Роль ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis thaliana

Осипенкова, Ольга Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis thaliana
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis thaliana"

На правах рукописи

003471357

ОСИПЕНКОВА Ольга Валерьевна РОЛЬ РЕТРОГРАДНЫХ ПЛАСТИДНЫХ СИГНАЛОВ В ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ЕЫР1 И ЕЫР2 У АгаЬШорв^й ИгаИапа

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 8 -7ППП

Москва 2009

003471357

Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.П. ЮРИНА доктор биологических наук И.В. ЕЛАНСКАЯ

доктор биологических наук, профессор В.В. КУЗНЕЦОВ

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ им. М.В. Ломоносова

2009 г. в -/Л

Защита состоится ' & //гО/7^1 2009 г. в /с^ часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.

Автореферат разослан / ' 2009 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хлоропласта являются не только центрами фотосинтетической деятельности растительных тканей, но принимают участие также в биосинтезе аминокислот, витаминов, пиримидинов, начальных этапах биосинтеза абсцизовой кислоты, восстановлении сульфатов и ряде других процессов. Хотя хлоропласта имеют собственный геном, большинство белков, необходимых для их функционирования, кодируется ядерным геномом и только небольшая часть кодируется геномом органелл (Leister, 2003; Одинцова и Юрина, 2003). Координированная экспрессия генов ядра и пластид, необходимая для развития и функционирования растительной клетки, достигается путем внутриклеточных взаимодействий ядра и пластид с помощью антероградного (от ядра к пластидам) и ретроградного (от пластид к ядру) механизмов регуляции (Taylor, 1989; Rodermel and Park, 2003). Важная роль ретроградных пластидных сигналов показана для биосинтеза хлорофилла, транспорта белков в органеллы и ответных реакций растений на стрессовые воздействия (Strand et al., 2003; Юрина и Одинцова, 2006). Роль таких сигналов выполняют продукты синтеза белка в пластидах, тетрапирролы (интермедиаты биосинтеза хлорофилла), а также редокс-состояние пула пластохинонов фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) пластид (Leister, 2003; Strand et al., 2003; Beck, 2005; Погульская и др., 2006; Юрина и Одинцова, 2006; Осипенкова и др., 2007). Для исследования ретроградных пластидных сигналов используют genome uncoupled (gun) мутанты Arabidopsis с нарушенной передачей пластидных сигналов (Strand et al., 2003). Идентифицированы пять неаллельных gun мутантов, у которых экспрессия кодируемых ядром генов хлоропластных белков, таких как Lhcbl и RbcS, увеличивалась на свету в присутствии гербицида норфлуразона, подавляющего синтез каротиноидов и вызывающего значительные фотоокислительные повреждения хлоропластов из-за образования активных форм кислорода (АФК). Клонированные гены соответствовали пяти оригинальным локусам GUN1-GUN5, четыре из которых (GUN2-GUN5) кодировали белки, участвующие в метаболизме тетрапирролов (Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003). Было высказано предположение, что высшие растения могут использовать Mg-протопорфирин IX (Mg-Proto) и его монометиловый эфир (Mg-ProtoMe) в качестве сигнальных молекул хлоропластов (Woodson and Chory, 2008), хотя до сих пор этот вопрос остается спорным.

Так как растения постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, особый интерес приобретает исследование экспрессии ядерных генов

стрессовых белков пластид ELIP (Early Light-Inducible Proteins), которые играют важную роль в защитных реакциях растений в ответ на действие стрессовых факторов. Эти белки синтезируются на ранних этапах зеленения этиолированных проростков, в условиях светового стресса, засухи и действия низких температур (Grimm and Kloppstech, 1987; Adamska et al., 2001). У высших растений низкомолекулярный (ELIP1) и высокомолекулярный (ELIP2) белки, относящиеся к мультигенному семейству светособирающих хлорофилл ^/¿-связывающих (LHC) белков, кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах, и в форме предшественников пост-трансляционно транспортируются в хлоропласта (Montane and Kloppstech, 2000).

Имеющиеся данные о ретроградных сигналах не позволяют судить о том, какие соединения являются сигнальными молекулами и как влияют пластидные сигналы на экспрессию генов белков светового стресса. Изучение экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 у gun мутантов Arabidopsis поможет получить информацию о роли пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов фотосинтеза.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение роли ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 с помощью gun и hy (аллельных gun) мутантов Arabidopsis thaüana, характеризующихся нарушениями биосинтеза тетрапирролов.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить влияние нарушений передачи тетрапиррол-медиированного ретроградного пластидного сигнала на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2, а также корреляцию между экспрессией этих генов и содержанием хлорофилла на разных стадиях развития hy и gun мутантов Arabidopsis.

2. Выяснить роль предшественников биосинтеза тетрапирролов в экспрессии генов ELIP у hy и gun мутантов с помощью ингибиторного анализа и увеличения содержания Mg-протопорфирина IX. Определить содержание предшественников тетрапирролов (протопорфирина IX, Mg-протопорфирина IX и его монометилового эфира).

3. Изучить действие других типов пластидных сигналов (активных форм кислорода и редокс-состояния пула пластохинонов) на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2.

4. Изучить влияние некоторых сигнальных систем клетки (световой, гормональной и углеводной) на экспрессию генов ELIP при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis.

Научная иовизна. Впервые показано, что нарушения в HY1, HY2 и GUN4 (но не GUN5) сигнальных путях приводят к изменению экспрессии генов стрессовых белков пластид EL1P1 и ELIP2. Ретроградные пластадные сигналы негативно регулируют экспрессию этих генов. Выявлены различия в световой и пластидной регуляции экспрессии генов близкородственных белков EL1P и Lhcb и генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла. Впервые показано, что интермедиаты биосинтеза тетрапирролов - Mg-Proto и его монометиловый эфир - влияют на экспрессию генов EL1P1 и EL1P2, возможно, опосредованно через АФК и редокс-состояние компонентов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) хлоропластов. Эти тетрапирролы непосредственно не участвуют в регуляции экспрессии генов ELIP1 и ELIP2. Обнаружена обратная корреляция между экспрессией генов ELIPI и ELIP2 и содержанием хлорофилла у gun мутантов. Показано, что белки ELIP модулируют синтез хлорофилла, предотвращая накопление свободного пигмента и, таким образом, фотоокислительный стресс.

Научио-практическая ценность. Детальное изучение молекулярных механизмов экспрессии генов и путей передачи сигналов, регулирующих экспрессию генов, необходимых для функционирования ядра и хлоропластов, является перспективным. Биохимические и молекулярно-биологические методы и подходы, используемые при изучении этих механизмов, не уступают мировому уровню и являются пионерскими. Выявление процессов, участвующих в генерации и передаче пластидных сигналов, имеет не только самостоятельный научный интерес, но и позволяет расширить представления о механизмах передачи сигналов и координированной регуляции экспрессии ядерных генов пластид. Молекулярная характеристика индивидуальных компонентов, участвующих в передаче сигналов, необходима для дальнейших исследований в этом направлении. Эти результаты могут быть использованы для регуляции процессов фотосинтеза, который определяет продуктивность сельскохозяйственных растений.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных симпозиумах «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Россия, Татарстан, Казань, 2006); "Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems" (Россия, Пущино, 2006); «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященном 100-летию акад. Н.М. Сисакяна (Россия, Дубна, 2007; Армения, Ереван, 2007) и на международной конференции FEBS "Origin and evolution of mitochondria and chloroplasts" (Италия, Маратея, 2007), а также на VI съезде общества физиологов растений России «Современная физиология растений: от

молекул до экосистем» (Россия, Коми, Сыктывкар, 2007) и семинаре кафедры физиологии растений университета им. А. Гумбольдта «Retrograde signaling in plants» (Германия, Берлин, 2008).

Публикации. Опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ, 1 статья в сборнике и 6 тезисов докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ¿¿¿Щеточников). Диссертация изложена н^^йтраницах, содержиъ^^рисунков и^ таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы дана общая характеристика антероградных и ретроградных сигналов. Детально рассмотрены современные представления о роли тетрапирролов, как возможных пластидных сигналов, в экспрессии ядерных генов белков пластид. Дан краткий обзор биосинтеза тетрапирролов. Приведено краткое описание некоторых сигнальных систем клетки и их роли в экспрессии ядерных генов белков, участвующих в фотосинтезе, а также структуры и функций белков ELIP .

Материалы и методы исследования

Растения и условия выращивания.

В работе были использованы мутанты (hy, gun) и растения дикого типа (ДТ) Arabidopsis thaliana (Arabidopsis): gun5 мутанты были предоставлены проф. Дж. Чори (The Salk Institute for Biological Studies, USA); gun5-l и gun4 мутанты были получены от ABRC (Ohio State University, USA); hyl (gun2) и hy2 (gun3) мутанты были получены от проф. А. Смит (University of Cambridge, UK). Поверхностно стерилизованные семена растений проращивали в стерильных чашках Петри на 2хМС (Murashige and Scoog) среде в течение 9 дней при режиме 8 ч свет/ 16 ч темнота, низкой освещенности (LL) (30 цмоль м'2 с"') и температуре 20-23° С. Для экспериментов со взрослыми растениями проростки растили в

земле в течение 30 дней на свету стандартной интенсивности (SL) (70 цмоль м"2 с'1). Некоторые чашки с семенами подвергали 30-мин экспозиции на свету (70 рмоль м"2 с"1) и затем помещали в темноту для прорастания в течение 10 дней. Семена ячменя (Hordeum vulgare L) проращивали в чашках Петри на смоченной водой фильтровальной бумаге при 2023° С в темноте или при освещении (12 ч свет/ 12 ч темнота) в течение 7 дней. Растения перед всеми опытами выставляли на свет высокой интенсивности (HL) (350 или 550 цмоль м2 с"1), либо холод (10° С) на 2 ч для индукции белков светового стресса пластид ELIP.

Обработка растений.

Норфлуразон (НФ) добавляли в среду для выращивания растений в концентрации 5 цМ, или растения опрыскивали на свету ежедневно в течение одной недели раствором НФ той же концентрации. С 5 мМ 2,2'-дипиридила (ДП) растения инкубировали в течение 8 ч (6 ч при 20-23° С и 2 ч при 10° С). Ацифлуорфен (АФ) добавляли в среду (0.05 цМ) или опрыскивали им растения (1, 5, 10, 20, 30 и 50 цМ) в течение трех дней. В опытах с интермедиатами тетрапирролов инкубацию листьев проводили в водном растворе 50 цМ Mg-Proto в течение 5 ч (3 ч при 20-23° С и 2 ч при 10° С). Инкубацию с 1 мМ 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) проводили в течение 2 ч в условиях HL. Для ингибирования фотохимической активности фотосистемы 2 (ФС2) растения инфильтрировали водным раствором 120 рМ 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевины (диурон). Для опытов с абсцизовой кислотой (АБК) или глюкозой растения в течение 4 дней выращивали на стерильных бумажных фильтрах, погруженных в 2хМС среду, содержащую 2% сахарозу. Затем их переносили на среду, содержащую 5 цМ АБК или 7% глюкозу, и выращивание продолжали еще в течение 6 дней. Семена ячменя замачивали в водном растворе меламиновой соли бис(оксиметил)-фосфиновой кислоты (мелафена) различной концентрации (0.5x10"'° М; 0.5х10"8 М; 0.5х10'5 М; 0.5х10"3 М) в течение 2 ч.

Выделение РНК.

Из гомогенизированных образцов растений с помощью набора «RNeasy Plant Mini kit» («QIAGEN», Германия), «TRIsure» («BIOLINE», Германия) или «YellowSolve» («Клоноген», Санкт-Петербург, Россия) выделяли суммарную РНК в соответствии с рекомендациями производителей. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Электрофорез проводили при напряжении 70 В в течение 1 ч в lxMOPS буфере (0.2 М MOPS; 50 мМ ацетат Na; 1 мМ ЭДТА, pH 8.0). РНК предварительно смешивали с 10 цл буфера для нанесения «LoadingMix» (lOxMOPS - 10 рл, 37% формальдегид - 35 рл, 100% формамид - 100 цл, стерильная вода - 53 цл, 0.5 цг/мл этидий бромид (EthBr - 2 цл), прогревали при 65° С в течение 5 мин и наносили на 1.5% агарозный гель. Флуоресценцию комплекса PHK-EthBr обнаруживали в УФ-свете (трансиллюминатор ТСР-15М «Vilber Lourmat», Франция) и

анализировали с использованием видеосистемы «DNA Analyzer» («Хеликон», Россия) и «AlphaEaseFS StandAlone» («Alpha INNOTECH», «BIOZYM», Германия). Подбор праймеров.

Праймеры для последовательностей генов ELIP1, ELJP2, 18S рРНК, UBQ10, СЫН, Lhcb2, НЕМА1 и НЕМА2 Arabidopsis и ячменя выбирали с помощью программы «Primer3 Input 0.4.0» (http'.//frodo.wi.mit.edu) и заказывали у фирм «БиоТехЛит» (Россия) или «SIGMA-Aldrich» (Германия). Последовательности праймеров представлены в таблице 1.

Таблица 1. Специфические праймеры, использованные для ПЦР.

название гена номер в базе генов направление последовательность праймеров (5'-3') длина праймера темп, отжига длина ПЦР продукта, п.н.

Arabidopsis thaliana

ПЦР в режиме реального времени

ELIP1 AT3G22840 прямой обратный gacgtttagcgatggttgga taccgaggaaccatgagacg 20 20 61 61 108

EL1P2 AT4G14690 прямой обратный gtggtgtcgggtggtttcta cctctgcccttattcccttg 20 20 61 61 84

UBQ10 AT4G05320.2 прямой обратный cgtcttcgtggtggtttctaa tacaaggccccaaaacacaa 21 20 61 61 101

Стандартная ПЦР

ELIP1 AT3G22840 прямой обратный tatccggtgggagtgagatg gagtgtcccacctttgacga 20 20 61 61 468

ELIP2 AT4G14690 прямой обратный ctgctccttccggtgtattg cctctgcccttattcccttg 20 20 61 61 429

Lhcb2 AT2G05070 прямой обратный gacccattgaacttggctga caagacgaccgttcttgagc 20 20 61 61 76

СЫН AT5G13630 прямой обратный attcgcatcctacgaagtgg ttaatcgccaattcctcgac 20 20 61 61 138

H EM AI AT1G58290 прямой обратный tattgcttctggtgcggttt ttttccagcgccaattacac 20 20 61 61 112

НЕМА 2 AT1G09940 прямой обратный ggttgtgaatcgaagcgaag ctgcagcacaagacagcatc 20 20 61 61 107

UBQ10 AT4G05320.2 прямой обратный cgtctcatcttcgctggaa agccatccttagaacccaaca 19 21 61 61 437

18S рРНК XI6077 прямой обратный cggagtaatgattaacagggac ccgcgatccgaacacttca 22 20 61 61 840

Ячмень

Стандартная ПЦР

ELIP клон HVLP60 Х15691 прямой обратный ccgtccgaacaactagcagc ttatccggtcgacagcaaagc 20 21 54 652

ELIP клон HVLP58 XI5693 прямой обратный cttagcaaggagcaccttc cgagcatagcgaagcggcc 19 19 54 697

ШрРНК AY552749 прямой обратный caaggaaggcagcaggcgc cctggtaagtttccccgtgtt 19 21 54 800

Получение комплементарной ДНК (кДНК) с помощью реакции обратной транскрипции (ОТ).

кДНК синтезировали, используя набор «Синтез первой цепи кДНК (базовый)» («СилексМ», Россия) или «Omniscript RT kit» («QIAGEN», Германия), согласно рекомендациям производителей. Для проведения реакции использовали Олиго-дТ или специфические праймеры. Реакцию ОТ проводили на амплификаторе «ДНК ТП-4ПЦР-01 Терцик» («ДНК-Технология», Россия) или «ТЗ THERMOCYCLER» («Biometra», Германия).

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени («Real-time» ПЦР).

«Real-time» ПЦР проводили на роторном анализаторе «Rotor-Gene (RG) 3000» («Corbett Research», Англия) с реакционной смесью, которая содержала: 2х «ImmoMix» (с 1.5 мМ MgCl2) («BIOLINE», Германия) - 10 цл; 35 мМ MgCl2 («BIOLINE», Германия) - 2 цл; 50xSYBR Green («QIAGEN», Германия) - 0.4 цл; 10 мМ прямого и обратного праймеров - по 1 цл; кДНК - 2 цл; стерильная вода - 2.6 цл. Реакцию проводили по следующей схеме:

1. Начальная денатурация - 94°С, 3 мин - 1 цикл. 2. Амплификационный цикл (40 повторов): денатурация - 94°С, 30 с; отжиг праймеров - 61° С, 30 с; элонгация - 72° С, 15 с. 3. Достраивание цепей ДНК - 72° С, 3 мин - 1 цикл.

Кривую плавления строили, устанавливая базовую линию и порог амплификации в соответствии с рекомендациями производителя роторного анализатора. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения LinRegPCR (Pfaff, 2001; Ramakers, 2003). Относительное содержание транскриптов нормализировали по UBQ10. Для подтверждения отсутствия примесей проводили реакции «негативного контроля» без добавления кДНК со всеми используемыми праймерами.

Стандартная ПЦР.

Для ПЦР использовали наборы «ОТ-ПЦР базовый» («СилексМ», Россия) и «BIOTAG PCR Kit» («BIOLINE», Германия). Реакционные смеси (25 цл) готовили согласно рекомендациям производителей. Реакцию амплификации проводили по следующей схеме:

1. Начальная денатурация - 94°С, 3 мин - 1 цикл. 2. Амплификационный цикл (35 повторов): денатурация - 94°С, 30 с; отжиг праймеров - 54 (61)° С (в зависимости от используемых праймеров), 30 с; элонгация - 72° С, 15 с. 3. Достраивание цепей ДНК - 72° С, 5 мин - 1 цикл. 4. Хранение - 4°С.

Было выбрано оптимальное число циклов ПЦР. Контролем, подтверждающим нанесение равных количеств суммарной кДНК, служили 18S рРНК и UBQ10. Параллельно проводили реакции без добавления полимеразы для доказательства отсутствия примесей.

Электрофорез ПЦР-продуктов.

Амплифицированные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 1.5% (для фрагментов > 300 п.н.) и 2% (для фрагментов < 300 п.н.) агарозном геле, содержащем IxTAE буфер (0.04 М Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА) в присутствии 0.5 цг/мл EthBr при напряжении 120В в течение 25 мин. Размер продукта амплификации определяли сравнением с маркерами длин фрагментов. Гель фотографировали и анализировали, как описано выше. Рестрикция амплифицированного фрагмента ДНК ферментами HindIII и BamHI являлась доказательством, что амплификация прошла корректно.

Определение содержания интермедиатов биосинтеза тетрапирролов.

Содержание протопорфирина IX (Proto), Mg-Proto и Mg-ProtoMe определяли по методу, описанному в литературе (Alawady and Grimm, 2005).

Измерение фотохимической активности ФС2.

Флуоресценцию хлорофилла а измеряли на импульсном флуориметре РАМ (РАМ 101/PDA, Heinz Walz, Effeltrich, Германия).

Результаты и их обсуждение

Í 160 &Э 80

а11

££ о * -i X lu

Í¿160

□ - ELÍP1 D - ELIP2

10-дневные

1. Участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии ядерных генов иластидных белков ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis.

1.1. Экспрессия генов ELIP и содержание хлорофилла у hy и gun мутантов на разных стадиях развития растений.

Для того чтобы выяснить, участвуют ли интермедиаты биосинтеза тетрапирролов в экспрессии ядерных генов белков фотосинтеза, мы исследовали экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у четырех мутантов с нарушениями в ферментах биосинтеза тетрапирролов: hy мутанты (аллельные gun) с нарушениями в биосинтезе гема (где HYI гены кодируют гемоксигеназу; HY2 - фитохромобилинсинтазу) и gun мутанты с нарушениями в биосинтезе хлорофилла (где GUN4 гены кодируют белок, участвующий в регуляции активности Mg-хелатазы; GUN5 ген - Н-субъединицу этого фермента).

<Ъ et

30-дневные

№

ДТ

Рис. 1. Уровень экспрессии ELIP1 и EL1P2 у 10- и 30-дневных hy и gun мутантов Arabidopsis. Содержание транскриптов определяли относительно уровня экспрессии генов ELIP1 у ДТ растений, который принимали за 100%.

Анализ ОТ-ПЦР показал, что уровень экспрессии генов ELIP1 и EL1P2 у 10-дневных gun5 и gun5-1 мутантов (полиморфизм в экзоне 3) сходны с уровнем экспрессии этих генов у растений дикого типа. Однако уровень экспрессии генов ELIP у hyl, hy2 мутантов увеличивался на 30-40%, а у gun4 мутантов на 50-60% по сравнению с растениями дикого типа. Уровень экспрессии ELIP2 был ниже, чем ELIP1, как у мутантов, так и у растений дикого типа (рис. 1).

Для того чтобы исследовать экспрессию генов ELIP1 и EL1P2 в процессе развития растений, был проведен эксперимент со взрослыми растениями hy и gun мутантов Arabidopsis. ОТ-ПЦР анализ содержания транскриптов генов EL1P у 30-дневных растений показал, что различия в уровнях экспрессии этих генов у мутантов и растений дикого типа сходны с различиями, наблюдающимися у 10-дневных растений (рис. 1).

Исследование содержания хлорофилла в хлоропластах hy и gun мутантов и ДТ растений Arabidopsis показало, что растения с мутациями, повреждающими пластидные ферменты биосинтеза тетрапирролов, характеризуются пониженным содержанием хлорофилла (у gun4, hyl и hy2 мутантов накапливалось ~ 50% хлорофилла; у gun5-l {gun5) ~ 80%, по сравнению с растениями дикого типа). Различия по содержанию хлорофилла между мутантами и диким типом не зависят от возраста растений. В то же время у взрослых растений хлорофилла накапливалось больше (~ в 2 раза), чем у 10-дневных проростков (рис. 2).

Рис. 2. Содержание хлорофилла у 10- и 30- дневных gun мутантов Arabidopsis. (А) Растения gun5-l, gun4, hyl, hy2 мутантов и ДТ Arabidopsis, выращенные в течение 10 и 30 дней. (Б) Диаграмма накопления хлорофилла у мутантов и растений дикого типа. СВ -сырой вес. Приведенные на рисунке данные являются средними не менее трех независимых экспериментов. ± стандартное отклонение.

Таким образом, было показано, что HYI, HY2 и GUN4 пластидные сигналы позитивно регулируют экспрессию генов ELIP независимо от возраста растений. Эти факты свидетельствуют о том, что экспрессия генов ELIP находится под влиянием пластидных сигналов, генерируемых биосинтезом тетрапирролов. Обнаруженная обратная корреляция между накоплением транскриптов ELIP и содержанием хлорофилла у gun мутантов с нарушениями биосинтеза тетрапирролов, по-видимому, указывает на то, что белки ELIP

модулируют синтез хлорофилла, предотвращая накопление свободного пигмента и, таким образом, защищая клетки от фотоокисления.

1.2. Действие норфлуразона на экспрессию генов ELIP у hy и gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis.

Для того чтобы изучить участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов, как пластидных сигналов, в регуляции экспрессии генов ELIP, были проведены опыты с gun мутантами и ДТ растениями Arabidopsis в присутствии НФ. Как известно, обработка растений НФ - ингибитором биосинтеза каротиноидов, приводит к нарушению функционирования хлоропластов (Mayfield and Taylor, 1987) и подавлению пластидного сигнала (Woodson and Chory, 2008).

Анализ пигментного состава пластид растений, обработанных НФ, показало полное отсутствие хлорофилла и каротиноидов у 10-дневных проростков. Исследование содержания транскриптов ELIPI и ELIP2 с помощью ОТ-ПЦР и ПЦР в режиме реального времени у растений дикого типа показало, что полная дисфункция пластид (при обработке НФ) приводит к значительному ингибированию (на 80-90%) экспрессии ELIP (рис. 3). Однако у НФ-обработанных hy и gun мутантов Arabidopsis наблюдалось только частичное ингибирование экспрессии этих генов (на 40-50%).

А дип4 дип5-1 ДТ пу1 ЬУ2 ДТ eunS ДТ

НФ + -

шр' ШЯШВЯШ -1—-— дмв

164 78 101 47 100 9 143 101 137 106 100 18 95 48 100 8.Э

a IP2 ¡ШИШ» тт-тшш* Ib-*^--[pé fr*»» I

158 69 98 40 100 8 2 135 10S 138 103 100 23 101 42 100 6.7

шо„,Е>.----Hí^------

Рис. 3. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у 10-дневных растений hy и gun мутантов и ДТ Arabidopsis, выросших в присутствии 5 цМ НФ (+) и без добавления ингибитора (-). (А) ОТ-ПЦР анализ накопления ELIP. (Б, В) ПЦР анализ в режиме реального времени. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Содержание транскриптов ELIPI и ELIP2 определяли относительно уровня экспрессии генов ELIP1 у контрольных растений, который принимали за 100%.

Для того чтобы изучить изменяется ли действие ретроградного сигнала на экспрессию ELIP в процессе развития растений, было изучено действие НФ на 30-дневные растения

Arabidopsis. Результаты, полученные с помощью ОТ-ПЦР, показали, что экспрессия ядерных генов стрессовых белков ELIP1 и ELIP2 у НФ-обработанных растений дикого типа была подавлена (на 80-90%), а у hy и gun мутантов практически не изменялась (рис. 4).

дип5-1 дип4 ДТ hyl hy2 ДТ дип 5 ДТ Нф - + - + - + - + -+ - +■ - + - +

ELIP1 — — я. — — ({•_ яш т — |

103 89 157 98 100 15 131 101 137 98 100 12 98 100 100 18

ELIP2 I*™* — mm «"•«■» II— _ — — _ | j ф.. , ■ J

98 87 145 99 100 9 5 142 123 147 126 100 15 87 85 100 14

UBQ10 mm mm, "Т ■ .......II™" — — — ш __ ш —. ш ', ...... | г ^^

Рис. 4. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у НФ-обработанных (+) и контрольных (-) 30-дневных hy и gun мутантов и ДТ растений Arabidopsis. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Таким образом, результаты, полученные при исследовании мутантов с нарушениями в передаче пластидного сигнала, и с помощью ингибиторного анализа, показали, что пластидные сигналы, индуцируемые интермедиатами биосинтеза тетрапирролов, участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов хлоропластных белков ELIP в зависимости от возраста растений.

1.3. Влияние экзогенного и эндогенного Mg-Proto на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у gun5 мутантов и растений дикого типа Arabidopsis.

Ранее было высказано предположение, что Mg-Proto и Mg-ProtoMe - интермедиа™ биосинтеза тетрапирролов могут выступать в роли молекул, передающих сигнал от пластид к ядру. Мы проверили, существует ли зависимость между накоплением этих молекул и содержанием транскриптов ядерных генов ELIP с помощью увеличения их содержания эндогенно (добавлением гербицида ДП) и экзогенно (добавлением Mg-Proto). Как известно, ДП ингибирует биосинтез тетрапирролов на стадии превращения Mg-ProtoMe в протохлорофиллид, в результате чего происходит избыточное накопление Mg-ProtoMe.

ДП в условиях фотодеструкции, вызванной НФ, приводил к значительному подавлению экспресии генов ELIP, как у растений дикого типа, так и у gun5 мутантов (рис. 5А). Как было сказано выше, экспрессия этих же генов у растений, которые были обработаны одним НФ, была только частично подавлена у мутантов (рис. 5Б). Следовательно, повышение содержания Mg-Proto в хлоропластах коррелирует с экспрессией генов ELIP. Кроме того, дополнительным доказательством было значительное снижение экспрессии генов ELIP у

растений дикого типа и gun5 мутантов при действии самого М§-РгоЮ на клетки растений (рис. 5В).

Рис. 5. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 после обработки НФ, ДП и Mg-Proto (+) у gun5 (gun5-l) мутантов и ДТ растений Arabidopsis и контрольных растений (-). (А) 10-дневные растения инкубировали с раствором 5мМ ДП. (Б) Растения росли на НФ-среде. (В) Листья 30-дневных растений инкубировали с 50 цМ Mg-Proto. UBQ10 и I8S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Эти данные и данные литературы позволяли предполагать, что Mg-Proto может выступать в роли сигнальной молекулы, которая участвует в передаче сигналов от хлоропластов к ядру, регулируя экспрессию ядерных генов белков хлоропластов ELIP1 и ELIP2.

1.4. Содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов у gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis, выращенных в присутствии или без НФ.

Для того чтобы выяснить, коррелирует ли содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов с уровнем экспрессии ядерных генов белков пластид EL1P, было изучено содержание предшественников хлорофилла (Proto, Mg-Proto и Mg-ProtoMe) в присутствии НФ у проростков Arabidopsis в условиях светового стресса.

Результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) показали, что в отсутствие ингибитора уровень Proto был выше у gun5-l и gu/i4 мутантов по сравнению с ДТ (рис. 6А). В присутствии НФ накопление Proto было подавлено ~ на 100% у gun4 мутантов и ДТ растений, и у gun5-l мутантов ~ на 50%. Содержание Mg-Proto и Mg-ProtoMe у необработанных gun5-l, gun4 мутантов не отличалось от их уровня у растений дикого типа. Видимо, gun мутации не влияют на накопление этих интермедиатов у растений. В присутствии НФ содержание Mg-Proto и Mg-ProtoMe снижалось как у ДТ растений, так и у gun мутантов. Как следует из рис. 6Б, в присутствии НФ экспрессия генов ELIP была подавлена у растений дикого типа и частично восстановлена у gun5-l и gun4 мутантов.

Таким образом, прямое определение содержания Mg-Proto и Mg-ProtoMe с помощью HPLC не выявило корреляции между уровнем накопления Mg-Proto и Mg-ProtoMe в

условиях фотодеструкции, вызванной НФ, и экспрессией генов ЕЫР. Следовательно, эти интермедиа™ биосинтеза тетрапирролов не являются сигнальными молекулами при передаче ретроградного пластидного сигнала в ядро.

Рис. 6. Содержание тетрапирролов (А) и транскриптов ЕЫР1 и ЕЫР2 (Б) у 10-дневных £11/14, &т5-1 мутантов и ДТ растений АгаЫсЬзрв'м, выросших на НФ-среде (+) или на среде без ингибитора (-). СВ - сырой вес. \JBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Содержание транскриптов ЕЫР1 и ЕЫР2 определяли относительно уровня экспрессии генов ЕЫР1 у ДТ растений, который принимали за 100%.

Это, однако, не означает, что тетрапирролы вообще не участвуют в передаче пластидного сигнала. Не исключено, что деградация 1У^-РгоЮ приводит к образованию побочных продуктов (например, АФК) или к сдвигу редокс-состояния ЭТЦ пластид, которые и могут выступать в качестве ретроградных сигналов. Кроме того, возможно побочное действие ингибиторов (НФ, ДП), поскольку эти гербициды влияют на различные биологические процессы в клетке, которые также могут участвовать в регуляции экспрессии ядерных генов. Несмотря на большое количество полученных данных, остается неясным, как нарушение метаболизма тетрапирролов может приводить к восстановлению транскрипции ЕЫР, и каков механизм передачи пластидного сигнала, Для того чтобы это выяснить, необходимы дальнейшие исследования.

2. Влияние других типов пластидных сигналов на экспрессию генов ЕЫР при нарушении биосинтеза тетрапирролов у 1гу и gun мутантов.

Для того чтобы изучить участие АФК, как возможных пластидных сигналов, в экспрессии генов ЕЫР использовали ацифлуорфен, который ингибирует протопорфириноген-оксидазу (ППО) и приводит к образованию АФК (Майн^е е! а1., 1989). Обработка АФ растений дикого типа и %ип5-1, ку1, Иу2 мутантов Лгабк/ертм на разных стадиях их развития показала, что взрослые растения более АФ-толерантны, чем молодые

растения, причем толерантность растений на НЬ выше, чем на IX. Была обнаружена также повышенная резистентность к АФ у молодых проростков ^иг\5-1 мутантов, имеющих дефект в Н-субъединице Г>/^-хелатазы, что указывает на участие этого фермента в резистентности к гербициду.

С помощью ОТ-ПЦР было показано, что содержание транскриптов ЕЫР1 и ЕЫР2 было снижено у 30-дневных растений дикого типа, обработанных 50 цМ ингибитора, и составляло всего около 30% и 15%, соответственно. Обработка 30 цМ АФ приводила к снижению уровня экспрессии генов ЕЫР1 и ЕЕ1Р2 на ~ 50% и ~ 65%, соответственно (рис.

А 120

Б gunS-1 ДТ hy2 ДТ

Дф - + -+ - + - +

h- — — >« —

Рис. 7. Уровень экспрессии генов ЕЫР1 и ELIP2 у 30- (А) и 10-дневных (Б) растений Arabidopsis, обработанных АФ. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 определяли относительно уровня экспрессии у ДТ растений, который принимали за 100%.

Изучение экспрессии этих генов у молодых растений, развитие которых было подавлено гербицидом, показало, что экспрессия генов ЕЫР у 10-дневных проростков ДТ и Ну мутантов, выращенных на АФ-среде, подавляется на 80-90%. У АФ-обработанных %ип5-1 мутантов было обнаружено снижение экспрессии генов ЕЫР только ~ на 30% (рис. 7Б).

Таким образом, АФ влияет на экспрессию генов ЕЫР у растений АгаЬШорйк, причем увеличение концентрации АФ приводит к более сильному ингибированию экспрессии генов ЕЕ1Р1 и ЕЫР2. В основе этой регуляции, вероятно, лежит е накопление Рго1:о, которое ведет к образованию АФК. По-видимому, можно говорить о негативной регуляции экспрессии генов ЕЫР пластидным сигналом с участием АФК. Однако нельзя исключить возможного побочного действия АФ, что может приводить к накоплению других соединений, которые также могут участвовать в экспрессии ядерных генов ЕЫР.

Для того чтобы изучить экспрессию ядерных генов ЕЕ1Р1 и ЕЫР2 при накоплении интермедиатов биосинтеза тетрапирролов, в условиях, когда хлоропласты подвержены

1 мМ АЛК

Контроль

ELIP1

S 5» а ДТ Si ■о га ДТ

19 20 79 156 102 100

* <0** flK W шш

5.2 8.9 54 151 94 100

аш мот тешя tnt

фотоокислению, была использована АЛК. При действии АЛК на HL избыточное накопление тетрапирролов в клетках приводит к индукции АФК (рис. 8). У мутантов с нарушенной передачей сигнала содержание транскриптов ELIP коррелирует с фотоокислением клеток и заметно ниже (10-20% от контроля), чем у растений дикого типа (60-80% от контроля) после воздействия АЛК (рис. 8).

Таким образом, можно предположить, что избыточное накопление тетрапирролов при действии АЛК на клетки растений приводит к индукции АФК, которые негативно регулируют экспрессию генов ELIP. Возможно, содержание тетрапирролов, вызывающих сильные фотодинамические повреждения, у АЛК-обработанных gun мутантов превышает их содержание у растений дикого типа, или эти мутанты имеют более слабый механизм защиты от окислительного стресса, что может являться причиной отличий в экспрессии генов ELIP у этих растений.

Для того чтобы изучить участие редокс-состояния пула пластохинонов (ПП) пластид в регуляции экспрессии генов ELIP у растений ячменя и Arabidopsis были проведены опыты со специфическим ингибитором, блокирующим транспорт электронов от ФС2 к ПП, -диуроном. Этот ингибитор препятствует восстановлению пула пластохинонов и приводит к накоплению окисленных форм ПП.

Наши данные показали, что действие диурона приводит к снижению транскрипции генов ELIP и подавлению фотохимической активности ФС2 (Осипенкова и др., 2007). Обработка растений ячменя диуроном с помощью опрыскивания приводила к снижению уровня транскрипции генов ELIP на 70-80%, с помощью инфильтрации - к значительному ингибированию (~ на 90%) экспрессии этих генов (рис. 9).

Нарушение биосинтеза тетрапирролов (у gun5 мутантов) не влияло на экспрессию генов ELIP при обработке диуроном. Фотохимическая активность ФС2 у 7-дневных растений ячменя, обработанных диуроном, была подавлена ~ на 30% (Осипенкова и др., 2007).

Рис. 8. ОТ-ПЦР анализ накопления транскриптов ЕЕ1Р1 и Е11Р2 у 30-дневных glln4, gun5-l мутантов и растений дикого типа (ДТ) АгаЫАорйв, инкубированных с 1 мМ АЛК на НЬ (2 ч). ив<210 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Диурон ELIP1

ELIP2

18S рРНК

ячмень - + дипб ДТ дип5 + ДТ

_ -

1МК шшш

100 58 98 100 49 54

............. ...........

100 8.7 94 100 37 41

......^

......."L ................

Рис. 9. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов EL1P1 и ELIP2 у обработанных диуроном (+) и контрольных (-) растений ячменя и Arabidopsis. I8S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Таким образом, эти результаты подтверждают, что редокс-состояние пула пластохинонов хлоропластов может выступать в роли негативного пластидного сигнала при экспрессии генов ЕЫР у растений ячменя и Arabidopsis.

3. Влияние некоторых сигнальных систем клетки на экспрессию генов ЕЫР при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis.

3.1. Действие пластидного сигнала при разной интенсивности света на экспрессию генов мультигенного семейства белков LHC: ELIP1, ELIP2 и Lhcb2 и экспрессию генов, кодирующих ферменты биосинтеза тетрапирролов (НЕМА1, НЕМА2 и СЫН).

Был проведен анализ экспрессии генов стрессовых белков хлоропластов ELIP и близкородственного гена Lhcb2 с генами, кодирующими ферменты биосинтеза тетрапирролов (НЕМА1, НЕМА2 и ChlH) у hy и gun мутантов при разной интенсивности света, для того чтобы сравнить участие ретроградной регуляции и света в их экспрессии.

Изучение влияния пластидного сигнала на экспрессию Lhcb2, HEMAs и СЫН показало, что, в противоположность экспрессии генов ELIP, HY1 и HY2 пластидные сигналы участвуют в негативной регуляции экспрессии генов Lhcb2 и НЕМА1, снижая ее (на 30-50%) и не влияют на экспрессию генов НЕМА2 и ChlH (рис. 10).

Кроме того, GUN4 мутация, приводящая к активации экспрессии генов ELIP и подавлению экспрессии гена ChlH (~ на 50%) не влияла на экспрессию генов HEMAs и Lhcb2. Мутация GUN5-1 не влияла на экспрессию изученных генов, кроме гена ChlH, содержание транскриптов которого было понижено (на 70-80%) у gim5-l мутантов.

Таким образом, экспрессия генов ELIP1 и ELIP2 регулируется пластидным сигналом противоположно генам Lhcb2, НЕМА1 и ChlH. Пластидная регуляция не вовлечена в экспрессию генов НЕМА2.

ELIP1

ELIP2

HEMA1

HEMA2

Lhcb2

СЫН

UBQ10

Было показано, что при увеличении интенсивности освещения уровень экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 увеличивается (~ в 3 раза), а генов Lhcb2 и НЕМА1 снижается (более чем вдвое). Световой сигнал не влияет на экспрессию генов НЕМА2 и СЫН.

Таким образом, экспрессия генов ELIP зависит от интенсивности освещения, как и генов Lhcb2 и HEMAI, однако, эти гены регулируются противоположным образом.

Предполагали, что световой и пластидный сигналы тесно связаны: пластидный сигнал может модулировать действие света и являться его эндогенным регулятором (Larkin and Ruckle, 2008). Некоторые пластидные сигналы могут усиливать действие световых сигналов, как в нашем случае, или превращать их из индукторов в репрессоры генов белков фотосинтеза. Таким образом, несмотря на то, что гены ELIP и Lkcb2 относятся к одному и тому же семейству, они регулируются по-разному световыми и пластидными сигналами, а гены, относящиеся к различным семействам (Lhcb2 и HEMAI), регулируются сходным образом, что согласуется с литературными данными (McCormac and Terry, 2002; Ruckle et al, 2007).

•ч- ■ч- 1Г>

г- СМ с т- см С с

-С -с СП Si дт ■с х: а & дт

— — mm _ —. <ш ■» Ш Ш W»

140 144 168 108 100 342 354 379 339 319

— —. — — <■» — ЯРИ* 'Qt&P ЦНр

144 146 164 100 100 318 322 358 209 210

--- — — — — '--

47 58 99 SS 100 25 23 42 51 49

_ __ — — — •-- —----

93 96 101 98 100 92 97 100 94 98

^^ . .. _______ —_ ^^

Р0Щ ■ .....р- и

69 74 101 117 100 13 21 32 36 39

тш.тт ашв «■»О» -------

93 96 46 16 100 102 99 49 21 97

— — — — — — — — — —

Рис. 10. Накопление транскриптов ELIP1, ELIP2, Lhcb2, HEMAI, НЕМА2 и СЫН у gun и hy мутантов и растений дикого типа (ДТ) Arabidopsis. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

3.2. Влияние регуляторов роста растений и углеводов на экспрессию генов ЕЫР.

Изучение действия природного гормона - абсцизовой кислоты, ингибирующей рост растений, на экспрессию генов ЕЫР показало, что сигналы, индуцируемые АБК, в условиях светового стресса позитивно регулируют экспрессию генов ЕЫР, приводя к ее повышению в 2-2.5 раза (рис. 11).

Исследование участия АБК в передаче ретроградных сигналов с помощью gш5 мутантов показало, что у мутантов наблюдается некоторое снижение экспрессии этих генов. В условиях фотодеструкции, вызванной НФ, АБК значительно ингибировала (на 80-90%) экспрессию генов ЕЫР1 и ЕЫР2 у растений дикого типа и частично (~ на 50%) у gun5 мутантов (рис. 11).

guns gun5 Ï3T

fSSpPHKl

шшт

95 48 100 8.8 100 94 256 51 19

ШшШ шшт «МИ»

100 42 100 6.7 100 89 208 47 8 9

ta* ^МЙЙММР щщшивш |цмн# Щшшшь Щашшё

Рис 11. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у gun5 мутантов и ДТ растений Arabidopsis, обработанных АБК, НФ (+) или в отсутствие ингибитора и гормона (-). I8S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Таким образом, АБК в условиях светового стресса позитивно регулирует экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у растений дикого типа Arabidopsis, что согласуется с современными представлениями о механизме влияния АБК на экспрессию генов стрессовых белков (Wierstra and Kloppstech, 2000; Shen et al., 2006; Koussevitzky et al, 2007). Наши данные об экспрессии генов стрессовых белков при АБК-обработках gun5 мутантов, свидетельствуют в пользу ранее высказанных предположений о том, что СЫН (GUN5) участвует в передаче пластидных сигналов и восприятии АБК-сигналов (Shen et al., 2006). Поскольку у gun5 мутантов отсутствует рецептор сигналов, индуцируемых АБК, поэтому не было обнаружено повышения экспрессии ELIP при действии абсцизовой кислоты. Однако остается неясным, как СЫН выполняет роль посредника между пластидными и АБК-сигналами, участвуя в регуляции экспрессии генов. На основании этих данных можно также говорить о наличии связи между пластидными и АБК-сигналами.

Так как природный фитогормон АБК, ингибирующий развитие и рост растений,

позитивно регулирует экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 у растений Arabidopsis, представляло интерес рассмотреть, как влияют на экспрессию этих генов природные регуляторы роста растений, обладающие стимулирующим действием на процессы развития. Для экспериментов был выбран препарат нового поколения - мелафен (Патент РФ № 2158735, 2000).

Концентрация мелафена 0.5x10"8 М приводит к усилению роста растений и повышению экспрессии гена высокомолекулярного стрессового белка ELIP2 (~ на 35%), однако, более высокие концентрации мелафена негативно влияют на экспрессию этого гена (рис. 12). При этом не было обнаружено влияния мелафена на экспрессию гена, кодирующего стрессовый

О* Ь Q

Мелафен, M о

18S рРНК

Рис. 12. Содержание транскриптов генов ELIP1 и ELIP2 у растений ячменя, обработанных мелафеном в разных концентрациях. 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

белок пластид ЕЫР1. Во всех использованных концентрациях мелафен не влиял на содержание хлорофилла и каротиноидов (Осипенкова и др., 2008). Наши данные показали, что регулятор роста растений мелафен, повышая экспрессию генов стрессового белка хлоропластов ЕЫР2, видимо, влияет на биогенез хлоропластов и приводит к усилению защиты растений от различных стрессовых воздействий.

Таким образом, различные по механизму действия регуляторы роста растений могут сходно влиять на экспрессию генов ЕЫР.

Для того чтобы изучить участие углеводов в экспрессии ядерных генов стрессовых

белков пластид ЕЫР1 и ЕЫР2 проростки Лгаб/с/о/ш.? были выращены на среде, содержащей 2%-ную или 7%-ную глюкозу. Как следует из полученных данных, глюкоза значительно ингибирует транскрипцию ядерных генов белков фотосинтеза ЕЫР1 и ЕЫР2 у растений дикого типа (~ на 80%) (рис. 13). Анализ содержания транскриптов у gun5 мутантов, выращенных на среде с 7% глюкозой, показал, что экспрессия генов ЕЫР1 и ЕЫР2 была снижена только на 60-70%.

Таким образом, изучение участия углеводов в экспрессии ЕЫР показало, что глюкоза в высокой концентрации ингибирует транскрипцию генов ЕЫР у растений дикого типа. У обработанных глюкозой ^ип5 мутантов было обнаружено, что нарушения биосинтеза тетрапирролов способствовали частичному

восстановлению экспрессии. Это видимо, указывает на связь углеводного статуса и ретроградных сигналов, индуцируемых интермедиатами биосинтеза тетрапирролов.

Наличие сахарозы в среде для выращивания также влияло на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ЕЫР в условиях фотодеструкции. Как было сказано выше, экспрессия генов ЕЫР была значительно подавлена у НФ-обработанных растений дикого типа и восстанавливалась у gl^n5-l, %ип4

ДТ дип5 дт дип5 Глюкоза 2% 2% 7% 7%

Рис. 13. Содержание транскриптов ЕЫР1 и ELIP2 у растений gun5 мутантов и дикого типа Arabidopsis, выращенных на среде с 2% или 7% глюкозой. 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

ДТ дип5-1 gunj

НФ - + - + - +

Рис. 14. Содержание транскриптов ЕЫР1 и ЕЫР2 у 10-дневных ¿гш мутантов и ДТ растений Arabidopsis, выросших в присутствии НФ (+) и без добавления ингибитора (-) на среде без сахарозы. \JBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

мутантов, выращенных на среде, содержащей 2%-ную сахарозу (рис. 3, 4). Содержание транскриптов у тех же растений, обработанных ингибитором, но выращенных на среде без сахарозы, отличалось от содержания транскриптов генов ELIP у проростков, выращенных на содержащей сахарозу среде. Не наблюдалось восстановления транскрипции ELIP1 и ELIP2 у gun мутантов, обработанных НФ и выращенных на среде без сахарозы. Результаты ОТ-ПЦР показали, что у ДТ растений в этих же условиях подавляется экспрессия генов ELIP1 и ELIP2 только на 70-80% по сравнению с растениями, выращенными на НФ-среде с 2%-ной сахарозой (рис. 14).

Можно предположить, что при фотодеструкции на транскрипцию ядерных генов не только влияют нарушения биосинтеза тетрапирролов, но и углеводный статус, что предполагает связь этих двух сигнальных путей. Наши данные согласуются с ранее опубликованными данными о регуляции экспрессии ядерных генов Lhcb и НЕМА1 сахарами и GUN4, GUN5 ретроградными сигналами (McCormac and Terry, 2004).

Таким образом, нами показано, что экспрессия ядерных генов стрессовых белков пластид ELIPI и ELIP2 регулируется гормональными сигналами. Так, фитогормон АБК и регулятор роста мелафен на свету повышают экспрессию ядерных генов ELIP. Углеводы подавляют экспрессию генов ELIP.

Заключение

Ретроградные пластидные сигналы координируют экспрессию ядерного и органелльного геномов и влияют на экспрессию ядерных генов белков хлоропластов в зависимости от функционального состояния этих органелл. Мы исследовали экспрессию ELIP1 и ELIP2 у gun и hy мутантов, имеющих нарушения в передаче пластидного сигнала. Было обнаружено, что ретроградные пластидные сигналы, зависящие от HY1, HY2 и GUN4 белков (но не GUN5), влияют на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и EL1P2, негативно регулируя их экспрессию. Кроме того, было обнаружено, что пластидные сигналы по-разному регулируют экспрессию родственных генов ELIP и Lhcb2, и генов биосинтеза тетрапирролов НЕМА1, СЫН: у gun мутантов экспрессия ELIP1 и ELIP2 увеличивается, а экспрессия Lhcb2, НЕМА1, СЫН уменьшается. На экспрессию гена НЕМА2 пластидные сигналы не влияют. Экспрессия генов ELIP, Lhcb2 и НЕМА1 зависит также от интенсивности освещения: увеличение интенсивности освещения приводит к повышению экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 и снижению экспрессии генов Lhcb2, HEMAI. Световой и пластидный сигналы взаимодействуют друг с другом. На экспрессию генов НЕМА2 и СЫН интенсивность освещения не влияет. Исследования gun мутантов Arabidopsis с помощью ингибиторного анализа (норфлуразон, дипиридил) и экзогенного добавления Mg-Proto

указывают на участие тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков EL1P. Однако такие предшественники биосинтеза тетрапирролов, как Mg-Proto и Mg-ProtoMe, по-видимому, не являются сигнальными молекулами, индуцирующими пластидный сигнал. Обнаружена обратная зависимость между содержанием хлорофилла и экспрессией генов ELIP, что указывает на возможное участие белков светового стресса ELIP в регуляции биосинтеза хлорофилла и/или защите хлоропластов от фотоокисления.

Подавление экспрессии генов ELIP при использовании ингибиторов (ацифлуорфен) и предшественника биосинтеза тетрапирролов (5-аминолевулиновая кислота), приводящих к накоплению активных форм кислорода свидетельствует о том, что эти молекулы вовлечены в передачу пластидного сигнала и являются негативными регуляторами экспрессии этих генов. Изучение участия редокс-состояния компонентов ЭТЦ фотосинтеза показало, что этот тип ретроградного сигнала также негативно влияет на транскрипцию генов ELIP. При ингибировании (с помощью диурона) транспорта электронов от ФС2 к пулу пластохинонов в хлоропластах, приводящем к окислению пула пластохинонов, экспрессия генов ELIP снижается.

Кроме пластидных сигналов на экспрессию ядерных генов ELIP действуют сигналы, индуцируемые гормонами и углеводами. Действие регуляторов роста растений с разным механизмом действия (абсцизовая кислота и мелафен) приводит к активации экспрессии генов ELIP на свету. Углеводы подавляют экспрессию генов ELIP.

На основе наших данных можно говорить, что на экспрессию генов ELIP действуют сигналы экзогенного (свет) и эндогенного происхождения (ретроградные сигналы, гормоны, углеводы).

Поскольку наши результаты показали, что молекулы Mg-Proto и Mg-ProtoMe не являются сигнальными, возможно, что эти интермедиаты биосинтеза тетрапирролов могут связываться с компонентами Mg-хелатазного мультибелкового комплекса (в частности, с субъединицей СЫН и/или белком GUN4), которые участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов. Кроме того, изменения Mg-хелатазного комплекса могут приводить к индукции пластидного сигнала. Известно, что фактор транскрипции ABI4 вовлечен в экспрессию генов белков фотосинтеза (Koussevitzky et al., 2007). Поскольку общие принципы работы сигнальных систем, по-видимому, универсальны в клетках, не исключено, что ABI4 влияет на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2. Возможно, что ABI4 может обеспечивать связь ретроградных сигналов хлоропластов с углеводными сигналами и сигналами, индуцируемыми абсцизовой кислотой, которые также участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2.

Таким образом, в клетках существует сложная сигнальная сеть, регулирующая координированную экспрессию ядерных генов, при этом различные типы пластидных сигналов могут конвергировать друг с другом и с другими сигнальными системами клетки и ингибировать (или активировать) транскрипцию ядерных генов ELIP1 и ELIP2.

Выводы

1. Показано, что нарушения ретроградных пластидных сигналов, зависящие от HY1, HY2 и GUN4 белков (но не GUN5), у мутантов Arabidopsis позитивно влияют на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2.

2. При исследовании hy и gun мутантов Arabidopsis впервые обнаружена обратная зависимость между экспрессией генов ELIP и содержанием хлорофилла. Это свидетельствует о том, что белки ELIP1 и ELIP2 участвуют в защите хлоропластов от фотоокисления.

3. Показано участие тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии генов ELIP1 и ELIP2. Mg-протопорфирин IX и его монометиловый эфир, по-видимому, не являются сигнальными молекулами при передаче ретроградного пластидного сигнала в ядро, поскольку их содержание не коррелирует с уровнем экспрессии генов ELIP.

4. Подавление экспрессии генов EL1P1 и ELIP2 ацифлуорфеном и 5-аминолевулиновой кислотой свидетельствует о том, что возникающие активные формы кислорода участвуют в передаче пластидного сигнала. Ингибирование экспрессии генов ELIP диуроном указывает на то, что ретроградный сигнал зависит от редокс-состояния компонентов электрон-транспортной цепи в хлоропластах Arabidopsis.

5. Сравнение действия тетрапиррол-медиированного пластидного сигнала на экспрессию близкородственных генов (ELIP1, ELIP2 и LhcbT) показало, что они регулируются этими сигналами по-разному, а гены, относящиеся к различным семействам (Lhcb2 и НЕМА1), регулируются сходным образом. У hy и gun мутантов световой сигнал, подобно пластидному, увеличивает экспрессию генов ELIP и снижает экспрессию генов Lhcb2 и НЕМА 1.

6. Так как регуляторы роста (абсцизовая кислота и мелафен) усиливают, а углеводы подавляют экспрессию генов ELIP, высказано предположение, что на экспрессию генов стрессовых белков ELIP Arabidopsis наряду с пластидными сигналами действуют сигналы экзогенного (свет) и эндогенного происхождения (гормональные и углеводные).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Осипенкова О.В.. Рахимбердиева М.Г., Карапетян Н.В., Юрина Н.П. Участие двух пластидиых сигналов в регуляции экспрессии ядерного гена хлоропластного белка EL1P. Доклады Российской Академии наук, 2007, т. 416, № 4, с. 546-549.

2. Осипенкова О.В.. Ермохина О.В., Белкина Г.Г., Фаггахов С.Г., Юрина Н.П. Влияние мелафена на экспрессию генов белков светового стресса хлоропластов Elipl и Elip2 у ячменя. Прикладная биохимия и микробиология, 2008, т. 44, № 6, с. 701-708.

Статьи в сборниках:

3. Осипенкова О.В.. Юрина Н.П. Влияние ретроградных сигналов на экспрессию ядерных генов стрессового белка пластид Elip и генов белков фотосинтеза Lhcbl, RbcS. Труды III Международного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященного 100-летию акад. Н.М. Сисакяна, 2007, с. 184-186.

Тезисы докладов:

4. Юрина Н.П., Погульская E.H., Осипенкова О.В.. Олескина Ю.П., Белкина Г.Г. Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков Elip и Hsp32 у ячменя. Второй Международный симпозиум «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете». Россия, Казань, 2006, с. 142-143.

5. Osinenkova О.. Pogulskaya Е., Yurina N. Regulation of nuclear gene expression of plastid stress protein Elip by tetrapyrrole biosynthesis intermediates and chloroplast redox activity. International Meeting «Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems». Россия, Пущино, 2006, с. 211.

6. Осипенкова О.В., Юрина Н.П. Влияние ретроградных сигналов на экспрессию ядерных генов стрессового белка пластид Elip и генов белков фотосинтеза Lhcbl, RbcS. III Международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященный 100-летию акад. Н.М. Сисакяна. Россия, Дубна, 2007, с. 205-206.

7. Осипенкова О.В.. Юрина Н.П. Хлоропластные сигналы и экспрессия ядерных генов, кодирующих стрессовые белки хлоропластов. III Международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященный 100-летию акад. Н.М. Сисакяна. Армения, Ереван, 2007, с. 100.

8. Osipenkova O.V., Yurina N.P. Chloroplasts regulate the expression of nuclear genes encoding ELIP in barley. FEBS Advanced Lecture Course: «Origin and Evolution of Mitochondria and Chloroplasts». Италия, Маратея, 2007, с. 79.

9. Юрииа Н.П., Осипенкова О.В. Пластидиые сигналы: регуляция экспрессии ядерных генов. VI съезд общества физиологов растений России - Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Россия, Сыктывкар, 2007, с. 225-226.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ, Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и стипендии FEBS.

Список сокращений

АБК - абсцизовая кислота

AJIK - 5-аминолевулиновая кислота

АФ - ацифлуорфен

АФК - активные формы кислорода

Диурон - [3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина]

ДП - 2,2'-дипиридил

ДТ - дикий тип Arabidopsis

НФ - норфлуразон

п.н. - пара нуклеотидов

ПП - пул пластохинонов

ФС2 - фотосистема 2

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

HL - свет высокой интенсивности

LL - свет низкой интенсивности

Mg-Proto - магний протопорфирин IX

Mg-ProtoMe - монометиловый эфир магний протопорфирина IX SL - стандартное освещение

Заказ № 56/05/09 Подписано в печать 13.05.2009 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5

.ijr^x ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 j www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Осипенкова, Ольга Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие сведения о сигнальных системах растений.

1.1.1. Антероградная сигнальная система.

1.1.2. Ретроградная сигнальная система.

1.1.2.1. Митохондриальный ретроградный контроль.

1.1.2.2. Пластидный ретроградный контроль.

1.1.3. Взаимодействие сигнальных систем хлоропластов и митохондрий.

1.2. Пластидные сигналы.

1.2.1. Тетрапирролы, как возможные сигнальные молекулы, участвующие в регуляции экспрессии ядерных генов.

1.2.1.1.Краткое описание биосинтеза тетрапирролов.

1.2.1.2. Роль тетрапирролов в регуляции экспрессии ядерных генов.

1.2.1.3. gltn мутанты - модельные объекты для изучения роли интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в передаче пластидного сигнала.

1.2.1.4. Основные доказательства участия тетрапирролов в передаче сигнала от пластид к ядру.

1.2.1.5. Компоненты пути передачи сигналов, индуцируемых интермедиатами биосинтеза тетрапирролов.

1.2.1.6. Действительно ли молекулы тетрапирролов являются ретроградными сигналами?.

1.2.2. Редокс-сигналы пластид.

1.2.2.1. Активные формы кислорода как пластидные сигналы.

1.2.2.2. Редокс-состояние фотосинтетической электрон-транспортной цепи в регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков.

1.2.3. Продукты синтеза белка в пластидах как ретроградный сигнал, участвующий в регуляции экспрессии ряда ядерных генов белков пластид.

1.3. Краткое описание некоторых сигнальных систем клетки.

1.4. Белки светового стресса пластид ELIP.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Растения и условия выращивания.

2.2. Обработка растений ингибиторами.

2.3. Условия светового и холодового стрессов.

2.4. Выделение РНК.

2.5. Очистка РНК от примесей.

2.6. Электрофорез РНК.

2.7. Подбор праймеров.

2.8. Получение цепи комплементарной ДНК с помощью реакции обратной транскрипции.

2.9. «Real-time» ПЦР.

2.10. Стандартная ПЦР.

2.11. Электрофорез ПЦР-продуктов.

2.12. Рестрикционный анализ ДНК.

2.13. Определение содержания интермедиатов биосинтеза тетрапирролов.

2.14. Измерение фотохимической активности ФС2.

2.15. Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков

ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis.

3.1.1. Экспрессия генов ELIP и содержание хлорофилла у hy и gun мутантов на разных стадиях развития растений.

3.1.2. Действие норфлуразона на экспрессию генов ELIP у hy и gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis.

3.1.3. Влияние экзогенного и эндогенного Mg-Proto на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у gun5 мутантов и растений дикого типа Arabidopsis.

3.1.4. Содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов у gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis, выращенных в присутствии или без НФ.

3.2. Влияние других типов пластидных сигналов на экспрессию генов ELIP при нарушении биосинтеза тетрапирролов у hy и gun мутантов Arabidopsis.

3.3. Влияние некоторых сигнальных систем клетки на экспрессию генов ELIP при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis.

3.3.1. Действие пластидного сигнала при разной интенсивности света на экспрессию генов мультигенного семейства белков ЬНС: ЕЕ1Р1, ЕЫР2 и ЬксЬ2 и экспрессию генов, кодирующих ферменты биосинтеза тетрапирролов сНЕМА1, НЕМА2 и СЫН).

3.3.2. Влияние регуляторов роста растений и углеводов на экспрессию генов ELIP.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis thaliana"

Хлоропласты являются не только центрами фотосинтетической деятельности растительных тканей, но принимают участие также в биосинтезе аминокислот, витаминов, пиримидинов, начальных этапах биосинтеза абсцизовой кислоты, восстановлении сульфатов и ряде других процессов. Хотя хлоропласты имеют собственный геном, большинство белков, необходимых для их функционирования, кодируется ядерным геномом и только небольшая часть кодируется геномом органелл (Leister, 2003; Одинцова и Юрина, 2003). Координированная экспрессия генов ядра и пластид, необходимая для развития и функционирования растительной клетки, достигается путем внутриклеточных взаимодействий ядра и пластид с помощью антероградного (от ядра к пластидам) и ретроградного (от пластид к ядру) механизмов регуляции (Taylor, 1989; Rodermel and Park, 2003). Важная роль ретроградных пластидных сигналов показана для биосинтеза хлорофилла, транспорта белков в органеллы и ответных реакций растений на стрессовые воздействия (Strand et al., 2003; Юрина и Одинцова, 2007). Роль таких сигналов выполняют продукты синтеза белка в пластидах, тетрапирролы (интермедиаты биосинтеза хлорофилла), а также редокс-состояние пула пластохинонов фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) пластид (Leister, 2003; Strand et al., 2003; Beck, 2005; Погульская и др., 2006; Юрина и Одинцова, 2007; Осипенкова и др., 2007). Для исследования ретроградных пластидных сигналов используют genome uncoupled (gun) мутанты Arabidopsis с нарушенной передачей пластидных сигналов (Strand et al., 2003). Идентифицированы пять неаллельных gun мутантов, у которых экспрессия кодируемых ядром генов хлоропластных белков, таких как Lhcbl (ген, кодирущий хлорофилл «/¿-связывающие белки светособирающего комплекса фотосистемы 2 (ФС2)) и RbcS (ген, кодирущий малую субъединицу рибулезобифосфаткарбоксилазы), увеличивалась на свету в присутствии гербицида норфлуразона, подавляющего синтез каротиноидов и вызывающего значительные фотоокислительные повреждения хлоропластов из-за образования активных форм кислорода (АФК) (Strand et al., 2003). Клонированные гены соответствовали пяти оригинальным локусам GUN1-GUN5, четыре из которых (GUN2-GUN5) кодировали белки, участвующие в метаболизме тетрапирролов (Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003). Было высказано предположение, что высшие растения могут использовать Mg-протопорфирин IX (Mg-Proto) и его монометиловый эфир (Mg-ProtoMe) в качестве сигнальных молекул хлоропластов (Woodson and Chory, 2008), хотя до сих пор этот вопрос остается спорным.

Так как растения постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, особый интерес приобретает исследование экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP (Early Light Inducible Proteins; ранние светоиндуцируемые белки), которые играют важную роль в защитных реакциях растений в ответ на действие стрессовых факторов(Оптт and Kloppstech, 1987; Adamska, 1997). Эти белки синтезируются на ранних этапах зеленения этиолированных проростков, в условиях светового стресса, засухи и действия низких температур (Adamska et al., 2001). У высших растений низкомолекулярный (ELIP1) и высокомолекулярный (ELIP2) белки, относящиеся к мультигенному семейству белков LHCP (Light Harvesting Chlorophyll a/b Proteins, светособирающие хлорофилл ¿¿/^-связывающие белки) (Strasser and Butler, 1977), кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах, и в форме предшественников пост-трансляционно транспортируются в хлоропласты (Montane and Kloppstech, 2000).

Целью настоящей работы было изучение роли ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 с помощью gun и hy (аллельных gun) мутантов Arabidopsis, характеризующихся нарушениями биосинтеза тетрапирролов.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить влияние нарушений передачи тетрапиррол-медиированного ретроградного пластидного сигнала на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ЕЫР1 и ELIP2, а также корреляцию между экспрессией этих генов и содержанием хлорофилла на разных стадиях развития hy и gun мутантов Arabidopsis.

2. Выяснить роль предшественников биосинтеза тетрапирролов в экспрессии генов ELIP у hy я gun мутантов с помощью ингибиторного анализа и увеличения содержания Mg-протопорфирина IX. Определить содержание предшественников тетрапирролов (протопорфирина IX, Mg-протопорфирина IX и его монометилового эфира).

3. Изучить действие других типов пластидных сигналов (активных форм кислорода и редокс-состояния пула пластохинонов) на экспрессию генов ЕЫР1 и ELIP2.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Осипенкова, Ольга Валерьевна

ВЫВОДЫ

2. При исследовании hy и gun мутантов впервые обнаружена обратная зависимость между экспрессией генов ELIP и содержанием хлорофилла. Это свидетельствует о том, что белки ELIP1 и ELIP2 участвуют в защите хлоропластов от фотоокисления.

3. Показано участие тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии генов ЕЫР1 и ELIP2. Mg-протопорфирин IX и его монометиловый эфир, по-видимому, не являются сигнальными молекулами при передаче ретроградного пластидного сигнала в ядро, поскольку их содержание не коррелирует с уровнем экспрессии генов ELIP.

4. Подавление экспрессии генов ELIP ацифлуорфеном и 5-аминолевулиновой кислотой свидетельствует о том, что возникающие активные формы кислорода участвуют в передаче пластидного сигнала. Ингибирование экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 диуроном указывает на то, что ретроградный сигнал зависит от редокс-состояния компонентов электрон-транспортной цепи.

5. Сравнение действия тетрапиррол-медиированного пластидного сигнала на экспрессию близкородственных генов (ELIP1, ELIP2 и Lhcb2) показало, что они регулируются этими сигналами по-разному, а гены, относящиеся к различным семействам (Lhcb2 и НЕМА1), регулируются сходным образом. У hy и gun мутантов световой сигнал, подобно пластидному, увеличивает экспрессию генов ELIP и снижает экспрессию генов Lhcb2 и НЕМА1.

6. Так как регуляторы роста (абсцизовая кислота и мелафен) усиливают, а углеводы подавляют экспрессию генов ELIP, высказано предположение, что на экспрессию генов стрессовых белков ELIP наряду с пластидными сигналами действуют сигналы экзогенного (свет) и эндогенного происхождения (гормональные и углеводные).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ретроградные плаетидные сигналы координируют экспрессию ядерного и органелльного геномов и влияют на экспрессию ядерных генов белков хлоропластов в зависимости от функционального состояния этих органелл. Мы исследовали экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ЕЫР1 и ELIP2 у gun и hy мутантов, имеющих нарушения в передаче пластидного сигнала. Было обнаружено, что ретроградные плаетидные сигналы, зависящие от HY1, HY2 и GUN4 белков (но не GUN5), влияют на экспрессию генов ЕЫР1 и ELIP2, негативно регулируя их экспрессию. Кроме того, было обнаружено, что плаетидные сигналы по-разному регулируют экспрессию генов фотосинтеза ELIP и Lhcb2 и генов биосинтеза тетрапирролов НЕМА1 и СЫН: у gun мутантов экспрессия ЕЫР1 и ELIP2 увеличивается, а экспрессия Lhcb2, НЕМА1 и СЫН уменьшается. На экспрессию гена НЕМА2 плаетидные сигналы не влияют. Экспрессия генов ELIP, Lhcb2 и НЕМА1 зависит также от интенсивности освещения: увеличение интенсивности освещения приводит к повышению экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 и снижению экспрессии генов Lhcb и НЕМА1. Световой и пластидный сигналы взаимодействуют друг с другом. На экспрессию генов НЕМА2 и СЫН интенсивность освещения не влияет. Исследования gun мутантов Arabidopsis с помощью ингибиторного анализа (норфлуразон, дипиридил) и экзогенного добавления Mg-Proto указывают на участие тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков ELIP. Однако такие предшественники биосинтеза тетрапирролов, как Mg-Proto и Mg-ProtoMe, по-видимому, не являются сигнальными молекулами, индуцирующими пластидный сигнал. Обнаружена обратная зависимость между содержанием хлорофилла и экспрессией генов ELIP, что указывает на возможное участие белков светового стресса ELIP в регуляции биосинтеза хлорофилла и/или защите хлоропластов от фотоокисления. Подавление экспрессии генов ELIP с помощью ингибиторов (ацифлуорфен) и предшественника биосинтеза тетрапирролов (5аминолевулиновая кислота), приводящих к накоплению активных форм кислорода, свидетельствует о том, что эти соединения вовлечены в передачу пластидного сигнала и являются негативными регуляторами экспрессии исследованных генов. Изучение участия редокс-состояния компонентов ЭТЦ фотосинтеза показало, что этот тип ретроградного сигнала также негативно влияет на транскрипцию генов ELIP. При ингибировании (с помощью диурона) транспорта электронов от ФС2 к пулу пластохинонов в хлоропластах, приводящем к окислению пула пластохинонов, экспрессия генов ELIP снижается.

На основе полученных данных можно говорить, что на экспрессию генов ELIP действуют сигналы экзогенного (свет) и эндогенного происхождения (ретроградные сигналы, гормоны, углеводы).

Поскольку наши результаты показали, что молекулы Mg-Proto и Mg-ProtoMe не являются сигнальными, возможно, что эти интермедиаты биосинтеза тетрапирролов могут связываться с компонентами Mg-хелатазного мультибелкового комплекса (в частности, с субъединицей СЫН и/или белком GUN4), которые участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов. Кроме того, изменения Mg-хелатазного комплекса могут приводить к индукции пластидного сигнала. Известно, что фактор транскрипции ABI4 вовлечен в экспрессию генов белков фотосинтеза (Koussevitzky et al., 2007). Поскольку общие принципы функционирования сигнальных систем в клетках, по-видимому, универсальны, не исключено, что ABI4 влияет на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2. Возможно, что ABI4 может обеспечивать связь ретроградных сигналов хлоропластов с углеводными сигналами и сигналами, индуцируемыми абсцизовой кислотой, которые также участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ЕЫР1 и ЕЫР2.

Таким образом, в клетках существует сложная сигнальная сеть, регулирующая координированную экспрессию ядерных генов, при этом различные типы пластидных сигналов могут взаимодействовать друг с другом и с другими сигнальными системами клетки и ингибировать (или активировать) транскрипцию ядерных генов стрессовых белков пластид ЕЫР1 и ЕЫР2.

179

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Осипенкова, Ольга Валерьевна, Москва

1. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов. Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 626-640.

2. Носов A.M. Растительная клетка. Физиология растений. Ред. Ермаков И.П. М.: Издательский центр «Академия». 2005. С. 35-39.

3. Одинцова М.С., Юрина Н.П. Геном пластид высших растений и водорослей: структура и функции. Молекулярная биология. 2003. Т. 37. С. 1— 16.

4. Одинцова М.С., Юрина Н.П. Геномика и эволюция клеточных органелл. Генетика. 2005. Т.41. С. 1170-1182.

5. Одинцова М.С., Юрина Н.П. Редактирование РНК в хлоропластах и митохондриях растений. Физиология растений. 2000. Т. 37. С. 307-320.

6. Осипенкова О.В., Ермохина О.В., Белкина Г.Г., Фаттахов С.Г., Юрина Н.П. Влияние мелафена на экспрессию генов белков светового стресса хлоропластов Elipl и Elip2 у ячменя. Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. С. 701-708.

7. Осипенкова О.В., Рахимбердиева М.Г., Карапетян Н.В., Юрина Н.П. Включение двух пластидных сигналов в регуляцию экспрессии ядерного,гена, хлоропластного белка Elip. Доклады Академии наук. 2007. Т. 416. С. 546-549.

8. Патент РФ. 2000. № 2158735.

9. Погульская E.H. Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков Elip и HSP32 у проростков ячменя. Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: 2006. 25 с.

10. Фаттахов С.Г., Лосева Н.Л., Коновалов А.И., Резник B.C., Алябьев А.Ю., Гордон Л.Х., Трибунских В.И. Влияние мелафена на рост и энергетические процессы растительной клетки. Доклады Академии наук. 2004. Т. 394. С. 127— 129.

11. Юрина Н.П., Одинцова М.С. Сигнальные системы митохондрий. Ретроградная регуляция у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Генетика. 2008. С. 1445-1452.

12. Юрина Н.П., Одинцова М.С. Сигнальные системы растений. Пластидные сигналы и их роль в экспрессии ядерных генов. Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 1-14.

13. Юрина Н.П.,. Погульская Е.Н, Карапетян Н.В. Действие фотодеструкции пластид из норфлуразон-обработанных проростков на экспрессию ядерных генов, кодирующих стрессовые белки хлоропластов ячменя. Биохимия. 2006. Т. 71. С. 533-540.

14. Acevedo-Hernandez G.J., Leon Р., Herrera-Estrella L.R. Sugar and ABA responsiveness of a minimal RBCS light-responsive unit is mediated by direct binding of ABI4. Plant J. 2005. V. 43. P. 506-519.

15. Adamska I. ELIPs light-induced stress proteins. Plant Physiol. 1997. V. 100. P. 794-805.

16. Adamska I. Regulation of early light-inducible protein gene expression by blue and red light in etiolated seedlings involves nuclear and plastid factors. Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 1167-1175.

17. Adamska I., Funk C., Renger G., Andersson B. Developmental regulation of the PsbS gene expression in spinach seedlings: The role of phytochrome. Plant Mol. Biol. 1996a. V. 31. P. 793-802.

18. Adamska I., Kloppstech K. Low temperature increases the abundance of early light inducible transcript under light stress conditions. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 30221-30226.

19. Adamska I., Kloppstech K., Ohad I. UV light stress induces the synthesis of the early light-inducible protein and prevents its degradation. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 24732-24737.

20. Adamska I., Kloppstech K., Ohad I. Early light-inducible protein in pea is stable during light stress but is degraded during recovery at low light intensity. Biol. Chem. 1993a. V. 268. P. 5438-5444.

21. Adamska I., Kloppstech K., Ohad I. The effect of free radical enhancers and scavengers on accumulation of early light-inducible protein during light stress. Z. Naturforsch. 1993b. V. 48c. P. 391-396.

22. Adamska I., Kruse E., Kloppstech K. Stable insertion of the early light-induced proteins into etioplast membranes requires chlorophyll a. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 8582-8587.

23. Adamska I., Lindahl M., Roobol-Boza M., Andersson B. Degradation of the light stress protein is mediated by an ATP-independent serine-type protease under-low light conditions. Eur. J. Biochem. 1996b. V. 236. P. 591-599.

24. Ahlert D., Ruf S., Bock R. Plastid protein synthesis is required for plant, development in tobacco. PNAS USA. 2003. V. 100. P. 15730-15735.

25. Alawady A.E., Grimm B. Tobacco Mg protoporpyrin IX methyltransferase is involved in increase activation of Mg porphyrin and protoheme synthesis. Plant J. 2005. V. 41. P. 282-290.

26. Al-Karadaghi S., Hansson M., Nikonov S., Jonsson B., Hederstedt L. Crystal structure of ferrochelatase: the terminal enzyme in heme biosynthesis. Structure. 1997. V. 5. P. 1501-1510.

27. Anderson J.M. Photoregulation of the composition, function, and structure of thylakoid membranes. Annu. Rev. Plant Physiol. 1986. V. 37. P. 93-136.

28. Anderson S.L., Teakle G.R., Martino-Catt S.J., Kay S.A. Circadian clock- and phytochrome-regulated transcription is conferred by a 78 bp cw-acting domain of the Arabidopsis CAB2 promoter. Plant J. 1994. V. 6. P. 457-470.

29. Andersson U., Heddad M., Adamska I. Light stress-induced one-helix protein of the chlorophyll «/¿-binding family associated with photosystem I. Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 811-820.

30. Ankele E., Kindgren P., Pesquet E., Strand A. In vivo visualization of Mg-protoporphyrin IX, a coordinator of photosynthetic gene expression in the nucleus and the chloroplast. Plant Cell. 2007. V. 19. P. 1964-1979.

31. Apel K., Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu. Rev. Plant Biol. 2004. V. 55. P. 373-399.

32. Bartels D., Hanke C., Schneider K., Michel D., Salamini F. A desiccation-related Elip-like gene from the resurrection plant Craterostigma plantagineum is regulated by light and ABA. EMBO J. 1992. V. 11. P. 2771-2778.

33. Beale S.I. Enzymes of chlorophyll biosynthesis. Photosynth. Res. 1999. V. 60. P. 43-73.

34. Beck C.F. Signaling pathways from the chloroplast to the nucleus. Planta. 2005. V. 222. P. 743-756.

35. Binyamin L., Falah M., Portnoy V., Soudry E., Gepstein S. The early light-induced protein is also produced during leaf senescence of Nicotiana tabacum. Planta. 2001. V. 212. P. 591-597.

36. Blecken J., Weisshaar B., Herzfeld F. The distinct czs-acting elements are involved in light-dependent activation of the Elip promoter. Mol. Gen. Genet. 1994. V. 245. P. 371-379.

37. Block M.A., Tewari A.K., Albrieux C., Marechal E., Joyard J. The plant S-adenosyI-L-methionine:Mg-protoporphyrin IX methyltransferase is located in both envelope and thylakoid chloroplast membranes. Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 240-248.

38. Bolle C., Sopory S., Lübberstedt T. The role of plastids in the expression of nuclear genes for thylakoid proteins studied with chimeric ß-glucuronidase gene fusions. Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 1355-1364.

39. Bollivar D.W. Recent advances in chlorophyll biosynthesis. Photosynth. Res. 2006. V. 90. P. 173-194.

40. Bradbeer J.W., Atkinson Y.E., Börner T., Hagemann R. Cytoplasmic synthesis of plastid polypeptides may be controlled by plastid-synthesised RNA. Nature. 1979. V. 279. P. 816-817.

41. Brown E.C., Somanchi A., May field S.P. Interorganellar crosstalk: new perspectives on signaling from the chloroplast to the nucleus. Gen. Biol. 2001. V. 2. P. 10211-10214.

42. Bruno A.K., Wetzel C.M. The early light-inducible protein (ELIP) gene is expressed during the chloroplast-to-chromoplast transition in ripening tomato fruit. Exp. Bot. 2004. V. 55. P. 2541-2548.

43. Brusslan J.A., Tobin E.M. Light-independent developmental regulation of cab gene expression in Arabidopsis thaliana seedlings. PNAS USA. 1992. V. 89. P. 7791-7795.

44. Butow R.A., Avadhani N.G. Mitochondrial signaling, the retrograde response. Mol. Cell. 2004. V. 14. P. 1-15.

45. Casazza A.P., Rossini S., Rosso M.G., Soave C. Mutational and expression analysis of ELIP1 and ELIP2 in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 2005. V. 58. P. 41-51.

46. Chakraborty N., Tripathy B.C. Involvement of singlet oxygen in 5-aminolevulinic acid-induced photodynamic damage of cucumber (Cucumis sativus L.) chloroplasts. Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 7-11.

47. Chen Y.B., Durnford D.G., Koblizek M., Falkowski P.G. Plastid regulation of Lhcbl transcription in the chlorophyte alga Dunaliella tertiolecta. Plant Physiol. 2004. V. 136. P. 3737-3750.

48. Chory J., Peto C.A, Ashbaugh M., Saganich Yb.L., Pratt R., Ausubel F. Different roles for phytochrome in etiolated and green plants deduced from characterization of Arabidopsis thaliana mutants. Plant Cell. 1989. V. 1. P. 867-880.

49. Danon A., Coll N.S., Apel K. Cryptochrome-1-dependent execution of • programmed cell death induced by singlet oxygen in Arabidopsis thaliana. PNAS USA. 2006. V. 103. P. 17036-17041.

50. Davis S.J., Kurepa J., Vierstra R.D. The Arabidopsis thaliana HY1 locus, required for phytochrome-chromophore biosynthesis, encodes a protein related to heme oxygenases. PNAS USA. 1999. V. 96. P. 6541-6546.

51. Davison P.A., Schubert H.L., Reid J.D., Iorg C.D., Heroux A., et al. Structural and biochemical characterization of Gun4 suggests a mechanism for its role in chlorophyll biosynthesis. Biochem. 2005. V. 44. P. 7603-7612.

52. Dolganov N.A.M., Bhaya D., Grossman A.R. Cyanobacterial protein with similarity to the chlorophyll afb binding proteins of higher plants: Evolution and regulation. PNAS USA. 1995. V. 92. P. 636-640.

53. Emanuel C., Weihle A., Graner A., Hess W.R., Börner T. Chloroplast development affects expression of phage-type RNA polymerases in barley leaves. Plant J. 2004. V. 38. P. 460-472.

54. Fernández A.P., Strand A. Retrograde signaling and plant stress: plastid signals initiate cellular stress responses. Curr. Opin. Plant Biol. 2008. V. 11. P. 509-513.

55. Finkelstein R.R., Gibson S.I. ABA and sugar interactions regulating development: "cross-talk" or "voices in a crowd"? Curr. Opin. Plant Biol. 2002. V. 5. P. 26-32.

56. Frankenberg N., Mukougawa K., Kohchi T., Lagañas J.C. Functional genomic analysis of the HY2 family of ferredoxin-dependent bilin reductases from oxygenic photosynthetic organisms. Plant Cell. 2001. V. 13. P. 965-978.

57. Funk C., Schröder W.P., Napiwotzki A., Tjus S.E., Renger G., Andersson B. The PSII-S protein of higher plants: a new type of pigment-binding protein. Biochemistry. 1995. V. 34. P. 11133-11141.

58. Gadjieva R., Axelsson E., Olsson U., Hansson M. Analysis of gun phenotype in barley magnesium chelatase and Mg-protoporphyrin IX monomethyl ester cyclase mutants. Plant Physiol. Biochem. 2005. V. 43. P. 901-908.

59. Goldschmidt-Clermont M. Coordination of nuclear and chloroplast gene expression in plant cells. Int. Rev. Cytol. 1998. V. 177. P. 115-180.

60. Gorman A.A., Rodgers M.A. Current perspectives of singlet oxygen detection in biological environments. Photochem. Photobiol. B.J. 1992. V. 14. P. 159-176.

61. Green B.R., Kühlbrandt W. Sequence conservation of light-harvesting and stress-response protein in relation to the three-dimensional molecular structure of LHCII. Photosynth. Res. 1995. V. 44. P. 139-148.

62. Grimm B., Kloppstech K. The early light-inducible proteins of barley. Characterization of two families of 2-h-specific nuclear-coded chloroplast proteins. Eur. J. Biochem. 1987. V. 67. P. 493^199.

63. Grimm B., Kruse E., Kloppstech K. Transiently expressed early light-inducible thylakoid proteins share trans-membrane domains with light-harvesting chlorophyll binding proteins. Plant Mol. Biol. 1989. V. 13. P. 583-593.

64. Guaragnella N., Butow R.A. AT03 encoding a putative outward ammonium transporter is an RTG-independent retrograde responsive gene regulated by GCN4 and the Ssy-Ptr3-Ssy5 amino acid sensor system. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 45882-45887.

65. Harari-Steinberg O., Ohad I., Chamovitz D.A. Dissection of the light signal transduction pathways regulating the two early light-induced protein genes in Arabidopsis. Plant Physiol. 2001. V. 127. P. 986-997.

66. Heddad M., Adamska I. Light stress-regulated two-helix proteins in Arabidopsis thaliana related to the chlorophyll «/¿-binding gene family. PNAS USA. 2000. V. 97. P. 3741-3746.

67. Heddad M., Adamska I. The evolution of light stress proteins in photosynthetic organisms. Comp. Funct. Genom. 2002. V. 3. P. 504-510.

68. Heddad M., Noren H., Reiser V., Dunaeva M., Andersson B., Adamska I. Differential expression and localization of early light-induced proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 2006. V. 142. P. 75-87.

69. Hess W.R., Schendel R., Börner T., Rüdiger W. Reduction of mRNA level for two nuclear encoded light regulated genes in the barley mutant albostrians is not correlated with phytochrome content and activity. Plant Physiol. 1991. V. 138. P. 292-298.

70. Hirayama T., Shinozaki K. Perception and transduction of abscisic acid signals: keys to the function of the versatile plant hormone ABA. Trends in Plant Sci. V. 12. P. 343-351.

71. Hon T., Hach A., Tamalis D., Zhu Y., Zhang L. The yeast heme-responsive transcriptional activator Hapl is a preexisting dimer in the absence of heme. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 22770-22774.

72. Hotta Y., Tanaka T., Bingshan L., Takeuchi Y., Konnai M. Improvement of cold resistance in rice seedlings by 5-aminolevulinic acid. J. Pest. Sci. 1998. V. 23. P. 29-33.

73. Huijser C., Kortstee A., Pego J., Weisbeek P., Wisman E., Smeekens S. The Arabidopsis sucrose uncoupled-6 gene is identical to abscisic acid insensitive-4: involvement of abscisic acid in sugar responses. Plant J. 2000. V. 23. P. 577-585.

74. Hung K.T., Cheng D.G., Hsu Y.T., Kao C.H. Abscisic acid-induced hydrogen peroxide is required for anthocyanin accumulation in leaves of rice seedlings. Plant Physiol. 2008. V. 165. P. 1280-1287.

75. Jacobs J.M., Jacobs N.J. Oxidation of protoporphyrinogen to protoporphyrin, a step in chlorophyll and haem biosynthesis. Purification and partial characterization of the enzyme from barley organelles. Biochemistry. 1987. V. 244. P. 219-224.

76. Jacobs J.M., Jacobs N.J. Porphyrin accumulation and export by isolated barley CHordeum vulgare) plastids. Plant Physiol. 1993. V. 101. P. 1181-1187.

77. Jarvis P. Intracellular signalling: the language of the chloroplast. Curr. Biol. 2003. V. 13. P. R314—R316.

78. Johanningmeier U. Possible control of transcript levels by chlorophyll precursors in Chlamydomonas. Eur. J. Biochem. 1988. V. 177. P. 417^124.

79. Kim S.J., Jansson S., Hoffman N.E., Robinson C., Mant A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 4715-4721.

80. Kleffmann T., Russenberger D., von Zychlinski A., Christopher W., Sjölander K., Gruissem W., Baginsky S. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Curr. Biol. 2004. V. 14. P. 354—362.

81. Kleine T., Kindgren P., Benedict C., Hendrickson L., Strand A. Genome-wide gene expression analysis reveals a critical role for cryptochromel in the response of Arabidopsis to high irradiance. Plant Physiol. 2007. V. 144. P. 1391-1406.

82. Kleine T., Voigt C., Leister D. Plastid signalling to the nucleus: messengers still lost in the mists? Trends in Genetics. 2009. V. 25. P. 185-192.

83. Kloppstech K., Otto B., Sierralta W. Cyclic temperature treatments of dark-grown pea seedlings induce a rise in specific transient levels of light-regulated genes related to photomorphogenesis. Mol. Gen. Genet. 1991. V. 225. P. 468-473.

84. Kohchi T., Mukougawa K., Frankenberg N., Masuda M., Yokota A., Lagarias J.C. The Arabidopsis HY2 gene encodes phytochromobilinsynthase, a ferredoxin-dependent biliverdin reductase. Plant Cell. 2001. V. 13. P. 425^136.

85. Kolanus W., Scharnhorst C., Kühne U., Herzfeld F. The structure and light-dependent transient expression of a nuclear-encoded chloroplast protein gene from pea (Pisum sativum L.). Mol. Gen. Genet. 1987. V. 209. P. 234-239.

86. Koussevitzky S., Nott A., Mockler T.C., Hong F., Sachetto-Martins G., Surpin M., Lim J., Mittler R., Chory J. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 2007. V. 316. P. 715-719.

87. Kropat J., Oster U., Rüdiger W., Beck C.F. Chlorophyll precursors are signals of chloroplast origin involved in light induction of nuclear heat-shock genes. PNAS USA. 1997. V. 94. P. 14168-14172.

88. Kropat J., Oster U., Rüdiger W., Beck C.F. Chloroplast signalling in the light induction of nuclear HSP70 genes requires the accumulation of chlorophyll precursors and their accessibility to cytoplasm/nucleus. Plant J. 2000. V. 24. P. 523531.

89. Kropat J., von Gromoff E.D., Mûllèr F.W., Beck C.F. Heat shock and light activation of a Chlamydomonas HSP70 gene are mediated by independent regulatory pathways. Mol. Gen. Genet. 1995. V. 248. P. 727-734.

90. Kruse E., Kloppstech K. Integration of early light-inducible proteins into isolated thylakoid membranes. Eur. J. Biochem. 1992. V. 208. P. 195-202.

91. Kubo T., Newton K.J. Angiosperm mitochondrial genomes and mutations. Mitochondrion. 2008. V. 8. P. 5-14.

92. Kwak J.M., Nguyen V., Schroeder J.I. The role of reactive oxygen species in hormonal responses. Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 323-329.

93. Y., Lee K.K., Walsh S., Smith C., Hadingham S., Sorefan K., Cawley G., Bevan M.W. Establishing glucose- and ABA-regulated transcription networks in

94. Mayer G., Kloppstech K. A rapidly light-induced chloroplast protein with a high turnover coded for by pea nuclear DNA. Eur. J. Biochem. 1984. V. 138. P. 201207.

95. Mayfield S.P., Taylor W.C. Carotenoid-deficient maize seedlings fail to accumulate light-harvesting chlorophyll a/b binding protein (LHCP) mRNA. Eur. J. Biochem. 1984. V. 144. P. 79-84.

96. McCormac A.C., Terry M.J. Loss of nuclear gene expression during the phytochrome A-mediated far-red block of greening response. Plant Physiol. 2002. V. 130. P. 402-414.

97. McCormac A.C., Terry M.J. The nuclear genes Lhcb and HEMA1 are differentially sensitive to plastid signals and suggest distinct roles for the GUN1 and

98. GUN5 plastid-signalling pathways during de-etiolation. Plant J. 2004. V. 40. P. 672685.

99. Meskauskiene R., Apel K: Interaction of FLU, a negative regulator of tetrapyrrole biosynthesis, with the glutamyl-tRNA reductase requires the tetratricopeptide repeat domain of FLU. FEBS Lett. 2002. V. 532. P. 27-30.

100. Mochizuki N., Brusslan J.A., Larkin R., Nagatani A., Chory J. Arabidopsis genomes uncoupled 5 (GUN 5) mutant reveals the involvement of Mg-chelatase H subunit in plastid-to-nucleus signal transduction. PNAS USA. 2001. V. 98. P. 20532058.

101. Mochizuki N., Tanaka R., Tanaka A., Masuda T, Nagatani A. The steady-state level of Mg protoporphyrin IX is not a determinant of plastid-to-nucleus signaling in Arabidopsis. PNAS USA. 2008. V. 105. P. 15184-15189.

102. Montane M.H., Kloppstech K. The family of light-harvesting-related proteins (LHCs, ELIPs, HLIPs): was the harvesting of light their primary function? Gene. 2000. V. 258. P. 1-8.

103. Moreira D, Philippe H. Smr: a bacterial and eukaryotic homologue of the C-terminal region of the MutS2 family. Trends Biochem. Sci. 1999. V. 24. P. 298-300.

104. Moulin M., McCormac A.C., Terry M.J., Smith A.G. Tetrapyrrole profiling in Arabidopsis seedlings reveals that retrograde plastid nuclear signaling is not due to Mg-protoporphyrin IX accumulation. PNAS USA. 2008. V. 105. P. 15178-15183.

105. Moulin M., Smith A.G. Regulation of tetrapyrrole biosynthesis in higher plants. Biochem. Soc. Trans. 2005. V. 33. P. 737-742.

106. Muramoto T., Kohchi T., Yokota A., Hwang I., Goodman H.M. The Arabidopsis photomorphogenic mutant hyl is deficient in phytochrome chromophore biosynthesis as a result of a mutation in a plastid heme oxygenase. Plant Cell. 1999. V. 11. P. 335-347.

107. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol. 1962. V. 15. P. 473-497.

108. Nagata N., Tanaka R., Satoh S., Tanaka A. Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus species. Plant Cell. 2005. V. 17. P. 233-240.

109. Narita S., Tanaka R., Ito T., Okada K., Taketani S., Inokuchi H. Molecular cloning and characterization of a cDNA that encodes protoporphyrinogen oxidase of Arabidopsis thaliana. Gene. 1996. V. 182. P. 169-175.

110. Nott A., Jung H.-S., Koussevitzky S., Chory J. Plastid-to-nucleus retrograde signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 2006. V. 57. P. 739-759.

111. Obornik M., Green B.R. Mosaic origin of the heme biosynthesis pathway in photosynthetic eukaryotes. Mol. Biol. Evol. 2005. V. 22. P. 2343-2353.

112. Oelmuller R., Dietrich G., Link G., Mohr H. Regulatory factors involved in gene expression (subunits of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase) in mustard 0Sinapis alba L.) cotyledons. Planta. 1986. V. 169. P. 260-266.

113. Oswald O., Martin T., Dominy P.J., Graham I.A. Plastid redox state and sugars: Interactive regulators of nuclear-encoded photosynthetic gene expression. PNAS USA. 2001. V. 98. P. 2047-2052.

114. Padmasree K., Padmavathi L., Raghavendra A.S. Essentiality of mitochondrial oxidative metabolism for photosynthesis: optimization of carbon assimilation and protection against photoinhibition. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2002. V. 37. P. 71-119.

115. Papenbrock J., Grimm B. Regulatory network of tetrapyrrole biosynthesis-studies of intracellular signalling involved in metabolic and developmental control of plastids. Planta. 2001. V. 213. P. 667-681.

116. Papenbrock J., Mock H.P., Tanaka R., Kruse E., Grimm B. Role of magnesium chelatase activity in the early steps of the tetrapyrrole biosynthetic pathway. Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 1161-1169.

117. Pesaresi P., Masiero S., Eubel H., Braun H.-P., Bhushan S., Glaser E., Salamini

118. F., Leister D. Nuclear photosynthetic gene expression is synergistically modulated byrates of protein synthesis in chloroplasts and mitochondria. Plant Cell. 2006. V. 18. P. 970-991.

119. Pesaresi P., Schneider A., Kleine T, Leister D. Interorganellar communication. Curr. Opin. Plant Biol. 2007. V. 10. P. 600-606.

120. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time • RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. e45-e47 (1).

121. Pfannschmidt T. Chloroplast redox signals: how photosynthesis controls its own genes. Trends Plant Sei. 2003. V. 8. P. 33-41.

122. Pfannschmidt T., Liere K. Redox regulation and modification of proteins controlling chloroplast gene expression. Antioxidants & Redox Signaling. 2005. V. 5. P. 607-618.

123. Piippo M., Allahverdiyeva Y., Paakkarinen V., Suoranta U.-M., Battchikova N., Aro E.-M. Chloroplast-mediated regulation of nuclear genes in Arabidopsis thaliana in the absence of light stress. Physiol. Genomics. 2006. V. 25. P. 142-152.

124. Pötter E., Kloppstech K. Effect of light stress on the expression of early light-inducible protein in barley. Eur. J. Biochem. 1993. V. 214. P. 779-786.

125. Ramakers C., Ruijter J.M., Lekanne Deprez R.H., Moorman A.F.M. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci. Let. 2003. V. 339. P. 62-66.

126. Rapp J.C., Mullet J.E. Chloroplast transcription is required to express the nuclear genes RbcS and Cab. Plastid DNA copy number is regulated independently. Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. P. 813-823.

127. Reiser V. Light stress proteins in the chloroplast of Arabidopsis thaliana. Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften an der Universität Konstanz, Fachbereich Biologie. 2007. 107 p.

128. Rhoads D.M., Subbaiah C.C. Mitochondrial retrograde regulation in plants. Mitochondrion. 2007. V. 7. P. 177-194.

129. Rhoads D.M., Umbach A.L., Subbaiah C.C., Siedow J.N. Mitochondrial ROS, contribution to oxidative stress and interorganellar signaling. Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 357-366.

130. Richly E., Dietzmann A., Biehl A., Kurth J., Laloi C., Apel K., Salamini F., Leister D. Covariations in the nuclear chloroplast transcriptome reveal a regulatory master-switch. EMBO Rep. 2003. V. 4. P. 491-498.

131. Rock C. Pathways to abscisic acid-regulated gene expression. New Phytol. 2000. V. 148. P. 357-396.

132. Rodermel S., Park S. Pathways of intracellular communication: tetrapyrroles andplastid-to-nucleus signaling. BioEssays. V. 25. P. 631-636.

133. Rolland F., Baena-Gonzalez E., Sheen J. Sugar sensing and signalling in plants, conserved and novel mechanisms. Annu. Rev. Plant Biol. 2006. V. 57. P. 675-709.

134. Rook F., Bevan M.W. Genetic approaches to understanding sugar-response pathways. Exp. Bot. 2003. V. 54. P. 495-501.

135. Rook F., Hadingham S.A., Li Y., Bevan M.W. Sugar and ABA response pathways and the control of gene expression. Plant Cell Environ. 2006. V. 29. P. 426^434.

136. Rossini S., Casazza A.P., Engelmann E.C., Havaux M., Jennings R.C., Soave C. Suppression of both ELIP1 and ELIP2 in Arabidopsis does not affect tolerance to photoinhibition and photooxidative stress. Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 1264-1273.

137. Ruckle M.E., DeMarco S.M., Larkin R.M. Plastid signals remodel light signaling networks and are essential for efficient chloroplast biogenesis in Arabidopsis. Plant Cell. 2007. V. 19. P. 3944-3960.

138. Scharnhorst C., Heinze H., Meyer G., Kolanus W., Bartsch K., Heinrichs S., Gudschun T., Möller M., Herzfeld F. Molecular cloning of a pea mRNA encoding an early light induced, nuclear coded chloroplast protein. Plant Mol. Biol. 1985. V. 4. P. 241-245.

139. Schulze J.O., Schubert W.D., Moser J., Jahn D., Heinz D.W. Evolutionary relationship between initial enzymes of tetrapyrrole biosynthesis. Mol. Biol. 2006. V. 358. P. 1212-1220.

140. Shen Y.Y., Wang X.F., Wu F.Q., Du S.Y., Cao Z., Yi S., Wang X.-L., Peng C.-C., Yu X.-C., Zhu S.-Y., Fan R.-C., Xu Y.-H., Zhang D.-P. The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature. 2006. V. 443. P. 823-826.

141. Shimosaka E., Sasanuma T., Handa H. A wheat cold-regulated cDNA encoding an early light-inducible protein (ELIP): its structure, expression and chromosomal location. Plant Cell Physiol. 1999. V. 40. P. 319-325.

142. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 2000. V. 3. P. 217-223.

143. Sobotka R., Dühring U., Komenda J., Peter E., Gardian Z., Tichy M., Grimm B., Wilde A. Importance of the cyanobacterial Gun4 protein for chlorophyllmetabolism and assembly of photosynthetic complexes. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 25794-25802.

144. Somerville C.R. Analysis of photosynthesis with mutants of higher plants and algae. Annu. Rev. Plant Physiol. 1986. V. 37. P. 467-507.

145. Strand A., Asami T., Alonso J., Ecker J.R., Chory J. Chloroplast to nucleus communication triggered by accumulation of Mg-protoporphyrin IX. Nature. 2003. V. 42l.P. 79-83.

146. Strasser R.J., Butler W.L. Fluorescence emission spectra of photosystem I, photosystem II and the light-harvesting chlorophyll a/b complex of higher plants. Biochim. Biophys. Acta. 1977 V. 462. P. 307-313.

147. Sullivan J.A., Gray J.C. Multiple plastid signals regulate the expression of the pea plastocyanin gene in pea and transgenic tobacco plants. Plant J. 2002. V. 32. P. 763-774.

148. Sullivan J.A., Gray J.C. Plastid translation is required for the expression of nuclear photosynthesis genes in the dark and in roots of the pea Elipl mutant. Plant Cell. 1999. V. 11. P. 901-910.

149. Surpin M., Larkin R.M., Chory J. Signal transduction between the chloroplast and the nucleus. Plant Cell. 2002. V. 14. P. 327-338.

150. Susek R.E., Ausubel F.M., Chory J. Signal transduction mutant of Arabidopsis uncouple nuclear CAB and RBCS gene expression from chloroplast development. Cell. 1993. V. 74. P. 787-799.

151. Tanaka R., Tanaka A. Effects of chlorophyllide a oxygenase overexpression on light acclimation in Arabidopsis thaliana. Photosynth. Res. 2005. V. 85. P. 327-340.

152. Tanaka R., Tanaka A. Tetrapyrrole biosynthesis in higher plants. Annu. Rev. Plant Biol. 2007. V. 58. P. 321-346.

153. Taylor W.C. Regulatory interactions between nuclear and plastid genomes. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1989. V. 40. P. 211-233.

154. Terry M.J., Kendrick R.E. Feedback inhibition of chlorophyll synthesis in the phytochrome chromophore-deficient aurea and yellow-green-2 mutants of tomato. Plant Physiol. 1999. V. 119. P. 143-152.

155. Terry M.J., Linley P.J., Kohchi T. Making light of it: the role of plant haem oxygenases in phytochrome chromophore synthesis. Biochem. Soc. Trans. 2002. V. 30. P. 604-609.

156. Vasileuskaya Z., Oster U., Beck C.F. Mg-ProtoporphyrinIX and heme control HEMA, the gene encoding the first specific step of tetrapyrrole biosynthesis, in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic Cell. 2005. V. 4. P. 1620-1628.

157. Verdecia M.A., Larkin R.M., Ferrer J.L., Riek R., Chory J., Noel J.P. Structure of the Mg-chelatase cofactor GUN4 reveals a novel hand-shaped fold for porphyrin binding. PLoS Biol. 2005. V. 3. P. 777-789.

158. Vinti G., Hills A., Campbell S., Bowyer J.R., Mochizuki N., Chory J., Lopez-Juez E. Interactions between hyl and gun mutants of Arabidopsis, and their implications for plastid/nuclear signalling. Plant J. 2000. V. 24. P. 883-894.

159. Von Gromoff E.D., Schroda M., Oster U., Beck C.F. Identification of plastid response element that acts as an enhancer within the Chlamydomonas HSP70A promoter. Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 4767-4779.

160. Wagner D., Przybyla D., Camp R., Kim C., Landgraf F., Lee K.P., Wursch M., Laloi C., Nater M., Hideg E., Apel K. The genetic basis of singlet oxygen-induced stress responses of Arabidopsis thaliana. Science. 2004. V. 306. P. 1183-1185.

161. Wang L.J., Jiang W.B., Huang B.J. Promotion of 5-aminolevulinic acid on photosynthesis of melon (Cucumis melo) seedlings under low light and chilling stress conditions. Physiol. Plantarum. 2004. V. 121. P. 258-264.

162. Weatherwax S.C., Ong M.S., Degenhardt J., Bray E.A., Elaine M. The interaction of light and abscisic acid in the regulation of plant gene expression. Plant Physiol. 1996. V. 11. P. 363-370.

163. Wetzel C.M., Harmacek L.D., Yuan L.H., Wopereis J.L.M, Chubb R., Turini P. Loss of chloroplast protease SPPA function alters high light acclimation processes in Arabidopsis thaliana L. (Heynh.). Exp. Bot. 2009. V. 60. P. 1715-1727.

164. Wierstra I, Kloppstech K. Differential effects of methyl jasmonate on the expression of the early light-inducible proteins and other light-regulated genes in barley. Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 833-844.

165. Wilde A., Mikolajczyk S., Alawady A., Lokstein H., Grimm B. The gun4 gene is essential for cyanobacterial porphyrin metabolism. FEBS Lett. 2004. V.571. P. 119-123.

166. Willows R.D. Biosynthesis of chlorophylls from protoporphyrin IX. Nat. Prod. Rep. 2003. V. 20. P. 327-341.

167. Woodson J.D., Chory J. Coordination of gene expression between organellar and nuclear genomes. Nat. Rev. Genet. 2008. V. 9. P. 383-395.

168. Yabuta Y., Maruta T., Yoshimura K., Ishikawa T., Shigeoka S. Two distinct redox signaling pathways for cytosolic APX induction under photooxidative stress. Plant Cell Physiol. 2004. V. 45. P. 1586-1594.

169. Yamasato A., Nagata N., Tanaka R., Tanaka A. The N-terminal domain of chlorophyllide a oxygenase confers protein instability in response to chlorophyll b accumulation in Arabidopsis. Plant Cell. 2005. V. 17. P. 1585-1597.

170. Yurina N.P., Kloppstech K. Accumulation of plastid protein precursors under norflurazon induced carotenoid deficiency and oxidative stress in barley. Plant Physiol. Biochem. 2001. V. 39. P. 807-814.

171. Zarkovic J., Anderson S.L., Rhoads D.M. A reporter gene system used to study developmental expression of alternative oxidase and isolate mitochondrial retrograde regulation mutants in Arabidopsis. Plant Mol. Biol. 2005. V. 57. P. 871-888.

172. Zarter C.R., Demmig-Adams B., Ebbert V., Adamska I., Adams III W.W. Photosynthetic capacity and light harvesting efficiency during the winter-to-spring transition in subalpine conifers. New Phytologist. 2006. V. 172. P. 283-292.

173. Zeng O., Chen X.B., Wood A.J. Two early light-inducible protein (ELIP) cDNA from the resurrection plant Tortula ruralis are differentially expressed in response to desiccation, rehydration, salinity, and high light. Exp. Bot. 2002. V. 53. P.1197-1205.

174. Zhang D.P. Signaling to the nucleus with a loaded GUN. Science. 2007. V. 316. P. 700-701.

175. Zhang L., Hach A., Wang C. Molecular mechanism governing heme signaling in yeast: a higher-order complex mediates heme regulation of the transcriptional activator Hap 1. Mol. Cell Biol. 1998. V. 18. P. 3819-3828.

176. Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (№ 06-04-48923а), программой Российской Академии Наук «Клеточная и молекулярная биология» и стипендией FEBS «Collaborative Experimental Scholarships for Central & Eastern Europe».

Информация о работе

Осипенкова, Ольга Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis thaliana - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы