Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii"

На правах рукописи

ЧЕКУНОВА ЕЛЕНА МИХАИЛОВНА

Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зеленой водоросли СМатуйотопаз геткагйШ

специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

005558350

Санкт-Петербург 2015

5 СЕЗ 2015

005558350

Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Официальные оппоненты:

Усатов Александр Вячеславович, доктор биологических наук, профессор кафедры генетики факультета биологических наук, заведующий отделом изменчивости генома НИИ биологии Южного федерального университета (Ростов на Дону);

Рукавцова Елена Борисовна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии растений Филиала государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино);

Симаров Борис Васильевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией генетики и селекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАН (Санкт-Петербург).

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (МГУ, Москва).

Защита диссертации состоится 2015 г. в часов

на заседании Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета и на сайте Санкт-Петербургского государственного университета (http://spbu.ru/ Биепсе/сШзег/).

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор [Квитко К~в]

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета Д.212.232.12

доктор биологических наук Людмила Андреевна Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Фототрофные бактерии и пластиды растений содержат бактериохлорофиллы (БХл) и хлорофиллы (Хл) -тетрапиррольные пигменты фотосинтеза, - одного из наиболее важных и сложных биологических процессов, играющих ключевую роль в существовании жизни на Земле. Молекулы БХл и Хл обладают уникальной способностью поглощать энергию света и преобразовывать её в энергию химических связей. Актуальная фундаментальная проблема современной биологической науки состоит в изучении механизмов биосинтеза, функционирования и регуляции Хл, а также закономерностей их эволюции при адаптации к различным экологическим факторам. Аноксигенные бактерии, цианобактерии, водоросли и голосеменные формируют Хл в темноте и на свету, а покрытосеменные растения - только на свету. Светозависимые реакции синтеза Хл подробно исследованы [Беляева, 2010], тогда как современные сведения о темновом биосинтезе Хл крайне малочисленны. Настоящая работа посвящена изучению молекулярно-генетических механизмов регуляции темновых процессов формирования Хл у одноклеточной зелёной водоросли Chlamydomonas (С.) reinhardtii -модельного объекта генетики фотосинтеза [Rochaix, 1995]. Её способность синтезировать Хл в гетеротрофных условиях позволяет получать мутанты по двум путям биосинтеза - темновому и зависимому от света [Ford, 1981; Choquet, 1992]. Уникальная генетическая коллекция пигментных мутантов С. reinhardtii [Столбова, 1971], созданная на кафедре генетики СПбГУ, положила начало исследованиям генетики метаболизма пигментов фотосинтеза -хлорофиллов и каротиноидов.

Список сокращений: AJIK - 5-аминолевулиновая кислота, MX - магний-хелатаза, Mg-ПП - магний-протопорфирин IX, MgIIII3 - монометиловый эфир Mg-ПП, ОРС - открытая рамка считывания, ПП - протопорфирин IX, Пд - протохлорофиллид, Хд — хлорофиллид, Хл - хлорофилл, ФТ — фактор транскрипции.

Степень разработанности темы исследования. У всех биологических объектов (от древнейших микроорганизмов до человека) биосинтез тетрапирролов (рис. 1) начинается с образования 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК). Она превращается в уропорфириноген П1 - первый циклический тетрапиррол, который дает начало двум ветвям биосинтеза, одна из которых завершается формированием корриноидов и сирогема Г".;-,о, вторая — протопорфирином IX (ПП) - общим предщественникрм Хл и гема. Встраивание железа (Ре2+) в молекулу ПП ведет к образованию гема и ряда нелинейных тетрапирролов. Специфичные реакции биосинтеза Хл, так называемая «магниевая ветвь», начинаются с формирования комплекса и ПП и

завершаются молекулами Хл (рис. 1,2). Их можно разделить на два этапа:

(I) Ранние этапы биосинтеза Хл - это реакции синтеза протохлорофиллида (Пд) из ПП, которые проходят одинаково у всех фотосинтетиков. Первый фермент этого пути -магний-хелатаза (МХ) -обеспечивает превращение ПП в и представляет собой комплекс, состоящий из трех субъединиц:

СНЫ, СН1Л) и СНЬН. Помимо выполнения ферментативных функций, а именно встраивания М§2+ в молекулу ПП, большая Н-субъединица МХ (СНЬН) участвует в передаче сигналов от хлоропласта к ядру и является компонентом путей гормонального и редокс-контроля метаболизма Хл [Юрина и др., 2012; Мависк, 2008]. Метилирование Mg-ПП и формирование циклопентанонового кольца ведут к образованию Пд и Хл (рис. 2). Гены, кодирующие субъединицы МХ, впервые были найдены в геноме бактерии КЪоёоЬаМег сарзиШт методом

Сущитл-КсА * Глщин ——•АЛК •— Путают }

МУропорфириноген IIII

+ «?♦ / Фактор Р,

Прекоррин II

Протопорфирин IX Бишны

\ / \ ФиКОбиЛИНЫ

Сиропм /+МЯ»

+ С02* Хпорофиллы '

Бактериохлорофиллы Гемш1обин

Витамин В12 Цитохром Ь

Каталазы пероксидазы

Рисунок 1. Биосинтез природных тетрапирролов

Глутамат

5-AJIK

Гсм

: 11[>СГОПОр'|прШ( IX

■•V^ ¡_ ¿м./ 1 MI

hr.-f 1 "

Гены

с: к (Д1

.u.w

m

aiili]

• In)'

- jtW

I <!ш

Mg-нрошпорфирш! монометиловый эфир

_________I_____

. pc't

»ПНР

/Ш

Хлороф1Шлтд а i

Хиорофштпд Ь

I i

Хлорофтсш л Хлорофилл Ь

Рисунок 2. Генетический контроль биосинтеза хлорофилла у С. reinhardtii.

Строчными буквами обозначены мутации, блокирующие отдельные этапы биосинтеза. Ядерные гены ферментов биосинтеза Хл: GTR - глутамил-тРНК редуктаза; GSA -глутамат-1-полуальдегидаминотрансфераза; ALAD - AJIK-дегидратаза; СРХ-копропорфириноген III оксидаза; РРХ— протопорфириноген IX оксидаза; субъединицы магний-хелатазы (MX): |CHLH, CHIP, CHLk POR - светозависимая НАДФН: Пд-оксидоредуктаза (сПОР); CAO

- Хл а/Хд а оксидоредуктаза. Хлоропластные гены: trnE кодирует глутаминовую тРНК, а субъединицы тПОР

- гены: \ohlB, chlL и chll4\. В овалах -мутации, ведущие к структурным и регуляторным нарушениям MX

инсерционного мутагенеза [Bollivar et al., 1994]. У высших растений их ортологи были обнаружены при изучении бесхлорофильных мутантов арабидопсиса Arabidopsis thaliana - Ch42 (ген СНЫ), и львиного зева Antirrhinum majus (ген olive — CHLH). Важная роль белка большой субъедшищы MX в функционировании и регуляции системы биосинтеза Хл определила актуальность задачи идентификации кодирующего его гена у водорослей. (II) Завершающие этапы биосинтеза Хл — конверсия Пд до Хл, у покрытосеменных растений светозависимы, а голосеменные, мхи, лишайники, водоросли и эубактерии могут зеленеть и в темноте. До недавнего времени полагали, что способность к зеленению зависит только от наличия двух ферментов, катализирующих превращение Пд в Хд (рис. 2). Светозависимый катализ осуществляет кодируемая ядром Пд-оксидоредуктаза (сПОР), а темновую реакцию - ферментный комплекс тПОР, субъединицы которого кодируют 3 гена хлоропласта, ведущие свое происхождение от нитрогеназ эубактерий. В процессе эволюции покрытосеменные утратили тПОР, а более

древние формы, включая С. reinhardtii, сохранили темновой биосинтез Хл. Бесхлорофильные мутанты высших растений и водорослей являются объектами генетического и биохимического анализа метаболических путей формирования Хл [Granick, 1948; Suzuki et al., 1997; Tanaka, 2007]. У зеленых водорослей Chlamydomonas, Chlorella и Scenedesmus известны десятки мутантов с нарушениями темновой конверсии Пд, которые относят к фенотипическому классу «yellow» [Александрова, 1979; Квитко, 1983; Timko, 1998]. Их клетки, подобно этиолированным проросткам покрытосеменных растений, в темноте не синтезируют Хл, а накапливают Пд, и, благодаря присутствию каротиноидов, формируют желтые колонии, зеленеющие на свету. Генетические исследования мутантов yellow зеленой водоросли С. reinhardtii позволили обнаружить 3 хлоропластных (кодирующих тПОР), и не менее восьми ядерных генов, контролирующих функционирование тПОР [Timko, 1998; Zhang,2007]. Среди неспособных синтезировать Хл в темноте мутантов С. reinhardtii, помимо yellow были описаны формы, накапливающие более ранний, чем Пд его предшественник - протопорфирин IX (ПП) [Столбова, 1971; Wang et al., 1974]. Это означает, что темновой биосинтез Хл обеспечивается также генами, контролирующими превращение 1111 в Пд. Предметом исследований генетического контроля этого раннего этапа темнового биосинтеза Хл стали мутанты С. reinhardtii, накапливающие ПП в темноте. К началу работы у С. reinhardtii были идентифицированы все гены ферментов, синтезирующих ПП из глутамата, и превращающих Пд в Хд. Генетическая детерминация этапа конверсии 1111 до Пд до последнего времени оставалась неизвестной. Целью работы стало выяснение молекулярно-генетических механизмов регуляции ранних этапов биосинтеза Хл у одноклеточной зеленой водоросли С. reinhardtii. Для её достижения требовалось осуществить поиск и идентификацию генов, контролирующих конверсию ПП до Пд, и выяснить их роль в темновом биосинтезе Хл, решив следующие задачи: (1) осуществить генетико-биохимические исследования мутантов зеленой водоросли С.

reinhardtii с нарушениями темнового биосинтеза Хл на этапах, предшествующих формированию Пд, для поиска генов, контролирующих мутантный признак; (2) исследовать обнаруженные гены С. reinhardtii, и идентифицировать кодируемые ими факторы, обеспечивающие протекание ранних этапов темнового биосинтеза Хл; (3) Изучить супрессию мутантных признаков для поиска альтернативных путей темнового синтеза Хл у С. reinhardtii; (4) Исследовать механизмы регуляции ранних этапов темнового синтеза Хл в клетках С. reinhardtii.

Научная новизна работы. В работе получены фундаментальные знания о генетических механизмах регуляции темновых процессов биосинтеза Хл у зеленой водоросли С. reinhardtii. Исследованы ядерные гены CHLH и LTS3 С. reinhardtii, мутации в которых нарушают биосинтез Хл и ведут к накоплению клетками водоросли его интермедиата — ГШ. Установлено, что продукты этих генов необходимы для функционирования фермента магний-хелатазы (MX), конвертирующего ПП в Mg-ПП. Мутации в гене CHLH останавливают синтез Хл в условиях роста в темноте и на свету. У мутантов по гену LTS3 блокирован только темновой синтез Хл, но сохраняется способность зеленеть на свету. Впервые у зеленых водорослей осуществлено клонирование гена CHLH С. reinhardtii, кодирующего Н-субъединицу MX. Исследованы его структура и функции. Обнаружен новый регуляторный ген LTS3 С. reinhardtii, кодирующий фактор активации транскрипции генов MX в темноте. Установлено, что кодируемый им белок - первый, описанный у водорослей фактор транскрипции семейства GATA, регулирующий экспрессию генов биосинтеза Хл. Идентифицировано два новых ядерных гена С. reinhardtii'. SUP-3 и SUP-I. Ген SUP-3 кодирует фактор негативной регуляции активности MX, а продукт гена SUP-I активирует транскрипцию гена LTS3 и необходим для процесса зеленения - индуцированного светом синтеза Хл. Выявлен новый хлоропластный ген хламидомонады Mod-u-25, продукт которого регулирует уровень содержания ПП в клетке.

Теоретическая и практическая значимость. В работе впервые установлено, что темновой биосинтез Хл у зеленой водоросли С. reinhardtii регулируется на уровне транскрипции - путем активации генов, кодирующих фермент MX. Найдены ядерные гены LTS3 и SUP-I, кодирующие факторы транскрипционной активации MX в темноте. Клонирован ген CHLH большой субъединицы MX С. reinhardtii. Описан хлоропластный ген Mod-u-25. Он кодирует регуляторный фактор, обеспечивающий низкий уровень содержания фотосенсибилизатора ПП в клетке путем подавления активности ферментов синтеза AJIK. Разработан экспресс-метод оценки продуктивности по ПП штаммов С. reinhardtii. На основе мутантов по гену CHLH с нарушенной регуляцией получены штаммы-продуценты ПП, два из которых защищены авторскими свидетельствами (№ 1369275, и № 1759231) и могут быть использованы для микробиологического синтеза ПП - фотосенсибилизатора, необходимого для фотодинамической терапии рака и при создании альтернативных источников энергии. Положения, выносимые на защиту:

- Помимо темновой Пд-оксидоредуктазы, у зеленой водоросли С. reinhardtii биосинтез Хл в темноте обеспечивает транскрипционная регуляция генов MX - фермента, конвертирующего ПП в Mg-ПП в цепи биосинтеза Хл.

- Ген CHLH С. reinhardtii кодирует Н-субъединицу MX, а мутации в этом гене останавливают синтез Хл в условиях роста в темноте и на свету.

- Ген LTS3 С. reinhardtii кодирует фактор активации транскрипции генов MX в темноте. Это первый, обнаруженный у водорослей фактор транскрипции семейства GATA, регулирующий экспрессию генов биосинтеза Хл.

- Ядерный ген SUP-3 С. reinhardtii кодирует фактор негативной регуляции активности MX, а продукт гена SUP-I активирует транскрипцию гена LTS3 и необходим для процесса зеленения - индуцированного светом синтеза Хл.

- Продукт обнаруженного в работе хлоропластного гена Mod-u-25

подавляет активность ферментов синтеза AJIK, препятствуя накоплению фотосенсибилизатора ПП в клетке.

Степень достоверности и апробация результатов. Данные диссертации представлены в более чем 50 публикациях, 20 из которых - в рецензируемых журналах и изданиях, рекомендованных ВАК, и двух авторских свидетельствах. Результаты работы были доложены на международных и российских конференциях: девяти конференциях по клеточной и молекулярной биологии хламидомонады {International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas) с 1994 no 2014 годы; на X и XV Конгрессах по фотосинтезу (International Congress on Photosynthesis, 1995, 2010); на III съезде EMBO (European Molecular Biology Organization, 2011); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2006); V съезде ВОГиС (Москва,2009); на Пущинских чтениях по фотосинтезу (Пущино, 2009, 2012); Международной конференции "Роль организации и экспрессии генетического материала в наследственной и ненаследственной изменчивости" (Санкт-Петербург, 2009); V международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития»(Москва, 2009).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертация изложена на 337 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (1), материалы и методы (2), экспериментальная часть (3), заключение, выводы и список цитируемой литературы (390 наименований, из которых 50 - на русском языке). Работа содержит 76 рисунков и 49 таблиц.

Введение. Сформулирована фундаментальная научная проблема -выяснение механизмов регуляции процессов биосинтеза Хл в фотосинтезирующей клетке. Определены предмет изучения, цели и задачи работы, сформулированы положения, выносимые на защиту.

Раздел 1. Обзор литературы описывает современное состояние

генетических исследований метаболизма Хл. Он включает общую характеристику природных тетрапирролов (1.1), описание различных форм Хл (1.2), современное состояние генетических исследований биосинтеза Хл (1.3). Подробно рассмотрены темновой и светозависимый пути превращения Пд в Хд в биосинтезе Хл (1.4). Представлены результаты исследований катаболизма Хл в растительной клетке (1.5), отражены эволюционные аспекты метаболизма Хл (1.6) и обсуждаются механизмы регуляции его биосинтеза (1.7).

Раздел 2. Материалы и методы содержат описание штаммов С. reinhardtii, использованных в работе (2.1), условий их культивирования (2.2) и методов тестирования мутаций (2.3-2.7). В работе применяли методы генетики, биохимии и молекулярной биологии. Наряду с классическими методиками гибридологического анализа (2.8), описаны биохимические и биофизические методы изучения пигментного состава и активности ферментов биосинтеза Хл в клетках С. reinhardtii (2.9-2.13). Классический генетический анализ (тетрадный анализ, рекомбинационный и комплементационный тесты) позволил изучить наследование изучаемых генов и аллельность мутаций бесхлорофильности. Биохимическими и биофизическими методами были определены пигментный состав и активности ферментов биосинтеза Хл в клетках С. reinhardtii (мутантов, ревертантов, трансформантов). Клонирование генов и анализ их экспрессии осуществляли методами молекулярной биологии C.reinhardtii (2.14-2.17): выделение и анализ ДНК, РНК и белков; гибридизация, ПЦР-амплификация и ОТ-ПЦР; генетическая трансформация. Описаны методы статистической обработки данных (2.18) и методы биоинформатики (2.19). В работе использовали базы данных генетической информации и компьютерные программы сравнительного анализа структуры и функций молекул ДНК, РНК и белков доступные на сайтах: NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov); ExPASy (http ://www. expasv. ch/tool s): и геномного проекта С. reinhardtii (http://www.genome.jgi-psf.org).

Раздел 3. Экспериментальные исследования состоит из 5 подразделов.

3.1. Генетико-биохимические исследования мутантов С. reinhardtii. накапливающих протопорфирин. Изучали группу фенотипически-сходных хлорофильных оранжевых мутантов С. reinhardtii (ХОМ) из Петергофской генетической коллекции штаммов зеленых водорослей [Квитко и др., 1983]. Их клетки не синтезируют Хл и в гетеротрофных условиях накапливают бурый пигмент порфириновой природы, придающий колониям желто-оранжевую окраску (рис. 3). Описаны эксперименты по первичной характеристике мутантов (3.1.1), их гибридологическому анализу (3.1.2) и изучению их методами биохимии (3.1.3). Спектральные характеристики нативных культур ХОМ свидетельствовали о наличии в их клетках пигмента с максимумом поглощения в области 540 нм, характерного для протопорфиринов -интермедиатов биосинтеза Хл. Мутанты разделились на две фенотипические группы - светочувствительные и зеленеющие на свету. ХОМ, вместе с полученными из США штаммами Brs-1 и Вгс-1сходного фенотипа [Wang et al., 1974] были вовлечены в гибридологический анализ для выяснения характера наследования и установления аллельности анализируемых мутаций. Оказалось, что все они рецессивны и принадлежат двум ядерным генам: СНЫ и LTS3, представленным рядом аллелей: chll, brs-1, огЗ, or2/5, or5, lts7 и !ts3-122, Ьгс-1, ог13, ог69, соответственно. Это означало, что два ядерных гена CHL1 и LTS3 С. reinhardtii контролируют ранние этапы биосинтеза Хл.

Для картирования CHL1 и LTS3, мутантные по этим генам штаммы скрещивали с ауксотрофными и множественно-маркированными линиями.

Темнота ^ Свет ^

Lts3 fc- Brc-1

LTS3

Рисунок 3. Фенотип ХОМ по генам CHLH (CHL1) и LTS3, штаммов yellow (Y-\) и дикого типа: СС124 и 137С(+), растущих в темноте и на свету

CHLH (СН1-1)

Тетрадный анализ их потомства (табл. 1) показал свободную рекомбинацию мутаций в этих генах с маркерами групп сцепления (ГЦ):У1, X и XI и слабое Таблица 1.Тетрадиый анализ потомства скрещиваний ХОМ

Маркеры и их локализация: LTS3 CHL1

маркер ГЦ* P:N:T** P(P=N) P:N:T** P(P=N)

msr-1 1/43/ 29:7:30 <0,01 5:11:27 >0,95

Pf-14 VI/12/ - - 3:2:9 >0,95

act-2 VI /44/ 7:8:17 >0,99 25:12:43 <0,05

nic-13 Х/3/ 3:5:12 >0,95 7:9:9 >0,95

pf-2 XI/2/ 7:7:18 >0,99 18:18:35 >0,99

mt VI/24/ 18:17:47 >0,99 ***

♦ГЦ - группа сцепления /в скобках даны расстояния (сМ) маркера от центромеры/; ** - дитипы: родительские (Р), неродительские (N) и тегратипы (Т); *** - нерегулярное расщепление.

сцепление гена LTS3 (33 сМ) с маркером ГЦ I, - соотношения P:N достоверно не отличались от 1:1 во всех вариантах, кроме пары: lts3 - msr-1 (Р<0,001). Для оценки расстояний генов от центромер в скрещивания были вовлечены штаммы-дисомики. Анеуплоидия ведет себя как центромерный маркер, что позволяет рассчитывать частоту расщепления во втором делении мейоза (fn), равную частоте тетратипов (Т) в сочетании исследуемого маркера и анеуплоидии (п+1) среди тетрад диплоида-трисомика [Горденин, 1978]. Расщепления по orl3ln+1 (6P:11N:26T) означало, что расстояние ген-центромер, определяемое как 0,5 f(T), для гена LTS3 - 30 сМ. Для гена CHL1 по данным расщепления зигот-трисомиков (++-) оно составило 5,4сМ. Таким образом, по результатам генетического анализа, ген LTS3 локализован в группе сцепления I С. reinhardtii в 30 сМ от центромеры.

Биосинтез Хл - это цепь последовательных ферментативных реакций, и для поиска звена, контролируемого генами CHL1 и LTS3 С. reinhardtii, в клетках мутантов по этим генам определяли содержание Хл и их предшественников методами хроматографии (HPLC) и спектроскопии (рис. 4).

ХОМ содержат только одну форму безметальных порфиринов -

протопорфирин IX (ПП). Светочувствительные мутанты по гену СНЫ в

темноте накапливают только ПП,

тогда как зеленеющие на свету клетки

мутантов по гену LTS3, содержат и его

магниевые производные (от Mg-ПП до

Хл). Наличие ПП - субстрата MX в

клетках мутантов по гену CHL1 (табл.

2) указывало, что у них биосинтез Хл

генетически заблокирован на этапе

превращения ПП. Слабая активность

Рисунок. 4. Спектр поглощения этого фермента позволила „орфиринов (в диэтиловом эфире) из

предположить, что продуктом гена мутанта ..о гену CHL1 (1,2). Положения

максимумов соответствуют спектру СНЫ является одна из субъединиц поглощения стандартного ПП (3)

MX. Western-blot анализ белков, экстрагированных из штаммов дикого типа С.

reinhardtii и ХОМ, с антителами к белкам MX табака и арабидопсиса, показал

отсутствие белка Н-субъединицы MX в мутантах по гену СНЫ, и наличие

субъединиц Н и I этого фермента у дикого типа и мутантов по гену LTS3.

Данные о генетике и биохимии мутантов по гену СНЫ С. reinhardtii

свидетельствовали, что он кодирует большую субъединицу Н фермента

магний-хелатазы. Этот ген был переименован в CHLH.

Таблица 2. Характеристики аппарата биосинтеза хлорофилла

Штамм Условия роста Генотип Содержаниепигментов (nMol/l О9клеток) © *Относительная(%) активностьферментов:

ПП Гем Хл MX МТ АЛК

СС124 свет wt 0,31 23 3800 100 100 100

СС124 темнота wt 0,17 50 2400 63 77 60

Chll темнота chll 30 270 н 18 77 91

© - даны средние значения величин, полученных в 3-6 повторностях. Ошибки не превышают 5%. *МХ - магний-хелатаза; МТ - магний-ПП метилтрансфераза: АПК -АЛК-синтезирующий комплекс; н - не обнаружено.

3.2. Молекулярно-генетическая идентификация гена CHLH С. reinhardtii. Поиск гена Н-субъединицы MX (рис. 5) начинали с анализа аминокислотных последовательностей продуктов его генов-ортологов у бактерий Rodobacter capsulatus (BchH) и Synechocystis РСС6803 (chlH), ячменя (ген Xantha-f) и львиного зева (ген Olive). Было обнаружено 2 консервативных участка белка CHLH ячменя: FGYEGDPM (624-631) и LEFMPGRQ (670-677). Сконструированные на их основе дегенеративные праймеры использовали для ПЦР-амплификации на матрице ДНК из клеток дикого типа С. reinhardtii. Полученный ампликон (162 пн) по результатам секвенирования оказался идентичен (100%) гену Xantha-f ячменя. Этот фрагмент гена Н- субъединицы MX С. reinhardtii послужил зондом при скрининге библиотеки кДНК С. reinhardtii, любезно предоставленной проф. Роше (J.-D. Rochaix, University of Geneva, Switzerland). В результате были найдены 2 позитивных фаговых клона, имеющих перекрывающиеся фрагменты ДНК гена CHLH размером 1,4 тпн и 3,1 тпн. Второй фрагмент содержал сигнал полиаденилирования TGTAA и короткий поли-А хвост. Фрагмент размером 1,4 тпн не включал начала этого гена. Для поиска его 5'-конца, с помощью системы 5'RACE {rapid amplification cDNA ends) был получен фрагмент, послуживший зондом при скрининге геномной (A.EMBL3) библиотеки С. reinhardtii [Goldschmidt-Clermont, 1986]. Фаговые ДНК из 3-х позитивных клонов обрабатывали рестриктазами и искали фрагмент, который гибридизовался с RACE-фрагментом, но не с остальными

двумя кДНК-зондами.

CHLH

о—^т ■ i - i

i ПЦР-фрагмент - 162 пн

Он был найден (1,75тпн), выделен из

кДНК библиотека ,/jHt.umnu 1 I , агарОЗНОШ ГеЛЯ И

СЫзту | J

RACE.eom„ =L°m т^НК'3'1тП" секвенирован. Области

=■ Г. 75 тпн Геномная библиотека С. reinhardtii ЭКЗОНОВ И ИНТрОНОВ В

Рисунок. 5. Клонирование гена CHLH Н-субъединицы магний-хелатазы С. reinhardtii - реконструкция

его нуклеотиднои

последовательности

определяли сравнением с гомологичным ему EST-фрагментом размером 445 пн, из EST-библиотеки [Asamizu et al, 1999]. Сопоставляя все полученные фрагменты гена CHLH С. reinhardtii, определили начало кодирующего сиквенса, установили кодон инициации трансляции, и получили полную последовательность его кДНК (5054 нп). Последовательность ДНК гена CHLH амплифицировали на матрице ДНК штамма дикого типа с использованием 6-ти пар праймеров, синтезированных по его кДНК, и ДНК-полимеразы Pfu-Turbo (Stratagene). Сравнение геномной и кДНК последовательностей гена CHLH позволило реконструировать его интрон-экзонную структуру (рис. 6). Он содержит короткий (25 пн) 5'UTR, ОРС длиной 4186 пн, кодирующую 1399 аминокислотных остатков, первые 36 из которых принадлежат хлоропластному транзитному пептиду, и длинный (827 пн) З'-нетранслируемый конец. Нуклеотидные последовательности кДНК и геномной ДНК гена CHLH большой субъединицы магний-хелатазы С. reinhardtii, депонированы в базе данных EMBL: AJ307054 (CHLH сША) и AJ307055 (CHLH gene). Копийность гена CHLH проверяли методом блот-гибридизации по Саузерну (рис. 7).

Рисунок 6. Структура гена СНЪН хламидомонады (7035 пн). Темные области экзоны, белые - интроны. 5'1ГП1 и З'иТЯ - в виде узких прямоугольников. Стрелки указывают положения инициирующего кодона (АТС), стоп-кодона (ТАА), сигнала полиаденилирования (ТвТАА) и мутаций (+1 А-атевЫй) сМ1 и Ьк-1

Рисунок 7. Анализ ДНК С. reinhardtii но Саузерну. 800 нг

_ 1 2 3 4 геномной ДНК штамма СС124, порезанной рестриктазами, ip. Цр не имеющими сайтов узнавания в гене CHLH, или этот сайт 9 42 ш- расположен на его концевом участке: Sail - дорожка 1;

6.56- Hindlll - 2: BamH 1 - 3; Sinai - 4, были фракционированы в

-агарозном геле и перенесены на мембрану. Для гибридизации

использовали фрагменты кДНК гена CHLH С. reinhardtii

Единичные сигналы гибридизации говорят о наличии только одной копии этого гена в геноме С. гетИагЛИ. Мутантные аллели гена СНЬН были амплифицированы на матрицах ДНК мутантных штаммов, с использованием 6-ти пар ранее созданных праймеров, и Р/м-7мг6о-ДНК-полимеразы {Stratagenë). Мутации сМ1 и ¿га-Угена СНЬН оказались однонуклеотидными вставками (рис. 6), ведущими к сдвигу рамки считывания и появлению стоп-кодонов через 22 и 164 триплетов нуклеотидов, соответственно. Генетическую природу мутаций сМ1 и Ьг.ч- 1, как дефектов в гене СНЬН, подтвердили эксперименты по геномной комплементации. Трансформация мутантов по этому гену фрагментами ДНК, содержащими аллель дикого типа гена СНЬН, вела к появлению зеленых трансформантов. После клонирования гена СНЬН были получены антитела к белку СНЬН С. геткагЛи. Иммуноблотинг (рис. 8) подтвердил отсутствие белка СНЬН в клетках мутантов генотипа: сМ1 и Ьгв~ /.

Рисунок 8. Вестерн-блот анализ белков из штамма дикого типа (\\'Т) и мутантов сЫ1 и Ьгв-1 С. гетИаЫШ.

А. Иммунодетекция белков (10 с поликлональными антителами (ПКА) к малой СНЫ субъединице МХ табака, узнающих, также, белок СНЫ). Б. Темновые культуры клеток \УТ и мутантов освещали 2 часа и экстрагировали из них белки. Иммуноблоттинг проводили с ПКА для белка СНЬН С. гетЪагЛИ, полученные в ходе работы

Транскрипция гена СНЬН С. геткагЛИ светозависима (рис. 9). Его мРНК детектируется в обоих мутантных штаммах, и свет, также как и в случае клеток дикого типа, стимулирует ее накопление, свидетельствуя, что, мутации сЫ1 и Ьг.ч-1 не оказывают заметного влияния ни на транскрипцию гена СНЬН, ни на её регуляцию светом. Свет активирует экспрессию этого гена на уровне транскрипции, - накопление белков СНЬН в клетках С. гетИагЛп отражает динамику накопления транскриптов гена СНЬН {рис. 10). Белки, ортологичные белку СНЬН С. геткагйШ, были обнаружены у представителей как про-, так и эукариот. Филогенетический анализ показал, что их общий предшественник —

%\пг еМ1 ЦИ-СНЫ

в дат сЫ1 1кз-!

i тШ тШ

ттттф

А # «*

Рисунок 9. Транскрипция гена СШ.Я С. геткагйШ

10 суммарной РНК из штамма \¥Т дикого типа и мутантов сЫ1 и Ьге-1 ибридизованы по Нозерну с фрагментами кДНК гена СНЬН С. гетИагс/Ш. Уровень мРНК определяли в клетках, выращенных в темноте (Т), при перенесении их на свет или на постоянном свету (С). Контроль - пробы ядерного гена ЛВС52 малой субъединицы рибулозобифосфат-карбоксилазы

Длительность освещения

i..............v...........i.....-......i

Т 2 4 6 7(час.)

Рисунок 10. Вестерн-блот анализ с антителами

(ПКА) к белку СНЬН С гетИагШи. На каждой СНI н

(154 КО) Д°Рожке _ п0 20 белков из темновых культур (Т)

дикого типа (WT), и после их переноса на свет.

кобальт-хелатаза (CobN) прокариот. В последовательности белка CHLH С. reinhardtii найдено три консервативных остатка гистидина: Н664, H66s и Н8Ь -потенциальных сайтов связывания Mg2+ с CHLH при формировании гистидин-Mg-ПП комплексов.

3.3. Идентификация гена LTS3 зеленой водоросли С.reinhardtii. Генетический контроль темновых процессов формирования Хл изучали на модели мутантов С. reinhardtii по гену LTS3 - оранжевых в темноте, зеленеющих на свету (рис. 1). У фенотипически сходного с ними мутанта yellow Y-7 блокирована реакция превращения Пд в Хд, - в темноте их клетки накапливают только Пд (табл. 3). Мутации lts3 и brc-1 в гене LTS3 ведут к накоплению ПП - более раннего, чем Пд, интермедиата Хл и небольших количеств его магниевых производных: Mg-ПП, Mgnn3 и Пд. На свету мутанты по гену LTS3 синтезируют Хл до уровня темновых культур дикого типа. В отличие от содержащих Пд форм yellow (штамм Y-7, рис. 11), у накапливающих ПП мутантов процесс зеленения -индуцированного светом синтеза Хл, происходит с временной задержкой. Учитывая, что время одной генерации штаммов: Y-7, Lts3, и Вгс-1 составляет 20, 23 и 27 часов, соответственно, видно, что синтез Хл запускается у мутантов

Таблица 3. Содержание Хл и его предшественников в клетках С. гетИагйШ

Штамм Условия роста культур Генотип Содержание пигментов (пМо!/109клеток)©

ПП Мц-ГШ МцППЭ Пд Хд Хл

СС124 свет 0,19 0,20 0,18 н н 3680

ЦзЗ свет //53 0,41 0,54 0,56 н 89-529* 2450

Вгс-1 свет Ьгс-1 0,37 0,67 0,39 н 54-385* 2100

У-7 свет у-7 0,2 н н н н 3280

СС124 темнота 0,3 0,20 0,08 0,8 н 2350

иэЗ темнота Д&.3 12,0 0,77 0,62 н 187

Вгс-1 темнота Вгс-1 14,0 0,54 0,82 17,0 н 85

У-7 темнота уеПо-л>-7 0,43 н н 42,0 н н

превышают 5%. Обозначения: ПП - протопорфирин IX, ГУ^ППЭ - монометиловый эфир магний-ПП, Пд - протохлорофиллид, Хд - хлорофиллид, Хл - хлорофиллы (а+Ь); н - не регистрируется; * - измерения в условиях переноса культур из темноты на свет, так как при постоянном освещении Пд не накапливается.

ц-М наЮ'

16 24 32 -18 72 96 120

Рисунок 11. Накопление Хл в клетках мутантов и дикого типа (СС124) при переносе темновых культур на свет

по гену ЬТБЗ только после деления на свету. По-видимому, свет снимает эффект мутаций, - при освещении мутантные клетки перестают накапливать ПП и начинают синтезировать Хл. Активность МХ у мутанта ЫвЗ (табл. 4) подавлена в темноте и восстанавливается на свету до уровня темновых культур дикого типа. Это означало, что продукт гена I ТБЗ регулирует работу МХ в темноте.

Таблица 4. Активность ферментов биосинтеза хлорофилла

Штамм, условия роста Генотип Активность ферментов:

Mg-xeлamaзa Mg-ПП-мemuлmpaнcфepaзa АЛ К

(пМоль/10 кл/час) (%) (цка1/ё) (%) (%)

СС124 (свет) ш 3,23 ± 0,34 100 3,5 ±0,11 100 100

СС124 (теми.) IV/ 2,57 ±0,18 79 2,7 ±0,08 77 60

ЫвЗ (свет) ШЗ 2,46 ± 0,72 76 3,2 ±0,06 91 91

1ЛвЗ (темн.) кчЗ 0,72 ±0,1 22 3,3 ±0,07 94 7

Для выяснения влияния мутаций в гене LTS3 на экспрессию генов, кодирующих ферменты биосинтеза Хл, изучали их транскрипцию (рис. 12). В отличие от дикого типа, в темновых культурах мутанта Lts3 не детектируются транскрипты генов MX и GSA, а у му танта yellow их уровень снижен. Перенос на свет клеток дикого типа ведет к активации этих генов через 1,5-2 ч, достигая за четыре часа максимума. Для мутантов по гену LTS3 характерна задержка

СС124

Lls3

Y-7

12 4 6 [К

12 4 6 ni'

Oír GSA AI-ДО 1

[

immmmmmi

2 4 6 IK-

Cl 11.11 C1I1.I С] U.D

•Ж

•••

Kbcs2

Рис. 12. Транскрипция генов С. reinhardtii, кодирующих ферменты синтеза AJ1K (677?, GSA, ALAD) и субъединицы магний-хелатазы (CHLH, CHLD и CHLI) у мутантов но темновому синтезу Хл.

Аликвоты (10 ng) тотальных РНК из штамма дикого типа СС124 и мутантов: Lts3 и Y-7 использованы для Нозерн-блот гибридизации с фрагментами кДНК генов интереса. Культуры выращивали в темноте (ПТ), на свету (ПС) и в условиях темнота - свет. Контроль -пробы к гену Rbcs2 рибулозобифосфаткарбоксилазы

активации транскрипции светом. В световых культурах уровень

экспрессии изучаемых генов у мутанта сходен с таковым у дикого типа, и превышает его у генов: СТК, СЖН и СЯШ Синтез субъединиц МХ: СНЬН и СНЫ у дикого типа и мутанта 1^3 отражает характер

накопления мРНК генов, их кодирующих (рис. 13), свидетельствуя, что

их экспрессия регулируется на транскрипционном уровне, и продукт гена LTSЗ необходим для транскрипции генов, кодирующих белки МХ, в темноте. Таким образом, мутации в гене LTSЗ подавляют темновую транскрипцию генов, кодирующих МХ и фермента ОБА из АЛК-синтезирующего комплекса.

СС124

Lts3

Рисунок 13. Иммуноблотинг белков CHLH и CHLI магний-хелатазы С. reinhardtii. Клетки штамма СС124 дикого типа и мутанта Lts3 выращены в темноте (ПТ), при освещении темновых культур и на свету (ПС). Контроль - CRP - пробы к белку plRpLl рибосом хлоропластов

Поиск гена LTS3 в геноме С. reinhardtii вели методами позиционного клонирования и геномной комплементации, оптимальными для идентификации картированных генов (рис. 14) с неизвестными функциями. Метод состоит в трансформации мутантных культур фрагментами геномной ДНК дикого типа в составе библиотеки ВАС-клонов [Rymarquis, 2005]. Результаты локализации гена LTS3 позволили из ВАС-библиотеки С. reinhardtii выбрать 25 клонов, перекрывающих суммарно по геномной ДНК область его вероятной локализации (~15сМ). Зеленые в темноте устойчивые к хлорамфениколу трансформанты появлялись только в случаях использования двух ВАС-клонов: PTQ9626 и PTQ4402. Их ДНК компенсировали эффект мутантных аллелей гена LTS3 и содержали перекрывающиеся последовательности, свидетельствуя, что общий для них обоих участок размером 11,9 тпн, несет аллель дикого типа гена LTS3. При сопоставлении последовательностей геномной ДНК, мРНК и EST-клонов в составе этого фрагмента обнаружили три ОРС. Повторная трансформация ДНК этих клонов, обработанных специфичными для каждой ОРС рестриктазами, позволила найти искомый ген (рис. 15). Ген LTS3 (971 пн) содержит два экзона (58 пн и 257 пн) и интрон (156 пн). Его транскрипт (815 пн) включает короткий (33 пн) 5'UTR, длинный (467 пн) 3'UTR, и ОРС (315 пн), кодирующую белок из 104 аминокислотных остатков. В составе белка

Группа сцепления I

" т. у-6 ^

V

Хромосома I

у-10 ас 14

у-5 рс"1 ARG7 LTS3 ас!15 риЬ2 егуЗ

3,2

9,3

19Î7

0,3

2,3

2454тпн

1415 тпн 1853 тпн

ВАС-клоны 3704 тпн

Рисунок 14. Генетическое и молекулярное картирование гена ЬТЗЗ в группе сцепления I и в геноме С. гетНаЫШ. Расстояния на генетической карте указаны в сантиморганах, положение маркеров на хромосоме I - порядковым номером нуклеотидов. Область перекрывания ДНК использованных ВАС-клонов: 1853 -3704 тпн. Положение аллелей дикого типа генов ЬТЗЗ и ас115 дано курсивом

GATA-motif 5'ffIR ,_, J TJTR

-t-

668 -474 +1 l7~—J 1-

ЬТ53обнаружсн ДНК-связывающий цинк-пальцевый домен, типичный для факторов транскрипции (ФТ) семейства GATA (ZnFGATA) растительного типа. Секвенирование

Рисунок 15. Структура гена LTS3

показало, что результатом мутации

brc-1 и lts3 в гене LTS3 стало отсутствие ZnF_GATA-CTpyKTyp у виртуальных

мутантных белков, что, по-видимому, привело к их дисфункции. Экспрессию

гена LTS3 изучали методом ОТ-ПЦР (рис. 16) и показали, что в норме (у дикого

типа - wt), она негативно регулируется светом, и позитивно - ацетатом. В

промоторных областях генов, кодирующих MX и AJIK-комплекс, были

обнаружены цис-элементы GATA, узнаваемые ДНК-связывающими доменами

ZnFGATA (от одного - у ALAD и CHL1, до пяти - у G S А) и G-боксы

(CACGTG), существенные для световой регуляции транскрипции (у генов GSA,

CHLH и CHLD). По-видимому, фактор LTS3 активирует транскрипцию генов

MX: CHLH, CHLD, CHLI и гена GSA, кодирующего фермент AJIK-

синтезирующего комплекса в темноте, и необходим для их световой индукции.

Поиск белков, гомологичных LTS3 (программа BLAST), в базах данных nr (АН

non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF) показал,

что его ортологи встречаются только у эукариот. Их гомология основана на

сходстве ДНК-связывающих GATA-доменов и позволяет отнести белок LTS3

wt Ьгс-1 wt Brc_s T8-3

не- ai'-t-

LTS3

ТиЬ2

Рисунок 16. Транскрипция гена LTS3. Уровень транскриптов гена LTS3 определяли в клетках штамма дикого типа (wt), и мутантов, выращенных в темноте (Т), на свету (С) и после двух часов освещения (2ч) темновых культур. Контроль -экспрессия гена TUB2. Тотальную РНК обрабатывали ДНК-зой и проводили обратную транскрипцию РНК-зависимой ДНК полимеразой M-MLV с праймерами oligo-dT. Полученные кДНК (500 нг) служили матрицами для ПЦР-амплификации транскриптов гена LTS3 с ген-специфичными праймерами. Ампликоны (10 мкл) визуализировали гель-электрофорезом в 1,2% агарозном геле в буфере TBE. Штаммы Вгс-8 и Т8-3 описаны ниже (в разделе 3.4)

к семейству 2пР_ОАТА ФТ. Продукт гена ЬТБЗ хламидомонады - первый, обнаруженный у водорослей ФТ, активирующий экспрессию генов магний-хелатазы в темноте. Сам факт его существования свидетельствует, что темновой биосинтез Хл может обеспечиваться регуляторными элементами, действующими на уровне транскрипции. Таким образом, регуляторный ген ЬТБЗ у С. геткагсЬИ кодирует ФТ семейства гпР вАТА, который активирует транскрипцию генов ферментов ранних этапов биосинтеза Хл - магний-хелатазы и АЛК-синтезирующего комплекса в гетеротрофных условиях. 3.4. Супрессия мутаций в гене ЬТ53 С. гетИагЖИ. Анализ супрессии мутантных признаков - продуктивный подход к поиску альтернативных путей биосинтеза пигментов. Предметом исследований механизмов регуляции синтеза Хл у С. гетИагЖИ стали ревертанты, полученные от пигментных мутантов по гену ЬТБЗ, кодирующему фактор транскрипционной регуляции генов ферментов синтеза Хл: МХ и АЛК-комплекса. Значительный интерес представлял поиск других компонентов регуляторной машины клетки С. гетИагсШ, обеспечивающих темновой биосинтез Хл в условиях отсутствия функционального белка ЬТБЗ. Для их обнаружения, из клеточной культуры мутанта Вгс-1 по гену ЬТБЗ, был отобран зеленый в темноте спонтанный ревертант Вгс-8. Сходный уровень содержания Хл в его темновых и световых культурах (табл. 6), свидетельствовал о восстановлении темнового синтеза Хл. Гибридологический анализ позволил ответить на вопрос, наследуется ли способность штамма Вгс-8 зеленеть в темноте. Тетрадный анализ показал, что признак наследуется, и реверсия произошла в результате единичной ядерной мутации ¡ир-З в гене 8ЫР-3, который сцеплен с геном ЬТБЗ С. гетИаЫШ. Эффект мутации не аллелоспецифичен, - она супрессирует обе мутантные аллели гена ЬТЗЗ. Мутация .и/р-З рецессивна - диплоиды, гетерозиготные по 5мр-3 на фоне гомозиготы: Ьгс-1/Ьгс-1, формировали оранжевые в темноте колонии. Наличие межгенной супрессии и отсутствие её аллельной специфичности свидетельствовало о включении альтернативного механизма

Таблица 6. Содержание пигментов в клетках мутантов по гену ЬТБЗ

Штамм Условия Генотип Пигменты (пМо!/1(?клеток)©

ПП МкПП 116 Хл

СС124 темнота уЛ 0,3 0,20 0,8 2480

СС124 свет и»? 0,19 0,20 н 3280

Вгс-1 темнота Ьгс-1 12,30 0,54 3,4 12,9

Вгс-1 свет Ьгс-1 0,37 0,67 н 2420

Вгс-8 свет Ьгс-1 ,аг^7\sup-3 0,2 - н 2510

Вгс-8 темнота Ьгс-1, аг% 7,$ир-3 н н 14.5 2320

*Т-8-3 темнота Ьг-1 ,arg7,sup-3,sup-l 7,5 0,35 3,5 9,3

© - Метод спектрофлуориметрии; даны средние значения величин, полученных в 3-6 повторностях. Ошибки не превышают 5%. * - штамм будет описан ниже.

регуляции. По-видимому, фактор БГГР-З в норме репрессирует темновой биосинтеза Хл, а мутация .чир-З блокирует эту функцию. Учитывая свойства продукта гена ЬТБЗ активировать в темноте транскрипцию генов МХ, предположили, что в случае его дисфункции в клетках водоросли включается альтернативный путь темновой активации экспрессии этих генов ^2), в норме, находящийся под негативным контролем белка БиР-З. Восстановление способности синтезировать Хл у ревертанта Вгс-8 связано с усилением активности МХ в темноте (рис. 17). Она в 7 раз превышала активность этого фермента в темновых культурах исходного мутанта Вгс-1 и снижалась на свету, означая, что путь \¥2 негативно регулируется светом. БиР-З - сильный

репрессор, - мутация в гене Б11Р-3 вела к двукратному повышению активности МХ в темноте даже по сравнению с диким типом. Ген ЯИР-1. Для обнаружения дополнительных факторов активации синтеза Хл в темноте, на основе зеленого ревертанта Вгс-8 был получен

4.76

г+п

с т с т

Вгс-1 Вгс-Я

Штаммы

т

Т8-5

Рис. 17. Активность магний-хелатазы (МХ)

мутант Т8-3 (рис. 18), у которого инсерция sup-I

привела к возврату фенотипа исходного оранжевого

в темноте штамма Вгс-1. Пигментный состав

темновых культур мутантов Т8-3 и Вгс-1 одинаков —

они накапливают ПП и небольшое количество его

магниевых производных (табл. 6, см. выше), однако

Рисунок 18. Получение

трансформант утратил способность расти и зеленеть штамма Т8-3 на свету. Методами тетрадного и семейного анализов потомства скрещиваний штамма Т8-3 с мутантами по гену LTS3 и штаммами дикого типа было установлено, что инсерция наследуется по моногенной схеме, и мутации оранжевости не рекомбинируют и не комплементируют. Генетический анализ и изучение пигментного состава клеток Т8-3 позволили определить его генотип: brc-I,sup-3,sup-I, подтвердив, что оранжевая в темноте окраска клеток Т-8-3 обусловлена мутацией brc-1 в гене LTS3. Высокий уровень активность MX, выявленный у трансформанта (рис. 17), сопоставимый с таковым у ревертанта Вгс-8, указал, что эффект мутации sup-З сохранен в его клетках, но инсерция (sup-I) блокировала способность к зеленению. На фоне гомозиготы по мутациям в гене LTS3 проявление аллели sup-I, — потеря способности к зеленению, носит доминантный характер, - признак сохранялся у гетерозигот sup-I/+. При этом, дигетерозиготы lts3/+,sup-I/+ растут на свету фотоавтотрофно. Эффект инсерционной мутации (по доминантному / рецессивному типу) зависит от отсутствия / наличия в клетке продукта гена LTS3, означая, что, гены LTS3 и SUP-I взаимодействуют, и продукт делетированного гена, названного нами SUP-I, активен при наличии нормального белка LTS3. Для идентификации гена SUP-I С. reinhardtii в геноме трансформанта Т8-3, фланкирующие инсерцию нуклеотидные последовательности искали методом «Ligation-mediated suppression-PCR». Инсерция оказалась встроенной в хромосому 13 в положении 1194741 пн. В Базе данных геномного проекта была найдена мРНК (au5.g4469_tl), которая

зеленый

Its3,arg-,sup~3

Трансформация рСВ412(агд7+)

отбор (темнота, среда ТАР)

r-i- ?

I Т8-3 I lts3,arg+,sup-3,sup-I

оранжевый, ссето чувствительный

принадлежит гену SUP-I, локализованному на хромосоме 13 (в положении: 1193966-1195740). Его структура (рис. 19) была воссоздана путем сравнения нуклеотидных последовательностей геномной ДНК и транскрипта этого гена. Ген SUP-I включает 2 интрона, первый из которых расположен в 5'-некодирующей области. Транскрипт размером 933 пар оснований кодирует белок (виртуальный) из 108 аминокислотных остатков массой 11,5 kDa. Область (-800 - +1) этого гена содержит несколько элементов GATA -мишеней транскрипционной регуляции ZnFGATA ФТ. Отсутствие хлоропластных и митохондриальных транзитных последовательностей (программы: ChlorоР и mitoprot) и наличие сайта фосфорилирования протеинкиназой С (РКС) свидетельствуют, что, белок SUP-I функционирует в ядре и задействован в сигнальной трансдукции. Оценка его влияния на экспрессию гена LTS3 (рис. 16, с.22) показала, что выключение гена SUP-I у трансформанта Т8-3 резко снижает уровень 1Г55-транскриптов. По-видимому, белок SUP-I участвует в активации транскрипции гена LTS3 в темноте, и оба

Ген SLP-I с. reinhardtii бвЛКа LTS3 И SUP-I

la)

ннсерцня

175 пн 147пн_f входят в состав

5* шшшт-——\-1-1 ^щ у

237пн 605 пн

(б)

10 22 3fi Ч 5S

KSSiaOFSRe QFDgURRAL ERURUOTO. S»«VMEHLN SAIZSLIECE RL?KSÍ5®KI

10 80 90 10Q

MiVITORESO AOAAAAAAGO AGAGA0AGRP C@K0AK?KS IOPKTSA

регуляторной системы, контролирующей работу МХ. Белок 511Р-

Рисунок 19. Структура гена С. геткапНП (а) и 3 в норме подавляет

аминокислотная последовательность белка 811Р-1 (б).

Стрелка - место инсерции в геноме штамма Т8-3. иной путь (W2) Прямоугольники - экзоны, линии - интроны. Цифры ^^

указывают размеры экзонов (вверху) и интронов активации

(снизу). Рамкой обведен сайт фосфорилирования РКС хламидомонады.

3.5. Изучение генетической регуляции биосинтеза Хл на модели мутантов С. геМагЛи по гену СНЬ Н. Протопорфирин IX (ПП) - самый фототоксичный из окрашенных предшественников Хл. Будучи в свободном состоянии, на свету он генерирует активные формы кислорода, разрушающие липиды клеточных мембран [Красновский, 2001]. Механизмы, препятствующие накоплению ПП,

изучали на модели накапливающих ПП мутантов С. геМагЛи по гену СНЬН. В результате УФ-мутагенеза и последующего многоступенчатого отбора темно-окрашенных коричневых клонов, были получены штаммы (рис. 20, табл. 7.1), накапливающие более чем в 20 раз больше ПП, чем одиночный мутант генотипа сЫ1. Генетическую природу такого фенотипа у наиболее продуктивного по ПП штамма Н-19-25 (т!-) выясняли методом гибридологического анализа. В потомстве скрещивания его на штамм дикого типа (С1525) только 2 из 42 полных тетрад содержали коричневые (кор) клоны (табл. 7.2). В большинстве тетрад наблюдали нормальное расщепление по мутации с/г//: 2оранжевых (ор):2зеленым (зел). Напротив, в реципрокном скрещивании (С1712) коричневые колонии появлялись в составе 96% тетрад. Однородительская (от 11«+) передача признака означала хлоропластную природу изучаемой мутации, названной тос1-и-25. Метаболическая регуляция биосинтеза Хл у высших растений и зеленых водорослей осуществляется гемом и Пд путем обратного ингибирования синтеза АЛК [Тапака, 2007]. В клетках мутантов по гену СНЬН, не содержащих Пд, мутация тос/-и-25 не влияет на синтез гема. Её эффект

Таблица 7.1. Содержание хлорофилла и его предшественников

Генотип Фенотип окраска колоний Накопление ХЛ* и его предшественников:

АЛК' (пМ/107кл) ПП <цМ/1()'кл) Хлорофилл (цМ/иУкл)

»с/ (свет) зеленая 3,01±0,041 н.о. 4,12±0,046

зеленая. 2,14±0,041 н. о. 3,46±0,002

сЫ1 оранжевая 2,58±0,054 0,182±0,0037 0,001

1сЫ1,тос1-и-25 коричневая 5,33±0,058 4,593±0,0321 0,007

сЫ1,тос1-и-25 коричневая 5,18±0,012 4,314±0,0042 0,005

тос!-и-25 зеленая 3,10±0,035 н.о. 3,516±0,008

ШЗ оранжевая 1,70±0.014 0,049±0,002 0,015

И53,тос)-и-25 коричневая 3,36±0.027 1,337±0,016 0,017

1 - относительная АЛК-синтетазная активность определяется количеством АЛК, которое клетки накапливают при обработке сублетальными дозами (4тМ) левулиновой кислоты (ЛК);2- штамм Н-19-25. Обозначения: н.о. - не обнаружено.

Рисунок 20. Мутанты, накапливающие ПП

Таблица 7.2. Тетрадный анализ потомства зигот скрещиваний коричневых мутантов С. гетИагМИ на штаммы дикого типа

Номер Генотипы родителей Число тетрад с расщеплением: Передача

скрещи- mt(+) mt(-) 2зел 2зел:2 4зел 2зел : 1 ор I признака

вания :2ор кор * : 1кор. от mt(+)

1525 wt chll,mod-u-25 30 2 10 0 42 4,75%

1712 chll, mod-u-25 wt 1 20 4 0 25 96%

* Тетрады из 4-х зеленых колоний оказались митотическим потомством вегетативных диплоидов - средний объем их клеток (около 208 мкм) и единообразие по типу спаривания -все mt(-) соответствовали критериям диплоидности клеток С. reinhardtii [Harris, 1989]

состоит в усилении активности АЛК-синтезирующего комплекса (табл.7.1), - у коричневых штаммов с высоким содержанием ПП она увеличена вдвое по сравнению с одиночными мутантами генотипа: сЬ11, и штаммом дикого типа. Повышенная активность комплекса АЛК-ферментов у штамма Н-19-25 детектировали по устойчивости к левулиновой кислоте (ЛК) - конкурентному ингибитору синтеза АЛК, в концентрации 10 тМ, губительной для клеток дикого типа и одиночных мутантов по генам СНЬН и ЬТБЗ. Признак устойчивости к ЛК также наследуется как хлоропластный детерминант - от родителя пЦ(+). Таким образом, тос!-ы-25 - мутация хлоропластного гена, которая приводит к усилению синтеза АЛК и может быть тестирована по устойчивости клеток к 10 тМ ЛК. Причиной сверхпродукции АЛК и ПП в темновых культурах двойных мутантов генотипа сЬ11,тос/-и-25 (рис. 21), стало усиление в темноте транскрипции генов, кодирующих ферменты их синтеза: (777? (глутамил-тРНК редуктазы), СНЬН (Н-субъединицы МХ) и белка САВП светособирающего комплекса фотосистемы 2. Уровень транскриптов этих генов у

сЫ1,т^п1 и 25

свет свет

Т Мд 2 4 в (час> Т Мд 2 4 6 (час)

«.«.•» снш -- «•-» вт* ,5

»«§** СВ1.Р ЩЩЩЩЩ-

Рис. 21. Экспрессия генов СНЬН и (777? С. гетИагЛШ в клетках дикого типа (и*/) и двойного мутанта генотипа: сЫ1,той-и-25.

Нозерн-блот гибридизация с ген-специфичными пробами. СВЬР -контроль. Т - темнота

двойного мутанта (сМ1,тос1-и-25) в отличие от не репрессирован в темноте, что характерно для мутантов по ретроградному контролю - передаче сигналов из хлоропласта в ядро.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярно-генетические механизмы контроля ранних этапов цепи биосинтеза Хл - от ПП до Пд у одноклеточной зеленой водоросли С. гетИагЖИ изучали методами генетики, молекулярной биологии и биохимии на модели бесхлорофилльных мутантов с нарушенной конверсией ПП и их ревертантов. Причиной мутантного фенотипа (клетки накапливали ПП и формировали оранжевые колонии в гетеротрофных условиях) стало подавление активности фермента МХ, встраивающего магний в молекулы ПП в цепи биосинтеза Хл. В работе удалось обнаружить несколько генов, контролирующих функционирование МХ у С. геткагЛп: СНЬН, ЬТБЗ, БЦРЗ, Б11Р-1 и Мос1-и-25. Структурный ген СНЬН (первоначально - СНЫ), оказался геном большой Н-субъединицы МХ. Продукты остальных генов регулируют активность этого фермента. Ген ЬТБЗ кодирует фактор транскрипционной регуляции - активатор генов МХ в темноте. Продукт гена Б11Р-1, по-видимому, вместе с фактором ЬТБЗ входит в состав регуляторной системы, координирующей работу МХ. Белок, кодируемый геном Б1/Р-3, в норме подавляет иной путь активации МХ у хламидомонады. Таким образом, помимо ПОР, у С. ге'тИагЖи первый спщифический фермент биосинтеза Хл — МХ оказался важнейшим компонентом системы регуляции темновых процессов хлорофиллобразования. Нам удалось обнаружить два пути активации МХ в темноте. В первом пути задействованы факторы транскрипционной регуляции ЬТБЗ и БиР-Г В случае его блокирования, возможно переключение на альтернативный путь, в норме репрессированный продуктом гена Б1/РЗ. Получение мутантов-продуцентов ПП привело к обнаружению нового механизма ретроградной (из хлоропласта в ядро) регуляции, препятствующего накоплению этого сильного фотосенсибилизатора, разрушающего клетки С. ге'тИагЖи в условиях

освещения. Его контролирует ген хлоропласта, названный Mod-u-25, — негативный регулятор синтеза AJIK. Молекулярную природу гена Mod-u-25 еще предстоит выяснить. Полученные результаты позволяют говорить о существовании в системе регуляции биосинтеза Хл у хламидомонады регуляторного контура, координирующего работу двух ферментативных комплексов - MX и синтеза AJTK (рис. 22). В отличие от известного посттрансляционного механизма обратного ингибирования {feedback) AJIK гемом и Пд, он, по-видимому, представляет собой систему «feedforward»,

Глутзмат

<W.cvHmemo3<

Литохромобилин Хлорофилл Ь

Смд-хепачшза^ ] M«

Mg-nporonop<t>MpMH IX

i

Mg-лротопорфирин IX 1 монометилозый эфир

V 1

m Протохлорофиллид

<т>ь

Хлорофиллид а -» Хлорофиллид Ь

i Хлорофилл а

Рисунок 20. Факторы регуляции синтеза Хл у С. reinhardtii. Пострансляционно синтез AJIK репрессируют (стрелки): протохлорофиллид, связываясь с белком FLU, и гем, взаимодействуя с ферментом глутамил-тРНК редуктазой (GluTR). Белок Gun4 связывает магний-хелатазу (MX) с мембранами хлоропласта, активируя фермент. Новые факторы регуляции, обнаруженные в работе: темновой биосинтез Хл обеспечивается путем транскрипционной регуляции генов, кодирующих MX и AJIK-комплекс. Фактор LTS3 активирует их транскрипцию; фактор SUP-3 репрессирует MX; фактор SUP-I - активатор транскрипции гена LTS3; Mod-u-25 - репрессор синтеза AJIK и MX. Гены, обнаруженные в работе, - в прямоугольниках. Контур -область /еей{Г0пш«/-транскригпдионной регуляции

которая обеспечивает одновременную «настройку» работы этих двух ферментных комплексов. На посттрансляционном уровне модулятором этого контура может служить белок Gun4, а транскрипционная активация генов обоих ферментных комплексов осуществляется продуктами генов LTS3 и SUP-I, описанных в работе. Фундаментальные исследования, представленные в работе, имеют практическую значимость. Мутанты С. reinhardtii, дефектные по гену CHLH с нарушенной регуляцией биосинтеза Хл, послужили основой создания штаммов-продуцентов ПП [Авторские свидетельства: № 1369275 (1988); № 1759230 (1989)]. Его уникальные фотохимические свойства состоят в способности поглощать световую энергию. 1111 - сильный фотосенсибилизатор, - на свету он генерирует активные формы кислорода, которые запускают процессы разрушения липидов клеточных мембран. Пигмент флуоресцирует в красной области спектра (Х=606 нм и 604 нм при возбуждении светом с длиной волны 405 нм) и способен накапливаться в пролиферирующих тканях. Это позволяет использовать его в целях флуоресцентной диагностики канцерогенеза и при фотодинамической терапии, - накопленный в тканях ПП при освещении вызывает быструю деструкцию окружающих тканей. Еще одна, новая область применения ПП связана с нанотехнологиями - созданием порфирин-содержащих полимеров - основных компонентов сенсоров, способных выявлять широкий спектр токсичных элементов в окружающей среде [Asano Т. et al., 2010]. Перспективными являются работы по созданию энергопреобразующих структур на основе ПП. В этих трехкомпонентных системах (безметалльный порфирин - Zn порфирин - хинон) может быть осуществлена последовательность событий, реализуемых в фотосинтезирующих организмах: поглощение света —> миграция энергии —» разделение зарядов. Такие синтетические структуры могут стать прообразом искусственных энергопреобразующих устройств будущего. Таким образом, перспективы применения ПП (как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте) связаны с возможностью создания гибридных наноразмерных

биоэнергетических и биосенсорных устройств. Результаты работы могут быть использованы при подготовке материалов по новым курсам лекций «Генетика фотосинтеза» и «Генетика микроводорослей», на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ, и аналогичных курсов в других университетах России. Основные научные результаты работы

1. Идентифицировано два ядерных гена Chlamydomonas (С.) reinhardtii: CHLHvi LTS3, рецессивные мутации в которых блокируют биосинтез Хл, приводя к накоплению его интермедиата протопорфирина IX в темноте. Мутанты по гену CHLH светочувствительны, а ¿Г^З-мутанты способны зеленеть на свету.

2. Впервые у водорослей клонирован и секвенирован ядерный ген CHLH С. reinhardtii, кодирующий Н-субъединицу MX. Охарактеризованы его структура и функции, идентифицированы мутантные аллели.

3. Осуществлено позиционное клонирование гена LTS3 С. reinhardtii. Он кодирует фактор транскрипции семейства GATA, который активирует экспрессию генов ферментов биосинтеза Хл - MX и AJIK-синтезирующего комплекса в гетеротрофных условиях.

4. Результатом исследования супрессии мутаций в гене LTS3 стало обнаружение двух новых ядерных генов SUP-3 и SUP-I С. reinhardtii, кодирующих факторы регуляции активности MX. Продукт SUP-I, вместе с LTS3 задействован в транскрипционной активации темнового биосинтеза Хл и необходим для зеленения. Ген SUP-3 контролирует альтернативный LTS3-nyra механизм регуляции.

5. Обнаружена новая хлоропластная мутация mod-u-25, которая приводит к сверхпродукции по ПП в клетках двойных мутантов С. reinhardtii генотипа: chll,mod-u-25 за счет усиления синтеза АЛК. Эффект мутации состоит в отсутствии темновой репрессии транскрипции генов: CHLH, GTR и CABII, кодирующих белки MX, АЛК-синтезирующего комплекса и светособирающего комплекса ФС2, соответственно. Продукт гена Mod-u-25 является новым

хлоропластным детерминантом, задействованным в передаче сигнала из хлоропласта в ядро.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Nikoulina К. Induction and analysis of reversions from various cbnl-mutants laking chlorophyll b and neoxanthin in Chlamydomonas reinhardtii / K. Nikoulina, E. Chekunova // Photosynthesis research. - 1992 - V.34 - № 1 - P. 186. ISBN: 0-7923-2090-5.

2. Чекунова E.M. Регуляция биосинтеза предшественников хлорофилла в мутантах зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii t E.M. Чекунова, H.B. Шалыго, Е.Б. Яронская, Аверина Н.Г., Чунаев А.С. // Биохимия. - 1993. - Т. 58. - № 9. - С. 14301436.

3. Чунаев А.С. Генетический контроль биосинтеза хлоропластных пигментов у зеленых водорослей / А.С. Чунаев, А.В. Столбова, К.В. Квитко, Н.Н. Александрова, Е.М. Чекунова и др //Генетика- 1994-Т. 30-№ 8. -С.1075-1084.

4. Chekunova E.M. Regulatory mutation affecting chlorophyll biosynthesis in Chlamydomonas reinhardtii E.M. Chekunova, E.B. Yaronskaya, N.V. Shalygo, N. G. Averina., A.S. Chunaev / Photosynthesis: from light to Biospere; ed.: P. Mathis / Dordrecht: Klawer AP, 1995.-V. 3.-P. 921-924. ISBN: 0-7923-3859-6.

5. Ermilova E.V. Isolation and characterization of chemotaxis mutants of Chlamydomonas reinhardtii / E.V. Ermilova, E.M. Chekunova, Zh. M. Zalutskaya, K.R Krupnov, B.V. Gromov // Current Microbiology. - 1996. - V. 32. - P. 357- 359.

6. Никулина К.В. Генетический анализ ревертантов от мутантов, лишенных хлорофилла b у Chlamydomonas reinhardtii / К.В. Никулина, Е.М. Чекунова, В. Рюдигер, А.С. Чунаев // Генетика. - 1997. - Т. 33. - № 5. - С. 577-582.

7. Chekunova Е.М. Molecular characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants defective in H subunit of Magnesium chelatase / E.M. Chekunova, Y. Papenbrock, V. Voronetskaya, B. Grimm, C.F. Beck // Mol.Gen.Genet. - 2001. - V. 266. - P. 363-373.

8. Савельева H.B. Супрессия мутаций в гене LTS3, контролирующем светонезависимый синтез хлорофилла у Chlamydomonas reinhardtii I H.B. Савельева, E.M. Чекунова // Вестник С.-Петербургского университета — 2005. - Сер. 3. — Вып. 2. -№ 11.-С. 24-32.

9. Чекунова Е.М. Ген LTS3 контролирует светонезависимый биосинтез хлорофилла у

зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii / Е.М. Чекунова, H.B. Савельева // Экологическая генетика. - 2010. - № 2. - С. 35-44.

10. Чекунова Е.М. Генетика биосинтеза хлорофилла: Темновой и светонезависимый пути/Е.М. Чекунова // Экологическая генетика. - 2010. -№ 3. - С. 38-51.

11. Сердюк О.П. Прямой перенос плазмиды pga482:ipt с геном биосинтеза цитокининов в клетки фототрофных пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides и Rhodopseudomonas palustris методом элекгропорации / О.П. Сердюк, Л.Д. Смолыгина, Е.М. Чекунова, Е.П. Санникова, Г.Н Ширшикова, А.Н. Хуснутдинова, Н.В. Ярцева // ДАН. Биохимия, биофизика, молекулярная биология. — 2013. - Т. 451. - № 2. — С. 232235.

12. Чекунова Е.М. Генетический контроль метаболизма хлорофиллов /Е.М. Чекунова // Экологическая генетика. - 2013. - Т. XI. - № 3. - С. 14-36.

13. Чекунова Е.М. Исследование генетического контроля биосинтеза и метаболизма хлорофилла с использованием мутагенеза и генной инженерии Е.М. Чекунова, В.Г. Ладыгин / коллективная монография в двух томах «Фотосинтез: открытые вопросы и что мы знаем о нем» / под ред. Алахвердиева С.И., Рубина А.Б. Шувалова A.B. — Ижевск: Издательство AHO «ИИКИ», 2014. - Том 2. - С. 169-268.

14. Chekunova Е.М. Genetic Control of the Chlorophyll Metabolism / E.M. Chekunova // Russian Journal of Genetics: Applied Research. - 2014. - V. 4. - № 5. - P. 351-367.

15. Чекунова Е.М. Новые факторы регуляции магний-хелатазы у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii / Е.М. Чекунова, Е.Б. Яронская, Н.В. Ярцева, Н.Г. Аверина //Физиология растений. - 2014.-Т. 61. -№2.-С. 1-9.

16. Ладыгин В.Г. Структурно-функциональная организация клеток мутанта Вгс-1 Chlamydomonas reinhardtii, накапливающего протопорфирин IX в темноте / В.Г. Ладыгин, Е.М Чекунова, Г.А. Семенова, A.A. Кособрюхов // Биофизика. - 2014. - Т. 59.-Вып. 4.-С. 692-703.

Благодарности. Данные, представленные в диссертации, получены на кафедре генетики и селекции биологического факультета СПбГУ, и явились результатом плодотворного сотрудничества с лабораторией Биофизики и биохимии фотосинтетического аппарата института Фотобиологии АН Республики Беларусь (д.б.н.: Н.В. Шалыго, Н.Г. Аверина и Е.Б. Яронская). Часть экспериментов была осуществлена в лабораториях Германии: у проф. Бека (Ch.Beck, Fraiburg University) и проф. Гримма (B.Grimm, IPK, Gatersleben). Автор признателен европейским фондам: DFG, DAAD и ЕМВО, поддерживавшим ее исследования в период с 1997 по 2002 годы. Автор также благодарит РФФИ за поддержку исследований генетики темновых процессов биосинтеза хлорофилла у хламидомонады (грант: 09-04-01646-а). Автор благодарит своего учителя — К.В. Квитко, кафедру, своих коллег и студентов за понимание, помощь и поддержку.

Подписано в печать 23.12.2014 Формат 60x84Цифровая Печ. л. 1.5 Тираж 100 Заказ № 17/12 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)