Регуляция хемотаксиса в жизненном цикле одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii

Никитин, Максим Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция хемотаксиса в жизненном цикле одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция хемотаксиса в жизненном цикле одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

НИКИТИН Максим Михайлович

Регуляция хемотаксиса в жизненном цикле одноклеточной зеленой водоросли СЫатуйотопаъ гетИагйШ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2006

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Биологического научно-исследовательского института Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» Федерального агентства по образованию и в отделе биохимии и молекулярной биологии университета г. Кордоба (Испания).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ермилова Елена Викторовна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Симаров Борис Васильевич

доктор биологических наук, профессор Карпов Сергей Алексеевич

Ведущая организация: Институт Цитологии РАН

Защита состоится «IV » _ 2006 г. в часов на заседании диссертационного

совета Д 212 232.07 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Биолого-почвенный факультет СПбГУ, аудитория\!&>

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке имени А М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « 5"» фдд^^Д. 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е. И. Шарова

/.eetA H 93

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Направленное движение клеток в ответ на действие внешних стимулов, определяемое в литералуре как поведение, описано у многих одноклеточных организмов на разных стадиях их развития Поведение является наиболее сложной формой жизнедеятельности организма и в самом общем виде представляет собой формиру емый организмом отклик на сигналы, поступившие к нему из окружающей среды (Гаазе-Раппопорт, Поспелов, 1987) В последние годы предпринимаются многочисленные попытки определения механизмов, лежащих в основе взаимодействия подвижных клеток с окружающей средой и последующей ориентированной относительно внешнего раздражителя двигательной реакции -поведенческой реакции Поведенческие реакции часто называют таксисами Таксисы описаны у раз тичных представителей архей, бактерий и эукариотических микроорганизмов Способность к поведенческим реакциям позволяет микроорганизмам искать питательные субстраты и избегать вредных воздействий Особый интерес к изучению механизмов контроля двигательных поведенческих ответов можно объяснить как важной биотогической ролью данного явления, так и выявленными взаимосвязями регуляции поведения одноклеточных органипгов с такими ф\ н «ментальными процессами как тифференцировка клеток и межклеточная сигнализация при половом размножении.

В настоящее время наиболее подробно исследованы молеку лярные механизмы зависимого от лишенного пикта контроля систем направленного движения бактерий (Ермилова и др . 2004) У эукариотических микроорганизмов регуляция подвижности и поведения в жизненном цикле изучена главным образом у клеточного миксомицета Dictyostphum discoidcum с амебоидным типом движения (Williams, Harwood, 2003. Strmecki et al, 2005) Вместе с тем, \ одноклеточных э\кариот, обладающих жгутиками и ресничками, исследовалась в основном структурно-ф\ нкциональная организация систем движения. Подобное ограничение свя;ано с особыми требованиями, предъявляемыми к объектам исследования, и, прежде всею, с ючки зрения знаний биологии, физиологии, частной генетики и наличия разработанных методов молекулярно-генетического анализа. В этом отношении Chlamydomonas remhardtn является уникальным модельным организмом для проведения молеку лярно-генетических исследований поведенческих реакций. В последние годы достигнуты значительные успехи в расшифровке молекулярных механизмов, контролирующих у этого модельного микроор! анизма светозависимые поведенческие ответы (Ehlenbeck et al , 2002) и хемотаксис к органическим соединениям (Ermilova et ri, ¿000) С целью расширения, углубления и детализации механизмов контроля направленного др 1жзпия С reinhardtn необходим анализ дополнительных систем рецепции и передачи сигналов

чя рнных этапах жизненного цикла организма

Цель и чадами исследования. Целью настоящей работы являлось комплексное*, исследование хемотаксиса С reinhardtii к наиболее предпочтитеi ьно \t\ для микроорганизма источнику азота, ионам аммония, на разных этапах жизненного цикла, а также выяв 1ение физиологической основы взаимосвязи между процессами ассимиляции аммония и направленного движения к аммонию (хемотаксиса) Задачи работы были связаны с решением принципиальных вопросов, ранее не освещенных в литературе В частности, предполагалось экспериментально исследовать и теоретически проанализировать-

1 Хемотаксис к аммонию подвижных клеток, представляющих разные стадии

жизненного цикла' вегетативные клетки, предметы (некомпетентные гаметы), гаметы

2. Действие сигналов (голодание по источнику азота, свет), регулирующих формирование зрелых гамет, на характер реакции хемотаксиса к аммонию

3 Два типа транспортных систем для переноса аммония в клетки, транспортеров с низким сродством к аммонию (LATS) и транспортеров с высоким сродством к аммонию (HATS), у вегетативных клеток, прегамет и гамет

4 Возможну ю роль транспортеров аммония в контроле реакции хемотаксиса к аммонию.

Научная новизна. Впервые показано, что хемотактическое поведение одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomcmas reinhaidlii изменяется на разных этапах жизненного цикла Предложена модель контроля хемотаксиса к аммонию/метиламмонию в ходе гаметогенеза, согласно которой реп ляция изменений в системе хемотаксиса включает два этапа первый, контролируемый аммонием и независимый от света этап, и второй этап, контролируемый действием света Впервые проанализирована активность двух типов транспортных систем на разных этапах жизненного цикла С leinhwdtii и охарактеризованы особенности экспрессии восьми генов семейства Amtl В работе выявлена совершенно новая область использования фототрофными организмами транспортеров аммония - контроль двигательной поведенческой реакции.

Научно-практическое значение. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов регуляции транспортных систем, обеспечивающих перенос аммония Идентификация компонентов, осуществляющих передачу сигналов в клетке, является одним из важнейших шагов на пути к пониманию молекулярных механизмов работы регуляторных систем организма. Предложенный оригинальный метод определения стадий гаметогенеза на основе выявленного отличия в поведенческих ответах между вегетативными клетками и зрелыми гаметами может быть применен в исследованиях механизмов

дифференнировки Ряд данных может быть использован в учебном процессе на кафедре Микробиологии СПбГУ.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на между народной конференции «Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology» (Москва, Минск, 2001), на X международной конференции «Cell and Molecular Biology of Chlamydomonam (Ванкувер, 2002), на конференции «Генетика в XXI веке' современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), на международном симпозиуме «Biological Motility» (Пу щино, 2004)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи и 8 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях

Структура диссертации. Диссертационная рабога состоит из введения, обзора литературных чанных, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 112 страницах, содержит 10 таблиц и 33 рисунка, список литературы включает 187 наименований

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы Штаммы Chlamydnmonas reinhardtn, использованные в работе, любезно предоставлены' СС-124 - Э Харрис ("Коллекция Культур CMamydomonas Университета г Дюк, США); 620, 621 -С П\ртоном (Лондонский Университет, Великобритания), CF3, CF5 и CF46 - К Беком (Университет г Фрайбурга, Германия), CR02, CR39 и CR40 - К. Кимом (Университет Калифорнии, США).

Условия культивирования Культуры водорослей выращивали в среде ТАЯ или TMP (без Трис-апетата) (Harris, 1989) В экспериментах использовали культуры, выращенные синхронно в режиме освещения люминесцентными лампами 12 ч свет -12 ч темнота при 23°С (освещенность 2000 люкс) Для опытов культуры пересевали каждые 72 часа

Опенка хемотаксиса Реакции хемошксиса изучали капиллярным методом с использованием плоскостенных капилляров Перфильева (Ermilova et al , 1993) Для характеристики определяемой

величины по имеющейся выборке использовали среднее арифметическое X — X ± SК1 р, iде St - среднеквадратичное отклонение по выборке, tp - коэффициент Стьюдента для у ровня значимости Р = 0,05

Получение и определение процента образовавшихся гамет Процент зрелых гамет, способных

формированию зигот, рассчитывали по формуле (Beck, Acker, 1992)' ß '

% --— 100, где О - количество четырехжп гиковьтх клеток, В количество

B + 2Q

двухжгутиковых клеток, а - коэффициент, определяемый как отношение котичества тестир\ емых гамет к общему количеств\ гамет

Получение мутанта методом ннсерционного мутагенеза. Для трансформации была использована плазмида pSP124S, содержащая бактериальный ген ble, придающий клеткам устойчивость к антибиотику зеомицину (Lumbreras et al, 1998) Трансформацию прово тили линейной формой плазмиды методом встряхивания со стеклянными шариками (Kindle et al, 1989) Устойчивые к зеомицину трансформанты использовали в последл юшем отборе м\ гантов, резистентных к метиламмонию и демонстрирующих замедленный рост на среде, содержащей в качестве источника азота глутамин. Процедуры скрещиваний и тетрадного анализа выполнялись стандартными методами (Harris, 1989).

Определение поглощения (14С]-метиламмония. Вегетативные клетки из логарифмической фа!ы роста (15-20 мкг хлорофилла) осаждали центрифугированием и ресуспендировали в среде ТМР без азота Для получения прегамет и гамет клетки инкубировали 18 ч в темноте или на свету, соответственно Затем к 2 мл суспензии добавляли [14С]-метиламчоний (NEN, США) до конечных концентраций 6, 8, 12,5, 25, 50, 100 и 200 мкМ Каждые 3 минуты при постоянном перемешивании отбирали по 250 мкл суспензии, которую центрифугировали (12000 об/мин, 1 чин) в удлиненных эппендорфах с 80 мкл смеси динонилфталата (Fluka, Швейцария) с силиконом (Fluka, 60 40) Затем 50 мкл супернатанта добавляли к 2 мл специального буфера (Ready Gel, Beckman), и оценивати количество распадов ядра изотопа ,4С в счетчике LS 6000ТА (Beckman) Начальную скорость поглощения V вычисляли для каждого временного отрезка по следующей формуле

(Franco et al , 1988). V ~ —срт2 ^ Cpmj и срт2 - число распадов/мин [14С]-метиламмония

в моменты времени ti и Х2, соответственно; R - исходное число распадов/мкмоль/мин Значения Vmax и К,„ определяли графическим способом

Выделение тотальной ДНК и РНК. Вегетативные клетки (50 мл) из логарифмической фазы роста осаждали центрифугированием, осадок ресу спендировати в 1 мл буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 8, 0,3 М NaCl; 5 мМ ЭДТА, 2% SDS) и после центрифугирования супернатант отбирали, iриукды обрабатывали смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25 24.1), после чего нуклеиновые кислоты переосаждачи в хлороформе (Sambrook ct al, 1989) Для выделения ДНК образцы оставляли в 95° этаноле на 30 мин при -20°С, затем переосаждали 70° этанолом. Осадок высушивали и растворяли в воде MilliQ Для выделения РНК образцы обрабатывали 95° этанолом 3-4 часа при -20°С', после чего ресуспендировали в 4М LiCl и оставляли на 4 ч при -4°С Затем РНК осаждали из раствора двойным объемом 70° этанола и растворяли в воде MilliQ с 0,1% диэтилпирокарбонатом

Клот-гибрнднзация по Саучерну. Выделенная тотальная ДНК обрабатывалась рестриктазами Apal, PstT или PvuII (Fermentas, Канада), после чего образовавшиеся фрагменты разделяли электрофорезом в 0,7%-агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану "Nitran "N (ScMcicher&Stmell, США). Изготовление меченого зонда (ГТЦР продукт гена Ые) с использованием дУТФ-дигоксигенина, а также отмывку мембраны проводили согласно рекомендации фирмы-производителя (Bochrmger Mannheim, Германия) Детекцию сигнала производили на фотопленке XAR-5 (Kodak, США).

Метод ПЦР с предшествующей обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для синтеза одноцепочечной кДНК из тотальной РНК, выделенной из разных штаммов, использовали N-(ро1уТ)20тег праймеры в соответствии с инструкцией фирмы-производителя (Invitrogen, Нидерланды). Синтезированну ю кДНК хранили при -40°С Реакции амплификации методом ПЦР ос\ шествлялись в объеме 25 мкл со следующими компонентами- 0,2 пМ каждого праймера; 0,2 мМ смеси дeioкcиpибoнyклeoтидилфocфaтoв; 0,5 ед Taq ДНК-полимеразы (Biotools, Испания), 2,5 мМ MgCb; 1-2 мкл одноцепочечной кДНК, 2,5 мкл реакционного буфера и 2-3% диметилсульфоксида (ДМСО) Условия реакций были следу ющими- 95°С, 5 мин; 40 циклов: 95°С, 30 с, 53-68°С, 30 с, 72°С, 15 с; 72°С, 10 мин Продукты ПЦР реакции разделяли электрофорезом в 0,8%-агарозном геле Анализ гелей проводился с помощью оптической системы GelDoc 2000 (BioRad, США) и программного обеспечения Quantity One v. 4.1.

Метод ПЦР в режиме реального времени. ПЦР реакции проводились на \ становке LightCycler Instrument (BioRad lCycler iQ Real-Time PCR Detection System) в С001ве1Ствии с правилами производителя (Molecular Probes, Нидерланды), в качестве флюоресцирующего красителя использовался SYBR Green Т Реакции осуществлялись в объеме 25 мкл со следующими компонентами: 0,2 пМ каждого праймера, 0,2 мМ смеси дезоксирибону клеотидил фосфатов, 0,5 ед Taq ДНК-полимеразы (Biotools, Испания); 2,5 мМ MgCl2; 1-2 мкл кДНК, 1,25 мкл SYBR Green I, 2,5 мкл реакционного буфера. Условия реакций были следу ющими- 95°С, 5 мин, 40 циклов: 95°С, 30 с 53-68°С, 30 с, 72°С, 15 с, измерение флюоресценции (84°С, 10 с), 72°С, 10 мин Специфичность синтеза цепей ДНК проверялась программой iCycler iQ, Optical System Software V 1 В качестве контроля использовался ieii у биквчтинлигазы С icmhardtii, который экспрессиру ется констит\ тивно Скорость синтеза цепи ДНК каждо! о транскрипта (Cf) ьычлелялась по методу PCR Base I me программного обеспечения I iglitCy ~ler ("iCyclcr iQ, Optical System Software v 3) при постоянном уровне флюоресценции Значения Ct определялись по трем ог.нгам по три повтора в каждом Относительная разнича уровнен экспрессии генов вычислялась г о формуле: Л = 2 «^■""«■»■"i-"^

С айт-специфическая амплификация методом ПЦР (С'СА-ПЦР). Для идентификации участков, фл'Шлиру ющи\ маркерную ДНК в мутанте hat/, были использованы праймеры, содержащие на 3'-

конце специфические последовагельности, которые соответствовали сайтам рестрикции ферментов (рис 1) Выделенная тотальная ДНК использовалась в двухэтапном ПЦР (Оопгй1ег-Ва11е81ет е! а1, 2005)

И нс ер НИХ RH R b 2 "" Ые Амипификаиия I __ ПЦР продукты Вырожденные праимеры AlulPsll SaiHTnijl I cHOMildü ДНК II ос тело вател ьн ости праймеров

Rbl_ A luí Q 0 Pul Q 0 Rbl_ ' --« Sai 11 go Rbl_ Rbl 5' А С G A G CTGTACGCCGAGTGGTC 1 A luí Q0 Л!и1 5 CLAGTGAGCAGA G TG ACG4ÍÍÍNN%4/ С AC,{ ТТ 3' Psll QO Pul 5 í C4GTGAGC4GAGTG ^fGIIIlINNSCTGCAGW 1 Saell Qll SacII V CCA G TOA G С A GA G TGACGIUIÍ\ NbCCGCGGW 1 Taql QO Taql

Taql Q0

Амплификация 11 11 Ц P и род\ КТЫ П ос тедовател ьности праймеров

Rb2 *'lul QO Rb2 Pul 00 Rb2 la, II 00 Rb^ Taql У0 Rb2 5' С G T G G С С G A G С A G С Л G G А С T А 1 00 5 СС AGTGAGC AGAGTGACG 3'

Реамплификаиия ПЦР продукты Последоваi ельности праймеров

Rb2 *Л!и 1 QO Реамплификаиия Rb2 Q0 (см выше)

Рис. 1. Схема cam-специфической амплификации методом ПЦР (ССА-ПЦР)

На первом этапе ПЦР проводились с праймером Rbl (специфичным к гену ble) и вырожденными праймерами к сайтам рестрикции ферментов AM, /4*1, SadI и Taq\ (в четырех параллельных реакциях) На втором этапе ПЦР проводились со специфичными праймерами Rb2 и Q0 В качестве матрицы использовался ПЦР-продукт первого этапа ПЦР-продукты разделялись электрофорезом в 0,8%-агарозном геле Анализ гелей проводился с помощью оптической системы GelDoc 2000

(BioRad) и программного обеспечения Quantity One v 4 1 В случае недостаточного количества продукта проводили реамплификацию (аналогично второму этапу ПЦР)

Секвеиирование продуктов ПЦР. Для секвенирования использовали ДНК, выделенную из замороженного (-20°С, 30 мин) фрагмента геля, соответствующего ПЦР продукту Секвенирование осуществлялось в Servicio Central de Apoyo a la Investigación (SCAI) Университета г Кордоба (Испания) на автоматических секвенаторах АВТ 377 (Applied Biosystems; Perkin-Elmer Го , США) Анализ полученных последовательностей проводился с помощью программного обеспечения DNASTAR v 4 05, NCBI Blast (http //www nchi nlm mh gov/BLAST/) и Chlamy JGI Blast (http://genome jgi-psf org/chlre2/chlrc2 honic html')

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Хемотаксис С. reinhardtii иа разных этапах жизненного цикла. С помощью капиллярного метода нами установлено, что вегетативные клетки Chlamydomonas reinhardtii обнаруживают хемотаксис не только к аммонию, но и его неметаболизируемому аналогу - метилам-монию. Были изучены реакции хемотаксиса к аммонию/метиламмонию у прегамет (незрелых гамет), которые не способны к формированию пары с гаметами противоположного типа спаривания и гамет, полученных из этих прегамет под действием света (рис 2) Прегаметы, как и вегетативные клетки, демонстрировали реакции хемотаксиса к аммоникАметиламмонию; действие спета на прегаметы приводило к полной утрате хемотаксиса через ? часа

Необходимость света для завершения гаметогенеза может быть связана с его энергетической или сигнальной функцией в этом процессе. Для выяснения этого вопроса гаметогенез был проведен в минеральной среде без ацетата Na (TMP-N) и в среде, содержащей ацетат Na (TAP-N). В обоих вариантах опыта через 24 часа освещения сформировались гаметы, утратившие хемотаксис к аммонию Добавление ингибитора фотосистемы II, 3'-(3,4-дихлорфенил)-1,1-Л1 ме^члчочевины (ДХММ), привело к нарушению процесса дифференцировки в минеральной среде без aneiara Na В присутствии ацетат Na и ДХММ клетки полностью утратили чемотактимеску ю активность к аммонию, что свидетельству ет о том, что (1) как свет, так и ацетат ч.>т служить экзогенными источниками энергии для процесса дифференцировки, и (2)

! емнота Свет

Время, ч

Рис. 2. Хемо1аксис к аммонию (•) и четиламмонию (■) прегамет С. ге'ткагйШ, освещенных белым светом

Освещенность света 2000 лк

необходимость света в присутствии ацетата и ДХММ не может быть связана с его энергетической функцией Таким образом, процессы преобраювания систем, отвечающих за формирование состояния компетентности и утрату хемотаксиса к аммонию у гамет, регу тируются одними внешними сигналами отсутствием источника азота (аммония) и светом Впоследствии в работе коллег было показано, что сигнал света, приводящий к утрате реакции хемотаксиса, воспринимается фоторецептором синего света фототропином (ЕгшПоуа е! а!, 2004)

Установлено, что как пи\ так и гт гаметы полностью утрачивали хемотаксис к ионам аммония, т е этот процесс находится под контролем гамета-специфичных генов, общих для обоих типов гамет

Характеристика мутантов, способных к гаметогенезу в отсутствии светового сигнала

Были и ¡учены хемотаклические ответы 1 ре\ мутантов, которые дифференцировашсь в компетентные гаметы, как на свету, так и в отсутствие светового сигнала (ОЬескег, Всск, 1995). В отличие от дикого типа, вегетативные клетки !)£ штаммов в среде без азота в темноте подноегью утратили хемотаксис к аммонию/мегиламмонию Полу ченные нами данные свидетельству ют о том, что в контроль изменений в системе хемотаксиса и приобретение состояния компетентности у гамет вовлечены общие компоненты

Роль аммония в процессе преобразования системы хемотаксиса при гаметогенезе. Выявлено нарушение утраты хемотактической акгивности в присутствии ассимилируемых С

гетИаЫШ аминокислот в среде с ацетатом Ыа. Это может быть связано с аккумуляцией

26 _ 1 7

«- ионов аммония в среде при дезаминирова-Л нии аминокислот неспецифической оксида-

В 22

К £ 18 О

ял

Я 1,4 1

—А

~Г 48

1,1

- 0,5

зой (.-аминокислот (рис 3). Сделан вывод о и ключевой роли ионов аммония в контроле

преобразования системы хемотаксиса в пров

§ цессе гамегогенеза.

Время, ч

Рис. 3. Кинетика образования пировиноградной кислоты и шмснснис хсмотактическои активное ги ве1е1ан1внмх клеток

Вегеытвные клетки и 1 погарифчической фазы росы были рестспендированы в безаяггной среде (ТАР-Ч (ептоттшая нтия) и ТМР^ (пунктирная шния)), содержащей 2 мМ а.имиш В указанные промежутки времени определялись индекс хемоыксиса (Л) и содержание в среде пировиноградной кислоты (ПВК, •)

Контроль дедифференцнровки гамет аммонием. Внесение в суспензию гамет аммония инициирует процесс их дедифференцнровки, при этом гаметы утрачивают агглютинины, структуры, обеспечивающие формирование пар и лигический фермент,

отвечающий за гидролиз клеточной стенки (Ма18ис1а е! а1 , 1987, 1990) Нами установлено, что добавление аммония в среду полностью

восстанови то реакцию хемотаксиса через 1 час; наименьшая концентрация аммония, которая необходима для восстановления хемотаксиса, составила 0,1 мМ

Действие мочевины на изменение хемотаксиса к аммонию в процессе гаметогенеза. Мочевина переносится в клетки специальной транспортной системой (Williams, Hodson, 1977), посте чего гидролизуется ферментным комплексом АТФ:амидолиаза мочевины (Leftley, Syrett, 1973) Добавление мочевины в безазотную среду полностью блокировало потерю хемотаксиса к аммонию, т е процессы преобразования систем хемотаксиса и компетентности гамет, контролируются внутриклеточным аммонием Гаметы, обработанные D,L-MeraoHHH-D,L-с\ льфоксимином (MSX), который блокирует ассимиляцию аммония путем ингибирования глутаминсинтетазы, полностью восстанавливали хемотаксис после добавления в среду аммония. Следовательно сами ионы аммония, а не продукты их метаболизма, ответственны за контроль преобразования системы хемотаксиса Полученные нами данные позволяют сделать вывод, что су шествуют внутриклеточные пороговые концентрации ионов аммония, при превышении которых аммоний репрессирует регуляторные компоненты, вовлеченные в контроль систем компетентности и хемотаксиса у гамет (рис. 4).

Мочевина Аргинин-

2кетокислота ^Нч

Оксидаза аминокислот

¡а 1-1

Аминокислота

-Аргинин- -

nh4 - --

MSX

Глутамин

Вегетативные

клетки

Хемота кг ически активны kNH4*

Презаметы

Темнота

Хемота кгически активны к NH/

Гвметы

Хемотактичееки неактивны к NH4*

Рис. 4. Схема вероятных этапов дифференцировки клеток, приводящей к утрате реакции хечо i аксиса к ионам аммония у гамет С. relnhurdtii

Транспортеры аммония и их роль на разных этапах жизненного цикла С. reinhardtiL

Анализ поглощения [14С]-метиламмония С reinhardtu показал, что в вегетативных клетках, выращенных в среде ТАР, функционирует только система с низким сродством к аммонию/четиламмонию, LATS (с высокими значениями Кт и Упщ}; тогда как в гаметах появляется вторая система с высоким сродством к аммонию/метиламмонию, HATS (с высокими значениями Кш и Vmax).

Представители HATS описаны у высших растений, грибов и бактерий, и выделены в семейство белков AMT (ammonium and methylammonium transport proteins) У С reinhardtii охарактеризовано восемь генов семейства Amt1 (Gonzälez-Ba Hester et al, 2004) Метолом ГПДР в режиме реального времени нами был проведен сравнительный анализ особенностей регуляции экспрессии восьми генов Amtl на разных этапах жизненного цикла вегетативных клетках, прегаметах и гаметах (рис 5) Установлено, что транскрипция генов Amtl,3, Amtl, 7 и Amtl,8 не зависит от стадии цикла, причем уровни мРНК Amtl;3 и Amtl.fi зафиксированы на низком уровне Транскрипция генов Amtl, /, Amtl,2, Amtl,4, и Amtl,5 репрессирована в вегетативных клетках, а гена Amt 1,6 - в прегаметах и гаметах Кроме того, выявлена дополнительная световая регуляция экспрессии генов Amt 1,1 и Amt 1,5, которая у прегамег ниже уровней, зафиксированных у гамет Таким образом, утрата реакции хемотаксиса у гамет не вызвана блоком экспрессии Amtl, 1-1,8 на уровне транскрипции.

□ вегет кл-ки ■ гаметы

□ прегаметы

ЕЗ гаметы из прегамет

Amtl,1 Amtl, 2 Amtl, 3 Ami 1,4 Amtl, 5 Amtl,6 Amtl, 7 Amtl, 8

Рис. S. Уровни относительной жспрессии Amtl-rtwta у дикого типа С.

reinhardtii на разных с гадиях жизненно! о цикла

* - не выявлено

Хемотаксис мутантов с повреждениями транспортера АМТ1;4. А нал и ¡ хемотаксиса к аммонию спонтанных, устойчивых к метиламмонию мутантов с поврежденным транспортером АМТ1;4 (Kim et al., 2005) свидетельствует о том, что этот транспортер не является ключевым звеном в передаче хемотактического сигнала, и его нарушение не сказывается на поведении клеток в целом.

Получение и характеристика мутанта с нарушенной активностью системы HATS. В

результате трансформации было получено 1276 клонов, устойчивых к зеомицинх' На 1-м этапе нами было отобрано 12 резистентных к метиламмонию штаммов На 2-м этапе был отобран штамм, который при росте на глутамине демонстрировал задержку роста и время генерации мутантного штамма составляло 22 ч, по сравнению с 13 ч для исходного штамма

а Щ

транс^ормант

Ш jMM&¡

fX.-.Ш.

Рис. 6. Гибридизация но CajicpHy с использованием в качестве зоила v час гка гена Ые

«,>* обозначены дополнительные инсерции трансформирующею вектора

Таблица 1. Кинетические параметры транспор га метиламмония СС-124 и hatl

Гибридизация по Саузерну с использованием в качестве зонда участка гена ble выявила наличие у трансформанта нескольких инсерций плазмидного вектора (рис. 6). Сравнительный анализ кинетик поглощения [14С]-метиламмония у дикого типа и мутанта показал, что тогда как у дикого типа присутствуют оба типа транспортных систем для переноса аммония/метиламмония в клетки (LATS и HATS), у трансформанта активна только система LATS. В связи с этим мутант был назван hatl (от англ. defective in HATS). На основе полученных данных были вычислены кинетические параметры для hatl (табл. 1).

В настоящее время ни у одного организма система LATS не охарактеризована на молекулярном уровне. В отличие от дикого типа при инкубации штамма hatl в среде ТАР с ингибитором К+-каналов тетраэтиламмонием (ТЭА), клетки полностью сохраняли подвижность, но утрачивали хемотактическую активность и у них

блокировалось поступление [14С]-метиламмония (рис. 7) Полученные данные показывают, что LATS-система у hatl включает К+-каналы, чувствительные к ТЭА.

Если вегетативные клетки hatl были выращены в среде, содержащей в качестве единственного источника азота мочевину (в этих условиях транспортеры аммония не функционируют), клетки полностью утратили хемотактическую активность. Это свидетельствует о том, что для восприятия/передачи хемотактического сигнала требуется активно-фу нкциониру ющая транспортная система LATS.

Стадия цикла Система СС-124 hatl

Km Vjuax Km v v max

Вегет. клетки LATS 1210,0±31,3 53,3±7,23 396,2+30,45 12,4+0,77

HATS - - - -

Гаметы LATS 528,0±20,1 78,2±2,5 150,6±8,20 153,7+7,38

HATS 2,16±0,12 1,96+0,02 - -

Примечание К„ - константа Михаэлиса-Ментена (мкМ), Vm скорость поглощения (мкМ/мг хл-ч)

- максимальная

5 05

004 0 08 0,12

Рис. 7. Хемотаксис к аммонию (а) и поглощение [|4С1-мстиламмония вегетативными клетками СС-124 (б) и /шг/ (в) в средах ТАР (•) и ТАР+ТЭА (■)

8 концентрация [14С]-мети1ачмония, мкМ V - скорость 1Ю1 лощения, мкМ/мг хл ч Ве1етативныс клеши выращены в среде ТАР

С целью выявления уровня экспрессии компонентов HATS, на котором произошло нару шеиие(я), приведшее к блоку активности этой системы, нами была проанализирована экспрессия Amtl генов в hat/ методом ПЦР с предшествующей обратной транскрипцией. Результаты свидетельству ют о том, что все гены Amtl в мутанте не нару шены и экспрессиру ются (рис 8)

Анализ потомков из скрещиваний hall со штаммом дикого типа показал, что нару шение в активности системы HATS не вызвано единичной мутацией Таким образом, в мутанте hall нарушены несколько компонентов, вовлеченных в контроль экспрессии Amt1 генов на посттранскрипционном уровне.

Amtl;l Amtl ;2 Amll,3 Amtl,4 -

Amt 1,5 Amtl,6 Amtl,7 Amtl, 8

Рис. 8. Результаты ОТ ПЦР для генов Апч1

1 СС-124, 2 - каИ, М маркер мотекулярной массы ДНК 1 кЬ

Для характеристики компонентов, нарушение которых блокировало активность системы HATS у мутанта hall, нами была предпринята попытка клонирования соответствующих генов. С помощью сайт-специфической амплификации методом ПЦР было получено несколько специфических продуктов и было осуществлено секвенирование одного из них При помощи программы BLAST JGI Chlamy v 2 0 установлено, что данный фрагмент имеет гомологию с геном EBNA-1 вируса герпеса человека (50,0%) Компьютерный анализ секвенированной последовательности hatl позволяет предположить, что данный ген может кодировать ядерный пицин-богатый белок, предположительно являющийся транскрипционным фактором

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

* Анализ реакций хемотаксиса на разных стадиях жизненного цикла одноклеточной зеленой

водоросли Chlamydomonas remhardtii позволяет прийти к следующему заключению. I Вегетативные клетки С remhardtii обнаруживают способность к восприятию не только

разнообразных хемосигналов органической природы (Ermilova et al, 2000), но и неорганических соединений Охарактеризованы два хемоэффектора, аммоний и метиламмоний, установлены концентрационные зависимости и закономерности процессов адаптации. Причем кинетика адаптации к хемосенсорным сигналам сходна с закономерностями адаптационных процессов, описанных ранее для органических соединений

Из полученных нами результатов следует, что организация аппарата хемотаксиса изменяется на разных этапах жизненного цикла В частности показано, что вегетативные клетки и прегаметы демонстрируют хемотаксис к аммонию/метиламмонию, тогда как зрелые гаметы утрачивают хемотакгическую активность к ним. По нашему мнению, подобный контроль имеет биологический смысл, поскольку отсутствие у гамет способности двигаться направленно к соединениям, приводящим к их дедифференцировке в вегетативные клетки, обеспечивает тем самым более благоприятные условия для выполнения этим типом специализированных клеток их t основной биологической функции - образованию пары с гаметой противоположного типа спаривания в ходе полового цикла развития организма В пользу этого предположения свидетельствует также то, что в ходе гаметогенеза у С reinhardtii процессы преобразования систем, ответственных за приобретение состояния компетентности (т е способности к формированию пары с гаметой другого типа спаривания) и утрату хемотаксиса к аммонию/метиламмонию, регулируются одними внешними сигналами' отсутствием источника азота в среде и светом, и находятся под контролем гамета-специфичных генов, общих для обоих типов гамет. Анализ полученных данных позволяет предполагать, что существуют внутриклеточные пороговые концентрации ионов аммония, при превышении которых аммоний репрессирует дифференцировку систем компетентности и хемотаксиса у гамет

На основе сравнительного анализа особенностей регу ляции экспрессии восьми генов Amt 1 на разных этапах жизненного цикла (вегетативные клетки, прегаметы, гаметы) методом ПЦР в режиме реального времени, установлено, что утрата реакции хемотаксиса у гамет не вызвана блоком экспрессии Amt!, 1-1,8 на уровне транскрипции Для понимания функционального значения каждого из транспортеров семейства ЛМТ1 в ходе жизненного цикла необходимо выявление их точной су бклеточной локагазации и кинетических характеристик

Методом инсерционного мутагенеза изолирован трансформант hall с нарушенным транспортом аммония Сравнительный аналш кинегик поглощения [14С]-метиламмония у дикого типа и мутанта показал, что если у дикого типа присутству ют оба типа транспортных систем для переноса четилаччония'аччонин в клетки (LATS и HATS), то у hall активна только система LA TS Полученные в работе данные свидетельствуют, что у hatl (1) активность HATS блокирована на пост-транскрипционном у ровне в результате нарушения нескольких регу ляторных компонентов; (2) LATS-система у hatl включает неспецифические К1-каналы, чувствительные к '* ТЭА; (3) активность этой системы ответственна за контроль реакции хемотаксиса у hatl Тот факт, что ТЭА хотя и приводил к изменению кинетики поглощения метиламмония у СС124, однако полностью не блокировал ни поглощение соединения, ни реакцию хемотаксиса, позволяет предположить участие другого компонента(ов) в системе LATS и контроле хемотаксиса v вегетативных клеток дикого типа, возможно из семейства Amt1 Мы предполагаем, что в клетках Chlamydomonas активность нескольких транспортеров принимает участие в контроле реакций хемотаксиса к аммонию/метиламмонию

ВЫВОДЫ

1. Способность одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtü к хемотактическому поведению изменяется на разных этапах жизненного цикла' вегетативные клетки и прегаметы (некомпетентные гаметы) демонстрируют хемотаксис к аммонию/метиламмонию, тогда как зрелые гаметы у тра«ивают хемотактическую активность * к ним

2 Сигналы, регулирующие утрату реакции хемотаксиса к аммонию/метиламмонию, те же, что » и в случае контроля формирования состояния компетентности у гамет: голодание по азоту и свет Предложена модель контроля хемотактического поведения в ходе гачетогенеза, согласно которой регуляция изменений в системе хемотаксиса включает два этапа: первый, контролируемый аммонием и независимый от света этап, и второй этап, кошролируемыи действием света

3. Компоненты, регулирующие утрату хемотактической активности у зрелых гамет, находя!ся под контролем гамета-специфичных генов, общих для обоих типов гамет

4 Впервые проанализирована активность двух типов транспортных систем аммония, LATS и HATS, на разных этапах жизненного цикла, в частности, установлено, что в вегетативных клетках функционально активна только система LA TS, тогда как в гаметах - обе системы

5 Охарактеризованы особенности экспрессии восьми генов семейства Amtl на разных этапах жизненного цикла (вегетативные клетки, прегаметы, гаметы) Методом ПЦР в режиме реального времени установлено, что транскрипция генов Amtl, 3, Amtl,-7 и Amtl;S не зависит от стадии цикла, генов Amtl.l, Amtl;2, Amt 1,4 и Amt 1,5 репрессирована в вегетативные клетках, а гена Amtl, 6 - в прегаметах и гаметах Выявлена дополнительная регуляция светом транскрипции генов Amtl, 1 и Amtl, 5

6 Показано, что LATS-система аммония у С reinhardtii включает неспецифичные чувствительные к ТЭА К ^каналы.

7 Изолирован мутант hat! с нарушенной активностью системы HATS аммония Установлено, что активность системы LATS ответственна за контроль реакции хемотаксиса к аммонию/метиламмонию у hatl

8 На основе экспериментальных данных предложена рабочая гипотеза, согласно которой транспортеры аммония Chlamydomonas играют ключевую роль в способности этого одноклеточного организма к реакции хемотаксиса к аммонию.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ермилова H В , Залуцкая Ж M , Лапина Т В , Никитин М.М., Громов Б В Использование гена аргининсу кцинатлиазы для получения хемотактических мутантов Chlamydomonas reinhardtii м ei о до м инсерционного мутагенеза // Физиология растений - наука III тысячелетия Тезисы докладов Москва, 4-9 октября 1999. С 577.

2 Ермилова Е В , Залуцкая Ж M , Лапина Т В , Никитин М.М., Громов Б В Регуляция работы жгутиков в контроле таксисов Chlamydomonas reinhardtii II Физиол растений 2000 Т 47. С 752-756.

3 Ермилова Е.В, Залуцкая Ж.М, Лапина ТВ., Никитин М.М., Громов Б.В Механизмы регуляции направленного движения одноклеточных зеленых водорослей // Автотрофные микроорганизмы Материалы Международной научной конференции Москва, 2000 С 79-80

4 Никитин М.М. Роль жгутиков в контроле поведенческих реакций одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii // Тезисы VII Молодежной Конференции ботаников С-Петербург, 15-19 мая 2000 С. 73-74

5 Erniilova F V , Zalutskaya 7h M , Lapina T V , Nikitin M.M., Gromov В V Studies on motility and behavior an approach using genctic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii И

Molecular mcchanisms of genetic processes and biotechnology International symposium Moscow, November 18-21, 2001; Minsk, November 22-24,2001. P 205-206

6 E Ermilova, Z Zalutskaya, T Lapina, 1VT. Nikitin Change in chemotactic behaviour of Chlamydomonas reinhardtii during gamctogenesis // Abstracts of the Tenth International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas 2002 Vancouver, В С Canada

7. Ermilova E V, Zalutskaya Zh.M , I apina T V. Nikitin M.M. Effects of nitrogen-containing compounds on change in chemotaxis mode during gametogenesis of Chlamydomonas reinhardtii // Protistology. 2003 V 3 P. 10-16

8. Ermilova E V , Zalutskaya Z M , Lapina T V , Nikitin M.M. Chemotactic behavior of С reinhardtii is altered during gametogenesis//Curr Microbiol 2003 V 46 P 261-264

9 E В Ермилова, Ж M Залу цкая, Т В Лапина, М.М. Никитин, К Х\ анг, К Ф Бек Сенсорные фоторецепторы и их роль в контроле поведения одноклеточных фототрофных эукариот (подвижность и поведение в жизненном цикле Chlamydomonas reinhardtii) // Генетика в XXI веке' современное состояние и перспективы развития. Тезисы конференции Москва, 6-12 июня 2004 С. 283.

10 Е V Frmilova, Zh М Zalutskaya, С F Beck, К Huang, Т V Lapina, М. М. Nikitin. Control of chcmotactic behavior in the life cycle of phototrophic protist Chlamydomonas reinhardtii // Abstract' of the International Symposium on Biological Motility May 23-June 1 2004 Pushchmo. P 171-173

11 E. V Ermilova, M. M. Nikitin, T V Lapina, Zh M Zalutskaya Chal, a DNA insertions! transformant of the green alga Chlamydomonas temhaidtii with altered chcmotaxis to ammonium '/ Protistology 2004 V 3 P 230-240

12 Ермилова ЕВ, Никитин M.M., Фернандес Э Получение и характеристика инсерционного мутанта Cha2 одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas remhardtii с нарушенной HATS-системой транспорта аммония // Актуальные проблемы современной альгологии Тезисы конференции Харьков, 20-23 апреля 2005 С 56

Подписано в печать 31 03 2006. Формат бумаги 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать Уел печ. л. 1,0. Тираж 100 экз Заказ 3750. Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр 26

¿e£éá¿\

№-7193

i i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никитин, Максим Михайлович

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Поведенческие реакции водорослей.

1.1.1. Феноменология процессов и их классификация.

1.1.2. Светозависимые поведенческие реакции.

1.1.3. Хемотаксис.

1.1.4. Аэротаксис.

1.1.5. Магнитотаксис.

1.1.6. Гравитаксис.

1.2. Транспорт аммония у эукариот.

1.2.1. Системы транспорта аммония у высших растений.

1.2.2. Системы транспорта аммония у грибов.

1.2.3. Системы транспорта аммония у Dictyostelium discoideum.

1.2.4. Системы транспорта аммония у Chlamydomonas reinhardtii.

1.3. Ассимиляция аммония у Chlamydomonas reinhardtii.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Условия культивирования.

2.3. Капиллярный метод изучения хемотаксиса.

2.4. Определение 2-кето-кислот.

2.5. Получение и определение количества образовавшихся гамет

2.6. Метод тетрадного анализа.

2.7. Получение автолизина.

2.8. Генетическая трансформация.

2.9. Блот-гибридизация по Саузерну.

2.10. Определение поглощения [14С]-метиламмония.

2.11. Выделение тотальной ДНК и РНК.

2.12. Метод ПЦР с предшествующей обратной транскрипцией.

2.13. Метод ПЦР в режиме реального времени.

2.14. Сайт-специфическая амплификация методом ПЦР.

2.15. Секвенирование продуктов ПЦР.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Хемотаксис С. reinhardtii на разных этапах жизненного цикла.

3.1.1. Вегетативные клетки.

3.1.2. Прегаметы и гаметы.

3.1.3. Сигнальная функция света.

3.1.4. Характеристика мутантов, способных к гаметогенезу в отсутствии светового сигнала.

3.2. Роль ионов аммония в процессе преобразования системы хемотаксиса при гаметогенезе.

3.2.1. Действие аминокислот на изменение хемотаксиса к аммонию в процессе гаметогенеза.

3.2.2. Контроль дедифференцировки гамет ионами аммония.

3.2.3. Действие мочевины на изменение хемотаксиса к аммонию в процессе гаметогенеза.

3.2.4. Действие 0,1-метионин-0,1-сульфоксимина на хемотаксис к аммонию.

3.3. Транспортеры аммония и их роль на разных этапах жизненного цикла С. reinhardtii.

3.3.1. Системы LATS и HATS.

3.3.2. Хемотаксис мутантов с повреждениями транспортера АМТ1;4.

3.3.3. Получение и характеристика мутанта с нарушенной активностью системы HATS.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция хемотаксиса в жизненном цикле одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii"

Направленное движение клеток в ответ на действие внешних стимулов, определяемое в литературе как поведение, описано у многих одноклеточных организмов на разных стадиях их развития. Поведение является наиболее сложной формой жизнедеятельности организма и в самом общем виде представляет собой формируемый организмом отклик на сигналы, поступившие к нему из окружающей среды (Гаазе-Раппопорт, Поспелов, 1987). В последние годы предпринимаются многочисленные попытки определения механизмов, лежащих в основе взаимодействия подвижных клеток с окружающей средой и последующей ориентированной относительно внешнего раздражителя двигательной реакции - поведенческой реакции. Поведенческие реакции часто называют таксисами. Таксисы описаны у различных представителей архей, бактерий и эукариотических микроорганизмов. Способность к поведенческим реакциям позволяет микроорганизмам искать питательные субстраты и избегать вредных воздействий. Для многих микроорганизмов, неподвижных в течение длительного периода вегетативного роста, подвижная стадия представляет собой единственную возможность целесообразной пространственной ориентации в окружающей среде, что может иметь немаловажное значение для выживания, так как подвижные клетки репродуктивной стадии могут обеспечивать не только функцию распространения организма, но и оптимизацию условий его жизнедеятельности и перехода к вегетативному росту. Особый интерес к изучению механизмов контроля двигательных поведенческих ответов можно объяснить как важной биологической ролью данного явления, так и выявленными взаимосвязями регуляции поведения одноклеточных организмов с такими фундаментальными процессами как дифференцировка клеток и межклеточная сигнализация при половом размножении.

В настоящее время наиболее подробно исследованы молекулярные механизмы зависимого от жизненного цикла контроля систем направленного движения бактерий, у которых охарактеризована природа регуляторных сигналов и выявлены механизмы экспрессии генов, продукты которых необ6 ходимы для перехода к подвижной стадии (Ермилова и др., 2004). У эука-риотических микроорганизмов регуляция подвижности и поведения в жизненном цикле изучена главным образом у клеточного миксомицета Dictyos-telium discoideum с амебоидным типом движения (Williams, Harwood, 2003; Strmecki et al., 2005). Вместе с тем, у одноклеточных эукариот, обладающих жгутиками и ресничками, исследовалась в основном структурно-функциональная организация систем движения. Подобное ограничение связано с особыми требованиями, предъявляемыми к объектам исследования, и, прежде всего, с точки зрения знаний биологии, физиологии, частной генетики и наличия разработанных методов молекулярно-генетического анализа. В этом отношении Chlamydomonas reinhardtii является уникальным модельным организмом для проведения молекулярно-генетических исследований поведенческих реакций. В последние годы достигнуты значительные успехи в расшифровке молекулярных механизмов, контролирующих светозависимые поведенческие ответы (Ehlenbeck et al., 2002) и хемотаксис к органическим соединениям у этого модельного микроорганизма (Ermilova et al., 2000). С целью расширения, углубления и детализации механизмов контроля направленного движения С. reinhardtii необходим анализ дополнительных систем рецепции и передачи сигналов на разных этапах жизненного цикла организма.

Целью настоящей работы являлось комплексное исследование хемотаксиса С. reinhardtii к наиболее предпочтительному для микроорганизма источнику азота, ионам аммония, на разных этапах жизненного цикла, а также выявление физиологической основы взаимосвязи между процессами ассимиляции аммония и направленного движения к аммонию (хемотаксиса). Задачи работы были связаны с решением принципиальных вопросов, ранее не освещенных в литературе. В частности, предполагалось экспериментально исследовать и теоретически проанализировать:

1. Хемотаксис к аммонию подвижных клеток, представляющих разные стадии жизненного цикла: вегетативные клетки, прега-меты (некомпетентные гаметы), гаметы.

2. Действие сигналов (голодание по источнику азота, свет), регулирующих формирование зрелых гамет, на характер реакции хемотаксиса к аммонию.

3. Два типа транспортных систем для переноса аммония в клетки, транспортеров с низким сродством к аммонию (LATS) и транспортеров с высоким сродством к аммонию (HATS), у вегетативных клеток, прегамет и гамет.

4. Возможную роль транспортеров аммония в контроле реакции хемотаксиса к аммонию.

В процессе изучения реакции хемотаксиса к аммонию у Chlamydomonas reinhardtii был получен фактический материал, показывающий, что ор ганизация аппарата хемотаксиса изменяется на разных этапах жизненного цикла, в частности вегетативные клетки и прегаметы демонстрируют хемотаксис к аммонию/метиламмонию, тогда как зрелые гаметы утрачивают хе-мотактическую активность к ним. Установлено, что сигналы, контролирующие утрату реакции хемотаксиса, те же, что и в случае контроля формирования состояния компетентности у гамет: голодание по азоту и свет. Предложена схема предполагаемого взаимодействия сигналов в клетках Chla-mydomonas в ходе гаметогенеза. Впервые проанализирована активность двух типов транспортных систем на разных этапах жизненного цикла и описаны особенности экспрессии восьми генов семейства Amt1. Впервые показано, что LATS-система у Chlamydomonas reinhardtii включает неспецифичные чувствительные к TEA К+-каналы. Получены данные, свидетельствующие, что транспортеры аммония Chlamydomonas играют ключевую роль в способности этого одноклеточного организма к реакции хемотаксиса к аммонию.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературных данных, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 112 страницах, содержит 10 таблиц и 33 рисунка, список литературы включает 187 наименования. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Никитин, Максим Михайлович

Выводы

1. Способность одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii к хемотактическому поведению изменяется на разных этапах жизненного цикла: вегетативные клетки и прегаметы (некомпетентные гаметы) демонстрируют хемотаксис к аммонию/метиламмонию, тогда как зрелые гаметы утрачивают хемотак-тическую активность к ним.

2. Сигналы, регулирующие утрату реакции хемотаксиса к аммонию/метиламмонию, те же, что и в случае контроля формирования состояния компетентности у гамет: голодание по азоту и свет. Предложена модель контроля хемотактического поведения в ходе гаметогенеза, согласно которой регуляция изменений в системе хемотаксиса включает два этапа: первый, контролируемый аммонием и независимый от света этап, и второй этап, контролируемый действием света.

3. Компоненты, регулирующие утрату хемотактической активности у зрелых гамет, находятся под контролем гамета-специфичных генов, общих для обоих типов гамет.

4. Впервые проанализирована активность двух типов транспортных систем аммония, LATS и HATS, на разных этапах жизненного цикла, в частности, установлено, что в вегетативных клетках функционально активна только система LATS, тогда как в гаметах обе системы.

5. Охарактеризованы особенности экспрессии восьми генов семейства Amt1 на разных этапах жизненного цикла (вегетативные клетки, прегаметы, гаметы). Методом ПЦР в режиме реального времени установлено, что транскрипция генов Amt1.3, Amt1.7 и Amt1.8 не зависит от стадии цикла, генов Amt1.1, Amt1.2, Amt1.4 и Amt1.5 репрессирована в вегетативных клетках, а гена Amt1.6- в прегаметах и гаметах. Выявлена дополнительная регуляция светом транскрипции генов Amt1.1 и Amt1.5.

6. Впервые показано, что LATS-система аммония у С. reinhardtii включает неспецифичные чувствительные к ТЭА К+-каналы.

7. Изолирован мутант hat1 с нарушенной активностью системы HATS аммония. Установлено, что активность системы LATS ответственна за контроль реакции хемотаксиса к аммонию/метиламмонию у hatl.

8. На основе экспериментальных данных предложена рабочая гипотеза, согласно которой транспортеры аммония Chlamydomonas играют ключевую роль в способности этого одноклеточного организма к реакции хемотаксиса к аммонию.

Заключение

Анализ реакций хемотаксиса на разных стадиях жизненного цикла одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii позволяет прийти к следующему заключению.

Вегетативные клетки С. reinhardtii обнаруживают способность к восприятию не только разнообразных хемосигналов органической природы (Ег-milova et al., 2000), но и неорганических соединений. Охарактеризованы два хемоэффектора, аммоний и метиламмоний, установлены концентрационные зависимости и закономерности процессов адаптации. Причем кинетика адаптации к хемосенсорным сигналам сходна с закономерностями адаптационных процессов, описанных ранее для органических соединений.

Из полученных нами результатов следует, что организация аппарата хемотаксиса изменяется на разных этапах жизненного цикла. В частности показано, что вегетативные клетки и прегаметы демонстрируют хемотаксис к аммонию/метиламмонию, тогда как зрелые гаметы утрачивают хемотакги-ческую активность к ним. По нашему мнению, подобный контроль имеет биологический смысл, поскольку отсутствие у гамет способности двигаться направленно к соединениям, приводящим к их дедифференцировке в вегетативные клетки, обеспечивает тем самым более благоприятные условия для выполнения этим типом специализированных клеток их основной биологической функции - образованию пары с гаметой противоположного типа спаривания в ходе полового цикла развития организма. В пользу этого предположения свидетельствует также то, что в ходе гаметогенеза у С. reinhardtii процессы преобразования систем, ответственных за приобретение состояния компетентности (т. е. способности к формированию пары с гаметой другого типа спаривания) и утрату хемотаксиса к аммонию/метиламмонию, регулируются одними внешними сигналами: отсутствием источника азота в среде и светом.

На основе выявленного отличия в поведенческих ответах между вегетативными клетками и зрелыми гаметами предложен оригинальный метод определения клеточных стадий гаметогенеза. Важным преимуществом предложенного метода изучения процесса гаметогенеза является возможность прямого анализа изменений, происходящих при образовании гамет одного типа спаривания до момента формирования ими пары с гаметами другого типа.

Установлено, что дифференцировка клеток, приводящая у гамет к утрате хемотаксиса к ионам аммония, находится под контролем гамета-специфичных генов, общих для обоих типов гамет.

Предложена модель контроля процесса дифференцировки вегетативных, клеток в хемотакгически неактивные гаметы, согласно которой регуляция изменений в системе хемотаксиса в процессе гаметогенеза включает два этапа: первый, контролируемый аммонием и независимый от света этап, и второй этап, контролируемый действием света. Анализ полученных данных позволяет предполагать, что существуют внутриклеточные пороговые концентрации ионов аммония, при превышении которых аммоний репрессирует дифференцировку систем компетентности и хемотаксиса у гамет. Установлена сигнальная функция света в этом процессе; в работе коллег показано, что роль фоторецептора принадлежит фототропину (Ermilova et al., 2004).

На основе сравнительного анализа особенностей регуляции экспрессии восьми генов Amt1 на разных этапах жизненного цикла (вегетативные клетки, прегаметы, гаметы) методом ПЦР в режиме реального времени, установлено, что утрата реакции хемотаксиса у гамет не вызвана блоком экспрессии Amt1;1-1;8 на уровне транскрипции. Для понимания функционального значения каждого из транспортеров семейства АМТ1 в ходе жизненного цикла необходимо выявление их точной субклеточной локализации и кинетических характеристик.

Методом инсерционного мутагенеза изолирован трансформант hat1 с нарушенным транспортом аммония. Сравнительный анализ кинетик поглощения [14С]-метиламмония у дикого типа и мутанта показал, что если у дикого типа присутствуют оба типа транспортных систем для переноса метиламмония/аммония в клетки (LATS и HATS), то у hat1 активна только система LATS. Полученные в работе данные свидетельствуют, что у hat1 1) активность HATS блокирована на пост-транскрипционном уровне в результате нарушения нескольких регуляторных компонентов; 2) LATS-система у hat1 включает неспецифические К+-каналы, чувствительные к ТЭА; 3) активность этой системы ответственна за контроль реакции хемотаксиса у hatt Тот факт, что ТЭА хотя и приводил к изменению кинетики поглощения метиламмония у СС-124, однако полностью не блокировал ни поглощение соединения, ни реакцию хемотаксиса, позволяет предположить участие другого компонента(ов) в системе LATS и контроле хемотаксиса у вегетативных клеток дикого типа, возможно из семейства Amt1. Мы предполагаем, что в клетках Chlamydomonas активность нескольких транспортеров принимает участие в контроле реакций хемотаксиса к аммонию/метиламмонию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитин, Максим Михайлович, Санкт-Петербург

1. Гаазе-Рапопорт М.Г., Поспелов Д.А. От амебы до робота: модели поведения // М.:Наука. 1987. 285 с.

2. Ермилова Е.В. Поведенческие реакции одноклеточных зеленых водорослей // Дисс. Докт. Биол. Наук. С-Петербург: СПбГУ. 1997. 228

3. Ермилова Е.В. Поведенческие реакции водорослей // Учебное пособие. СПбГУ. 2000. 24 с.

4. Ермилова Е.В., Громов Б.В. Хемотаксис зооспор зеленой водоросли Chlorococcum minutum II Физиол. растений. 1988. Т. 35. С. 510-515.

5. Ермилова Е.В., Залуцкая Ж.М., Крупное К.Р., Громов Б.В. Направленное движение вегетативных клеток и гамет в реакциях хемотаксиса хламидомонады // Автотрофные микроорганизмы. Тезисы конференции. Москва. 1996. С. 35.

6. Ермилова Е.В., Залуцкая Ж.М., Лапина Т.В. и др. Регуляция работы жгутиков в контроле таксисов Chlamydomonas reinhardtii И Физиол. растений. 2000. Т. 47. С. 752-756.

7. Ермилова Е.В., Залуцкая Ж.М., Лапина Т.В. Подвижность и поведение микроорганизмов // Т.1. Прокариоты. СПб., Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004.192 с.

8. Ермилова Е.В., Крупное К.Р., Сотников А.Г., Громов Б.В. Получение и характеристика инсерционного мутанта Chlamydomonas reinhardtii, утратившего хемотаксис к сахарозе // Физиол. растений. 1999. Т. 46. С. 82-86.

9. Маниатис Е., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование // М.: Мир. 1984. С. 344-350.

10. Посудин Ю.И., Масюк Н.П. Дифракционный механизм фоторецепции у одноклеточных зеленых жгутиковых водорослей // Альгология. 1996. Т. 6. С. 368-376.

11. Синещеков О.А., Говорунова Е.Г. Родопсиновые рецепторы фототаксиса зеленых жгутиковых водорослей // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 1609-1622.

12. Adler J. Chemotaxis in bacteria // Ann. Rev. Biochem. 1975. V. 44. P. 341-356.

13. Aispaugh J.A., Perfect J.R, Heitman J. Cryptococcus neoformans mating ang virulence are regulated by the G-protein a subunit GPA1 and cAMP // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 3206-3217.

14. Barsanti LM Passarelli P., Lenzi P., Walne P.L., Dunlap J.R., Gualti-eri P. Effects of hydroxylamine, digitionin and Trilon X-100 on photoreceptor (paraflagellar swelling) and photoreception of Euglena gracilis II Vision Res. 1993. V. 33. P. 2043-2050.

15. Barsanti L., Passarelli V., Walne P.L., Gualtieri P. In vivo photocycle of the Euglena gracilis photoreceptor // Biophys. J. 1997. V. 72. P. 545553.

16. Bazylinski D.A. Bacterial production of iron sulfides // Materials Research Symp. Proceed. 1991. V. 218. P. 81-91.

17. Bazylinski D.A., Fraenkel R. В., Garaat-Recd A.J., Mann S. Biomin-eralization of iron sulfides in magnetotactic bacteria from sulfidic environments // In: Biominerals. 1990. Ed. by Fraenkel R.B. New Yolk: Plenum Press. P. 239-255.

18. Bean B. Geotactic behavior of Chlamydomonas II J. Protozool. 1977. V. 24. P. 394.

19. Beck C.F., Acker A. Gametic differentiation of Chlamydomonas reinhardtiiII Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 822-826.

20. Beck C.F., Haring M. Gametic differentiation of Chlamydomonas H Int. Rev. Cytol. 1996. V. 168. P. 259-302.

21. Bibikov S.I., Barnes L.A., Gitin Y., Parkinson J. S. Domain organization and flavin adenine dinucleotide-binding determinants in the aerotaxis signal transducer Aer of Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 5830-5835.

22. Bibikov S., Miller A., Gosink K., Parkinson J. Methylation-Independent Aerotaxis Mediated by the Escherichia coli Aer Protein // J. Bad. 2004. V. 186. P. 3730-3737.

23. Biswas К., Morschhauser J. The Mep2p ammonium permease controls nitrogen starvation-induced filamentous growth in Candida albicans H Mol. Microbiol. 2005. V. 56. P. 649-669.

24. Block J., Briegleb N. Sobick V.f Wohlfarth-Bottermann K.E. Conformation of gravisensitivity in the slime mold Physarium poiycephalum under near weightlessness //Adv. Space Res. 1986. V, 6. P. 134-150.

25. Bonner J.T., Har D., Suthers H.B. Ammonia and thermotaxis: further evidence for a central role of ammonia in the directed cell mass movement of Dictyostelium discoideum II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2733-2736.

26. Bonner J.T., Suthers H.B., Odell G.M. Ammonia orients cell mass and speeds up aggregating cells of slime moulds // Nature. 1986. V. 323. P. 630-632.

27. Braun F.J., Hegemann P. Two light-activated conductances in the eye of the green alga Volvox carteri И Biophys. J. 1999. V. 76. P. 16681678.

28. Britto D.T., Glass A.D.M., Kronzucker H.J., Siddiqi M.Y. Cytosolic concentration and transmembrane fluxes of NH47NH3. An evaluation of recent proposals // Plant Physiol. 2001a. V. 125. P. 523-526.

29. Britto D.T., Siddiqi M.Y. Glass A.D.M., Kronzucker H.J., Futile transmembrane NH4+ cycling: a cellular hypothesis to explain ammonium toxicity in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001b. V. 98. P. 4255-4258.

30. Brodhum В., Hader D.-P. Photoreceptor proteins and pigments in the paraflagellar body of the flagellate Eugiena gracilis II Photochem. Photo-biol. 1990. V. 52. P. 865-871.

31. Chen Z-Y.f Burow M.D., Mason C.B., Moroney J. A low-СОгinducible gene encoding an alanine: a-ketoglutarate aminotranstransferase in Chlamydomonas reinhardtii// Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 677-684.

32. Chen Q., Silflow C.P. Isolation and characterization of glutamine synthetase genes in Chlamydomonas reinhardtii // Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 677-684.

33. Cordoba F., Cardenas J., Fernandez E. Cooperative regulation by ammonium and ammonium derivatives of nitrite uptake in Chlamydomonas reinhardtii// Biochim. Biophys. Acta. 1987 V. 902. P. 287-292.

34. Cotter D.A., Sands T.W., Virdy K.J., North M.J., klein G., Satre M. Pattering of development in Dictyostelium discoideum: factors regulating growth, differentiation, spore dormancy, and germination // Biochem. Cell Biol. 1992. V. 70. P. 892-919.

35. Couillard P. Photoreception in Protozoa, an overview // Photorecep-tion and vision invertebr. New York, London. 1984. P. 115-130.

36. Crawford N.M., Forde B.G. Molecular and developmental biology of inorganic nitrogen nutrition. In: The Arabidopsis book. 2002. American Society of Plant Biologists.

37. Creutz C., Diehn B. Motor responses to polarized light and gravity sensing in Euglena gracilis II J. Protozool. 1976. V. 23. P. 552-556.

38. Cullimore J.V., Sims A.P. Glutamine synthetase of Chlamydomonas: its role in the control of nitrate assimilation // Planta. 1981a. V. 153. P. 1824.

39. Cullimore J.V., Sims A.P. Pathway of ammonia assimilation in illuminated and darkened Chlamydomonas reinhardtii // Phytochem. 1981b. V. 20. P. 933-940.

40. Cullimore J.V., Sims A.P. Occurrence of two forms of glutamine synthetase of Chlamydomonas reinhardtii // Phytochem. 1981c. V. 20. P. 597600.

41. Diehn В., Feinleib M., Haupt W., Hildebrand E., Lenci F., Nultsch W. Terminology of behavioral responses of motile microorganisms // Photo-chem. Photobiol. 1977. V. 26. P. 559-560.

42. Dent R.M., Haglund C.M., Chin B.L., Kobayashi M.C., Niyogi K.K. Functional genomics of eukaryotic photosynthesis using insertional mutagenesis of Chlamydomonas reinhardtii // Plant Physiol. 2005. V. 137. P. 545-556.

43. Ehlenbeck S., Gradmann D., Braun F-J., Hegemann P. Evidence for a light-Induced Hf conductance in the eye of the green alga Chlamydomonas reinhardtii II Biophys. J. 2002. V. 82. P. 740-751.

44. Ermilova E.V., Zalutskaya Zh.M., Gromov B.V. Chemotaxis towards sugars in Chlamydomonas reinhardtii II Curr. Microbiol. 1993. V. 27. P. 4750.

45. Ermilova E.V., Zalutskaya Z.M., Huang K.f Beck C.F. Phototropin plays a crucial role in controlling changes in chemotaxis during the initial phase of the sexual life cycle in Chlamydomonas II Planta. 2004. V. 219. P. 420-427.

46. Ermilova E.V., Zalutskaya Z.M., Lapina T.V., Nikitin M.M. Chemotao-tic behavior of C. reinhardtii is altered during gametogenesis // Curr. Microbiol. 2003 V. 46. P. 261-264.

47. Feinleib M.E. Photomotile responses in flagellates // Photoreception and sensory transduction in Aneural organisms. F. Lenci, G. Golombettis eds. New York: Plenum Press. 1980. P. 45-68.

48. Fenchnel Т., Finlay B.J. Photobehavior of the ciliated protozoan Loxodex: taxic, transient and kinetic responses in the presence and absence of oxygen // J. Protozool. 1986. V. 33. P. 139-145.

49. Fischer P., Klein U. Localization of nitrogen-assimilating enzymes in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtiHI Plant Physiol. 1988. V. 88. P. 954-962.

50. Florencio F.J., Gadal P., Buchman B.B. Thioredoxinlinked activation of the chloropiast and cytosolic forms of Chlamydomonas reinhardtii giutamine synthetase // Plant Physiol. Biochem. 1993. V. 31. P. 649-655.

51. Florencio F.J., Vega J.M. Separation, purification and characterization of two forms of giutamine synthetase from Chlamydomonas reinhardtii //Z. Naturforsch. V. 38c. P. 531-538.

52. Follstaedt S.C., Kirsten J.H., Singleton C.K. Temporal and spatial expression of ammonium transporter genes during growth and development of Dictyostelium discoideum II Differ. 2003. V. 71. P. 557-566.

53. Forde B.G., Clarkson D.T. Nitrate and ammonium nutrition of plant: physiological and molecular perspectives //Adv. Bot. Res. 1999. V. 30. P. 1-90.

54. Foster K.W., Smyth R.D. Light antennas in phototactic algae // Microbiol. Rev. 1980. V. 44. P. 572-630.

55. Foster K.W., Saranak J., Patel N., Zarilli G., Okabe M., Kline Т., Na-kanishi K. A rhodopsin is the functional photoreceptor in the unicellular eu-karyote Chlamydomonas II Nature. 1984. V.311. P. 756-759.

56. Franco A.R., Cardenas J.f Fernandez E. two different carrier transport both ammonium and methylammonium in Chlamydomonas reinhardtii II J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 14039-14043.

57. Galv£n F., Marquez A., Vega J.M. Purification and molecular properties of ferredoxin-glutamate synthase from Chlamydomonas reinhardtii II Planta. 1984. V. 162. P. 180-187.

58. Gazzarrini S., Lejay L., Gojon A., Ninnemann O., Frommer W.B., von Wiren N. three functional transporters for constitutive, diurnally regulated and starvation-induced uptake of ammonium into Arabidopsis roots // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 937-948.

59. Glass A.D.M. Nitrogen use efficiency of crop plants: Physiological constraints upon nitrogen absorption // Crit. Rev. Plant Sci. 2003. V. 22. P. 453-470.

60. Gloecker G., Beck C.F. Genes involved in light control of sexual differentiation in Chlamydomonas reinhardtii // Genetics. 1995. V. 141. P. 937-943.

61. Gonzaiez-Ballester D., Camargo A., Fernandez E. Ammonium transporter genes in Chlamydomonas: the nitrate-specific regulatory hege Nit2 is involved in Amt1;1 expression // Plant Mol. Biol. 2004. V. 56. P. 863-878.

62. Gonzaiez-Ballester D., de Montaigu A., Galvan A., Fern£ndes E. restriction enzyme site-directed amplification PCR: a tool to identify regions flanking a marker DNA // Anal. Biochem. 2005. V. 340. P. 330-335.

63. Gualtieri R., Barsanti L., Rosati G. Isolation of the photoreceptor (paraflagellar body) of the phototactic flagellate Euglena gracilis II Arch. Microbiol. 1986. V. 145. P. 303-305.

64. Gualtieri R., Pelosi P., Passarelli V., Barsanti L. Identification of a rhodopsin photoreceptor in Euglena gracilis II Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1117. P. 55-59.

65. Hader D.-P. Effects of inhibitors on photomovement in desmids // Arch. Microbiol. 1981. V. 129. PP. 168-172.

66. Hader D.-P. Photosensory behavior in prokaryotes // Microbiol. Rev. 1987. V. 1.P. 1-21.

67. Hader D.-P., Liu Shi-Mei. Motility and gravitactic orientation of the flagellate, Euglena grucilis, impaired by artificial and solar UV-B radiation // Curr. Microbiol. 1990. V. 21. P. 161-168.

68. Hader D.-P., Lebert M., DiLena M.R. Evidence for the mechanism of phototactic orientation of Euglena gracilis II Curr. Microbiol. 1986. V. 14. P. 157-163.

69. Harris E. The Chlamydomonas reinhardtii sourcebook: a comprehensive guide to biology and laboratory use // Academic Press, San Diego 1989. 780 p.

70. Harz H., Hegemann P. Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas II Nature. 1991. V. 351. P. 489-491.

71. Hasegawa E., Hayashi H., Asakura S., Kamiya R. Stimulation of invitro motility of Chlamydomonas axonemes by inhibition of cAMP-dependent phosphorylation // Cell Motil. Cytoskel. 1987. V. 8. P. 302-311.

72. Hegemann P., Hegemann U., Foster K.W. Reversible bleaching of Chlamydomonas reinhardtii rhodopsin in vivo // Photochem. Photobiol. 1988 V. 48. P. 123-128.

73. Hellingwert K.J., Hoff W.D., Crueloard L. Photobiology of microorganisms: how photoreceptors catch a photon to initialize signalling // Mol. Microbiol. 1996. V. 21. P. 683-693.

74. Hill G.J.C. Mating induction in Oedogonium. In: Handbook of Phy-cological Methods, Developmental and cytological methods (ed. E. Gantt). Cambridge Univ. Press. Cambridge. 1980. P. 25-36.

75. Hill G.J.C., Cunningham M.R., Byrne M.M., Ferry T.P., Halvorson J.S. Chemical control of androspore morphogenesis in Oedogonium don-nellii (Chlorophyta, Oedogoniales) II J. Phycol. 1989. V. 25. P. 368-376.

76. Hinrichsen R.D. Calcium and calmodulin in the control of cellular behavior and motility// Bioch. Bioph. Acta. 1993. V. 1155. P. 277-293.

77. Hodson R.C., Williams S.K., Davidson W.R.Jr metabolic control of urea catabolism in Chlamydomonas reinhardtii and Chlorella pyrenoidosa //J. Bacterid. 1975. V. 121. P. 1022-1035.

78. Howitt S.M., Udvardi M.K. Structure, function and regulation og ammonium transporters in plants // Biochim. Biophys. Aacta. 2000. V. 1465. P. 152-170.

79. Isshiki Т., Mochizuki N., Maeda Т., Yamamoto M. Characterization of a fission yeast gene, gpa2, that encodes a Ga subunit involved in the monitoring of nitrition // Genes Dev. 1992. V. 6. P. 2455-2462.

80. Jaenicke L. Signals in the development of cryptogams // Prog. Bot. 1991. V. 52. P. 138-189.

81. Jaenicke L., Mamer F.I. Lurlene, the sexual pheromone of the green flagellate C. allensworthii Liebigs // Ann. Chem. 1995. V. 218. P. 13431345.

82. Jaenicke R., Starr R.C. The lurlens, a new class of plastoquinone related mating pheromones // Eur. J. Biochem. 1996. V. 241. P. 581-585.

83. Kam V., Moseyko N. Nemson J., Feldman L.J. Gravitaxis in Chlamydomonas reinhardtii, characterization using video microscopy and computer analysis // Int. J. Plant Sci. 1999. V. 160. P. 1093-1098.

84. Kamiya R., Witman G.B., Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas И J. Cell Biol. 1984. V. 98. P. 97-107.

85. Kawai H., Inouye J. Flagellar autofluorescence in forty-four chlorophyll c- containing algae // Phycologia. 1989. V. 28. P. 222-227.

86. Kawai H„ Kreimer G. Sensory mechanisms. In: The flagellates. Ed. By B.S.C. Leadbeater and J.C. Green. 2000. Taylor and Fransis Press. London, New York. P. 125-146.

87. Kessler J.O., Hill N.A., Hader, D.-P. Orientation of swimming flagellates by simultaneously acting external factors // J. Phycol. 1992. V. 28. P. 816-822.

88. Kim K-S., Field E., King N., Yaoi Т., Kustu S., Inwood W. Spontaneous mutations in the ammonium transport gene AMT4 of Chlamydomonas reinhardtii// Genetics. V. 170. P. 631-644.

89. Kindle K.L., Schnell R.A., Fernandez E., Lefebvre P.A. Stable nuclear transformation of Chlamydomonas using the Chlamydomonas gene for nitrate reductase // J. Cell Biol. 1989. V. 109. P. 2589-2601.

90. King S, Dutcher S. Phosphorylation of an inner dynein arm complex in Chlamydomonas reinhardtii is altered in phototactic mutant strains // J. Cell Biol. 1997. V. 136. P 177-191.

91. Kirk D.L., Kirk M.M. Carrier-mediated uptake of arginine and urea by Chlamydomonas reinhardtii II Plant Physiol. 1978. V. 61. P. 556-560.

92. Kivic P.A., Veck M. Structure and function in the euglenoid eyespot apparatus: the fine structure, and response to environmental changes // Plants. 1972. V. 105. P. 1-14.

93. Kivic P.A., Walne P.L. Algal photosensory apparatus probably represent multiple parallel evolutions // Bio Systems. 1983. V. 16. P. 31-38.

94. Koehidai L., Kovacs P., Csaba G. Chemotaxis of the unicellular green alga Dunaliella salina and the ciliated Tetrahymena pyriformis Effects of glycine, lysine, and alanine, and their oligopeptides // Biosci. Res. 1996. V. 16. P. 467-476.

95. Kreimer G. Cell biology of phototaxis in flagellate algae // Int. Rev. Cytol. 1994. V. 148. P. 229-310.

96. Lam H.M., Coschigano I.C., Oliveira I.C., Melo-Oliveira R., Coruzzi G.M. The molecular genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. P. 569-593.

97. Lea P.J., Miflin B.J. The occurrence of glutamate synthetase in algae // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 64. P. 856-862.

98. Lebert M., Hader D.-P. How Euglena tells up from down // Nature. 1996. V. 379. P. 590.

99. Lebert M., Hader D.-P. Effects of hypergravity on the photosynthetic flagellate, Euglena gracilis II J. Plant Physiol. 1997. V. 150. P. 153-159.

100. Leftley J.W., Syrett P.J. Urease and ATP:amidolyase activity in unicellular algae // J. Gen. Microbiol. 1973. V. 77. P. 109-115.

101. Lend F., Ghetti F. Photoreceptor pigments for photomovement of microorganisms: some spedroscopic and related studies // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1989. V. 3. P. 1-16.

102. Lisa T.A., Piedras P., Cardenas J., Pineda M. Utilization of adenine and guanine as nitrogen sources by Chlamydomonas reinhardtii И Plant Cell Inviron. 1995. V. 18. P. 583-588.

103. Lorenz M.C., Heitman J. Regulators of pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae identified through multicopy suppressor analysis in ammonium permease mutant strains // Genetics. 1998. V. 150. P. 1443-1457.

104. Lumbreras V., Stevens D., Purton S. Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron // Plant J. 1998. V. 14. P. 441-448.

105. Machlis L. The chemotactic activity of various sirenins and analogues and the uptake of sirenen by the sperm of Allomyces II Plant Physiol. 1973. V. 52. P. 527-531.

106. Machlis L., Nutting W.H., Rapoport H. The structure of sirenin // J. Ann. Chem. Soc. 1968. V. 90. P. 1674-1676.

107. Machlis L., Hill G.G.C., Steinback K.E., Reed W. Some characteristics of the sperm attractant from Oedogonium cardiacum II J. Phycol. 1974. V. 10. P. 199-204.

108. Macnab R.M. Chemotaxis in bacteria // In: W. Haupt, M. Feinleib (eds.) Encyclopedia of plant physiology, new series. Springer-Verlag, Berlin. 1979. V. 7. P. 310-334.

109. Maier I. Gamete orientation and induction of gametogenesis by pheromones in algae and plants // Plant Cell Environ. 1993. V. 16. P. 891907.

110. Maier I., MQIIer D.G. Sexual pheromones in algae // Biol. Bullet. 1986. V. 170. P. 145-175.

111. Maier I., Miiller D.G. Chemotaxis in Laminaria digitata (Phaeophy-ceae). II. Pheromone receptor sensitivity // Naturwissen. 1990. V. 79. P. 420-422.

112. Maier J., MQIIer D.J., Schmid C., Boland W., Jaenicke L. Pheromone receptor specificity and threshold concentrations for spermatozoid release in Laminaria digitata // Naturwissen. 1988. V. 75. P. 260-263.

113. Mann S., Sparks N.H.C., Frankel R.B., Bazylinski D.A., Jannarch H. Biomineralization of ferrimagnetic greigite (Fe3S4) and iron pyrite (FeS2) in a magnetotactic bacterium // Nature, London. 1990. V. 343. P. 258-261.

114. Mannheim B. The DIG system user's guide for filter hybridization. 1995.

115. Martinez-Rivas J.M., Vega J.M., Marquez A.J. Differential regulation of the nitrate-reducing and ammonium-assimilatory systems in synchronous cultures of Chlamydomonas reinhardtii II FEMS Lett. 1991. V. 78. P. 85-88.

116. Marquez A.J., Galvan F., Vega J.M. Utilization of ammonium by mutant and wild type Chlamydomonas reinhardtii I/ J. Plant Physiol. 1986. V. 124. P. 95-102.

117. Matsuda Y., Saito Т., Koseki M., Shimada T. The Chlamydomonas non-synchronous and synchronous gametogenesis are analyzed by the activities of cell body agglutinin and cell wall lytic enzyme // Plant Physiol. 1990. V. 9. P. 1-6.

118. Matsuda Y., Saito Т., Yamaguchi Т., Koseki M., Hayashi K. Topography of cell wall lytic enzyme in Chlamydomonas reinhardtii: form and localization of the stored enzyme in vegetative cell and gamete // J. Cell Biol. 1987. V. 104. P. 321-329.

119. Matsuda Y., Shimada Т., Sakamoto Y. Ammonium ions control gametic differentiation in Chlamydomonas reinhardtii И Plant Cell Physiol. 1992. V. 33. PP. 909-914.

120. McFadden G.I., Schulze D., Sure В., Salisbury J.L., Melkonian M. Basal body reorientation mediated by a Ca2+-modulated contractile protein // J. Cell Biol. 1987. V. 105. P. 903-912.

121. Melkonian M., Robenek H. The eyespot apparatus of flagellated green algae: a critical review// Progress in Phycological research. 1984. V. 3. P. 195.268.

122. Miles C.A., Holwill M.E.J. Asymmetric flagellar movement in relation to the orientation of the spore of Blastocladiella emersonii II J. Exp. Bot. 1969. V. 50. P. 683-687.

123. Miller R.L. Sperm chemo-orientation in the metazoa // In: Biology of fertilization. V. 2., Eds. C.B. Metz, A. Monroy. Acad. Press. Orlando. 1985.1. P. 275-337.

124. Miller S., Diehn B. Cytochrome С oxidase as the receptor molecule for chemoaccumulation (chemotaxis) of Euglena gracilis toward oxygen // Science. 1978. V. 200. P. 548.

125. Moyano E., Cardenas J., Munoz-Blanco J. Purification and properties of three NAD(P)+ isozymes of L-glutamate dehydrogenase of Chlamydomonas reinhardtii// Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1119. P. 63-68.

126. Miiller D.G. The role of pheromones in sexual reproduction of brown algae // In: Algae as experimental systems (eds. A.W. Colemav, L.J. Goff, J.R. Stein-Taylor). 1989. P. 201-213. Alan R. Liss. New York. NY.

127. Miiller D.G., Jaenicke L., Donike M., Akintobi T. Sex attractant in a brown alga: chemical structure // Science. 1971. V. 171. P. 815-817.132. Munoz 1988

128. Munoz-Blanco J., Hidalgo-Martinez , Cardenaz J. Extracellular deamination of L-amino acids by Chlamydomonas reinhardtii cells // Planta. 1990. V. 182. P. 194-198.

129. Nagel G., Ollig D., Furhmann M., Kateriya S., Musti A.M., Bamberg E., Hegemann P. Channelrhodopsin-1: A light-gated proton channel in green algae // Science. 2002. V. 296. P. 2395-2398.

130. Nagel G., Szellas Т., Huhn W., Kateriya S., Adeishvili N. Berthold P., Ollig D., Hegemann P., Bamberg E. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 V. 100. P. 13940-13945.

131. Ninnemann O., Jauniaux J.C., Frommer W.B. Identification of a high affinity ammonium transporter from plants // EMBO. 1994. V. 13. P. 34643471.

132. Nultsch W. Phototaxis and photokinesis // Primitive sensory and communication systems: The taxis and tropisms of microorganisms and cells. N. Y. Acad. Press. 1975. P. 29-90.

133. Pazour G.J., Sineshchekov O.A., Witman G.B. Mutational analysis of the phototransduction pathway of Chlamydomonas reinhardtii II J. Cell

134. Biol. 1995. V. 131. P. 427-440.

135. Perez-Vicente R., Alamillo J.M., Cardenas J., Pineda M. Purification and substrate inactivation of xanthine dehydrogenase from Chlamydomonas reinhardtii! I Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1117. P. 159-166.

136. Pineda M., Piedras P., Cardenas J. A continuous spectrophotometry assay for ureidoglycolase activity with lactate dehydrogenase or glyoxylate reductase as coupling enzyme // Anal. Biochem. 1994. V. 222. P. 450-455.

137. Planner J.J., Rapoport H. The synthesis of d- and I- sirenin and their absolute configurations //J. Am. Chem Soc. 1971. V. 93. P. 1758-1761.

138. Rawat S.R., Silim S.N., Kronzucker H.J., Siddiqi M.Y., Glass A.D.M. AtAMTI gene expression and NH4+ uptake in roots of Arabidopsis thaliana. Evidence for regulation by root giutamine levels // Plant J. 1999. V. 19. P. 143-152.

139. Rhiel E., Hader D.-P., Wehrmeyer W. Diaphototaxis and gravitaxis in a freshwater Cryptomonas II Plant Cell Physiol. 1988. V. 29. P. 755-763.

140. Ruffer U., Nultsh W. Flagellar responses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: III. Shock response // Bot. Acta. 1995. V. 108. P. 255-265.

141. Sager R., Granick S. Nutritional studies with Chlamydomonas reinhardtii/I Am. N.Y. Acad. Sci. 1953. V. 56. P. 831-838.

142. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning; a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 1989.

143. Schmidt W., Galland P., Senger H,. Furuya M. Microspectropho-tometry of Euglena gracilis. Pterin- and flavinelike fluorescence in the para-flagellar body // Planta. 1990. V. 182. P. 375-381.

144. Schroda M., Beck C.F., Vallon O. Sequence elements within an

145. HSP70 promoter counteract transcriptional transgene silencing in Chlamydomonas II Plant J. 2002. V. 31. P. 445-455.

146. Semler B.L., Hodson R.C., Williams S.K. II, Howell S.H. The induction of allophanate lyase during the vegetative cell cycle in light-synchronized cultures of Chlamydomonas reinhardtii II Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 399. P. 71-78.

147. Simon-Rosin U., Wood C., Udvardi M.K. Molecular and cellular characterization of LjAMT2;1 an ammonium transporter from the model legume Lotus japonicus I/ Plant. Mol. Biol. 2003. V. 51. P. 99-108.

148. Sineshchekov O.A., Jung K-H., Spudich J.L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 8689-8694.

149. Sineshchekov O.A., Litvin F.F., Keszthelyi L. Two components of photoreceptor potential in phototaxis of the flagellated alga Haematococ-cus pluvialisl/ Biophys. J. 1990. V. 57. P. 33-39.

150. Sineshchekov O.A., Govorunova E.G., Der A., Keszthelyi L., Nultsch W. Photoelectric responses in phototactic flagellated algae measured in cell suspension // J. Photochem. Photobiol. 1992 V. 13 P. 119-134.

151. Singleton C.K., Zinda M.J., Mykytka В., Yang P. The histidine kinase dhkC regulates the choice between migrating slugs and terminal differentiation in Dictyostelium discoideum II Dev. Biol. 1998. V. 203. P. 345-357.

152. Sjoblad R.D., Chet J., Mitchell R. Quantitative assay for algae chemotaxis//Appl. Envir. Microbiol. 1978. V. 36. P. 847-850.

153. Sjoblad P.P., Frederikse P.H. Chemotactic responses of Chlamydomonas reinhardtii II Mol. Cell Biol. 1981. V. 1. P. 1057-1060.

154. Sohlenkamp C., Shelden M., Howitt S., Udvardi M. Characterization of Arabidopsis AtAMT2, a novel ammonium transporter in plants // FEBS1.tt. 2000. V. 467. P. 271-278.

155. Sohlenkamp C., Wood C.C., Roeb G.W., Udvardi M.K. Characterization of Arabidopsis AtAMT2, a high-affinity ammonium transporter of the plasma membrane // Plant Physiol. 2002. V. 130. P. 1-9.

156. Spring S., Schleiter K.-M. Diversity of magnetotactic bacteria // System. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 147-153.

157. Starr R.C., Marner F.J., Jaenicke L. Chemoattraction of male gametes by a pheromone produced by female gametes of Chlamydomonas II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 641-645.

158. Stavis A., Hirschberg R. Phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii И J. Cell. Biol. 1973. V. 59. P. 367-377.

159. Strmecki L., Green D.M., Pears C.J. Developmental decisions in Die-tyostelium discoideum II Develop. Biol. 2005. V. 284. P. 25-36.

160. Taneda K. Geotactic behavior in Paramecium caudatum. I. Geotaxis assay of individual specimen // Zool. Sci. 1987. V. 4. P. 781-788.

161. Taneda K., Miyata S., Shiota A. Geotactic behavior in Paramecium caudatum. II. Geotaxis assay in a population of the specimens // Zool. Sci. 1987. V. 4. P. 789-795.

162. Thomas G.H., Mullins J.G.L., Merrick M. Membrane topology of the Mep/Amt family of ammonium transporters // Mol. Microbiol. 2000. V. 37. P. 331-344.

163. Torchinsky M. Transamination: Its discovery, biological and chemical aspects (1937-1987) // Trends Biochem. Sci. 1987. V. 12. P. 115-117.

164. Torres de Araujo F.F., Pires M.A., Fraenkel G.S., Bicudo C.E.M. Magnetite and magnetotaxis in algae // Biophys. J. 1986. V. 50. P. 375.

165. Treier U., Fuchs S., Weber M., Wakarchuk W.W., Beck C. Gametic differentiation in Chlamydomonas reinhardtii: light dependence and gene expression pattern //Arch. Microbiol. 1989. V. 152. P. 572-577.

166. Wallsgrove R.M., Turner J.C., Hall N.P., Kendall A.C. Bright S.W.J. Barley mutants lacking chloroplast glutamine synthetase // Plant Physiol. 1987. V. 83. P. 155-158.

167. Wang M., Siddiqi M.Y., Ruth T.J. Glass A.D.M. Ammonium uptake by rice roots. (II. Kinetics of 13NH4+ influx across the plasmalemma) // Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 1249-1258.

168. Watanabe M., Miyoshi Y., Furuya M. Phototaxis in Cryptomonas sp. under condition suppressing photosynthesis // Plant Cell Physiol. 1976. V. 17. P. 683-690.

169. Wiech H., Geier B.M., Paschke Т., Spang A., Grein K. Characterization of green alga, yeast, and human centrins // J. Biol. Chem. 1996. V. 27. P. 22453-22461.

170. Wilkinson J.Q., Crawford N.M. Identification and characterization of a chlorate resistant mutant of Arabidopsis with mutations in both NIA1 and NIA2 nitrate reductase structural genes // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 239. P. 289-297.

171. Williams H.P., Harwood A.J. Cell polarity and Dictyostelium development // Curr. Opin. Microbiol. 2003. V. 6. P. 621-627.

172. Williams S.K., Hodson R.C. Transport of urea at low concentration in Chlamydomonas reinhardtiiII J. Bact. 1977. V. 130. P. 266-273.

173. Witman G.B. Chlamydomonas phototaxis // Trend Cell Biol. 1993. V. 3. P. 403-408.

174. Whitney P.A., Cooper T. Urea carboxylase from Saccharomycescerevisiae III Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 325-330.

175. Wolke A., Niemeyer F., Achenbach F. Geotactic behavior of the acellular myxomycete Physarium polycephalum II Cell Biol. Int. Rep. 1987. V. 11. P. 525-528.

176. Wolken J.J. Euglena: the photoreceptor system for phototaxis // J. Protozool. 1977. V. 24. P. 518-522.

177. Yoshimura K. A novel type of mechanoreception by the flagella of Chlamydomonas II J. Exp. Biol. 1996. V. 199. P. 295-302.

178. Yoshimura K. Mechanosensitive channels in the cell body of Chlamydomonas //J. Membr. Biol. 1998. V. 166. P. 149-155.

179. Yoshimura K., Matsuo Y., Kamiya R. Gravitaxis in Chlamydomonas reinhardtii studied with novel mutants // Plant Cell Physiol. 2003. V. 44. P. 1112-1118.

Информация о работе

Никитин, Максим Михайлович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Регуляция хемотаксиса в жизненном цикле одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы