Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP и HSP32 у проростков ячменя

Погульская, Елена Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP и HSP32 у проростков ячменя
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP и HSP32 у проростков ячменя"

На правах рукописи

ПОГУЛЬСКАЯ Елена Николаевна

РОЛЬ ПЛАСТИДНЫХ СИГНАЛОВ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ЕЫР И Н8Р32 У ПРОРОСТКОВ ЯЧМЕНЯ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Н.П. ЮРИНА

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.П. КОРАБЛЕВА доктор биологических наук В.В. КУЗНЕЦОВ

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «Ю» .ЛЛЛХА 2006 г. в ■/5 ч на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан <Д&» ОЦ_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук , 47 Л А.Ф. Орловский

¿9 Ж

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хлоропласта содержат около 3500 различных белков, только небольшая часть которых кодируется пластидным геномом Большинство белков пластид кодируется ядром. Координация экспрессии генов хлоропластных белков, кодируемых двумя клеточными геномами, достигается путем обмена информацией между ними, в котором участвуют специфические регуляторные сигналы, идущие как от ядра к пластидам, так и от пластид к ядру. Ключевая роль в этих процессах принадлежит клеточному ядру Сигналы, посылаемые ядром в различные компартменты клетки (ядерные или антероградные сигналы) изучены значительно лучше, чем сигналы, генерируемые хлоропластами (пластидные или ретроградные сигналы).

Предположение о существовании «пластидного сигнала», который регулирует экспрессию ядерных генов хлоропластных белков, было высказано впервые в середине 80-х годов (Börner, 1986; Oelmiiller, Mohr, 1986) В последние годы интерес к исследованию пластидных сигналов сильно возрос Было установлено, что пластинными сигналами, «запускающими» синтез кодируемых ядром пластидных белков, могут являться продукты синтеза белка в пластидах, активные формы кислорода (синглетный кислород и перекись водорода), редокс-состояние электрон-транспортной цепи фотосинтеза, а также интермедиаты биосинтеза тетрапирролов Было доказано, что пластидные сигналы регулируют экспрессию ряда генов фотосинтеза (Pfannschmidt, 2003) Однако данные о передаче сигналов от хлоропластов к ядру по-прежнему немногочисленны Молекулярная характеристика индивидуальных компонентов, участвующих в передаче сигналов, только начинается. Не идентифицированы ни механизмы, позволяющие пластидному сигналу проходить через оболочку органелл, ни молекулы-мессенджеры, локализованные в цитоплазме/ядре

В связи с изложенным, большой интерес представляет исследование роли пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков хлоропластов, поскольку эти белки играют важную роль в защите растений от стрессовых факторов окружающей среды (интенсивный свет, экстремальные температуры, засуха и др) В хлоропластах высших растений идентифицированы мультигенное семейство стрессовых белков Elip, локализованных в тилакоидах, и стрессовый белок теплового шока Hsp32, локализованный в строме хлоропластов Действие пластидного сигнала на транскрипцию ядерных генов стрессовых белков хлоропластов практически не изучено Белки семейства Elip (ранние индуцируемые светом белки) синтезируются в растениях на ранних этапах зеленения

этиолированных проростков, а также в условиях

низких температур (Adamska et al, 2001). У высших растений белки, относящиеся к мультигенному семейству Elip, кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах и в форме предшественников пост-трансляционно транспортируются в хлоропласта (Montane, Kloppstech, 2000).

Белки теплового стресса образуются у растений в условиях повышенной температуры окружающей среды Низкомолекулярный белок Hsp32 играет существенную роль в устойчивости к тепловому стрессу и в процессах развития растений (Kruse et al., 1993)

Цель и задачи работы. Целью данной работы было исследование роли пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид - гена низкомолекулярного белка светового стресса Elip и гена белка теплового шока Hsp32 с использованием ингибиторного анализа. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид Elip, Hsp32 и маркерных генов белков фотосинтеза Lhcbl, RbcS на уровне мРНК и на уровне белков в условиях, позволяющих выявить пластидный сигнал.

2. Изучить импорт белков в хлоропласта в условиях окислительного стресса, вызванного недостатком каротиноидов у стрессовых белков пластид Elip и Hsp32 и белков фотосинтеза Lhcbl и RbcS.

3 Изучить участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов (Mg-протопорфирина IX и монометилового эфира Mg-протопорфирина IX), продуктов синтеза пластидных белков и редокс-состояния электрон-транспортной цепи фотосинтеза о регуляции транскрипции гена Elip.

Научная новизна. Выявлены различия в регуляции экспрессии генов стрессовых белков пластид и генов белков фотосинтеза. Показано, что в изученных условиях пластидные сигналы ингибируют экспрессию генов белков фотосинтеза, частично подавляют экспрессию гена Elip и не влияют на экспрессию гена белка теплового шока Hsp32 Регуляция гена Elip отличается от регуляции экспрессии гена близкородственного белка Lhcbl Показано, что в регуляции транскрипции гена Elip участвуют интермедиа™ биосинтеза тетрапирролов и редокс-состояние компонентов электрон-транспортной цепи (пула пластохинонов). Впервые установлено, что экспрессия одного и того же гена Elip может кооперативно регулироваться несколькими (по крайней мере, двумя) хлоропластными сигналами Впервые обнаружено накопление в оболочке хлоропластов

предшественников пластидных стрессовых белков в условиях фотодеструкции, что обусловлено нарушениями импорта белков-предшественников в пластиды.

Научно-практическая ценность. Полученные данные позволяют существенно расширить представления о механизмах внутриклеточной передачи сигналов, обусловливающих координированную экспрессию генов в различных структурах растительной клетки. Настоящая работа является фундаментальным исследованием. Полученные данные могут быть использованы при проведении генно-инженерных работ по созданию продуктивных сортов сельскохозяйственных растений.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на У-м ( Съезде Общества Физиологов растений России (г. Пенза, 2003), Международной

1 конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (г. Минск, 2004), XVII-

ой молодежной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (г. Москва, 2005) и на 11-ом Конгрессе Общества фотобиологов (г. Э-ле-бен. Франция, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемои литературы источников). Диссертация

изйожена на 4а страницах, содержит 49 рисунков и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы рассмотрены современные представления о регуляции экспрессии ядерных генов белков пластид с помощью сигналов, генерируемых хлоропластами, и о медиаторах, участвующих в этом процессе. Основное внимание уделено рассмотрению классов пластидных сигналов, структуры и функций белков Elip и Hsp32.

Материалы и методы исследования Растения и условия выращивания. Проростки ячменя (Hordeum vulgare L) выращивали при 20°С в водной культуре в темноте в течение 7 сут Для ингибирования биосинтеза тетрапирролов использовали 2,2'-дипиридил («Sigma», США). Этиолированные проростки обрабатывали 2,2'-дипиридилом в конечной концентрации 5 мМ и освещали светом 30 мкмоль квантов м~2 сек-1 в течение 8 ч Для выявления роли пластидного сигнала в опытах использовали растения, обработанные норфлуразоном (SAN 9789, 4-хлор -5-(метиламино)-2-(а,а,а-три-фтор-м-толил-3-(2Н)пиридазинон; NF), что приводило к фотодеструкции хлоропластов. Семена замачивали в дистиллированной воде, содержащей 0,5 мМ NF, и выращивали в водной культуре в темноте в присутствии той же концентрации ингибитора. В опытах с ингибитором синтеза белка в пластидах использовали линкомицин в конечной концентрации 0,5 мМ Затем проростки освещали светом 300 мкмоль квантов м- 2 с" 1 в течение суток. Условия теплового стресса: контрольные и обработанные NF интактные растения инкубировали в течение 2 ч при 42°С в термостате в темноте. Для создания условий светового стресса этиолированные проростки в течение 24 ч освещали светом 300 мкмоль квантов м-2 с-' Для того чтобы выяснить, может ли редокс-состояние хлоропластов являться пластидным сигналом при экспрессии гена Elip, мы использовали 3-(3', 4'- дихлорфенил)- 1.Г -диметилмочевину (DCMU, диурон, 120 мМ) - специфический ингибитор, блокирующий транспорт электронов от фотосистемы 2 к пулу пластохинонов (PQ), что предотвращает восстановление последнего Проростки ячменя (Hordeum vulgare L.) выращивали при 20°С в водной культуре в темноте в течение 7 сут, затем переносили на раствор ингибитора - 120 мМ, опрыснув раствором DCMU той же концентрации Затем проростки освещали светом 300 мкмоль квантов м- 2 с"1 в течение суток.

Содержание Mg-протопорфирина IX и его монометилового эфира определяли с помощью спектрофлуориметра RF-5301PC («Shimadzu», Япония) Длины волн возбуждения (Ех) и испускания (Em) флуоресценции составляли 420 и 598 нм, соответственно (Rebeiz et al., 1966; Rebeiz et al, 1975).

Геномную ДНК выделяли из контрольных проростков ячменя с помощью СТАВ-буфера и депротеинизации хлороформом.

Выделение РНК и нозери-гибридизация. Суммарную РНК выделяли из контрольных и обработанных ингибиторами проростков ячменя с помощью фенольной депротеинизации Препараты тотальной РНК, фракционированные методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле и окрашенные EthBr. переносили на нитроцеллюлозный фильтр с помощью капиллярного блоттинга и проводили нозерн-гибридизацию Фильтр помещали в раствор для предварительной гибридизации, которую проводили в течение 2 ч в термостате при 42°С в присутствии 50%-ного формамида, 5 х раствора Денхарда (1 х Денхард • 0,02%-ный Фиколл, 0,02%-ный поливинилпирролидон, 0,02%-ный БСА), 5 х SSC (1 х SSC • 0,15 М NaCl, 0.015 М цитрат Na, pH 7,0), 1%-ного Ds-Na и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Для обнаружения мРНК, кодируемой геном Elip, использовали пробы, полученные с помощью амплификации геномной ДНК ячменя РНК-блоты гибридизовали с меченными [a-3JP]dATP ДНК -зондами ДНК-зонды метили [cc-35P]dATP с помощью набора для случайного мечения праймеров («Random Pnmer», СилексМ, Россия) рРНК, окрашенные бромистым этидием, служили контролем, подтверждающим нанесение равных количеств суммарной РНК и эффективность последующего переноса РНК на мембрану Для тестирования линейности ответа использовали несколько разных по времени экспозиции с пленкой Радиоавтограммы фотографировали и анализировали с помощью видеосистемы "DNA Analyzer" и специализированного программного обеспечения "'Gel Explorer" («Хеликон», Россия)

Амплификацию гена Elip проводили с помощью Tag-полимеразы («СилексМ», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя 30 чкл стандартной реакционной смеси содержали- 10 мМ Трис-HCl. pH 8,3, 50 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl2, 1,5 мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфагов («СилексМ». Россия), по 10 мкМ праймеров 5'-TTGATTAATGGCGACC'ATGATG -3' (прямой) и 5'- CACAACCTGTACTTAGCTAGTA -3' (обратный), 10 нг ДНК-матрицы, 5 единиц 7й£-полимеразы Полимеразную реакцию проводили на многоканальном амплификаторе ДНК ТП-4ПЦР-01 «Терцик» (АО ДНК-Технология) Реакция протекала при следующих условиях 1-ый цикл - 94°, 10 мин. 30 циклов 94°, 30 сек; 56°, 30 сек. 72°, 45 сек, последний цикл 72°, 5 мин Продукты амплификации (ампликоны) разделяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, содержащем 1 х буфер ТАЕ (0,04 М трис-ацетат, 2 мМ ОДТА) в присутивии EthBr при 100 В Фрагмент геля, содержащий необходимый ПЦР-мродукт. вырезали, и ДНК экстра! ировали с помощью набора «Выделение ДНК из агарозныч гелей» («СилексМ». Россия) П>тем секвенирования подтверждали идентичность ПЦР-продуктов

В реакции обратной транскрипции, сопряженной с ПЦР (ОТ-ПЦР), матрицей служила суммарная РНК, выделенная из листьев ячменя, как описано выше. Обратную транскрипцию проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя фермента, используя 100 ед. обратной транскриптазы («СибЭнзим», Россия). Для подтверждения отсутствия примесей геномной ДНК в препаратах РНК проводили реакции без добавления обратной транскриптазы. Проводили также обработку выделенной РНК ДНКазой. кДНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров: 5'- CGAGCGCGACGAGTCCGA -3' (обратный для кДНК), 5'- GCGGCTCGGCCCGGTCTCT - 3' (прямой для ПЦР-продукта), 5'-AGAGCTCCGCGTTGGCGTTCATG -3' (обратный для ПЦР-продукта). В качестве гена для нормирования данных была исследована 18S рРНК с использованием специфических праймеров: 5'- AAGAAGCTAGCTGCGGAGGGATGG -3' (обратный для кДНК), 5'-GACAGTCGGGGGCATTCGTATTTC -3' (прямой для ПЦР-продукта), 5'-CCTGGTAAGTTTCCCCGTGTTGAG -3' (обратный для ПЦР-продукта). ПЦР-продукты фракционировали с помощью электрофореза в 1,5%-ной агарозе.

Выделение пластид из проростков ячменя. Интактные пластиды выделяли из 200-400 г проростков ячменя и очищали с помощью центрифугирования в градиенте Перколла (Юрина и ДР)-

Выделение суммарных белков клетки. Для выделения суммарных белков 100 мг листьев гомогенизировали в жидком азоте, переносили в 1мл буфера, содержащего 12,5 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 2%-ный Ds-Na, 1 мМ ЭДТА, 6 мМ DTT и 10%-ный глицерин. Экстракт прогревали при 65°С в течение 15 мин и затем центрифугировали 15 мин при 18 000 g. Концентрацию белка определяли по Лоури, и белки анализировали с помощью Ds-Na-ПААГ.

Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофорез белков (10 мкг на дорожку) проводили в 12,5%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na по Лэммли (Laemmli, 1970). Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Schleicher and Schüll», Германия) с размером пор 0,45 мкм (Towbin et al., 1979). Мембраны инкубировали в течение 1 ч при 4°С в блокирующем буфере: 5%-ное обезжиренное сухое молоко в 20 мМ Na-фосфатном буфере (pH 7,2), 0,15 M NaCl, 0,1%-ный Твин 20, и затем инкубировали с первичными антителами, разведенными 1:2000, к соответствующему белку (ELIP, HSP32, Lhcbl или RbcS) в течение ночи при 4°С. Мембраны инкубировали 2 ч при комнатной температуре с антикроличьими IgG козы, конъюгированными с щелочной фосфатазой. Специфические белковые полосы обнаруживали с помощью субстратов для щелочной фосфатазы: 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий. Все эксперименты повторяли не менее трех раз.

Пептидные карты получали с помощью ограниченного протеолиза белков. Переваривание белков в ПААГ проводили по методу Кливленда (Cleveland, 1983). Для

переваривания использовали химотрипсин (20 мкг/мл) и протеазу М8 (16 мкг/мл). Полипептиды, образовавшиеся при протеолизе, обнаруживали с помощью иммуноблоттинга

Обработка хлоропластов трипсином. Осадок хлоропластов суспендировали в 0,5 мл буфера: 330 мМ сорбит, 50 мМ НЕРЕЭ-КОН, рН 8,0, содержащего 20 мкг/мл трипсина (из поджелудочной железы быка: «ВоеЬппдег», Германия) Инкубацию с трипсином проводили в течение 15 мин во льду Затем хлоропласта разбавляли 5 мл исходного буфера, содержащего ингибитор трипсина (20 мг/мл; яичный ингибитор трипсина, «ВоеЬппдег», Германия) или ингибиторы протеаз (1 мМ ФМСФ, 1 мМ бензамидин) Хлоропласта осаждали центрифугированием, и суммарные белки хлоропластов анализировали с помощью Оэ-Ма -ПААГ электрофореза с последующим иммуноблотгингом

Результаты и их обсуждение 1. Влияние фотодеструкции хлоропластов на экспрессию ядерных генов

стрессовых белков пластид. Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне мРНК у ОТ- обработанных растений Для обнаружения действия пластидного сигнала применяют методы ингибиторный анализ или анализ мутантов с нарушениями механизма передачи сигнала При изучении влияния хлоропластов на экспрессию ядерных генов стрессовых белков использовали растения, у которых в результате фотодеструкции пластиды лишенны каротиноидов и внутренних структур Проростки ячменя, выращенные в темноте в присутствии № (ингибитора биосинтеза каротиноидов) освещали интенсивным светом что приводит к фотоокислительному разрушению хлоропластов В обесцвеченных пластидах отсутствует большинство внутренних структур, в числе которых тилакоидные мембраны и рибосомы, ДНК и оболочка пластид повреждаются относительно мало Анализ пигментного состава пластид показал отсутствие каротиноидов и хлорофиллов в растениях, обработанных ингибитором В апикальной части контрольных пророс!ков хлоропласта содержат регулярно организованные тилакоидные мембраны, в то время как в растениях, обработанных ОТ. пластиды апикальной части листьев почти лишены внутренней мембранной системы Такие же повреждения ультраструктуры пластид в результате обработки этим соединением наблюдаются и в базальной части проростков ячменя В контрольных растениях клетки содержат дифференцированные хлоропласта с типичной ультраструктурой, пластиды опытных растений полностью лишены внутренних мембран Исследование экспрессии четырех ядерных генов пластидных белков двух генов стрессовых белков РЬр и Н\р32 и шух генов белков фотосинтеза ЬксЫ и ЯЬсЗ с помощью нозерн-гибридизации показало, что ген Н\р32 экспрессируется практически в одинаковой степени у контрольных и ОТ-обработанных растений, тогда как содержание транскриптов

гена ЕНр снижено у опытных растений (рис 1) Относительное содержание транскриптов в обработанных № проростках составляло 50-70% и 90-95% от контроля для ЕНр и Нзр32, соответственно Гены ЬИсЫ и ЯЬсЗ не транскрибируются у ОТ-обработанных растений

Таким образом, показано, что в условиях фотодеструкции хлоропластов пластидные сигналы ингибируют экспрессию генов белков фотосинтеза, частично подавляют экспрессию гена ЕНр и не влияют на экспрессию гена белка теплового шока Нзр32 Выявлены различия в регуляции экспрессии генов близкородственных белков ЬЬсЫ и ЕПр

№ + - + - + - + -

шВЩЩг Tl!^* ¡r^^z. ^^^

Elip

Hsp32

Lhcbl

RbcS

Lhcbl = RbcS >Elip> Hsp32

Elip Hsp32 Lhcbl RbcS

Рис 1 Радиоавтограмма нозерн-блот гибридизации меченных 12Р Elip, Hsp32, Lhcbl и RbcS с суммарной РНК NF-обработанныч и контрольных растении ячменя - а, б рРНК каждого из образцов, окрашенные EthBr, представленных в (а), в - относительное содержание (% от контроля) транскриптов Elip, Hsp32, Lhcbl, RbcS у проростков, обработанных норфлуразоном щ - контроль, |—| - опыт

2. Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне белка у РПР-обработанных растений

С помощью вестерн-блот анализа клеточных экстрактов ОТ-обработанных и контрольных проростков ячменя определяли содержание пластидных белков ЕПр, НБр32, ЕЬсЫ и ШзсЗ Содержание белков ЦюЫ и Юзсв понижено у ОТ-обработанных проростков по сравнению с контрольными растениями (рис 2).

ОТ

+ - + -+ -+ -

ЕПр Нбр32 ЬЬсЫ ЯЬсБ

Рис. 2. Вестерн-блот анализ белков ЕПр. Нэр32, ЬЬсЫ и МгсЭ ОТ-обработанных и контрольных растений ячменя 7-сут этиолированные проростки освещали (300 мкмоль квантов \Г" с-1) в течение 24 ч В опытах с Нэр32 проростки предварительно подвергали тепловому стрессу (42°С. 2 ч) Стрелками отмечены дополнительные белки

Однако у обработанных Ж проростков ячменя обнаружено накопление

дополнительных. более высокомолекулярных, белков как в случае белка теплового шока

Нзр32. так и белка светового стресса ЕНр При совместном действии фотоокислительного

стресса, вызванного ингибитором биосинтеза каротиноидов, и теплового стресса кроме

зрелого №р32. обнаруживается дополнительный белок с молекулярной массой 36 кДа В

случае ЕЬр кроме зрелого белка 13 кДа - белок с молекулярной массой 17 кДа (рис. 2)

Допо гантельные белки обнаруживаются уже при 2-ч экспозиции проростков на свету и их

содержание продолжает возрастать при увеличении продолжительности экспозиции на свету

На примере белка теплового стресса Нзр32 показана динамика накопления предшественников

Рис 3 Иммуноблот-анализ содержания Нэр32 у ОТ-обработанных (черный столбик - белок 36 кДа. серый столбик - Нзр32) и контрольных (белые столбики -белок 36 кДа, заштрихованные столбики - Нэр32) проростков ячменя Проростки инкубировали 2 ч при 42° и затем освещали (300 мкмоль квантов м-2 с-1) в течение 4 - 24 ч Суммарные белки фракционировали с помощью Оэ-Ыа-ПААГ электрофореза, после чего проводили иммуноблоттинг

оелков (рис :>)

Время осясшенмя 1

В растениях, подвергнутых только тепловому стрессу, накапливается зрелый белок Hsp32 (заштрихованные столбики), причем его содержание возрастает с увеличением продолжительности освещения до 12 ч. Следовое количество белка с молекулярной массой 36 кДа также обнаруживается в этих препаратах, но его содержание не изменяется при освещении В то время как в растениях, подвергнутых совместному действию теплового шока и окислительного стресса, содержание дополнительного белка 36 кДа увеличивалось линейно вплоть до 24 час экспозиции проростков на свету, содержание Hsp32 выходило на плато на ранних стадиях освещения (черные и серые столбики, соответственно).

Получены сходные пептидные карты для зрелого Hsp32 и дополнительного белка 36

Рис. 4. Пептидная карта Hsp32 и белка 36 кДа. Переваривание белков химотрипсином проводили in situ Пептиды обнаруживали с помощью вестерн-блот анализа. Белки выделяли из NF- обработанных (NF) и контрольных (К) проростков ячменя, освещенных в течение 24 ч Справа видны пептиды зрелого белка у NF-обработанных проростков. Двусторонними стрелками обозначено положение пептидов, обнаруженных в обоих образцах. Пунктирной стрелкой отмечено положение предшественника белка Hsp32 у NF-обработанных проростков. М - зрелый белок. Р - предшественник.

Это указывает на высокую степень гомологии между этими белками и доказывает наличие взаимосвязи предшественник-продукт Таким образом, показано, что в присутствии NF происходит накопление предшественника Hsp32 Другой возможностью показать связь предшественник-продукт для Hsp32 и белка 36 кДа является доказательство того, что при удалении NF содержание дополнительного белка (предположительно предшественника) уменьшается Было показано, что через 16 час после удаления NF из среды с помощью двукратной отмывки корней растений водой содержание белка 36 кДа резко уменьшается (рис 5)

Рис 5 Действие удаления NF на содержание предшественника Hsp32. Nb- обработанные (+) и контрольные (-) проростки ячменя подвергали тепловому шоку (42° С, 2 ч) и затем освещали 8 ч (300 мкмоль м2 с1) Корни растений отмывали, проростки переносили на воду и освещение продолжали в течение 16 ч Белки выделяли из NF-обработанных проростков (1,3), проростков, перенесенных на воду (4), и контрольных проростков ячменя (2,5)

Продолжительное™ оемщенмя, ч 8 24

-II-1

+ +/_ _

Тот факт, что обнаруживаются следовые количества этого белка, объясняется, видимо, неполной отмывкой корней от вермикулита, содержащего № Эти данные подтверждают, что белок 36 кДа является предшественником Няр32 На рис 6 представлено действие ОТ на содержание предшественника другого стрессового белка пластид ЕНр (13 кДа), кодируемого ядром и локализованного в тилакоидных мембранах В этом случае наблюдается накопление более высокомолекулярного белка с молекулярной массой 17 кДа

Рис. 6. Действие удаления № на содержание предшественника ЕЬр. ОТ- обработанные (+) и контрольные (-) проростки ячменя освещали 8 ч (300 мкмоль квантов м"2 с"1), затем корни растений отмывали, проростки переносили на воду и освещение продолжали в течение 16 ч. Белки выделяли из ОТ-обработанных проростков (1,3), проростков, перенесенных на воду (4) и контрольных (2,5) проростков ячменя.

Процесс накопления дополнительных белковых компонентов в присутствии ОТ является обратимым Эти белки практически исчезают при отмывке корней растений от ОТ. Наличие нескольких минорных белковых иммунодетектируемых зон, наблюдаемых на рис. 5, объясняется тем, что в растениях имеется семейство белков ЕЬр На основании отличия по молекулярной массе, иммунологического сходства, пептидного картирования, а также опытов по удалению ОТ нами было установлено, что более высокомолекулярные белки являются предшественниками стрессовых белков Нэр32 и ЕЬр

Для того чтобы выяснить, где накапливаются предшественники стрессовых белков в клетках обработанных ОТ растений, очищенные в градиенте Перколла хлоропласта обрабатывали трипсином. Обнаружено, что предшественники белков чувствительны к действию трипсина, в то время как зрелые белки, прошедшие процессинг и находящиеся внутри пластид, не разрушаются при такой обработке органелл (рис 7)

Рис 7 Действие трипсина на хлоропласта из ОТ-обработанных (+) и контрольных (-) проростков ячменя. Переваривание трипсином (20 мкг/мл, 4°С, 15 мин) не импортируемых в пластиды белков М -зрелые белки, Р - предшественники белков

Это указывает на то, что часть предшественников стрессовых белков у ОТ-обработанных растений не проходит через мембрану оболочки, и позволяет считать, что накопление

Продолжительность освещения, ч

8 24

кДа

17_ 13~*

- 1 1 + +/- -

• гт "зи

И»Ш . -'¡г* 4 » ,

рК.

1 2 3 4 5

Трипсин - + - +

Р —

м—

ЕПр Нзр32

предшественников пластидных белков происходит за счет нарушения транслокации предшественников стрессовых белков в пластиды.

3. Влияние пластидных сигналов разных классов на регуляцию

экспрессии ядерного гена пластидного белка ЕНр 3.1. Сигнальная роль интермедиатов биосинтеза тетрапирролов. Чтобы изучить участие тетрапирролов в регуляции транскрипции ядерного гена ЕИр, а именно - роль Мд-протопорфирина ГХ (\^-прото IX) и его монометилового эфира - М^-прото ГХ-Ме в регуляции экспрессии ядерного гена низкомолекулярного пластидного белка ЕИр, были проведены опыты с 2,2'-дипирндилом Дипиридил блокирует биосинтез тетрапирролов, локализованных в хлоропластах, на стадии превращения К^-прото ГХ-Ме в '

протохлорофиллид, что приводит к накоплению в хлоропластах Mg- прото IX- Ме. В ходе измерения содержания интермедиатов биосинтеза хлорофилла обнаружено, что, по )

сравнению с контрольными растениями, количество Mg-пpoтo IX и Мд-прото ГХ-Ме увеличивается в 5,8 раз в проростках, обработанных 2,2'-дипиридилом. Как видно из табл. 1, у ОТ-обработанных проростков ячменя также наблюдается повышенное содержание Мд-прото IX и Мд-прото 1Х-Ме По-видимому, негативная регуляция ОТ транскрипции генов белков хлоропластов может быть обусловлена накоплением интермедиатов биосинтеза тетрапирролов.

Таблица 1 Содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в проростках

ячменя

Вариант Содержание Мд-прото IX + прото 1Х-Ме

нмоль/г сырого веса % от контроля

Контроль 0.073 ±0,020 100

Норфлуразон* 0,116 ±0,025 159

2,2'- Дипиридил** 0,423 ±0,024 579

* Проростки ячменя выращивали в темноте в течение 7 сут на растворе 5 х 10"5МОТ или воде (контроль), а затем освещали в течение 24 ч

* Проростки ячменя выращивали в темноте в течение 7 сут на воде, а затем на растворе 5 мМ 2,2'-дипиридила или воде (контроль) в течение 8 ч на свету (30 мкмоль квантов м2 с ') Среднее значение получено из трех независимых экспериментов

Это может объясняться тем, что синтез тетрапирролов до стадии протохлорофиллида локализован в окружающей мембране (оболочке) хлоропластов, а последующие стадии - во внутренних (тилакоидных) мембранах. При фотодеструкции в первую очередь разрушаются внутренние мембраны хлоропластов, в то время как оболочка остается неповрежденной, поэтому там накапливаются \lg-np0T0 IX и >/^-прото 1Х-Ме.

В результате анализа данных ОТ-ПЦР было обнаружено, что уровень экспрессии гена белка светового стресса хлоропластов в проростках, обработанных 2,2'-дипиридилом, ~ на 50% ниже, чем в контрольных растениях (рис 8)

Дп

Рис 8 Содержание транскриптов ядерного гена стрессового белка ЕЬр у контрольных растений и растений, обработанных 2.2'-дипиридилом (ДП) а - радиоавтограмма (нозерн-гибридизация), б - электрофореграмма суммарной РНК, окрашенной ЕЛВг, в -относительное содержание (% от контроля) транскриптов гена Е1\р у проростков ячменя, обработанных 2.2'-дипиридилом К-контроль

На основании данных о содержании предшественников биосинтеза тетрапирролов в опытных и контрольных растениях, и данных, полученных с помощью ОТ-ПЦР, можно сказать, что содержание тетрапирролов в кпетках коррелирует с содержанием гранскриптов гена ЕПр Эксперименты по изучению влияния повышенного содержания \^-прото IX и Р^-прото 1Х-Ме на экспрессию генов Е1гр показали, что накопление в хлоропластах М§-прото IX и его монометилового эфира приводит к частичному ингибированию транскрипции гена низкомолекулярного пластидного белка светового стресса ЕЬр Оба метода оценки содержания транскриптов гена ЕЬр (но!ерн-гибридизаиия и ОТ-ПЦР) дали сходные результаты

3.2. Влияние синтеза белка в пластидах на экспрессию гена Elip. Для того чтобы выяснить возможную роль хлоропластных белков как пластидного сигнала, регулирующего экспрессию гена Elip, нами был использован линкомицин, ингибирующий синтез белков в пластидах Проростки ячменя в течение 5 сут росли в темноте на 0,5 мМ растворе линкомицина, а затем были выставлены на свет (300 мкмоль квантов \Г2сек"') на 48 ч С помощью нозерн-гибридизации мы сравнили уровень транскриптов гена Elip в опытных и контрольных растениях. Экспрессия ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip в опытных проростках не отличалась от его экспрессии в растениях, не подвергавшихся обработке ингибитором. Таким образом, подавление синтеза пластидных белков в 7-сут растениях не оказывает влияния на экспрессию гена Elip У таких растений процесс трансляции в пластидах не участвует в регуляции экспрессии гена Elip. Ранее было показано, что на начальных этапах прорастания обработка тинкомицином приводит к снижению экспрессии ядерных генов, кодирующих белки фотосинтеза хлоропластов. В проростках табака в результате действия ингибитора не накапливаются транскрипты генов Lhcbl и RbcS в первые 2-3 дня развития проростков На этом основании был сделан вывод о необходимости трансляции в хлоропластах в этот период развития проростков (Sullivan & Gray, 1999; Gray et al., 2003). Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансляция в пластидах 7-сут проростков ячменя не влияет на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид По-видимому, синтез пластидных белков нужен для формирования сигнальной системы хлоропластов на более ранних этапах развития проростков

3.3. Регуляция экспрессии гена Elip редокс-состоянием фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Для того чтобы выяснить может ли редокс-состояние электрон-транспортной цепи хлоропластов выступать в роли пластидного сигнала при экспрессии гена Elip, мы использовали 3-(3'. 4'- дихлорфенил)- 1,1 ' -диметилмочевину (DCMU) - специфический ингибитор, блокирующий транспорт электронов от ФС II к пулу пластохинонов (PQ), что предотвращает восстановление последнего и приводит к накоплению пула окисленного PQ Опытные растения ячменя выращивали в течение 7 сут в темноте в водной культуре После этого проростки переносили в среду, содержащую 120 мкМ DCMU, таким же раствором опрыскивали растения и в течение 24 ч освещали белым светом (300 мкмоль квантов ч~2 с"1) Световой режим контрольных и опытных растений был идентичен Как следует из табл 2, фотохимическая активность ФСН у обработанных DCMU растений ингибирована на 30% по сравнению с контролем

Таблица 2 Фотохимическая эффективность ФСП в проростках ячменя после обработки

исми

Варианты Fo Fm Fv=Fm-F0 Fv/Fm отн ед Fv/Fm %

Контроль 46 256,0 ± 0,030 210 0,820 ±0,012 100

DCMU 46 107.5 ±0,021 61,5 0,572 ± 0,02 70

Снижение фотохимической активности ФСП приводит к окислению пула пластохинонов. С помощью ОТ-ПЦР определяли уровень транскриптов у контрольных и обработанных DCMU проростков ячменя В ходе исследований было показано, что содержание транскриптов Elip понижено у растений, обработанных ингибитором, и составляет всего 20-30% от контроля (рис 9) Подавление переноса электронов от ФСН к пулу пластохинонов на 30% приводит к снижению уровня транскрипции гена Elip на 80% М DCMU

К DCMU

Рис 9 Электрофореграмма ПЦР-продукта (567 п н ) гена Elip, полученного с помощью ОТ -ПЦР

а - электрофореграмма ПЦР-продукта в 1,5%-ной агарозе, б - относительное содержание (% от контроля) транскриптов Elip у проростков, обработанных DCMU, М - ДНК-маркеры («100 bp Ladder») К-контроль

Таким образом, обработка ОСМи. вызывающая окисление пула пластохинонов. приводит к существенному ингибированию транскрипции гена Е1:р

Заключение

В настоящее время с помощью ингибиторного анализа и исследования мутантов обнаружены пять возможных путей передачи сигналов от хлоропластов к ядру (пять классов пластидных сигналов). Один из этих путей зависит от продукта (-ов) пластидного синтеза белков; второй - связан с синглетными формами кислорода; в третьем пути участвует перекись водорода, генерируемая хлоропластами; четвертый сигнальный путь контролируется редокс-состоянием электрон-транспортной цепи фотосинтеза и в пятом участвуют интермедиаты биосинтеза тетрапирролов (Beck, 2005) Эти пластидные сигналы являются частью сложной сигнальной сети, связывающей функциональное и физиологическое состояние хлоропластов с ядром.

В нашей работе мы попытались оценить участие трех классов пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов стрессовых хлоропластных белков (ЕИр и Hsp32). Было исследовано участие промежуточных продуктов биосинтеза тетрапирролов, продуктов синтеза пластидных белков и редокс-состояния хлоропластов в регуляции экспрессии этих генов у ячменя.

На первом этапе исследований была изучена экспрессия генов Elip и Hsp32 в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласты Маркерными генами служили ядерные гены белков фотосинтеза (Lhcb, RbcS), для которых доказана регуляция экспрессии с помощью пластидного сигнала Показано, что в условиях фотодеструкции хлоропластов, вызванной норфлуразоном, ингибитором фитоиндесатуразы, в пластидах отсутствуют фотосинтетическая активность, тилакоидные мембраны и рибосомы Однако ДНК и оболочка органелл повреждаются сравнительно мало При сравнении экспрессии четырех ядерных генов - генов стрессовых белков пластид Elip и Hsp32 и генов белков фотосинтеза Lhcb и RbcS. в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласты, было обнаружено, что транскрипция генов белков фотосинтеза наиботее чувствительна к пластидному сигналу На экспрессию ядерного гена хлоропластного белка теплового шока Hsp32 пластидный сигнал практически не оказывает действия его транскрипция практически не отличается у норфлуразон-обработанных и контрольных растений Поэтому можно говорить о том, что Hsp32 является геном, экспрессия которого относительно нечувствительна к пластидному сигналу Уровень транскрипции гена Elip снижен у фотоповрежденных растений Это указывает на то. что хлоропласты контролируют экспрессию данного гена Наши результаты о регуляции экспрессии гена Elip согласуются также с представлением о том. что экспрессия ядерных генов регулируется функциональным состоянием пластид скорее непрерывно, чем дискретно по принципу «open-shut gate» (McCormac. Terry, 2004) Возможно, что различная

чувствительность транскрипции изученных четырех генов к фотодеструкции хлоропластов отражает различия в регуляторных элементах промоторов соответствующих генов. Таким образом, хлоропласта принимают непосредственное участие в регуляции экспрессии ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Екр.

Обнаружено, что при фотодеструкции в хлоропластах ячменя кроме зрелых форм белков ЕНр и Нзр32 наблюдается накопление их предшественников В этих условиях не обнаруживаются предшественники хлоропластных белков периферической антенны ФСП (ЬЬсЫ) и малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы (ЯЬсЭ) Как показали результаты нашей работы, это может объясняться тем, что транскрипция генов стрессовых белков продолжается, а транскрипция генов белков фотосинтеза заблокирована. При окислительном стрессе, вызванном недостатком каротиноидов, частично нарушается импорт белков в хлороптасты. при этом предшественники белков накапливаются в оболочке пластид Такой вывод следует из опытов по обработке изолированных пластид экзогенными протеазами (трипсином) По-видимому, И-конец стрессового белка находится в обо точке пластид, в то время как С-конец экспонирован снаружи и поэтому подвержен действию протеаз У ОТ-обработанных и контрольных растений предшественники стрессовых белков связываются с сайтами транслокации оболочки хлоропластов, но у обработанных растений реакция переноса частично нарушена.

Чтобы обнаружить корреляцию между уровнем экспрессии гена белка светового стресса Екр и содержанием тетрапирролов - предполагаемых сигнальных молекул, биосинтез которых локализован у высших растений в хлоропластах, использовали 2,2'-дипиридил Обнаружено, что повышение содержания 1У^-прото IX и \^-прото 1Х-Ме коррелирует с понижением экспрессии гена Екр Это указывает на зависимость экспрессии гена хлороптастного бечка светового стресса от внутриклеточного содержания интермедиатов биосинтеза тетрапиррочов В нашей работе впервые показано, что в реп чяции транскрипции гена Екр > ячменя участвуют тетрапирролы. частично ингибируя экспрессию этого гена (на ~ 50%) Отсюда следует что пластидный сигнал, медиаторами которого являются Мп-прогопорфирин IX и Ме-проюпорфирин 1Х-Ме. подавляет транскрипцию данного гена, что позволяет говорить о негативной регуляции тетрапирролами экспрессии Екр Сходные результаты получены при оценке содержания транскриптов гена Екр методом нозерн-гибридизации и ОТ-ПЦР

Для выявления корреляции между уровнем экспрессии гена белка светового стресса и редокс-состоянием хчоропчастов испочьзовали специфический ингибитор ФСП - ВСМ1! Как известно, ингибирование ФСП приводит к окислению пула иластохинонов. который, в основном, и определяет редокс-состояние хлоропластов

Показано, что в регуляции экспрессии ядерного гена низкомолекулярного хлоропластного белка светового стресса ЕНр участвует редокс-состояние электрон-транспортной цепи фотосинтеза Изменение редокс-состояния пула пластохинонов, вызванное обработкой проростков ячменя ИСМи (специфический ингибитор ФСП), приводит к снижению транскрипции гена ЕНр (на ~ 80%) Таким образом, в регуляции экспрессии гена хлоропластного белка светового стресса у ячменя участвуют не только тетрапирролы, но и другой класс пластидного сигнала, который индуцируется окисленным пулом пластохинонов.

Тот факт, что экспрессия ядерного гена белка ЕНр регулируется разными классами пластидных сигналов, свидетельствует о том, что экспрессия одного и того же гена может кооперативно регулироваться несколькими пластидными сигналами

На основании вышеизложенного, нами предложена схема регуляции хлоропластами экспрессии ядерного гена хлоропластного белка светового стресса ЕНр (рис 10) Накопление промежуточных соединений биосинтеза хлорофилла (Х^-прото IX и его монометилового эфира) в оболочке хлоропластов приводит к снижению уровня экспрессии гена ЕЬр По-видимому, 1\^-прото IX и \^-прото IX Ме поступают в цитозоль, и в ходе ряда последовательных реакций блокируют активатор/активирует репрессор транскрипции, что приводит к снижению уровня экспрессии этого гена Возможна и регуляция экспрессии этого гена с участием редокс-равновесия электрон-транспортной цепи фотосинтеза При блокировании транспорта электронов от ФСП к пулу пластохинонов происходит окисление пула пластохинонов что коррелирует с падением уровня экспрессии гена ЕЬр на 80%.

Рис 10 Схема участия разных классов пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков хлоропластов

Таким образом, можно говорить о функционировании при регуляции экспрессии гена ЕИр двух классов пластидно-ядерного взаимодействия. Первый класс предполагает участие Г^-прото IX и К^-прото 1Х-Ме в инициации процессов, приводящих к изменению транскрипции этого гена. Поскольку в настоящее время не обнаружены последующие этапы пластидно-ядерного взаимодействия с участием N^^0™ IX и Г^-прото 1Х-Ме (транскрипционные факторы, способные взаимодействовать с данными соединениями), эти тетрапирролы можно считать «медиаторами» пластидного сигнала. Второй класс пластидно-ядерного взаимодействия осуществляется при непосредственном участии электрон-транспортной цепи фотосинтеза. Ингибирование транспорта электронов от ФСН к пулу пластохинонов в хлоропластах ячменя, в результате чего пул остается окисленным, вызывает понижение уровня транскриптов гена ЕИр. Функционирование указанных двух классов пластидно-ядерного взаимодействия, приводящее к снижению уровня экспрессии ядерного гена белка светового стресса ЕИр, позволяет говорить о негативной регуляции экспрессии данного гена этими классами сигналов.

Выводы

1. Изучено влияние сигналов, генерируемых хлоропластами (пластидные или ретроградные сигналы) на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид (ЕИр, Н8р32) и генов белков фотосинтеза (ЬИсЫ, КЬсЗ) в условиях фотодеструкции. Показано, что в изученных условиях пластидные сигналы ингибируют экспрессию генов белков фотосинтеза, частично подавляют экспрессию гена ЕИр и не влияют на экспрессию гена белка теплового шока Н$р32. Выявлены различия в регуляции экспрессии генов близкородственных белков ЬЬсЫ и ЕИр.

2. При фотодеструкции хлоропластов происходит накопление предшественников белков ЕИр и Нзр32 в оболочке пластид, что свидетельствует о нарушении импорта стрессовых белков в хлоропласты.

3. Показано, что в регуляции транскрипции гена ЕЬр участвуют тетрапирролы, которые частично (на -50%) ингибируют экспрессию этого гена. Медиаторами пластидного сигнала служат промежуточные продукты биосинтеза тетрапирролов -протопорфирин IX и монометиловый эфир М§-протопорфирина IX, которые подавляют экспрессию данного гена.

4. Показано, что неполное ингибирование диуроном восстановления пула пластохинонов приводит к существенному снижению уровня транскриптов ЕИр, что

указывает на зависимость экспрессии ядерного гена белка светового стресса пластид от редокс-состояния электрон-транспортной цепи фотосинтеза.

5 На основании полученных данных предложена схема регуляции экспрессии ядерного гена пластидного белка Elip, согласно которой ген белка светового стресса Elip регулируется, по крайней мере, двумя сигналами- с помощью участия интермедиатов биосинтеза тетрапирролов и редокс-состоянием компонентов электрон-транспортной цепи По-видимому, пластидные сигналы являются частью сложной сигнальной сети, связывающей функциональное и физиологическое состояние хлоропластов с экспрессией ядерных генов.

•

Список работ, опубликованных по теме диссертации

) ч

1. Юрина Н.П., Погульская Е.Н, Олескина Ю П., Белкина Г Г Участие хлоропластов в регуляции экспрессии ядерных генов, кодирующих пластидные белки V Съезд Общества Физиологов растений России Пенза.15-21 сентября 2003 С 475-476

2. Белкина Г Г , Погульская Е.Н , Юрина Н П. Выделение и частичная характеристика ДНК-топоизомеразы I из нуклеоидов хлоропластов горчицы. Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40. №3. С. 276-281.

3 Погульская Е.Н, Юрина Н П Изучение роли пластидного сигнала в регуляции экспрессии ядерных генов, кодирующих белки хлоропластов Тезисы Международной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» Минск. 2004 С

308-309. *

4 Юрина Н.П , Погульская Е Н , Одинцова М С Влияние хлоропластов на экспрессию

ядерных генов пластидных белков Труды III Сисакяновских чтений. Дубна, 2005. С. 231-238.

5 Погульская Е Н , Юрина Н П Экспрессия ядерных генов, кодирующих стрессовые белки пластид, в растениях с дефицитом каротиноидов XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва. 2005 С 71

6. Погульская E.H.. Юрина Н.П. Фотодеструкция пластид и экспрессия ядерных генов стрессовых белков хлоропластов. 9-я Международная путинская школа-конференция молодых ученых «Биология- наука XXI века», Пущино, 2005. С.44-45.

7. EN. Pogulskaya. N.P Yurina. Expression of genes for early light inducible proteins under oxidative stress in barley. 11th Congress European Society for Photobiology Aix-les-bains, France, 2005. P. 160.

8. Погульская E.H.. Олескина Ю П., Белкина Г Г , Юрина Н П Транскрипция ядерных генов стрессовых белков пластид в условиях фотодеструкции хлоропластов Материалы III съезда Общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова. Москва, 25-27 октября 2005. С. 122-123.

9 Юрина Н.П , Погульская EH.. Карапетян Н.В Действие фотодеструкции пластид из норфлуразон-обработанных проростков на экспрессию ядерных генов, кодирующих стрессовые белки хлоропластов ячменя Биохимия 2006, Т 71 № 4, С. 533-540

10 Погульская Е Н . Юрина Н П , Карапетян Н В Участие тетрапирролов в регуляции экспрессии ядерного гена низкомолекупярного пластидного белка ELIP Прикладная биохимия и микробиология. 2006 Т 42 №3 С 390-395

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.

t»

Гарнитура Times Формат 60\90/16 Бумага офсетная 80г Печать офсетная Уч -изд. Л 1,0 Уел Печ. Л 1,5 Тираж 100 экз

Отпечатано с готового оригинал макета в ООО «Знаменка»

/сШ Z/J3

►-7 93 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Погульская, Елена Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая характеристика генома хлоропластов

1.1.1. Структура и функции хлоропластной ДНК (хпДНК)

1.1.2. Эндосимбиотическое происхождение хлоропластов

1.1.3. Перенос хлоропластных генов в ядро в процессе эволюции

1.2. Взаимодействие ядерных и хлоропластных геномов

1.3. Координация экспрессии генов и межорганелльная передача сигналов

1.3.1. Антероградные механизмы (передача сигналов от ядра к органеллам)

1.3.2. Координация экспрессии генов хлоропластов и митохондрий

1.3.3. Общая картина регуляции транскрипции ядерных генов белков хлоропластов

1.4. Ретроградные сигналы (передача сигналов от хлоропластов к ядру)

1.4.1. Роль синтеза белка в пластидах в экспрессии ряда ядерных генов

1.4.2. Влияние мутаций, вызывающих нарушения фотосинтеза или передачи пластидного сигнала, на экспрессию ядерных генов хлоропластов

1.4.3. Регуляция экспрессии ядерных генов редокс-состоянием фотосинтетической электрон-транспортной цепи

1.4.4. Регуляция транскрипции ядерных генов тетрапирролами

1.4.4.1. Сигнальная роль тетрапирролов у высших растений

1.4.4.2. Сигнальная роль тетрапирролов у зеленых водорослей

1.4.4.3. М£-протопорфирин IX и его монометиловый эфир как регуляторы экспрессии ядерных генов ф 1.4.4.4. Мишени тетрапиррольных сигналов

1.4.4.5. Транспорт тетрапирролов

1.5. Стрессовые белки хлоропластов

1.5.1. Белки светового стресса пластид ЕПр

1.5.2. Низкомолекулярные белки теплового стресса

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Растения и условия выращивания. Обработка растений ингибиторами

2.2. Условия теплового и светового стрессов 53 ® 2.3. Определение содержания порфиринов

2.4. Выделение РНК

2.4.1. Электрофорез в агарозном геле

2.5. Выделение геномной ДНК

2.6. Нозерн - гибридизация зондов, меченных [а- ^Р]с1АТР, с тотальной РНК ячменя

2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Сопряженная реакция обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)

2.8. Выделение пластид и фракционирование хлоропластов

2.9. Выделение суммарных белков клетки 59 ф 2.10. Электрофорез и иммуноблоттинг

2.11. Пептидные карты, полученные с помощью ограниченного протеолиза белков

2.12. Обработка хлоропластов трипсином

2.13. Измерение фотохимической активности ФСП

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 62 3.1. Влияние фото деструкции хлоропластов на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид. Обнаружение а экспрессии генов стрессовых белков на уровне мРНК у ЫБ- обработанных растений

3.2. Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне белка у ^-обработанных растений

3.3. Влияние пластидных сигналов разных классов на регуляцию экспрессии ядерного гена пластидиого белка ЕИр

3.3.1. Сигнальная роль интермедиатов биосинтеза тетрапирролов

3.3.2. Влияние синтеза белка в пластидах на экспрессию гена ЕИр

3.3.3. Регуляция экспрессии гена ЕИр редокс-состоянием фотосинтетической электрон-транспортной цепи

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP и HSP32 у проростков ячменя"

Хлоропласты содержат около 3500 различных белков, только небольшая часть которых кодируется пластидным геномом. Большинство белков пластид кодируется ядром. Координация экспрессии генов хлоропластных белков, кодируемых двумя клеточными геномами, достигается путем обмена информацией между ними, в котором участвуют специфические регуляторные сигналы, идущие как от ядра к пластидам, так и от пластид к ядру. Ключевая роль в этих процессах принадлежит клеточному ядру. Сигналы, посылаемые ядром в различные компартменты клетки (ядерные или антероградные сигналы) изучены значительно лучше, чем сигналы, генерируемые хлоропластами (пластидные или ретроградные сигналы).

Предположение о существовании «пластидного сигнала», который регулирует экспрессию ядерных генов хлоропластных белков, было высказано впервые в середине 80-х годов (Börner, 1986; Oelmüller, Mohr, 1986). В последние годы интерес к исследованию пластидных сигналов сильно возрос. Было установлено, что пластидными сигналами, «запускающими» синтез кодируемых ядром пластидных белков, могут являться продукты синтеза белка в пластидах, активные формы кислорода (синглетный кислород и перекись водорода), редокс-состояние электрон-транспортной цепи фотосинтеза, а также интермедиаты биосинтеза тетрапирролов. Было доказано, что пластидные сигналы регулируют экспрессию ряда генов фотосинтеза (Pfannschmidt, 2003). Однако данные о передаче сигналов от хлоропластов к ядру по-прежнему немногочисленны. Молекулярная характеристика индивидуальных компонентов, участвующих в передаче сигналов, только начинается. Не идентифицированы ни механизмы, позволяющие пластидному сигналу проходить через оболочку органелл, ни молекулы-мессенджеры, локализованные в цитоплазме/ядре.

В связи с изложенным, большой интерес представляет исследование роли пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков хлоропластов, поскольку эти белки играют важную роль в защите растений от стрессовых факторов окружающей среды (интенсивный свет, экстремальные температуры, засуха и др). В хлоропластах высших растений идентифицированы мультигенное семейство стрессовых белков Elip, локализованных в тилакоидах, и стрессовый белок теплового шока Hsp32, локализованный в строме хлоропластов. Действие пластидных сигналов на транскрипцию ядерных генов стрессовых белков хлоропластов практически не изучено.

Белки семейства Elip (ранние индуцируемые светом белки) синтезируются в растениях на ранних этапах зеленения этиолированных проростков, а также в условиях светового стресса, засухи и действия низких температур (Adamska et al., 2001). У высших растений белки, относящиеся к мультигенному семейству Elip, кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах и в форме предшественников пост-трансляционно транспортируются в хлоропласты (Montane, Kloppstech, 2000).

Белки теплового стресса образуются у растений в условиях повышенной температуры окружающей среды. Низкомолекулярный белок Hsp32 играет существенную роль в устойчивости к тепловому стрессу и в процессах развития растений (Kruse et al., 1993).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Погульская, Елена Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние сигналов, генерируемых хлоропластами (пластидные или ретроградные сигналы) на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид {ЕНр, Н$р32) и генов белков фотосинтеза (ЬИсЫ, ЯЬс^ в условиях фотодеструкции. Показано, что в изученных условиях пластидные сигналы ингибируют экспрессию генов белков фотосинтеза, частично подавляют экспрессию гена ЕНр и не влияют на экспрессию гена белка теплового шока Нвр32. Выявлены различия в регуляции экспрессии генов близкородственных белков ЬЬсЫ и ЕНр.

2. При фото деструкции хлоропластов происходит накопление предшественников белков ЕНр и Нзр32 в оболочке пластид, что свидетельствует о нарушении импорта стрессовых белков в хлоропласты.

3. Показано, что в регуляции транскрипции гена ЕНр участвуют тетрапирролы, которые частично (на ~50%) ингибируют экспрессию этого гена. Медиаторами пластидного сигнала служат промежуточные продукты биосинтеза тетрапирролов - М§-протопорфирин IX и монометиловый эфир М§-протопорфирина IX, которые подавляют экспрессию данного гена.

4. Показано, что неполное ингибирование диуроном восстановления пула пластохинонов приводит к существенному снижению уровня транскриптов ЕНр, что указывает на зависимость экспрессии ядерного гена белка светового стресса пластид от редокс-состояния электрон-транспортной цепи фотосинтеза.

5. На основании полученных данных предложена схема регуляции экспрессии ядерного гена пластидного белка ЕНр, согласно которой ген белка светового стресса ЕНр регулируется, по крайней мере, двумя сигналами: с помощью участия интермедиатов биосинтеза тетрапирролов и редокс-состоянием компонентов электрон-транспортной цепи. По-видимому, пластидные сигналы являются частью сложной сигнальной сети, связывающей функциональное и физиологическое состояние хлоропластов с экспрессией ядерных генов.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю д.б.н. Надежде Петровне Юриной за постоянное внимание и поддержку в ходе выполнения работы, а также д.б.н., профессору Маргарите Семеновне Одинцовой за ценные критические замечания и помощь при оформлении диссертации.

Выражаю искреннюю признательность д.б.н., профессору Навасарду Вагановичу Карапетяну, в лаборатории которого была выполнена настоящая работа, за постоянную поддержку и интерес к работе, глубокую признательность Марине Генриховне Рахимбердиевой за сотрудничество и плодотворное обсуждение результатов, и всем сотрудникам лаборатории за дружеское отношение и ценные советы.

Выражаю особую признательность Анне Владимировне Гончаренко за помощь в экспериментальной работе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регуляция процессов жизнедеятельности растительной клетки мало изучена. Очевидно, однако, что координация экспрессии трех геномов эукариотической клетки: ядерного, пластидиого и митохондриального, дистигается с помощью специфических сигналов. Ключевую роль при этом играет клеточное ядро.

Клеточные сигналы двунаправленны: они поступают от ядра к органеллам и от органелл к ядру. Существует также обмен сигналами между разными типами органелл (Raghavendra, Padmasree, 2003; Leister, 2005). Биогенез и функционирование органелл контролируются ядром с помощью множества сигналов. Существуют различные уровни контроля функций органелл ядром: 1. регуляция содержания транскриптов ядерных генов хлоропластных белков. Этот механизм касается контроля содержания многих белков хлоропластов (Kleffman et al., 2004); 2. регуляция пост-трансляционного поступления белков в хлоропласта и митохондрии с участием комплексов Tic/Toc и Tim/Tom, соответственно. Известны различные изоформы этих транслоконов с разной субстратной специфичностью, которые, вероятно, и создают тканеспецифичные протеомы пластид и митохондрий (Leister et al., 2004). Кроме того, импорт белков в хлоропласта, по-видимому, зависит от редокс-состояния органелл (Kuchler et al., 2002; Leister, 2005); 3. регуляция транскрипции, редактирования транскриптов, созревания мРНК и процессинга, а также трансляции кодируемых органеллами белков. В этих процессах участвуют ядерные факторы, обеспечивая ядерный контроль экспрессии органелльных генов. Согласно имеющимся данным регуляция экспрессии генов пластома и хондриома протекает, в основном, на пост-транскрипционном уровне (Leister, 2005); 4. пост-трансляционные процессы, такие как сборка белковых комплексов тилакоидных мембран или внутренней оболочки митохондрий. Эти процессы осуществляются при участии кодируемых ядром факторов сборки; 5. образование органелл (например, при делении) строго контролируется белками, кодируемыми ядром (Osteryoung, Nunnari, 2003).

Взаимодействие между ядром и органеллами включает антероградный (от ядра к органеллам) и ретроградный (от органелл к ядру) контроль. Антероградные механизмы координации экспрессии генов в хлоропластах и митохондриях являются рецепторами эндогенных и внешних сигналов, воспринимаемых ядром. Ретроградные механизмы регулируют экспрессию ядерных генов органелл в соответствии с их метаболической активностью и состоянием дифференцировки.

В настоящее время с помощью ингибиторного анализа и исследования мутантов обнаружены пять возможных путей передачи сигналов от хлоропластов к ядру (пять классов пластидных сигналов). Один из этих путей зависит от продукта (-ов) пластидного синтеза белков; второй - связан с синглетными формами кислорода; в третьем пути участвует перекись водорода, генерируемая хлоропластами; четвертый сигнальный путь контролируется редокс-состоянием электрон-транспортной цепи фотосинтеза и в пятом - участвуют интермедиаты (и возможно белки) биосинтеза тетрапирролов (Веек, 2005). Эти пластидные сигналы являются частью сложной сигнальной сети, связывающей функциональное и физиологическое состояние хлоропластов с ядром.

В нашей работе мы попытались оценить участие трех из этих классов пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов стрессовых хлоропластных белков (ЕНр и Нзр32). Была исследована роль промежуточных продуктов биосинтеза тетрапирролов, продуктов синтеза белков пластид и редокс-состояния электрон-транспортной цепи фотосинтеза в регуляции экспрессии этих генов у ячменя.

На первом этапе исследований была изучена экспрессия генов ЕНр и Шр32 в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласта, что позволяет обнаружить действие пластидного сигнала. Маркерными генами служили ядерные гены белков фотосинтеза (ЬИсЬ, КЬсЯ), для которых доказана регуляция экспрессии с помощью пластидного сигнала. Показано, что в результате обработки растений 1МР, ингибитором фитоиндесатуразы, происходит фотодеструкция пластид: в них отсутствуют фотосинтетическая активность, тилакоидные мембраны и рибосомы. Однако ДНК и оболочка органелл повреждаются сравнительно мало. При сравнении экспрессии четырех ядерных генов - генов стрессовых белков пластид ЕНр и Шр32 и генов белков фотосинтеза ЬИсЬ и ЯЬсБ, в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласты, было обнаружено, что транскрипция генов белков фотосинтеза наиболее чувствительна к пластидному сигналу. На экспрессию ядерного гена хлоропластного белка теплового шока Нзр32 пластидный сигнал не оказывает действия: его транскрипция практически не отличается у ^-обработанных и контрольных растений. Поэтому можно говорить о том, что НБр32 является геном, экспрессия которого относительно нечувствительна к пластидному сигналу. Уровень транскрипции гена Elip снижен у фотоповрежденных растений. Это указывает на то, что дифференцированные хлоропласты контролируют экспрессию данного гена. Наши результаты о регуляции экспрессии гена Elip согласуются также с представлением о том, что экспрессия ядерных генов регулируется функциональным состоянием пластид скорее непрерывно, чем дискретно по принципу «open-shut gate». Возможно, что различная чувствительность транскрипции изученных четырех генов к фотодеструкции хлоропластов отражает различия в регуляторных элементах промоторов соответствующих генов. Таким образом, хлоропласты принимают непосредственное участие в регуляции экспрессии ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip.

Обнаружено, что при фотодеструкции в хлоропластах ячменя кроме зрелых форм белков Elip и Hsp32 наблюдается накопление их предшественников. В этих условиях не обнаруживаются предшественники хлоропластных белков периферической антенны ФСП (Lhcbl) и СЕ рибулозобисфосфаткарбоксилазы (RbcS). Как показали результаты нашей работы, это может объясняться тем, что транскрипция генов стрессовых белков продолжается, а транскрипция генов белков фотосинтеза заблокирована. При окислительном стрессе, вызванном недостатком каротиноидов, частично нарушается импорт белков в хлоропласты, при этом предшественники белков накапливаются в оболочке пластид. Такой вывод следует из опытов по обработке изолированных пластид экзогенными протеазами (трипсином). По-видимому, N-конец стрессового белка находится в оболочке пластид, в то время как С-конец экспонирован снаружи и поэтому подвержен действию протеаз. У NF-обработанных и контрольных растений предшественники стрессовых белков связываются с сайтами транслокации оболочки хлоропластов, но у NF-обработанных растений реакция переноса частично нарушена.

Чтобы обнаружить корреляцию между уровнем экспрессии гена белка светового стресса Elip и содержанием тетрапирролов - предполагаемых сигнальных молекул, биосинтез которых локализован у высших растений в хлоропластах, использовали 2,2'-дипиридил. Этот ингибитор является хелатором железа, блокирует железосодержащий фермент оксидазу монометилового эфира Mg-протопорфирина IX, что приводит к повышению внутриклеточного содержания Mg-протопорфирина IX и его монометилового эфира. Дипиридил широко используется при изучении регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков. Обнаружено, что повышение содержания Mg-прото IX и Mg-прото IX-Ме коррелирует с понижением экспрессии гена ЕИр . Это указывает на зависимость экспрессии гена хлоропластного белка светового стресса от внутриклеточного содержания интермедиатов биосинтеза тетрапирролов. В нашей работе впервые показано, что в регуляции транскрипции гена ЕИр у ячменя участвуют тетрапирролы, частично ингибируя экспрессию этого гена (на ~ 50%). Отсюда следует, что пластидный сигнал, медиаторами которого являются М§-протопорфирин IX и М§-протопорфирин 1Х-Ме, подавляет транскрипцию данного гена, поэтому можно говорить о негативной регуляции тетрапирролами экспрессии ЕИр. Сходные результаты получены при оценке содержания транскриптов гена ЕИр методом нозерн-гибридизации и ОТ-ПЦР.

Кроме того, было обнаружено, что в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласты, повышено содержание промежуточных продуктов биосинтеза тетрапирролов М§-протопорфирина IX и монометилового эфира протопорфирина IX по сравнению с контролем. При фотодеструкции в первую очередь разрушаются внутренние мембраны хлоропластов, в то время как оболочка остается неповрежденной, поэтому там накапливаются 1У^-протопорфирин IX и метиловый эфир протопорфирина IX. Таким образом, ОТ вызывает увеличение содержания тетрапирролов в хлоропластах. Содержание 1У^-протопорфирин IX и его метилового эфира увеличивалось в опытах с № в 1,5 раза по сравнению с контролем.

Наши данные показали, что функциональное состояние пластид влияет на экспрессию гена низкомолекулярного белка светового стресса, и важным звеном в этом процессе являются тетрапирролы. Известно, что тетрапирролы участвуют в регуляции экспрессии ряда генов фотосинтеза у высших растений. Нами показано, что светоиндуцируемый ген ЕИр также регулируется пластидным сигналом, медиаторами которого являются М§-протопорфирин IX и монометиловый эфир Мд-протопорфирина IX.

Для того чтобы определить роль синтеза хлоропластных белков в регуляции экспрессии гена ЕИр, проростки ячменя обрабатывали линкомицином - ингибитором трансляции в пластидах. Анализ результатов, полученных при нозерн-гибридизации, показал, что уровни транскрипции ЕИр у обработанных линкомицином и контрольных недельных растений не отличаются. Поэтому можно говорить о том, что у семидневных растений ячменя продукты синтеза белка в пластидах не участвуют в регуляции экспрессии гена ЕИр. Это согласуется с литературными данными о том, что ингибиторы белкового синтеза эффективно подавляют экспрессию ядерных генов белков хлоропластов только на ранних стадиях развития проростков, в первые 2-3 дня прорастания. Такой пластидный сигнал нужен, вероятно, для индукции экспрессии ядерных генов ранних белков фотосинтеза (Gray et al., 2003,2005).

Чтобы выявить корреляцию между уровнем экспрессии гена белка светового стресса и редокс-состоянием хлоропластов использовали ингибитор ФСН - DCMU. Как известно, ингибирование ФСН приводит к окислению пула пластохинонов, который, в основном, и определяет редокс-состояние хлоропластов. Показано, что редокс-состояние электрон-транспортной цепи фотосинтеза участвует в регуляции экспрессии ядерного гена низкомолекулярного хлоропластного белка светового стресса Elip. Изменение редокс-состояиия хлоропластов, вызванное обработкой проростков ячменя DCMU (специфический ингибитор ФСН), приводит к снижению транскрипции гена Elip (на ~ 80%). Таким образом, в регуляции экспрессии гена Elip у ячменя участвуют не только тетрапирролы, но и другой класс пластидного сигнала, который индуцируется окисленным пулом пластохинонов. Тот факт, что экспрессия ядерного гена белка Elip регулируется разными классами пластидных сигналов, свидетельствует о том, что экспрессия одного и того же гена может кооперативно регулироваться множественными пластидными сигналами.

Поскольку Elip - хлоропластный белок светового стресса, ген Elip регулируется также светом. Как было показано ранее, в этиолированных проростках гороха транскрипция Elip индуцируется с помощью синего и красного света (Adamska, 1995), в то время как в тканях зрелых растений Elip индуцируют синий и ультрафиолетовый свет (Adamska et al., 1992 a, b). Известны фоторецепторы, участвующие в регуляции транскрипции генов гомологичных белков Elip, причем показано, что гены низкомолекулярного и высокомолекулярного белков Elip различаются по способу регулирования, что предполагает разные функции этих белков (Levy et al., 1993). По данным Кузнецова и др. (Kusnetsov et al., 1996) свет и сигналы, генерируемые хлоропластами, действуют на одни и те же участки промоторов светоиндуцируемых генов. Свет (фитохром) активирует гетеромерный G белок (Lefkowitz, 1993; Ma, 1994; Neer, 1995), который, в свою очередь, активирует три последующих процесса: первый протекает с участием cGMP, второй - с участием у I

Са /кальмодулина, и в третьем участвуют cGMP и Са /кальмодулин.

Существуют три модели, объясняющие взаимодействие пластидного и светового сигналов: 1) Передача светового сигнала непосредственно не влияет на экспрессию ядерных генов хлоропластов; он способствует биогенезу пластид, который, в свою очередь, стимулирует экспрессию ядерных генов благодаря «освобождению» пластидного сигнала (Thompson, White, 1991). 2) Пластидный сигнал контролирует более поздние этапы световой регуляции. Отсутствие этого сигнала может инактивировать факторы транскрипции, которые обычно активируются светом. 3) Пластидный сигнал контролирует экспрессию генов с помощью взаимодействия с ранними компонентами светового сигнального пути. Поскольку G белки активируют и Са2+/кальмодулин и cGMP-зависимый пути и оба этих пути необходимы для развития хлоропластов, возможно, это эти белки являются той «точкой», в которой пластидный сигнал эффективно контролирует действие света (Kusnetsov et al., 1996). Эти данные подтверждают, что в клетках существует сложная сигнальная сеть, регулирующая координированную экспрессию ядерных и хлоропластных генов, при этом пластидные сигналы могут как ингибировать транскрипцию ядерных генов, так и активировать ее (La Rocca et al., 2001).

Получены экспериментальные доказательства наличия, по крайней мере, пяти путей передачи пластидных сигналов. Более того, один и тот же ядерный ген может регулироваться несколькими пластидными сигналами. Как, например, в случае гена Elip, на экспрессию которого влияют пластидные сигналы нескольких классов (тетрапирролы и редокс-состояние хлоропластов).

На основании вышеизложенного, нами предложена схема регуляции хлоропластами экспрессии ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip (рис. 19). Накопление промежуточных соединений биосинтеза хлорофилла (Mg-прото IX и его монометилового эфира) в оболочке хлоропластов приводит к снижению уровня экспрессии гена Elip на ~50%. По-видимому, Mg-прото IX и Mg-прото IX Me поступают в цитозоль, и в ходе ряда последовательных реакций блокируют фактор транскрипции (фактор активности), что приводит к снижению уровня экспрессии этого гена. Возможна и регуляция экспрессии Elip с участием редокс-равновесия электрон-транспортной цепи фотосинтеза. Таким образом, можно говорить о функционировании при регуляции экспрессии гена Elip двух классов пластидно-ядерного взаимодействия. Первый класс предполагает участие Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me в инициации процессов, приводящих к изменению транскрипции этого гена. Поскольку в настоящее время не обнаружены последующие этапы пластидно-ядерного взаимодействия с участием Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me (транскрипционные факторы, способные взаимодейсвовать с данными соединениями), эти тетрапирролы можно считать «медиаторами» пластидного сигнала. Второй класс пластидно-ядерного взаимодействия осуществляется при непосредственном участии электрон-транспортной цепи фотосинтеза. Ингибирование транспорта электронов от ФСП к пулу пластохинонов в хлоропластах ячменя, в результате чего пул остается окисленным, вызывает понижение уровня транскриптов гена ЕИр. осми тилакоиды

ФС1 Синтез белка

А1А

РС2Н2

Редокс-состояние электрон-транспортной цепи

Прото ч 4 Мд-прото рецепторы света

ХЛОРОПЛАСТ

Рис. 19. Схема участия разных классов пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков.

Функционирование указанных двух классов пластидно-ядерного взаимодействия, приводящее к снижению уровня экспрессии ядерного гена белка светового стресса ЕИр, позволяет говорить о негативной регуляции экспрессии этого гена этими классами сигналов.

Общие принципы работы сигнальных систем, по-видимому, универсальны в клетках живых организмов. Это касается структуры рецепторов, встроенных в клеточные мембраны, О-белков, ферментов сигнальных систем, структуры протеинкиназ, протеинфосфатаз, факторов регуляции транскрипции, РНК-полимераз, рибосом и т. д. (Тарчевский, 2002). Сложная сеть сигнальных систем клетки тесно взаимодействует с ядерным геномом; существует постоянный двусторонний обмен сигналами между геномом и органеллами, что позволяет координировать жизнедеятельность клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Погульская, Елена Николаевна, Москва

1. Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл. Минск. «Тэхналопя». 2003. С. 270-276.

2. Одинцова М.С., Юрина Н.П. Общие черты структурной организации генома хлоропластов. Сравнение с геномами про- и эукариот. Мол. биология. 1992. Т. 26. С. 757-771.

3. Одинцова М.С., Юрина Н.П. Редактирование РНК в хлоропластах и митохондриях растений. Физиология растений. 2000. Т. 37. № 2. С. 307-320.

4. Одинцова М.С., Юрина Н.П. Геном пластид высших растений и водорослей: структура и функции. Мол. биология. 2003. Т. 37. № 5. С. 1-16. Одинцова М.С., Юрина Н.П. Геномика и эволюция клеточных органелл. Генетика. 2005. Т.41. С. 1170-1182.

5. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. Москва. «Наука». 2002. С. 294.

6. Adamska I. Regulation of early light-inducible protein gene expression by blue and red light in etiolated seedlings involves nuclear and plastid factors. Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 1167-1175.

7. Adamska I., Kloppstech K. Low temperature increases the abundance of early light-inducible transcript under light stress conditions. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 3022130226.

8. Adamska I., Kloppstech K., Ohad I. UV light stress induces the synthesis of the early light-inducible protein and prevents its degradation. J. Biol. Chem. 1992a. V. 267. P. 2473224737.

9. Adamska I., Ohad I., Kloppstech K. Synthesis of the early light-inducible protein is controlled by blue light and related to light stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992b. V. 89. P. 2610-2613.

10. Adamska I., Kloppstech K., Ohad I. Early light-inducible protein in pea is stable during light stress but is degraded during recovery at low light intensity. J. Biol. Chem. 1993a. V. 268. P. 5438-5444.

11. Adamska I., Kloppstech K., Ohad I. The effect of free radical enhancers and scavengers on accumulation of early light-inducible protein during light stress. Z. Naturforsch. 1993b. V. 48c. P. 391-396.

12. Adamska I., Funk C., Renger G., Andersson B. Developmental regulation of the PsbS gene expression in spinach seedlings: The role of phytochrome. Plant Mol. Biol. 1996a. V. 31. P. 793-802.

13. Adamska I., Lindahl M., Roobol-Boza M., Andersson B. Degradation of the light stress protein is mediated by an ATP-independent serine-type protease under low light conditions. Eur. J. Biochem. 1996b. V. 236. P. 591-599.

14. Ahlert D., Ruf S., Bock R. Plastid protein synthesis is pequired for plant development in tobacco. Proc Natl Acad Sci. 2003. V. 100. P. 15730-15735.

15. Alawady A.E., Grimm B., Tobacco Mg protoporpyrin IX methyltransferase is involved in increase activation of Mg porphyrin and protoheme synthesis. Plant J. 2005. V. 41. P. 282290.

16. Barkan A., Goldschmidt-Clermont M. Participation of nuclear genes in chloroplast gene expression. Biochimie. 2000. V. 82. P. 559-572.

17. Bartels D., Hanke C., Schneider K., Michel D., Salamini F. A desiccation-releted Elip-liks gene from the resurrection plant Craterostigma plantagineum is regulated by light and ABA. EMBO J. 1992. V. 11. P. 2771-2778.

18. Batschauer A., Mösinger E., Kreuz K. The implication of a plastid-derived factor in the transcriptional control of nuclear genes encoding the light-harvesting chlorophyll a/b protein. Eur. J. Biochem. 1986. V. 154. P. 625-634.

19. Bauer C.E., Elsen S., Bird TH. Mechanisms for redox control of gene expression. Annu. Rev. Microbiol. 1999. V. 53. P. 495-523.

20. Beator J., Pötter E., Kloppstech K. The effect of heat shock on mophogenesis in barley. Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 1780-1786.

21. Beator J., Kloppstech K. The circadian oscillator coordinates the synthesis of apoproteins and their pigments during chloroplast development. Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 191196.

22. Beck C.F., Signalling pathways in chloroplast-to-nucleus communication. Protist. 2001. V. 152. P.175-182.

23. Beck C.F. Signaling pathways from the chloroplast to the nucleus. Planta. 2005. V. 222. P. 743-756.

24. Blanchard JL, Lynch M. Organellar genes: why do they end up in the nucleus? Trends Genet. 2000. V. 16. P. 315-320.

25. Blecken J., Weisshaar B., Herzfeld F. The distinct eis-acting elements are involved in light-dependent activation of the Elip promoter. Mol. Gen. Genet. 1994. V. 245. P. 371379.

26. Bold R., Koshuchowa S., Gross W., Börner T., Schnarrenberger C. Decrease in glycolate pathway ensyme activities in plastids and peroxisomes of the albostrians mutant of barley (.Hordeum vulgare L.). Plant Sei. 1997. V. 124. P. 33-40.

27. Bolle C., Sopory S., Lübberstedt T. The role of plastids in the expression of nuclear genes for thylakoid proteins studied with chimeric ß-glucuronidase gene fusions. Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 1355-1364.

28. Bolle C., Kusnetsov V.V., Herrmann R.G., Oelmüller R. The spinach AtpC and AtpD genes contain elements for light-regulated, plastid-dependent and organ-specific expression in the vicinity of the transcription start sites. Plant J. 1996. V. 9. P. 21-30.

29. Börner T. Enzymes of plastid ribosome-deficient mutants Ferredoxin-NADP+ reductase. Biochem Physiol Pflanzen. 1981. V. 176. P. 737-743.

30. Börner T. Chloroplast control of nuclear gene function. Endocyt Cell Res. 1986. V. 3. P. 265-274.

31. Bradbeer J.W., Atkinson Y.E., Börner T., Hagemann R. Cytoplasmic synthesis of plastid polypeptides may be controlled by plastid-synthesised RNA. Nature. 1979. V. 279. P. 816817.

32. Brown E.C., Somanchi A., Mayfield S.P. Interorganellar crosstalk: new perspectives on signaling from the chloroplast to the nucleus. Genome Biology. 2001. V. 2. P. 1021110214.

33. Chen Y.-B., Durnford D.G., Koblizek M., Falkowski P.G. Plastid regulation of Lhcbl transcription in the chlorophyte alga Dunaliella tertiolecta. Plant Physiology. 2004. V. 136. P. 3737-3750.

34. Chory J. Out darkness: mutants reveal pathways controlling light-regulated development in plants. Trends Genet. 1993. V. 9. P. 167-172.

35. Chory J., Surpin M, Larkin R.M. Signal transduction between the chloroplast and the nucleus. Plant Cell. 2002. V. 14. P. 327-338.

36. Cleveland D.W. Peptide mapping in one dimension by limited proteolysis of sodium dodecyl sulfatesolubilized proteins, in: Fleischer S., Fleischer B. Methods in Enzymology. Academic Press, New York. 1983. V. 96. P. 222-229.

37. Duckett C.M., Gray J.C. Illuminating plant development. Bioessays. 1995. V. 17. P. 101-^ 103.

38. Dumford D.G., Falkowski P.G. Chloroplast redox regulation of nuclear gene transcription during photoacclimation. Photosynth Res. 1997. V. 53. P. 229-241.

39. Dutilleul C. et. al. Leaf mitochondria modulate whole cell redox homeostasis, set antioxidant capacity, and determine stress resistance through altered signaling and diurnal regulation. Plant Cell. 2003b. V. 15. P. 1212-1226.

40. Eisenberg-Domovich Y., Kloppstech K., Ohad I. Reversible membrane association of heat-shock protein 22 in Chlamydomonas reinhardtii during heat shock and recovery. Eur. J. Biochem. 1994. V. 222. P. 1041-1046.

41. Emanuel C., Weihle A., Graner A., Hess W.R., Börner T. Chloroplast development affects expression of phage-type RNA polymerases in barley leaves. Plant J. 2004. V. 38. P. 460-^ 472.

42. Escoubas J.M., Lomas M., La Roche J., Falkowski P.G. Light intensity regulation of cab gene transcription is signaled by the redox state of the plastoquinone pool. Proc Natl Acad. 1995. V. 92. P. 10237-10241.

43. Goldschmidt-Clermont M. Coordination of nuclear and chloroplast gene expression in plant cells. Int. Rev. Cytol. 1998. V. 177. P. 115-180.

44. Gray J.C., Sornarajah R., Zabron A.A., Duckett C.M., Khan M.S. Chloroplast control of nuclear gene expression. In Photosynthesis, from light to biosphere. 1995. V. 3. P. 543550.

45. Gray M.W., Lang B.F., Cedergren R. Genome structure and gene content in protists mitochondrial DNAs. Nucl. Acids Res. 1998. V. 26. P. 865-878.

46. Gray MW. Evolution of organellar genomes. Curr Opin Genet Dev. 1999. V. 6. P. 678687.

47. Gray J.C. Chloroplast-to-nucleus signalling: a role for Mg-protoporphyrin. Trends Genet. 2003. V. 19. P. 526-529.

48. Grimm B., Kruse E., Kloppstech K. Transiently expressed early light-inducible thylakoid proteins share transmembrane domains with light-harvesting chlorophyll binding protein. Plant Molecular Biology. 1989. V. 13. P. 583-593.

49. Grimm B., Kloppstech K. The early light-inducible proteins of barley. Eur. J. Biochem. 1987. V. 167. P. 493-499.

50. Gyurjan I, Yurina NP, Thurischeva MS, Odintsova MS. Altered chloroplast ribosomal proteins in a yellow mutant of Chlamydomonas reinhardii. Mol Gen Genet. 1979. V. 2. P. 203-211.

51. Hedtke B., Wagner I., Borner T., Hess W.R. Interorganellar crosstalk in higher plants: impaired chloroplast development affects mitochondrial gene and transcript levels. Plant J. 1999. V. 19. P. 635-644.

52. Hess W.R., Nagy F., Börner T. Ribosome-deficient plastids affect transcription of light-induced nuclear genes: genetic evidence for a plastid-derived signal. Mol Gen Genet. 1994. V. 242. P. 305-312.

53. Hon T., Hach A., Tamalis D., Zhu Y., Zhang L. The yeast heme-responsive transcriptional activator Hapl is a preexisting dimer in the absence of heme. J Biol Chem. 1999. V. 274. P. 22770-22774.

54. Jacobs J.M., Jacobs N.J. Porphyrin accumulation and export by isolated barley (Hordeum vulgare) plastids. Plant Physiol. 1993. V. 101. P. 1181-1187.

55. Khrebtunkova I., Spreitzer R.J. Elimination of the Chlamydomonas gene family that encodes the small subunit of ribulose-l,5-biphosphate carboxylase/oxygenase. Proc. Natl. Acad. Sei USA. 1996. V. 93. P. 13689-13693.

56. Kloppstech K., Otto B., Sierralta W. Cyclic temperature treatments of dark-grown pea seedlings induce a rise in specific transient levels of light-regulated genes related to photomorphogenesis. Mol. Gen. Genet. 1991. V. 225. P. 468-473.

57. Kolanus W., Scharnhorst C., Kühne U., Herzfeld F. The structure and light-dependent transient expression of a nuclear-encoded chloroplast protein gene from pea (Pisum sativum L.). Mol. Gen. Genet. 1987. V. 209. P. 234-239.

58. Kropat J., Beck C.F. Characterization of photoreceptor and signaling pathway for light induction of the Chlamydomonas heat-shock gene HSP70A. Photobiol. 1998. V. 68. P. 414419.

59. Kropat J., Oster U., Rüdiger W., Beck C.F. Chlorophyll precursors are signals of chloroplast origin involved in light induction of nuclear heat-shock genes. Proc Natl Acad Sei. 1997. V. 94. P. 14168-14172.

60. Kruse E., Kloppstech K. Integration of early light-inducible proteins into isolated thylakoid membranes. Eur. J. Biochem. 1992. V. 208. P. 195-202.

61. Maenpaa P., Gonzalez E.B., Chen L. et al. The ycf9 (or/62) gene in the plant chloroplast genome encodes a hydrophobic protein of stromal thylakoid membranes. J. Exp. Bot. 2000. Spec. № P. 375-382.

62. Martin W., Herrmann R.G. Gene transfer from organelles to the nucleus: how much, what happens and why? Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 9-17.

63. Martin W., Stoebe B., Goremykin V. et al. Gene transfer to the nucleus and the evolution of chloroplasts. Nature. 1998. V. 393. P. 162-165.

64. Mayfield S.P., Taylor W.C. Chloroplast photooxidation inhibits the expression of a set of nuclear genes. Molecular and General Genetics. 1987. V. 208. P. 309-314.

65. McCormac D.J., Barkan A. A nuclear gene in maize required for the translation of the chloroplast atpB/E mRNA. Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1709-1716.

66. Montane M.H., Kloppstech K. The family of light-harvesting-related proteins (LHCs, ELIPs, HLIPs): was the harvesting of light their primary function? Gene. 2000. V. 258.P. 1-8.

67. Oelmliller R. Photooxidative destruction of chloroplast and its effect on nuclear gene expression and extraplastidic enzyme levels. Photochem Photobiol. 1989. V. 49. P. 229

68. Oelmuller R., Mohr H. Photooxidative destruction or chloroplast and its consequences for expression of nuclear genes. Planta. 1986. V. 167. P. 106-113.

69. Oelmuller R., Dietrich G., Link G., Mohr H. Regulatory factors involved in gene expression (subunits of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase) in mustard (Sinapis alba L.) cotyledons. Planta. 1986a. V. 169. P. 260-266.

70. Oelmuller R., Levitan I., Bergfeld R. Expression of nuclear genes as affected by treatments acting on plastids. Planta. 1986b. V. 168. P. 482-492.

71. Pearson C.K., et. al. NAD turnover and utilization of metabolites for RNA synthesis in a reaction sensing the redox state of the cytochrome b(f complex in isolated chloroplasts. Eur. J. Biochem. 1993. V. 218. P. 397-404.

72. Pfannschmidt T., Allen J.F., Oelmuller R. Principles of redox control in photosynthesis gene expression. Physiol Plant. 2001. V. 112. P. 1-9.

73. Pfannschmidt T. Chloroplast redox signals: how photosynthesis controls its own genes. Trends Plant Sci. 2003. V. 8. P. 33-41.

74. Pfannschmidt T., Nilsson A., Allen J.F., Photosynthetic control of chloroplast gene expression. Nature. 1999. V. 397. P 625-628.

75. Potter E, Beator J, Kloppstech K. The expression of mRNAs for light-stress proteins in barley: inverse relationship of mRNA levels of individual genes within the leaf gradient. Planta. 1996. V. 199. P. 314-320.

76. Potter E., Kloppstech K. Effect of light stress on the expression of early light-inducible protein in barley. Eur. J. Biochem. 1993. V. 214. P. 779-786.

77. Puente P., Wei N., Deng X.-W. Combinatorial interplay of promoter elements constitutes the minimal determinants for light and developmental control of gene expression in Arabidopsis. EMBO J. 1996 V. 15. P. 3732-3743.

78. Race H.L., Herrmann R.G., Martin W. Why have organelles retained genomes? Trends Genet. 1999. V. 15. P. 364-370.

79. Rebeiz C.A., Mattheis J.R., Smith B.B., Rebeiz C.C., Dayton D.F. Biosynthesis and accumulation of protochlorophyll by isolated etioplasts and developing chloroplasts. Arch. Biochem. Biophys. 1975. V. 171. №2. P. 549-567.

80. Richly E., Dietzmann A., Biehl A., Kurth J., Laloi C., Apel K., Salamini F., Leister D. Covariations in the nuclear chloroplast transcriptome reveal a regulatory master-switch. EMBO reports. 2003. V. 4. P. 491-498.

81. Rochaix J.-D. The three genomes of Chlamydomonas. Photosynthesis Res. 2002. V. 73. P. 285-293.

82. Smith H. Physiological and ecological function within the phytochrome family. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1995. V. 46. P. 289-315.

83. Somerville C.R. Analysis of photosynthesis with mutants of higher plants and algae. Annu. Rev. Plant Physiol. 1986. V. 37. P. 467-507.

84. Stapel D., Kruse E., Kloppstech K. The protective effect of heat shock proteins against photoinhibition under heat shock in barley (Hordeum vulgare). J. Photochem. Photobiol. D. Biol. 1993. V. 21. P. 211-218.

85. Strand A., Asami T., Alonso J., Ecker J.R., Chory J. Chloroplast to nucleus communication triggered by accumulation of Mg-protoporphyrin IX. Nature. 2003. V. 421. P. 79-83.

86. Sullivan J.A., Gray J.C. Plastid translation is required for the expression of nuclear photosynthesis genes in the dark and in roots of the pea lipl mutant. Plant Cell. 1999. V. 11. P. 901-910.

87. Surpin M., Larkin R.M., Chory J. Signal transduction between the chloroplast and the nucleus. Plant Cell. 2002. V. 14. P. 327-338.

88. Taylor W.C. Regulatory interactions between nuclear and plastid genomes. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1989. V. 40. P 211-233.

89. Taylor W.C. Regulatory interaction between nuclear and plastid chromosomes. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1989. V. 40. P. 211-233.

90. Terzaghi W.B., Gashmore A.R. Light-regulated transcription. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1995. V. 46. P. 445-474.

91. Thompson W.F., White M.J. Physiological and molecular studies of light-regulated nuclear genes in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 423-466.

92. Waters E., Vierling E. Chloroplast small heat shock proteins: evidence for atypical evolution of an organelle-localized protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 14394-14399.

93. Wei N., Deng X.-W. The role of COP/DET/FUS genes in light control of Arabidopsis seedling development. Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 871-878.

94. Yabuta Y., Maruta T., Yoshimura K., Ishikawa T., Shigeoka S. Two distinct redox signaling pathways for cytosolic APX induction under photooxidative stress. Plant Cell Physiol. 2004. V. 45. P. 1586-1594.

95. Yoshida R., Sato T., Kanno A., Kameya T. Streptomycin mimics the cool temperature response in rice plants. J. Exp. Bot. 1998. V. 49. P. 221-227.

96. Yurina N.P., Odintsova M.S., Maliga P. An altered chloroplast ribosomal protein in streptomycin resistant tobacco mutant. Theor. Appl. Genet. 1978. V. 52. P. 125-128.

Информация о работе

Погульская, Елена Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP и HSP32 у проростков ячменя - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы