Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ мутантов Chlamydomonas reinhardtii, устойчивых к норфлуразону

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ мутантов Chlamydomonas reinhardtii, устойчивых к норфлуразону"

Сацкт-Петербургский государственный университет

1 1 НОЯ 1336

На правах рукописи

УДК 575.24 : 557.355.2+582.133.1

----------Заяданы БОЛАТХАН

Генетический анализ мутантов ^СЪЫтуйот(та&.гетЬагйШ,— устойчивых к норфлуразону.

специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертациина соискание____

учёнойстепени кандидата биологических наук

Санкт-Петерб^^ ______1996___

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

А-СЧунаев (БиНИИ СПбГУ).

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Б.ВТромов {БиНИИ СПбГУ), доктор биологических наук В.ГЛадыгин (ИПФС РАН).

Ведущее учреждение. Институт Физиологии Растений РАН

Защита состоится пг~/_1996 года ъ/^часов на

заседании Диссертационного совета Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук в Санкт-Петербургском государственном университете *

по адресу. 199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, д7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета. Автореферат разослан _199б года.

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследований. Сельскохозяйственное производство основано на применении различных продуктов химической промышленности и. в частности, гербицидов. Оценка эффектов гербицидов на биоценоз в целом и на отдельных ею представителей является одной из актуаль ньгх задач экспериментальной биологии.

Норфлуразон - это гербицид пиридазинонового ряда. Пири-дазиноны обладают множественным действием на фотосинтетический аппарат растений. В сельскохозяйственной практике эти соединения используются как предпосевные гербициды против широколиственных сорняков (Гояьдфот-.д л Кзрзпстяи, 1989).

Хламидомонада (СМатуЖтюпал гешплгаш Одп^еагй), - почвенная одноклеточная зелёная водоросль, представляет собой удобную модель для решения ряда генетических вопросов, в том числе выявления генетических эффектов действия химических препаратов. Изучение последствий действия гербицидов на дикие и мугантные штаммы хламидомонады представляет интерес как в плане расширения наших знаний о биологическом действии факторов, загрязняющих окружающую среду, так и в плане расширения возможностей генетического анализа у модельных объектов в ¿результате выявления новых генетических признаков. У хламидомонады известны мутанты по биосинтезу каротиноидоп, однако не описаны мутанты по фитоиндесатуразе - ключевому ферменту биосинтеза каротшюидов. Норфлуразон специфически иигибирует фигоиндесатуразу. Поэтому есть основания полагать, что изучаше действия норфпуразона на СЬ (мпуск)топач гетИагЛИ позволит подойти к постановке вопроса о генетической регуляции биосинтеза каротиноидов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение последствий действия гербицида норфлуразона на зелёную водоросль СН ¡атуЖтопах геШшгЛИ . Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Сравнить чувствительность к норфлуразону клеток штаммов дикого типа и мутантных штаммов СЫатусЬтопаь Teinha.Td.tii в различных условиях культивирования.

2. Получить мутанты, устойчивые к норфлуразону, изучить их фенотипические характеристики

3. Провести генетический анализ полученных мутантов Chlamydomonas reinhardtii, устойчивых к норфлуразону.

4. Провести анализ фенотипических характеристик норфлуразон-устойчивых мутантов Chlamydomonas reinhardtii биофизическими и биохимическими методами.

5. Изучить взаимодействие генов норфяуразон-устойчивости и генов, контролирующих признаки хлоропласта.

Научная новизна. Впервые описано действие норфлуразона на дикие и мутантные штаммы Chlamydomonas reinhardtii в различных условиях культивирования. Показано, что штаммы дикого типа наиболее чувствительны к норфлуразону в миксотрофных условиях. Получены спонтанный и УФ-индуиированные мутанты, устойчивые к норфлуразону.

Гибридологический анализ показал, что у всех изученных мутантов устойчивость к норфлуразону обусловлена мутациями в ядерных генах. Скрещивания выявили наличие, как минимум, трёх независимо наследуемых генов, контролирующих признак устойчивости. У мутантов Nfr-1, Nfr-3, Nfr5, Nfr-б и Nfr-7 устойчивость определяется мутациями в гене п/т-1 ; у мутантов Nfr-1 и Nfr-З, кроме того, присутствуют мутации гена nfr-З ; у мутанта Nfir-4 устойчивость определяется мутантной аллелью гена n/r-2 . Показано, что мутант Nfr-4 по гену nfr-2 не накапливает фитоина в присутствии норфлуразона в миксотрофных условиях. Мутанты Nfr-1 (nfr-1 nfr-З ), Nfr-6 (nfrl )и Nfr-7 (nfr-1 ) имеют более высокую интенсивность флуоресценции хлорофилла в условиях фотоингибирования фотосинтеза по сравнению с исходным штаммом.

Обнаружено, что мутанты по хлоропластному гену psbA проявляют повышенную чувствительность к норфлуразону в фотоавтотрофных условиях. Наследование норфлуразон-чувстви-тельности определяется взаимодействием хлоропластшго гена psbA и ядерных генов генетического фона.

Практическое значение. В работе дана дополнительная фено-типическая и генетическая характеристика штаммам Петергофской генетической коллекции микроводорослей - основы генетических и микробиологических исследований с хламидомонадой в Санкт-Петербургском государственном университете и в других научных организациях в России и за рубежом. Штаммы, несущие гены норфлуразон-устойчивосга, выделенные в ходе настоящей работы, могут быть предложены в качестве моделей для генетических, физио-

логических, биохимических и молекулярно-биологических исследований. Ввиду известного сходства мутаций устойчивости в белке D1 у сельскохозяйственных растений и водорослей, обнаруженная нами чувствительность к норфлуразсяту мутантоп, устойчивых к диурону и атразину, позволяет рекомендовать использование норфлуразона в агроценозах, ранее нодвергавтпихся действию атразина или диуропа.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Iii -м съезде Всероссийского Общества Физиологов Растений (Санкт-Петербург, 1993), Т -м съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (Саратов, 1994), 6-й и 7-й Международных конференциях по клеточной и молекулярной биологии хгааадомсяиды (Т*ао Сити, США. 1994 г., PercHoiypi. Германия, 1996г.), научной сессии, посвященной 73-летию кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета, (1994), Т(ХТ) Международном совещан1ш и школе по эволюционной физиологии, Санкт-Петербург, 1996 г., заседании секции биофизики Московского Общества Испытателей Природы, 1996 г.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 работ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, четырех глав с изложением экспериментальных результатов, заключения, выводов Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц, 23 рисунка и список литературы, содержащий 1б1 наименование работ отечественных и зарубежных авторов.

Исходный материал и методы исследования.

Исходным материалом исследования послужили штаммы зелёной водоросли Chtamydomonax reinkardtii из коллекции отдела генетики БиНИИ Санкт-Петербургского государственного университета (Квитко и др., 1983), а также из Центра Генетики Chlamydomonas Дюкского университета (США). Состав сред и условия культивирования описаны ранее (Столбова, 1971; Квитко и др., 1983; Harris, 1989). Для получения устойчивых к но^шуралону мутантов мы применяли ультрафиолетовое излучение с длиной волны 254 нм. Процедура скрещиваний и тетрадный анализ соответствуют описанным в литературе (Столбова, 1971; Harris, 1989). Обработку результатов

расщеплений в потомстве скрещиваний проводили, применяя метод X2 (Глотов и др., 1982). Тип спаривания определяли по методу Сэджер (Sager, 1956). Проверку устойчивости и чувствительности клеток к норфлуразону осуществляли подращиванием культур при температуре + 25* в темноте на плотной минимальной среде с ацетатом натрия (в гетеротрофных условиях), при люминесцентном освещении 2000 люкс на плотной минимальной среде с ацетатом натрия (в миксотрофных условиях), либо без ацетата натрия (в фотоавтотрофных условиях) с добавкой от 2,5 до 7,5 мкМ норфлуразона. Содержание пигментов в клетках определяли по спекграм поглощения ацетоновых экстрактоа Спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометров СФ-10 и Specord UV-VIS, Содержание пигментов в клетках определяли методом ВЖХ. (высокоэффективной жидкостной хроматографии) (Emst and Sandmann, 1988; Broumann and Grimme, 1981). Выход быстрой флуоресценции в лабораторных условиях измеряли при помощи импульсного флуориметра (Лядский и др., 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Действие норфлуразона на вегетативные клетки

Chlamydomonas reinhardtii в различных условиях.

Мы анализировали коллекционные штаммы Chlamydomonas reinhardtii с целью выявления полиморфизма реакции на действие ингибитора. Нами были проверены мутанты без хлорофилла Ь, мутанты устойчивые к антибиотикам, светочувствительные и ауксотрофные мутанты, мутанты по хлоропластному гену psbA, а также мутант без клеточной стенки,

В миксотрофных условиях норфлуразон при концентрации 2,5 мкМ подавлял рост колоний штаммов дикого типа, тогда как в фотоавтотрофных условиях рост штаммов дикого типа наблюдали и при концентрации норфлуразона 5 мкМ, а в гетеротрофных условиях рост штаммов дикого типа наблюдали и при 7,5 мкМ. Наши опыты выявили, что штаммы СС-2059, СС-2060, СС-2473, несущие мутантные аллели хлоропластного гена psbA, более чувствительны к 5мкМ норфлуразона по сравнению со штаммами дикого типа Chlamydomonas reinhardtii в фотоавтотрофных условиях.

В гетеротрофных условиях при концентрации 3 мкМ норфлуразона наблюдалось посветление зелёной окраски колоний у

штаммов СС-2059, СС-2060. При 5мкМ ослабление пигментации отмечено у штаммов дикого типа СкЫтуйотогш гетИагёШ. Наши

данные позволяют нам разделить изученные штаммы по чувствительности к норфлуразону в различных условиях на 4 группи.

I группа: чувствительные к норфлуразону штаммы СС-2059> СС-2060. Они чувствительны к норфлуразону в фотоавтогрофных, миксотрофных и гетеротрофных условиях.

[I группа: штамм СС-2473 чувствительный к норфлуразону в фотозвтотрофных и миксотрофных условиях.

Ш группа; штаммы дикого типа и мутантный штамм без клеточной стенки, штаммы без хлорофилла Ь, ауксотрофные по аргинину, эритромицинустойчивые и сгрептомицин>'СГойч1шые мутанты. Они чупгтютглкнм к норфлуразону в микгстфофнш: условиях

IV труппа: светочувствителышй штамм N-13. Этот штамм чувствителен к норфлуразону в гетеротрофных условиях

2. Получение мутантов СМат^отопт тетЬагйШ. устойчивых к норфлуразону в миксотрофных условиях

Поскольку штаммов, устойчивых к норфлуразону, в коллекции нами выявлено не было, последующей нашей задачей было их получение. Исходным штаммом служил штамм дикого типа СС-124. Отбор производили а миксотрофных условиях при концентрации норфлуразона 5 мкМ. Нами был использован метод пндуциропатюго мутагенеза. В результате серии опытов мы отобрали 1 спонтанный и 20 индуцированных мутантов

3. Фенотипическая характеристика мутантов СЫатуёотопа5

тпИагЖП, устойчивых к норфлуразону.

В результате изучения содержания фитоина у штаммов СЫатус1отопаз гетИаЫШ, мы обнаружили, что лишь один из нор-флуразон-устойчивых штаммов, а именно, ЖМ, не накапливает фитоина при выращивании в миксотрофных условиях в присутствии и в отсутствии норфлуразона в среде (Рис 1). Штаммы №г-1 и Ийт-З накапливали фитоин на свету в среде без норфлуразона.

ЛИКИИ №г-Г3\Тг-2Жг-ЗЖг-4№г-5Шг-6 №г~7

тип

Щ без норфлуразона В с норфлуразоном

Рис.1. Накопление фитоина у штаммов СЬШшуёотогшз

гетЬагсМи

Fv/Fm

СС-Ш Жг-6 №г-1 Жг-7

СП без норфлуразона; Ш без норфлуразона, 1,1 часа освещения; Ц после 3-х дней в среде о норфлуразоном; Ц после 3-х дней в среде с норфлуразоном , 1,3 часа освещения.

Рис. 2. Соотношение у пггаммов Chlamydomoшs гепйгагски в

среде с хлорамфениюолом без норфлуразона и с норфлуразоном

Изучение биофизических параметров мутантов, устойчивых к норфлуразону показало, что у трёх мутантов (Nfr-1, Nfr-6, Nfr-7) при

выращивании на среде без норфлуразона интенсивность флуоресценции (Fm) была выше, чем у штамма дикого типа СС-124. У одного мутанта, Nfir-4, интенсивность флуоресценции была ниже, чем у штаммов дикого типа. У мутанта N-13 по гену ¡¡s-4 , накапливающего фитоин d среде без норфлуразона, индукция флуоресценции не обнаруживается.

В результате исследования фотоингибирования штаммов Chtamydomonas reinhardtii, устойчивых к норфлуразону, иа свету интенсивностью 25 Вт/м2 в среде с хлорамфениколом обнаружено снижение фотоингибирования у мутантов Nfr-1, Nfr-6 и Nfr-7 по сравнению го пггаммом дикого типа (Рис. ¿).

4. Гибридологический анализ мугантных штаммов Chlamydomonas reinhardtii, устойчивых к норфлуразону в микеотгххЬных условиях.

Гибридологический анализ признака устойчивости мутантов к норфлуразону в миксотрофных условиях - Nfr (norflurazon resistance), преследовал цель выявления характера наследования этого признака.

Мы скрещивали мутантные штаммы Chlamydomonas reinhardtii, устойчивые к норфлуразону, со штаммами дикого типа. Результаты анализа тетрад и случайной выборки мейозоспор показывают, что мутанты Nt'r-5, Nfr-7, Nfr-4 дают расщепление в потомстве, соответствующее теоретически ожидаемому 1:1, что свидетельствует о моногенном наследовании признака устойчивости У двух других мутантов (Nfr-1, Nfr 3) в потомстве наблюдалось преобладание мутантного фенотипа. Эти результаты позволяют нам предполагать, что здесь мы имеем дело с расщеплением по двум несцепленным -ядерным генам, каждый из которых в отдельности обеспечивает устойчивость к норфлуразону (Табл. 1).

Скрещивания норфлуразон-устойчивых мутантов между собой выявили наличие, как минимум, трёх, независимо наследуемых генов, контролирующих признак устойчивости (Табл. 2). Как видно из таблицы 2. сегрегант Сб-1а "нлюс"-типа спаривания, полученный в потомстве скрещивания штамма Nfr-4, не даст расщеплении по признаку устойчивост и при скрещивании с родительским пггаммом,

- ю -

Таблица 1. Результаты гибридологического анализа зигоспор от скрещиваний мутантов, устойчивых (И) к норфлуразону, со штаммом дикого типа 26 тг+, чувствительным^) к норфлуразону в миксо-

Шифр Число Выжива Выжива Случайная выборка

родителя и типы емоггь емость Количес- Вероятность

mt~ типа тетрад зиго- зоо- тво сегре Р(Но) соот-

спари- спор, спор, гантов ветствия

вания гипотезе

2R2S 3K1S 4R0S % % R: S 1R1S 3R:1S

Nfr-5 12 0 0 70,2 24,3 104:98 >0,95 <0,05

Nfr-7 10 0 0 44,0 13,0 154: 148 >0,95 <0,05

Nfr-4 14 0 0 48,2 15,0 92 : 88 >0,95 <0,05

Nfr-l 0 8 0 89,8 30,1 94 : 30 <0,05 >0,95

Nfr-З 0 6 0 35,3 4,2 72 : 22 <0,05 >0,95

но даёт расщепления по этому признаку при скрещивании с другими норфлуразон-устойчивыми мутантами. В то же время, ссгрегант С7-1с из потомсгва штамма Nfr-7 не даёт расщеплений при скрещивании с этими же мутантами. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что у мутантов Nfir-1, Nfr-З, Nfr-5, Nfr-6, Nfr-7 устойчивость определяется мутациями в одном и том же гене (названном нами nfr-l от английского обозначения признака norflurazon resistance), а у мутанта Nfr-4 устойчивость определяется мутантной аллелью другого гена -nfr-2 . Анализ соответствия теоретически ожидаемому расщеплению 3R : IS для скрещиваний сегреганта Сб-la с мутантами Nfr-5, Nfr-6, Nfr-7 даёт значения х2, не позволяющие отбросить нулевую гипотезу. Для скрещиваний сегреганта Сб-la с мутантами Nfr-l, Nfr-З значения у^ позволяют отбросить гипотезу о расщеплении дигетерозиготы. В то же время, в этих скрещиваниях происходит расщепление по типу наследования трёх несцепленных между собой генов, каждый из которых определяет признак устойчивости к норфлуразону (7R:1S). Этот вывод соответствует данным о наследовании признака устойчивости в скрещиванях мутантов Nfr-l и Nfr-З со штаммами дикого типа (Табл. 2). Несут ли эти мутанты кроме аллелей гена nfr-l , мутации в двух разных генах или в одном и том же гене nfr-З, может быть предметом последующего экспериментального изучения,

Таблица 2. Анализ скрещиваний норфлуразон-устойчивых мутантов между собой.

Шифры штаммов ГСНОТШШ Количество колоний сегрегантов в случайной выборке Вероятность Р(Но) соответствия гипотезе Всего полных тетрад

Всего колоний Количество чувствительных колоний Количество устойчивых колоний 3R1S 7R1S

Nfr-1 х С6-1а nfr-1 nfr-3x nfr-2 132 22 110 <0.05 >0,50

Nfr-З х С6-1а nfr-1 nfr-3x nfr-2 120 20 100 <0.05 >0,50

Nfr-4 х С6-1а nfr-2 x nfr-2 102 0 102 <0.05 <0,05

Nfr-5 х С6-1а nfr-1 x nfr-2 140 42 98 >0,50 <0,05 3(3R:1S)

Nfr-б х С6-1а nfr-1 x nfr-2 150 42 108 >0.25 <0,05

Nfr-7 х С6-1а nfr-1 x nfr-2 110 30 80 >0,25 <0,05 4(3R: 1S)

Nfr-1 х С7-1с nfr-lnft-3 x nfr-1 114 0 114 <0,05 <0,05

Nfr-З х С7-1с nfr-1 nfr-3x nfr-1 121 0 121 <0,05 <0,05

Nfr-5 х С7-1с nfr-1 x nfr-1 92 0 92 <0,05 <0,05

Nfr-б х С7-1с nfr-1 x nfr-1 88 0 88 <0,05 <0,05

Nfr-7 хС7-1с nfr-I x nfr-1 102 0 102 <0,05 <0,05

i

>—i

i—i

i

5. Взаимодействие генов ногхЬлуразон-устойчивости с хлооопластным и ядерным генами, контролирующими признаки хлоропласта.

Мутанты, несущие мутации в хлоропластом гене р$ЬА, определяющие устойчивость к диурону проявляют чувствительность к норфлуразону в фелшвтотрофных условиях. Результаты скрещивания диурон-устойчивого штамма СС-2473 со штаммом дикого типа СС-124 показывают, что всё потомство в 19 тетрадах устойчиво к диурону, в соответствии с однородительской хлоропластной схемой наследования. В половине всех тетрад (в 9 из 19) нет устойчивых сегрегантов, то есть наследование норфлуразон-чувствигельности определяется мутацией хлоропластного гена. В остальных случаях наследование норфлуразон-чувствигельности определяется взаимодействием хлоропластного гена р$ЬА и ядерных генов генетического фона, перекомбинация которых объясняет появление одного из четырёх (в 8 тетрадах) или двух из четырёх (в 2 тетрадах) устойчивых сегрегантов (Табл. 3).

Таблица 3. Тетрадный анализ расщеплений по признакам устойчивости (Я) и чувствительности (Б) к норфлуразону в фотоавто-трофных и в миксотрофных условиях в скрещиваниях мутантов по гену рьЬА_

Шифры родительских штаммов Всего тетрад Условия регистрации чувствительности^) и устойчивости (К) к норфлуразону Число тетрад с соотношением

(Ж45 т-зэ ЗЙЗЙ 2й25 ЗШБ

СС-2473хСС-124 19 фотоавтотрофные 9 8 2

СС-2059х СС-79 5 фоггоавгсггрофные 4 1

СС-2059х№г-4 7 фотоавтотроф! шс 6 1

миксотрофные 2 5

СС-2473 х№т-5 26 фотоавтотроф11ые 8 18

миксотрофные 6 1 16 3

СС-2059хКГг-7 И фотоавтотрофные 1 10

миксотрофные 1 5 5

Примечание : все потомство несло хлоропластый ген усгойчивосги к диурону р&Л

Скрещивания мутантов по гену р$ЬА с мутантами, устойчивыми к норфлуразону в миксотрофных условиях, показали, что чувствительность к норфлуразону в фотоавтотрофных условиях и устойчивость к норфлуразону I) миксотрофных условиях представляют собой два разных генетических признака (Табл. 3). Отличие в этих скрещиваниях расщеплений по устойчивости к норфлуразону в миксотрофных условиях от моногенного, характерного для наследования мутантных аллелей генов п/т-1 и п/г-2 в ск]>ещиваниях норфлуразон-устойчивых мутантов со штаммами дикого типа, свидетельствует о влиянии хлоропластного генома и ядерных генов генетического фона также и на признак устойчивости к норфлуразону в миксотрофных условиях (сравните Табл.. 1 и Табл. 3).

В результате скрещивания тторфгуразоп-з-гтйттгапго мутанта !Чйг-4 со светочувстзигельньил штаммом N-13 мы получили двойные мутанты п/г-2 Ш-4 . В тетрадный анализ было вовлечено более 1000 потомств зигоспор, однако, большая часть мейотического потомства оказалась легальной. Полных тетрад получено не было. Реконструкция 10 неполных тетрад, т. н. "троек", в которых только один из четырёх мейогических продуктов оказывался летальным, в двух из которых были обнаружены двойные мутанты, показывает, что из 5 летальных генотипов А представляют собой двойные мутанты п/г-2 11.Ч-4. Мы отобрали двойной му-гант и в случайной выборке мейозоснор из этого скрещивания. В скрещивании этого двойного мутанта С9-2а со штаммом дикого тана наблюдалось расщепление 60 светочувствительных к 156 светоустойчнвых и 49 норфлуразон-усгойчивых к 117 морфлуразон-чувствитеяьных.Это доказывает, что полученный нами светочувствительный норфлуразон-устойчивый двойной мутант С9-2а \its-4 п/г-2 ) нссёт гены светочувствительности 11а-4 и норфрлуразон-устойчивости п/г-2 . В результате изучения содержания фитоина показано, что двойной мутант С9-2а (Ш-4 п/г-2 ) не накапливает фитоина, тогда как сегрсгант С9-5а генотипа (¡$-4 N111-2 накапливает фитоин при выращивании в гетеротрофных условиях в отсутствии норфлуразона (РисЗ)

- 14 -

без норфлуразона,

темнота

с норфлуразоном, темнота

дикий тип, 26+ 0,5 мкМ норфлуразона

в)

0,5 мкМ норфлуразона

Ля-4 (С9~5а)

(С9-5а), 0,6 мкМ норфлуразона

ад

л/г-Ж9-2а), 0,5 мкМ норфлуразона

! < «

Рис. 3. Хромато'граммы экстрактов из клеток штаммов СЫатуйотопаэ гетЬагШИ. Стрелками обозначено положение пика фитоина на хромато-граммах.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано действие норфлуразона на штаммы

СЫатуёотопаз гетИагёШ в различных условиях культивирования.

Показано, что норфлуразои в концентрации 2.0 мкМ и выше ингибирует рост колонии штаммов дикого типа в мнксотрофных условиях. Эта концентрация норфлуразона не является ингибирующсй для штаммов дикою типа ни в гетеротрофных условиях, ни в фотоавтотрофных условиях.

2. Получены спонтанные и индуцированные УФ-излучением муганты от штамма дикою типа, обладающие устойчивостью к норфлурзэону в диапазоне кояпентрзпий от 5 до 10 мкМ в миксо-ттхэфшлх условиях.

3. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии у устойчивого штамма №г-4 показано отсутствие накопления фитоина (в отличие от штамма дикого типа и от норфлуразои-устойчивых мутантов №-1, №г-3, №-5, №г-6, N№-7) в присутствии норфлуразона в михсотрофных условиях. У мутантов N11-1 и зарегистрировано накопление фитоина в мнксотрофных условиях на среде без норфлуразона.

- !. Норфт"разон-устойч1шь1с мутанты отличаются от штамма дикого типа по параметрам кривой индукции флуоресценции. Штамм N11-4 имеет пониженную и .тенсивность флуоресценции. а штаммы КТг-1. КГг-6, КСг-7 - повышенную интенсивность флуоресценции. В условиях фотоингибнрованим фотосинтеза штаммы КГг-1, N11-6 и №г-7 проявляют повышенную интенсивность флуоресценции по сравнению со штаммом дикого тина как в присутствии, так и в отсутствии норфлуразона.

5. Гибридологический анализ показал, что у всех изученных мутантов устойчивость к норфлуразону обусловлена мутациями в ядерных генах. В скрещиваниях мутантов N№-5, N6--7, №г-4 обнаружено моногенное расщепление по признаку устойчивости, у №г-1, N№-3 - дигеннос. Скрещивания иорфлуразон-устойч1шых мутантов между собой выявили наличие как минимум трёх независимо наследуемых генов, контролирующих признак устойчивости У мутантов Ый>1, №г-3, №г-5, №г-б, ЫГг-7 устойчивость определяется мутациями в гене п/г-1 , у мутантов Жг-1 и N£1-3, кроме того, присутствуют мутации гена п/г-З , у мутанта №г-4 устойчивость определяется мутантной аллелью гена п/г-2.

6. Получены двойные мутанты, несущие мутации норфлуразон-усгойчивости nfr-2 и светочувствительности lts-4 . Двойной мутант не накапливает фитоина при выращивании в гетеротрофных условиях. Таким образом, мутация в гене nfr-2 эпистатирует проявление мутантной аллели lts-4 , выражающееся в накоплении фитоина в гетеротрофных условиях

7. Мутанты, несущие мутации в хлоропластом гене psbA, определяющие устойчивость к ингибиторам П-й фотосистемы, проявляют повышенную степень чувствительности к норфлуразону в фотоавтотрофных условиях. Результаты скрещивания диурон-устойчивого штамма СС-2473 со штаммом дикого типа СС-124 показывают, что в половине всех тетрад наследование норфлуразон-чувствительности определяется мутацией хлоропластного гена, а в остальных случаях - взаимодействием хлоропластного и ядерных генов генотипического фона.

8. Скрещивания мутантов по гену psbA с мутантами, устойчивыми к норфлуразону в миксотрофных условиях, показали, что чувствительность к норфлуразону в фотоавтотрофных условиях и устойчивость к норфлуразону в миксотрофных условиях представляют собой два разных генетических признака. Отличие расщеплений в этих скрещиваниях от моногенного, характерного для наследования мутаций норфлуразон-устойчивосги в скрещиваниях со штаммами дикого типа, свидетельствует о влиянии хлоропластного генома также и на признак устойчивости к норфлуразону в миксотрофных условиях

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. АР. Звинчук, А.С Басов, A.B. Столбова, 3. Болатхан, КВ. Квитко., АСЧунасв. Мутанты микроводорослей, перспективные для нужд биотехнологии. // Фотосинтез и фотобиотехнология. Тез. докл. международной конференции. Пущино, 1991., С 85.

2. Чунаев A.C., Звинчук АР., Салимова ЕФ., Болатхан 3,, Чекунова Е.М., Никулина КВ., Мирная О.Д, Борщевская Т.Н. Пополнение Петергофской генетической коллекции микроводорослей и каталогизация новых штаммов Chlamydomonas reinhardtii. //Изогешше линии и генетические коллекции. Второе совещ-ание. Новосибирск, 1993, С 150-153.

3. Звинчук АР, Болатхан 3., Салимова Е.Ф., Крёнинг Р., Боскегги А, Чунаев АС. Мутанты Chlamydomonas reinhardlii, устойчивые к

норфлуразону. /Дез. докл. ПТ-го съезда Всероссийского общества физиологов растений. Санкт-Петербург, 1993, Т.6, С575.

4. Болатхан 3., Салимова Е.Ф., Звинчук АР., Боскетги А, Чунаев АС. Два типа мутантов Chlamydomonas reinhardlii, отобранных по устойчивости к норфлуразону. // Генетика, 1994 Т. 30, Приложение. С. 17.

5. Zvintchouk A.R., Saiiraova E.F., Boiathan Z, Kroening R., Bosclietti A, Chunaev AS. Norflurazon-resistant mutants in Chlamydomonas reinhardlii. // Sixth International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas. Tahoe City, USA 1994. P.46.

6. Болатхан 3., Звинчук АР., Боскегги А, Чунаев, АС Изучение ссдерллнга фпгоппа и реакций па тторфтгуразон культур клеток эука риотичсскон зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii. // I (XI) Международное Совещание и Школа по эволюционной физиологии, посвященные памяти академика ЛАОрбели и 40-летию Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М. Сеченова PAIL . Тездокл. Санкт-Петербург, 1996 г. С. 22-23.

7. Zvintchouk A, Boiathan Z., Boschetti A, Chunayev AS. Phytoene accumulation and norflurazon sensitivity in Chlamydomonas reinhardtii mutants. // Seventh International Conference on the Cell and Molecular Biology of CtiIamyriomonas.Rcgcnsburg, Germany. 1596. P.40.

8. Болатхан 3.. Салимоде Е.Ф., Вавияин Я В., Звинчук АР., Чунаев АС. Маторин Д.Н. Исследование (флуоресценции хлорофилла в клетках мутлгтов Chlamydomonas reinhardtii, с разной устойчивостью к гербициду норфлуразону. // Доклады Московского Общества Испытателей Природы. Об шля биология, 1996 (рукопись депонирована в ВИНИТИ).