Поведенческие реакции одноклеточных зеленых водорослей

Ермилова, Елена Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поведенческие реакции одноклеточных зеленых водорослей
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Поведенческие реакции одноклеточных зеленых водорослей"

§ § О

чу-

^ ■ На правах рукописи

ЕРМИЛОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург — 1997

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского государственного университета

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН

Громов Б.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН

Гамалей Ю.В.

доктор биологических наук, профессор Медведев С.С. доктор биологических наук, профессор Круглое Ю.В.

Ведущая организация: Институт Цитологии Российской Академии наук

Защита состоится <?//> 1997 г. в /¿Г. ¿¿пас. на

заседании диссертационного совета ДОбЗ.57.59 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, биолого-почвенный факультет СП6ГУ, ауд. Щ ■

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан </О » 1997 г.

Ученый сектерарь диссертационного совета

доктор биологических наук ' Чиркова Т.В.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Способность клеток изменять направление своего движения относительно внешнего стимула является одной из отличительных особенностей многих подвижных клеток и одноклеточных организмов на различных стадиях их развития. Направленное движение клеток в ответ на действие внешнего сигнала в литературе определяют как поведение клеток (Parkinson, 1975; 1977; Diehn et al., 1977; Macnab, 1978; Kung, Saimi, 1982; Hinrichsen, 1993).

В последние годы предпринимаются многочисленные попытки изучения механизмов регуляции поведенческих реакции как отдельных клеток, так и одноклеточных организмов. Поведение является наиболее сложной формой жизнедеятельности организма и в самом общем виде представляет собой формируемый организмом отклик на сигналы, поступившие к нему из окружающей среды (Гаазе-Рапопорт, Поспелов, 1987). Успехи генетики и молекулярной биологии, одними из основных объектов которых являются одноклеточные организмы, привели к выявлению весьма своеобразных и совершенных молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия клетки с окружающей средой и последующей ориентированной относительно внешнего раздражителя двигательной реакции — поведенческой реакции. Поведенческие реакции часто называют таксисами ( Adler, 1975; Maier, 1993).

Одноклеточным организмам свойственны такие поведенческие реакции, как хемотаксис, фототаксис, аэротаксис, гравитаксис, термотаксис, вискозотаксис и магпитотаксис. Выявлены взаимосвязи регуляции поведенческих реакций отдельных клеток с такими фундаментальными процессами, как транспорт и трансформация энергии, межклеточная сигнализация при половом размножении, морфогенез и регуляция жизненного цикла. У одноклеточных зеленых водорослей, которые являются объектом нашего изучения, также была описана способность к поведению (Bean, 1977; Feinleib, 1978; Häder, 1988; Kreimer, 1994).

Вместе с тем, к началу нашей работы в литературе обсуждались преимущественно светозависимые поведенческие реакции одноклеточных зеленых водорослей, и практически отсутствовали какие-либо сведения, которые позволили бы достоверно судить о способности подвижных клеток этой группы организмов к другим типам поведения и, прежде всего, к хемосенсорному поведению.

О важности хемосеисорного поведения свидетельствует широкая распространенность этого явления среди организмов: бактерий, простейших, некоторых грибов и водорослей. Установлено, что способность к хемотаксису лежит в основе направленного движения гранулоцитов, макрофагов и лимфоцитов крови животных и человека (Кипа et al., 1995; Taub et al., 1995). Однако структурно-функциональная и молекулярная организация системы хемотаксиса сравнительно подробно изучена только у бактерий, клеточного миксомицета Dictyostelium di-scoideum и простейших родов Paramecium и Tetrahymena. В связи с этим, изучение поведенческих реакции фототрофных эукариот может представлять не только самостоятельный научный интерес, но и позволит судить об эволюции сенсорных систем, контролирующих направленное движение у организмов различного уровня организации. С целью расширения, углубления и детализации исследований механизмов, регулирующих поведенческие реакции, необходимо привлечение новых модельных объектов.

Цели и задачи исследования. Целыо настоящей работы являлось комплексное исследование поведенческих реакций одноклеточных зеленых водорослей, а также выявление возможных механизмов копт-роля направленного движения в ответ на сигналы различной природы. Задачи работы были связаны с решением принципиальных вопросов, ранее не освещенных в литературе. В частности, предполагалось экспериментально исследовать и теоретически проанализировать:

1. Разнообразие типов поведенческих реакций у одноклеточных зеленых водорослей.

2. Возможные механизмы ориентации вегетативных клеток и гамет в ответ на хемосенсорные сигналы.

3. Особенности механизмов, передающих хемосенсорные сигналы к жгутиковому аппарату.

4. Общие этапы в управлении движением в ответ на действие сигналов различной природы.

5. Локализацию генов хламидомонады, контролирующих поведенческие реакции в ответ на химические стимулы.

6. Эволюционные тенденции формирования механизмов контроля поведенческих реакций жгутиковых фототрофных одноклеточных эукариот и других подвижных организмов.

Научная новизна работы. Получен фактический материал, показывающий, что одноклеточные зеленые водоросли обнаруживают не только фото-, но и хемосенсорное поведение относительно химических сигналов органической природы. Впервые для растительных клеток выявлен тип поведенческой реакции, при которой происходит межклеточная сигнализация в ходе жизненного цикла и которая не связана с половым размножением. Описаны различные механизмы изменения направления движения при хемотаксисе одноклеточных зеленых водорослей, что свидетельствует о существовании различных путей формирования механизмов поведенческих реакций даже у близкородственных организмов. Установлено, что механизмы контроля направления движения при хемотаксисе те же, что и в случае фототаксиса, причем клетка способна осуществлять интеграцию фото- и хемосигналов. Предложена схема взаимодействия сенсорных сигналов в клетках СМа-туйотопаз. Разработан метод отбора хемотактичсских мутантов. Впервые для эукариотических нодророслей получены мутанты с нарушенным хемосенсорпым поведением. Показано, что у С1йатуйотопав ге'ткапиН хемотаксис контролируется рядом ядерных генов. Впервые установлено существование поведенческих реакций, связанных не с регуляцией направленного движения, а с регуляцией адгезии подвижных клеток. Таким образом, обнаружен второй (кроме контроля направленного движения) тин поведения у зеленых водорослей.

Научная и практическая значимость. Работа является первым комплексным исследованием поведенческих реакций у эукариотических водорослей. Получены новые данные о различных типах поведенческих реакций у одноклеточных зеленых водорослей, а также исследованы механизмы ориентации клеток в ответ па сигналы различной природы. Создана коллекция поведенческих мутантов СЫатуйотопаь геЫшгйШ, которая может быть использована для изучения молекулярно-генетических основ движения и поведения. Данные и методические разработки, представленные в работе, используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Санкт-Петербургского государственного университета.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих научных конференциях: I Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы современной альгологии» (Киев, 1987), VIII съезде ВБО (Алма-Ата, 1988), II съезде ВОФР (Москва, 1992), III съезде ВОФР (Санкт-

Петербург, 1993), VI Международной конференции по клеточной и молекулярной биологии хламидомонады (Гранлибаккен, США, 1994), конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 1996), VII Международной конференции по клеточной и молекулярной биологии хламидомонады (Регенсбург, Германия, 1996), I Европейском фикологическом конгрессе (Кельн, Германия, 1996), III Международном симпозиуме «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997), VI Международном фикологическом конгрессе (Лейден, Нидерланды, 1997), III Международном конгрессе по биологии и систематике зеленых водорослей (Смоленице, Словакия, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, включающих результаты, обсуждение, обзор литературы и методы исследования, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 228 страницах машинописного текста, содержит 39 таблиц, 42 рисунка, список литературы включает 369 наименований.

Глава 1. Поведенческие реакции эукариотических водорослей

Подвижные клетки эукариотических водорослей, обладающие жгутиковым аппаратом, демонстрируют поведенческие реакции в отпет на световые сигналы, химические соединения, магнитное поле и гравитационное ноле. Среди них наиболее изученными являются свето-зависимые поведенческие реакции. 13 системе фотоноведенчсских ответов можно выделить три основных элемента: 1) фотореценторную систему; 2) систему преобразования поступающего светового сигнала; 3) эффектор, вызывающий двигательный ответ клетки относительно светового стимула. Функцию фоторецеищш у разных представителей могут выполнять различные каротиноиды, фикобилииы, пигменты флавиновой природы. Кроме того, фоторецепторные системы водорослей различаются по структуре фоторецситора и его расположению в клетке. Данные о разнообразии строения фоторецепторных систем водорослей представляют значительный интерес в качестве дополнительных признаков, позволяющих более полно обосновать филогенетическую систему водорослей (Масюк, Посудин, 1991). Кроме того, результаты

последних исследовании фотоповедения зеленых водорослей свидетельствуют о важной роли биоэлектрических нроцесов в фоторегуляции их движения. По мнению некоторых авторов, изменение электрического потенциала в клеточной мембране с последующим электрическим возбуждением мембраны может быть общим компонентом в системе преобразования световых сигналов у отдельных представителей прокариотических и эукариотических организмов (Синещеков, Литвин, 1982).

Хемотаксис водорослей остается одним из наименее изученных типов их поведения. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что хемоаттрактангами могут быть различные классы соединений от гидрофобных углеводородов у бурых водорослей до аминокислот и производных пластохппопа у зеленых водорослей (Maier, 1993; Jaenicke, Starr, 1996). Не исключено, что степень разнообразия структуры аттрактаптов в пределах рода может отражать специфичность хеморецепции у представителей разных таксонов. Однако этот вопрос, безусловно, требует дальнейшего изучения. В литературе нет данных о возможных механизмах преобразования и передачи хемосенсорных сигналов. Отсутствие синтетических аналогов аттрактаптов и недостаток информации о соединениях, которые могут быть хемо-эффекторамн, существенно ограничивают возможности изучения механизмов регуляции хемотаксиса. Это отчасти связано с тем, что синтезируемые клетками агтрактанты выделяются в среду в очень незначительных количествах, их пороговые концентрации составляют около1010-1042 М (Müller et al., 1971;.Starr et al., 1995).Необходимость использования в большинстве случаев высокоспецифичных методов выделения и очистки этих соединений выводит эту проблему за рамки только биологической. Многие ключевые вопросы, связанные с исследованием хемосенсорпого поведения, могут быть решены с помощью выявления и использования более доступных соединений — хемоэффекторов. Кроме того, изучение регуляторных механизмов поведения невозможно без привлечения модельных объектов, для которых разработаны методы молекулярпо-гепетического анализа. В связи с этим, использование модельных объектов, с одной стороны, и расширение спектра соединений, вызывающих хемотаксис, с другой стороны, может способствовать, на наш взгляд, более успешному изучению этого тина поведенческих реакций.

Глава 2. Хемотаксис Chlamydomonas reinhardtii и его связь с фотоповеденческими реакциями

Характеристика хемоэффекторов

Системы хемотаксиса у различных организмов отличаются уровнем специфичности хемосенсорного поведения. Пределы хемотактической чувствительности у некоторых микроорганизмов достаточно обширны и могут включать несколько десятков различных по структуре химических соединений, тогда как хемотаксис других организмов характеризуется высокой специфичностью, и клетки способны реагировать только па несколько близких по химическому строению [¡сшести (Bean, 1979). Хемотактическая система любого организма определяется прежде всего спектром химических агентов, которые являются для него хемоэффекторами.

В работе использованы штаммы С. reinhardtii из Петергофской генетической коллекции, а также штаммы, любезно предоставленные Д. Витманом (США) и Э. Харрис (США).

Капиллярным методом Адлера (Adler, 1973) в реакциях хемотаксиса нами были исследованы различные аминокислоты, жирные кислоты, сахара, спирты, фенолы и ионы металлов как возможные хемоэффекторы для С. reinhardtii. Было установлено, что ат-трактанта.чи для них являются сахара: сахароза, мальтоза, ксилоза и шестиатомный алифатический спирт — маннит. Другие мопо- и олигосахариды не являлись для клеток С. reinhardtii аттрактантами. Нам не удалось выявить какие-либо закономерности между наличием функциональных групп (альдегидная, кетопная, первичная спиртовая, вторичная спиртовая) или числа атомов кислорода в углеводе и его способностью аттрагпровать клетки. В дальнейшем при обсуждении результатов для обозначения органических хемоэффекторов Chla-mydomonas мы будем использовать термин «сахара», включая и эту группу для удобства и производную маннозы — сахарный спирт маннит.

Нами был проведен компьютерный анализ направленного движения и скорости клеток. Движение популяции С. reinhardtii фиксировалось в течение 15 мин как сумма индивидуальных треков каждой клетки за указанный период времени (Hader, Lebert, 1985). Направление

каждого трека было рассчитано как направление вектора из исходной 1С конечной точке трека. Получаемая в результате суммирования треков диаграмма состоит из 64 рапных секторов, расположенных в круге от 0° до 360°. Радиус каждого сектора пропорционален числу треков, векторы которых расположены внутри данного сектора. В результате, для популяции клеток, движение которых фиксировалось с помощью видеокамеры, значение направленного движения рассчитывалось как:

sin 0 = 1 ,/n Zsin а , cos 0 - 1/п cos а,

а также оценивалась степень ориентации клеток в популяции, г, как: г =[(Z sin а)2 + (X cos а)2]'/2/п, где а — угол трека перемещения одной клетки, п — число зарегистрированных треков (Häder, Vogel, 1991).

Из полученных результатов компьютерного анализа движения С. reinhardtii в реакциях хемотаксиса к сахарам следует, что перемещение клеток было строго ориентировано в направлении распространения градиента аттрактаита и 0 во всех случаях составлял 180° ± 9° (рис. 1-1 а, б, в, г). В опытах с глюкозой, которая не является хемоэффектором, движение клеток было случайным, и какой-либо их ориентации в направлении изменения се концентрации зафиксировано не было (рис. 1—1 д). Эти данные подтверждает расчет параметра степени ориентации г, значения которого при наличии градиента аттрактантои составили 0.49—0.66, что свидетельствует о направленном, а не случайном движении клеток.

Параллельный анализ распределения скоростей движения клеток показывает, что их скорость не зависела от направления перемещения С. reinhardtii (рис. 1-2).

Таким образом, при хемотаксис к сахарам у С. reinhardtii происходит ориентированное движение в направлении увеличения концентрации аттрактаита, и этот процесс не связан с увеличением скорости движения клеток иод действием аттрактантов.

Направленное движение вегетативных клеток и гамет в реакциях хемотаксиса

Описанные закономерности хемотактнческих ответов вегетативных клеток С. reinhardtii наблюдались только у клеток, находящихся в логарифмической фазе роста. Подвижные клетки, взятые из лаг-фазы, которая длилась в наших экспериментах 30-36 ч, или стационарной

270°

90° 270°

180°Jm»

0°

180°

1д

90°

180°

2а

180°

90° 270°

180°

2в

180°

2г

90° 270°

180°

2Д

0°

Рис. 1. Гистограммы распределения направлений перемещения (1) и скорости движения (2) клеток С. reinhardtii, плывущих в градиенте концентраций сахарозы (а), мальтозы (б), ксилозы (в), маннита (г) и глюкозы (д).

Капилляры с сахарами расположены на 180°. Количество зарегистрированных за 15 мин треков составило: 840 (а), 675 (б), 810 (в), 860 (г), 804 (д).

фалы роста, которая начиналась через 76-80 ч с начала пересева, не демонстрировали хемотактического ответа на сахара (рис. 2). Следует отметить, что фототактическая активность Сhlamydamonas также варьирует в зависимости от фазы роста (Stavis, Hirschberg, 1973). Максимальный уровень фототаксиса также был зарегистрирован во время логарифмической фазы роста, и реакция полностью отсутствовала в стационарной фазе роста.

Время, ч

Рис. 2. Зависимость хемотактической активности вегетативных клеток С. reinhardtii от фазы роста.

Концентрация сахарозы — 5 Ю 3М, мальтозы — 10 3 М. Реакции хемотаксиса, представленные на рис. 2, изучали капиллярным методом с использованием плоскостенных капилляров Перфильева, содержащих 5 каналов объемом 3 мкл каждый (сечение — 260 х 450 мкм). 3 контрольных канала капилляра заполняли средой L min с ацетатом натрия (Levine, Ebersold, 1958), 2 опытных канала капилляра — растворами испытуемых веществ, после чего капилляры помещали одним концом в суспензию клеток. В результате диффузии веществ из опытных капилляров образовывался пространственный градиент, воспринимаемый клетками. Через 10 минут экспозиции при 23 °С в темноте клетки, накопившиеся в каналах капилляров, обездвиживали в пламени спиртовки и подсчитывали их число под микроскопом (объектив х10, окуляр х15). Опыты ставили в 10 по-вторностях, на графике приведены средние арифметические значения величин и доверительные интервалы (±Sx tp) при уровне значимости 0.01.

Кроме того, нами были изучены реакции хемотаксиса подвижных клеток Chlamydomonas reinhardtii в процессе гаметогенеза. Для индукции гаметогенеза вегетативные клетки суспендировали в среде L без азота и выдерживали на свету (Harris, 1989). Клетки начинали реагировать хемотактически на сахара спустя 20 ч после начала гаметогенеза; хемотактическпй ответ был максимальным через 24-26 ч, после чего его интенсивность снижалась и через 30 ч гаметы были хемотактически неактивны. Причем, способность к хемотаксису у гамет не зависела от типа спаривания, и, по нашим данным, гаметы обоих типов спаривания реагировали хемотактически на ксилозу, сахарозу, мальтозу и маннит.

Описанная нами динамика хемотаксиса к сахарам в процессе гаметогенеза отличается от закономерностей, характерных для хемотаксиса к ионам аммония (Byrne et al., 1991). Подвижные клетки реагировали на аммоний в течение первых 6—8 ч гаметогенеза, а через 10-12 ч полностью утрачивали способность к хемотаксису, что, по-видимому, отражает процесс дифференциации вегетативных клеток в гаметы, одним из основных условий которого является отсутствие в среде источников азота.

Аммоний может быть использован вегетативными клетками С. reinhardtii в качестве источника азота, что может обуславливать наличие хемотаксиса к нему. Мальтоза, сахароза, ксилоза и маннит не используются клетками С. reinhardtii в качестве источника углерода (Sager, Granick, 1953). Нам не удалось также выявить какое-либо действие сахаров-аттрактантов па эффективность образования пар между гаметами противоположных типов спаривания или на выживание образовавшихся зигот. Следует отметить, что хотя приспособительное значение хемотаксиса в целом не вызывает сомнений, биологический смысл наличия хемотаксиса у организмов к определенным соединениям часто не ясен. Так, некоторые соединения, которые активно метаболизируются бактериями, в ряде случаев не являются для них аттрактантами или даже могут оказывать реиеллептный эффект (Adler, 1973); и напротив, в качестпе аттрактантов служат не усваиваемые и не транспортируемые в клетку соединения, как, например, а-аминоизобутират, являющийся, неметаболизируемым аналогом серина (Melton et al., 1978), а-метиласпартат — аналог аспартата (Mcsibov, Adler, 1972).

Действие аттрактантов на фотоповеденческие ответы

С.гет1шг<1Ш обладает фотосенсорной системой, которая передает информацию об интенсивности и направлении действующего света па жгутиковый аппарат, обеспечивая ориентированное движение (Вобсоу, Рет1еП>, 1979). В зависимости от интенсивности света С.ге1п/гаг(1Ш обнаруживает три типа фотоповеденческих ответов: слабый по интенсивности свет вызывает движение клетки к источнику света (положительный фототаксис), более высокие интенсивности света

приводят к движению клетки от источника света (отрицательный фототаксис), и резкое изменение интенсивности света приводит к временной остановке клетки (стоп-ответ или реакция фотошока). Рис. 3. Гистограммы распределения направлений перемещения клеток С. reinhardtii 137 с к источнику света в минеральной среде (а) и в минеральной среде после добавления сахарозы (б). Источник света интенсивностью 0,75 Вт/м2 расположен на 180°. Количество зарегистрированных за 5 мин треков составило 820 (а) и 790 (б).

В наших опытах при интенсивности света 0.75 Вг/м2 клетки двигались к источнику света (рис. 3 а). Добавление в суспензию клеток сахарозы перед началом освещения изменяло характер фотоответа, приводя к более рассеянному, менее ориентированному

движению клеток к источнику света (рис. 3 б), а коэффициент степени ориентации г уменьшался после внесения аттрактанта от 0.5 до 0.29 соответственно. Сходный эффект был зарегистрирован и для других аттрактантов.Как было установлено, хсмоэффекторы временно изменяли характер двигательного ответа С. reinhardtii в реакциях фототаксиса, независимо от знака фототаксиса. Длительность этого воздействия зависела от двух факторов: концентрации хемоэффектора и интенсивности действующего света. Кроме того, сахароза, мальтоза, ксилоза и маннит могли временно блокировать реакцию фотошока.

Глава 3. Получение и генетический анализ мутантов Chlamydomonas reinhardtii с нарушенным хемосенсорным поведением

В изучении фотосенсорного поведения Chlamydomonas в настоящее время достигнуты значительные успехи, в частности, установлена родонсиновая природа фоторецепторного пигмента (Foster el al., 1984; Deininger et al., 1995), выявлена ключевая роль фотоэлектрических реакций и трансдукцни световых сигналов (Harz, Hegemann, 1991; Sineshchekov et al., 1992), клонированы некоторые гены, контролирующие светозависимые поведенческие реакции (Pazour et al., 1995). Для понимания структурно-функциональной организации системы хемотаксиса прежде всего было необходимо создание коллекции мутантов с нарушенным хемотаксисом па различных этапах передачи сигналов от хемосеисоров к жгутиковому аппарату и проведение на их основе генетического анализа с целью выявления локализации генов, контролирующих хемосенсорное поведение.

Метод получения хемотактических мутантов

Методы, впервые разработанные в лаборатории Д. Адлера для отбора хемотактических мутантов у бактерий (Ordal, Adler, 1974) были позднее использованы для селекции мутантов по хемотаксису у миксамеб D. diseoideum (Segall et al., 1987). Однако эти методы оказались неприемлемыми для организмов со значительно более высокими скоростями движения, чем у бактерий. Для селекции хемотактических мутантов у С. reinhardtii нами был разработан принципиально новый

метод отбора, основанный на временном подавлении фототаксиса аттрактантами. Когда популяция клеток после воздействия мутагена (УФ свет или Ы->(емшу/-1чГ-н?ия;;о-нитрозогуанидии (МННГ)) исиытывалась в реакциях фототаксиса, то большинство клеток не могли мигрировать к источнику света после добавления аттрактантов в течение первых 15—20 мин; па свет реагировали только мутанты с нарушенным восприятием хемосснсориого сигнала. В опытах по получению мутантов подвижные клетки С. reinhardtii штамм 137с(+) (концентрация клеток 1.8-2.0- 10е кл/мл) облучали ультрафиолетом (8 Дж/м2 с) в течение 50 с. Затем 5 мл облученной культуры засевали в колбу с 40 мл среды L min с ацетатом натрия и помещали в темноту для предотвращения фотореактивании. Для мутаганеза с использованием МННГ к подвижным клеткам С. reinhardtii 137 с(+) (концентрация клеток 1.8— 2.0-10ß кл/мл) добавляли раствор МННГ в концентрации 5 мкг/ мл. Затем культуру помещали в темноту на 15 мин, после чего центрифугировали (10 мин, 4000 об/мин) и ресусиендиронали вереде L. При таких условиях клетки демонстрировали около 10% выживаемости. Через 72 ч к суспензии клеток добавляли растворы хемоаттрактантов (конечная концентрация 1%) и помещали в стеклянную камеру объемом 1 мл, локально освещенную пучком света, на 7 мин. Фототаксис подвижных клеток С. reinhardtii, обладающих нормальным хемотаксисом, временно подавлялся хемоаттрактантами. Клетки, мутаптные по реакциям хемотаксиса, под действием света двигались 1С освещенному концу камеры. 100 мкл культуры отбирали с освещенного конца и переносили в 1 мл среды L min с ацетатом натрия. Последующие 4 отбора производили через каждые 48 ч, сокращая время экспозиции до 6, 5, 4, 3 мин соответственно. После пятого отбора делали высев на чашки Петри со средой L min с ацетатом натрия с 1,5% агара по 0.1 мл. Через 14 дней выросшие колонии отсевали в жидкую среду L min с ацетатом натрия. Полученные культуры испытывали па реакции хемотаксиса.

Таким образом, предложенный нами метод позволяет пространственно разделить популяцию клеток с нормальным поведением от популяции, обогащенной клетками, мутантными по хемотаксису.

Мутантные штаммы, изолированные нами с помощью описанного метода, оставались полностью подвижными и были далее охарактеризованы по их неспособности отвечать на различные хемосенсорные сигналы.

Фенотипическая характеристика поведенческих мутантов

9 из 10 отобранных мутантов обладали нарушениями хемотактических ответов на один аттрактант (табл. 1). У всех мутантов были зарегистрированы нормальные фотоповеденческие ответы: фототаксис и реакция фотошока. Это означает, что данные мутанты могут иметь нарушения на ранних этапах пути передачи хемотактического сигнала. У бактерий и миксамеб Dictyostelium diseoideum мутанты с дефектами в структуре хеморецепторов неспособны отвечать на соединения, определяемые одним видом рецепторов, в то время как ответы, опосредуемые другими рецепторами, не нарушаются (Taylor et al., 1980; Segall et al., 1987, Kuwayama et al., 1993). Таким образом, по-видимому, у этих 9 мутантов нарушения реакций хемотаксиса вызваны дефектами хеморецепторов.

Таблица 1

Фенотшшческие характеристики поведенческих мутантов1

Штам- Фото- Фото- Хемотаксис к Подвижность в

мы таксис шок среде с низкон

маль- саха- кси- ман- аммо- концентрацией

тозе розе лозе ииту нию ионов Са2+

Che 1,

Che3 4- + - + + + + +

Che2,

Che4 + + + - + + + +

Chc5 + + - - + + + +

Che6,

Che7,

Che8 + + + + - + +

Che9,

С he 10 + + + + - + + +

CPT1 - + - + + + + +

CPT2 + + + - + + + +

Мутант С!ге5 не реагировал хемотактически на 2 соединения — мальтозу и сахарозу. Мутация в штамме С/ге5, возможно, нарушает ген,

1 «+» — штамм демонстрирует двигательную реакцию, характерную для клеток дикого типа; «—» — штамм утратил двигательную реакцию на стимул; «±» — фототактическая активность снижена но сравнению с реакцией дикого типа.

продукт которого является либо компонентом как мальтозпого, так и сахарозного рецепторов, либо какой-то общий компонент коммуникационной системы, который передает мальтозныи и сахарозный сигналы па жгутиковый аппарат. Все мутанты по хемотактическим реакциям па сахара сохраняли нормальный хемотаксис к попу аммония.

У двух из изолированных нами штаммов были выявлены нарушения направленного движения в ответ на хемо- и фотосенсорные сигналы (табл. 1). Мутант, обозначенный как СРТ1 (defects in çhemotactic and jîhototactic responses), утратил хемотаксис к одному из аттрактантов — мальтозе и реакцию фототаксиса.

Мутант СРТ2 не реагировал хемотактически на сахарозу, и у него зарегистрировано снижение фототактической активности по сравнению с клетками дикого типа. Однако подвижные клетки СРТ1 и СРТ2 демонстрировали реакцию фотошока и нормальную чувствительность аксонем к ионам Ca21". Полученные данные показывают, что нарушения поведенческих ответов у СРТ1 и СРТ2 штаммов не вызваны повреждением функций жгутикового аппарата и могут быть обусловлены мутациями в генах, контролирующих более ранние этапы передачи сенсорных сигналов.

Гибридологический анализ поведенческих мутантов

С целью выявления локализации генов, включенных в контроль хемотаксиса, четыре хемотактических мутанта из двух фенотипических классов: Che1, CheJ, утративших хемотаксис к мальтозе, и Che2, Che f, утративших хемотаксис к сахарозе, были скрещены со штаммами дикого типа, демонстрирующими нормальные реакции хемотаксиса к сахарам. Процедуры скрещиваний п тетрадного анализа выполнялись стандартными методами (Harris, 1989).

Анализ характера наследования изучаемых мутаций показал, что все они наследуются моногенно (2+:2~) без реципрокных различий, то есть локализованы в ядерном геноме (табл. 2).

Генетическое изучение фенотипически сходных мутантов предполагает выявление их аллельпых взаимоотношений. С этой целью рекомбинанты, несущие интересующие пас мутации {mall, mal2, sud и suc2) в сочетании с обоими типами спаривания, были вовлечены в скрещивания между собой (табл. 3). Мутации рекомбинируют свободно, то есть, они не сцеплены. Кроме того, mall, mal2, sud и suc2 не сцеплены также с маркером mt (VI). Появление рекомбинантов в

скрещиваниях между мутантами по хемотаксису к мальтозе свидетельствует о неаллельности mall и та12 (табл. 3). Наличие реком-бинантного потомства выявлено и при скрещивании мутантов, утративших хемотаксис к сахарозе, то есть, sud и suc2 неаллсльны.

Таблица 2

Тетрадный анализ скрещивании хемотактических мутантов со штаммами дикого типа1

Штамм Мутагенез Генотипы родителей PD NPD T Выживаемость зооспор, %

СНЕ1 УФ таИхтаИт 20 0 0 54.1

СНЕ2 УФ sudxsucl+ 12 0 0 44.6

СНЕЗ мннг mal2xmal2 14 0 0 48.9

СНЕ4 мннг suc2xsuc2¥ 26 0 0 63.1

Таблица 3

Тетрадный анализ скрещиваний хемотактических мутантов между собой2

Генотип та 12 sud suc2

mall 1:1:8 8:7:35 3:2:25

7па12 4:5:23 3:3:18

sud 2:3:15

С целью подтверждения полученных данных о неаллельности mall и та12 нами был проведен дополнительный комплементационпый тест но методу Эберсольда (Ebersold, 1967). Для получения диплоидов были использованы ауксотрофные маркеры агд2 и агд7, полученные в результате скрещиваний исходных мутантов со штаммами А-7 и II-32f.

Восстановление хемотаксиса к мальтозе в гетерозиготных дипло-идах показывает, что mall и та12 комплементарны (табл. 4). Таким образом, можно утверждать, что mall и та12 неаллельны и занимают разные группы комплементации. Комбинация suc1 и suc2 в гетерозиготных диплоидах также привела к восстановлению реакции хемотаксиса, то есть suc1 и suc2 принадлежат к двум разным ядерным

' В таблице приведены соотношения тетрад родительского (PD), неродительского (NPD) дитипов и тетратипов (Т).

2 В таблице приведены соотношения PD:NPD:T.

генетическим локусам. Анализ диилоидов, гетерозиготных по изучаемым мутациям, которые были получены при скрещивании мутантов с диким типом, показал, что эти диилоиды реагировали на мальтозу и сахарозу в реакциях хемотаксиса, что свидетельствует о рецессивности данных мутаций (табл. 4). Нам не удалось получить жизнеспособных зооспор в различных скрещиваниях, в которые был вовлечен штамм С1ге5, что не позволяет нам судить о характере мутации(й), вызвавших нарушение хемотаксиса к мальтозе и сахарозе в этом мутанте.

Таблица 4

Комплемснтационные тесты скрещиваний между хемотактическими мутантами1

Генотип mal 1 mal2 suc1 sitc2 ret

mal 1 — + +

та12 - +

sud — + +

snc2 — +

Таким образом, но крайней мере четыре независимо наследуемых ядерных гена вовлечены в генетический контроль хемотаксиса к мальтозе и сахарозе. Полученные данные позволяют предположить, что хемотакгические гены не формируют у С. reinhardtii единую структурно-функциональную группу. Известно, что у миксамеб D. discoid еит хемотактическне гены также локализованы в различных группах сцепления (Kuwayama et al., 1993). Следует отметить, что у С. reinhardtii большинство из описанных в настоящее время генов, которые контролируют отдельные клеточные функции, находятся в разных группах сцепления (Harris, 1989); это справедливо и в отношении генов,регулирующих фотоноведенчсскис реакции (Pazour et al., 1995). Единственное исключение в этом плане может представлять гшг-группа сцепления, включающая, главным образом, гены, ответственные за процессы сборки и работу жгутикового аппарата (Ramanis, Luck, 1986).

Результаты тетрадного анализа СРТ мутантов свидетельствуют о том, что в данном случае происходит расщепление по двум несцеи-лепным ядерным генам, которые в отдельности контролируют реакции

1 «+» — наличие комплементации (диилоиды демонстрируют хемотаксис); «-» — отсутствие комплементации (диилоиды не демонстрируют хемотаксис); \vt — аллели дикого типа.

фото- и хемотаксиса (табл. 5). Утрата хемотаксиса к одному из аттрактантов у каждого мутанта произошла, вероятнее всего, вследствие повреждений на ранних этапах передачи хемосенсорных сигналов. Мутации, вызвавшие у двойных поведенческих мутантов изменения характера реакций фототаксиса, не приводят к нарушениям в работе жгутикового аппарата и не связаны с этапом рецепции, что предполагает у них нарушения на стадии преобразования световых сигналов.

Таблица 5

Тетрадный анализ скрещиваний СРТ мутантов со штаммами дикого типа1

Штамм Генотипы родителей PD NPD T

CPT1 mal3 х mal'j+ 12 0 0

pt1 х pt1+ 12 0 0

та 13 pt1 x mal3+ pt1+ 2 3 7

СРТ2 suc3 x suc3+ 8 0 0

pt'2 x pt2+ 8 0 0

suc3 pt2 x suc3+ pt2+ 1 1 6

Таким образом, предложенный нами метод отбора поведенческих мутантов позволяет изолировать не только хемотактические мутанты, но и мутанты с нарушенным фотоповедением, что не зависит от тина использованного агтрактапта. Кроме тою, возможность отбора двойных мутантов с помощью метода, который основан па временном подавлении фотоповедснческнх реакций аттракгантами, дополнительно свидетельствует в пользу высказанной нами гипотезы о наличии у С. rein-hardtii механизма интеграции сигналов разной природы.

Получение и характеристика инсерционного мутанта, утратившего хемотаксис к сахарозе

Гены известной биохимической природы, мутации по которым вызывают в клетке нарушение синтеза белков с известными биохимическими свойствами, можно клонировать с помощью иммунного и гибриди-зационного скрининга геномных библиотек. Однако такой подход неприменим для клонирования генов, кодирующих белки с невыявлен-ными биохимическими свойствами и неизвестной локализацией в

1 В таблице приведены соотношения тетрад родительского (PD), неродительского (NPD) дитипон и тетратиио!?.

клетке. Альтернативным подходом для клонирования такой группы генов является использование метода случайного инсерционного мутагенеза (Rocliaix, 1995).

Трансформацию С. reinhardtii проводили методом встряхивания клеток со стеклянными шариками (Kindle et al., 1989). Клетки штамма GB 49 (c\v15arg7) выращивали в среде L с аргинином при температуре 25 "С и освещении 8 Вт/м2 до концентрации 2-10е кл/мл. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин и ресуспендировали в среде L без аргинина до концентрации 2- 10я кл/ мл. К 0.3 мл полученной суспензии добавляли 5 мкг pARG7.8/BamHl и 300 мг стеклянных шариков диаметром 0.55 мм. Смесь встряхивали дважды по 15 с с пятиминутным перерывом, после чего добавляли 7 мл среды L без аргинина с 0.5% агара. Культуру высевали на чашки Петри со средой L6e3 аргинина с 2% агара. Через 16—20 дней подсчитывали число трансформантов.

В результате четырех независимых экспериментов было получено 1178 трансформантов. Частота трансформации составила 5.67.1 трансформантов на 10'; клеток. Наблюдаемая частота трансформации соответствует частоте трансформации arg7 мутантов плазмидой pARG7.8 с использованием баллистического метода (Debuchyet al., 1989).

Полученные после трансформации нрототрофные по аргинину штаммы были использованы далее для отбора мутантов по хемотаксису к сахарозе. Из 68 проанализированных после отбора трансформантов был изолирован штамм TF1, утративший хемотаксис к сахарозе, но сохранивший хемотаксис к мальтозе, ксилозе и манниту.

Для подтверждения процесса интеграции плазмиды pARG7.8 в геном С. reinhardtii был проведен анализ ДНК TF1 мутанта с помощью блот-гибридизации ДНК (рис. 4).

Собственный (резидентный) ген аргшшисукцинатлиазы С. reinhardtii содержится в BamHl фрагменте ДНК размером приблизительно 17 тыс. пар оснований (Debuchy et al., 1989). В обработанной BamHl ДНК инсерционного мутанта TF1 выявлено три дополнительных фрагмента, гибридизующихся с плазмидой pARG7.8.

TF1 мутант был скрещен со штаммом CCI24, имеющим нормальную реакцию хемотаксиса к сахарозе. Один из рекомбииантов Р—TF1—4 (sucrnt*) был скрещен со штаммом ARG7 (табл. 6). Все сегрегапты, утратившие хемотаксис к сахарозе, росли па среде без аргинина. Наблюдаемая ко-сегрегация Arg+и Suc" фенотипов может свидетель-

ствовать о том, что Suer фенотип является следствием единичного включения плазмиды pARG7.8 в ген, ответственный за хемотаксис к сахарозе. Таким образом, показана возможность получения хемотак-тических мутантов С. reinhardtii методом инсерционпого мутагенеза.

pARG 7.8 TF1

23.1

9.4

6.5

4.3

2.3 2.0

Рис. 4. Результаты блот-гибридизации суммарной ДНК TF1 трансформанта, утратившего хемотаксис к сахарозе, с меченой ДНК pARG 7.8/BamHI.

Суммарную ДНК из клетокТР1 выделяли по методу Викса (Weeks et al., 1986), 5 мкг ДНК, обработанной рестриктазой BamH! (Fermentas), после электрофореза в 0,8 % агарозном геле перенесли на мембрану (Hybond) и проводили гибридизацию с ДНК pARG 7.8/BamHI, меченной методом статистической затравки. Стрелкой обозначен фрагмент ДНК, содержащий ген аргининсукцинатлиазы. Справа указаны размеры фрагментов Hindlll рестрикции бактериофага X, тыс. п. н.

Таблица 6

Тетрадный анализ зигоспор из скрещиваний трансформанта TF1 со штаммом дикого типа и рекомбинанта P-TF1—4 со штаммом ARG7

Штамм Генотипы родителей PD ИР!) T Выживаемость

зооспор, %

TF1 siic~ х suc* 10 0 0 81.3

P-TF1-4 stier argl* x suc+ arg7 5 0 0 32.1

Глава 4. Механизмы регуляции направленного движения СЫатуботопав ге/пИагМИ

Способность клеток реагировать на внешние стимулы, меняя направление своего движения, I! значительной мере определяется эффективностью функционирования системы преобразования сенсорных сигналов, воспринимаемых рецепторами.

У эукариотических организмов системы подвижности к легок по морфологическим свойствам и по белковому составу структур, определяющих движение, можно отнести к двум основным типам. Первая система состоит из микротрубочек, основным компонентом которых является тубулин, и связана с движением ресничек и жгутиков. Вторая система состоит из микрофнламентов, содержащих, главным образом, актин, и связана с амебоидным движением. Механизмы направленного движения в ответ на хемосенсорные стимулы изучены у различных по уровню организации эукариотических клеток, демонстрирующих оба типа движения. Исключение в этом плане составляли фотогрофныс подвижные эукариоты. В связи с этим, выяснение основных механизмов, регулирующих хемотаксис у С. ге1п/гагс1Ш, может быть весьма перспективным с точки зрения выявления некоторых эволюционных тенденций формирования механизмов контроля направленного движения.Роль кальция в контроле направленного движения

Ионы кальция необходимы для регуляции движения и клеточного поведения многих микроорганизмов. Неспецифические блокаторы кальциевых каналов Ьа3' и Сс!2*" полностью ингибировали реакции хемотаксиса, не влияя при этом на подвижность клеток, что свидетель-

стпуст о необходимости тока ионов кальция из среды для регуляции хемотактической реакции.

Верапамил, принадлежащий к группе фенилалкиламипов, и дилтиазем, принадлежащий к группе бензотиазешшов, которые блокируют действие Ca2:-каналов L-типа (Triggle, 1981; Berridge, 1995), также ипгибировали реакции хемотаксиса С. reinhardtii. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в хемотактических ответах С. reinhardtii к сахарам и ионам аммония участвуют Ca2,-каналы L-типа. Кроме хемотаксиса ионы Са2^ контролируют у Chlamydomonas светозависимые поведенческие реакции (Witman, 1993), процесс дефлагелляции в ответ на различные внешние воздействия (Quarmby, Hartzell, 1994 b), а также процесс регенерации жгутиков (Cheshire, Keller, 1991). По нашим данным, блокаторы Са2,-каналов оказывали на хемотаксис Chlamydomonas действие, аналогичное описанному ранее для фотоповеденческих ответов (Nultsch et al., 1986; Hegemann et al., 1990; Harz, Hegemann, 1991). Это позволяет предположить, что в процессах регуляции фото- и хемоноведенческнх ответов могут участвовать сходные Са2+-каналы или сходные механизмы регуляции активности этих каналов.

Инозитол-1, 4, 5-трифосфат и передача хемосенсорных сигналов

Увеличение цитоплазматической концентрации ионов кальция может происходить как за счет сто поступления из окружающей среды в клетку, так и путем его извлечения из внутриклеточных кальциевых депо. В ряде случаев возможно взаимодействие между сигнальными путями, регулирующими освобождение Са2+ из внутриклеточных источников и поступление внешнего Са2+ через плазматическую мембрану, что, в конечном счете, позволяет клетке контролировать динамику ответа на внешний сигнал (Dolmetsch, Lewis, 1994). Образование D-инозитол-1, 4, 5-трифосфата (1Р3) и высвобождение внутриклеточного Са2+ являются ключевыми этапами быстрых ответов животных клеток на различные внешние сигналы (Kraus-Friedman, 1994). Компоненты инозитол-фосфагного сигнального пути, включены в передачу хемосенсорных сигналов у клеток с амебоидным движением, таких как лейкоциты крови человека (Shum et al., 1995) и миксамебы Dictyo-stelium diseoideum (Snaar-Jagalska et al., 1988). Показано, что

аттрактанты взаимодействуют и клетках с соответствующими G-белками, которые активируют фосфолипазу С, гидролизующую фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфат с образованием вторичных посредников 1Р3 и 1, 2-диацилглицерина. Нас интересовало, не происходит ли увеличение концентрации Са2+в цитозоле в ходе хемотаксиса С. reinhardtii также за счет участия компонентов инозитол-фосфатпого пути. С этой целью нами была произведена сравнительная оценка количеств 1Р3 в нестимулировапных (контрольных) клетках и в клетках, стимулированных аттрактантами.

Уровни внутриклеточного 1Р3, образующегося при гидролизе фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфата, были определены радио-рецеиторным методом (Musgrave et al., 1993) с использованием [3Н]инознтол-1, 4, 5-трпфосфат-связывающей системы (Amersham, TRK 1000). Каждый вариант содержал по 40 мкл пробы, стандартного буфера, |3Н]1Р3 (0.138 КБк) и 1Р3-связывающего белка. После внесения в суспензию сахарозы пли аммония через различные интервалы времени количество 1Р3 в клетках не превышало 0.54 нМ IP3/10G клеток и не отличалось достоверно от количества 1Р3, измеренного в контрольных (нестимулировапных) клетках. Таким образом, 1Р3 не включен в передачу хемосепсорных сигналов у клеток С. reinhardtii, что предполагает у них функциональную организацию аппарата хемотаксиса, отличную от систем, выявленных у клеток с амебоидным типом движения.

Роль биоэлектрических процессов в преобразовании сенсорных сигналов

В преобразовании стимулов окружающей среды, регулирующих у жгутиковых и ресничных клеток их ориентацию в пространстве, ключевую роль играют биоэлектрические процессы (Eckert, 1972; Litvin et al., 1978; Harz, Hegemann, 1991). С другой стороны, изучение механизмов хемотаксиса у клеток с амебоидным типом движения свидетельствует о том, что Са21-завнсимое направленное движение у них не контролируется мембранным потенциалом, а изменение концентрации Ca2* в цитозоле необходимо для изменения локальной активности белков цитоскелета (Brundage et al., 1991).

По-видимому, у клеток с различными типами движения в ходе эволюции сформировались принципиально различные механизмы, контролирующие преобразование сенсорных сигналов в ходе поведен-

чес ких ответов. В связи с этим, нами были изучены биоэлектрические процессы в клетках С. reinhardtii при действии на них сигналов различной природы.

Биоэлектрические процессы в клетках

при одновременном действии на них фото- и

хемостимулов

У С. reinhardtii фототактически активный свет действует па родопсин-подобный фоторецентор, расположенный в глазке, что приводит к активации фоторецепторных Ca2-каналов и току Ca2f внутрь клетки (Harz, Hegemann, 1991). Вызванная вследствие этого деполяризация мембраны распространяется по всей клетке и активирует потен-циалозависимые Са2+-каналы, расположенные в мембранах жгутиков (Beck, Uhl, 1994), Са2т поступает внутрь жгутиков, изменяя характер их движения.

Мы предположили, что описанный нами эффект аттрактантов на фотоповсденчсские ответы может быть связан с их действием на уровень вызываемой светом деполяризации плазматической мембраны. Регистрацию фотоэлектрических сигналов суспензионным методом, разработанным O.A. Спнещеконым (Sineshchekov et al., 1992), проводили на кафедре физико-химической биологии МГУ. Измерения осуществляли с помощью платиновых электродов, погруженных в суспензию клеток. Клеточная суспензия (2-10с кл/мл) была помещена в прямоугольную кювету (2x60x25 мм) и освещена серией вспышек действующего света, направленных под углом 45° к линии, соединяющей электроды. Для измерений фотоэлектрических сигналов использовали предусилитель на базе интегральной схемы LF 353 1С. В качестве параметра фотоэлектрической активности клеток служил стационарный уровень фоторецепторного тока, определяемый как отношение амплитуды позднего фоторецепторного тока к сопротивлению клетки в расчете на 106 клеток, для оценки которого по цени пропускали импульсы постоянного тока малой величины.

По нашим данным аттрактанты временно снижали амплитуду фотоэлектрических сигналов. Была проанализирована динамика изменения фотоэлектрических сигналов после внесения аттрактантов в суспензию клеток в ходе гаметогенеза с целыо выяснения связи эффекта аттрактантов со способностью клеток воспринимать хемо-

сенсорные сигналы, то есть с их хемотактической активностью. Из результатов экспериментов с ксилозой (рис. 5) следует, что максимальное снижение фоторецеиторного потенциала наблюдалось при добавлении ксилозы в суспензию гамет, демонстрирующих максимальный хемотактический ответ, и через 26 ч гаметогенеза составляло около 30% от исходного значения. Эффект полностью отсутствовал в суспензиях хемотактически неактивных клеток (через 18 ч и 32 ч). Полученные данные свидетельствуют о том, что подавление фотоэлектрических сигналов хемоэффекторами зависит от хемотактического состояния клеток, то есть от их способности реагировать па хемо-сепсорные сигналы.

1,0-.

си 1

—п-2 3

22 24 26 28 30 Время гаметогенеза,ч

1.5-

Рис. 5. Действие ксилозы на фоторецепторный потенциал в зависимости от времени гаметогенеза.

1 — индекс хемотаксиса клеток к ксилозе (10 4 М);

2 — амлитуда сигнала в измерительной среде;

3 — амлитуда сигнала в измерительной среде после добавления ксилозы.

На основании полученных данных можно предположить, что биоэлектрические процессы, измеренные при одновременном действии фото- и хемосенсорных сигналов, отражают наличие у С. геткагсИи механизма интеграции сигналов различной природы, который контролирует, в конечном счете, характер движения жгутиков и, как результат, ориентацию клетки в окружающей среде.

Характеристика фотоэлектрических реакций у СРТ мутантов

Поведенческие му танты с нарушенным фото- и хемотаксисом способны генерировать электрические сигналы при возбуждении суспензии вспышками света. Однако, как у СРТ1, так и у СРТ2 наблюдалось значительное снижение фоторецепторного потенциала. Очевидно, что небольшая амплитуда фоторецепторного потенциала в суспензии мутантных клеток не связана с нарушениями в механизме функционирования фоторецепторного аппарата, гак как клетки сохранили нормальную реакцию фотошока (табл. 1).

Фотоэлектрические реакции у изолированных нами СРТ-мутаптов сходны с сигналами, зарегистрированными ранее у рЬхЗ штамма, утратившего фототаксис,но сохранившего реакцию фотошока (Рагоиг е1 а1., 1995). У рЬхЗ мутанта блокирование в преобразовании фотогактнческих сигналов связано, по-видимому, с нарушением механизмов, регулирующих потенциал покоя плазматическом мембраны, что, в свою очередь, может влиять на эффективность тока иоиов Са2' и уровень деполяризации мембраны при действии света низкой интенсивности. Анализ реакций хемотаксиса р1хЗ мутанта показал, что он полностью утратил хемотаксис ко всем сахарам. Фоновое освещение клеток рЬхЗ красным светом (>.>640 им, 2 Вт/м2) привело к появлению хемотактической активности, которая полностью ипгибируется добавлением ДХММ.

По-видимому, у СРТ-мутантов значения потенциала покоя достаточны для передачи хемосенсорных сигналов, а у р1хЗ штамма достигают некоторого порогового уровня только после действия фотосинтетически активного света.

Глава 5. Роль жгутиков в контроле поведенческих реакций С. ге/лЛа/тЛ//

Компоненты жгутикового аппарата и их роль в управлении движением клеток

Подвижные клетки СЫатуйотопа& имеют два жгутика длиной 1015 мкм, аксонемы которых состоят из девяти дублетов микротрубочек,

образующих кольцо вокруг центральной нары микротрубочек. Строение аксоиемы по типу «9 + 2» достаточно консервативно в эволюции организмов и характерно для жгутиков и ресничек многих эукариоти-ческих микроорганизмов и клеток млекопитающих, включая человека (Johnson, 1995). В связи с этим, изучение процессов сборки и работы жгутикового аппарата Chlamydonionas представляет собой удобную модельную систему для выявления общих механизмов, генерирующих движение жгутиков и определяющих направленную подвижность клеток в целом.

Жгутики и реснички у большинства клеток имеют два типа дииеиновых ручек, внутренние и внешние (Huang et al., 1979), которые структурно и функционально отличаются друг от друга. Функция внутренних дииеиновых ручек заключается создании правильной формы волны, генерируемой в аксонеме, в то время как внешние дипешювые ручки амплифицируют действие, вызванное внутренними ручками (Kato et al., 199:0-

Нами были проанализированы реакции хемотаксиса мутантов с нарушенной структурой дииеиновых ручек. Клетки штамма ida4 утратили три тина тяжелых полипептидных пеней, формирующих J2 класс внутренних дииеиновых ручек, по сохранили при этом способность к движению (Kamiya et al., 1991). Жгутики подвижных клеток \da4 сохранили частоту биения, характерную для дикого типа, но генерировали волну меньшей амплитуды. Мутант ida4 демонстрировал способность к направленному движению в реакциях хемотаксиса. Полученные данные свидетельствуют о том, что небольшое изменение амплитуды генерируемой аксонемами волны существенно не сказывается на ориентации Chlamydomonas по отношению к хемосенсорным стимулам в пространстве.

Кроме того, памп был проанализирован штамм oda11, который специфически утратил а-тяжелую цепь внешних дииеиновых ручек (Sakakiba et al., 1991). Клетки oda11 также сохранили хемотактичес-кую активность, которая составляла около 70% от хемотактическои активности клеток дикого типа. Повреждение а-тяжелой полипептидной цепи внешних дииеиновых ручек вызывает нарушение в существующей у клеток дикого типа разнице в частотах биения цис- и транс-жгутиков С. reinliardtii (Sakakibara et al., 1991). Предполагается, что существующая у клеток дикого типа разница в частотах биения двух жгутиков может сказываться на эффективности фототаксиса, не определяя в

целом механизм фототактического поворота (Takada, Kamiya, 1997). Это, очевидно, справедливо и для хемосеисорного поведения С. rein-hardtii, так как odall штамм демонстрирует не только фототаксис (Sakakibara et al., 1991), но и способность к хемотаксису. Са2+-независимое различие в частоте биения двух жгутиков Chlamydomonas не является их единственным функциональным различием. Цис- и транс-жгутики по-разному отвечают на изменение концентрации ионов Са2+ в среде, что определяет активный поворот клеток в реакциях фототаксиса. ida4 и odal 1 мутанты сохранили способность к Са2+-зависимому переключению функциональной активности цис- и трансжгутиков (Horst, Witman, 1993; Takada, Kamiya, 1997). В связи с этим, нами была проверена в дальнейшем возможная роль функционального Са2+-зависимого доминирования одного из жгутиков в реакциях хемотаксиса.

Функциональное доминирование цис- и транс-жгутиков как основа хемотактического поворота

Мутанты, которые утратили способность цис- и транс-аксонем изменять характер своего движения при изменении концентрации Са2\ сохранили нормальную реакцию фотошока, но не демонстрировали реакции фототаксиса (Pazour et al., 1995). Мутанты с нарушенной чувствительностью аксонем к ионам Са2+ не реагировали хемотактически на сахарозу, мальтозу, ксилозу и маннит (табл. 7). Эти штаммы, по-видимому, имеют повреждения в генах, кодирующих белки аксопем, чувствительные к субмикромолярным концентрациям кальция. Считают, что эти белки могут быть компонентами Са21-регулируемого комплекса, расположенного предположительно в высокоспециализированном регионе жгутиков, формирующим границу между флагел-лоплазмой и цитоплазмой и плазматической мембраной и жгутиковой мембраной (Tamm, 1994). Анализ мутантов позволяет предположить, что изменение в характере биения цис- и транс-жгутиков в ходе фототактического и хемотактического поворотов регулируются одними белками-сенсорами ионов Ca2t.

Полученные данные подтверждают высказанное нами ранее предположение, что направленное движение клеток С. reinhardtii в реакциях хемотаксиса, как и фототаксиса, основано на функциональном различии цис-и траис-жгутиков.

На основе проведенных экспериментов мы предлагаем схему, согласно которой у СМату(1отопа5, как и у других жгутиковых и ресничных клеток, ключевую роль и преобразовании хемосенсорных сигналов играют биоэлектрические процессы, и интеграция различных но природе сигналов происходит на уровне изменения степени поляризации клеточной мембраны, которая, в свою очередь, приводит к изменению токов ионов Са*^ в жгутиках и, в конечном счете, изменению характера их движения (рис. 6).

Таблица 7

Поведенческие ответы /jte-штаммов с нарушенной чувствительностью аксонем к ионам кальция1

Штамм Фототаксис* Фотошок* Хемотаксис к

сахарозе ксилозе мальтозе манииту

G1 + + + + + +

ptxi-1 - +

ptx5~I - + - - - -

ptxB-l - +

ptx7~1 - +

Глава 6. Подвижность и поведенческие реакции зооспор Chlorococcum minutum

Среди одноклеточных зеленых водорослей имеются формы, которые обладают более сложным, чем у Chlamydomonas, жизненным циклом. Это, в частности, относится к видам широко распространенных пресноводных водорослей, из рода Chlorococcum.

Представители рода Chlorococcum обладают либо одиночными вегетативными клетками, либо клетками, сгруппированными во временные ценобии неопределенной формы, их бесполое размножение происходит с помощью неподвижных аплапоспор или подвижных зооспор (Starr, 1958). Для организма, неподвижного в течение

' «*» — rioPazouret al., 199.1. /^.г-мутаитыбылп полученытрансформацпен штамма G1 илазмидой рМЫ24.

СВЕТ

Хлам нраролсгы

Фа га ре ив ига рны й Сэ*~-<а чал

АТТРАКТАИТ

¿V

Погани налоза в иси и ые Са^""-«а нал ы вж'угнох

Са

Б«л<(1 восприн имасшнс Вв1са<не <ан де игра и лл Са^~ в а «соне мах.

|та11].|та С]

|гис1].|г<1с2]

Погеч□налаза висииые Са^-оналы вж^гио*

Са

|р1х1]—^ |Рие]-^

|р1*7]-

Б«л<г1 васлркн и маош ие н«а<н>г <о наснг ра и ни Са2" в а <сан« мах

Дн ней нов ыс руч<и

Дине* новые руч<г1

Фа гага<сг«с. хемага <снс

Рис. 6. Вероятные пути передачи хемо- и фотосенсорных сигналов в клетках СЫатубатопаз гетЬагбШ (по: Рагоиге! а1., 1995; с добавлениями: ЕптШоуа е1 а!., 1997).

длительного периода вегетативного роста, стадия зооспор представляет собой единственную возможность целесообразной пространственной

ориентации в окружающей среде, что может иметь немаловажное значение для выживания, так как подвижные клетки репродуктивной стадии могут обеспечивать не только функцию распространения организма, по и оптимизацию условий его жизнедеятельности и перехода к вегетативному росту. Нами было высказано предположение, что зооспоры способны регулировать не только изменение направления своего движения относительно внешнего стимула, но и процесс остановки с последующим прикреплением к субстрату. В связи с этим, нами было проведено комплексное изучение поведенческих реакций зооспор, включающих их направленное движение и активное прикрепление при переходе 1С вегетативному росту.

Адгезия зооспор к субстрату

У СЫогососспт пппиШп 51агг САШ 746 зооспоры представляют собой клетки овальной формы 6-7 мкм в длину, 3-5 мкм в ширину и имеют по два жгутика равной длины. Было установлено, что свет стимулирует прикрепление зооспор С. т'тиЬит. Прикрепившиеся зооспоры не отделяются от субстрата в токе среды, что позволяет дать количественную оценку их адгезии.

Проведенные исследования позволяют сделать вывод, что адгезия к субстрату зооспор С. тишШт при их переходе к вегетативному росту происходит при определенном физиологическом состоянии клеток. Это состояние может быть достигнуто как при автотрофном, так и при гетеротрофном росте и зависит от уровня энергнзацин клеток; причем энергия может быть получена в результате окислительного фосфо-рилированпя или циклического фотофосфорплирования. На гетерогенном субстрате в темноте зооспоры прикрепляются преимущественно в участках, содержащих энергетический субстрат, при освещении эффект этих соединении незначителен. На свету клетки избирательно прикрепляются к субстрату, содержащему аттрактант, который сам по себе не обеспечивает ни адгезию, ни размножение.

Характеристика движения и тактические ответы зооспор Хемотаксис

Аттрактантами для зооспор С. тиийит являются аминокислоты: серии, треонин, глутамиповая кислота и аспарагиповая кислота (рис. 7).

10' 10« 10* 1СН 103

Концентрация аминокислот, М

Рис. 7. Аттракция зооспор серином (1), треонином (2), глаутаминовой кислотой (3), аспарагиновой кислотой (4).

Половой процесс у представителей С. minutum не известен. Из-за невозможности проведения генетического анализа, как в случае Chlamydomonas, у С. minutum нами был использован другой методический подход для выявления множественности хеморецепторов, который заключается в испытании одного аттрактанта в присутствии насыщающих концентраций других аттрактантов (Adler, 1973). Серии в присутствии насыщающей концентрации треонина (10 6 М) и треонин в присутствии насыщающей концентрации серииа (10 5 М) не являлись аттрактантами. Видимо, эти близкие по структуре аминокислоты связывались одним и тем же хеморецептором. Аналогичные результаты были получены для близких по структуре аспарагиновой и глутами-новой кислот. Однако глутаминовая кислота в присутствии насыщающих концентраций серпна и треонина и обе эти аминокислоты в присутствии насыщающей концентрации глутаминовой кислоты (Ю-5 М) обладали аттрагирующей способностью, то есть они, очевидно, воспринимаются разными хемореценторами. Таким образом, можно заключить, что зооспоры С. minutum обладают системой хеморецепции, включающей по меньшей мере два независимых хеморецептора — сериново-треоннновый и глутаминово-аспарагиновый.

Нами была изучена роль Са2+ в хемотаксисе Chlorococcum minutum. Неорганические блокаторы Са2*-капалов La3f и Cd2f полностью ингибировалп реакции хемотаксиса, не влияя при этом на подвижность зооспор. Ca2t антагонисты из трех различных групп, верапамил (фенилалкиламипы), дилтиазем (бензотпазепипы) и нимодипин (днгидрониридины) также блокировали хемотаксис зооспор. Эти результаты свидетельствуют об участии Са2,-каналов L-типа в реакциях хемотаксиса к аминокислотам у зооспор С. minutum также как в реакциях хемотаксиса С. rcinhardtii.

Кроме того, зооспоры С. minutum демонстрируют аэротаксис, который позволяет им двигаться в направлении оптимальной концентрации кислорода.

Фотоповеденческие ответы и их взаимодействие с системой хемотаксиса

Зооспоры С. minutum, по нашим данным, обладают фотоиндуци-рованными двигательными ответами. Процесс ориентации при фототаксисе у некоторых организмов представляет собой результат последовательных элементарных двигательных реакций, основанных на изменении соотношения времен движения клетки к источнику света и от пего (Diehn et al., 1977). Мы предположили, что этот механизм лежит в основе фотоориентапии зооспор. Установлено, что в присутствии аттрактаитов изменялся характер фотоповедепческих ответов зооспор.

Пептон вызывал аттракцию зооспор, что может быть обусловлено наличием аминокислот — аттрактаитов в его составе. Добавление пептона в суспензию зоспор полностью подавляло их фотоаккумуляцию, однако через время, необходимое, по-видимому, для адаптации клеток к хемоэффекторам, характер фотонидуцированного двигательного ответа зооспор полностью восстанавливался. Добавление к среде 1% глюкозы, которая не является хемоэффектором, не влияло па фотоаккумуляцию зооспор (рис. 8).

Адаптация к действию стимула является, по-видимому, общим свойством сенсорных систем (Goldber, 1987). Предположение о необходимости определенного периода времени для адаптации подвижных клеток С. minutum к хемоаттрактаптам в фотодви-гательпых реакциях подтверждают эксперименты с различными концентрациями пептона (1, 0.5 и 0.1%). Внесение указанных концентраций пептона в среду в начальный момент времени ингиби-

решало фотоответ зооспор, однако восстановление реакции для 1% пептона происходило через 40 мин, 0.5% пептона — через 30 мин, а для 0.1% — через 20 мин. Эти данные согласуются с представлением о том, что с увеличением концентрации аттрактанта время адаптации возрастает (Е15еп51ет е! а1., 1973). Вычислено также время адаптации зооспор к серипу, треонину, глутаминовой кислоте и аспарагиповой кислоте, которое находилось в пределах 10-30 мин, в зависимости от природы и концентрации аттрактанта.

Время преинкубации, мин

Рис. 8. Действие пептона и глюкозы на аккумуляцию зооспор у освещенного конца капилляра (100 мкл) через 10 мин после включения света.

Клетки преинкубированы в темноте после добавления в среду: нехемоэффектора — глюкозы в концентрации 1% (а) и хемоэф-фектора — пептона в концентрации 0.1% (б), 0.5% (в), 1% (г). А — уровень аккумуляции зооспор в контроле (среда № 1); Б — уровень аккумуляции зооспор, инкубированных в темноте.

Механизм ориентированного движения зооспор С. ттиШт

Стимулы окружающей среды регулируют ориентацию клеток, изменение направления движения которых происходит в результате изменения характера движения их органелл, жгутиков или ресничек. У некоторых

двужгутиковых зеленых водорослей переориентация их гамет и зооспор в ответ на денствие светового стимула происходит как фотоклинокинез в результате изменения характера биения жгутиков от асимметричного, цилиарного типа биения в процессе движения клетки вперед к симметричному, ундуляторному типу в момент остановки и смены направления движения. Установлено, что этот двигательный ответ обусловлен переориентацией базальных тел в жгутиковом аппарате, которая связана с регулируемым Са2+ сокращением белка-цептрина, расположенного в дистальных фибриллах, связывающих базальные тела (Salisbury et al., 1984).

Зооспоры С. minutum также имеют два жгутика, базальные тела которых соединены дпетальными фибриллами (Громов, Гаврилова, 1985). Изучение зооспор, фиксированных 4% 0s04, показало наличие в популяции клеток с асимметрично расположенными жгутиками и клеток с симметрично, параллельно друг другу расположенными жгутиками (рис. 9). В отсутствие внешних воздействий па зооспоры соотношение двух типов клеток с различной ориентацией жгутиков было постоянным; 62-64 % зооспор в популяции изменяли направление движения, что соответствует клеткам с параллельно расположенными, ундулнрующнми жгутиками.

4 мкм

Рис. 9. Зооспоры С. minutum с симметричным (а) и асимметричным (б) расположением жгутиков.

Внешние стимулы (хемоэффекторы, свет), вызывающие ориентированное движение С. minutum, временно увеличивали процент

зооспор с асимметрично расположенными жгутиками, то есть изменяли характер движения клеток за счет увеличения времени их прямолинейного движения (табл. 8, 9). Таким образом, поведенческие реакции зооспор С. ттиШт могут быть отнесены к реакциям типа клинокинеза. Возможно, что описанный ранее эффект Са2+ на направленное движение зооспор С. ттиЫт связан непосредственно с его действием на дпстальные соединительные фибриллы, как у других зеленых водорослей (Ме1кошап, 1989). Можно предположить, что этот этап является общим в передаче различных но природе сигналов к жгутиковому аппарату.

Таблица 8

Количество зооспор с параллельно расположенными жгутиками при разных иптенсивпостях света, %'

Интенсивность Время экспозиции 1, мин

света, Вт/м2 0.5 10 15 20 30

0 63+0.6 63+0.4 63+0.6 62+1.3 64+0.9

7 37+0.9 48+0.6 55+1.0 58+2.0 64+0.8

21 32+0.4 61 + 1.0 64+1.0 63+1.2 64+0.8

70 28+0.8 36+1.3 43+0.5 58+0.7 63+1.0

Таблица 9

Количество зооспор с параллельно расположенными жгутиками в зависимости от присутствия пептона и глюкозы в среде, %2 Состав среды Время инкубации зооспор в темноте, мин

0 5 10 20 30 40 50

Среда №1 63+0.7 63±0.6 65+0.9 64±1.1 65±0.9 64±0.8 63±0.6 Среда К«1 31+0.6 34±0.8 37+0.8 48+0.8 55+1.1 64+0.9 63+0.6 +0.1% пептон

Среда №1 4±1.0 9+0.7 12±1.1 15+0.8 32+0.9 48+0.1 62+1.2 +1% пептон

Среда Х«1 60+0.4 63+0.7 62+0.7 60+0.5 64+0.7 62+1.0 62+1.0 + 1% глюкоза

1 Клетки были проинкубированы в темноте в течение 20 мин. Опыты ставили в пяти повторностях. В таблице приведены средние арифметические значения величин и средние квадратичные ошибки.

2 Пептон и глюкоза были добавлены в начале эксперимента (1 = 0), до конечных концентраций указанных в таблице. Опыты ставили и шести повторностях. Б таблице приведены средние арифметические значения величин и средние квадратичные ошибки.

Таким образом, такая непродолжительная стадия размножения в жизненном цикле зеленой водоросли С. minutum, как зооспоры, позволяет ей активно искать среду, оптимальную для обитания и перехода к вегетативному росту. Этим, по-видимому, обусловлено наличие у зооспор целого комплекса поведенческих реакций: светозависимых поведенческих реакций, хемотаксиса и аэротаксиса.

Глава 7. Групповое поведение зооспор Chlorococcum minutum

Адгезия зооспор при их переходе к вегетативному росту происходит не равномерно, а с образованием групп клеток. У некоторых зеленых и бурых морских водорослей также отмечена тенденция к образованию скоплений в процессе прикрепления зооспор к плотной поверхности (Pachpande, David, 1978; Раилкпн и др., 1985). Однако в литературе отсутствуют сведения о природе стимулов и механизмах регуляции, обуславливающих подобные процессы. Проведенные нами иследования механизмов взаимодействия между зооспорами при их оседании на субстрат свидетельствуют о наличии у зооспор С. minutum элементов группового поведения, основанного на образовании сигнальных соединений.

Контагиозность адгезии зооспор при их переходе к вегетативному росту

При оседании на субстрат зооспоры С. minutim обнаруживают групповое пли контагиозное распределение (рис. 10). Контагиозность распределения организмов на поверхности была доказана статистически. При контагиозном распределении, в отличие от случайного, распределение чисел организмов, обнаруживаемых в квадратах заданной площади, не является пуассоновским, что может быть определено при помощи /2-критерия (Уиттекер, 1980).

Анализ числа клеток, осевших в квадрате нлощадыо 625 мкм2 через 2-6 ч освещения показал, что %2 > Х2001, то есть различия между теоретическим и эмпирическим распределениями значимы, и следовательно, исследуемое распределение не является пуассоновским. Это подтверждают и приведенные в табл. 10 значения коэффициентов вариации, при симметричном распределении они не превышают 50%.

Рис. 10. Зооспоры С. ттМит, прикрепившиеся к субстрату на свету через 1 ч (А) и через 6 ч (В).

Таблица 10

Число клеток, осевших па поверхности чашки площадью 625 мкм1

Время экспозиции, ч X 8 \У, % X2 Ро

2 3.77 6.86 182 48.26 <0.001

4 5.84 8.76 150 36.15 <0.001

6 10.03 13.54 135 24.32 0.01-0.001

24 42.36 20.76 49 12.40 >0.99

Причем, как установлено, контагиозность распределения зооспор не связана с неоднородными свойствами поверхности.

Гомотаксис

Объединение подвижных клеток в группы может происходить в результате гомотаксиса, их взаимного привлечения выделяемым ими

1 X — среднее арифметическое значение числа зооспор, осевших на поверхности чашки площадью 625 мкм2, условно принятого за единицу. 5 — среднее квадратич-

ное отклонение; и' = 8/Х х 100% — коэффициент вариации; Х20 = Х20С5(6) = 2.6; Ро — вероятность случайности оседания.

аттрактантом (Brock, 1966). В культуральной среде был обнаружен привлекающий зооспоры аттрактант. Аттрактант, накапливающийся в культуральной среде, реагирует с рецептором, независимым от серин-треонинового и глутаминово-аспарагинового рецепторов, поскольку присутствие насыщающих концентраций аминокислот не влияет на аттракцию.

Активное соединение, вызывающее аттракцию зооспор, было экстрагировано из среды. Экстракцию биологически активных веществ из культуральной среды осуществляли при помощи хлороформа. Хлороформ выпаривали па роторном испарителе и сухой остаток растворяли в дистиллированной воде и затем лиофилизиронали. Полученный сырец анализировали с помощью тонкослойной хроматографии. Детектирование компонентов проводили в УФ-свете и с помощью специфических реактивов на определенные классы химических соединений (Кирхнер, 1981).

Соединение, содержащееся на хроматограммах в пятне с Rf х 100, равным 21.4 обладала активностью аттрактапта и реагировало с реактивом Фолина и смесыо, состоящей из 1.5 мл 3% раствора п— нитроанилипа в 8% серной кислоте и 25 мл 5% раствора AgN02, давая характерное окрашивание серо-голубого и коричневого цветов соответственно. Это свидетельствует о феиольиой природе активного вещества. Соединение, содержащееся в пятне с Rf х 100, равным 13.7, реагировало с реактивом Брсдфорда, что предполагает его пептидную природу (Bradford, 1976).

В настоящее время на организмах различного эволюционного уровня изучается способность клеток поддерживать связь друг с другом. Групповое поведение появляется тогда, когда контакты между организмами начинают осуществляться посредством специфических сигнальных соединений (Фабри, 1976). Способность к такому типу поведения описана у некоторых прокариот, например, у миксобактерий (White, 1981) и морских скользящих бактерий p. Leucothrix (Raj, 1977), а также у миксомицета Dictyostelium diseoideum (Gerisch, 1982). У растительных клеток подобный тип поведения, при котором происходит межклеточная сигнализация в ходе жизненного цикла и который не связан с половым размножением, описан нами впервые.

Авторегуляция адгезии зооспор

В культуральной среде С. minutum происходит накопление не только аттрактапта, по также стимулятора оседания зооспор. При помещении

зооспор в кульгуральную среду, отделенную от накопившихся в ней клеток, они оседают на субстрат значительно интенсивнее, чем при помещении их в исходную минеральную среду № 1 (рис. И). Отсутствие эффекта в темноте свидетельствует против предположения о наличии в культуральной среде энергетического субстрата.

Время, ч

Рис. 11. Динамика оседания зооспор Chlorococcum minutum: 1 — в культуральной среде, полученной из 48-часовой культуры при непрерывном освещении (2 тыс. лк); 2 — в среде № 1 при непрерывном освещении (2 тыс. лк); 3 — в культуральной среде в темноте; 4 — в среде № 1 в темноте.

Стимуляции оседания зооспор элюатом из пятна с предполагаемой пептидной природой отмечено не было. Вещество фенольной природы стимулировало адгезию зооспор. Циклогексимид, в отличие от хлорамфеникола, полностью ингибировал адгезию как в присутствии стимулятора, так и без него. Таким образом, зооспоры, достигшие определенного состояния зрелости, синтезируют и выделяют в среду авторегуляторный фактор — стимулятор адгезии, который не служит энергетическим субстратом, а является сигнальным веществом. При изучении дифференцировки клеток плазмодия D. diseoideum был открыт новый класс эффекторных молекул, которые индуцируют стебельковую дифференциацию амеб (Morris et al., 1987; Loomis, 1996). Эти вещества, названные факторами, индуцирующими дифференциацию, имеют фенольную природу и синтезируются и выделяются в среду

самими амебами, регулируя затем активность некоторых генои па уровне транскрипции, что приводит к синтезу новых специфических белков (Másenlo et al., 1988). Мы предположили, что выделенный и описанный нами автостимулятор фенолыюй природы может также влиять па белковый синтез зооспор, регулируя таким образом их переход к вегетативной стадии.

Действие стимулятора адгезии на синтез белка в зооспорах

Белки зооспор были разделены с помощью электрофореза в ПААГ, и вновь синтезированные за время опыта белки были выявлены методом флюорографии. После внесения стимулятора в минеральной среде (15-20 мкг/мл) клетки метили с помощью [-^S]—метиоиина (1 мкКи в 0.1 мл).

КД

94 -

67 -

43 -

30 —

20.1 -

14.4--

Рис. 12. Флюорограмма меченых растворимых белков, синтезированных зооспорами С. т1пШит на свету.

Клетки инкубировали в течение 30 мин (1) и 2 ч (2) в минеральной среде и 30 мин в минеральной среде, содержащей стимулятор (3). Полипептиды с мол. м. 30 кД и 53 кД отмечены стрелками.

кД 12 3

Рис. 13. Флюорограмма меченых растворимых белков, синтезированных зооспорами в темноте.

Клетки инкубировали в течение 1 ч (1) и 2 ч (2) в минеральной среде, в течение 2 ч в минеральной среде содержащей стимулятор (3).

Полипептиды с молекулярной массой 30 кД и 53 кД появлялись после 2 ч инкубации зооспор в минеральной среде или после 30 мин инкубации зооспор в присутствии автостимулятора (рис. 12). Задержка синтеза белка в клетках, инкубируемых в минеральной среде, вероятно, связана с временем, необходимым для накопления стимулятора. Причем стимуляция синтеза полипептидов с молекулярной массой 30 кД и 53 кД совпадает по времени с возрастанием числа прикрепившихся клеток в присутствии стимулятора (рис. 11). Синтез указанных полипептидов не обнаружен у клеток, инкубированных в темноте (рис. 13), как в присутствии стимулятора, так и без него, что подтверждает наше утверждение о том, что стимулятор является сигнальным соединением, а не энергетическим субстратом. Не исключено, что полипептиды с молекулярной массой 30 кД и 53 кД являются элементами системы, регулирующей клеточный цикл СЫогососсит.

Заключение

Анализ поведенческих реакции подвижных клеток зеленых водорослей, проведенный на модели двух видов: Chlamydomonas rcinhardtii и Chlorococcum minidum, позволяет прийти к следующему заключению.

Подвижные клетки С. reinhardtii и С. minidum обнаруживают способность 1С восприятию не только фото-, но и хемосигналов. Определены хемоэффекторы органической природы, установлены концентрационные зависимости и закономерности процессов адаптации. Причем кинетика адаптации к хемосенсорпым сигналам сходна с закономерностями адаптационных процессов, описанными ранее для простейших (Buskcy, Stoccker, 1988).

Из полученных нами результатов следует, что механизм активного хемогактического поворота С. reinhardtii отличается от механизма хемоклинокппеза, определяющего ориентацию зооспор хлорококковой водоросли, что указывает па разнообразие типов двигательных ответов, контролирующих направленное движение в ответ на хемосепсорные сигналы даже у близкородственных организмов.

Особо следует подчеркнуть, что до сих пор хемотаксис, основанный па активном изменении направления движения под воздействием хемоэффекторов, был описан только у клеток, обладающих амебоидным типом движения. Для клеток и одноклеточных организмов, двигающихся с помощью жгутиков и ресничек, включая бактерии, простейшие и гаметы ряда водорослей, хемотаксис был охарактеризован как стратегия случайного поиска, в результате которой ориентация достигается за счет изменения частоты самопроизвольных актов смены направления движения (хемоклинокинез) или за счет изменения скорости движения в ответ на химический стимул (хемоортокинсз) (Taylor, Panaseko, 1984; Maier, 1993). Однако, согласно нашим данным, активная ориентация в отношении градиента химических веществ может определять также направленную подвижность клеток, имеющих жгутики, и, таким образом, ориентацию по тип}' хемотаксиса, очевидно, нельзя рассматривать как тип поведенческой реакции, характерной только для клеток с амебоидным движением.

В регуляцию хемосенсорпого поведения С. minutum и С. reinhardtii включены Са^-капалы L-типа. Кроме того, для каждого вида одни и те же механизмы, контролирующие движение жгутиков, определяют направленную подвижность в отношении хемо- и фотосигналов, причем клетки способны осуществлять интеграцию

сигналов разной природы. На основе полученных нами результатов при изучении поведенческих ответов у С. геигЬагсИИ и анализе литературных данных мы предполагаем, что общим звеном в преобразовании световых и хемосигналов является изменение электрического потенциала на клеточной мембране. По нашему мнению, у СЫа-туйотопаз, так же, как у подвижных клеток некоторых простейших, ключевую роль в преобразовании хемосснсорных сигналов играют биоэлектрические процессы. Интеграция различных по природе сигналов происходит, по-видимому, на уровне изменения степени поляризации плазматической мембраны, которая определяет, в конечном счете, характер движения жгутиков и двигательного ответа клетки С. гегнИагсНИ в пространстве относительно градиента действующего стимула. Предполагаемая схема взаимодействия сигналов носит пока характер рабочей гипотезы и требует дальнейшего уточнения.

На основе факта временного изменения характера двигательного ответа клеток на световые сигналы нами был разработан оригинальный метод получения и отбора поведенческих мутантов у С. геткапИи. Это позволило впервые получить хемотактические мутанты одноклеточных жгутиковых водорослей, способных к направленному движению в ответ на химические стимулы.

Результаты гибридологического анализа свидетельствуют о ядерной локализации нескольких генов, включенных в контроль хемотаксиса к сахарам; установлена иесцеиленность мутаций, нарушающих хемотаксис к различным аттрактантам. Кроме того, результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности использования ядерной трансформации для получения инсерционных мутантов С. геигкагйШ с нарушенными хемотактическими ответами. Получение инсерционных мутантов открывает перспективы для клонирования генов, продукты которых включены в регуляцию хемотаксиса.

Наличие эффективного метода отбора хемотактичсских мутантов и создание коллекции мутангных штаммов с нарушенным хемо- и фотосенсорным поведением служит необходимой основой для дальнейшего изучения функциональной п молекулярно-генетической организации системы хемотаксиса у С. геШгагсИИ, что может быть весьма перспективным с точки зрения выявления некоторых эволюционных тенденций формирования механизмов контроля направленной подвижности.

У С. minutum нами обнаружен новый тип попеденческих реакций. Полученные данные свидетельствуют о том, что адгезия зооспор С. minutum к поверхности субстрата является элементом их диф-ференцировки в вегетативные клетки. Этот процесс зависит от источников энергии (свет или глюкоза в темноте) и требует синтеза белков. Зооспоры распределяются по поверхности субстрата неравномерно образуя временные скопления неопределенной формы. Как было установлено, образование скоплений клеток С. minutum является результатом группового поведения его зооспор, поведения, при котором взаимодействие между организмами осуществляется посредством специфических сигнальных действий. В данном случае в роли сигнала выступает соединение фенольпой природы, обладающее активностью аттрактапта и стимулятора адгезии. Авторегуляторпый фактор влияет на белковый синтез зооспор, стимулируя синтез полипептидов с молекулярной массой 30 кД и 53 кД. Поведение, приводящее к объединению клеток в группы и основанное на накоплении авто-регуляторного соединения, у растительных клеток описано памп впервые. Не исключено, что подобное поведение способствует более успешной колонизации субстрата.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что в жизни низших растительных организмов, ente обладающих жгутиковыми клетками, поведенческие реакции имеют существенное значение, так же, как и для простейших. Полученные данные можно рассматривать как одно из свидетельств в подтверждении идей, высказанных родоначальниками отечественной биологии — Фампнцыным, Ценковским и другими о значительном сходстве низших растений с животными.

Выводы

1. У зооспор Chlorococcum minutum выявлено несколько типов поведенческих реакций: фотоповеденческие реакции, хемотаксис и аэротаксис.

2. Одноклеточные зеленые водоросли обладают хемотаксисом к соединениям органической природы. Аттрактантами для зооспор Chlorococcum minutum являются серии, треонин, аспарагиновая кислота и глутамииовая кислота; аттрактантами для гамет и вегетативных клеток Clúamydomonas reinhardtii, находящихся в

логарифмической фазе роста, являются сахароза, мальтоза, ксилоза и гексит-маннит.

3. Ориентацию зооспор Chlorococcum minutum в реакциях фото- и хемотаксиса определяет хемоклинокипез. Механизм ориентации подвижных клеток Chlamydomonas reinhardtii в реакциях хемотаксиса основан на функциональной неидентичности цис- и транс-жгутиков, определяемой разными частотой их биения и чувствительностью двух аксонем к субмикромоляриым концентрациям ионов кальция.

4. Ионы кальция необходимы для регуляции движения и поведенческих реакций Chlorococcum minutum и Chlamydomonas reinhardtii. По данным ингибиторного анализа, в контроль хемотаксиса к сахарам у С. reinhardtii и к аминокислотам у С. minutum включены кальциевые каналы L-типа.

5. Основной компонент передачи хемосепсорных сигналов у клеток с амебоидным типом движения, инозитол-1, 4, 5-трифосфат, не включен в регуляцию хемотаксиса Chlamydomonas reinhardtii. Выдвинута гипотеза о различной функциональной организации аппарата хемотаксиса у жгутиковых клеток и клеток с амебоидным движением.

6. Предложен метод получения и отбора поведенческих мутантов Chlamydomonas reinhardtii, который основан на временном подавлении реакции фототаксиса аттрактантами. Отобрано 12 поведенческих мутантов, которые на основе тестирования их фенотипов подразделены на 7 фснотипических классов: СРТ1 утратил хемотаксис к мальтозе и фототаксис, СРТ2 утратил хемотаксис к сахарозе и имеет сниженную фототактическую активность, Che1 и Che2 утратили хемотаксис к мальтозе, Che'j и С/ге4 — к сахарозе, Che6, Che7 и CheS — к машшту, Che9 и Che10 — к ксилозе, С/ге5 — к двум аттрактангам — мальтозе и сахарозе.

7. Показана возможность использования метода ядерной трансформации для получения хемотактических мутантов Chlamydomonas reinhardtii. Путем трансформации нлазмидой pARG7.8 получен мутант TF1, утративший хемотаксис к сахарозе.

8. Результаты гибридологического анализа свидетельствуют о ядерной локализации нескольких генов, включенных в контроль хемотаксиса к сахарам. Установлена несцеплепность мутаций mail, mal2, sud и suc2, нарушающих хемотаксис к мальтозе и сахарозе.

9. Образование групп клеток Chlorococcum mi пи turn па поверхности субстрата является результатом поведения зооспор, при котором взаимодействие между отдельными подвижными клетками осуществляется посредством автоаттрактапта фенольной природы.

10.Адгезия зооспор Chlorococcum minutum к поверхности субстрата является элементом их дифференцировки в вегетативные клетки и зависит от источников энергии (свет или экзогенный субстрат дыхания), а также находится иод контролем авторегуляторного фактора, стимулирующего синтез нолипептидов с молекулярной массой 30 кД и 53 кД.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ермилова Е.В. Фоторегуляция перехода к вегетативному росту зооспор зеленой водоросли //В кн.: Культивирование и применение микроводорослей в народном хозяйстве. Материалы Респ. Коиф. Ташкент. 1984. С. 96-97.

2. Громов Б.В., Ермилова Е.В. Условия адгезии к субстрату зооспор зеленой водоросли Chlorococcum minutum // Физиология растений. 1985. Т. 32. Вып. 4. С. 795-799.

3. Ермилова Е.В., Громов Б.В. Выбор субстрата зооспорами зеленой водоросли Chlorococcum minutum // Вестник ЛГУ. Сер. биол. 1985. № 10. С. 81-84.

4. Ермилова Е.В., Громов Б.В. Адгезия к субстрату подвижных клеток хлорококка //В кн.: Достижения микробиологии — практике. Тез. докл. 6 съезда ВМО. Алма-Ата. 1985. Т. 2. С. 49.

5. Ермилова Е.В. Поведенческие реакции подвижных клеток зеленой водоросли /,/ Вестник ЛГУ. Сер. биол. 1986. С. 7.

6. Ермилова Е.В. Влияние ингибиторов метаболизма на адгезию зооспор зеленой водоросли Chlorococcum minutum // Вестник ЛГУ. 1987. Сер. 3. Вып. 3. X» 17. С. 100-102.

7. Ермилова Е.В., Громов Б.В. Хемотаксис зеленых водорослей // В кн.: Актуальные проблемы современной альгологии. Тез. докл. 1 Всесоюзной конф. Киев. 1987. С. 28-29.

8. Ермилова Е.В., Громов Б.В. Хемотаксис зооспор зеленой водоросли Chlorococcutn minutum // Физиология растений. 1988. Т. 35. Вып. 3. С. 510-515.

9. Хемотаксис у зеленых водорослей // В кн.: Актуальные вопросы ботаники в СССР. Тез. докл. 8 съезда ВБО. Алма-Ата. 1988. С. 129.

Ю.Ермилова Е.В., Нарымбетова Р.Ж., Громов Б.В. Аттракция перекисью водорода (аэротаксис) зооспор зеленой водоросли Chlorococcutn minutum // Физиология растений. 1990. Т. 37. Вып. 1. С. 105-108.

И.Ермилова Е.В., Громов Б.В. Групповое поведение зооспор зеленой водоросли Chlorococcum minutum Starr // Журн. общ. биол. 1990. Т. 5. С. 688-692.

12.Ермилова Е.В., Громов Б.В. Адаптивное значение поведенческих реакций // Тез. докл. 2 съезда ВОФР. Москва. 1992. ч. II. С. 31.

13.Ermilova E.V, Zalutskaya Zh.M., Gromov B.V. Chemotaxis towards sugars in Chlamyclomonas reinhardtii // Curr. Microbiol. 1993. V. 27. P. 47-50.

14.Ермилова E.B., Залуцкая Ж.М., Громов Б.В. Интеграция фото- и хемосигналов в поведении хламидомонады // Тез. докл. 3 съезда ВОФР. С.-Петербург. 1993. Т. 1. С. 99.

15.Ермилова Е.В., Крупнов K.P., Громов Б.В. Авторегуляция адгезии зооспор зеленой водоросли Chlorococcum minutum при их переходе к вегетативному росту // Тез. докл. 3 съезда ВОФР. С.Петербург. 1993. Т. 8. С. 790.

16.Ермилова Е.В. Поведенческие реакции зооспор Chlorococcum minutum // Альгология. 1993. Т. 3. № 3. С. 95-100.

17.Ермилова Е.В., Крупнов K.P., Громов Б.В., Филатов A.A. Зооспоры зеленой водоросли Chlorococcum minutum Starr CALU 746

выделяют авторегулятор] 1ый фактор, влияющий на их белковый синтез // Физиология растений. 1994. Т. 42. № 2. С. 220-222.

18.Ermilova E.V., Chekunova Е.М., Krupnov K.R., Gromov B.V. Chemotactic mutants of Chlamydomonas reinhardtii defective in responses to sugars // Sixth International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas. Granlibakken, California. USA. May 17-22. 1994. P. 36.

19.Gromov B.V., Ermilova E.V., Poletaeva T.V. Swimming behavior of Chlorococcum minutum (Chlorococcaceae) zoospores // Algological studies. 1995. V. 77. P. 75-82.

20.Ермилова E.B., Залуцкая Ж.М., Крупной К.P. Роль ионов Са2^в хемотаксисе Chlamydomonas reinhardtii // Физиология растений. 1995. Т. 42. М> 2. С. 320-322.

21.Ermilova E.V., Chekunova Е.М., Zalutskaya Zh.M., Krupnov K.R., Gromov B.V. Isolation and characterization of chemotactic mutants of Chlamydomonas reinhardtii // Curr. Microbiol. 1996. V. 32. P. 357-359.

22.Ermilova E.V., Zalutskaya Zh.M., Gromov B.V. Isolation and characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants with altered chemotactic and photoshock responses // Seventh International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas. Regensburg. Germany. 1996. P. 38.

23.Ermilova E.V., Krupnov K.R., Gromov B.V. Regulatory mechanisms in the life cycle: control of Chlorococcum minutum zoosporesadhcsion // Seventh International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas. Regensburg. Germany. 1996. P. 1.

24.Ermilova E., Krupnov K., Zalutskaya Zh., Gromov B. Isolation and characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants generated by insertional mutagenesis // 1st European Phycological Congress Cologne. Koln. Germany. August 11-18. 1996. V 31.

25.Ермилова E.B., Залуцкая Ж.М., Круннов К.P., Громов Б.В. Кальциевые каналы, но не инозитол-фосфатный метаболизм, включены I! механизм хемотаксиса у хламидомонады // Авто-трофные микроорганизмы. Тезисы конференции. Москва. 1996. С. 34.

26.Ермилова Е.В., Залуцкая Ж.М., Крупнов К.Р., Громов Б.В. Направленное движение вегетативных клеток и гамет в реакциях хемотаксиса хламидомонады // Автотрофиые микроорганизмы. Тезисы конференции. Москва. 1996. С. 35.

27.Ермилова Е.В., Залуцкая Ж.М., Громов Б.В. Хемотаксис и его взаимодействие с фотоответом у штамма Chlamydomonas rein-hardtii с отрицательным фототаксисом // Известия АН. 1997. № 4 С. 500-503.

28.Ермилова Е.В., Крупнов К.Р., Громов Б.В. Получение и характеристика инсерционного мутанта Chlamydomonas reinhardtii, утратившего хемотаксис к сахарозе // Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология. III Ежегодный Симпозиум. Москва. 1997. С. 4.

29.Ermilova E.V., Zalutskaya Zh.M., Golubeva A.E., Gromov B.V. Flagellar responses of green algae in chemotaxis / / Phycoligia. 1997. V. 36. № 4 P. 29.

30.Ermilova E.V., Zalutskaya Zh.M., Munnik Т., van den Ende H., Gromov B.V. Chemotactic orientation of Chlamydomonas reinhardtii / / Biology and taxonomy of green algae. III International Symposium. Smolenice. Slovakia. October 6-10. 1997. P. 26.

Информация о работе

Ермилова, Елена Викторовна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1997
ВАК 03.00.07

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Поведенческие реакции одноклеточных зеленых водорослей ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Поведенческие реакции одноклеточных зеленых водорослей"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поведенческие реакции одноклеточных зеленых водорослей
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология