Молекулярно-генетические механизмы ответа на абиотические стрессовые факторы у мутанта nfz24 Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.

Новокрещенова, Мария Габриэловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические механизмы ответа на абиотические стрессовые факторы у мутанта nfz24 Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические механизмы ответа на абиотические стрессовые факторы у мутанта nfz24 Arabidopsis thaliana(L.) Heynh."

Новокрсщёнова Мария Габриэловна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ОТВЕТА НА АБИОТИЧЕСКИЕ СТРЕССОВЫЕ ФАКТОРЫ У МУТАНТА п/г24 АгаЬШор$1$ МаИапа (Ь.) НеупЬ.

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

003454561

Работа выполнена на кафедре генетики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

доктор биологических наук, доцент Ежова Татьяна Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Шевякова Нина Ивановна

кандидат биологических наук Огаркова Ольга Александровна

РГАУ МСХА имени К.А.Тимирязева

Защита диссертации состоится « 25 » ноября 2008г. в 12 ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (499) 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д. 3.

Автореферат разослан «___»_2008г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Полухина Г. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Растения подвергаются воздействию разнообразных стрессовых факторов, вызывающих разные физиологические эффекты, среди которых есть и сходные компоненты, в первую очередь - окислительный стресс. Растение отвечает на эти воздействия активацией разнообразных систем защиты; универсальным ответом на все воздействия является активация антиоксидантной системы (Seki et al., 2002; Kreps et al., 2002). Эти факты, свидетельствующие о важности изучения генетического контроля защиты растений от окислительного стресса, привели к развитию идеи о создании форм растений с перекрестной устойчивостью к разнообразным стрессовым факторам на основе повышения у них активности антиоксидашных систем (Allen 1997). Экспериментальная проверка этой идеи имеет важное практическое значение.

Анализ мутантов с измененной чувствительностью к стрессовым факторам является эффективным методом выявления генов, контролирующих адаптивный ответ. Мутанты с измененной чувствительностью к разным абиотическим факторам (окислительному стрессу, холоду, засухе, УФ и др.) получены у модельного растения Arabidopsis thaliana, геном которого полностью секвенирован. К сожалению, большинство исследований таких мутантов ограничиваются анализом чувствительности/устойчивости к отдельным стрессовым факторам, что не позволяет оценить всех последствий мутационных изменений для растения, а значит и перспектив использования мутантных генов этого вида с целью улучшения адаптивных свойств у хозяйственно ценных растений. Коллекция мутантов А. thaliana толерантных к индукторам окислительного стресса создана и на кафедре генетики МГУ (Ежова и др., 2001). В данной работе исследован мутант nfz24, выделенный с помощью химического мутагенеза по устойчивости к индуктору окислительного стресса гербициду норфлуразону, который ингибируег биосинтез каротииоидов, вызывает фотодеструкцию хлорофилла и гибель растений. Мутант nfz24 по данным проведенных ранее исследований проявляет перекрестную устойчивость к другому индуктору окислительного стресса - нараквату, что связано с повышенной активностью антиоксидантных ферментов - суперокснддисмутазы и псроксидазы. D то же время, при воздействии низких положительных температур мутант nfz?.4 показывает большую чувствительность к холоду, чем растения дикого типа расы Dijon-M (Волкова и др., 2004).

Целью работы является изучение молекулярно-генетических механизмов ответа мутанта nfz24 АЛкаНада на разные абиотические стрессовые факторы (холод, высокие дозы гербицида норфлуразона, яркий свет) и локализация мутации на молекулярно-генетической и физической картах хромосом этого вида.

Задачами работы являлись-

1. Характеристика морфо-физиологаческих особенностей мутанта п/г24 (анализ структуры хлоропласта, содержания пигментов, токоферола, пролина).

2. Анализ влияния гербицида норфлуразона, холода и разных уровней освещенности на фенотииические и физиологические параметры мутанта ф24.

3. Изучение экспрессии генов, контролирующих антиоксидантный, холодовой ответ и синтез хлорофилла и каротиноидов у мутанта п/г24 в условиях действия стрессовых факторов.

4. Локализация гена №7,24 на молекулярно-генетической и физической картах генома АЛНаНапа и выявление генов кандидатов.

Научная новизна. Исследована функция гена №224, контролирующего устойчивость/чувствительность растений АМгаИапа к абиотическим стрессовым факторам и определена его локализация на генетической и физической картах 2-ой хромосомы. Установлено, что ген ИР224 участвует в развитии устойчивости/ чувствительности одновременно к нескольким типам абиотических факторов -гипотермии, яркому свету и индуктору окислительного стресса норфлуразону, контролируя уровень транскрипции генов антиоксидантной защитной системы и генов АБК-зависимого холодового ответа. Кроме гена N¡<224, выявлено еще 2 гена с ранее не известной функцией (А12§23670 и At2g24040), участвующих в разпитии ответа на гипотермию. Показано, что уровень транскрипции этих генов зависит от активности гена МГ224.

Научно-практическая значимость работы. Необходимой предпосылкой для создания генетической сети, контролирующей устойчивость растений к стрессовым факторам окружающей среды, является идентификация всех генов адаптивного ответа. В связи с этим выявленные в работе новые компоненты генетического ответа на абиотические стрессовые воздействия - гены АлИаНапа М7224, At2g23670 и А^24040 вносят вклад в решение этой важной проблемы. Экспериментально продемонстрированная в исследованиях мутанта гф24 сложная взаимосвязь разных систем стрессового ответа убедительно свидетельствует о необходимости комплексных исследований перекрестной устойчивости/ чувствительности к разным стрессовым факторам полученных экспериментаторами форм растений с генетическими изменениями активности систем стрессового ответа (индуцированных мутагенами или созданных генно-инженерными методами).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены: на конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (г.Минск, Беларусь 2004), XII и XV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» и «Ломоносов-2008» (Москва), на

международных конференциях и конгрессах «Новые информационные технологии и медицине, фармакологии, биологии и экологии» (Крым, Украина, 2007), «Биофизика фотосинтеза. Межклеточная сигнализация и регуляция генов в растениях» (Минск, Беларусь, 2007), «Международный генетический конгресс 2008» (Берлин, Германия, 2008), на межлабораторном семинаре «Генетика растений» и «Мутагенез и генетическая безопасное] ь» (ИОГен им.Н.И.Вавилова, 2008). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на_страницах,

состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), описания материалов и методов (Глава 2), результатов и обсуждения (Глава 3), заключения, выводов и списка

литературы, включающего _ источника. Работа содержит _ рисунков и _

таблиц.

Работа поддержана грантами РФФИ (проект 07-04-12077-офи), ФЦП «Ведущие научные школы» (HIII-4202.2008.4), npoipaMMofi РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека» и гратом Германской службы академических обменов (DAAD).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Обзор литературы

В первом разделе -)той главы приведена информация о влиянии на растения абиотических стрессовых факторов (холод, засуха, засоление, разные уровни освещения), которые не только лимитируют рост и развитие, но и являются основной причиной гибели растений в природе. В обзоре рассмотрены данные об изменении экспрессии генов защитного ответа при действии индукторов окислительного стресса, яркого света и гипотермии, проведен анализ информации о функции этих генов в клетках растений. Особое внимание уделено рассмотрению роли абсцизовой кислоты (АБК) и генов контролирующих биосинтез этого гормона в развитии устойчивости к стрессовым факторам. Анализ литературы позволил выделить те гены, уровень экспрессии которых у A thaliana существенно зависит от действия разнообразных стрессовых факторов и которые целесообразно использовать для получения полной картины изменений адаптивного ответа у мутанта nfz24 A.thaliana.

Глава II. Материалы и методы

В главе сообщается об условиях выращивания растений и использованных в работе стрессовых воздействиях. Приведены методы выделения и очистки ДНК и РНК, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и

трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), метод определения пролина. Приведены перечни праймеров, которые использованы для изучения транскрипции генов методом полуколичественного ПЦР-апализа продуктов обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) и секвенирования генов, а также праймеры и рестриктазы для САР8-маркеров (ПЦР-ПДРФ). Приведены условия различных видов Г1ЦР. Особое внимание уделено методам молекулярно-генетического картирования. Последний раздел посвящен компьютерным методам анализа функции генов. Обобщенная схема основных экспериментов по исследованию мутанта п/г24 приведена ниже (рис.1).

Схема работы: п/г24 и растения расы йЦоп-М

Генетическое картирование (F2 и КЗ от скрещивания с Columbia-M)

Морфо-физиологические и Анализ экспрессии генов в биохимические

ответ на различные стрессовые воздействия (ОТ-НЦР)

исследования

Поиск и секвенирование генов кандидатов

холод, АБК,

холод + АБК

Компьютерный анализ баз данных и анализ экспрессии генов кандидатов

окислителыши (гербицид НФ)

ТЭМ, ВЭЖХ (сравнение содержания каротиноидов, токоферолов и хлорофилла в растениях мутанта и дикого типа

разные уровни освещенности

анализ чувствительности к гербициду, холоду, разным уровням инсоляции

Рисунок I. Схема экспериментов по исследованию мутанта nfz24.

Глава III. Результаты и обсуяздсние

1. Фенотиннческие особенности мутанта nfz24 и реакция на стрессовые факторы (холод, свет и длительное действие НФ)

В работе описаны особенности проявления рецессивной мутации nfz24 11а уровне морфологии растений и динамики их развития. Наиболее характерной особенностью мутанта nfz24 является светло-зеленая окраска листьев и цветоноса, а также бледная желто-зеленая окраска верхушек цветоноса, интенсивное гь которой меняется в течение вегетации и в зависимости от условий освещения. В связи с изменениями окраски листа у мутанта проведены сравнительные исследования ультраструктуры хлоронластов nfz24 и растений дикого типа (расы Dljon-M, на основе которой была получена мутация). Показано, что хлоропласта из клеток розеточных листьев

молодых и взрослых растений п/г24 имеют хорошо сформированную внешнюю мембрану и содержат крахмальные зерна, однако их количество значительно меньше чем в хлоропластах растений расы Оуоп-М. 'Гилакоиды большинства хлоропластов мутанта п/г24 имеют вид длинных полос, а стопки гран состоят из 3-4 ламелл в отличие от 5-9 ламелл гран хлоропластов дикого типа. В некоторых клетках мутантных растений отмечено увеличение размера митохондрий. Выявленные изменения в структуре хлоропластов и митохондрий могут влиять на эффективность фотосинтеза и дыхания в клетках мутанта и являться одной из причин изменения резистентности к стрессовым факторам.

Проведен анализ реакции мутанта на гипотермию, яркий свет и длительное действие НФ. Установлено, что мутант п/г24 характеризуется высокой чувствительностью к низкой положительной температуре не только на уровне взрослых растений и суспензии клеток (Волкова и др., 2005), но и на стадии прорастания семян. При субоптимальной температуре (+15°С) у мутантной линии наблюдается более значительная, чем у исходной, задержка прорастания семян (рис.2). На 2-е сутки у исходной линии дикого типа наблюдали 9% проклюнувшихся семян (образование корешков) по отношению к доле проклюнувшихся семян при оптимальной температуре (23-25°С); на 3 и 4-е сутки - 67% и 99% семян имели семядоли и корешок. Среди семян мутантной линии всхожие семена появились только на 4-е сутки (60% всхожих семян по отношению к контролю при 23-25°С).

100

S 60

5 40

Г*-)

Рисунок 2. Всхожесть семян пинии дикого типа (белый) и мутанта nfz24 (серый) при +15"С (в % от величины всхожести семян при 23~25°С).

2 4 5

сутки

□ Ирп-М Вг^г24

Данные результаты говорят о чувствительности мутанта п/г24 к пониженным температурам, что подтверждает полученные ранее данные о повышенной чувствительности к холоду растений на репродуктивной стадии развитии (Волкова и др., 2005).

Мутант п/г24 показал более высокий уровень устойчивости к воздействию

яркого света по сравнению с растениями дикого типа. В контрольных условиях (150 мкЕ, 14 ч/освещения) растения дикого типа в возрасте четырех недель переходили к стадии цветения и начинали формировать цветонос, в то время как растения мутанта nfz24 находились на стадии розетки. После воздействия ярким светом (300 мкЕ, 14 ч/освещения) в течение недели растения расы Dijon-M приобретали более насыщенный темно-зеленый цвет, однако прирост числа листьев и увеличение длины цветоноса было не значительным и составляло, соответственно всего 20 и 15% от этих показателей у растений, оставленных в контрольных условиях (рис. 3). В отличие от оставленных в контрольных условиях растений nfz24, которые так и оставались на стадии розетки, на ярком свету растения мутанта характеризовались значительным приростом числа листьев и высоты цветоноса (рис. 3). На воздействие слабым светом (50 мкЕ, 12ч/освещения) растения, как дикого типа, так и мутанта отвечали более значительным замедлением роста и накопления общей массы. Единственным отличием было то. что растения расы Dijon-M приобретали светло-зеленую окраску, в то время, как мутант становился чуть более зеленым, чем контрольные растения.

Прирост числа листьев Прирост длины цветоноса

Рисунок 3. Изменение морфометрических показателей (увеличение числа листьев, удлинение цветоноса) растений мутанта п/г24 (черный) и дикого типа (серый) после 7 дней выращивания в контрольных условиях (К), в условиях высокой (Ш) и низкой (Ы) освещенности, в % от исходных значений этих показателей.

Таким образом, мутант п/г24 более устойчив к воздейст вию света, по сравнению с растениями дикого типа. В отличие от последних, рост которых и переход к цветению резко замедлялся, растения мутанта отвечали усилением роста и общей массы на данное воздействие.

Мутант был получен прямой селекцией на устойчивость к норфлуразону (11Ф) среди проростков поколения М2, полученных после обработки семян

этилметансульфонатом (Маманова и др., 1997). В данной работе был проведен эксперимент с более длительным (21 день) выращиванием на среде, содержащей ПФ в диапозоне концентраций от 0,05 до 0,005 мкМ. Было обнаружено, что семена мутанта в большинстве (85%) проклевывались (образование корешков) уже на вторые сутки проращивания, а семена дикого типа только на четвертые. Это хорошо согласуется с данными об устойчивости мутанта nfz24 к воздействию гербицида НФ. Однако в дальнейшем рост и развитие растений мутанта практически прекращался в отличие от растений дикого типа. Таким образом, толерантность растений мутанта nfz24 проявляется только при кратковременных (7 суток) воздействиях НФ. При длительном воздействии (21 день) мутант проявляет большую чувствительность к этому гербициду.

2. Физиологические особенности мутанта nfz24

В связи с тем, что мутант nfz24 имеет светлую желто-зеленую окраску листьев и стебля, было определено содержание пигментов. В листьях мутанта обнаружено 32% общего содержания хлорофилла по сравнению с растениями дикого типа. Отношение хлорофилла а/b у мутанта ниже, чем у дикого типа (табл. 1), что связано с более выраженной редукцией содержания хлорофилла а. Растения мутанта nfz24 характеризуются пониженным уровнем общего содержания каротипоидов (до 30 % от дикого типа), хотя по соотношению разных форм каротипоидов растения мутанта и дикого типа практически не различались (табл. 1).

Таблица 1.

Содержание каротипоидов и хлорофилла в растениях дикого типа и мутанта nfz24.

Diion-M nfz24

Общее содержание хлорофилла в 1574±150 496±53

мкг на г сырого веса

Отношение хлорофилла а/Ь 3.39 2.76

Общее содержание каротипоидов в 234,0±15 73,5 ±0,5

мкг на г сырого веса

Спектр люгеин 39.0 43.5

каротипоидов (% зеаксантин 0.77 2.7

бэтга-каротин 23.5 20.3

от общего неоксантин 13.3 12.6

содержания) виолаксантин 20.7 15.6

антероксантин 2.6 5.3

Поскольку мутант был отобран по толерантности к НФ, провели анализ содержания пигментов и после обработки 4-х-недельных растений 10 мкМ НФ.

Суммарное содержание хлорофилла в растениях расы Dijon-M после воздействия понизилось на 16%, в то время как в растениях мутанта nfz24 содержание хлорофилла снизилось более чем на 40%. Что касае1ся каротиноидов, динамика изменений различна, но, в то же время, в растениях мутанта содержание всех каротиноидов снижается в два и более раза, в то время как в растениях дикого тина почти не изменяется. Полученные данные согласуются с данными по длительному выращиванию (21 день) проростков в присутствии гербицида и свидетельствуют о необходимости дополнительных исследований активности антиокидантных систем в растениях мутанта.

С этой целью проведен анализ содержания в растениях мутанта и дикого типа токоферола - важного компонента неферментативной антиоксидантной защиты, образующегося из геранилгеранилпирофосфата, который является также предшественником синтеза каротиноидов и фитила. Общее содержание токоферола у мутанта оказалось почти в два раза выше, чем в растениях дикого типа (табл. 2). Таким образом, выявляется обратная корреляция между содержанием токоферола и хлоропластных пигментов, что согласуется с данными продемонстрированными ранее на нескольких видах растений (Rise М et al. 1989). Как и в случае с пигментами, был проведен анализ содержания токоферолов после обработки 4-х-нсдельных растений ЮмкМНФ.

Суммарное содержание токоферолов в растениях расы Dijon-M после воздействия гербицидом понижалось примерно на 20%, в то время как в растениях мутанта nfz24 содержание токоферолов снизилось на 60% от первоначального высокого уровня, в результате содержание токоферола стало ниже, чем в растениях дикого типа. Этот результат свидетельствует о высокой напряженности стрессового фактора в растениях мутанта nfz24, которая может являться причиной первоначальной толерантности мутанта к воздействию 1 ербицида.

Таблица 2.

Содержание токоферола и пролина в растениях дикого типа и мутанта nfz24.

Токоферола а в мкг на г сырого веса Токоферола у в мкг на г сырого веса 2,7±0,2 0,1 ±0,01 4,4±0,15 0,24±0,01

Пролина в мкг на г сырого веса контроль 304±15 246±12

4°С 10 суток 562±25 620±21

4°С 20 суток 580±23 480±18

Уровень пролина в растениях nfz24, выращенных при 24°С на свету ниже, чем в исходной линии на 20% (табл. 2). При холодовом воздействии (+4°С, 10 суток) содержание пролина в растениях дикого типа и мутанта значительно повышалось (в 1.8 и 2.5 раза, соответственно, по сравнению с исходным уровнем). На 20 сутки холодового воздействия содержание пролина у мутанта снизилось на 29%, в то время как у дикого типа снижения не было (табл. 2). Отмечено увядание листьев у мутанта на 20-е сутки. Значительное повышение пролина в растениях nfz24 также свидетельствует о более выраженной у мутанта напряженности стрессового фактора.

3. Анализ экспрессии генов 3.1. Анализ экспрессии генов холодового ответа после воздействия холодом н

экзогенной АБК

Методом полуколичественного ПЦР-анализа продуктов обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) изучили экспрессию генов АБК-зависимого и АБК-независимого отпета на холодовой стресс в растениях, выращиваемых при температуре -f20°C (контроль) и подвергнутых холодовому воздействию (+4°С). Уровень экспрессии АБК-зависимого гена RABJ8, который кодирует гидрофильный, глицин-богатый белок из семейства дегидринов, в растениях мутатной линии оказался в три раза ниже в контрольных условиях, чем в растениях дикого типа (рис. 4 а, б). Ранее было показано, что существует прямая зависимость концентрации мРНК гена RABI8 от содержания АБК в растении, поэтому но уровню экспрессии этого гена можно оценивать относительный уровень эндогенной АБК в растениях (Parcy et al., 1997). Следовательно, выявленные различия в экспрессии гена RAB18 в растениях дикого типа и мутанта nfz24 косвенно указывают на еннжение концентрации гормона в мутантных растениях в 2 раза. При воздействии экзогенной АБК экспрессия гена RAB18 увеличивалась как в растениях дикого типа, так и в мутантных растениях в сходном соотношении 40% (рис. 4 а, б), что подтверждает выявленную зависимость между уровнями экспрессии гена RABI 8 и содержанием АБК.

При холодовом стрессе количество транскрипта RABI8 в растениях мутанта и дикого типа становится близким (рис. 4 а. б), что можно объяснить индукцией под действием холода синтеза эндогенной АБК не только в растениях дикого типа, но и у мутанта nfz24. При совместном действии холода и экзогенной АБК уровень экспрессии гена RABI8 увеличивался еще значительнее в равной степени у мутанта и дикого типа.

Экспрессия гена АВА1 (LOS6), контролирующего синтез АБК, в растениях мутанта существенно ниже (более, чем в 8 раз), чем в контрольных растениях дикого типа (рис. 4, а, в). При холодовом воздействии в растениях дикого типа экспрессия гена АВА1 повышалась, н то время как у мутанта она оставалась на низком уровне.

При совместном действии холода и АБК экспрессия гена ABA J в растениях дикого типа практически не изменялась rio сравнению с холодовой обработкой, а в растениях мутанта увеличивалась в 10 раз, достигая уровня транскрипции этого гена в растениях дикого типа после воздействия холода (рис, 4). Холодовое воздействие незначительно повышало экспрессию гена CBF1, кодирующего транскрипционный фактор С-ВОХ BINDING FACTOR-1, в растениях дикого типа и мутанта (рис. 4 а, в), но практически не влияло на уровень экспрессии гена COR15a, который кодирует гидрофильный белок, находящийся в строме хлоропласта (рис. 4 а, в). Совместное действие холода и АБК не вызывало дальнейшего повышения уровня транскрипции гена COR 15а.

контроль АБК ХОЛОД ХОЛОД И АБК й) контроль холод

150

холод и АБК

UBS RAB18 АВА1 COR15 CBF1

ISO 120 эо

К19 пfz24 К19 nfe?4 К19 nfz24 К19 nfz24 sSBS шш ЯШ ШШ

контроль АБК RAB18

холод холод и АБК

150 120

АВА1

COR 15

CBF1

Рисунок 4. Относительный уровень транскрипции генов холодового ответа АВА1, CORI5A, CBFI (в) и RAB18 (б) в растениях дикого типа (серый) и мутанта nfz24 (черный). Данные О'Г-ПЦР (а) и рассчитанный no ait'vi относытельныы уровень ■экспрессии генов (б, в). Содержание кДНК выравнивали по контрольному гену UBS, так же на рис 5 и 7.

Таким образом, анализ транскрипции генов, контролирующих разные пути холодового ответа показал, что у мутанта nfz24 наблюдается изменение экспрессии генов АБК-зависимого холодового ответа (RAB18, АВА1), но практически не изменена (по сравнению с диким типом) экспрессия генов, которые не регулируются АБК (CBF1) или регулируются как холодом, так и АБК (CORlSa). При совместном

действии холода и экзогенной АБК экспрессия гена АВА1 в растениях мутанта достигала уровня дикого типа, что согласуется с данными о регуляции этого гена конечным продуктом. Полученные результаты свидетельствуют о снижении уровня эндогенной АБК, который может объясняться сниженным содержанием каротиноидов у мутанта (30% от общего содержания каротиноидов у дикого типа).

3.2. Анализ экспрессии генов антшиссидантной защитной системы в ответ на холодовой стресс и высокий уровень освещения

Ранее было показано, что причиной толерантности мутанта nfz24 к кратковременному воздействию гербицида НФ является более быстрое и более существенное повышение уровня активности антиоксидаптных ферментов (Ежова и др., 2000). В данной работе изучали активацию антиоксидаптных систем на уровне регуляции транскрипции генов. Для исследований были выбраны гены sApxd (стромалыюй аскорбатпсроксидазы). CSÜ2 (магний/цинк супероксиддисмутазы) и PrxQ (пероксиредуксина), которые участвуют в детоксикации радикалов кислорода и перекиси водорода, в том числе и при таких стрессовых факторах, как гипотермия, окислительный стресс и высокий уровень инсоляции (Küebenstein et al., 1998; Mittler et al., 2004).

Нами установлено, что исходный уровень транскрипции гена sApx в растениях мутантной линии rtfz24 ниже, чем в растениях расы Dijon-M, но при воздействии холода, эют уровень значительно повышается по сравнению с диким типом (рис. 5 а). Аналогично, но менее выражено ведет себя ген из семейства сунероксиддисмутаз CSD2 (рис. 5 а). Ранее более значимое повышение у мутанта суммарной активности супероксиддисмутаз и пероксидаз наблюдали после обработки растений 1мкМ раствором НФ на репродуктивной стадии развития (Ежова и др., 2000).

При совместном воздействии холода и АБК уровень экспрессии 1ена sApxd в растениях расы Dijon-M повышается в три раза по сравнению с контрольным уровнем. Это значение у мутанта nfz24 достигает лишь уровня, который наблюдается в растениях дикого типа под воздействием только холода. Уровень транскрипции гена CSD2 при совместном воздействии холода и АБК не отличается у растений мутанта и дикого типа.

Транскрипция гена PrxQ в контрольных условиях в растениях мутанта сравнима с таковой в растениях расы Dijon-M. Под воздействием холода, как и иод совместным воздействием холода и экзогенной АБК, в растениях дикого типа экспрессия снижается. В то же время транскрипция гена PrxQ в растениях мутанта nfz24 под воздействием холода не изменяется, и повышается иод совместным воздействием холода и АБК. При выращивании растений в условиях короткого дня (КД) и слабой освещенности (LI) существенных различий по уровню экспрессии генов

антиоксидантной системы между растениями дикого типа и мутанта выявлено не было, в то же время на ярком свету (Н1) экспрессии С?£>2 и Ргх() была повышена. Изменение уровня транскрипции данных генов в условиях разной освещенности представлена на рис. 5 Б.

ЭАРХс!

SAPXd PrxQR CSD2

UBS

v. • .«

WS: '

(KOHT)

CSD2

(KOHT)

(ХОЛОД)

(x+ABA)

(KOHT)

(холод) PrxQ R

(холод)

(x+ABA)

SAPXd

PrxQR CSD2

UBS

es» i» ¿.«

• 1

Конт Конт Кд Кд Hl Hl LI

250 | 200 150 -100 -50 -0

Конт Конт Кд Кд Hl Hl

PrxQR

Конт Конг Кд Кд Hl Hl LI LI

Рисунок 5.Относительный уровень транскрипции генов антиоксидантного ответа sAPX, PrxQ и CSD2 в ответ на холодовой стресс (А) и изменение светового режима (Б) в растениях дикого типа (черный) и мутанта гф.24 (серый). Данные ОТ-ПЦР и рассчитанный по ним относительный уровень экспрессии.

Таким образом, при воздействии холода и яркош свста выявляются различия в ответе антиоксидантных систем мутанта на уровне транскрипции генов по сравнению с диким типом. Мутант отвечает на воздействие холода и яркого света более существенным увеличением уровня транскрипции исследованных генов. Только при изучении гена sAPX повышение его транскрипции в ответ на яркий свет достигало у растений дикого типа того же уровня, что и у мутанта. Следовательно, мутант nfz24 характеризуется повышенной активностью антиоксидантных систем не только при действии гербицидов, вызывающих окислительный стресс - НФ (Ежова и др., 2000; 2001) и иараквата (Волкова и др., 2005), но и при воздействии других стрессовых факторов, одной из составляющих которых является повышение уровня активированного кислорода и перекисей.

Поскольку в растениях мутанта выявлено снижение содержания хлорофилла, нами также была проанализирована экспрессия генов биосинтеза хлорофилла Chll, СЫН, ChlD и Chl27 в растениях дикого типа и мутанта. Значительных изменений уровня транскрипции этих генов обнаружено не было.

4. Молскулярио-генетическое картирование гена nfz24 4.1. Картирование с использованием морфологических маркеров

Для выяснения локализации гена NFZ24 на генетической и физической картах A.ihaliana использовали доминантные морфологические и кодоминантные ДПК-маркеры. Для картирования гена NFZ24 относительно морфологических маркеров было проанализировано в общей сложности около 4 000 растений из поколения F2 от скрещивания мутанта с маркерными линиями. Анализ расщеплений показал сцепление NFZ24 с маркерными генами из хромосомы 2: с геном ASI (20 сМ), геном PI1YB (13 сМ) и геном ER (рис. 6 а). Причем, на выборке из 1323 растений рекомбинаиты между генами NFZ24 и ER не обнаружены. При допущении наличия одного рекомбинанта, рассчитанное расстояние до гена ER составляет менее 6 сМ.

Для более точною определения расстояния между генами использовали растения F3 поколения, которые получены от скрещивания мутанта nfz24 с растениями маркерных линий mm2L и ЬуЗ, содержащими мутацию ег. Всего исследовано - 76 семей потомков гомозигот по мутации ег из F2, полученного от рсципрокных скрещиваний с маркерными линиями. Из них только 4 семьи выщепляли мутант nfi.24. Таким образом, расстояние между генами ER и NFZ24, вычисленное по методу (Koornnecf, Stam, 1987), составляет 2.8 сМ. Полученные результаты не дают, однако, возможности определить, с какой стороны от гена ER локализован ген NFZ24. В этой связи был проведен более точный анализ локализации гена NFZ24 с помощью ДНК-маркеров.

4.2. Молекулярное картирование гена NFZ24 с помощью CAPS-маркеров

Анализ проводили на растениях поколения F3, полученных от скрещивания мутанта nfz24 с растениями расы Columbia-M, которая по ранее полученным данным (Пении и др., 2003) показывает высокий полиморфизм ДНК с расой Dijon-M. Поскольку в базах данных отсутствует информация о маркерах, позволяющих выявлять полиморфизм ДНК этих рас, па первом этапе были проведен поиск и создание CAPS-маркеров (cleaved amplified polymorphic sequences), локализованных в интересующем районе хромосомы 2. Было установлено, что для выявления полиморфизма между расами Columbia-M и Dijon-M можно использовать 3 маркера, которые по данным TAIR (www arabidopsis.org) выявляют рестрикционный полиморфизм ДНК расы Columbia-M и лабораторной линии Ler. это маркер era (или ег), который расположен на RI-карте в положении 50.64 сМ, а на физической карте - в положении 11 219 т.п.п., маркер GPA1, который находится на RI карте в положении 48.9 сМ, а па физической - 11 206 т.п.н., а также маркер T20D163, локализация которого на генетической карте не известна, а на физической он находится в положении 9957 т.п.н. (в ВАС-клоне T20D16). Кроме того, нами созданы 2 новых маркера к генам СОР1 (назван в соответствии с новыми требованиями номенклатуры MSUCAPS-COP, локализован на физичексой карте 13 990 т.п.н.) и гену GGPS2 (назван MSUCAPS-GGPS, находится в положении 10 139 т.п.н.)

м- 13,3 --►

20 -►

35.00 си 65.00 CM[~F]

____________.J0

I.......I I I I I 1 I I I I I i I

40.00 -*-2,8->- 50.00 60.00

I' . , , I.......I , i I

^PHVpl CP2 RPTA^Ely НАХТ ЕИВТ52 LAN ШП ЕИВ53 PIDQ_Asi)

S SURl P0M2 CIV3 SE FUS12 DWF6 FIL ИАХ2 C0P1 ABIS

w' ' '

$ CHL2 ELF3 RTM SYD 3IH2 DAD CPC

^ i ill iii

It !_~,JL _____^-Ty-J..^»»«!..^. .„■.«U.U-J.J —J ..„¡и«!.™™!.,— — »!««.'-„,» U.

Т20Р163 М8ЦСАР£-ОСР82 ер_С, РА 1 ЖиСАР8-£ОР

N1-7,24

■*- 7,8 -► •«- 5,3 -►

<- 6,2 -►

«- 11,7 -►

Рисунок б. Положение гена ЫР224 на классической генетической (а) и мопекулярно-генетической карте (б) хромосомы 2. Цифрами обозначены генетические расстояния (сМ), звездочкой обозначено предположительная локализация гена ЫР224 относительно морфологических маркерных генов (а) и ДНК- маркеров (б).

Анализ 78 растений (156 хромосом) позволил обнаружить 8 рекомбинантных хромосом по era (расстояние до гена NFZ24 составило 5.3± сМ) и 9 рекомбинантных хромосом по GPA1 (расстояние до гена NFZ24 составило 6.2± сМ) (рис. 6 б). Рекомбинаиты по era и GPA1 являются одновременно рекомбинантами но маркеру MSUCAPS-COP, но не являются рекомбинантами по маркеру T20D163. Следовательно, ген NFZ24 локализован справа от маркера T20DI63. По маркеру MSUCAPS-GGPS не было обнаружено рекомбинантных хромосом, следовательно, расстояние между данным маркером и искомым мутантным геном (при допущении одного рекомбинаита) составляет менее 0.65 сМ. Таким образом, ген nfz24 локализован в непосрсдст венной близости от данного маркера.

По нашим данным, полученным для генов ER и СОР], 1 сМ на RI-карте в этом районе хромосомы соответствует 217.8 i.h.h. Из этого следует, что геи NFZ24 локализован в пределах 10 ООО - 10 300 т.п.н. на физической карте, что соответствует участку ВЛС-клонов F27L4 и Т29Е15. В картированном участке, протяженностью в 300 т.п.н., расположено 70 генов. Полученные результаты позволяют перейти к поиску кандндатных генов для позиционного клонирования гена NFZ24.

5. Анализ генов-претендентов на роль гена NFZ24

Для более эффективного поиска генов-кандидатов в районе локализации nfz24, учитывали морфо-физиологические особенности проявления мутации - ее плейогроппый эффект на устойчивость к инсоляции и чувствительность к холоду, четкое морфологическое проявление на всех стадиях морфогенеза и во всех наземных органах (по изменению окраски листа, связанному со снижением содержания пигментов и изменениями структуры хлоропластов). На основе этих характеристик мутанта, которые позволяют судить о функции гена на уровне растения, с помощью компьютерных баз данных A Comprehensive Systems-Biology Database (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de). далее CSB.DB, и SIGnAL (http://signal.salk.edu) среди 70-ти генов были выявлены гены (At2g23800, At2g23790, At2g23670, A/2g23680, At2g24040 и At2g23340), которые характеризуются наличием экспрессии во всех наземных органах и изменяют уровень экспрессии при стрессовых воздействиях, а также гены, продукты которых локализованы в хлоропластах, а значит, потенциально могут нести мутацию nfz24. Анализ предполагаемой функции выявленных генов проводился с использованием базы данных A.thaliana «TAIR» (http://www.arabidopsis.org).

На начальном этапе был исследован ген At2g23800 максимально близко расположенный к зоне картирования мутации, поскольку между маркером к гену At2g23800 (MSUCAPS-GGPS) и nfz24 реко.мбинантов не обнаружено. Ген At2g23800 (GGPS2) - кодирует геранилгеранилпирофоефат синтазу, один из ключевых ферментов

биосинтеза предшественника каротиноидов, которые играют важнейшую роль в защите растений от стрессовых воздействий - гипотермии, засухи, оксидативного стресса.

При сравнении нуклеотидной последовательности гена GGPS2 расы Dijon-M, Columbia и мутанта nfz24 была обнаружена высокая гомология между ними, за исключением замены в положении 32 С (у Columbia и nfz24) на Т у Dijon-M. В нуклеотидной последовательности Dijon-M и nfz24 обнаружена замена в положении 624 G по сравнению с Columbia (624 Т). Именно эта замена позволила создать CAPS маркер MSUCAPS-GGPS в данном районе, который был использован при картировании гена NFZ24 в популяции F2 от скрещивания мутанта с растениями расы Columbia-M (см выше). Выявленные замены не приводят к изменениям аминокислотной последовательности. Таким образом, отсутствие существенных нуклеотидных замен в последовательности гена мутанта nfz24 говорит о том, что рассматриваемый ген At2g23800, по-видимому, не является геном NFZ24.

Исследованы также ген At2g24040, кодирующий белок, предположительно участвующий в холодовом ответе (TAIR), и ген At2g23670, кодирующий белок с неизвестной функцией, локализований в люмене хлоропластов. Методом ОТ-ПЦР экспрессия генов At2g24040 И At2g23670 была проанализирована в растениях мутанта nfz24 и растениях дикого типа при воздействии холодом, АБК, холодом совместно с АБК и светом (рис. 7).

В нормальных условиях транскрипция гена At2g24040 в растениях расы Dijon-M и в мутантных растениях nfz24 была одинакова. В ответ на холод и холод совместно с экзогенной АБК транскрипция гена Al2g24040 повышалась в два раза в растениях дикого типа уже через час после начала эксперимента, но не изменялась, или изменялась незначительно в растениях мутанта. На ярком свегу значительных различий между мутантом и диким типом не наблюдалось (рис. 7). Эти результаты подтверждают данные TAIR о том, что данный ген активно экспрессируется в ответ на холод у A.thaliana. Поскольку в растениях мутанта nfz24 транскрипция гена Al2g24040 практически не изменялась в ответ на холод, можно предполагать, что изменение уровня экспрессии этого 1ена может быть одной из причин чувствительности мутанта к холоду.

В свою очередь транскрипция гена At2g23670 в мутантных растениях намного ниже в контрольных условиях, чем у растений дикого типа, по она усиливается в 15 раз на холоде по сравнению с контрольными условиями, в отличие от растений дикого типа, у которых экспрессия гена практически не изменяется. Транскрипция данного гена усиливается в два раза на коротком дне и уменьшается в два раза на слабом свету в обоих классах растений. На ярком свету уровень его экспрессии увеличивается в два

раза только в растениях мутанта п/г24. Эти результаты свидетельствуют о том, что в нормальных условиях растения мутанта испытывают стрессовое напряжение, и регуляция ответа на определенные абиотические стрессы изменена. Также, эти результаты могут свидетельствовать о гипотетическом наличие мутации в этих генах.

А12д23570 М2д24040 иВБ

контроль короткий яркий слабый день свет свет »ШЯШ ,.

&т. т

' ЧФЬ^ 'Л.— гщ,

Ш. • ¡у., „___- '| •■■ 'У'" ■•

250 200 150 100 50 -О

А!2д236Г0

к I

Кокт Конт Кп Кд

АГ2С/24040

Конт Кон'

контроль холод холод+АБК

А12д23570 ^м

М2д24040 ■¿/Щ.

контроль холод холод+АБК

250 200 150 100 50

контроль холод холод+АБК

Рисунок 7. Относительный уровень транскрипции генов At2g23670 и Al2g24Q40 в ответ на изменение светового реэюима (а) и холодовой стресс (б) в растениях дикого типа (черный) и мутанта п/г24 (серый). Данные ОТ-ПЦР и рассчитанный по ним относительный уровень экспрессии.

Нуклеотидные последовательности двух генов (Лt2g23670 и Al2g24040) из растений расы Оуоп-М и мутанта п/г24 были амплифицированы и секвеиированы и

сравнивались с расой Colombia из базы данных TAIR.

При сравнении нуклеотидной последовательности гена At2g23670 из генома расы Dijon-M, расы Columbia и мутанта nfz24 была обнаружена 100% гомология между ними. Таким образом, отсутствие нуклеотидных замен в последовательности генов мутанта nfz24 говорит о том, что рассматриваемый ген не является геном NFZ24.

В результате анализа нуклеотидной последовательности гена At2g24040 расы Dijon-Mu мутанта nfz24 обнаружена инсерпия в 35 п.п. между позициями 118 и 119, а также деления 8 п.н. (с 181 по 189 нуклеотид) по сравнению с At2g23670 расы Columbia. Как делеция так и инсерция наблюдаются в начале интрона и не вызывают изменения аминокислотной последовательности белка. Следовательно, рассматриваемый ген At2g24040 не является геном NFZ24. В то же время, поскольку уровень экспрессии гена At2g24040 в растениях мутанта снижен и не повышается при гипотермии и комплексном воздействии гипотермии и АБК, ген At2g24040, очевидно является мишенью (прямой или опосредованной другими генетическими компонентами) гена NFZ24. Поскольку экспрессия гена At2g23670 у мутанта существенно ниже, чем в растениях дикого типа, можно предполагать, что этот ген также является мишеныо гена NFZ24 (зависит от уровня его активности). Тот факт, что холод восстанавливает уровень его экспрессии в растениях мутанта до уровня дикого типа свидетельствует о том, ген At2g23670, по-видимому, регулируется также другими генами, связанными с развитием холодового ответа.

Таким образом, нами сужен круг кандидагных i-енов. Их дальнейший анализ позволит идентифицировать ген NFZ24, контролирующий устойчивость растений к холодовому стрессу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе проведен анализ чувствительности мутанта nfz24 к гипотермии на самых ранних этапах морфогенеза (прорастание семени) и исследована чувствительность мутанта к еще одному типу стресса - высокой интенсивности света. Молекулярно-генетический анализ ответа на эти стрессовые факторы подтвердил полученные ранее данные об активации у мутанта систем антиоксидантного oiBeia, которые обеспечивают повышенную устойчивость к яркому свету и кратковременному действию индукторов окислительного стресса.

Обнаруженный в данной работе феномен повышенной устойчивости к яркому свету у мутанта со сниженным до 30% содержанием каротиноидов является неожиданным, поскольку именно каротиноиды защищают хлоропласта от фотоокисления, забирая энергию с молекулы хлорофилла и выделяя тепло в окружающую среду. По-видимому, повышение активности антиоксидантных систем у

мутанта является компенсацией снижения активности каротиноидной системы защиты, достаточной для защиты хлоропластов от фогоокислепия.

В то же время активная работа антиоксидангных cucieM не способна компенсировать дефицит- каротиноидов после воздействия на растения низких положительных температур. Очевидно, это связано с тем, что окислительный стресс не является главной причиной повреждения и гибели клеток при гипотермии. Из каротиноидов образуется стрессовый гормон - абсцизовая кислота, играющая ключевую роль в защите от гипотермии, заморозков и дегидратации (важнейшем компоненте низкотемпературных стрессов).

У мутантов со сниженным содержанием каротиноидов наблюдается пониженное содержание АБК. Хотя мы не проводили анализ содержания АБК в растениях, целый ряд экспериментальных данных свидетельствует о том, что наш мутант не является исключением из правила. Наиболее важными экспериментальными свидетельствами являются результаты анализа экспрессии гена АВА1 (рис. 4), контролирующего синтез ДБК, а также гена RAB18 (рис. 4), экспрессия которого находится в филигранной зависимости от эндогенного и экзогенного уровня этого гормона (Läng cl al., 1993, Parcy et al., 1997). Нарушение работы этих генов, которые участвуют в АБК-зависимом ответе на воздействие холода, позволяет сделать вывод о том, что каротиноиды и связанный с их содержанием полноценный АБК-зависимый холодовой ответ являются важнейшими молекулярно-генетическими механизмами защиты от гипотермии, действие которых другие пуш (не связанные с АБК) восполнить не могут. Необходимо отметить также, что пониженный у мутанта исходный уровень пролина, который является важным компонентом защиты от холода и дегидратации, также может быть связан со снижением содержания эндогенной АБК, поскольку гормон участвует в регуляции экспрессии генов биосинтеза этого осмопротсктора (Savoure et al., 1997). Повышение в условиях гипотермии уровня пролина у мутанта предполагает включение холодом альтернативных путей метаболизма пролина, не зависящих от АБК (Harc et al., 1999; Verslues, Bray, 2006). Однако повышенный уровень пролина не может компенсировать недостаток каротиноидов и АБК, которые защищают хлоропласты и растения в условиях холодового стресса.

устойчивости/чувствительности растений к разным стрессовым факторам. Решение о целесообразности использования измененных форм (и генов, вызывающих эти изменения) в практике должно приниматься в зависимости от конкретных условий произрастания и способов возделывания, с учетом удельного веса влияния разных факторов на конечную урожайность.

Изучение мутанта nfz24 позволило выявить новый геи, который играет важную роль в контроле устойчивости/чувствительности растений A.thaliana к абиотическим стрессовым факторам - холоду, яркому свету, гербицидам. Высокая чувствительность к холоду была продемонстрирована ранее для пигментных мутантов ячменя с фенотипом albina (alb-e16 и alb-/7) и xantha (xan-s46 и xan-b12), которые обладают низким (до 6% хлорофилла у мутанта xan-b'2) или следовым уровнем содержания пигментов и аномальной структурой хлоропластов (Svensson et al., 2006). В отличие от мутантов ячменя, мутант nfz24 A thaliana характеризуется нормальной жизнеспособностью и функционально способными (хотя и с изменениями структуры) хлоропластами. Очевидно, что мутанты подобные nfz24 являются более информативными для изучения роли разных компонентов клетки (например, каротиноидов) в функционировании систем защиты от холода.

По результатам проведенных исследований снижение содержания каротиноидов у мутанта не связано с нарушением их биосинтеза, о чем свидетельствует отсутствие качественных изменений спектра каротиноидов. Возможно, у мутанта снижен пул предшественников каротиноидов (например, нарушена работа генов, участвующих в синтезе ГГПФ) или затруднен процесс связывания каротиноидов с мембранами хлоропластов. Исследования не показали наличия мутаций в кодирующей части гена ГТПФ-спнтазы GGPS2, который локализован в районе гена NFZ24, однако это не исключает наличие нарушений в его регуляции. Эти нарушения могут затрагивать регуляторные области гена (цис-элемепты), которые в данной работе не исследовались, либо вышестоящие гены, регулирующие работу гена GGPS2 (о регуляторах экспрессии генов GGPS пока ничего не известно).

Молекулярпо-генетическое картирование гена NFZ24 с использованием CAPS-маркеров позволило сузить район поиска гена и локализовать его в пределах ВАС-клонов F27L4 и Т29Е15. Полученные результаты позволяют определить точное положение гена NFZ24 на физической карте, но недостаточны для его позиционного клонирования. Тем не менее, эти результаты дали возможность найти несколько кандидатных генов.

Для двух кандидатных генов с неизвестной пока функцией выявлено нарушение экспрессии в растениях мутанта (рис. 7). Поскольку уровень их экспрессии в растениях мутанта снижен, можно предполагать, что эти гены являются мишенью

гена №224 (прямой или опосредованной другими генетическими компонешами). По результатам проведенных исследований 1ене1ическую схему ответа растений А.ЛаНапа па холодовой стресс можно дополнить новыми компонентами - геном №724 и двумя новыми генами с неисследованной функцией (рис. 8).

Рисунок 8. Гипотетическая схема развития ответа растений A. thaliana на холодовой стресс с учетом генов NF7.24, At2g24040 и At2g23670.

В ходе выполненной работы были получены сведения о нуклеотидпых последовательностях нескольких участков ДНК расы Dijon-M, которые были отправлены в GenBank. Информация о CAPS маркерах MSUCAPS-COP и MSUCAPS-GGPS2, выявляющих полиморфизм между расами Dijon-M и Colambia-M, отправлена в базу данных TAIR.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НФ - норфлуразон АБК - абсцизовая кислота Ы - слабый свет Н1 - яркий свет КД - короткий день

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная

хроматография ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

выводы.

1. Мутация nfz24 A.thaliana снижает содержание каротиноидов и хлорофилла и приводит к уменьшению числа ламелл в гранах хлоропластов. Снижение уровня зеленых пигментов не связано с нарушением экспрессии генов биосинтеза хлорофилла Chll, СЫН, СЬЮ и СЫ27.

2. Мутация nfz24 повышает устойчивость растений A.thaliana к яркому свету, что, по-видимому, связано с более активной экспрессией генов ферментативной антиоксидантной системы защиты - генов CSD2 (Cu/Zn супероксиддисмутазы) и PrxQ (псроксиредоксина Q).

3. Мутация nfz24 вызывает чувствительность к гипотермии, которая проявляется на всех стадиях онтогенеза и обусловлена снижением в 3 раза уровня каротиноидов и нарушением работы генов АБК-зависимого ответа на холод (гена ABA1/LOS6, контролирующего синтез АБК, и гена RABI8, кодирующего гидрофильный глицин-богатый белок из семейства дегидринов).

4. Повышение у мутанта nfz24 исходного уровня альфа- и гамма-токоферола может обусловливать толерантность к кратковременному воздействию индуктора окислительного стресса норфлуразона, но не обеспечивает толерантность к длительному воздействию гербицида.

5. Ген nfz24 сцеплен с ДНК- маркерами era и MSUCAPS-GGPS и локализован на физической карте в районе ВАС-кпонов F27L4 и Т29Е15.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куприянова Е.В., Новокрещенова М.Г. Молекулярно-генстичсскос картирование генов Arabldopsis thaliana, участвующих в защите от стрессовых факторов // Материалы Межд. Конф. «Молекулярная генетики, геиомика и Биотехнология» Минск, Беларусь 2004, стр.79

2. Новокрещенова М.Г. Компьютерный анализ генов, контролирующих синтез терпенов у Arabidopsis thaliana // Тезисы докладов XII Межд. Конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2005», Москва, Россия 2005, стр.161

3. Новокрещенова М.Г., Солдатова О.П.. Ежова Т.А. Молекулярно-генстичсскос картирование и функциональный анализ гена NFZ24, контролирующего устойчивость растений Arabidopsis thaliana к стрессовым факторам // Бюллетень Московского общества испытателей природы, отдел биологический, 2007, Т 112, вып. 1 прил. 1, стр. 74-80

4. Новокрещенова М.Г. Влияние инсоляции и гипотермии на экспрессию генов антиоксидантных систем в растениях Arabidopsis thaliana расы Dijon и мутанта nfz24 // Материалы XV Межд. Конф. и Диск. Науч. Клуба Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, Украина, Крым. Ял га-Гурзуф 2007, стр.43

5. Novokreshchenova M.G. Expression of Chlorophyll biosynthesis genes in Arabidopsis thaliana wild type {Dijon) and the nfz24 mutant plants. Biophysics of Photosynthesis // Intracellular signaling and gene regulation in plants, Minsk, Belarus, 2007. p. 38

6. Ezhova T.A., Soldatova O.P., Apchelimov A.A., Novokreshchcnova M.G., Grim В., Shestakov S.V. Identification and analysis of A.thaliana genes involved in control of resistance to herbicides inhibiting biophysics of photosynthesis // Intracellular signaling and gene regulation in plants, Minsk, Belarus, 2007, p.35

7. Новокрещенова М.Г. Анализ генов-претендентов на роль гена NFZ24 с помощью компьютерных баз данных // Тезисы докладов XV Межд. Конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2008», стр. 73-74

8. Новокрещенова М.Г., Солдатова О.П., Волкова Л.А., Бургутин А.Б., Ежова Т.А., Роль гена NFZ24 Arabidopsis thaliana в контроле ответа на холодовой сгресс // Экологическая генетика 2008. Т VI, N 1, сгр. 20-26

9. Novokreshchenova M.G. The Arabidopsis nfz24 Mutant Responses to Cold Treatment // Genetics - Understanding Living Systems, Berlin, Germany, 2008. Abstract Book, p. 187.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Т.А.Ежовой за неоценимую помощь и внимательное отношение на всех этапах выполнения работы.

Глубокую признательность заведующему кафедрой генетики МГУ академику РАН C.B. Шестакову за поддержку на всех этапах выполнения работы, В.М.Глазеру за помощь в работе над рукописью, а также всему коллективу кафедры генетики МГУ.

Искреннюю благодарность О.П.Солдатовой и другим сотрудникам лаборатории, от каждого из которых в любой момент можно было получить теоретическую и практическую помощь.

Профессору Б. Гримму (Humboldt University, Germany), а так же Л.А.Волковой и А.Б.Бургутину (ИФР) за помощь в выполнении биохимических и физиологических исследований.

Моей подруге, Куприяновой Евгении, за моральную поддержку и помощь на всех этапах выполнения работы. Моей маме и дочке Катеринке за предоставленную возможность учиться.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 20.10.2008 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Новокрещенова, Мария Габриэловна

ВВЕДЕНИЕ 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Разнообразие абиотических стрессовых факторов и универсальность явления окислительного стресса

2. Окислительный стресс, вызванный гербицидами

3. Антиоксидантные защитные системы растительных клеток

3.1 Ферментативные системы защиты от окислительного стресса.

4. Ответ растений на абиотические стрессовые факторы.

4.1 Взаимодействие систем ответа растений на действие разных абиотических стрессовых факторов.

4.2 Гипотермия и ее компоненты, генетический контроль устойчивости к холоду

3.2. Неферментативные системы защиты от окислительного стресса

5. Роль АБК в устойчивости к стрессовым факторам.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические механизмы ответа на абиотические стрессовые факторы у мутанта nfz24 Arabidopsis thaliana(L.) Heynh."

Растения, подвергающиеся постоянному воздействию стрессовых факторов окружающей среды, обладают способностью адаптироваться к ним за счет включения многообразных систем защиты. За последние годы значительный прогресс достигнут в понимании механизмов работы этих систем, идентификации и картировании генов, участвующих в защите растений от стрессовых воздействий. Одним из наиболее эффективных подходов, позволяющих выявлять эти гены адаптивного ответа, является выделение и изучение мутантов,, чувствительных и устойчивых к стрессовым воздействиям. Такие мутанты являются моделями для изучения механизмов регуляции адаптивного ответа на стрессовые воздействия.

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. является модельным генетическим объектом. Короткий жизненный цикл (1,5 - 2 месяца), высокая плодовитость (до 1000 семян с одного растения), миниатюрность растений, позволяющая выращивать их в пробирках в лабораторных условиях, а также мелкий размер семян, дающий возможность анализировать на одной чашке Петри более 1000 проростков, позволяют считать A.thaliana наиболее удобным объектом для получения мутантов с изменённой чувствительностью к окислительному стрессу. Получение мутантов, резистентных к окислительному стрессу, представляет не только научный интерес, но имеет большое практическое значение: небольшой размер генома A.thaliana (около 120 000 т.п.н.) и малое количество повторяющихся последовательностей повышают эффективность экспериментов по клонированию генов, что позволяет использовать гены A.thaliana для создания устойчивых к окислительному стрессу форм хозяйственно ценных растений (Li et al., 1992). На кафедре генетики МГУ создана коллекция мутантов модельного растительного объекта A. thaliana, толерантных к индукторам окислительного стресса: норфлуразоны, ацифлуорфену и плюмбалину (Ежова и др., 2001).

В данной работе был исследован мутант nfz24 A.thaliana, выделенный с помощью химического мутагенеза по устойчивости к норфлуразону, который ингибирует биосинтез каротиноидов, вызывает фотодеструкцию хлорофилла и гибель растений (Солдатова и др., 1996). Мутант nfz24 проявляет также перекрестную устойчивость к другому индуктору окислительного стресса — параквату, что связано с повышенной активностью антиоксидантных ферментов — супероксиддисмутазы и пероксидазы. В то же время, при воздействии низких положительных температур мутант nfz24 показывал значительно большую чувствительность к холоду, чем растения дикого типа расы Dijon (Ежова и др., 2001; Волкова и др., 2004).

Целью работы является изучение молекулярно-генетических механизмов ответа мутанта nfz24 A.thaliana на разные абиотические стрессовые факторы (холод, высокие дозы гербицида норфлуразона, яркий свет) и локализация мутации на молекулярно-генетической и физической картах хромосом этого вида.

Задачами работы являлись:

1. Характеристика морфо-физиологических особенностей мутанта nfz24 (анализ структуры хлоропласта, содержания пигментов, токоферола, пролина).

2. Анализ влияния гербицида норфлуразона, холода и разных уровней освещенности на фенотипические и физиологические параметры мутанта nfz24.

3. Изучение экспрессии генов, контролирующих антиоксидантный, холодовой ответ и синтез хлорофилла и каротиноидов у мутанта nfz24 в условиях действия стрессовых факторов.

4. Локализация гена NFZ24 на молекулярно-генетической и физической картах генома A.thaliana и выявление генов кандидатов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Новокрещенова, Мария Габриэловна

ВЫВОДЫ.

3. Мутация nfz24 вызывает чувствительность к гипотермии, которая проявляется на всех стадиях онтогенеза и обусловлена снижением в 3 раза уровня каротиноидов и нарушением работы генов АБК-зависимого ответа на холод (гена ABA1/LOS6, контролирующего синтез АБК, и гена RAB18, кодирующего гидрофильный глицин-богатый белок из семейства дегидринов).

5. Ген nfz24 сцеплен с ДНК- маркерами era и MSUCAPS-GGPS и локализован на физической карте в районе ВАС-клонов F27L4 и Т29Е15.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куприянова Е.В., Новокрещенова М.Г. Молекулярно-генетическое картирование генов Arabidopsis thaliana, участвующих в защите от стрессовых факторов // Материалы Межд. Конф. «Молекулярная генетики, геномика и Биотехнология» Минск, Беларусь 2004, стр.79

3. Новокрещенова М.Г., Солдатова О.П., Ежова ТА. Молекулярно-генетическое картирование и функциональный анализ гена NFZ24, контролирующего устойчивость растений Arabidopsis thaliana к стрессовым факторам // Бюллетень Московского общества испытателей природы, отдел биологический, 2007, Т 112, вып. 1 прил. 1, стр. 74-80

4. Новокрещенова М.Г. Влияние инсоляции и гипотермии на экспрессию генов антиоксидантных систем в растениях Arabidopsis thaliana расы Dijon и мутанта nfz24 II Материалы XV Межд. Конф. и Диск. Науч. Клуба Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, Украина, Крым, Ялта-Гурзуф 2007, стр.43

6. Ezhova T.A., Soldatova O.P., Apchelimov A.A., Novokreshchenova M.G., Grim В., Shestakov S.V. Identification and analysis of A.thaliana genes involved in control of resistance to herbicides inhibiting biophysics of photosynthesis // Intracellular signaling and gene regulation in plants, Minsk, Belarus, 2007, p.35

7. Новокрещенова М.Г. Анализ генов-претендентов на роль гена NFZ24 с

116 помощью компьютерных баз данных // Тезисы докладов XV Межд. Конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2008», стр. 73-74

8. Новокрещенова М.Г., Солдатова О.П., Волкова JI.A., Бургутин А.Б., Ежова Т.А., Роль гена NFZ24 Arabidopsis thaliana в контроле ответа на холодовой стресс // Экологическая генетика 2008, Т VI, N 1, стр. 20-26

9. Novokreshchenova M.G. The Arabidopsis nfz24 Mutant Responses to Cold Treatment // Genetics - Understanding Living Systems, Berlin, Germany, 2008. Abstract Book, p. 187.

Заключение.

В данной работе проведен анализ чувствительности мутанта nfz24 к гипотермии на самых ранних этапах морфогенеза (прорастание семени) и исследована чувствительность мутанта к еще одному типу стресса — высокой интенсивности света. Молекулярно-генетический анализ ответа на эти стрессовые факторы подтвердил полученные ранее данные об активации у мутанта систем антиоксидантного ответа, которые обеспечивают повышенную устойчивость к яркому свету и кратковременному действию индукторов окислительного стресса.

Обнаруженный в данной работе феномен повышенной устойчивости к яркому свету у мутанта со сниженным до 30% содержанием каротиноидов является неожиданным, поскольку именно каротиноиды защищают хлоропласты от фотоокисления, забирая энергию с молекулы хлорофилла и выделяя тепло в окружающую среду. По-видимому, повышение активности антиоксидантных систем у мутанта является компенсацией снижения активности каротиноидной системы защиты, достаточной для защиты хлоропластов от фотоокисления.

В то же время активная работа антиоксидантных систем не способна компенсировать дефицит каротиноидов после воздействия на растения низких положительных температур. Очевидно, это связано с тем, что окислительный стресс не является главной причиной повреждения и гибели клеток при гипотермии. Из каротиноидов образуется стрессовый гормон - абсцизовая кислота, играющая ключевую роль в защите от гипотермии, заморозков и дегидратации (важнейшем компоненте низкотемпературных стрессов).

У мутантов со сниженным содержанием каротиноидов наблюдается пониженное содержание АБК. Хотя мы не проводили анализ содержания АБК в растениях, целый ряд экспериментальных данных свидетельствует о том, что наш мутант не является исключением из правила. Наиболее важными экспериментальными свидетельствами являются результаты анализа экспрессии гена АВА1, контролирующего синтез АБК, а также гена RAB18, экспрессия которого находится в филигранной зависимости от эндогенного и экзогенного уровня этого гормона (Lang et al., 1993, Parcy et al., 1997). Нарушение работы этих генов, которые участвуют в АБК-зависимом ответе на воздействие холода, позволяет сделать вывод о том, что каротиноиды и связанный с их содержанием полноценный АБК-зависимый холодовой ответ являются важнейшими молекулярно-генетическими механизмами защиты от гипотермии, действие которых другие пути (не связанные с АБК) восполнить не могут. Необходимо отметить также, что пониженный у мутанта исходный уровень пролина, который является важным компонентом защиты, от холода и дегидратации, также может быть связан со снижением содержания эндогенной АБК, поскольку гормон участвует в регуляции экспрессии генов биосинтеза этого осмопротектора (Savoure et al., 1997). Повышение в условиях гипотермии уровня пролина у мутанта предполагает включение холодом альтернативных путей метаболизма пролина, не зависящих от АБК (Hare et al., 1999; Verslues, Bray, 2006). Однако повышенный уровень пролина не может компенсировать недостаток каротиноидов и АБК, которые защищают хлоропласты и растения в условиях холодового стресса.

Проведенные исследования показывают многокомпонентность систем ответа на стрессовые факторы и серьезные различия функциональной роли компонентов стрессового ответа при защите растений от абиотических стрессовых воздействий разной природы. Неразрывная связь разных систем стрессового ответа свидетельствует о том, что полученные экспериментаторами изменения активности систем стрессового ответа в мутантных или трансгенных растениях должны сопровождаться комплексными исследованиями перекрестной устойчивости/чувствительности растений к разным стрессовым факторам. Решение о целесообразности использования измененных форм (и генов, вызывающих эти изменения) в практике должно приниматься в зависимости от конкретных условий произрастания и способов возделывания, с учетом удельного веса влияния разных факторов на конечную урожайность.

Изучение мутанта nfz24 позволило выявить новый ген, который играет важную роль в контроле устойчивости/чувствительности растений A.thaliana к абиотическим стрессовым факторам - холоду, яркому свету, гербицидам. Высокая чувствительность к холоду была продемонстрирована ранее для пигментных мутантов ячменя с фенотипом albina (alb-e16 и alb-f7) и xantha {xan-s46 и xan-b12), которые обладают низким (до 6% хлорофилла у мутанта хап-Ь12) или следовым уровнем содержания пигментов и аномальной структурой хлоропластов (Svensson et al., 2006). В отличие от мутантов ячменя, мутант nfz24 A. thaliana характеризуется нормальной жизнеспособностью и функционально способными (хотя и с изменениями структуры) хлоропластами. У мутанта не обнаружено нарушения транскрипции ключевых генов биосинтеза хлорофилла: СНЫ, CHLD, CHLH и CHL27. Некоторое изменение уровня транскрипции гена CHL27 у мутанта (понижение исходного уровня и повышение при воздействии НФ), по видимому, может быть не причиной, а следствием изменений в структуре хлоропластов, что согласуется с литературными данными (Bang et al., 2008). Очевидно, что мутанты подобные nfz24 являются более информативными для изучения роли разных компонентов клетки (например, каротиноидов) в функционировании систем защиты от холода.

По результатам проведенных исследований снижение содержания каротиноидов у мутанта не связано с нарушением их биосинтеза, о чем свидетельствует отсутствие качественных изменений спектра каротиноидов. Возможно, у мутанта снижен пул предшественников каротиноидов (например, нарушена работа генов, участвующих в синтезе ГГПФ) или затруднен процесс связывания каротиноидов с мембранами хлоропластов. Исследования не показали наличия мутаций в кодирующей части гена ГГПФ-синтазы GGPS2, который локализован в районе гена NFZ24, однако это не исключает наличие нарушений в его регуляции. Эти нарушения могут затрагивать регуляторные области гена (цис-элементы), которые в данной работе не исследовались, либо вышестоящие гены, регулирующие работу гена GGPS2 (о регуляторах экспрессии генов GGPS пока ничего не известно).

Молекулярно-генетическое картирование гена NFZ24 с использованием CAPS-маркеров позволило сузить район поиска гена и локализовать его в пределах ВАС-клонов F27L4 и Т29Е15. Полученные результаты позволяют определить точное положение гена NFZ24 на физической карте, но недостаточны для его позиционного клонирования. Тем не менее, эти результаты дали возможность найти несколько кандидатных генов.

Для двух кандидатных генов с неизвестной пока функцией выявлено нарушение экспрессии в растениях мутанта. Поскольку уровень их экспрессии в растениях мутанта снижен, можно предполагать, что эти гены являются мишенью гена NFZ24 (прямой или опосредованной другими генетическими компонентами). По результатам проведенных исследований генетическую схему ответа растений A.thaliana на холодовой стресс можно дополнить новыми компонентами - геном NFZ24 и двумя новыми генами с неисследованной функцией (рис. 45).

At2g24040 пролин каротиноиды

ABA J холодовой стресс. окислительный стресс антиоксидантные системы: PrxQ, CSD2

Рисунок 45. Гипотетическая схема развития ответа растений A.thaliana на холодовой стресс с учетом генов NFZ24, At2g24040 и At2g23670.

В ходе выполненной работы были получены сведения о нуклеотидных последовательностях нескольких участков ДНК расы Dijon-M, которые были отправлены в GenBank. Информация о CAPS маркерах MSUCAPS-COP и MSUCAPS-GGPS2, выявляющих полиморфизм между расами Dijon-M и Colambia-M, отправлена в базу данных TAIR.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новокрещенова, Мария Габриэловна, Москва

1. Волкова Л. А., Бургутин А.Б., Солдатова О .П., Ежова Т.А., Лапшин П.В. Влияние параквата и гипотермии на устойчивые к норфлуразону мутанты Arabidopsis thaliana и полученные из них клеточные культуры // Физиология растений. 2005, 52 (3): 421-429.

2. Гольдфельд М.Г., Карапетян Н.В. Физико-химические основы действия гербицидов // Итоги науки и техники. Сер. биол. химия. М.: ВИНИТИ, 1989. Т. 30. 162.

3. Гриф В.Г. О возможности синтеза нуклеиновых кислот и белка при низких температурах // Цитология, 1966 Т.8, N5. С 659-661.

4. Ежова Т.А., Солдатова О.П., Маманова Л.Б., Мусин С.М., Гримм В., Шестаков С.В. Коллекция мутантов Arabidopsis thaliana с измененной чувствительностью к индукторам окислительного стресса // Известия РАН. 2001.№ 56: 533-543.

5. Ежова Т.А., Лебедева О.В., Огаркова О.А. и др. Arabidopsis thaliana — модельный объект генетики растений //М.: МАКС Пресс, 2003. 219 с.

6. Ежова Т.А., Ондар У.Н., Солдатова О.П., Маманова Л.Б. Генетическое и физиологическое изучение карликовых мутантов Arabidopsis thaliana (L) Heynh // Онтогенез. 1997a. T.28. № 5. С. 344-351.

7. Касперска-Палач А. Механизм закаливания травяных растений // Холодостойкость растений. М.: Колос, 1983 с 112-123.

8. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т.46. С. 321-336.

9. Куценко С.А. Основы токсикологии // Санкт-Петербург, 2002.

10. Соросовский образовательный журнал, 1989 N9 стр. 20-26

11. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микрскопии в биологии и медицине // С-Петербург «Наука» 1994, с.399.

12. Новокрещенова М.Г., Солдатова О.П., Ежова Т.А. Молекулярно-генетическое картирование и функциональный анализ гена NFZ24, контролирующего устойчивость растений Arabidopsis thaliana к стрессовым факторам // Бюллетень МОИП 2007, т.112, вып №1, с. 74 -80.

13. Пенин А.А. Анализ генетического контроля и моделирование развития структуры соцветия у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. М.: МАКС-Пресс, 2003. 24 с.

14. Пенин А. А., Будаев Р. А., Ежова Т. А. Взаимодействие гена BRACTEA с генами TERMINAL FLOWER1, LEAFY и APETALA1 при формировании соцветия и цветка у Arabidopsis thaliana II Генетика 2006, Т 43, № 3, с. 370376.

15. Родченко О.П. Адаптация корня к действию низких температур как показатель экологической устойчивости сорта // Условия среды и продуктивность растений. Иркутск 1985, с. 19-27.

16. Саляев Р.К., Кефели В.И. От редакторов // Пост и устойчивость растений. Новосибирск: Наука 1988, с. 144-154

17. Солдатова О.П., Ежова Т.А., Ондар У.Н., Гостимский С.А., Конрад У., Арцаенко О. Мутанты Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., толерантные к ингибитору биосинтеза каротиноидов норфлуразону // Генетика 1996, Т. 32. №7. с. 956-961.

18. Стржалка К., Костецка-Гугала А., Латовски Д. Каротиноиды растений и стрессовые воздействия окружающей среды: роль модуляции физических свойств мембран каротиноидами // Физиология растений 2003. Т. 50. №2, с.188-193.

19. Титов А.Ф., Акимова Т.В., Крупнова И.В. Формирование устойчивости в начальный период закаливания растений при действии ингибиторов белкового синтеза и цитокинина // Физиол. и биохим. культ, раст. 1992, Т 24, N 4, с. 367-372.

20. Юрина Н.П., Одинцова М.С. Сигнальные системы растений. Пластидные сигналы и их роль в экспрессии ядерных генов // Физиология растений 2007, Т 54, № 4, с. 485-498.

21. Янушкевич С.И. Использование арабидопсис в практических занятиях по общей генетике // М.: Издательство МГУ, 1985. с. 62.

22. Adams W.W., Demmig-Adams В., Rosintiel T.N., Brightwell А.К., Ebbert V. Photosinthesis and photoprotection in owerwintering plants // Planta Biology 2002, V. 4, pp. 545-557.

23. Allen G.J., Kuchitsu K., Chu S.P., Murata Y., Schroeder J.I. Arabidopsis abil-1 and abi2-l phosphatase mutations reduce abscisic acid-induced cytoplasmic calcium rises in guard cells // Plant Cell 1999 V. 11 (9) pp. 1785-98

24. Alscher R.G., Hess J.L. Antioxidants in Higher Plants // CRC Press 1993, Boca Raton, FL

25. Alscher R.G., Donahue J.L., Cramer C.L. Reactive oxygen species and antioxidants: relationships in green cells // Physiol Plant 1997, V. 100, pp. 224233.

26. Arango Y., Heise K.P. Localization of alpha-tocopherol synthesis in chromoplast envelope membranes of Capsicum annuum L. fruits // J Exp Bot 1998, V. 49, pp. 1259-1262.

27. Вакег S.S., Wilhelm K.S., Thomashow M.F. The 5'-region of Arabidopsis thaliana corl5a has cis-acting elements that confer cold-, drought- and ABA-regulated gene expression // Plant Mol Biol 1994, V. 24 (5) ,pp. 701-13.

28. Bates L.E., Waldren R.P., Teare J.D. Rapid determination of free proline for water stress studies // Plant and Soil. 1973, V. 39, p. 205-207.

29. Bartley C.E.,Scolnik P.A. Plant carotenoids: pigments for photoprotection, visual attraction, and human health // Plant Cell. 1995. V.7. P. 1027-1038

30. Bart J.B., Feys E.B., Penfold C.N., Turner J.G. Arabidopsis mutant selected for resist to the phutoxin coronative are male sterile, insensitive to metal jasmonate // Plant Cell 1994, V. 6, pp. 751-779.

31. Bartosz G. Oxidative stress in plants //Acta Physologiae Plantarum 1997, V. 19, pp. 47-64.

32. Bernier-Villamor L., Navarro E., Sevilla F., Lazaro J.-J. Cloning and characterization of a 2-Cys peroxiredoxin from Pisum sativum II J. Exp. Bot. 2004, V. 55, pp. 2191-2199.□

33. Bittner F., Oreb M., Mendel R.R. ABA3 is a molybdenum cofactor sulfurase required for activation of aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenase in Arabidopsis thaliana IIJ Biol Chem 2001, V. 276 (44), pp. 40381-4.

34. В oyer J.S. Plant productivity and environment // Science 1982, V. 218, pp. 443448.

35. Bowler C., Van Montagu M., Inze' D. Superoxide dismutase and stress tolerance // Annu Rev Plant Physiol Mol Biol 1992, V. 43, pp. 83-116.

36. Bray E.A. Plant responses to water deficit // Trends Plant Sci. 1997, V. 2, pp. 4854.

37. Bunkelmann J.R., Trelease R.N. Ascorbate peroxidase. A prominent membrane protein in oilseed glyoxysomes // Plant Physiol. 1996, V. 110 (2), pp. 589-98.

38. Chamovits D., Pecker I., Sandmann G., Boger P., Hirschberg J. Cloning a gene coding for norplurason resistance in Cyanobacteria II Z. Naturforach. 1990, V. 45, pp.482-486.

39. Chen H.H., Li P.H., Brenner M.L. Involvment of abscisic acid in potato cold acclimation // Plant Physiol. 1983, V. 71, N2, P. 362-365.

40. Chinnusamy, V., Ohta, M., Kanrar, S., Lee, B.H., Hong, X., Agarwal, M., and Zhu, J.-K. (2003). ICE1: A regulator of cold-induced tran- scriptome and freezing tolerance in Arabidopsis. Genes Dev. 17: 1043-1054.

41. Cohen Z., Heimer Y. Delta6 Desaturase Inhibition: A Novel Mode of Action of Norflurazone // Plant Physiol 1990, V. 93 (1), pp. 347-349.

42. Dietz, K.-J. Plant peroxiredoxins. Annu. Rev. Plant Biol. (2003) 54, 93-107.

43. Dietz, K.-J., Jacob, S., Oelze, M.-L., Laxa, M., Tognetti, V., de Miranda, S. M., Baier, M. and Finkemeier, I. The function of peroxiredoxins in plant organelle redox metabolism. J. Exp. Bot. (2006) 57, 1697-1709.

44. Dixon R.A., Paiva N. Stress-inducted phenylpropanoid metabolism // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 1085-1097.

45. Edge R., McGarvey D.J., Truscott T.G. The Carotenoids as Antioxidants a Review// Photochem. Photobiol. Ser. Biol. 1997 V. 41, pp. 189-200.

46. Ensminger I., Bucsh F., Huner N.P.A. Photosintasis and cold acclimation: sensing Low temperature through photosintesis // Physiologia Plantarum 2006, V. 126, pp. 28-44.

47. Finkelstein R., Rock C. Abscisic acid biosynthesis and response. In EM Meyerowitz, CR Somerville, eds, Arabidopsis, Ed 2 // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2002, pp. 52.

48. Fowler S., Thomashow M.F. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway // Plant Cell 2002, V. 14, pp. 1675-90.

49. Fraser P.D., Linden H., Sandmann G. Purification and reactivcation of recombinant Synechococcus phytoene desaturase from an overexpressing strain of Echerichia coli II Biochem J. 1993, V.l, № 291 (Pt 3). pp.687-692.

50. Giacomelli L., Rudella A., van Wijk K.J. High light response of the thylakoid proteome in Arabidopsis thaliana wild type and the ascorbate deficient mutant vtc2-2; a comparative proteomics study. Plant Physiology 2006, Vol. 14,1 pp. 685701.

51. Gilmour S.J., Lin C.T., Thomashow M.F. Purification and properties of Arabidopsis thaliana COR (cold-regulated) gene polypeptides COR15AM and COR6.6 expressed in Escherichia coli II Plant Physiology 1996, V 111, N 1, pp. 293-299.

52. Gilmor S.J., Thomashow M.F. Cold acclimation and cold-regulated gene expression in ABA mutants Arabidopsis thaliana II Plant and Mol.Biol. 1991, V. 17, N 1,P 1233-1240.

53. Gilmour SJ. Low temperature regulation of Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression // Plant J. 1998, 16, 433-442.

54. Goksoyr J. Evolution of eukaryotic cells //Nature 1967, V. 214, pp. 1161.

55. Goh C.H., Nam H.G., Park Y.S. Stress memory in plants: a negative regulation of stromatal response and transient induction of rd22 gene to light in abscisic acid-entrained Arabidopsis plants // Plant J. 2003, V. 36, pp. 240-55.

56. Grimm B. Novel insights in the control of tetrapyrrole metabolism of higer plants // Current opinion in Plant Biology 1998, V. 1, pp. 245-250.

57. Grenier G., Tremolieres A., Therrien H.P., Willemot C. Chengements dan les lipides de la luzerne en conditions menant a l'endurcissement au froid. // Can. J. Bot. 1972, V. 25, N4, p 741-756.

58. Grenier G., Willemot C. Lipid changes in roots of frost hardy and less hardy alfalfa varieties under hardening conditions // Cryobiology 1974, V 11, N 4, p 324-331.

59. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.-K., Bohnert HJ. Plant cellular and molecular responses to high salinity // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000, V 51, pp. 463-499.

60. Havaux M., Eymery F., Porfirova S., Rey P., Dormann P. Vitamin E Protects against Photoinhibition and Photooxidative Stress in Arabidopsis thaliana II Plant Cell. 2005, V 17(12), pp. 3451-3469.

61. Heino P., Sandman G., Lang V. Abscisic acid deficiency prevents development of freezing tolerance in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Theor. and Appl. Genet. 1990, V. 79, pp. 801-806.

62. Hirai N., Yoshida R., Todoroki Y., Ohigashi H. Biosynthesis of abscisic acid by the non-mevalonate pathway in plants, and by the mevalonate pathway in fungi // Biosci Biotechnol Biochem 2000, V. 64 (7), pp. 1448-58.

63. Hofmann В., Hecht H. J., Flohe L. Peroxiredoxins // J. Biol. Chem. 2002 383, 347-364□

64. Huner N.P.A., OOquish G., Hurry V.M., Krol M., Falk S., Griffit M. Photosinthesis, photoinhibition and low temperature acclimation in cold tolerant plants // Photosinthetic Research 1993, V. 37, pp. 19-39.

65. Kasperska-Palacz A., Wcislinska B. Electrophoretic pattern of soluble proteins in the rape leaves in relation to frost hardiness // Physiol, veget., 1972a, V 10, N 1, p 19-25.

66. Kasperska-Palacz A., Wcislinska B. The effect of CCC on the nitrogen compounds content in rape plants and their frost hardiness. Relation to the conditions of day length and temperature // Biol, plant 19726, V 14, N 1, pp. 39 -47.

67. Kasuga M. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress- inducible transcription factor // Nat. Biotechnol. 1999, V. 17, pp. 287-291.

68. Kliebenstein D.J., Monde R.A., Last R.L. Superoxide dismutase in Arabidopsis: An eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization // Plant Physiol 1998, V 118, pp. 637-650.

69. Knight H., Veale E.L., Warren G.J., Knight M.R. The sfr6 mutation in Arabidopsis suppresses low-temperature induction of genes dependent on the CRT/DRE sequence motif// Plant Cell 1999, V. 11, pp. 875-886.

70. Koornneef M., Stam P. Procedure for mapping by using F2 and F3 population // Arabidopsis Inf. Serv. 1987, V. 25, pp. 35-40.

71. Konig J., Lotte K., Plessow R., Brockhinke A., Baier M., Dietz K.-J. Reaction mechanism of plant 2-Cys peroxiredoxin: role of the C-terminus and the quaternary structure // J. Biol. Chem. 2003, V. 278, pp. 24409-24420.□

72. Kreps J.A., Wu Y., Chang H.S., Zhu Т., Wang X., Harper J.F. Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress // Plant Physiol. 2002, V 130, pp. 2129-2141.

73. Kruk J., Strzalka K. Occurrence and function of alpha-tocopherol quinone in plants // J Plant Physiol 1995, V. 145, pp.405-409.

74. Lang V., Palva E.T. The expression of a rab-related gene, rabl8, is induced by abscisic acid during the cold acclimation process of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Plant Mol. Biol. 1992, V. 20 (5), pp. 951-62.

75. Lang V., Palva E.T. The expression of a rab-related gene, rab 18, is induced by abscisic acid during the cold acclimation process of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Plant Mol. Biol. 1993, V. 21 (3), pp. 581-2.

76. Laxa M., Konig J., Dietz K.J., Kandlbinder A. Role of the cysteine residues in Arabidopsis thaliana cyclophilin CYP20-3 in peptidyl-prolyl cis-trans isomerase and redox-related functions // Biochem J. 2007, V 401(Pt 1), pp. 287-297.

77. Li Z., Hayashimoto A., Murai N. A sulfonylyrea herbicide resistance gene from Arabidopsis thaliana as a new selectable marker for production of fertil transgenic rice plants // Plant Phisiol. 1992, V 100, pp 662-668.

78. Lichtenthaler H., Wellburn A.R. Determinations of total carotenoids and chlorophyll a and b of leaf extracts in different solvents // Biochemical Society Transactions 1983, V. 603, pp. 591-592.

79. Marone M., Mozzetti S., De Ritis D., Pierelli L., Scambia G. Semiquantitative RT-PCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sample // Biological procedures online 2001, V. 3 (1), pp. 19-25.

80. McClung C.R. Regulation of catalases in Arabidopsis II Free Radi .Biol. Med. 1997, V 23, pp. 489-496.

81. Mehdy M.C. Active oxigen species in plant defense against pathogens // Plant Phisiol. 1994, V 105, pp. 467-472.

82. Miller E., Schreier P., Stadies on flavonol degradation by peroxidase (donor H202-oxidoreductase, EC 1.11.1.7) // Food Chem. 1985, V 17, pp 143-154.

83. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Van Breusegem F. Reactive oxygen gene network of plants // TRENDS in Plant Science 2004, Vol. 9, No. 10.

84. Muller P., Li X.P., Niyogi K.K. Non-photochemical quenching: a response to excess light energy // Plant Physiol. 2001, V. 125, pp. 1558-66.

85. Ndong C., Danyluk J., Huner N.P.A., Sarhan F. Survey of gene expression in winter rye during changes in growth temperature, irradiance or excitation pressure // Plant Mol. Biol. 2001, V. 45, pp. 691-703.

86. Nordin K., Heino P., Palva E.T. Separate signal pathways regulate the expression of a low-temperature-induced gene in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Plant Mol. Biol. 1991, V. 16 (6), pp. 1061-71.

87. Ostergaard L., Pedersen A.G., Jesperen H.M., Brunak S., Welinder K.G. Computation analyses and annotation of the Arabidopsis peroxidase gene family // FEBS Lett. 1998, V 14, N 433(1-2), pp 98-102.

88. Parcy F., Giraudat J. Interactions between the ABII and the ectopically expressed ABI3 genes in controlling abscisic acid responses in Arabidopsis vegetative tissues // Plant J 1997, V. 11 (4), pp. 693-702.

89. Pecker I., Chamovitz D., Mann V. Molecular characterization of carotinoid biosinthesis in plants the phytoene desaturase gene in tomato // Res. in photosynthesis 1992, V 3, p 11-18.

90. Rapacz M. The after-effects of temperature and irradiance during early growth of winter oilseed rape (Brassica napus L.) seedlings on the progress of their cold acclimation //Acta Physiologiae Plantarum 1998, V. 20, pp. 73-78.

91. Rey P., Cuine S., Eymery F, Garin J., Court M., Jacquot J.P., Rouhier N., Broin M. Analysis of the proteins targeted by CDSP32, a plastidic thioredoxin participating in oxidative stress responses // Plant J 2005, V. 41 (1), pp. 31-42.

92. Reyes-Diaz M., Ulloa N., Zuniga-Feest A., Gutierrez A., Gidekel M., Alberdi M., Corcuera L.J., Bravo L.A. Arabidopsis thaliana avoids freezing by supercooling // J. Exp. Bot. 2006, V. 57 (14), pp. 3687-96.

93. Rook F., Corke F., Card R., Munz G., Smith C., Bevan M.W. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signaling // Plant J 2001, V. 26, pp 421^433.

94. Rorat Т., Irzykowski W., Grygorowicz W.J. Identification and expression of novel cold induced genes in potato {Solanum sogarandinum) II Plant Sience 1997, V 124, N 1, pp. 69-78.

95. Savoure, Hua A., Bertauche X.J., van Montagu N., Verbruggen N. Abscisic acid-independent and abscisic aciddependent regulation of proline biosynthesis following cold and osmotic stresses. // Mol Gen Genet 1997, V. 254, pp. 104-109.

96. Scandalios J.G., Response of plant antioxidant defense genes to environmental stress //Adv. Genet.1990, V28, p 1-41.

97. Scheier P., Miller E. Studies on flavonol degradation by peroxidase (donor: H202-oxidoreductase, EC 1.11.1.7)//Food Chem. 1985, V 18, pp. 301-317.

98. Schwartz S.H., Leon-Kloosterziel K.M., Koornneef M., Zeevaart J.A.D. Biochemical characterization of the aba2 and aba3 mutants in Arabidopsis thaliana//Plant Physiol 1997, V. 114, pp. 161-166.

99. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Gene Expression and Signal Transduction in Water-Stress Response // Plant Physiol. 1997, V. 115, 327-334.

100. Shirley B.W. Flavonoid biosynthesis: "new1 functions for an 'old' pathway // Trends Plant Sci. 1996, V. l,pp.377-82.

101. Smolenska G., Kuiper P.J. Effect of low temperature upon lipid and fatty acid composition of roots and leaves of winterrape plants // Phisiol. Plant. 1977, V. 41, N l,pp. 29-35.

102. Soil J., Kemmerling M., Schultz G. Tocopherol and plastoquinone synthesis in spinach chloroplasts subtractions //Arch Biochem Biophys 1980, V. 204, pp. 544550.

103. Soil J., Schultz G., Joyard J., Douce R., Block M.A. Localisation and synthesis of prenylquinones in isolated outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts //Arch Biochem Biophys 1985, V. 238, pp.290-9.

104. Tanaka K. Gene structures and expression control of active oxygen scavenging ensymes in rice // In: Stress responses of photosynthetic organisms. Eds.: Satoh K., Murata N., Elsevire science, Amsterdam, 1998, pp 53-68.

105. Thomashow M.F. Arabidopsis tbaliana as a model for studying mechanisms of plant cold tolerance // Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1994, pp. 807-834.

106. Thomashow M.F. Annu Rev Plant Physiol // Plant Mol Biol 1999, V. 50, pp. 571-599.

107. Verslues P.E., Bray E.A. Role of abscisic acid (ABA) and Arabidopsis thaliana ABA-insensitive loci in low water potential-induced ABA and proline accumulation // J. Exp. Bot. 2005, V. 57 (1), pp. 201-12.

108. Willekens H., Langebartels С., Tire С., Van Montagu M., Inze D., Van Camp W. Diffrential expression of catalase genes in Nicotiana plurnbaginifolia (L) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, V. 91, pp. 10450-10454.

109. Willemot C. Stimulation of phospholipid biosinthesis during frost hardening of winter wheat // Plant Phisiol. 1975, V 55, N 2, pp. 356-359.

110. Welinder K., Gajhede. Structure and evolution of peroxidase // In: Plant peroxidase: biochemistry and physiology, 3 intern, symp. 1993, pp. 227-228.

111. Xin Z., Browse J. Eskimo 1 mutants of Arabidopsis are constitutively freezing-tolerant // Proc Natl Acad Sci USA 1998, V. 95 (13), pp. 7799-804.

112. Zhanguo Xin, Ajin Mandaokar, Junping Chen, Robert L Last, John Browse Arabidopsis ESK1 encodes a novel regulator of freezing tolerance // Plant J 2007, V. 49 (5), pp. 786-99.

113. Xiong L., Zhu J.K. Regulation of abscisic acid biosynthesis // Plant Physiol 2003, V. 133 (1), pp. 29-36.

114. Xiong L., Lee H., Ishitani M., Zhu J.K. Regulation of osmotic stress-responsive gene expression by the LOS6/ABA1 locus in Arabidopsis // J Biol Chem. 2002, V. 277, pp. 8588-8596 .

115. Yamasaki H., Sakihama Y., Ikehara N. Flavonoid-Peroxidase Reaction as a Detoxification Mechanism of Plant Cells against H202 // Plant Physiol 1997, V. 115 (4), pp. 1405-1412.

116. Yogesh K., Sharma T. Ozon-induced expression of stress-related genes in Arabidopsis thaliana II Plant Physiol. 1994, V. 39, pp. 439-531.

117. Zhang, H. The ethylene-, jasmonate-, absci- sic acid- and NaCl-responsive tomato transcription factor JERF1 modulates expression of GCC box-containing genes and salt tolerance in tobacco I I Planta 2004, V 220, pp. 262- 270.1. БЛАГОДАРНОСТИ.

118. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Т.А.Ежовой за неоценимую помощь и внимательное отношение на всех этапах выполнения работы.

119. Глубокую признательность заведующему кафедрой генетики МГУ академику РАН С.В. Шестакову за поддержку на всех этапах выполнения работы, В.М.Глазеру за помощь в работе над рукописью, а также всему коллективу кафедры генетики МГУ.

120. Искреннюю благодарность О.П.Солдатовой и другим сотрудникам лаборатории, от каждого из которых в любой момент можно было получить теоретическую и практическую помощь.

121. Профессору Б. Гримму (Humboldt University, Germany), а так же Л.А.Волковой и А.Б.Бургутину (ИФР) за помощь в выполнении биохимических и физиологических исследований.

122. Моей подруге, Куприяновой Евгении, за моральную поддержку и помощь на всех этапах выполнения работы. Моей маме и дочке Катеринке за предоставленную возможность учиться.

Информация о работе

Новокрещенова, Мария Габриэловна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Молекулярно-генетические механизмы ответа на абиотические стрессовые факторы у мутанта nfz24 Arabidopsis thaliana(L.) Heynh. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Молекулярно-генетические механизмы ответа на абиотические стрессовые факторы у мутанта nfz24 Arabidopsis thaliana(L.) Heynh. - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы