофеля позволило идентифицировать форш, которые в конкурсных испытаниях по ряду сельскохозяйственных признаков превосходили исходные сорта. Ноше признаки в большинстве случаев наследуются при размножении картофеля клубнями.

5. Разработаны приемы выделения in vitro цитоплазматических цутантов, позволяющие сохранять у них характерное гетерозиготное состояние исходных сортов. Выделенные хяорофиллдефектные цитоплаз-матические мутанты разных сортов картофеля являются ценными реципиентами для переноса чужеродной цитоплазш путем слияния протопластов. Иа их основе получены соматические гибриды и цибриды

3olanum, представляющие собой ценный селекционный материал.

6. Цибрвды, сочетающие геном культурного картофеля и цитоплазмой диких клубненосных видов Solanum , не обнаруживают каких-либо признаков ядерно-цитоплазматической несовместимости и преимущественно сохраняют фенотип исходного сорта - реципиента цитоплазш. Возможность замещения плазмагенов у существующих сортов картофеля открывает перспектива использования в селекции картофеля наряду с генофондом плазмофонда диких видов.

7. Продукты слияния нормальных и инактивированных гамма-облучением соматических клеток ("гамма-гибрида") жизнеспособны, причем облученная клетка вносит вклад в генетическую конституцию потомства.

8. "Гамма-гибрида" является асимметричными ядерными гибридами или цибридами, в которых имеет место экспрессия генетического материала обоих родителей; ряд рекомбинантных форм способны к регенерации функциональных, в частности фертильных растений; степень асимметрии в передаче генетического материала сильно варьирует в зависимости от применявшейся системы отбора гибридов; в пределах изученных диапазонов доз нет прямой зависимости между дозой облучения и степенью видоспецифической элиминации генетического материала. В результате "гаммя-елияния" впервые получены фер-тильные ядерные гибриды, объединяющие генетический материал видсэ, принадлежащих к различным родам и тркбам.

9. "Гамма-гибридизация" является принципиально новой модальной системой для изучения вопросов экспериментального метагенеза. "Гамма-гибрищ.!" характеризуйся чрезвычайно высокими частотами му-тац;1й и являглся кеточгалсч мичихрс/ссом.

10. Слияние облученных и нормальных протопластов, таким образом, может быть использовано для получения широкого разнообразия гибридов и цибридов, которые невозможно получить путем половой гибридизации. "Гамма-гибридизация" может служить методом переноса небольшого количества ядерного генетического материала между несовместимыми видами растений, в частности, использоваться для переноса селективных доминантных признаков и получения таким путем генетически маркированных линий растений.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В селекционные программы, направленные на сортоулучшение картофеля, следует включать методы культуры клеток с целью получения широкого разнообразия сомаклональных вариантов. Данные методы предлагается применять для улучшения отдельных признаков у сортов и перспективных линий картофеля. Сушественные преимущества имеет культура индивидуальных растительных клеток, протопластов, которая

' практически исключает возникновение химер.

2. Созданная коллекция цитоплазматических мутантов различных сортов картофеля рекомендуется в качестве исходного материала (реципиентов) для создания сортов с замещенной цитоплазмой различных клубненосных водов Зо1апш.

3. В качестве селекционного материала предлагается использовать аллоплазматические линии культурных сортов с цитоплазмой

S .piruiat lose turn, S .brrthaiiltl t, 3 .ЬПЪездг tnrmn, S.rlckli. Эти линии переданы в УкрНШ КХ К) ВАСХШ и ВНИИ растениеводства им.Н.П.Вавилова и могут вовлекаться в работу другими научшии и селекционными учреждениями.

4. В селекции тиеиииы и других злакошх культур рекомендуется использовать приемы селекции in Vitro, направленные на получение мутантов-сверхпродуцентов незаменимых аминокислот. В селекционную работу с пшеницей предлагается включить короткостебельпые, высокоурожайные линии сортов Чайка и Киника^ обпагчпчие доминантными маркерными признаками устойчивости к амИитилцистеину и лизину + треонину.

5. Для генетического изучения мутантов rnc'i'eunii мочет быть и с-пользован эффективный и быстрый метод геисти-сской комплементации, основанный на слиянии соматических клеток.

6. Для преодоления барьеров полевой несовместимости при отда-леншх скрещиваниях предлагается применять метод "гамма-гибриди-' зации".

СПИСОК РАБОТ, ОПШИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сытяик K.M., Сидоров В.А., Белицер Н.В., Глеба Ю.Ю. Ультраструктурное изучение начальных этапов слияния протопластов высших растений // Докл. АН СССР.-1976.-226. М.-С, 945-946.

2. Сидоров В.А., Белицер Н.В., Глеба Ю.Ю., Сытяик K.M. Ультраструктурное я цитохимическое изучение протопластов табака в процессе ах выделения, слияния а культивирования // X Всесо-юзн. конф. по электронной микроскопии: Тез. докл.- Москва,

1976.-II.-C. 391-392.

3. Сидоров В.А. Электронно-микроскопическое исследование начальных этапов слияния изолированных протопластов // Актуальные вопросы современной ботаника.-Киев: Наук, думка, 1977.-

С. 63-65.

4. Белицер Н.В., Сидоров В.А., Тарасенко B.Ä., Глеба Ю.Ю., Ситник K.M. Электрояномикроскопическое изучение протопластов мезофилла табака. I. Ультраструктурное и цитохимическое исследование протопластов табака на ранних стадиях культивирования // Цитология и генетика.-1977.-П.-С. 259-267.

5. Сидоров В.А., Белицер Н.В., Артеменко B.C., Глеба Ю.Ю., Сыт. ник K.M. Эдектроннсмикроскопическоз изучение протопластов

мезофилла табака. II. Ультраструктура культивируемых протопластов на стадии первичных колоний // Цитология и генетика.-

1977.-И.-С. 291-297.

6. Полевая B.C., Сидоренко П.Г., Хруслова Г.С., Уваров Г.А., Сидоров В.А., Мартын Г.И. Рост, фотосинтетическая активность и структурно- функциональные перестройки клеток ткани руты в культуре in vitro при различных условиях выращивания // Культура клеток растений.-Киев: Наук, думка, 1978.-С. 147-149.

7. Сидоров В.А., Белицер Н.В., Глеба Ю.Ю. Ультраструктурное и цитохимическое исследование протопластов мезофилла табака // Культура клеток растений.-Киев: Наук, думка, 1978.-С.271-275.

8. Сидоров В.А., Глеба Ю.Ю., Кривохатская Л.Д.', Ситник K.M. Ультраструктурный анализ слияния клеток человека с протопластами высших растений // Докл. АН СССР.-1978.-240.-С. 2II-2I2.

9. Глеба'Ю.Ю., Сидоров В.А., Артеменко B.C. Культивирование и слияние протопластов, выделенных из каллусной ткани ¿ц-аЫ-dopsis thaliana // Физаол. раст.-1978.-25.-С. I6I-I65.

10. Сидоров В.А. Ультраструктурное изучение слияния клеток two-

ших организмов // 1У Всесоюзн. симп. по электронной микроскопия в ботанических исследованиях: Тез. докл.-Рига: Занатие, I978.-C. 241-243.

II. Сидоров В.А., Глеба Ю.Ю. Слияние клеток высших организмов под воздействием поляэтиленгликоля // Цитология.-1979.-21. -С. 441-446.

1?.. Belitser II.V., Sidorov V.A., Gleba Xu.Tu., Sytnik K.M.

3,3-Maminobenzidine ultrastructural cytochemistry of tobacco protoplasts // Proc. of the Fifth Int. Congress of Hiatochera. and Cytochem.-Euchareat, 1976.-P. i+8.

T3. Sidorov '/.A., Globa Yu., Sytnik K.M. Ultrastructural study of Arsbidojisis thaliana /L./Heynh. cultured protoplasts and Arabirlopsis + Tobacco fusion products // Arsbld, Inf. Serv. -I978.-N.5.-P. 70-77.

X4. Sidorov V. A, , Gleba iu.Iu., Sytnik K.H. Culture of protoplasts isolated fro<o Arabidopnie thaliana Heynh. callus tissue and fusion of arabidopsic callus and tobacco mccophyll protoplasts //Plant Cell and Tissue Culture. Principles and Applications. -Columbus: Ohio State Univ. Press, 1979.-P. 8!)6~S«t7.

15. Sidorov V.A,, Gleba Y.i. Ultrastructural study of cell fusion under PEG treatment and analysis oi soeatic hybrid plante Nicotians tabacum + N. debneyi // Abotr. V Int. Protoplast Symp.-Szeged, 1979.-P. 74.

16. Sidorov V., Menczel L., Maliga P. Isoleuctne-requirlng fflcoti-ana plant deficient in threonine deaminase // Nature.-1981.-¿94. K. 5836.-P. 87-88.

17. Sidorov V,, Menczel I., Nagy F. , Maliga Г. Chloroplast transfer in Hicotiona based on metabolic complementation between irradiated and iodoac^lnte treated protoplasts // Planta.-I93I.-ii2.-i-. 3W-345.

18. Maliga P.,. Menczel L., Sidorov V. et al. Coll culture mutants and' №eir usee // Abst'r. XIII Int. Botanical Conirror.r,.-Sydney, I93X.-P. 206.

19. Haliga P., Sidorov V.A., Ccoplo A., Menczel L. Induced mutations ir. advancing in vitro culture teeim i i icn // Induced Mutation - A Tool in Plnnt research.-Vienna: 1АКЛ, I9'!I.~

P. 339-352.

20. MaJiw P., ;if.-nc2el I,., Sidorov V. nt £.1. Cell culturt; nut.mts nnci their u-. // :i-..nt i-aproveawnt r.ri'i Cnwtic Cell ."pnctics.

-N.Y.: Acad. Press, 1982.-P. 221-237.

21. Marton L., Sidorov V., Eiasini G., Maliga P. Complementation in somatic hybrids indicates four types of nitrate reductase deficient lines in Hicotiana pluiabaginifolia // Mol. Gen. Genet.-1982.-122.-P. 1-3.

22. Sidorov V.A., Haliga P. Fusion-complementation analysis of auxotrophic and chlorophyll-deficient lines isolated in hap-loid fticotiana plumhaginiiolia protoplast cultures // Ио1. Gen. Genet.-1982.-186.-P. 3^3-332.

23. Marton L., Biasini Q., Sidorov V., Maliga P. Nitrate-reductase deficients in the progeny after selfing coapleaented somatic hybrids of Nicotiana pluobaginifolia nutants // Protoplasts 1983. Proc. 6-th Int. Protoplast Symp.-Basel: Birkhauser Verlag, I9S3.-P. 100.

Hif. Sidorov V.A.» Kuchko A.A. Spontaftious and Induced variants from Solanua tuberosum through protoplast culture and fusion // Abstr. J. Congress of the ETCS and the EUEES.-Budapest, 1933.-P. 50.

25. Sidorov V. A., Kuchko A.A.-, Gleba Y.Y. Qenetic raodification of Solanua tuberosua through protoplast culture and fusion // Tissue Culture and RES.-Budapest: Akad. Kiad6,I98/f.-P. 529-53*1,

26. Diiks R., Negrutiu X., Sidorov V. A new cox gene in Nicotiana pluobaginifolia: revealed by biochemical, genetical, and fusion-complementation analysis of nitrate-reductase-less mutants // Abstr. First Int. Congress of Plant Molec. Biol. Savannah'85.-Georgia: Bicentennial, 1985.-P. 105.

2?. Qleba i Л., Sidorov V.A., Hoffmann Jt\ Mechanical isolation and single-cell culture of isolated protoplasts and somatic hybrid cells // Cell Culture and Soaatic Cell Genetics of Plants. Vol. I.-N.Y.: Acad. Press, 198*».-P. 405-413.

28, Dirks R., Negrutiu 1., Sidorov V., Jacobs M. Complementation analysis by somatic hybridisation and genetic crosses of nitrate reductase-deficient mutants of Hicotiana plumbaginifo-lia. Evidence for a new category of cnx ¡sutante // Hoi. Gen, Genet.-1935.-201.-P. 339-3^3.

29, Сидоров B.A., Кучно A.A., Гайдук П.П., Глеба Ю.Ю. Сомаклональ-ные вараацяа среда растений, полученных яэ протопластов картофеля // Докл. АН CCCP.-I985.-28I, »З.-С. 704-707.

30. Сидоров В.А., Лысенко Е.Г., Кучко A.A. Культура изолированных протопластов для получения новых форм картофеля // Исследования по клеточной селекция картофеля.-Москва: НИИ КХ, 1984.-С. I08-114.

31. Сидоров БД., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Ситник K.M. Соматическая гибридизация пасленовых.-Киев: Наук, думка, 1985.130 с.

32. Сидоров В.А., Лысенко Е.Г., Кучко A.A. Методические рекомендации по получению исходного селекционного материала картофеля с использованием гибридизации соматических клеток.-Киев: ЮО ВАСХ1Ш, 1985.- 17 с.

33. Сидоров В.А., Кучко A.A. Изолированные протопласты картофеля и их использование при соматической гибридизации // 1У Всесоюзн. копф. "Культура клеток растений и биотехнология": Тез. докл.-Кишинев: Штпинца, 1983.-С 195-196.

34. Лысенко Е.Г., Сидоров В.А. Получение андрогенных гаплоидов Solanum huibocist.inum и культура мезофильных протопластов // Цитология и генетика.-1985.-19, Кб.-С. 433-436.

35. Лысенко К.Г., Сидоров В.А. Культура 1зольовчних протопласт1в I одержяння нових форм картоггл1 // Укр. ботан. иурнал.-1985. -42, »2.-С. 44-47.

36. Банникова В.П., Сидорова Н.В., Сидоров В.А. и др. Культура незрелых зародшей как источник получения новых форм пшеницы // У съезд генетиков и селекционеров Украины. Часть I: Тез. докл.-Киев: Наук, думка, 1986.-С. 157-158.

37. Гайдук II.П., Кучко A.A., Сидоров В.А., Нетях Г.П. Изучение генетической изменчивости среди растений, полученных из протопластов картофеля. Часть I: Тез. доил.-Киев: Наук, думка, 1986.-С. 160.

38. Сидоров В.А., Зубко М.К., Кучко A.A. Получение мутантов картофеля in vitro и их использование в клеточной иняенерии // Генетика и селекция (Со|>яя).-1986.-19, Ä5.-C. 470-474.

39. Жила Е.Д., Кучко A.A., Сидоров В.А. Вариабельность числа хромосом у протоклонов картофеля сорта Зарево // Селекция и семеноводство.-1987.-Bim. 62.-С. 44-45.

40. Гайдук П.П., Кучко A.A., Сидоров В.А. Сомаклональная изменчивость в популяции регекерантов из протопластов картофеля // Картоплярство.-Ки1в: Урожай, 1987.-С. 13-15.

41. Сидоров В.А., Зубко М.К. Изучение коррекции признака ауксо-

трофности у Hi со ti ana plunbagini folia при помощи "облучк-ная-слияния" протопластов // Респ. конф. "Гаметная и зиготная селекция растений": Тез. докл.-Кшаенев: Штиинца, 1986. -С. 54.

42. Сидоров В.А. Экспериментальный мутагенез растений in vitro // Всесоюзн. конф. по генетике соматических клеток в культуре: Тез. докл.-Москва, 1986.-С. 128.

43. Зубко М.К., Сидоров В.А. Соматическая гибридизация как метод генетического анализа растений // Всесоюзн, конф. по га-нетике соматических клеток в культуре: Тез. докл.-Москва, 1986.-С. 108-109.

44. Сидоров В.А., Зубко М.К., Коломиец М.П., Кшарницкий И.К. Анализ мутаций хлорофиллдефектности у растений пра помощи слияния протопластов // Генетика.-1987.-23, B2.-G. 3II-3I6.

45. Сздоров В.А,, Сидорова Н.В. Сомаклональная изменчивость -источник генетического разнообразия у растений // Цитология а генетика.-1987.-21, >53.-С. 230-237,

46. Жала Э.Д., Кучко A.A., Сидоров В.А. Хромосомная изменчивость протопластов картофеля // Цитология а генэтяка.-1937.-21, JJ2.-C. 105-108.

47. Сидоров В.А., Матвеева Н,А. Некоторые аспекта клеточной технология пшеницы // Всесоюзн. конф. по биотехнологии зла-ковыз культур: Тез. докл.-Алма-Ата, 1988.-С. 48.

48. Кучко A.A., Сидоров В.А., Марунепко И.LI. и др. Способ получения растений из Пильняков картофеля в культуре ткана: A.c. 1269293 СССР, АС 12 »55/00.

49. Сидоров В.А., Кучко A.A., Зубко М.К., Глеба Ю.Ю. Питательная среда для культивирования растительных клеток ц протопластов: A.c. I33I892 СССР, АС 12 1*5/00.

50. Сидоров В.А., Самойлов В.М., Глеба D.D. Способ получения растеняй-регенерантов картофеля из протопластов: Пол. реш. по заявке на А.о. СССР М629087/31-13(182841)от ¡£.06.1989.

51. Сидоров В.А., Самойлов В.М., Глеба D.D. Способ получения растений с чужеродной цитоплазмой: Пол. pea. по заявке на A.c. СССР #4629089/31-13(182839) от 29.06.1989.

52. Сидоров В.А., Самойлов В.М., Глеба D.D. Способ выделения

in vitro цитоплазматипеских мутантов, позволяющий сохранять г<?терояиготность исходных 1орм растений: Пол. реи. по заявке на A.c. СССР .14221902/31-13(119766) от 28.1Г.1983.

53. Садоров В,А., Глеба Ю.Ю., Самойлов В.М. Способ микроразмножения растений картофеля in vitro : Пол. реш. по заявке на А.с. СССР «4388888/13(036119) от 28.09.ISS8.

54. Самойлов В.М., Сидоров В.А., Шевченко С.Н. д др. Способ выявления цибридов среди растеняй-регеиерантов, полученных при соматической гибридизации: Пол, реш. по заявке на А.с. СССР №4655694/13-029961

55. QXeba i.Y., Sidorov V. ft,, Kotaarnitsky I.К. Sonatic hybridization of higher plants // Acta Biol. Hungarica.- 1986 Suppl.-

2Z.-P. Ш.

56. Hegrutiu I., Brouwer D.D., Watte J.W., Sidorov V.A. et al. Fusion of plant protoplasts: a study uning auxotrophic mutants of ilicotiana plurabacinifojia, Viviarii // Theor. Appl. 0enet.-I966.-22.-P. 279-286.

57. Dirka В., Ilegi'utlu X., Jacobs K., Sidorov V. Isolation of auxotrophic mutants bgsed on reconstruction experlaente with iilcotisaa plucba.iinifoJia protoplasts // Genetic Manipulation in Plant Breeding.-Berlin: Walter de Qruyter, 1936.-P.599-600.

58. Foraelaer I,, Canmanrts С., Karp Д., Sidorov V, et al. Cellular engineering by "garaaa fusion" and "egg transformation". Recent experimental data and applications in plant breeding // Huclenr Techniques and in vitro Culture for Plant Inprove-cont.-Vienna: IAEA, 1956.-P. U5}-hGl,

59. Sidorov V.A., Zubko M.K., Kuchko A.A., Komorniteky 1.К., Gleba Г.У. Somatic hybridization in potato: use of ^-irradiated protoplasts of Solanua pinnaticoctum in gonotic recosstruc-tlcn // Theor. Appl. Genot.-I937.-2^.-P., 36^-363.

60. Sidorov V.A., Zubko M.K., Sonraylov V.H. et al. Selectable иагкегв in' potato: further progress in fusion experiraente // Abstr. of 7th Intern. Protoplast Symp. I987.-'iTageningen, 1967.-P. 166.

61. Iiinnisdaelc S., Hegrutiu I., Jacobs M.„ Sidorov V. Plant somatic cell hybridization: evaluations and prospectives // New8letter.-I988.-N.55.-P.. 2-10.

62. Gleba Y.Y., Hinnisdaels S., Sidorov V.A. ot al. Intargeaoric acymaetric hybrids between Nicotiana plutabaGlttifolia cad, &t-ropa belladonna obtained by са®ла-fusion // Theor, Appl. Genet.-I9&8.-2&. И.5.-Р. 760-766.

63. Sidorov V.A.,' Saaoylov V., Saroylov A. et al. Potato traao-

genones possessing geaetic material of different Solaaum species // XII EÜCAKPIA Congress: Poster Abstr. Science for Plaflt Breeding, Part I.-Göttingen, 1989.-P. 8-4.

64. Sidorov V.A., Sonoylov V., PogrebnyaJt N., GLeba Y. Potato cybrids with cytoplasa froa different Solsnua species // In Vitro /USA/.-I989.-iUb H.3.-P. 67A.

65. Facielaer Y., Gieba Y.Y,, Sidorov V.A. et al. Intrageneric asymmetric hyhrids between Nlcotiana pluabagini folia and Hi-cotiaaa sylvestris obtained by "gacaa-fusion." // Plant Science.-1939.-61.-P. 105-11?.

66. Сидоров В.А., Самойлов B.M., Дубинин В.Л. Селекция in vitro цптсплазматических мутантов картофеля // Генетика.-1889.-в печати.

67. Сидоров В.А., Моргун В.В., Матвеева H.A., Догвинеияо В.5. Ввделеняе и характеристика мутантов шзешщы, устойчивых к s-аманоэтдлцистеину я лазину,треонину // Цитология и генетика. -1989. -а печати.

68. Сидоров В.А., Самойлов В.М., Самойлов A.M. и др. Цябрдды картофеля с цитоплазмой различных видов пасленовых // Докл. АН СССР.-в печати.

69. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция.-Киев: Наук.думка, 1990.-2В п.л.

ВФ /ю. '-i ^f Подписано к neun _ lüfi ? г.

Уск.-вза.я. _ Заказ № ¡-"о Тираж 100 эьз.

Киев, ВНИС, рогаприаг