Белки теплового шока HSP70B хлоропластов Chlamydomonas reinhardtii: связь с устойчивостью клеток к окислительному стрессу и репарацией ДНК

Ермохина, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белки теплового шока HSP70B хлоропластов Chlamydomonas reinhardtii: связь с устойчивостью клеток к окислительному стрессу и репарацией ДНК
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белки теплового шока HSP70B хлоропластов Chlamydomonas reinhardtii: связь с устойчивостью клеток к окислительному стрессу и репарацией ДНК"

004607731

На правах рукописи

Ермохина Ольга Викторовна

БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА Н8Р70В ХЛОРОПЛАСТОВ СЫатуйотошя гетНаШЬ СВЯЗЬ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ КЛЕТОК К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ И РЕПАРАЦИЕЙ ДНК

Специальность 03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

004607731

Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов

Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Н.П. Юрина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Н.А. Пронина

доктор биологических наук Н.И. Васюкова

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Защита состоится «. 10

2010 г. в

часов на заседании

Автореферат разослан « т » иб^СЛ^

2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Абиотические стрессы, такие как интенсивный свет, засуха, засоление, экстремальные температуры и др. наносят большой вред окружающей среде, являются серьезной угрозой для сельского хозяйства и основной причиной потерь урожая в мире, достигающих до 50%. Выяснение основных механизмов формирования устойчивое™ сельскохозяйственных растении и водорослей (как модельных объектов) к различным видам стресса имеет большое теоретическое и практическое значение. Прямым результатом действия стрессов является накопление в клетках токсичных соединений, таких как активные формы кислорода - АФК, которые приводят к развитию окислительного стресса, являющегося компонентом большинства других стрессов, которые ограничивают способность растений эффективно использовать световую энергию при фотосинтезе.

Предполагают, что клетки растений воспринимают АФК через редокс-чувствительные факторы транскрипции белков теплового стресса (HSF), которые активируют экспрессию соответствующих генов, связанных с азотным обменом пермеаз (NPR1) (Mittler et al., 2004; Timperio et а!., 2008). У растений основными источниками образования АФК являются хлоропласты и пероксисомы.

Устойчивость и адаптация растений к неблагоприятным факторам окружающей среды определяется индукцией защитных систем клетки (репарационной, антиоксидантной, шаперонной и др.) в ответ на стрессовые воздействия. Особое место среди защитных систем занимают белки теплового шока (HSP), являющиеся ключевыми компонентами клеточного гомеостаза как при оптимальных условиях роста, так и в условиях стресса (Wang et al., 2004). В ответ на тепловой стресс или воздействие других стрессовых факторов в клетках всех живых организмов индуцируется синтез HSP, которые помогают клеткам выжить в условиях стресса и вернуться к нормальной жизнедеятельности после его прекращения (Niu et al., 2006). Белки HSP являются одним из обязательных звеньев неспецифического ответа клеток на повреждение и особенно важны для клеток растений (Huang et al., 2008; Timperio et al., 2008).

Среди различных семейств HSP особая роль в защите клеток ог действия стрессов принадлежит белкам HSP70. Н8Р70/шаперонная система относительно хорошо изучена у бактерий и в большинстве компартментов эукариотической клетки (цитозоле, эндоплазмагическом ретикулуме, митохондриях). Однако об HSP70/inaneponHofi системе хлоропластов известно очень мало. Это тем более удивительно, поскольку хлоропласты являются тем компаргментом, который обеспечивает превращение энергии света в

энергию химических связей углеводов, что является основой жизни на земле. Большой интерес представляет изучение комплекса пластидных белков Н8Р70В и НЭРЭОС, которые вместе с кошалеронными белками образуют «фолдосому» хлоропластов, играющую важную роль в защите растений от окислительного стресса (8сЬгос1а. \luehaus, 2009). Белок ШР70В играет важную роль в защите и репарации фотосистемы 2 при фотоингибировании (БсЬгоёа, 2004). Высказываются предположения, что при адаптивном ответе ГОР могут участвовать в репарации ДНК (Кагщ е1 а1., 2002; Кевгептап е1 а!., 2004; Ма1уи1та, КаЬакоу, 2007). Термин «адаптивный ответ» обычно означает, что воздействие относительно небольшого стресса (например, теплового стресса или гамма-радиации) приводит через некоторое время к повышению устойчивости к тому же или другому виду стресса.

В этой связи актуальным является изучение возможной функции ШР/молекулярных шаперонов хлоропластов как маркеров устойчивости клеток к окислительному стрессу, а также выяснение того, участвуют ли эти белки в репарации двунитевых разрывов ДНК. Удобным объектом для таких исследований являются клетки одноклеточной зеленой водоросли СЫатусЬэтопая геткагАН, у которой секвенированы все три клеточных геномы. Большая часть исследований, посвященных устойчивости растительных организмов к стрессу и поиску маркеров устойчивости, проводится на чувствительных к стрессу штаммах водорослей. Работ, выполненных на устойчивых к окислительному стрессу штаммах, мало. Поэтому в работе были использованы мутантные штаммы СЫатус1отопа5, обладавшие разной устойчивостью к окислительному стрессу и гамма-радиации (Битюга е1 а1., 2008).

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение белков теплового стресса хлоропластов ШР70В и Н8Р90С как маркеров устойчивости клеток СЫатуёотопси геткагЛи к окислительному стрессу и роли этих белков в репарации двунитевых разрывов ДНК. Исследования были проведены на мутантах С. гетИагЛИ, различающихся по устойчивости к окислительному стрессу, УФ и гамма-радиации. Были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Охарактеризовать по пигментному и белковому составу тилакоидных мембран мутантные штаммы С. гетИагШП, различающиеся устойчивостью к стрессам.

2. Сравнить мутантные штаммы С. геМагсЛи, различающиеся по устойчивости к стрессам, по содержанию Н8Р70В при тепловой индукции.

3. Исследовать участие хлоропластных HSP70B/iuaneponoB в образовании адаптивного ответа, индуцированного гербицидом паракватом.

4. Изучить влияние HSP70B и HSP90C на репарацию двунитевых разрывов ДИК в клетках мутанта CW15 С. reinhardtii.

Научная ноптна. Изучение мугантых штаммов С. reinhardtH с повышенной устойчивостью к окислительному стрессу выявило наличие корреляции между повышенной устойчивостью и повышенным содержанием хлоропластного HSP70B/manepoHa, а также с повышенным содержанием хлорофиллов и повышенной активностью антиоксидантных ферментов. Выявленная корреляция указывает на то, что уровень экспрессии хлоропластного HSP70B/uianepona может служить маркером устойчивости клеток к стрессам. Показано, что паракват-индуцированный адаптивный ответ устойчивых штаммов С. reinhardtii не коррелирует с устойчивостью к окислительному стрессу, из чего следует, что уровень адаптивного ответа не может служить маркером устойчивости клеток. Установлено, что индукция хлоропластных HSP70B и HSP90C/uianeponoB тепловым стрессом не приводит к повышению уровня репарации двунитевых разрывов ДНК, что свидетельствует о независимом функционировании HSP/шаперонной системы пластид и репарационной системы клетки у зеленой водоросли С. reinhardtii.

Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах устойчивости клеток растений к окислительному стрессу. Повышенное содержание пластидного HSP70B/uianepona и содержания хлорофиллов может служить маркером устойчивости при селекции растений. Изучение механизмов устойчивости к окислительному стрессу важно для создания резистентных к неблагоприятным факторам окружающей среды генотипов и генетической элиты популяции клеток, для получения устойчивых сортов сельскохозяйственных растений.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных симпозиумах «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Россия, Казань, 2006); «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященном 100-летию акад. Н.М, Сисакяна (Россия, Дубна, 2007; Армения, Ереван, 2007); «Seminar of Ecology» (Болгария, София, 2009). А также на Съезде генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина и Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Россия, Москва, 2009),

Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009» (Россия, Пущино-Тула, 2009).

Публикации. Опубликовано 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ, 3 статьи в сборниках и 7 тезисов докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (''Источников). Диссертация изложена на^^страницах, содержитрисунков и % таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы детально рассмотрено явление окислительного стресса у растений, процесс образования и удаления АФК и участие АФК в ответных реакциях на биотические и абиотические стрессы. Кратко освещен механизм формирования адаптивного ответа на стрессы окружающей среды у растений. Дана общая характеристика семейств белков теплового шока. Показан молекулярный механизм функционирования белков-шаперонов и их роль в защите растений от окислительного стресса.

Объекты и методы исследования Штаммы Chlamydomonas reinhardtii и условия культивирования клеток В работе были использованы мутантные штаммы Chlamydomonas reinhardtii, обладавшие разной устойчивостью к окислительному стрессу, гамма-радиации и УФ-свету. Штаммы CW15, АК-9-9, Н-3, GK-1, GK-2, GK-3 были получены проф. Ст. Майковой (Central Lab. of Ecology, Sofia, Bulgaria; Chankova et al., 2005). Штамм UVS-10, чувствительный к УФ и дефектный по рекомбинантной репарации ДНК, и штамм UVS-14, чувствительный к УФ и дефектный по мисматч-репарации ДНК, были получены проф. Д. Влчеком (Vlceket al., 1987). Все штаммы были предоставлены проф. Ст. Чанковой.

Выращивание С. reinhardtii проводили в стерильных условиях при постоянном освещении люминесцентными лампами 60 мкмоль м"2 с"1 и температуре 23-25°С. Клеточные суспензии достигали конца экспоненциальной и начала стационарной фазы

роста на 5-7 день выращивания. Культуру выращивали в конических (300 мл) или круглых (500 мл) колбах на трис-ацетат-фосфатной среде (ТАР среда) (Нагпз. 1989). Тепловая обработка клеток

Клетки ресуспендировали в 50 мл свежей среды ТАР и нагревали в темноте при 37°С в течение 30 мин или при 42°С в течение 5 мин. В некоторых опытах после тепловой предобработки через 1-4 ч клетки подвергали гамма-излучению 500 Гр (СЬапкоуа е( а)., 2005). Через 2 или 4 ч после облучения определяли содержание двунитевых разрывов ДНК с помощью электрофореза в постоянном иоле. В опытах с двумя последовательными тепловыми стрессами время между первым и вторым стрессом составляло 4 ч. Через 2 ч или 4 ч после второй тепловой обработки определяли содержание двунитевых разрывов ДНК и проводили иммуноблот-анализ. Обработка клеток зеоцнном

Зеоцин относится к семейству блеомициновых антибиотиков, которые индуцируют двунитевые разрывы ДНК в различных видах клеток, и приводит к окислительному стрессу (ПНтоуа е1 а!., 2009). Суспензию клеток С. ге'тЬагЛм (7-сут) центрифугировали при 400 £ в течение 5 мин. Осадок суспендировали в среде ТАР до плотности 10б клеток/мл и обрабатывали зеоцином. К суспензии клеток добавляли зеоцин (стерильный водный раствор, фирма 1пуНгоОеп, США) в конечной концентрации 2, 10 или 100 мкг/мл и центрифугировали 1 мин при 400 g. Надосадочную жидкость удаляли, и осадок клеток промывали свежей средой ТАР, каждый раз центрифугируя суспензию при 400 g и 4°С в течение 5 мин. Осадок клеток использовали в экспериментах. Обработка клеток мелафемом

Использовали 7-суточную культуру водоросли С. геЫгагс1Ш, штамм С\У15. Мелафен (Фаггахов и др., 2004) добавляли в среду ТАР на вторые сутки роста культуры, после чего выращивание продолжали в течение 5 сут. Использовали следующие концентрации мелафена: 10"9, 10"8, 10"', 104 и 10'2%. Для индукции ШР клетки С. геткаг&И С\¥15 инкубировали при 37°С в течение 30 мин в темноте, затем культуру оставляли при комнатной температуре в темноте еще на 4 ч. Клетки собирали центрифугированием (4000 g, 10 мин), промывали водой и использовали для биохимических анализов. Содержание хлорофиллов и каротииоидов определяли по Лихтенталеру (ЫсЫепШакг, 1987). Эксперименты проводили в трех повторностях. Индуцированный паракватом адаптивный ответ (адаптивная предобработка/повреждающая обработка),

Гербицид паракват (метилвиологен, Зщта-АМпсИ, США) использовали в качестве агента, индуцирующего окислительный стресс. В опытах по изучению адаптивного ответа

адаптивная предобработка низкими концентрациями параквата проводилась до основной повреждающей обработки высокими концентрациями параквата. Концентрация параквата для предобработки была определена ранее по выживаемости клеток (Chankova et al., 2008; Dimova et al., 2008). Оптимальная концентрация параквата для предобработки была равна L20 и дня разных штаммов была различной (2-9 мкг/мл). Концентрация параквата дня основной обработки клеток составляла L50 для всех штаммов (6-24 мкг/мл). Время между обработками составляло 4 ч. После основной повреждающей обработки (тест-доза) клетки восстанавливались в течение 3 ч и затем определяли содержание HSP70B и двунитевых разрывов в ДНК. Выделение суммарного белка

Для выделения суммарного белка клетки (из 50 мл культуры) гомогенизировали в буфере: 5 мМ трис-HCl, рН 7.8,4 мМ MgCl2, как описано ранее (Yurina, Kloppstech, 2001). Равные объемы двукратного лизирующего буфера (1х буфер - 62.5 мМ трис-HCl, рН 6.8, 2% 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин) и гомогената тщательно смешивали, Лизат нагревали 5 мин при 95°С и затем центрифугировали при 18 000 g в течение 15 мин. Содержание белка определяли по методу Бредфорд. Выделение белков тнлакоидных мембран

Клетки С. reinhardtii собирали центрифугированием при 4000 g (10 мин). Осажденные клетки 5 мин разрушали в гомогенизаторе Поттера в среде, содержащей 0.33 М маннит, 0.05 М трис-HCl, рН 8.0, 3 мМ ЭДТА, 1 мМ ФМСФ. Полученный гомогенат центрифугировали при 4000 g (10 мин). Осадок суспендировали в растворе, содержащем 0.001 М трис, 0.01М MgCI2, рН 8.0, и тилакоидные мембраны осаждали центрифугированием при 14000 g в течение 15 мин. Электрофорез в полиакриламидиом геле и иммуноблоттииг

Белки фракционировали с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na. Концентрирующий гель (рН 6.8) содержал 4%, а разделяющий (рН 8.8) - 12.5% полиакриламида. На дорожку наносили 150 мкг белка. Из геля белки переносили электроблотгангом на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C («Amersham», Великобри тания) с размером пор 0.45 мкм.

Иммуноблоттииг проводили согласно ECL Western blotting protocol («Amersham», Великобритания). Для иммунодетекции белка использовали поликлональные антитела кролика к HSP70B в разведении 1:10000. Для нормирования нанесения образцов на гель в качестве внутреннего страндарта использовали рибосомный белок хлоропластов L1 (plRpLl), антитела к которому разводили в отношении 1:3000. Антитела были любезно предоставлены проф. М. Шрода (М. Schroda, Max Plank Institute of Molecular Plant

Physiology, Potsdam-Golm, Germany). Инкубацию с антителами проводили при 4°С. Мембрану промывали буферным раствором 1 (20 мМ трис-HCl, рН 7.5, 150 мМ NaCl и 0.1% Твин-20), затем инкубировали 1 ч в 5%-ном растворе сухого обезжиренного молока в том же буфере и инкубацию продолжали в течение ночи в растворе первичных антител в 5%-ном растворе молока в буфере 1. Мембрану промывали указанным буфером три раза по 5 мин и помещали на один час в раствор вторичных антител, после чего также промывали.

Первичные антитела детектировали, используя антикроличьи иммуноглобулины, IgG (H+L), конъюгированные с пероксидазой (полученные из НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея, РАМН) в разведении 1:12000. Пероксидазную активность конъюгатов проявляли с помощью хемилюминесценции, используя реактивы ESL™ Western blotting analysis system . («Amersham», Великобритания). Хемилюминесцентное свечение регистрировали с помощью рентгеновской пленки ХВМ («Retina», Германия). При повторном использовании мембран (для инкубации с другими антителами) связавшиеся с мембраной антитела удаляли в растворе: 60 мМ трис-HCl, рН 6.8, 2%-ный ДДС-Na и 100 мМ 2-меркаптоэтанол, в течение 30 мин при 50°С. Для количественного определения HSP70B использовали программу ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Определение активности ферментов

Суспензию клеток центрифугировали при 4000 g в течение 10 мин и супернатант отбрасывали. Клетки ресуспендировали в 100 мМ К-фосфатном буфере, рН 7.0, содержащем 1.0 мМ ЭДТА и гомогенизировали с использованием балотиний при 4°С. Затем гомогенат центрифугировали при 14000 g в течение 30 мин. Надосадочную жидкость использовали для определения активности антиоксидантных ферментов. Активность супероксндянсмутазы (СОД; КФ 1.15.1.1) определяли с помощью реакции фотохимического восстановления нитросинего тетразолия супероксид радикалами, образовавшимися под действием рибофлавина (Beuchamp et al., 1971). За одну единицу СОД принимали такое количество экстракта, которое приводило к 50%-ному ингибированшо восстановления нитросинего тетразолия.

Активность каталазы (КАТ; КФ 1.11.1.6) измеряли спектрофотометрически по реакции разложения Н2О2 при 240 нм в 3 мл реакционной смеси, содержащей 50 мМ К-фосфатного буфера, рН 7.0, и 22.5 мкл 30% (v/v) Н202 (е=40.0 мМ'1 см"1) (Kato et al., 1987). Активность гваякол-иероксидазы (ГвП; КФ 1.11.1.7). Об активности фермента судили по увеличению поглощения при 470 нм, вызванному образованием тетрагваякола (е=26.6 мМ'1 см"1) (Decker et al., 1997) в 2 мл реакционной смеси, содержащей 50 мМ К-

фосфатного буфера, рН, 7.0, 0.3% (v/v) гваякола и 150 мкл 100 мМ H202. Содержание белка определяли по методу Бредфорд, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Определение содержания двунитевых разрывов ДНК в клетках С. reinhardtii

Дня определения содержания индуцированных (зеоцином или радиацией) двунитевых разрывов использовали агарозный электрофорез в постоянном поле (Chankova et al., 2007). Осадок клеток (обработанные или необработанные образцы) заключали в блок, содержавший 90 мкл 0,8% низкоплавкой агарозы в среде ТАР. Агарозные блоки с клетками помещали в 0,75 мкл лизирующего раствора, содержащего протеиназу К (1 мг/мл; «Merck»), 0,4 M ЭДТА, 2% Na-лаурилсаркозин («Merck»), рН 8,0. Лизис проводили в течение 30 мин на льду и затем в течение 20 ч при 37°. Агарозные блоки промывали четыре раза 10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА буфером, рН 7,6 и помещали в карманы разделяющего 0,8% агарозного геля, содержащего 0,045 M трис-боратный буфер, рН 8,3, 1мМ ЭДТА и 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Электрофорез проводили в течение 40 ч при постоянных напряжении 20 в и силе тока 10 ма. После окончания электрофореза содержание окрашенных бромистым этидием полос анализировали с помощью видеосистемы и программного обеспечения фирмы "Syngene" (Gene Tool Analyser G:Box Syngene, Великобритания).

Относительное содержание фракции фрагментов ДНК (ФФД) рассчитывали по формуле: ФФД = содержание фрагментов ДНК/(нефрагментированная ДНК + ДНК фрагментов).

Результаты и их обсуждение 1. Биохимическая характеристика мутаитных штаммов Chlamydomonas reinhardtii

Была проведена биохимическая характеристика девяти мутантов Chlamydomonas, обладающих повышенной устойчивостью к радиации и окислительному стрессу. Определен их пигментный состав (хлорофиллы и каротиноиды). Ранее с помощью сравнительного анализа выживаемости штаммов было показано, что их устойчивость последовательно убывает: Н-3 > АК-9-9 > GK-3 > GK-2 = GK-1 > 137С+ = CW15 (Chankova et. al., 2005; 2007).

Обнаружено, что у мутантных штаммов АК-9-9 н Н-3 содержание хлорофшшов (а+Ь) и каротиноидов ~ в два раза выше, чем у клеток дикого типа. Отношение хлорофиллов а/Ь было выше на 15 % у мутантов АК-9-9 и Н-3, чем у клеток дикого типа, в то время как по отношению хлорофилл/каротиноиды отличий между мутантами и клетками дикого типа не обнаружено (табл. 1).

Таблица 1. Содержание хлорофиллов и каротиноидов в клетках мутантов и дикого типа СЫату<1отопа5 гетИагЛН

Штаммы Хлорофилл а+Ь (мкг/107кл) Каротиноиды (мкг/107кл) Хлорофилл, а/Ь Хлорофилл/ каротиноиды

137С+ 19.0 ±2.6 5.6 ±0.1 2.2 ±0.1 3.4 ±0.2

С\У15 22.9 ±0.7 4.5 ± 0. 4 1.9 ±0.0 5.1 ±0.2

АК-9-9 36.3 ±2.1 10.0 ±0.5 2.5 ±0.1 3.7 ±0.2

Н-3 43.2 ±3.5 12.1 ±2.4 2.5 ±0.1 3.5 ± 0.7

иув-м 20.6 ± 1.2 5.3 ±0.4 2.4 ±0.1 3.6 ±0.5

иУ8-14 28.5 ± 5.7 6.2 ± 0.8 2.3 ±0.1 4.1 ±0.7

СК-1 16.0 ±1.9 3.9 ±0.7 2.5 ±0.1 4.1 ±0.3

вК-2 18.7 ±5.8 4.5 ± 0.5 2.5 ±0.1 4.2 ±0.6

19.0 ±5.9 4.5 ± 1.4 2.1 ±0.1 4.4 ±0.5

Таким образом, у мутантных штаммов АК-9-9 и Н-3 СЫатус1отопаз, имеющих повышенную устойчивость к окислительному стрессу, обнаружено повышенное содержание хлорофиллов а и Ь и каротиноидов.

2. Белки тилакоидных мембран у мутантов СМшщчЛотопаа гет/гагЛи

Как показано выше, устойчивые штаммы С. геткагЛИ характеризуются повышенным содержанием хлорофиллов, поэтому представляло интерес изучить также белковый состав тилакоидных мембран хлоропластов у этих штаммов, поскольку в хлоропластах хлорофиллы и каротиноиды связаны с белками тилакоидов.

Как следует из рис. 1, все мутанты имели сходный состав белков тилакоидов. Однако у штамма Н-3 СЫатус1отопа5 обнаруживалось пониженное содержание белка тилакоидных мембран с молекулярной массой 28 кДа. По элсктрофоретической подвижности этот белок сходен с белками свегособирающего комплекса фотосистемы 2 (молекулярная масса 24-29 кДа). Так как мутант Н-3 СЫатусЬтопаз является наиболее устойчивым среди изученных штаммов водоросли, возможно, что это отличие связано с повышенной устойчивостью мутанта Н-3 к окислительному стрессу.

-PsaA/S

-CP47 -CP43

-LHCI) -PsaO/F

Рис. 1. Электрофореграмма тилакоидных белков мутантных штаммов СЫатус1отопа$ ггтИагЛИ и клеток дикого типа. М - маркеры: 94 кДа, фосфорилаза Ь; 67 кДа, бычий сывороточный альбумин; 43 кДа, овальбумин; 30 кДа, карбоангидраза; 20,1 кДа, ингибитор трипсина; 14,5 кДа, а-лактальбумин.

3. Изучение тепловой индукции хлоропластного HSP70B/uianepoHa у мутантов С. reinhardtii

Абиотический стресс обычно становится причиной функциональных нарушений белков. В процессе эволюции организмы выработали различные защитные механизмы, чтобы минимизировать разрушающее действие стресса. Одним из них является шаперонная система. Белки теплового шока выступают в роли молекулярных шаперонов, которые участвуют в фолдинге образующихся полипептидов, а также в транспорте белков и их деградации. Они защищают клетки и организмы от окислительного разрушения как in vivo, так и in vitro (Lee et al., 2001). HSP70B, входящий в семейство 70-кДа HSP, является молекулярным шапероном (Schroda, 2004).

Для того чтобы выяснить, можно ли использовать уровень белков теплового стресса в качестве маркеров устойчивости к окислительному стрессу, мы сравнили содержание хлоропластных белков теплового шока HSP90C и HSP70B у мутантов, устойчивых к окислительному стрессу и радиации, и у клеток дикого типа.

Для исследования были выбраны именно эти хлоропластные белки, потому что в растениях, подвергавшихся воздействию различных абиотических стрессов, большая часть индуцированных стрессом активных форм кислорода образуется в хлоропластах. Кроме того, хлоропластные HSP70B играют важную роль в сохранении и биогенезе тилакоидных мембран и вносят свой вклад в защиту фотосистемы 2 (ФС2) от фотоингибирования и репарацию фотоповрежденной ФС2 (Schroda et al., 1999 ). Другой хлорогшастный стрессовый белок HSP90C сильно индуцируется тепловым стрессом и умеренно - светом. Взаимодействие этих двух шаперонов необходимо для образования

мульгибелкового комплекса, участвующего в созревании белков хлоропластов (ЗсЬгоёа, 2004).

Было проведено сравнительное исследование содержания белков теплового стресса у мутантов, подвергнутых действию теплового стресса. Для иммуноблот анализа использовали суммарные белки клетки. Все образцы выравнивали относительно содержания рибосомного белка пластид 1Л. Чтобы определить уровень Н8Р70В, суммарные белки выделяли из клеток СИ1атус1отопа$, которые были предварительно подвергнуты тепловому стрессу (37°С, 30 мин) с последующей инкубацией в течение 4 ч при комнатной температуре. Была установлена корреляция между содержанием шаперона Н8Р70В и устойчивостью клеток к окислительному стрессу. Данные иммуноблоттинга показали, что ШР70В строго индуцируется тепловым стрессом у всех изученных штаммов (рис. 2), при этом было обнаружено три варианта индукции Н8Р70В:

1) Значительное увеличение содержания ШР70В после воздействия теплового стресса обнаружено у штаммов Н-3 и ОК-1. Уровень Н8Р70В у этих мутантов возрастал на 7080% по сравнению с клетками дикого типа.

2) Умеренное увеличение индукции ШР70В наблюдали у штаммов АК-9-9, ОК-2, ОК-З. Уровень Н8Р70В у этих мутантов возрастал на 20-30% по сравнению с клетками дикого типа.

3) Относительно низкий уровень индукции Н8Р70В наблюдали у клеток дикого типа 137С+ и штамма С\У15 с редуцированной клеточной стенкой,

Учитывая данные сравнительного анализа штаммов по выживаемости клеток в стрессовых условиях (СИапкша е1. а!., 2005; Онпо\а й а1., 2008) и наши данные по содержанию ШР70В/шаперонов пластид у мутантных штаммов, можно заключить, что имеется корреляция между устойчивостью клеток и содержанием этих белков, а

пэто^ сут ж»« н-з ох-* ок^ акд

" ''• '¿$£¡33Рис. 2. Роль генотипа в индукции

хлоропластного шаперонного белка Н8Р70В. Индукция Н8Р70В у штаммов С. геткагЛН под действием теплового шока (37°С/30 мин).

(а) иммуноблот анализ с использованием антител к Н8Р70В и р1КрЫ.

(б) содержание ШР70В, нормализованное по содержанию хлоропластного рибосомного белка 1,1 (рЖрЫ).

Таким образом, тепловая обработка приводит к накоплению хлороапастных белков ШР70В у мутантов. Так как повышенное содержание ШР70 связывают с повышенной термоустойчивостью (Ваш^ е1 а1., 1998), можно предположить, что индукция Н8Р70В у этих му тантов связана с повышенной устойчивостью к окислительному стрессу.

Я «во Г в о .1, Д1)' 6 I 1 1 .0] » 1л а

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что существует корреляция межу накоплением HSP70B и устойчивостью мутантов. Все устойчивые мутанты накапливали больше HSP70B, чем дикий тип клеток. Это предполагает, что устойчивость штаммов связана со стресс-индуцированными механизмами. Результаты данного исследования указывают на то, что существует множество защитных механизмов, способствующих выживанию растений в стрессовых условиях. Как дикий тип, так и устойчивые штаммы С. reinhardtii, обнаруживали способность к индукции HSP. Различный стрессовый ответ на тепловой стресс у штаммов водоросли зависит, по-видимому, от генетической и морфологической характеристик изученных штаммов.

Можно предположить, что уровень белков теплового шока HSP70B является хорошим биохимическим индикатором устойчивости клеток к окислительному стрессу у растений. Это согласуется с представлениями о том, что у растений устойчивость к стрессовым воздействиям определяется, главным образом, белками теплового стресса (Huang, Xu, 2008; Timperio et al„ 2008).

4. Активность антиоксидаитных ферментов в клетках дикого типа и мутантов С. reinhardtii

Из данных литературы известно, что обезвреживание АФК является общим ответом клеток на большинство стрессов. Детоксикация АФК осуществляется системой антиоксидантной защиты, включающей такие ферменты как супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза. Считают, что уровень активности этих ферментов может быть использован в качестве биохимических маркеров устойчивости штаммов к окислительному стрессу. В этой связи было интересно сравнить данные, полученные для HSP, с данными, полученными для ферментов антиоксидантной системы.

Определение активности антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы у штаммов С. reinhardtii показало, что у штаммов Н-3 и АК-9-9 активность СОД и КАТ в 1.5-2 раза выше, чем у дикого типа клеток 137С+ и штамма CW15 (Р<0.01) (табл. 2). Не обнаружено существенных различий в активности пероксидазы у изученных штаммов водоросли.

Таблица 2. Активность супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы у штаммов С. reinhardtii. _ _____

Штаммы Супероксиддисмутаза, Ед.-мг'1 белка Каталаза, цмоль Н202'Мин"1,мг"1 белка Пероксидаза, AE-мин''-мг*1 белка

137С 32.01 ±2.53 28.99 ±2.22 0.14 ±0.01"

CW15 21.10 ± 1.02 42.22 ± 2.75 0.11 ±0.02"'

Н-3 43.41 ±3.15" 59.57 ±3.07 6 0.10 ±0.01"

АК-9-9 42.31± 1.73" 59.92 ±7.69 5 0.17 ±0.03'

Наши данные о корреляции между уровнем Н8Р и устойчивостью к окислительному стрессу у изученных штаммов хорошо согласуются с данными об антиоксидантной системе устойчивых мутантов. Как было показано ранее, катапаза и супероксиддисмутаза могут служить биохимическими маркерами устойчивости к окислительному сгрессу. Пероксидаза, являющаяся компонентом антиоксидазной защиты клеток, не пригодна для использования ее в качестве такого маркера.

5. Влияние мелафена на экспрессию ШР70В хлоропластов в клетках СН1атус1отопа5

геткагМи

Обнаружение того факта, что содержание ШР коррелирует с устойчивостью штаммов к окислительному стрессу, открывает возможность изучения действия и/или тестирования стрессового действия физиологически активных веществ на растения. В качестве примера такого использования Н8Р было изучено действие биологически активного соединения - мелафена, стимулятора роста нового поколения, обладающего протекторным действием.

Исходя из данных об антистрессовом действии мелафена (Осипенкова и др., 2008),

можно было предположить, что мелафен будет оказывать влияние и на синтез белков

теплового стресса Н8Р70В, играющих важную роль в защите клеток от повреждающего

действия стрессовых факторов. Как видно из рис. 3, белок Н8Р70В присутствует и в не

обработанных мелафеном клетках. При действии теплового стресса содержание этого

белка увеличивается в несколько раз. На рис. 3 представлено также относительное

содержание Н5Р70В в клетхах СЫату&топая, обработанных мелафеном. В

концентрациях 10'9%, 10"8%, 10" 7% и 1 (Г1% мелафен снижает уровень ШР70В на 39%, а в

концентрации 10""% - на 43%. Таким образом, в клетках С ге'ткаг&И мелафен подавляет

индукцию белков теплового шока хлоропластов с молекулярной массой 70 «Да. Для

клеток изученной водоросли мелафен не является стрессовым фактором, так как

обработка мелафеном не приводит к

увеличению содержания 118Р.

Рис. 3. Относительное содержание Н8Р70В, индуцированного тепловым стрессом, в клетках С. геМагЖН, обработанных мелафеном. а -вестерн-блоттинг Н8Р70В водорослей, выращенных при разных концентрациях мелафена. б - относительное содержание (% от контроля) Н8Р70В. Концентрация мелафена: 10 (контроль, без индукции тепловым стрессом); 2-0 (контроль, с индукцией тепловым стрессом); 3 -10""; 4 -10"8; 5 -¡О"7; 6-Ю"4 и 7 -10"2%.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что мелафен по-разному влияет на различные систематические группы растений (высшие растения и водоросли). У штамма CW15 С. reinhardtii клеточная стенка редуцирована, поэтому возможно, что концентрации 10"8 - 10"'% (обычно используемые для обработки семян) являются высокими дня данного штамма. По-видимому, для разных объектов надо подбирать оптимальные для индукции роста концентрации мелафена.

6. Адаптивный ответ, индуцированный паракватом, у мутантных штаммов С. reinhardtii

Одним из факторов, повышающих устойчивость растений к окислительному стрессу, является их способность к формированию адаптивного ответа. Адаптивный ответ - неспецифический феномен, при котором предобработка слабым стрессом приводит к увеличению устойчивости к высокому уровню того же или других типов стрессов (Asad et al., 2004; Girigoswami, Ghosh, 2005; Yan et al., 2006; Dimova et al., 2008). Показано, что предварительная обработка клеток тепловым стрессом может увеличивать радиоустойчивость клеток млекопитающих. Однако у растений этот вопрос практически не изучен, как и механизм образования адаптивного ответа.

Для того чтобы выяснить, может ли уровень индуцированного адаптивного ответа служить индикатором устойчивости к окислительному стрессу, была изучена способность к адаптивному ответу на действие параквата у четырех штаммов Chlamydomonas reinhardtii, отличающихся по радиоустойчивости: 137С, CW15, Н-3 и АК-9-9. Уровень индуцированного паракватом адаптивного ответа оценивали по содержанию шаперонных белков хлоропластов HSP70B.

Паракват (Ы,К,'-диметил-4,4'-бипириднн дихлорид (производное виологена, http://paraquat.com) в форме четвертичной аммонийной соли широко используется как сильный гербицид неспецифического действия (индуктор окислительного стресса). Было установлено, что окислительный стресс индуцирует образование хлоропластных белков теплового стресса HSP70B и HSP90C и адаптивный ответ на уровне этих же белков у клеток дикого типа.

Ранее было показано, что наивысший уровень адаптивного ответа наблюдается при использовании для предобработки параквата в концентрации ~1Л>2о и последующей обработки высокой концентрацией параквата (~LDj0), как указано в методах.

У клеток дикого типа 137С+ обнаружен высокий уровень адаптивного ответа на паракват (-90%) (рис. 4). У мутантов С\У15 и АК-9-9 выявлен более низкий уровень адаптивного ответа (60% и 30%, соответственно), чем у клеток дикого типа. У наиболее радиоустойчивого мутанта Н-3 адаптивного ответа не выявлено. Таким образом, не выявлено корреляции между уровнем устойчивости и величиной адаптивного ответа. Уровень адаптивного ответа на паракват, по всей видимости, мало пригоден для оценки устойчивости клеток к окислительному стрессу.

Рис. 4. Индуцированный паракватом адаптивный ответу штаммов С.\У15, 137С+, АК-9-9 и Н-3 СЫатус1отопси геМшгЛи.

(а) Вестерн-блоттинг с использованием антител к НБР70В. Дорожка 1 - необработанный контроль; 2 -обработка паракватом в концентрации и затем 4 ч инкубации; 3 - предобработка паракватом ЫЭго, инкубация в течение 4 ч, затем обработка паракватом в концентрации ЬОбо и 3 ч инкубации (адаптивный ответ); 4 - обработка паракватом ЬВ5о и инкубация Зч.

(б) Диаграмма, отражающая содержание Н8Р70В у штаммов СИ1ату^топаз при различных обработках.

7. Влияние индукции Н8Р70В на репарацию двуиитевых разрывов ДНК у С. ге'тНагШИ.

Относительно малоизвестно о взаимосвязи между репарационной способностью клетки, антиоксидантиой и шаперонной системами у растений. Для клеток животных показано, что тепловая предобработка, вызывающая индукцию НЗР, приводит к повышенной репарации поврежденной радиацией ДНК (Ке57,епшап е1 а!., 2000, 2004: Кагщ еЬ а!., 2002; Ма1уШша, КаЬакоу, 2007). Для того чтобы выяснить коррелирует ли накопление НвР с репарацией ДНК у СЫатуйотопая были изучены четыре штамма С. гетИагЛи, отличающиеся по способности к ДНК-репарации: дикий штамм 137С+, штамм С\У-15 и дефектные по рекомбинантной репарации ДНК и мисматч-репарации штаммы иУв-Ю и иУЭ-Н, у которых повреждения ДНК (двунитевые разрывы) были вызваны действием окислительного стресса. В качестве индуктора окислительного стресса был использован зеоцин (2 - 100 мкг/мл; радиомиметик, механизм действия которого связал со способностью вызывать фрагментацию ДНК). Можно было предположить, что если есть корреляция между накоплением ШР70В и репарацией ДНК, то после действия зеоцина у мутантов с нарушенной репарацией не будет также и индукции НвР. В том же

случае, если это независимые процессы, при нарушенной репарации ДНК синтез НБР будет наблюдаться.

Было обнаружено, что зеоцин после одного часа инкубации не приводит к значительной индукции синтеза ШР70В у штаммов 137С+ и С\У-15, но увеличивает содержание этих белков у штаммов ИУБ-Ю и иУв-14 на 30 - 70 % и 70 - 110%, соответственно. После четырех часов инкубации у штаммов ЦУв-Ю и ПУЭ-М содержание Н8Р70В остается на уровне контроля в независимости от используемых концентраций зеоцина.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что ШР/шаперонная система С. гетИаг&н принимает участие в защите клеток от окислительного стресса, вызванного действием зеоцина, и не зависит от функционирования репарационной системы. Эти результаты указывают также на то, что содержание Н8Р70В может быть использовано в качестве индикатора окислительного стресса.

8. Влияние тепловой предобработки на уровень двунитевых разрывов ДНК у С. геМагЛи

Для того чтобы выяснить, защищает ли тепловая предобработка клеток СЫатуЛотопая гемИагски от повреждающего действия гамма-радиации на ДНК было изучено влияние тепловой предобработки на содержание двунитевых разрывов ДНК. В частности, было изучено, может ли тепловая предобработка подобно низким дозам радиации повышать репарацию двунитевых разрывов ДНК и могут ли хлоропластные ШР70В/Н5Р90С шапероны защитить клетки от двунитевых разрывов ДНК, индуцированных радиацией.

На первом этапе работы было выяснено, может ли тепловая предобработка клеток С. гетИагШи вызывать адаптивный ответ на уровне репарации двунитевых разрывов ДНК у штамма С\У15, приводит ли тепловая предобработка (37°С/30 мин) к снижению уровня двунитевых разрывов ДНК, вызванных радиацией (500 Гр) через 1 ч или 4 ч после тепловой обработки. Было показано, что тепловая предобработка не влияет на содержание двунитевых разрывов. Не обнаружено различий в уровне репарации двунитевых разрывов ДНК у предобработанных тепловым стрессом и контрольных клеток.

Кроме того, было обнаружено, что тепловая обработка сама по себе не вызывает двунитевых разрывов ДНК (рис.5). Небольшие отличия в содержании двунитевых разрывов ДНК у клеток С. ге'ткагйМ., индуцированных тепловым стрессом, по сравнению с контрольными непрогретыми клетками были статистически недостоверными.

Рис. 5. Действие теплового шока на содержание двунитевых разрывов ДНК у С. геткаг&'й. Необработанный контроль (черный прямоугольник); 37°С, 30 мин (белый прямоугольник); 42°С, 5 мин (серый прямоугольник). ФФД - фракция фрагментов ДНК.

Для того чтобы убедиться, действительно ли тепловой стресс (37°С/30 мин или 42°С/5 мин), не вызывающий повреждений ДНК, является стрессовым фактором для штамма С\¥15, была изучена индукция хлоропласгных белков теплового шока ШР70В и ШР90С. Вестерн-блоттинг показал, что ШР70В и ШР90С строго индуцируются тепловым стрессом (рис. 6). Содержание этих белков увеличивалось в 2-4 раза по сравнению с контролем. Таким образом, оба используемых температурных режима индуцируют тепловой стресс в клетках С. гетИагскп.

Для того чтобы выяснить, приводит ли тепловая предобработка к дальнейшему увеличению содержания ШР70В и ШР90С и содержанию двунитевых разрывов ДНК, были поставлены дополнительные эксперименты по двойной - тепловой стресс/тепловой стресс - обработке. Обнаружено, что предобработка при обоих температурных режимах приводит к дополнительном)' образованию ШР70В и ШР90С в образцах с двойной обработкой тепловым стрессом (Рис. 6а, дорожки 5 и 6). Заметное увеличение содержания ШР90С (80% и 50%) было показано в зависимости от условий предобработки (37°С/30 мин или 42°С/5 мин, соответственно) (рис.66, столбики 2,4 и 3,5). Наибольшее накопление НБР90С было обнаружено при использовании 42°С/5 мин в двух последовательных обработках (Рис. 66, столбики 2,4). Обнаружено также, что оба использованных температурных режима приводят к повышенному накоплению Н8Р70В - на 60% и 50%, соответственно (рис.бв, столбики 2,4 и 3,5). В тех же экспериментальных условиях не наблюдается дополнительного повреждения ДНК в клетках С. гетИагс11И, приводящего к увеличению содержания двунитевых разрывов ДНК.

Таким образом, тепловая предобработка приводит к дополнительному накоплению ШР70В и ШР90С (рис. 6). В то же время двойная тепловая обработка не повышает уровень двунитевых разрывов ДНК (рис. 7, 8).

Рис. 6. Содержание белков ШР90С и Н8Р70В в клетках С. ге'ткагЛ'й, штамм С\\П5, после различных температурных воздействий, (а) вестерн-блот анализ с использованием антител к ШР90С, ШР70В и plR.pL I. (б, в) относительное содержание белков Н8Р90С и ШР70В, нормированное по содержанию рибосомного белка хлоропластов Ы (р1Кр1Л). 1 - контроль, без тепловой обработки; 2 - тепловая обработка 42°С/5 мин; 3 - тепловая обработка 37°С/30 мин; 4 - тепловая обработка 42°С/5 мин, -инкубация 4ч,- тепловая обработка 37°С/30 мин; 5 - тепловая обработка 37°С/30 мин - инкубация 4 ч,- тепловая обработка 37°С/30 мин.

Эти данные показывают, что тепловая предобработка не влияет на кинетику репарации двунитевых разрывов ДНК, вызванных радиацией у С. reinhardtii CW15 (рис. 7, 8). Таким образом, показано отсутствие корреляции между тепловой предобработкой и уровнем репарации двунитевых разрывов ДНК у штамма CW15 Chlamydomonas. Тепловая предобработка не влияла на последующее действие радиации и не вызывала адаптивного ответа. Однако ранее было обнаружено, что адаптивный ответ возникает у Chlamydomonas, когда в качестве предобработки используется гамма-излучение (Chankova, Bryant, 2002; Chankova et al., 2005).

Рис. 7. Кинетика восстановления двунитевых разрывов ДНК у С. reinhardtii после действия тепловой обработки (37°С/30 мин) с тепловой предобработкой (37°С/30 мин) (круги) или без нее (ромбы); время инкубации 4 ч.

Одним из возможных объяснений отсутствия индуцированного теплом адаптивного ответа у С. reinhardtii может быть то, что для активации адаптивного ответа требуется некоторая минимальная доза радиации, вызывающая повреждения ДНК (Leonard, 2007; Dimova et al., 2008). Повреждения ДНК, вызванные дозой выше этого порога, сигнализируют о необходимости активации репарационной системы ДНК (Matsumoto et al., 2004).

Рис. 8. Кинетика восстановления двунитевых разрывов ДНК у С. reinhardiii после действия теплового шока (37°С/30 мин) с использованием тепловой предобработки (42°С/5 мин) (круги) или без нее (ромбы); инкубация 4 ч (а). Э. ¡ектрофорез в постоянном поле препаратов ДНК, окрашенных бромистым этидием (б). Дорожки 1,2 -необработанный контроль; дорожки 3,4 -тепловая обработка (42°С/5 мин) + 4 ч время восстановления; дорожки 5,6 -4ч без тепловой обработки + тепловая обработка (42°С/5 мин); дорожки 7,8 - 4 ч без тепловой обработки + тепловая обработка (42°С/5 мин) + 2 ч время восстановления; дорожки 9,10-4 ч без тепловой обработки + тепловая обработка (42°С/5 мин) + 4 ч время восстановления; дорожки 11, 12 - 42°С/5 мин + 4 ч время инкубации + 37°С/30 мин; дорожки 13,14 - 42°С/5 мин + 4 ч время инкубации + 37°С/30 мин + 2 ч время восстановления; дорожка 15 - 42°С/5 мин + 4 ч время инкубации + 37°С730 мин + 4 ч время восстановления.

Подобно другим исследованиям, проведенным на клеточных линиях человека (Dong et al., 2007), наши данные показали, что однократная обработка клеток тепловым стрессом не вызывает двунитевых разрывов ДНК. Возможно, что по этой причине и не работает репарационная система, которой для этого требуется некоторое минимальное количество повреждений (Chankova et al., 2009).

Наши результаты свидетельствуют в пользу ранее сделанного предположения о том, что тепловая обработка не влияет на репарационную способность ДНК Chlamydomonas (Boreham, Mitchel, 1993). Молекулярный механизм действия теплового cipecca на устойчивость клеток к радиации неизвестен. Есть несколько работ, свидетельствующих о защитной роли HSP70 при радиации в фибробластах, костном мозге и тимоцитах мыши (Malyutina et al., 2005; Malyutina, Kabakov, 2007). Некоторые авторы полагают, что существует положительная корреляция между сверхэкспрессией HSP70 в клетках и повышенной радиоустойчиаостыо клеток животных (Calirii et а!., 2003; Hunt et al., 2004).

Наши данные показали, что тепловая обработка (37°- 42°С) является стрессовым фактором для С. reinhardiii, так как приводит к сверхсинтезу HSP70B и HSP90C. Повторная тепловая обработка приводит к дальнейшему накоплению хлоропластных шаперонов, что указывает на проявление индуцированной термоустойчивости (Banzet et al., 1998; Mendez-Alvarez et al., 1999). Индукция хлоропластных HSP70B и HSP90C/uianepoHOB тепловым стрессом не сопровождается повышением уровня репарации двунитевых разрывов ДНК, что свидетельствует о независимости

ШР/шаперонной системы пластид и репарационной системы в клетках зеленой водоросли С. геткагскИ. Это два независимых процесса.

Заключение

Сохранение белков в их функциональном состоянии и предотвращение агрегации ненативных белков чрезвычайно важно для выживания клеток в условиях абиотического стресса, обычно вызывающего дисфункцию белков. Изучение механизмов ответных реакций растений на стресс и их роль в индуцированной толерантности к стрессу постоянно привлекает внимание исследователей.

В данной работе впервые была обнаружена индукция хлоропластного Н8Р70В у мутантных штаммов СЫатус1отстаз гетЬагс1Ш с различной устойчивостью к окислительному стрессу, и выявлено участие этого белка в адаптивном ответе клеток дикого типа. При помощи вестерн-блот анализа были изучены девять мутантных штаммов и обнаружена корреляция между устойчивостью штаммов к окислительному стрессу и содержанием хлоропластных белков теплового стресса Н8Р70В. По-видимому, хлоропластный Н8Р70В/шаперон может участвовать в формировании устойчивости клеток к окислительному стрессу, а содержание хлоропластных НБР70В может служить маркером устойчивости клеток к окислительному стрессу совместно с другими маркерами, такими как активность ферментов антиоксидантной системы и содержание пигментов в хлоропластах.

Сравнительное исследование хлоропластных ШР70В/молекулярных шаперонов клеток дикого типа и клеток, чувствительных к УФ, показало, что ШР70В может служить ранним маркером окислительного стресса, индуцированного зеоцином. Это согласуется с представлениями о важной роли белков семейства Н8Р70 в защите организмов от окислительного стресса и их возможного использования в качестве ранних маркеров этого процесса (Типрепо й а1., 2008).

Адаптивный ответ клеток также играет важную роль в защите клеток от стрессовых воздействий. Нами впервые было изучено, защищает ли тепловая предобработка клеток С. гетНагЛН от стресса, вызванного радиацией. В частности, было исследовано, может ли тепловая предобработка подобно низким дозам радиации повышать уровень репарации двунитевых разрывов ДНК. Было обнаружено, что тепловая предобработка не меняет содержания двунитевых разрывов у С. геМагЛИ С\У15, при этом обнаружено также, что сама по себе тепловая обработка не вызывает двунитевых разрывов ДНК. Возможно, по этой причине и не функционировала репарационная

система, для чего требуется наличие повреждений ДНК. Эти результаты свидетельствуют о том, что тепловая обработка не влияет на репарационную способность ДНК у Chlamydomonas reinhardtii. Они хорошо согласуются с данными по зеоцин- и паракваг-инауцированному адаптивному ответу, в которых показано, что количество двунитевых разрывов ДНК, способное «запустить» адаптивный ответ, должно быть, по крайней мере, в 1,5 раза выше, чем у контрольных, не подвергшихся первичной обработке клеток (Chankova et al., 2005).

Молекулярный механизм действия теплового стресса на устойчивость клеток к стрессу, вызванному радиацией, до сих пор неизвестен. Есть несколько работ, указывающих на защитную роль HSP70 при гамма-излучении в фибробластах, костном мозге и тимоцитах мыши (Malyutina et al., 2005; Malyutina, Kabakov, 2007). Повышенная индукция внутриклеточных HSP70 может быть связана с повышенной радиоустойчивостью клеток млекопитающих. (Calini et al., 2003; Hunt et al., 2004).

Наши данные показали, что тепловая обработка (37-42 °С) является стрессовым фактором для С. reinhardtii, так как приводит к повышенной экспрессии белков HSP70B н HSP90C. Показано также, что повторная тепловая обработка приводит к дальнейшему накоплению этих хлоропластных шаперонов, что свидетельствует об индуцированной термоустойчивости. Отсутствие корреляции между повышенной экспрессией HSP70B к HSP90C и репарацией двунитевых разрывов ДНК служит аргументом и пользу предположения о том, что шаперонная и репарационная системы - независимые друг от друга защитные системы клеток С. reinhardtii. Полученные в работе данные указывают на то, что хлоропластные HSP/шапероны растений, определяющие клеточный гомеостаз и толерантность клеток, могут служить биохимическими маркерами устойчивости клеток к стрессу и ранними маркерами окислительного стресса.

Выводы

1. Впервые показано, что генотипы зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii с повышенной устойчивостью к окислительному стрессу характеризуются более высоким содержанием хлоропластных ЩР70В/шаперснов, которые могут служить маркерами устойчивости клеток к окислительному стрессу.

2. Повышенное содержание хлорофиллов и каротиноидов и высокая активность ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза, каталаза) у мутантов С. reinhardtii, более устойчивых к окислительному стрессу, также могут служить биохимическими маркерами устойчивости клеток С. reinhardtii к окислительному стрессу.

3. Хлоропластные белки HSP70B участвуют в формировании адаптивного ответа, индуцированного в клетках дикого типа С. reinhardtii тепловым или окислительным стрессом. Однако уровень адаптивного ответа не может быть использован в качестве маркера устойчивости, так как у устойчивых штаммов С. reinhardtii наблюдается более низкий уровень адаптивного ответа, чем у клеток дикого типа.

4. Шаперонная система С. reinhardtii принимает участие в защите клеток от окислительного стресса и не зависит от повреждений репарационной системы (мутанты UVS-10, UVS-14). Тепловая предобработка клеток С. reinhardtii (37 °С/30 мин, 42 °С/5 мин) не приводит к повышению уровня репарации двунитевых разрывов ДНК. По-видимому, HSP/шаперонная система пластид и репарационная система клетки функционируют у С. reinhardtii независимо.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах

1. Осипенкова О.В., Ермохина О.В., Белкина Г.Г., Фатгахов С.Г., Юрина Н.П. Влияние мелафена на экспрессию генов белков светового стресса хлоропластов Elipl и ЕИр2 у ячменя. Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т.44. №6. С. 701-708.

2. Chankova S.G., Yurina N.P., Dimova E.G., Ermohina O.V.. Oleskina Y.P., Dimitrova M.T., Bryant P.E. Pretreatment with heat does not affect double strand DNA rejoining in Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Thermal Biology. 2009.V. 34. №7. P.332-336.

3. О. В. Ермохина. Г.Г. Белкина, Ю.П, Олескина, С. Г. Фаттахов, Н. П. Юрина. Влияние мелафена на экспрессию шаперонного белка HSP70B хлоропластов и пигменты фотосинтеза в клетках Chlamydomonas reinhardtii. Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т.45., №5, С.612-617.

Статьи в сборниках

1. Епмохнна О.В., Юрина Н.П. Определение устойчивости к окислительному стрессу дикого и мутантных штаммов зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii путем их биохимической характеристики. Труды III Международного Симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Дубна. 2007. С. 135-138.

2. Ермохина О.В.. Дорофеев Ю.В., Димова Е.Г., Димитрова М.Т., Чанкова С.Г., Юрина Н.П. Индукция HSP70B и репарация двунитевых разрывов ДНК у Chlamydomonas reinhardtii. Сборник статей. Всероссийская конференция. Экотоксикология-2009. 26-30 октября 2009 г., Пущино - Тула. С.70-72.

3. О. Ermohina. Е. Dimova, М. Dlmitrova, S. Chankova, N. Yurina Different heat-stress response depending on the genotype of Chlamydomonas reinhardtii. Seminar of Ecology 2009. Proceedings , 2009, Izd. SUB, ISBN:978-954-397-015-5 Sofia, p. 159-167.

Тезисы докладов

1. Ermokhina O. Investigation of oxidative stress tolerance of green algae mutants Chlamydomonas reinhardtii.. Казань. 2006. The sccond international symposium "Signaling Systems of Plant Cells: Role in Adaptation and Immunity''. Kazan. 2006. C. 178.

2. Ермохина O.B. Сравнительная биохимическая характеристика дикого и муталтных штаммов зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii с различной устойчивостью к окислительному стрессу. Всероссийская конференция молодых ученых и II школа им. Академика Н.М. Эммануэля. «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты». Доклады и тезисы. Издательство Российского университета дружбы народов. Москва. 2006. С. 170-171.

3. Ермохина О.В.. Чанкова Ст., Юрииа Н.П. Определение устойчивости к окислительному стрессу дикого и мутантных штаммов зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii с помощью их биохимической характеристики. III международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященный 100-летию акад. Н.М. Сисакяна. Дубна. 2007. С. 36-37

4. Ермохина О.В.. Юрина Н.П. Устойчивость к окислительному стрессу и биохимическая характеристика мутантов Chlamydomonas reinhardtii. Международный симпозиум под эгидой Юнеско. «Проблемы биохимии, молекулярной, радиационной биологии и генетики». Ереван. 2007. С. 37-38.

5. Е. Dimova, P.Yonova, М. Dimitrova, О. Ermokhina. N.Yurina, A. Kujumdzieva, S. Chankova. Biochemical markers for oxidative stress in Chlamydomonas reinhardtii strains. Seminar of Ecology - 2009. 23-24 April 2009, Sofia. P.21.

6. O. Ermokhina. E. Dimova, M. Dimitrova, S. Chankova, N.Yurina. Different heat-stress response depending on the genotype of Chlamydomonas reinhardtii. Seminar of Ecology - 2009. 23-24 April 2009, Sofia. P.30.

7. O.B. Ермохина. Ю.П. Олескина, M. Димитрова, С. Чанкова, Н.П. Юрина. Роль генотипа в индукции хлоропластных шаперонов HSP70B и 1ISP90C Chlamydomonas reinhardtii. V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 2009, часть I, С. 24.

Работа была поддержана совместными научными проектами РАН и БАН «Биохимические маркеры устойчивости растений к окислительному стрессу» и «Молекулярные механизмы индуцированной устойчивости к окислительному стрессу у растений», Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российский фонд фундаментальных исследований (грант № 06-04-48923а).

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода ГвП - гваяколпероксидаза ДДС-Na - додецилсульфат натрия КАТ-катал аза

ПААГ - полиакриламидный гель

СОД - супероксиддисмутаза

трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ФМСФ - фенилметансульфонилфторид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

HSP - (heat shock protein) белки теплового стресса

ТАР среда - трис-ацетат-фосфатная среда

Отпечатано в типографии ООО чТипрософт" Ленинский пр-т. Д.37А Заказ №1310 от 05.05.10г. 1 печатный лист формат 60x90/16, тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ермохина, Ольга Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Окислительный стресс.

1.1.1. Образование АФК.

1.1.2. Удаление АФК.

1.1.3. АФК в ответных реакциях на биотические и абиотические стрессы.

1.2. Адаптивный ответ на стрессы

1.2.1. Молекулярные механизмы адаптивного ответа.

1.2.2. Адаптивный ответ на свет.

1.2.3. Фотосинтез и стресс, вызванный действием гербицидов и минеральных веществ.

1.2.4. Адаптивные ответные реакции на металлы.

1.3. Белки теплового шока (HSP).

1.3.1. Экспрессия генов HSP.

1.3.2. Семейства HSP, их функции.

1.3.2.1. Семейство HsplOO/Clp.

1.3.2.2. Семейство HSP90.

1.3.2.3. Семейство HSP70.

1.3.2.4. Семейство HSP60. Шаперонины.

1.3.2.5. Низкомолекулярные белки теплового шока (sHSP).

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Штаммы С. reinhardtii, использованные в работе.

2.2. Условия выращивания клеток Chlamydomonas reinhardtii.

2.3. Тепловая обработка клеток.

2.4. Обработка клеток зеоцином.

2.5. Обработка водорослей мелафеном.

2.6. Адаптивный ответ (адаптивная предобработка/повреждающая обработка), индуцированный паракватом.

2.7. Выделение суммарного белка.

2.8. Определение концентрации белка по методу Бредфорд.

2.9. Выделение белков тилакоидных мембран.

2.10. Электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг.

2.11. Определение активности ферментов.

2.12. Определение содержания двунитевых разрывов ДНК в клетках С reinhardtii.

2.13. Статистика.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Биохимическая характеристика мутантных штаммов Chlamydomonas reinhardtii.

3.2. Сравнение белков тилакоидных мембран у мутантов

Chlamydomonas reinhardtii.

3.3. Изучение тепловой индукции белков теплового стресса HSP70B у мутантов Chlamydomonas reinhardtii

3.4. Активность антиоксидантных ферментов в клетках дикого типа и мутантов С. reinhardtii.

3.5. Влияние мелафена на экспрессию HSP70B хлоропластов и пигменты фотосинтеза в клетках Chlamydomonas reinhardtii.о

3.6. Адаптивный ответ, индуцированный паракватом, у мутантных штаммов Chlamydomonas reinhardtii.

3.7. Влияние индукции HSP70B на репарацию двунитевых разрывов ДНК у Chlamydomonas reinhardtii.

3.8. Влияние тепловой предобработки на уровень двунитевых разрывов ДНК у Chlamydomonas reinhardtii.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Белки теплового шока HSP70B хлоропластов Chlamydomonas reinhardtii: связь с устойчивостью клеток к окислительному стрессу и репарацией ДНК"

Абиотические стрессы, такие как засуха, засоление, экстремальные температуры, токсичные соединения и др. наносят большой вред окружающей среде и являются серьезной угрозой для сельского хозяйства. Абиотические стрессы — основная причина потерь урожая в мире, среднее снижение урожайности для многих сельскохозяйственных растений достигает > 50%. Выяснение основных механизмов, участвующих в формировании устойчивости сельскохозяйственных растений и водорослей (как модельных объектов) к различным видам стресса имеет большое теоретическое и практическое значение. Прямым результатом действия стрессов является накопление в клетках токсичных соединений, прежде всего таких, как активные формы кислорода (АФК), которые приводят к развитию окислительного стресса, являющегося компонентом большинства других стрессов, ограничивающего способность растений использовать световую энергию при фотосинтезе.

Предполагают, что клетки растений воспринимают АФК через редокс-чувствительные факторы транскрипции, такие, например, как реактиватор связанных с азотным обменом пермеаз (NPR1) и факторы транскрипции белков теплового стресса (HSF), которые активируют экспрессию соответствующих генов (Mittler et al., 2004; Timperio et aL, 2008). У растений основными источниками образования АФК являются хлоропласты и пероксисомы. Протеомный анализ ответных реакций растений на абиотический стресс показал, что растения отвечают на различные стрессы сходным образом — индукцией белков теплового стресса (HSP), что указывает на сходство адаптивных механизмов у растений. Интересно, что у растений в большей степени, чем у животных, HSP защищают клетки от многих видов стресса. Кроме того, показана тесная связь метаболизма АФК и HSP, свидетельствующая о том, что в ходе эволюции растения достигли высокой степени контроля над токсичностью АФК и используют их также в качестве сигнальных молекул для контроля более специализированных процессов, таких как рост и защита растений, гормональный сигналинг и развитие (Suzuki, Mittler, 2006).

Устойчивость и адаптация растений к неблагоприятным факторам окружающей среды определяется индукцией защитных систем клетки (репарационной, антиоксидантной и др.) в ответ на стрессовые воздействия. Особое место среди защитных систем занимают HSP/молекулярные шапероны, являющиеся ключевыми компонентами клеточного гомеостаза как при оптимальных условиях роста, так и в условиях стресса (Wang et al., 2004). В клетках всех живых организмов в ответ на тепловой стресс или воздействие других стрессовых факторов индуцируется синтез HSP, которые помогают клеткам выжить в условиях стресса и вернуться к нормальной жизнедеятельности после его прекращения (Niu et al., 2006). Белки теплового шока являются одним из обязательных звеньев неспецифического ответа клеток на повреждение и особенно важны для клеток растений (Wang et al., 2004).

Высказываются предположения, что при адаптивном ответе HSP могут участвовать в репарации ДНК (Kang et al., 2002; Keszenman et al., 2004; Malyutina and Kabakov, 2007). Термин «адаптивный ответ» обычно означает, что воздействие относительно небольшого стресса (например, радиации) приводит через некоторое время к повышению устойчивости к тому же или другому виду стресса.

Среди различных семейств HSP особая роль в защите клеток от действия стрессов принадлежит белкам HSP70. Н8Р70/шаперонная система относительно хорошо изучена у бактерий и в большинстве компартментов эукариотической клетки (цитозоле, эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях). Однако об HSP70/nianepoHiiofi системе хлоропластов известно очень мало. Это кажется удивительным; так как хлоропласты являются тем компартментом, который обеспечивает превращение энергии света в энергию химических связей углеводов, что является основой жизни на земле. Большой интерес представляет изучение комплекса пластидных белков HSP70B и HSP90C, которые вместе с кошаперонными белками образуют «фолдосому» хлоропластов, играющую важную роль в защите растений от окислительного стресса (Schroda. Muehaus, 2009). Белок HSP70B играет важную роль в защите и репарации фотосистемы 2 при фотоингибировании (Schroda, 2004).

В этой связи очень актуальным является изучение возможной функции HSP/молекулярных шаперонов хлоропластов как маркеров устойчивости клеток к окислительному стрессу, а также выяснение того, участвуют ли эти белки в репарации двунитевых разрывов ДНК. Удобным объектом для таких исследований являются клетки одноклеточной зеленой водоросли С. reinhardtii, у которой секвенированы все клеточные геномы. Большая часть исследований, посвященных устойчивости растительных организмов к стрессу и поиску маркеров устойчивости, проводится на чувствительных к стрессу штаммах водорослей. Работ, выполненных на устойчивых к окислительному стрессу штаммах, мало, поэтому в работе были использованы мутантные штаммы Chlamydomonas, обладавшие разной устойчивостью к окислительному стрессу и радиации (Dimova et al., 2008).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ермохина, Ольга Викторовна

Выводы

Н8Р70В/шаперонов, которые могут служить маркерами устойчивости клеток к окислительному стрессу.

Заключение

Сохранение белков в их функциональном состоянии и предотвращение агрегации негативных белков чрезвычайно важно для выживания клеток в условиях абиотического стресса, обычно вызывающего дисфункцию белков. Изучение механизмов ответных реакций растений на стресс и их роль' в индуцированной толерантности к стрессу постоянно привлекают внимание исследователей.

В данной работе впервые была обнаружена индукция хлоропластного HSP70B у мутантных штаммов Chlamydomonas reinhardtii с различной устойчивостью к окислительному стрессу, и выявлено участие этого белка в адаптивном ответе клеток дикого типа. При помощи вестерн-блот анализа были изучены девять мутантных штаммов и обнаружена корреляция между устойчивостью штаммов к окислительному стрессу и содержанием хлоропластных белков теплового стресса HSP70B. По-видимому, хлоропластный HSP70B/inanepoH может участвовать в формировании устойчивости клеток к окислительному стрессу, а содержание хлоропластных HSP70B может служить маркером устойчивости клеток к окислительному стрессу совместно с другими маркерами, такими кяк активность ферментов антиоксидантной системы и содержание пигментов в хлоропластах.

Сравнительное исследование хлоропластных Н8Р70В/молекулярных шаперонов клеток дикого типа и клеток, чувствительных к УФ, показало, что HSP70B может служить ранним маркером окислительного стресса, индуцированного зеоцином. Это согласуется с представлениями о важной роли белков семейства HSP70 в защите организмов от окислительного стресса и их возможного использования в качестве ранних маркеров этого процесса (Timperio et al., 2008).

Адаптивный ответ клеток также играет важную роль в защите клеток от стрессовых воздействий. Нами впервые было изучено, защищает ли тепловая предобработка клеток С. reinhardtii от стресса, вызванного радиацией. В частности, было исследовано, может ли тепловая предобработка подобно низким дозам радиации повышать уровень репарации двунитевых разрывов ДНК. Было обнаружено, что тепловая предобработка не меняет содержания двунитевых разрывов у С. reinhardtii CW15, при этом обнаружено также, что сама по себе тепловая обработка не вызывает двунитевых разрывов ДНК. Возможно, по этой причине и не функционировала репарационная система, для чего требуется наличие повреждений ДНК. Эти результаты свидетельствуют о том, что тепловая обработка не влияет на репарационную способность ДНК у Chlamydomonas reinhardtii. Они хорошо согласуются с данными по зеоцин- и паракват-индуцированному адаптивному ответу, в которых показано, что количество двунитевых разрывов ДНК, способное «запустить» адаптивный ответ, должно быть, по крайней мере, в 1,5 раза выше, чем у контрольных, не подвергшихся первичной обработке клеток (Chankova et al., 2005).

Молекулярный механизм действия теплового стресса на устойчивость клеток к стрессу, вызванному радиацией, до сих пор неизвестен. Есть несколько работ, указывающих на защитную роль HSP70 при гаммаизлучении в фибробластах, костном мозге и тимоцитах мыши (Malyutina et al., 2005; Malyutina, Kabakov, 2007). Повышенная индукция внутриклеточных HSP70 может быть связана с повышенной радиоустойчивостью клеток млекопитающих. (Calini et al., 2003; Hunt et al., 2004).

Наши данные показали, что тепловая обработка (37°, 42°С) является стрессовым фактором для С. reinhardtii, так как приводит к повышенной экспрессии белков HSP70B и HSP90C. Показано также, что повторная тепловая обработка приводит к дальнейшему накоплению этих хлоропластных шаперонов, что свидетельствует об индуцированной термоустойчивости. Отсутствие корреляции между повышенной экспрессией HSP70B и HSP90C и репарацией двунитевых разрывов ДНК служит аргументом в пользу предположения о том, что шаперонная и репарационная системы - независимые друг от друга защитные системы клеток С. reinhardtii. Полученные в работе данные указывают на то, что хлоропластные HSP/шапероны растений, определяющие клеточный гомеостаз и толерантность клеток, могут служить биохимическими маркерами устойчивости клеток к стрессу и ранними маркерами окислительного стресса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ермохина, Ольга Викторовна, Москва

1. Жигачева И.В., Фаткуллина Л.Д., Русина И.Ф., Шугаев А.Г., Генерозова И.П., Фаттахов С.Г., Коновалов А.И. Антистрессовые свойства препарата «мелафен». Докл. РАН. 2007. Б. Т. 414. С. 263-265.

2. Жигачева И.В., Фаткуллина Л.Д., Шугаев А.Г., Фаттахов С.Г., Резник B.C., Коновалов А.И. Препарат мелафен и энергетический статус клеток растительного и животного происхождения. Докл. РАН. 2006. Т. 409. С. 123-125.

3. Кашина О.А., Фаттахов С.Г., Лосева Н.Л., Коновалов А.И., Гордон Л.Х., Алябьев А.Ю., Резник B.C. Сравнительное изучение влияния мелафена и кинетина на рост и энергетические процессы растительной клетки. Докл. РАН. 2005. Т. 405. С. 123-124.

4. Козлова Р.Ю., Винтер В.Г., Фаттахов С.Г., Резник B.C., Коновалов А.И. Меламиновая соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты (мелафен) какрегулятор специализированного обмена раувольфии змеевидной. Докл. РАН. 2005. Т. 401. С. 556-559.

5. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. М. Высш.шк. 2005.

6. Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу. Соровский образовательный журнал. 1997

7. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи современной химии. 2003. Т. 43. С. 5998.

8. Патент РФ. 2000. № 2158735.

9. Пескин А.В., Столяров С.Д. Окислительный стресс как критерий оценки окружающей среды. Изв. АН. Сер. биол. №4. 1994. С. 588-593.

10. Фаттахов С.Г., Лосева Н.Л., Коновалов А.И., Резник B.C., Алябьев А.Ю., Гордон Л.Х., Трибунских В.И. Влияние мелафена на рост и энергетические процессы растительных тканей. Докл. РАН. 2004. Т. 394. С. 127-129.

11. Adam A., Farkas Т., Somlyai G., Hevesi М., Kiraly Z. Physiol. Mol. Plant Pathol. 1989. V. 34. P. 13-26.

12. Adams M., Savino E., Freeman M. Timing and induction of hsp70 production in Chlamydomonas reinhardtii. Biology. 1994. V. 49. P. 623628.

13. Aro E.M., McCaffery S., Anderson J.M. Photoinhibition and D1 protein degradation in peas acclimated to different growth irradiances. Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 835-843.

14. Asad, N.R., Asad, L.M.B.O., de Almeida, C.E.B., Felzenszwalb, I., Cabral-Neto, J.B., Leitao, A.C., Several pathways of hydrogen peroxide action that damage the E. coli genome. Gen. Mol. Biol. 2004. V. 27. P. 291-303.

15. Asada K. and Takahashi M. Production and scavenging of active oxygen in photosynthesis. Photoinhibition. 1987. P. 227-287

16. Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 601-639

17. Baninal S.K., Bharti K., Chan K.Y. et al. Heat stress response in plants: a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors. J. Biosci. 2004. V.29. P. 471-487

18. Banzet N., Richaud C., Deveaux Y., Kazmaier M., Gagnon J., Triantaphylides C. Accumulation of small heat shock proteins, including mitochondrial HSP22, induced by oxidative stress and adaptive response in tomato cells. Plant J. 1998. V. 13. P. 519-527.

19. BeckB.D., Dynlacht J.R. Heat-induced aggregation ofXRCC5 (Ku80) in nontolerant and thermotolerant cells. Riadiat. Res. 2001. V. 156. P. 767-774.

20. Behra R. In vitro effects of cadmium, zinc and lead on calmodulin-dependent actions in Oncorhyncus mykiss, Mytilus sp., and Chlamydomonas reinhardtii. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1993. V. 24. P. 21-27.

21. Beuchamp С. H., Fridovich I. Anal. Biochem. 1971. V. 44. P. 276-287.

22. Biryukova E.N., Medentsev A.G., Arinbasarova A.Yu, Akimenko V.K. Tolerance of the yeast Yarrowia lipolytica to oxidative stress Article in Russian. Mikrobiologiia. 2006. V. 75.P. 293-298.

23. Boreham D.R., Mitchel R.E. DNA repair in Chlamydomonas reinhardtii induced by heat shock and gamma radiation. Radiat Res. 1993. V. 135. P. 365-371.

24. Boston R.S., Viitanen P.V., Vierling E. Molecular chaperones and protein folding in plants. Plant Mol Biol. 1996. V. 32. P. 191-222.

25. Brychzy A., Rein Т., Winklhofer K.F., Hartl F.U., Young J.C., Obermann W.M. Cofactor Tpr2 combines two TPR domains and a J domain to regulate the Hsp70/Hsp90 chaperone system. EMBO J. 2003. V. 22. P. 3613-3623.

26. Buttner M., Xie D-L., Nelson H., Pinther W., Hauska G., Nelson N. Photosynthetic reaction center genes in green sulfur bacteria and in photosystem I are related. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 81358139.

27. Calini V., Urani C., Camatini M. Over-expression of HSP70 is induced by ionizing radiation in 10T1/2 cells and protects from DNA damage. Toxicol. In Vitro. 2003. V. 17. P. 561-566.

28. Cao D., Froehlich J.E., Zhang H., Cheng C.L. The chlorate-resistant and photomorphogenesis-defective mutant cr88 encodes a chloroplast-targeted HSP90. Plant J. 2003. V. 33. P. 107-118.

29. Caplan A. Revulsion is simply not enough: the impending culture war over advances in genetics. АРА Newsl Philos Med. 2003. V. 2. P. 206-209.

30. Chankova G.S., Matos J.A., Simoes F., Bryant P.E. Adaptive response of a new radioresistant strain of Chlamydomonas reinhardtii and correlation with increasad DNA double-strand break rejoining. Int J Radiat Biol. 2005a. V. 81. P. 509-514.

31. Chankova S., Stoyanova-Koleva D., Kapchina-Toteva V., Bryant P. 20056. Characterisation of new radioresistant strains of Chlamydomonas reinhardtii. J. Environ Prot Ecol. V. 6. P. 660-668.

32. Chankova S., Sulzbach S., Diop F. Impact of mutual health organizations: evidence from West Africa. Health Policy Plan. 2008. V. 23. P. 264-276.

33. Chankova S.G., Bryant P.E. Acceleration of DNA-double strand rejoining during the adaptive response of Chlamydomonas reinhardtii. Radiat. Biol. Radioekol. 2002. V. 42. P. 600-603.

34. Chankova S.G., Matos J.A., Simoes F., Bryant P.E. Adaptive response of a new radioresistant strain of Chlamydomonas reinhardtii and correlation with increased DNA double-strand break rejoining. Int. J. Radiat. Biol. 2005. V. 81. P.509-514.

35. Collard J-M., Matagne R. Isolation and genetic analysis of Chlamydomonas reinhardtii strains resistant to cadmium. Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 2051-2055.

36. Corpas F .J. et al. Peroxisomes as a source of reactive oxygen species and nitric oxide signal molecules in plant cells. Trends Plant Sci. 2001. V. 6. P. 145-150

37. Crawford, D.R., Davies, K.J.A., Adaptive response and oxidative stress. Environ. Health Persp. 1994. V. 12. P. 25-28.

38. Creissen G. et al. Elevated glutathione biosynthetic capacity in the chloroplasts of transgenetic tobacco plants paradoxically causes increased oxidative stress. Plant Cell. 1999 V. 11. P.1277-1292

39. Dannehl H., Wietoska H., Heckmann H., Godde D. Changes in D1 protein turnover and recovery of photosystem II activity precede accumulation of chlorophyll in plants after release from mineral stress. Planta. 1996. V. 199. P. 34-42.

40. Decker L.A. Peroxidase. In: Worthington enzyme manual. Worthington biochemical corp. 1997. P. 66-70.

41. Delauney A. et al. Н2Ог sensing through oxidation of the Yapl transcription factor. EMBO J. 2000 V. 19. P. 5157-5166

42. Delledonne M. et al. Signal interactions between nitric oxide and reactive oxygen intermediates in the plant hypersensitive disease resistance response. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. V. 98. P. 13454-13459

43. Demmig-Adams В., Gilmore A.M., Adams III W.W. In vivo functions of carotenoids in higher plants. FASEB J. 1996. V. 10. P. 403-412.

44. Depka В., Jahns P., Trebst A. p-Carotene to zeaxanthin conversion in the rapid turnover of the D1 protein of photosystem II. FEBS Lett. 1998. V. 424. P. 267-270.

45. Desikin R. et al. Regulation of the Arabidopsis transcriptosome by oxidative stress. Plant Physiol. 2001. V. 127. P. 159-172

46. Dimova E.G., Bryant P.E., Chankova S.G. «Adaptive response» Some underlying mechanisms and open questions. Gen. Mol. Biology. 2008. V. 31. P. 396-408.

47. Dong Z., Ни H., Chen W., Li Z., Liu G., Yang J. Heat shock does not induce yH2AX foci formation but protected cells from N-methyl-N-nitro-N-nitrosiguanidine induced genotoxicity. Mutat. Res. 2007. V. 629. P. 40-48.

48. Drzymalla C, Schroda M, Beck CF. Light-inducible gene HSP70B encodes a chloroplast-localized heat shock protein in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Mol Biol. 1996. V. 31. P. 1185-1194.

49. Ederli L., Pasqualini S., Batini P., Antonielli M. Photoinhibition and oxidative stress: effects on xantophyll cycle, scavenger enzymes and abscisic content in tobacco plants. J. Plant Physiol. 1997. V. 151. P. 422428.

50. Erickson J.M., Rahire M., Malnoe P., Girard-Bascou J., Pierre Y., Bennoun P., Rochaix J-D. Lack of the D2 protein in a Chlamydomonas reinhardtii psbD mutant affects photosystem П stability and D1 expression. EMBO J. 1986. V. 5. P. 1745-1754.

51. Escoubas J.M., Lomas M., LaRoche J., Falkowski P.G. Light intensity regulation of cab gene transcription is signaled by the redox state of the plastoquinone pool. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 1023710241.

52. Ferris P., Goodenough U.W. The mating-type locus of Chlamydomonas reinhardtii contains highly rearranged DNA sequences. Cell. 1994. V. 76. P. 1135-1145.

53. Frydman J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu Rev Biochem. 2001. V. 70. P. 603-647.

54. Fuchs'G., Stupperich E., Eden'G. Autotrophic C02 fixation in Chlorobium limicola. Evidence for the operation of a reductive tricarboxylic acid cycle in growing cells. Arch. Microbiol. 1990. V. 128. P. 64-71.

55. Gagne G., Guertin M. The early genetic response in the green unicellular alga Chlamydomonas eugametos grown under light/dark cycles involves genes that represent direct responses to light and photosynthesis. Plant. Mol. Biol. 1992. V. 18. P. 429-445.

56. Garvey J.E., Owen H.A., Winner R.W. Toxicity of copper to the green alga, Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyceae), as affected by humic substances of terrestrial and freshwater origin. Aquat. Toxicol. 1991. V. 19. P. 89-96.

57. Girigoswami, B.K., Ghosh, R. Response to gamma-irradiation in V79 cells conditioned by repeated treatment with low doses of hydrogen peroxide. Radiat Environ Biophys. 2005. V. 44. P. 131-137.

58. Goodenough U.W., Shames В., Small L., Saito Т., Crain R.C., Sanders M.A., Salisbury J.L. The role of calcium in the Chlamydomonas reinhardtii mating reaction. J. Cell Biol. 1993. V. 121. P. 365-374.

59. Grant J J. and Laoke G.J. Role of reactive oxygen intermediates and cognate redox signaling in disease resistansce. Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 21-29

60. Halliwell В., Gutteridge JMC. Free Radicals in Biology and Medicine. London: Clarendon Press. 1995.

61. Halperin Т., Zheng В., Itzhaki H., Clarke A.K., Adam Z. Plant mitochondria contain proteolytic and regulatory subunits of the ATP-dependent Clp protease. Plant Mol Biol. 2001. V. 45. P. 461-468.

62. Harris E.D. Regulation of antioxidant enzymes. FASEB J. 1992. V.6. P. 2675-2683.

63. Harris E.H. The Chlamydomonas Source Book. A Comprehensive Guide to Biology and Laboratory Use. London: Academic Press. 1989.

64. Hartl F-U, Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science. 2002. V. 295. P. 1852-1858.

65. Hemmingsen S.M., Homologous plant and bacterial proteins chaperone oligomeric protein assembly. Nature. 1988. V.333. P.330-334

66. Hendrick J.P., Haiti F.U. Molecular chaperone functions of heat- shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 1993. V. 62. P. 349-384.

67. Henzier T. and Steudle E. Transport and metabolic degradation of hydrogen peroxide in Chara corallina: model calculations and measurements with the pressure probe suggest transport of H202 across water channels. J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 2053-2066

68. НШ K., Hassett R., Kosman D., Merchant S. Regulated copper uptake in Chlamydomonas reinhardtii in responses to copper availability. Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 697-704.

69. Hofseth LJ. The adaptive imbalance to genotoxic stress: Genome guardians rear their ugly heads. Carcinogenesis. 2004. V. 25. P. 1787-1793.

70. Howe G., Merchant S. Heavy metal-activated synthesis of peptides in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 127-136.

71. Huang В., Xu C., Identification and characterization of proteins associated with plant tolerance to heat stress. J. Integr. Plant Biol. 2008. V. 50. P. 12301237.

72. Jamieson D.J. The effect of oxidative stress on Saccharomyces cerevisiae. Redox Report. 1995. V. 1. P. 89-95.

73. Jovtchev G., Stergios M., Rieger R., Michaelis A. Effects of the topoisomerase I inhibitor camptothecin on the heat shock-triggered adaptive, response to maleic hydrazide (MH) in Hordeum vulgare. Biol. Zbl. 1993. V. 112. P. 365-372.

74. Kamal A., Thao L., Sensintaffar J., Zhang L., Boehm M.F., Fritz L.C., Burrows F.J. A high-affinity conformation of Hsp90 confers tumour selectivity on Hsp90 inhibitors. Nature. 2003. V. 425. P. 407-410.

75. Kaneko H., Igarashi K., Kataoka K., Miura M. Heat shock induces phosphorylation of histone H2AX in mammalian cells. Biochem. Bioph. Res. Co. 2005. V. 328. P. 1101-1106.

76. Kang C.M., Park K.P., Cho C.K., Seo, J.S., Park W.Y., Lee S.J., Lee Y.S., Hspa4 (HSP70) is involved in the radioadaptive response: results from mouse splenocytes. Radiat. Res. 2002. V. 157. P. 650-655.

77. Karpinska B. et al. Antagonistic effects of hydrogen peroxide and glutathione on acclimation to excess excitation energy in Arabidopsis. JUBMB Life. 2000. V. 50. P. 21-26

78. Kato M., Shimizu S. Can. J. Bot. 1987. V. 65. P. 729-735.

79. Keszenman D. J., Candreva E.C., Sanchez A.G., Nunes E. RAD6 gene is involved in heat shock induction of bleomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae.Jimxron. Mol. Mutagen. 2004. V. 45. P. 36-43.

80. Keszenman D.J., Candreva E.C., Nunes E. Cellular and molecular effects of bleomycin are modulated by heat shock in Saccharomyces cerevisiae. Mutat. Res. 2000. V. 459. P. 29-41.

81. Keszenman D.J., Santos J.F., Boeira J.M., Saffi J., Henriques J.A.P., Heat shock changes the response of the pso3 mutant of Saccharomyces cerevisiae to 8-methoxypsoralen photoaddition. Curr. Genet. 1994. V. 26, P. 100-104.

82. Kindle K.L. High frequency nuclear transformation of Chlamydomonas reinhardtii. Proc. Natl. Acad. Sci: USA. 1990. V. 87. P. 1228-1232.

83. Klessig D.F. et al. Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. V. 97. P. 8849-8855

84. Kristiansen K.A., Jensen P.E., Moller I.M., Schulz A. Monitoring reactive oxygen species formation and localisation in living cells by use of the fluorescent probe CM-H(2)DCFDA and confocal laser microscopy. Physiol. Plant. 2009. V. 136. P. 369-383.

85. Kropat J., Oster U., Riidiger W., Beck C.F. Chlorophyll precursors are signals of chloroplast origin involved in light induction of nuclear heat shock genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 14168-14172.

86. Kropat J., von Gromoff E.D., Muller F.W., Beck C.F. Heat shock and light activation of Chlamydomonas HSP70 gene are mediated by independent regulatory pathways. Mol. Gen. Genet. 1995. V. 248. P. 727734.

87. Laloi C., Przybyla D., Apel K. A genetic approach towards elucidating the biological activity of different reactive oxygen species in Arabidopsisthaliana. J. Exp. Bot. 2006. V. 57. P. 1719-1724.

88. Lam E. et al. Programmed cell death, mitochondria and the plant hypersensitive response. Nature. 2001. V. 411. P. 848-853

89. Larkindale J., Vierling E. Core genome responses involved in acclimation to high temperature. Plant Physiol. 2008. V.146. P. 748-761.

90. Ledford H.K., Chin B.L., Niyogi K.K. Acclimation to singlet oxygen stress in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic Cell. 2007. V. 6. P. 919930.

91. Ledford H.K., Chin B.L., Niyogi K.K. Acclimation to singlet oxygen stress in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic Cell. 2007. V. 6. P. 919930.

92. Lee G.J., Roseman A.M., Saibil H.R., Vierling E. A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state. EMBO J. 1997. V. 16. P. 659-671.

93. Lee S., Owen H.A., Prochaska D.J., Barnum S.R. HSP 16.6 is involved in the development of thermotolerance and thylakoid stability in the unicellular cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Curr Microbiol. 2000. V. 40. P. 283-287.

94. Lee H.J., Kang C.M., Kim S.R., Kim J.C., Bae C.S., Oh K.S., Jo S.K., Kim Т.Н., Jang J.S., Kim S.H. The micronucleus frequency in cytokinesis-blocked lymphocytes of cattle in the vicinity of a nuclear power plant. J Vet Sci. 2007. V. 8. P. 117-120.

95. Leonard B.E. Adaptive response and human benefit: Part I. A microdosimetry dose-dependent model. Int. J. Radiat. Biol. 2007. V. 83. P. 115-131.

96. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes. Meth. Enz. V. 148.

97. Lichtenthaler H.K. The stress concept in plants: an introduction. Ann. New York Acad. Sci. 1998. V. 851. P. 187-198.

98. Liu S.Z. On radiation hormesis expressed in the immune system. Crit Rev Toxicol. 2003. V. 33. P. 431-441.

99. Lopez-Huertas E. et al. Stress induces peroxisome biogenesis genes. EMBO J. 2000. V. 19. P. 6770-6777

100. Lupu A., Nevo E., Zamorzaeva I., Korol A., Ecological-genetic feedback in DNA repair in wild barley Hordeum spontaneum. • Genetika. 2006. V. 127. P. 121-132.

101. Macfie S.M., Tarmohamed Y., Welbourn P.M. Effects of cadmium, cobalt, copper, and nickel on growth of the green alga Chlamydomonas reinhardtii: The influences of the cell wall and pH. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1994. V. 27. P. 454-458.

102. Maliutina la. V., Kabakov A.E. Preirradiation heat shock protein induction increases cellular radioresistance. Radiat. Biol. Radioekol. 2007. V. 47. P. 273-279.

103. Malyutina Y.V., Makarova Y.M., Semenets T.N., Semina O.V., Mosin A.F., Kabakov A.E. Whole body hyperthermia in mice confers heat shock protein-dependent radioresistance of their bone marrow and thymocytes. J. Therm. Biol. 2005. V.30. P. 511-517.

104. Marples В., Wouters B.G., Collis S.J., Chalmers A.J., Joiner M.C. Low-dose hyper-radiosensitivity: a consequence of ineffective cell cycle arrest of radiation-damaged G2-phase cells. Radiat Res. 2004. V. 161. P. 247-255.

105. Martin R.E., Thomas D.J., Tucker D.E., Herbert S.K. The effects of photooxidative stress on photosystem I measured in vivo in Chlamydomonas. Plant Cell Environ. 1997. V. 20. P. 1451-1461.

106. Matsumoto H., Takahashi A., Ohinishi T. Radiation-induced adaptive response and bystander effects. Biol. Sci. Space. 2004. V. 18. P. 247-254.

107. Mendez-Alvarez S., Leisinger U., Eggen R.I.L. Adaptive responses in Chlamydomonas reinhardtii. Int. Microbiol. 1999. V. 2. P. 15-22.

108. Mendoza I., Rubio F., Rodriguez-Navarro A., Pardo J.M. The protein phosphatase calcineurin is essential for NaCl tolerance of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 8792-8796.

109. Merchant S., Hill K., Howe G. Dynamic interplay between two copper-titrating components in the transcriptional regulation of cyt сб. EMBOJ. 1991. V. 10. P. 1383-1389.

110. Miernyk J.A. Protein folding in the plant cell. Plant Physiol. 1999. V. 121. P. 695-703.

111. Mitsuhara I. et al. Animal cell-death suppressors Bcl-xL and Ced-9 inhibit cell death in tobacco plants. Curr. Biol. 1999. V. 9. P. 775-778

112. Mittler R. et al. Transgenic tobacco plants with reduced capability to detoxify reactive oxygen intermediates are hyper-responsive to pathogen infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. V. 96. P.14165-14170

113. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. 2002. V. 7. P. 405-410

114. Monod C., Takahashi Y., Goldschmidt-Clermont M., Rochaix J.D. The chloroplast ycf8 open reading frame encodes a photosystem II polypeptide which maintains photosynthetic activity under adverse growth conditions. EMBO J. 1994. V. 13. P. 2747-2754.

115. Moore M.M., Breedveld M.W., Autor A.P. The role of carotenoids in preventing oxidative damage in the pigmented yeast, Rhodotorula mucilaginosa. Arch. Biochem. Biophys. 1989. V. 270. P. 419-431.

116. Narberhaus F. Alpha-crystallin-type heat shock proteins: socializing minichaperones in the context of a multichaperone network. Microbiol Mol Biol Rev. 2002. V. 66. P. 64-93.

117. Nickelsen J., van Dillewijn J., Rahire M., Rochaix J.D. Determinants • for stability of the chloroplast psbD RNA are located within its short leader region in Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 1994. V. 13. P. 3182-3191.

118. Nikolova, Т., Petkova, S. Heat shock protection against induction of chromatid aberrations by triethylenemelamine in cultured human lymphocytes as affected by caffeine and novobiocin. Biol. Zbl. 1993. V. 112. P. 373-378.

119. Niyogi K.K., Bjorkman О., Grossman R. The roles of specific xanthophylls in photoprotection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 14162-14167.

120. Otsuka К., Koana Т., Tauchi H. and Sakai K. Activation of antioxidative enzymes induced by low-dose-rate wholebody gamma irradiation: Adaptive response in terms of initial DNA damage. Radiat Res. 2006. V. 166. P. 474-478.

121. Polidoros A.N. et al. Transgenic tobacco plants expressing the maize Cat2 gene have altered catalase levels that affect plant-pathogen interactions and resistance to oxidative stress. Transgenic Res. 2001. V. 10. P. 555-569

122. Polle A. Dissecting the superoxide dismutase-ascorbate peroxidase-glutathione pathway in chloroplasts by metabolic modeling. Computer simulations as a step towards flux analysis. Plant Physiol. 2001. V. 126. P. 445-462

123. Prade L., Huber R., Bieseler B. Structures of herbicides in complex with their detoxifying enzyme glutathione S-transferase-explanation for the selectivity of the enzyme in plants. Structure. 1998. V. 6. P. 1445-1452.

124. Prasil O., Adir N., Ohad I. Dynamics of Photosystem II. Mechanism of Photoinhibition and Recovery Processes. Ed. J. Barber. Amsterdam: Elsevier Sci. Publ., 1992. P. 295- 348.

125. Prieto R., Pardo J.M., Niu X., Bressan R.A., Hasegawa P.M. Salt-sensitive mutants of Chlamydomonas reinhardtii isolated after insertional tagging. Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 99-104.

126. Ritossa F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1996. V. 1. P. 97-98.

127. Ritossa, F. A new puffing pattern induced by temperature shock and dnp in drosophila. Experientia. 1962. V. 18. P. 571-573.

128. Robson Т., Joiner M.C., Wilson G.D., McCullough W., Price M.E., Logan I., Jones H., McKeown S.R., Hirst D.G. A novel human stress response-related gene with a potential role in induced radioresistance. Radiat Res. 1999. V. 152. P. 451-461.

129. Rochaix J-D. Chlamydomonas reinhardtii as the photosynthetic yeast. Annu. Rev. Genet. 1995. V. 29. P. 209-230.

130. Rohankhedkar M.S., Mulrooney S.B., Wedemeyer W.J., Hausinger R.P. The AidB component of the Escherichia coli adaptive response to alkylating agents is a flavin-containing, DNA-binding protein. J Bacteriol. 2006. V. 188. P. 223-230.

131. Santoro N., Johansson N., Thiele D.J. Heat shock element architecture is an important determinant in the temperature and transactivation domain requirements for heat shock transcription factor. Mol. Cell Biol. 1998. V. 18. P. 6340-6352

132. Schroda M. The Chlamydomonas genome reveals its secrets: chaperone genes and the potential roles of their gene products in the chloroplast. Photosynthesis Res. 2004. V. 82. P. 221-240.

133. Schroda M., Vallon O., Wollman F.A. Beck C.F. A chloroplast targeted heat schock protein 70 (HSP 70) contributes to the photoprotection and repair of photosystem II during and after photoinhibition. Plant Cell. 1999, V. 11. P. 1165-1178.

134. Schuster G., Even D., Kloppstech K., Ohad I. Evidence for protection by heat-shock proteins against photoinhibition during heat shock. EMBO J. 1988. V. 7. P. 1-6. ;

135. Shimada Y. Heat-shock induction of radiation resistance in primordial germ cells of the fish Oryzias latipes. Int. J. Radiat. Biol. 1985. V. 48. P. 189-196.

136. Stauber E. J., Hippie M. Chlamydomonas reinhardtii proteomics. Plant Physiol. andBiochem. 2004. V. 42. P. 989 -1001.

137. Swindell W.R., Huebner M., Weber A.P. Transcriptional profiling of Arabidopsis heat shock proteins and transcription factors reveals extensive overlap between heat and non-heat stress response pathways. BMC Genomics. 2007. V.8. P. 125-134.

138. Taddei F., Vulic M., Radman M., Matic I. Stress and mutagenesis in bacteria. In: Bijlsmak В., Loeschcke V (eds) Environmental Stress, Adaptation and Evolution. Basel: Birkhauser Verlag. 1997. P. 273-292.

139. Takahashi A., Matsumoto H., Nagayama K., Kitano M., Hirose S., Tanaka H., Mori E., Yamakawa N., Yasumoto J., Ohnishi Т., Evidence for the involvement of double-strand breaks in heat-induced cell killing. Cancer Res. 2004. V. 64. P. 8839-8845.

140. Takahashi A., Mori E., Ohnishi Т., Phospho-Nbsl and Mrel 1 proteins which recognize DSBs co-localize with gH2AX in the nucleus after heat' treatment. Ann. Cancer Res. Ther. 2007. V. 15. P. 50-53.

141. Tang H.W., Liang H.R., Zhuang Z.X. and He Y. Low concentration of hydropuinone-induced adaptive response in hPARP-1 protein normal and deficient cells Article in Chinese. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 2005. V. 23. P. 274-277.

142. Timperio A.M., Egidi M.G., Zolla L. Proteomics applied on plant abiotic stresses: role of heat shock proteins (HSP). J. Proteomics. 2008. V. 7. P. 391-411.

143. Tissieres A., Mitchell H.K., Tracy U.M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. J Mol Biol. 1974. V. 84. P. 389-398.

144. Vlcek D., Podstavkova S., Miadokova E., Adams G.M., Small G.D. General characteristics, molecular and genetic analysis of two new UV-sensitive mutants of Chlamydomonas reinhardtii. Mutat Res. 1987. V. 183. P. 169-175.

145. Von Gromoff E.D., Treier U., Beck C.F. Three light-inducible heat-shock genes of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cel. Biol. 1989. V. 9. P. 3911-3918.

146. Vranova E., Inze D., Van Breusegem F. Signal transduction during oxidative stress. J. Experimental Bot. 2002. V. 53. P. 1227-1236.

147. Wang W., Vinocur В., Shoseyov O., Altman A. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response. Trends Plant Sci. 2004. V. 9. P. 244-252.

148. Willekens H., Chamnongpol S., Davey M., Schraudner M., Langebartels C., Van Montagu M., Inze D., Van Camp W. Catalase is a sink for H2O2 and is indispensable for stress defence in C-3 plants. EMBO J. 1997. V. 16. P. 4806-4816.

149. Willmund F., Schroda M. Heat shock protein 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 2005. V. 138. P. 2310-2322.

150. Yan G., Hua Z., Du G., Chen J., Adaptive response of Bacillus sp. F26 to hydrogen peroxide and menadione. Curr. Microbiol. 2006. V. 52, P. 238242.

151. Yoshimura K. et al. Expression of spinach ascorbate peroxidase isoenzymes in response to oxidative stresses. Plant Physiol. 2000. V. 123. P. 223-234.

152. Yurina N.P., Kloppstech K. Accumulation of plastid protein precursors under norflurazon- induced carotenoid deficiency and oxidative stress in barley. Plant Physiol. Biochem. 2001. V. 39. P. 807-814

153. Zheng В., Halperin Т., Hruskova-Heidingsfeldova O., Adam Z., Clarke A.K. Characterization of Chloroplast Clp proteins in Arabidopsis: Localization, tissue specificity and stress responses. Physiol Plant. 2002. V. 114. P. 92-101.

154. Zimmer W.E., Schloss J.A., Silflo C.D., Youngblom J., Watterson D.M. Structural organization, DNA sequence, and expression of the calmodulin gene. J. Biol. Chem. 1988. V. 25. P. 19370-19383.

155. Zhou H., Randers-Pehrson G., Waldren C.A., Hei Т.К. Radiation-induced bystander effect and adaptive response in mammalian cells. Adv Space Res. 2004. V. 34. P. 1368-1372.1. БЛАГОДАРНОСТИ

156. Хотелось бы высказать искреннюю благодарность к.х.н. Саитгарей Галяувичу Фаттахову (ИОФХ КНЦ РАН, Казань) за возможность использования мелафена.

157. Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (№ 06-04-48923а), программой Российской Академии Наук «Клеточная и молекулярная биология».

Информация о работе

Ермохина, Ольга Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Белки теплового шока HSP70B хлоропластов Chlamydomonas reinhardtii: связь с устойчивостью клеток к окислительному стрессу и репарацией ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы