Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

Фурсова, Оксана Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh."

На правах рукописи

ООЭ4Б1187

Фурсова Оксана Васильевна

АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОМ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНА, КОНТРОЛИРУЮЩЕГО ОТВЕТ НА ХОЛОДОВОЙ СТРЕСС У АгаЫйорвк гИаИапа (Ъ.) НеупЬ.

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

1 2 ОЕВ 2229

Москва -2009

003461187

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Тарасов Валентин Алексеевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Игнатов Александр Николаевич

кандидат биологических наук Коростылева Татьяна Викторовна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

Защита состоитсяЛ^гч/^^МЗ^. 2009 г. в/^ часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д.З.

Автореферат разослан-^» г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Синелыцикова Татьяна Аркадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение функций генов у различных организмов до сих пор остаётся одной из наиболее важных и необходимых целей научных исследований. Анализ полученных данных может дать информацию и для сравнительной генетики и для глобального понимания процессов на всех уровнях развития. При изучении функций генов используются методы как прямой, так и обратной генетики. В случае использования подходов обратной генетики проводится отбор кандидатных генов по нуклеотидному составу, идентичности последовательностей их белковых продуктов, временному промежутку экспрессии и другим параметрам. Для определения функций генов высших растений основным является метод инсерционного мутагенеза. Основной задачей инсерционного мутагенеза является создание разных типов мутантов, с помощью которых можно наиболее полно охарактеризовать гены и процессы, функция которых каким-либо образом изменена.

Геном растений, и геном А. ЛаНапа в частности, содержит большое число межгенных участков, при попадании в которые инсерция не затрагивает участки, значимые для транскрипции генов. На основании этого факта можно анализировать трансгенные растения с повышенной конститутивной экспрессией и трансгенные растения с РНК-направленным «замолканием» конкретных генов, при встраивании инсерции в данные участки. После завершения в 2000 году глобального проекта по определению нуклеотидной последовательности генома Лгаб/с/о/ию ЛаИапа, при помощи компьютерных программ иг .чШсо было определено множество рамок считывания, предсказаны гены, их структура и функции. Но, несмотря на проделанную биоинформатическую работу, этап экспериментальной проверки полученных данных до сих пор не закончен. Таким образом, экспериментальный анализ структурно-функциональной организации генов, и в частности, поиск и идентификация генов растений, вовлеченных в регуляцию ответа на биотические и абиотические стрессы, на данный момент является актуальной задачей.

В связи с необходимостью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, устойчивость к холодовому стрессу у растений становится одной важнейших задач для генетики и функциональной геномики растений. Ранее были изучены и локализованы гены, такие как 1СЕ1, ЕБК1 и другие, которые участвуют в регуляции ответа на холодовой стресс. Однако повышенная экспрессия этих генов не приводит сохранению жизнеспособности растений при сильных заморозках. Таким образом, остается актуальной задача идентификации новых генов, участвующих в ответе на холодовой стресс и обеспечивающих морозоустойчивость растений.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключается в исследовании структурной организации и функциональной значимости гена А1^12860А. ЛаИапа.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Проведение т .чШсо анализа данных о структуре, экспрессии и функциях генауШ#;2Ш.

2. Клонирование полноразмерной копии гена А1^12860. Создание векторов для трансформации растений, несущих конструкции как для повышенной конститутивной экспрессии гена А1^12860, так и для РНК-направленного «замолкания » этого гена.

3. Получение трансгенных растений, характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией гена А1^12860 и мутантов с РНК-направленным «замолканием » этого гена.

4. Поиск фенотипических отличий между полученными инсерционными мутантами и растениями дикого типа А. ЛаНапа. Анализ первичной структуры транскриптов и определение функциональной значимости гена А1^12860 в процессе развития растений А. гкаНапа.

Научная новизна. Создана и охарактеризована с помощью методов классической генетики и молекулярно-генетического анализа коллекция трансгенных линий для анализа структуры и функции гена А1^12860. Трансгенные

линии являются уникальными на данный момент и представляют ценный материал для дальнейшего исследования in vivo изменения транскриптома растительного организма, устойчивого к холодовому стрессу и установления механизма, обуславливающего эту устойчивость. Впервые выявлена взаимосвязь регуляции экспрессии генов A. thaliana AtlgI2860, Aí5g61270 и CBFI семейства транскрипционных факторов типа bHLH.

Практическая значимость работы. С практической точки зрения создание растений, устойчивых к стрессовым факторам, является одной из важнейших задач биотехнологии растений, приобретающей все большую актуальность в условиях глобальных климатических изменений, усиления фитопатогенной опасности и растущего загрязнения окружающей среды. Нами охарактеризованы гены (ICE2, CBF1), непосредственно участвующие в регуляции экспрессии каскада генов, отвечающих за устойчивость к пониженной температуре и имеющие ортологов как у двудольных, так и у однодольных растений. Полученные данные можно использовать для модификации ценных сельскохозяйственных сортов с целью изменения их способности к адаптации в условиях температурных скачков.

Еще одна проблема, стоящая перед биотехнологией растений сегодня, связана с созданием трансгенных линий, являющихся продуцентами новых антимикробных и антигрибковых лекарственных препаратов для борьбы с болезнями человека и животных. Учитывая тот факт, что в белковом продукте локуса AtJgJ2860 был предсказан домен, свойственный антимикробным пептидам, полученная трансгенная линия с повышенной конститутивной экспрессией данного гена может быть использована для дальнейших исследований иммунитета высших растений.

Апробация результатов работы. Основные положения и результаты работы были представлены на международных конференциях: «EuroPhosphatases 2003», June 29 - July 3, 2003, Barcelona, Spain; «ABC Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Disease», Innsbruck, Austria, March 4-10, 2006; "New Information Technologies in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology"», May 31 - June 9, 2006, Crimea, Gurzuf, Ukraine; "Genetics in Russia and in a World"», June 28 - July 2,

2006, N1 Vavilov Institute of General Genetics, Moscow, Russia; «International Scientific Conference "Genetics in Russia and in a World"», June 28 - July 2, 2006, N1 Vavilov Institute of General Genetics, Moscow, Russia; "Microarray & Genosensor Techniques in Biomedical Applications", September 22 - 30, 2006, Prague, Czech Republic; "Bridging the Gap Between Gene Expression and Biological Function", 11-14 October, 2006, Luxembourg; "New concepts in lipidology: from lipidomics to disease", October 21 - 25, 2006, Congress Center 'Leeuwenhorst', Noordwijkerhout, The Netherlands; "Biovariety and Genofounds Dinamics", 1-3 November, Moscow, Russia; "Plant Transformation Technologies", February 4-7, 2007, Vienna, Austria; Fourth Moscow International Congress "BIOTECHNOLOGY: State of the Art and Prospects of Development". March 12-16, 2007, Moscow, Russia; "Biophysics of Membrane-Active Peptides", April 1 - 4, 2007, Lisbon, Portugal.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов исследования, Результатов и обсуждения, Заключения, а также Выводов, Приложений и Списка литературы. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, включая 41 таблицу, 76 рисунков и 5 схем. Список цитируемых литературных источников включает 162 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В главе приведены перечни использованных в работе плазмид (pGEM-7Zf(-), pGEM-T Easy, pET19b(+), pKANNIBAL, pMLBart, pART7, pBluescript II) и бактериальных штаммов Escherichia coli (JM 109, JM 110, XL 1 Blue, DH5a) и Agrobacterium tumefaciens (GV3101, C58), любезно предоставленных коллегами из российских и лабораторий, перечень использованных антибиотиков и гербицидов (Тс, Gtn, Km, Hg, Cm, Am, Cb, Rif, Spm, Баста), линий растений (A. thaliana Columbia-0) а также сред для культивирования Е. coli, A. tumefaciens и A. thaliana, составы использованных буферов.

Описаны методы выделения и очистки ДНК и РНК из бактерий (трубчатый электрофорез, хроматография и др.) (три метода) и растений (четыре метода), а также методы получения компетентных клеток Е. coli (три метода) и A. tumefaciens (три метода) и по три варианта методов трансформации. Уделено внимание разделам, посвященным культивации, трансформации и отбору трансгенных растений A. thaliana in vitro и in vivo. Подробно описаны этапы, необходимые для проведения блот-гибридизации по Саузерну (Остерман, 1983; Маниатис 1984; в модификации) и секвенирования ДНК по Сэнгеру (Sanger and Coulson, 1975).

Приведены условия для проведения синтеза кДНК, а также получения ESTs и полноразмерной кДНК; методы измерения количества транскриптов с помощью полуколичественного анализа и ПЦР в реальном времени. Описан метод количественного определения липидного и углеводного состава семян A. thaliana при помощи ядерного магнитного резонанса.

Результаты и обсуждения.

Предпосылкой и обоснованием данной работы явилось создание мутантной линии A. thaliana №137 в лаборатории изменчивости генома института общей генетики им Н.И.Вавилова (ИОГен РАН) в конце 90-х годов. Данная линия находится в составе коллекции мутантов, полученных с помощью метода агробактериальной трансформации плазмидным вектором pLD3. Мутантный фенотип линии A. thaliana №137 определяется нарушениями развития семядолей прорастающих семян, а именно образованием некрозов (Рис. 1). При помощи косегрегационного анализа было показано, что мутантный фенотип детерминируется инсерцией в локусе F13K23.12 первой хромосомы A. thaliana, фрагмент которой был клонирован в составе ВАС клона F13K23 (содержит 74328 п.н. геномной ДНК A. thaliana). Участок геномной ДНК мутанта (81 п.н.), примыкающий к левому бордеру Т-ДНК инсерции, секвенировали и показали, что ген, содержащий инсерцию представлен одним экзоном, содержащим консервативный домен F-бокс.

Рисунок /. Растения трансгенной линии A. thaViana Na137 с некротическими участками

па семядолях.

Анализ экспрессии гена Atlgl2860

Для анализа экспрессии гена Atlgl2860 проведен поиск в базе данных сервера RIKEN, являющегося одним из самых представительных по количеству экспериментально установленных последовательностей мРНК генов различных организмов. Полноразмерная мРНК гена Atlgl2860 зарегистрирована в 2002 году, но не содержит последовательности первого экзона данного гена (GenBank ID: АК118011). Это объясняется либо возможным наличием нескольких изоформ транскрипта исследуемого гена Atlgl2860, образующихся в ходе альтернативного сплайсинга, либо отсутствием экспрессии первого экзона, и ранее обозначенный ген F13K23.13 является независимо функционирующим от первого экзона (http://rarpe.gsc.riken.ip).

Нами проведено экспериментальное сравнение экспрессии первой и второй частей гена Atlgl2860 с помощью метода обратной транскрипции с матричных РНК. Данным методом в растениях дикого типа A. thaliana. экспрессия первого экзона не была выявлена, тогда как наличие экспрессии со второго экзона гена Atlgl2860 было показано.

Проведенный нами in silico анализ промоторных участков гена Atlgl2860 A. thaliana в доступных базах данных с помощью программы GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html) выявил два промотора, при этом промотор перед вторым экзоном гена Allgl2860 был идентифицирован только с привлечением базы промоторных последовательностей кукурузы, т.о. выявленная промоторная последовательность охарактеризована только для Zea mais (Рис. 2).

I. с

1'2

окз»п

►V 'к''

экзон о кзон окзон жми

----- г*-> Гч> \

-и" V V-

2 3 4 5

-•',,11 -К"?/»!! ~Л!."ИЧ I ') к'

Рисунок 2. Структурная организация гена Л1^12860 А. 1ИаНапа. Р1, Р2 - промоторы; Т- терминатор

По данным базы ОЕЫЕ\'Е5ТЮАТ(Ж, полученным с использованием технологии "Мкгоаггау", нами были построены сравнительные диаграммы уровней экспрессии на разных стадиях развития растения изучаемого нами гена А1^128б0 и уровней экспрессии конститутивно-экспрессирующегося гена «домашнего хозяйства» AtЗgl8780, кодирующего белок актин-2 (АсНп-2). Показано, что ген А1^12860 экспрессируется на разных стадиях развития растений А. ЛаНапа, а уровень транскрипции гена А1^12860 значительно ниже уровня транскрипции гена актина-2.

Поиск т $Шсо генов с высокой степенью соответствия гену /\tlgi286l).

Поскольку информация о предположительном белковом продукте гена А1^12860 А. МаНапа, характеризующегося наличием двух консервативных доменов, отсутствует, актуальной задачей явилось проведение т $Шсо анализа с целью сравнения нуклеотидной последовательности и соответствующей аминокислотной последовательности изучаемого гена с данными, представленными на сервере СепВапк. Кроме того, предпринят анализ литературных источников о генах, схожих по первичной структуре с геном А1^12860. Собрана также информация о функциях генов, нуклеотидные последовательности которых близки к последовательности изучаемого гена - для оценки предполагаемой функции тенаАг^12860.

Проведен поиск генов, проявляющих высокую степень соответствия последовательности гена А1^12860, среди размещенных в базе данных ББОВ (www.genome.jp). Выявлена высокая степень совпадения с предполагаемым белковым продуктом гена Ах1%12860 аминокислотной последовательности белка

0s08g0382800 (Oryza sativa). Данный белок состоит из 334 а.о., из которых 322 а.о. идентичны предсказанному белковому продукту гена At¡gl2860. Процент совпадения белка 0s08g0382800 с предполагаемым белковым продуктом гена Atlgl2860 (если транскрипция будет осуществляться с первого промотора) составляет 58%, и в другом случае, если транскрипция будет осуществляться со второго промотора - 83%. Следует отметить, что размер предсказанного белкового продукта гена Atlg¡2860 (если транскрипция будет осуществляться с первого промотора) составит 828 а.о., а экспериментально полученная кДНК кодирует белковый продукт, состоящий из 547 а.о. (GenBank ID: BG039379).

Среди всех генов A. thaliana выявили 588 генов, кодирующих белковые продукты с разной степенью совпадения по аминокислотной последовательности с белковым продуктом гена Atlgl2860. Для дальнейшего анализа провели выравнивание по нуклеотидной последовательности гена Atlgl2860 с тремя генами A. thaliana (.At3g26744, Atlgl3200 и Atlgl2870), имеющими >50% соответствия перекрывающихся участков с геном Atlgl2860: (Рис. 3).

ГЧШНННВЧ ■ — ШЯШ шт

лахшбо шш] ПШШ 11 О

■ШЛИ ■ I Я At3g26744

Atlgl3200

Рисунок 3. Схематическое изображение соответствия генов At3g26744, Atlgl3200, Atlgl2870 гену Atlgl2860. Серым цветом обозначена область, которая демонстрирует участок перекрывания со степенью соответствия >50% (п.н.)

Компьютерный анализ структуры продуктов генов Atlgl2860 и At3g26744 выявил идентичность доменов транскрипционного фактора семейства bHLH (DATF: http://datf.cbi.pku.edu.cn/index.php). Филогенетический анализ генов,

содержащих домен bHLH, показал, что гены At3g26744 (¡CEI) и Algl2860 относятся к одной подгруппе группы Е, в соответствии с классификацией транскрипционных факторов семейства bHLH предложенной Толедо-Ортиз в 2003 году.

По литературным данным, белок ICE 1 (Inducer of CBF Expression), кодируемый геном At3g26744, является регулятором ответа растений A. thaliana на холодовой стресс. Этот белок является транскрипционным активатором, специфически связывающимся с MYC-последовательностью промоторов генов CSF-группы. Показано, что в условиях холодовой акклиматизации при температуре 0°С экспрессия генов группы CBF стремительно возрастает, а при инактивации гена ICE1 уровень экспрессии гена CBF3 (At4g25480) не меняется, даже в условиях холодовой акклиматизации.

Показано, что экспрессирующаяся со второго промотора «вторая часть» гена Atlgl2860, содержащая 2-5 экзоны, имеет высокую степень соответствия гену ICE1, самостоятельно функционирующую вторую часть гена Atlgl2860 обозначили как ICE2.

На основании полученных данных о высокой степени соответствия транскрибирующейся второй части гена Atlgl2860 (ICE2) гену ICEI, являющемуся регулятором ответа на холодовой стресс у растений, возник вопрос о возможном участии гена ICE2 в регуляции клеточных процессов, связанных с акклиматизацией и Холодовым стрессом. Для ответа на данный вопрос была поставлена задача получения трансгенных линий A. thaliana с повышенной конститутивной экспрессией полноразмерной копии гена Atlgl2860 и трансгенных линий с повышенной конститутивной экспрессией отдельных частей (первой и второй) гена Atlgl2860, а также получения трансгенных линий характеризующихся РНК-направленным «замолканием» (PTGS) гена Atlgl2860. Использование метода получения трансгенных линий, характеризующихся РНК-направленным «замолканием» гена Atlgl2860 было необходимо для дополнительного контроля фенотипа трансгенной линии с повышенной конститутивной экспрессией гена

Л(^128б0, что связанно с особенностями феномена РНК-направленного «замолкания» генов.

Создание векторов для трансформации растений с целью определения структурно-функциональной организации гена А1^12860.

Т-области плазмид, содержащих конструкции для повышенной конститутивной экспрессии первой и второй частей гена А1^12860, а также его полноразмерной копии в растениях, представлены на рис.4 (А, В, С).

вектор: рРЕШбООЕ ОспВапк 10: 00995484

I1ЕРВАЯ ЧАСТЬ I ГИЛ ЛЧц12Ш) нрамотор

ПРАВЫЙ ________________________________________________________________________I ЛЕВЫЙ

БОРДЕР [_К_I 1 & БОРДЕР

Ы.ЩЦЫ.ЬШф» | 1 экзон _)ВШ&ф ВаЯ |

Т-ДНК (7022 п.н.)

Рисунок 4 А. Схема структуры Т-ДНК вектора для трансформации растений, содержащая конструкцию для конститутивной экспрессии первой части гена А1^12860

вектор: pLE128600E GenBank ID: DQ995485

NOS

вторая часть n-:i 1л .-и/цит промотор

ПРАВЫЙ I............. --~' 1 \ ЛЕВЫЙ

БОРДЕР ___> Б0РДЕР

ЧЩШВч 5 4 3 2 экзон ' BaR

; \m-N-~-1 " ;

Т-ДНК (7284 п.н.)

Рисунок 4 В. Схема структуры Т-ДНК вектора для трансформации растений, содержащая конструкцию для конститутивной экспрессии второй части гена Ailgl2860

ветор: pFC128600E

GenBank ID: DQ995487

ИО.ШОРЛЧМГ.ГНЛЯ КОПИЯ I 1.11Л ЛИ

ПРАВЫЙ БОРДЕР

ПРРМ0Т0Р ЛЕВЫЙ

Г L

1 экзон

л.

2 экзон 3 4 51

3 4 BaR

Т-ДНК (9217 п.н.)

Рисунок 4 С. Схема структуры Т-ДНК вектора для трансформации растений, содержащая конструкцию для конститутивной экспрессии полноразмерной копии гена Allgl2860

Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana.

Введение генетической информации, клонированной в составе плазмидных векторов, в клетки растений осуществляли с помощью трансформации неопыленных бутонов. После сбора семян с экспериментальных растений (Т0-поколение), весь пул полученных семян с каждой линии был высеян для отбора под воздействием селективного маркера на землю (опрыскивание гербицидом «Баста») и в песок (добавление гербицида «Баста» в воду для полива). Чтобы исключить дальнейшее действие агробактерий на растения семена с растений поколения Т1, отобранных по устойчивости к селективному маркеру, выдерживали в течение двух недель при температуре +37°С. Повторный анализ растений Т2-поколения проводили на устойчивость к гербициду «Баста» на почве, высевая собранные семена с каждого растения отдельно на индивидуальный сектор. Отобранные трансгенные растения, несущие инсерцию Т-ДНК каждого вектора, анализировали на расщепление по признаку устойчивости к селективному маркеру в поколении T2(F1). Показано, что в данном поколении происходит расщепление, соответствующее моногенному характеру наследования, в соотношении 3:1. Для дальнейшего анализа каждой созданной конструкции in vivo, были отобраны по три трансгенных линии с моногенным характером расщепления.

Повторно проверенные резистентные к гербициду «Баста» растительные линии прошли строгий отбор на проверку наличия инсерции (Т-ДНК

соответствующих векторов) и анализ количества инсерций, встроившихся в геном каждого растения.

Трансгенным линиям присвоены названия в соответствии с характеристиками внедренных в растения конструкций: 8ирег-1СЕ2 содержит полноразмерную копию гена А1^128б0, Т-ДНК из вектора рРС128600Е; Бирег-На1/1-1СЕ2 содержит первую часть гена, Т-ДНК из вектора рРЕ128600Е; 8ирег-На1/2-1СЕ2 содержит вторую часть гена А1^12860, Т-ДНК из вектора рЬЕ28600Е; БПепа^-На1/2-1СЕ2 содержит конструкцию для РНК-направленного «замолкания» гена (РТСБ), Т-ДНК из вектора рБЕШбОБ)

Анализ мРНК гена Л(1^1286П в трансгенных линиях с измененной экспрессией гена А(^12860.

Для сравнения уровней экспрессии гена А1^12860 (1СЕ2) в трансгенных линиях и в растениях дикого типа (Со1итЫа-0) использовали метод полуколичественного ПЦР, с последующим анализом точной количественной оценки уровня экспрессии с помощью ПЦР в реальном времени. Показано, что повышенная конститутивная экспрессия гена Аи^12860 в трансгенных линиях Бирег-Нау2-1СЕ2 превышала уровень его экспрессии в контрольных растениях дикого типа Со1итЫа-0 в 8,5 раз.

Характеристика мутантных фенотипов трансгенных линий А. ЛаИапа, характеризующихся измененной экспрессией гена Ай^12860.

Оценку фенотипов трансгенных растений Т2-поколения проводили в трех повторах в нескольких вариантах экспериментально созданных стрессовых условий: углеводный стресс (содержание в среде выращивания 3% сахарозы); солевой стресс (содержание в среде выращивания 50 тМ, 100 тМ или 200 тМ ЫаС1); гормональный стресс (присутствие в среде ауксинов (ИУК, БАП); брассиностероидов или цитокининов); гербицидный стресс (присутствие в среде выращивания пиклорам или тордон/хлорампа); температурный стресс (тепловой или холодовой). Все вышеперечисленные стрессы, кроме температурного, воздействовали на растения непрерывно, начиная со стадии прорастания семян

анализируемых растений, что обеспечивалось добавлением в питательную среду дополнительных ингредиентов. В экспериментах по температурному стрессу использовали 14-дневные проростки A. thaliana. Предварительно, до холодового стресса, проводили акклиматизацию растений в климатической камере (+4±1 °С в течение 4 суток; -1±1 °С в течение 16 ч; +4±1 °С - в течение 12 ч), и далее инкубировали чашки с растениями при температуре -20±1 °С в течение временных точек, предварительно подобранных для растений дикого типа (20, 60 и 80 мин). Показано, что отличия в развитии трансгенных линий A. thaliana и контрольных растений дикого типа были отмечены только в условиях экспериментального холодового стресса. В итоге, предварительно акклиматизированные растения трансгенных линий Super-Halß-ICE2 и Super-ICE2 проявляли повышенную устойчивость к холодовому стрессу (Рис. 5).

Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что ген AtIgI2860 кодирует как минимум один функциональный продукт, обеспечивающий устойчивость растений А. thaliana к холодовому стрессу на уровне регуляции. Этот продукт кодируется участком ДНК, расположенном в регионе со второго по пятый экзоны гена Atlgl2860, что подтверждено наличием устойчивости к холодовому стрессу только в трансгенных линиях Super-Half2-ICE2 и Super- -ICE2. При этом контрольные растения дикого типа и растения линий Super-Halfl-ICE2, Silencing-Half2-ICE2 не проявляли подобной устойчивости к холодовому стрессу (Табл. 1).

_»* • Silencing—Half2-ICE2 Трансгенные растения на основе вектора pSE12860S (1/1, 4/3, Ю/1) ^к--' * in'-it v W' & # * Super-Half 1-ICE2 Трансгенные растения на основе вектора pFE128600E (Т/4, V/3 ,W/3)

j j 1 ^ ч:;е У W* Super-Half2-ICE2 Трансгенные растения на основе вектора pLE128600E (М/3, 7/3, К/2) Г; /V .<• f а «а? уч Super-ICE2 Трансгенные растения на основе вектора pFCI28600E (0/1, R/1, 1/2)

Контрольные растения дикого типа расы Со1ишЫи-0

Рисунок 5. Результаты эксперимента по выживаемости акклиматизированных растений А. /ИаНапа после холодового стресса.

Таблица 1. Количественная оценка выживших (устойчивых) и не выживших (не устойчивых) акклиматизированных растений трансгенных линий и дикого типа после холодового стресса.

повтора Columbia0 Super-Half 1-ICE2 Super-Haljl-ICE2 Super-ICE2 Sailencing— Ha!f2-!CE2

уст. /не уст. °/<>уст. уст. /не уст. %уст. уст. /не \'ст. % уст. уст. /не vcm. % уст. уст. /не уст. % уст.

I 0/38 0 0/40 0 34/3 92 37/4 90 0/36 0

2 0/25 0 0/22 0 21/9 70 29/3 91 0/28 0

3 0/37 0 0/36 0 34/8 81 32/9 78 0/34 0

4 0/56 0 0/57 0 63/3 95 57/6 90 0/55 0

Среднее 0 0 87 88 0

Достоверность отличий Р<0.001

Так среди растений дикого типа (Columbia 0) и трансгенных линий Super-Halfl-ICE2; Silencing—Half2-ICE2 ни одно акклиматизированное растение не выжило после холодового стресса, в то время как -87% акклиматизированных трансгенных растений линий Super-Half2-ICE2 и Super-ICE2 проявили устойчивость и способность выживать после холодового стресса (Табл. 1).

Сравнение содержания липидов и углеводов в семенах трансгенпых растений по сравнению с растениями A. thaliana дикого типа.

Проведено сравнение фенотипов трансгенных растений и растений A. thaliana дикого типа на уровне оценки уровней содержания липидов и углеводов в семенах с помощью метода ядерного магнитного резонанса. Установлено, что семена трансгенных линий A. thaliana SuperHalf2-ICE2 и A. thaliana Super-ICE2 характеризовались повышенным содержанием липидов (на -10%), и пониженным содержанием углеводов (на -10%), по сравнению с контролем, тогда как семена трансгенной линии A. thaliana SuperHaIfI-ICE2 не отличались по своему углеводно-липидному содержанию от семян растений A. thaliana дикого типа (Рис. 6).

60 % 50 % 40 %

30 % Ii I Hfl В I KU ■ углеводы 20 % 'Ж I КШ ■ I ■ I ■! липиды

10 %

0 %

Co/0 SuperHain SuperHalß Super-IC:E2 ICE 2 ICE2

Рисунок 6. Содержание липидов и углеводов в семенах трансгенных линий А. thaliana (.SuperHalß-ICE2; SuperHalf2-ICE2; Super-ICE2) и растений А. Ihaliana дикого типа Columbia 0

Анализ экспрессии генов группы CBF в трансгенных линиях А. thaliana SuperHalf2-ICE2. Анализ первичной структуры транскриптов гена ICE2.

Анализ экспрессии генов группы CBF установил, что повышенная конститутивная экспрессия гена ICE2 в трансгенной линии А. thaliana SuperHa!f2-ICE2 приводит к увеличению уровня экспрессии гена CBF1, но не влияет на экспрессию гена СВЕЗ. (Рис. 7)

CBF1

CBF3

25 28 31 25 28 31

'' super-1 ' iupcr-' 1 super- ''

ColO ICE2 Col 0 ICE2 ColO ICE2

3 4 5 6

Рис. 7. Анализ экспрессии генов группы СВР в трансгенных линиях А. /ИаНапа 8ирегНа1)2-1СЕ2. А) Полуколичественный ПЦР-анализ экспрессии генов СВР1 и СВРЗ.

Б) контрольная реакция проверки исходного количества РНК и качества кДНК, проведенная с помощью амплификации фрагмента кДНК гена актина-2

Методом точной количественной оценки уровня экспрессии с помощью ПЦР в реальном времени было показано, что повышенная экспрессия гена ICE2 приводит к семикратному усилению транскрипции гена CBFI в сравнении с уровнем экспрессии этих генов в контрольных растениях A. thaliana дикого типа Со1-0.

Анализ первичной структуры транскриптов гена 1СЕ2 выявил в трансгенных линиях A. thaliana Super-ICE2 наличие экспрессии фрагмента, включающего в себя со второго по пятый экзоны, в то время как анализ сайта сплайсинга между первым и вторым экзонами этого гена показал отсутствие альтернативны транскрипции.

Важным дополнением к исследованию изменения уровня экспрессии генов в трансгенной линии A. thaliana SitperHalß-lCE2 явилось выявление повышенной экспрессии гена At5g61270 в трансгенных линиях с повышенной конститутивной

экспрессией гена ICE2. Так как при анализе сплайсирования мРНК гена ICE2

использовали общий пул мРНК и был выявлен фрагмент соответствующего размера (по молекулярной массе), экспрессия которого была обнаружена только в трансгенной линии, характеризующейся повышенной конститутивной экспрессией гена Atlgl2860, данный фрагмент был секвенирован и полученная нуклеогидная последовательность проанализирована. Установлено что трансгенная линия с повышенной конститутивной экспрессией гена AtIgI2860 отличается от растений А. thaliana дикого типа также повышенной экспрессией гена At5g612 70. Известно, что ген At5g61270 также относится к семейству транскрипционных факторов группы bHLH и представляет чрезвычайный интерес, поскольку именно в этом локусе идентифицирован дополнительный домен СОЕ, ранее не идентифицированный у растений. Особый интерес вызывает функция этого гена в растительном организме, так как у млекопитающих показано, что один из четырех транскрипционных факторов семейства СОЕ, а именно EBF2 (Early B-cell factor 2), участвует в развитии иммунной системы и в некоторых процессах метаболизма в

нейронах. Показано, что у млекопитающих белки СОЕ участвуют в «созревании» антимикробных пептидов семейства кателлицидины. Как все антимикробные пептиды кателлицидины участвуют в развитии механизмов защиты хозяина от патогенов. Кателлицидины синтезируются в костном мозге в виде препропептиды, запасаются в гранулах нейтрофилов в виде пропептидов, где «созревают» и, в виде зрелых пептидов выходят из нейтрофилов. На данный момент кателлицидины и белки СОЕ у растений не охарактеризованы.

5. Заключение.

На основании проделанной работы предоставляется возможным сформулировать следующие утверждения. Ген А1^12860 А. МаПста содержит две самостоятельные части: первую (первый экзон) - экспрессия которой не выявлена и вторую (со второго по пятый экзоны), экспрессия которой установлена в точном соответствии с данными, представленными в базе данных ТА1К. Возможно, что две части гена А(^12860 являются независимыми генами, что согласуется с данным, полученными ранее, когда две части гена А(^128б0 были обозначены как Р13К23.12 и Р13К23.13. Можно также предположить, что первая часть гена Atlg¡2860 является псевдогеном, на что указывает отсутствие данных по экспрессии первого экзона. Однако наличие мутантного фенотипа у трансгенной линии, несущей инсерцию в данной части гена А1^12860, ставит под сомнение данную гипотезу. Важно, что выявлено проявление аналогичного фенотипа, а именно формирование некрозов на семядолях на ранних стадиях развития растений, при повреждении первичной структуры гена А1^13200, характеризующегося высокой степенью соответствия с первой частью гена А1^12860. Важно, что информация по экспрессии гена А1^13200 на данный момент также отсутствует.

В ходе проделанной работы было показано, что вторая часть гена А1^12860 функционирует независимо от первой и успешно экспрессируется со второго промотора. Таким образом, можно утверждать, что данные по локусу А1^12860, обновленные в базе данных ТАЖ и СепВапк МСВ! в 2001 г. не соответствуют

реальной структуре данного гена, а предыдущая версия структурной организации этого локуса, до 2001 г., содержала достоверную информацию. Можно предположить, что второй промотор, расположенный в первом интроне гена Atlgl2860 не выявлялся, так как до сих пор не охарактеризован для растений А. thaliana, и был обнаружен нами только при поиске промоторной области, когда программа учитывала характеристики промоторных последовательностей кукурузы.

С целью выяснения структуры и функции гена Atlgl2860 нами были сконструированы специальные вектора для трансформации растений. Установлено, что полученные трансгенные линии А. thaliana, характеризующиеся повышенной конститутивной экспрессией гена AtlgJ2860, проявили устойчивостью к кратковременному (60 мин) замораживанию при -20°С.

При анализе липидно-углеводного состава семян трансгенных линий были выявлены различия по сравнению с контрольными растениями. С помощью метода ЯМР установлено, что в семенах трансгенных линий, характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией второй части гена Atlgl2860 (линии А. thaliana SuperHALF2-lCE2 и Snper-1CE2), содержание липидов было выше на -10%, чем в контрольных растениях А. thaliana дикого типа Со1-0. Уровень углеводов в семенах трансгенных растений, напротив, ниже, чем в растениях дикого типа на -10%. Таким образом можно утверждать, что повышенная конститутивная экспрессия гена Atlgl2860 приводит к изменению липидно-углеводного баланса в трансгенных линиях, по сравнению с контрольными растениями дикого типа.

На основании высокой степени соответствия экспрессирующейся со второго промотора «второй части» гена Atlgl2860 А. thaliana гену ICE1, данная часть гена Atlgl2860 обозначена нами как ICE2.

Таким образом, нами идентифицирован и охарактеризован ген 1СЕ2 А. thaliana, повышенная экспрессия которого в растениях обуславливает повышенную устойчивость трансгенных линий А. thaliana к холодовому стрессу

после акклиматизации. Более того, по сравнению с охарактеризованным ранее геном ICE1 - ген ICE2 обуславливает выживание акклиматизированных растений после глубокого замораживания при -20°С, тогда как для гена ICE1 было показано, что повышенная конститутивная экспрессия ICE1 после предварительной акклиматизации растений приводит к устойчивости при относительно низкой температуре -6°С.

Закономерно, что изменение экспрессии какого-либо транскрипционного фактора может приводить к изменению профиля транскриптома в трансгенных растениях. При анализе экспрессии генов группы CBF в трансгенных линиях с повышенной конститутивной экспрессией гена ICE2, было установлено, что в анализируемых растениях уровень экспрессии гена CBF3 одинаков, тогда как уровень экспрессии гена CBFI различается. Также было показано, что по сравнению с контрольными растениями А. thaliana дикого типа Со1-0, уровень экспрессии гена CBF1 в трансгенных линиях с повышенной конститутивной экспрессией гена ICE2 увеличен в семь раз.

Поскольку в гене Atlgl2860 обнаружен только один терминатор, была проанализирована возможность альтернативного «сплайсирования» транскриптов этого гена, а именно между первым и вторым экзонами гена Atlgl2860. Ни один вариант альтернативного сплайсинга обнаружен не был, но было выявлено, что в трансгенных растениях с повышенной конститутивной экспрессией гена ICE2, экспрессируется ранее не охарактеризованный ген At5g61270, который содержит домен СОЕ, до настоящего момента не охарактеризованный для растений, участвующему в «созревании» антимикробных пептидов семейства кателлицидины у млекопитающих.

Таким образом, можно утверждать, что транскрипционный фактор 1СЕ2 контролирует уровень транскрипции генов CBF1 и At5g6l270 и, является транскрипционным активатором, вовлеченным в регуляцию ответа на холодовой стресс (Рис.8).

Рисунок 8. Регуляторная IIспь, от момента воздействия сигнала холодового стресса до момента фенотгтического проявления признака холодоустойчивости

транскрипционный активатоп 1СЕ1 транскрипционный активатоп 1СЕ2

1 г г

транскрипционный фактор СВРЗ транскрипционный фактор СВР1

сигнальная трансдукция: группа СВР

активация с'15-элементов (СИТ: С/АСССАС)

экспрессия генов (СОК; протеазы: Я019,К021)

функция (устойчивость к холодовому стрессу)

Выводы

1. Установлено, что фрагмент гена Atlgl2860 А. thaliana, включающий в себя 2-5 экзоны и содержащий участок ДНК, кодирующий домен транскрипционного активатора по типу bHLH, выступает как самостоятельная функционально-полноценная единица.

2. Созданы трансгенные линии А. thaliana, характеризующиеся повышенной конститутивной экспрессией гена Atlgl2860, а также РНК-направленным «замолканием» гена Atlgl2860.

3. Проведенный фенотипический анализ показал, что трансгенные линии растений А. thaliana, геном которых содержит 2-5 экзоны гена Atlgl2860 или полноразмерную копию гена Atlgl2860, находящиеся под контролем конститутивного промотора 35S, обладают повышенной толерантностью к воздействию холодом.

4. Установлено, что повышенная толерантность к холодовому стрессу трансгенных линий А. thaliana связана с увеличением уровня экспрессии гена Atlgl2860, а не с РНК-направленным «замолканием» гена Atlgl2860.

5. Установлено, что ген Atlgl2860 (ICE2) осуществляет свою регуляторную функцию путем активации транскрипции гена группы CBF, а именно CBF1. Т.о. ген ICE2, является вторичным транскрипционным активатором, включенным в систему контроля ответа на абиотические стрессы у высших растений.

6. Впервые показано, что транскрипционная активность гена At5g6l270, продукт которого, в свою очередь, содержит домен транскрипционного фактора по типу bHLH, зависит от уровня экспрессии гена Atlgl2860.

Список опубликованных научных статей.

1. Фурсова О.В., Погорелко Г.В., Авсюк А.Ю., Томилова Н.Б., Томилов

A.А., Тарасов В.А., Огаркова О.А. Идентификация потенциального гена -регулятора развития семядолей у проростков Arabidopsis thaliana. Докл. Акад. Наук. 2004.-Т.395. №5.-С.1-3.

2. Погорелко Г.В., Фурсова О.В., Огаркова О.А., Тарасов В.А. Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений. Генетика. 2007.-Т.43, N2.-C. 194-202.

3. Огаркова О.А., Томилов А.А., Погорелко Г.В., Фурсова О.В., Тарасов

B.А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: коллекция морфологических инсерционных мутантов. Биотехнология овощеводства, цветоводства и культур злаковых. Москва 22-25 марта 2004 Г.-С.138-141.

4. Огаркова OA, Фурсова ОВ, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Тарасов ВА. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis thaliana: идентификация нового гена вовлеченного в контроль развития семядолей. Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур. Москва 22-25 марта 2004 г.-С. 142-145.

5. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. A new technique for activation tagging in Arabidopsis. Gene. 2008. V.414, №1-2, p.67-75.

6. Pogorelko GV and Fursova OV. A highly efficient miPCR method for isolating FSTs from transgenic Arabidopsis thaliana plants. Journal of Genetics. 2008. V. 87, № 2, p.133-140.

7. Погорелко ГВ, Фурсова OB, Огаркова OA, Тарасов ВА. Новый подход в изучении супер-экспрессирующих мутантов Arabidopsis thaliana. Материалы IV международной научной конференции «Экспериментальные факторы эволюции». Алушта. 2008.-Т.5,-С.425-430.

8. Фурсова ОВ, Погорелко ГВ, Огаркова OA, Тарасов ВА. Идентификация 2-х новых генов Arabidopsis thaliana, вовлеченных в контроль ответа растений на холодовой стресс. Материалы IV международной научной конференции «Экспериментальные факторы эволюции». Алушта. 2008.-Т.5,-С.448-450.

9. Fursova OV, Pogorelko GV, Tarasov VA. Identification of ICE2, a gene involved in cold acclimation which determines freezing tolerance in Arabidopsis thaliana. Gene. 2009. V.429, №1-2, p.98-103.

Список основных тезисов научных конференций.

Работа была представлена на 30 конференциях, в том числе:

1) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Investigation of Genes Controlling Protein Phosphorilation. «EuroPhosphatases 2003», June 29 - July 3, 2003, Barcelona, Spain

2) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Transgenic plants as the way to discover and validate novel genes and their functions in different organisms. «ABC Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Disease». Innsbruck, Austria, March 4-10, 2006

3) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Ubiquitin-dependent Proteolysis. «14th International Conference "New Information Technologies in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology"», May 31 - June 9, 2006, Crimea, Gurzuf, Ukraine

4) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Identification of the potential gene that controlling cotyledon development in Arabidopsis thaliana seedlings. «International Scientific Conference "Genetics in Russia and in a World"», June 28 -July 2, 2006, N1 Vavilov Institute of General Genetics, Moscow, Russia

5) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Creation and Analyzing of Collection of Gain-of-Function mutants of A.thaliana. Microarray & Genosensor Techniques in Biomedical Applications, September 22 - 30, 2006, Prague, Czech Republic

6) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. From the variety to the integrity. Studying genes functions of higher plants on model object Arabidopsis thaliana. Bridging the Gap Between Gene Expression and Biological Function, 11-14 October, 2006, Luxembourg

7) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Studying genes functions of higher plants on model object Arabidopsis thaliana. New concepts in lipidology: from lipidomics to disease, October 21 - 25, 2006, Congress Center 'Leeuwenhorst', Noordwijkerhout, The Netherlands

8) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Identification of Transcription Factors Involved in Regulation in the Cold. Plant Transformation Technologies. February 4-7, 2007, Vienna, Austria

9) Fursova OV, Pogorelko GV, Tomilova NB, Tomilov AA, Brouskin SA, Ogarkova OA, Tarasov VA. Creation of Transgenic Plants with Over-expression of Genes which Encode a Regulator of Cold-induced Transcriptome Improves Freezing Tolerance. Fourth Moscow International Congress "BIOTECHNOLOGY: State of the Art and Prospects of Development". March 12-16, 2007, Moscow, Russia.

10) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Influence of Cell Membrane Integrated Proteins to the Plant Development. Biophysics of Membrane-Active Peptides. Lisbon, Portugal, April 1 - 4, 2007

8. Регистрация в базах данных.

Наименование зарегистрированных последовательностей Описание GenBank Ш

Atlgl2860 2 EST мутантной линии A.thaliana ЕН643295

At5g61270 Arabidopsis thaliana O-line EST гена At5g61270A.thaliana ЕН669233

Atlgl2850 Arabidopsis thaliana X-line EST гена Atlgl2850 A. thaliana ЕН667252

E9 Partial cDNA EST гена At5gi0080 A.thaliana EL740208

PFC128600E Вектор для трансформации растений DQ995487

pFC128500E Вектор для трансформации растений DQ995486

PLE128600E Вектор для трансформации растений DQ995485

PFE128600E Вектор для трансформации растений DQ995484

P3UTR12850S Вектор для трансформации растений EF010980

PSE12860S Вектор для трансформации растений EF010979

PFE12860S Вектор для трансформации растений EF010978

Arabidopsis thaliana helicase-like (Atlg33390) mRNA, complete sequence Полноразмерная кДНК гена Atlg33390 EF630362

Подписано в печать 13.01.09 Формат 60x88 1/16. Объем 1 п.л. Тираж 60 экз. Заказ № 812 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фурсова, Оксана Васильевна

1. Введение.

1.1. Актуальность темы.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.3. Научная новизна.

1.4. Практическая значимость работы. 8 1.5 Список сокращений

2. Обзор литературы

2.1. Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. как модельный объект молекулярно-генетических 14 исследований

2.1.1. Основные характеристики Arabidopsis как модельного организма:

2.2. Первые мутанты A. thaliana (L.) Heynh. 15 2.1.3. Геном A. thaliana.

2.2. Абиотический стресс. Холодоустойчивость.

2.3. Убиквитин-зависимый протеолиз. Введение 24 2.3.1. Биохимические механизмы и особенности убиквитин-зависимого протеолиза

2.3.2.1. Схема убиквитин-зависимого протеолиза

2.3.2.2. Протеосома 26S

2.3.2.3. Убиквитин

2.3.2.4. Этапы убиквитинилирования

2.3.2.5. Характеристика семейства F-бокс-содержащих генов и кодируемых ими белков 31 FBP

2.3.2.5.1. Классификация F-бокс-содержащих белков эукариот (FBP) на основании 32 данных об их структуре

2.3.2.5.2. F-домен

2.3.2.5.3. Вариабельные домены F-бокс-содержащих белков млекопитающих

2.3.2.5.4. Вариабельные домены F-бокс-содержащих белков A. thaliana

2.3.2.5.5. Функции эукариотических F-бокс белков FBP 35 2.3.2.5.5.1. Функции FBP у растений 36 2.3. Регуляция на уровне экспрессии генов: Транскрипционные факторы. Семейство bHLH.

2.4.1. Транскрипционные факторы эукариот

2.4.2. Транскрипционные факторы A. thaliana

2.4.3. Характеристика семейства транскрипционных факторов по типу Basic helix-loop- 42 helix (bHLH) i

2.4.3.1. История открытия и сравнительная характеристика семейства эукариотических 42 транскрипционных факторов типа Basic helix-loop-helix (bHLH).

2.4.3.2. Структура домена basic helix-loop-helix (bHLH)

2.4.3.3. Классификация эукариотических белков семейства транскрипционных 45 факторов по типу basic helix-loop-helix (bHLH)

2.4.3.3.1. Классификация по типу основного домена

2.4.3.3.2. Классификации белков семейства транскрипционных факторов по типу bHLH

A. thaliana I

2.4.3.4. Функции белков семейства транскрипционных факторов по типу Basic helix- 47 loop-helix (bHLH)

2.4.3.4.1. Общие сведения

2.4.3.4.2. Функции белков bHLH

2.4.3.4.3. Функции белков bHLH A. thaliana

2.5. РНК-направленное «замолкание» генов - HDGS - феномен «подавления 48 экспрессии генов с высокой степенью идентичности»

2.5.1. Введение 48 '

2.5.2. Молекулярные механизмы

2.5.3. миРНК-биогенез

2.5.3.1. Регуляция активности генов посредством миРНК

2.5.3.2. Функционирование миРНК

2.5.3.3. миРНК-биогенез у растений

2.5.4. Особенности развития PTGS при системном транспорте у растений

2.5.5. Вирусные гены - супрессоры PTGS: HYR-зависимая РНК-полимераза RdRp

2.5.5.1. История открытия

2.5.5.2. Свойства РНК-зависимых РНК-полимераз у растений

2.5.6. Модель функционирования белковых комплексов, осуществляющих деградацию мРНК с помощью киРНК

2.5.7. Использование метода получения индивидуального «замолкания» гена для молекулярно-генетических исследований

3. Материалы и методы

3.1. Линии растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

3.2. Штаммы бактерий и плазмиды

3.3. Питательные среды

3.4. Антибиотики и гербициды, использованные в качестве селективных агентов

3.6. Методы получения компетентных клеток Е. coli

3.6.1. Получение компетентных клеток Е. coli, обеспечивающих трансформации 103-105 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.

3.6.2. Получение компетентных клеток Е. coli, обеспечивающих трансформации 106-107 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.

3.6.3. Получение компетентных клеток Е. coli, обеспечивающих трансформации до 109 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.

3.7. Методы трансформации клеток Е. coli

3.7.1. «Быстрая» трансформация клеток Е. coli с эффективностью 103-105 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК. эффективностью 10-10 колоний на 1 мкг эффективность эффективность эффективность

3.7.2 Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

3.7.3 Трансформация клеток Е. coli с эффективностью до 109 колоний на 1 мкг 67 плазмидной ДНК (электропорация).

3.7.4. Отбор клеток Е. coli, несущих рекомбинантные плазмиды.

3.8. Метод быстрого «переклонирования» ДНК из одного вектора в другой.

3.9. Скрининг бактериальных колоний методом ПЦР

3.10. Трансформация клеток бактерий Agrobacterium tumefaciens 69 3.10.1 Конъюгативный перенос. ' 69 3.10.2. Трансформация клеток A. tumefaciens методом электропорации

3.11. Культивирование растений A. thaliana

3.11.1. Подготовка семян A. thaliana к посеву: поверхностная стерилизация.

3.11.2. Выращивание растений в стерильных условиях на чашках Петри

3.11.3. Выращивание растений в открытом грунте

3.11.4. Выращивание растений в стрессовых условиях

3.12. Агробактериальная трансформация растений A. thaliana

3.12.1. Агробактериальная трансформация на ранней стадии развития растения — 72 стадии прорастающих семян.

3.12.2. Агробактериальная трансформация неопыленных бутонов

3.13. Отбор трансгенных растений A. thaliana

3.13.1. Отбор трансгенных растений A. thaliana в почве (in vivo).

3.13.2. Отбор трансгенных растений A. thaliana в песке (in vivo).

3.13.3. Отбор трансгенных растений A. thaliana in vitro

3.14. Методы выделения геномной ДНК из тканей растений A. thaliana 75 3.14.1. Быстрое выделение ДНК из листьев A. thaliana для ПЦР-тестирования на наличие инсерции Т-ДНК.

3.14.2. Получение мини-препаратов ДНК из тканей растений A. thaliana

3.14.3. Выделение ДНК A. thaliana для блот-гибридизации

3.14.4. Выделение геномной ДНК A. thaliana для последующего клонирования

3.15. Методы выделения плазмидной ДНК из клеток бактерий

3.15.1. Получение мини-препаратов ДНК

3.15.2. Тепловой метод выделения ДНК

3.15.3. Получение препаратов плазмидной ДНК с минимальным количеством примесей

3.15.4. Очистка препаратов ДНК от примесей белков

3.15.5. Очистка препаратов ДНК от примесей РНК

3.15.6. Хроматографическая очистка препаратов ДНК

3.15.7. Очистка препаратов ДНК методом электроэлюции

3.15.7.1. Трубчатый электрофорез

3.15.7.2. Электроэлюция в диализную плёнку

3.15.8. Очистка ДНК при помощи центрифугирования 82 3.15.9 Концентрирование препаратов ДНК с помощью изо-бутанолового спирта

3.16. Метод амплификации ДНК для последующего клонирования

3.17. Клонирование фрагментов ДНК

3.18. Метод блот-гибридизации по Саузерну

3.19. Анализ мРНК в растительных тканях A. thaliana

3.19.1. Реакция обратной транскрипции с поли-Т праймером

3.19.2. Реакция обратной транскрипции с гексапраймерами.

3.20. Количественный ПЦР в реальном времени (qPCR)

3.21. Секвенирование ДНК

3.22. Праймеры, использованные в работе.

3.23. Определение углеводной и липидной составляющей в семенах трансгенных 88 линий с помощью ЯМР.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Предпосылки. Инсерционная мутантная линия №137. 89 i 4.1.1. Локализация инсерции в гене Atlgl2860 трансгенной линии A. thaliana № 137.

4.2. Анализ экспрессии гена Atlgl

4.3. Поиск in silico генов с высокой степенью соответствия гену Atlgl2860 по 97 нуклеотидному составу.

4.3.1. Сравнительный анализ генов со значимой степенью соответствия первой части 99 гена Atlgl2860.

4.3.1.1. Анализ мутантного фенотипа мутантной линии A. thaliana, содержащей 101 инсерцию в гене Atlgl3200. I

4.3.2. Сравнительный анализ гена со значимой степенью соответствия второй части 102 TQRaAtlgl2860.

4.3. Получение трансгенных линий A.thaliana характеризующихся измененной 106 экспрессией гена Atlgl2860.

4.3.1. Создание векторных конструкций для получения трансгенных линий A.thaliana, 106 характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией первой и второй частей TenaAtlgl2860 независимо.

4.3.1.1. ЭТАП 1. Амплификация нуклеотидных последовательностей двух частей гена 108 i Atlgl2860.

4.3.1.2. ЭТАПЫ 2-4. Клонирование двух частей гена Atlgl

4.3.2. Создание векторной конструкции для получения трансгенных линий A.thaliana, 113 характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией полноразмерной копии гена Atlgl2860.

4.3.2.1. Клонирование полноразмерной копии гена Atlgl

4.4. Вектор для РНК-направленного «замолкания» гена Atlgl2860.

4.4.1. Амплификация уникального фрагмента для РНК-направленного «замолкания» 120 гена Atlgl

4.4.2. Клонирование уникальных фрагментов со второго экзона гена Atlgl2860.

4.5. Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana с помощью векторов, 124 специально созданных для определения тонкой структурно-функциональной организации и функции гена Atlgl2860.

4.6. Анализ мРНК гена Atlgl2860 в трансгенных линиях с измененной экспрессией 126 гена Atlgl2860.

4.6.1. Поиск альтернативных форм сплайсирования гена Atlgl2860.

4.6.2. Анализ in silico предполагаемой функции продукта гена At5g61270 132 4.8. Поиск мутантного фенотипа трансгенных линий A. thaliana, характеризующихся 133 измененной экспрессией гена Atlgl2860.

4.8.1. Анализ развития трансгенных растений A. thaliana, характеризующихся 133 измененной экспрессией TenaAtlgl2860, в стрессовых условиях.

4.10. Сравнение содержания липидов и углеводов в семенах трансгенных растений по сравнению с растениями дикого типа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh."

1.1. Актуальность темы.

Изучение функций генов у различных организмов до сих пор остаётся одной из наиболее важных и необходимых целей научных исследований. Анализ полученных данных может дать информацию и для сравнительной генетики и для глобального понимания процессов на всех уровнях развития. При изучении функций генов используются методы как прямой, так и обратной генетики. В случае использования подходов обратной генетики проводится отбор кандидатных генов по нуклеотидному составу, схожести последовательностей их белковых продуктов, временному промежутку экспрессии и другим параметрам. Для определения функций генов высших растений основным является метод инсерционного мутагенеза. Основной задачей инсерционного мутагенеза является создание разных типов мутантов, с помощью которых можно наиболее полно охарактеризовать гены и процессы, функция которых каким-либо образом изменена.

Геном растений, и геном A. thaliana в частности, содержит большое число межгенных участков, при попадании в которые инсерция не затрагивает участки, значимые для транскрипции генов. На основании этого факта можно анализировать «суперэкспрессирующие» трансгенные линии и трансгенные растения с РНК-направленным «замолканием» конкретных генов, при встраивании инсерции в данные участки. После завершения в 2000 году глобального проекта по определению нуклеотидной последовательности генома Arabidopsis thaliana, при помощи компьютерных программ in silico было определено множество рамок считывания, предсказаны гены, их структура и функции. Но, несмотря на проделанную биоинформатическую работу, этап экспериментальной проверки полученных данных до сих пор не закончен. Таким образом, экспериментальный анализ структурно-функциональной организации генов, и в частности, поиск и идентификация генов растений, вовлеченных в регуляцию ответа на биотические и абиотические стрессы, на данный момент является актуальной задачей.

В связи с необходимостью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, устойчивость к холодовому стрессу у растений становится одной важнейших задач для генетики и функциональной геномики растений. Ранее были изучены и локализованы гены, такие как ICE1, ESK1 и другие, которые участвуют в регуляции ответа на холодовой стресс. Однако повышенная экспрессия этих генов не приводит сохранению жизнеспособности растений при сильных заморозках. Таким образом, остается актуальной задача идентификации новых генов, участвующих в ответе на холодовой стресс и обеспечивающих морозоустойчивость растений.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Фурсова, Оксана Васильевна

6. Выводы

1. Установлено, что фрагмент гена Atlgl2860 A. thaliana, включающий в себя 2-5 экзоны и содержащий участок ДНК, кодирующий домен транскрипционного активатора по типу bHLH, выступает как самостоятельная функционально-полноценная единица.

2. Созданы трансгенные линии A. thaliana, характеризующиеся повышенной конститутивной экспрессией гена Atlgl2860, а также РНК-направленным «замолканием» гена Atlgl2860.

3. Проведенный фенотипический анализ показал, что трансгенные линии растений A. thaliana, геном которых содержит 2-5 экзоны гена Atlgl2860 или полноразмерную копию гена Atlgl2860, находящиеся под контролем конститутивного промотора 35S, обладают повышенной толерантностью к воздействию холодом.

4. Установлено, что повышенная толерантность к холодовому стрессу трансгенных линий A. thaliana связана с увеличением уровня экспрессии гена Atlgl2860, а не с РНК-направленным «замолканием» гена Atlgl2860.

6. Впервые показано, что транскрипционная активность гена At5g61270) продукт которого, в свою очередь, содержит домен транскрипционного фактора по типу bHLH, зависит от уровня экспрессии гена Atlgl2860.

7. Публикации.

7.1 Научные статьи

1. Фурсова ОВ, Погорелко ГВ, Авсюк АИ, Томилова НБ, Томилов АА, Тарасов ВА, Огаркова OA. Идентификация потенциального гена контролирующего развитие семядолей у проростков Arabidopsis thaliana. Докл. Ак. Наук. 2004. 395:161-2

2. Погорелко ГВ, Фурсова ОВ, Огаркова OA, Тарасов ВА. Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений. Генетика. 2007. т.43 №2: 194-202

3. Огаркова OA, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Фурсова ОВ, Тарасов В А. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis thaliana: коллекция морфологических инсерционных мутантов. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 138-141

4. Огаркова OA, Фурсова ОВ, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Тарасов ВА. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis thaliana: идентификация нового гена вовлеченного в контроль развития семядолей. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 142-145.

5. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. A new technique for activation tagging in Arabidopsis. Gene. 2008. v. 414, №1-2, p. 67-75.

6. Pogorelko GV and Fursova OV. A highly efficient miPCR method for isolating FSTs from transgenic Arabidopsis thaliana plants. Journal of Genetics. 2008. v. 87, № 2, p.133-140.

8. Фурсова ОВ, Погорелко ГВ, Огаркова OA, Тарасов В А. Идентификация 2-х новых генов Arabidopsis thaliana, вовлеченных в контроль ответа растений на холодовой стресс. Материалы IV международной научной конференции «Экспериментальные факторы эволюции». 2008. Алушта, Крым, Украина. Т.5, 448-450.

9. Fursova OV, Pogorelko GV, Tarasov VA. Identification of ICE2, a gene involved in cold acclimation which determines freezing tolerance in Arabidopsis thaliana. Gene. 2009. v. 429, №1-2, p.98-103

7.2 Тезисы конференций, устные и стендовые доклады.

Работа была представлена на 30 конференциях, в том числе:

Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Investigation of Genes Controlling Protein Phosphorilation. «EuroPhosphatases 2003», June 29 - July 3, 2003, Barcelona, Spain

Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Transgenic plants as the way to discover and validate novel genes and their functions in different organisms. «ABC Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Disease». Innsbruck, Austria, March 4-10, 2006

Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Ubiquitin-dependent Proteolysis. «14th International Conference "New Information Technologies in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology"», May 31 - June 9, 2006, Crimea, Gurzuf, Ukraine

Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Identification of the potential gene that controlling cotyledon development in Arabidopsis thaliana seedlings. «International Scientific Conference "Genetics in Russia and in a World"», June 28 - July 2, 2006, N1 Vavilov Institute of General Genetics, Moscow, Russia

Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Creation and Analyzing of Collection of Gain-of-Function mutants of A.thaliana. Microarray & Genosensor Techniques in Biomedical Applications, September 22 - 30, 2006, Prague, Czech Republic

Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. From the variety to the integrity. Studying genes functions of higher plants on model object Arabidopsis thaliana. Bridging the Gap Between Gene Expression and Biological Function, 11-14 October, 2006, Luxembourg

Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Studying genes functions of higher plants on model object Arabidopsis thaliana. New concepts in lipidology: from lipidomics to disease, October 21 - 25, 2006, Congress Center 'Leeuwenhorst', Noordwijkerhout, The Netherlands

Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Identification of Transcription Factors Involved in Regulation in the Cold. Plant Transformation Technologies. February 4-7, 2007, Vienna, Austria

Fursova OV, Pogorelko GV, Tomilova NB, Tomilov AA, Brouskin SA, Ogarkova OA, Tarasov VA. Creation of Transgenic Plants with Over-expression of Genes which Encode a Regulator of Cold-induced Transcriptome Improves Freezing Tolerance. Fourth Moscow International Congress "BIOTECHNOLOGY: State of the Art and Prospects of Development". March 12-16, 2007, Moscow, Russia.

Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Influence of Cell Membrane Integrated Proteins to the Plant Development. Biophysics of Membrane-Active Peptides. Lisbon, Portugal, April 1 - 4, 2007

7.3 Регистрация в базах данных.

Название Описание GenBank ID

Atlgl2860 2 EST мутантной линии A.thaliana ЕН643295

At5g61270 Arabidopsis thaliana 0-line EST гена At5g61270 A.thaliana ЕН669233

Atlgl2850 Arabidopsis thaliana X-]ine EST гена Atlgl285OA. thaliana ЕН667252

E9 Partial cDNA EST гена At5gl 0080 A. thaliana EL740208 pFC128600E Вектор для трансформации растений DQ995487 pFC128500E Вектор для трансформации растений DQ995486 pLE128600E Вектор для трансформации растений DQ995485 pFE128600E Вектор для трансформации растений DQ995484 p3UTR12850S Вектор для трансформации растений EF010980 pSE12860S Вектор для трансформации растений EF010979 pFE12860S Вектор для трансформации растений EFO10978

Arabidopsis thaliana helicase-like (.Atlg33390) mRNA, complete sequence Полноразмерная кДНК гена Atlg33390 EF630362

5. Заключение

В итоге проделанной работы можно выдвинуть следующие утверждения. Локус Atlgl2860 Arabidopsis thaliana содержит две самостоятельные части, первую - экспрессия которой не выявлена (первый экзон) и вторую (со второго по пятый экзоны), экспрессия которой установлена в точном соответствии с данными, представленными в базе данных TAIR. В данном случае, возможно, эти две части являются независимыми генами, что соответствует первоначальным данным, когда две части гена Atlgl2860 были обозначены как F13K23.12 и F13K23.13. Можно предположить, что первая часть является псевдогеном, на это указывает отсутствие данных по экспрессии 1-го экзона, но наличие мутантного фенотипа у трансгенной линии, содержащей инсерцию в этой части локуса Atlgl2860, ставит под сомнение данную гипотезу. Важно отметить проявление схожего фенотипа, а именно некроза на семядолях на ранних стадиях развития при повреждении первичной структуры гена Atlgl3200, характеризующегося высокой степенью соответствия первой части гена Atlgl2860. Важно, что информация по экспрессии гена Atlgl3200 на данный момент также отсутствует. В ходе проделанной работы было показано, что вторая часть гена Atlgl2860 может функционировать независимо и успешно экспрессируется со второго промотора, независимо от первого экзона. Таким образом, можно утверждать, что данные по локусу Atlgl2860, обновленные в базе данных TAIR и GenBank NCBI в 2001 году не соответствуют реальной структуре данного гена, а предыдущая версия структурной организации этого локуса, до 2001 года, содержала достоверную информацию. Можно предположить, что второй промотор (Табл. 4.3.), расположенный в первом интроне гена Atlgl2860 не выявлялся, так как до сих пор не охарактеризован для растений Arabidopsis thaliana, и был обнаружен нами только при расширенном поиске промоторной области, когда программа учитывала характеристики промоторных последовательностей кукурузы.

С целью выяснить структуру и функцию гена Atlgl2860 были сконструированы специальные вектора для трансформации растений.

138

Установлено, что полученные акклиматизированные трансгенные линии Arabidopsis thaliana, характеризующиеся повышенной конститутивной экспрессией гена At Igl2860, проявляют устойчивостью к холодовому стрессу (при -20°С) по сравнению с контрольными растениями.

При анализе липидно-углеводного состава семян трансгенных линий были выявлены различия по сравнению с контрольными растениями. Используя метод ЯМР установлено, что в семенах трансгенных линий, характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией второй части гена At Igl2860 {SuperHALF2-ICE2 и Super-ICE2), содержание липидов выше на ~10%, чем в контрольных растениях дикого типа (Со1-0). Уровень углеводов в семенах трансгенных растений, напротив, ниже, чем в растениях дикого типа на ~10%. Таким образом можно утверждать, что повышенная конститутивная экспрессия гена Atlgl2860 приводит к изменению липидно-углеводного баланса в трансгенных линиях, по сравнению с контрольными растениями дикого типа.

Так как было показано, что независимо экспрессирующаяся вторая часть гена Atl gl2860 имеет высокую степень соответствия гену ICE1, самостоятельно функционирующую вторую часть гена Atlgl2860 обозначили как ICE2.

Таким образом, нами был идентифицирован ген ICE2, повышенная экспрессия которого обуславливает повышенную устойчивость трансгенных линий A. thaliana к холодовому стрессу после акклиматизации. Более того, по сравнению с охарактеризованным ранее геном ICE1 (гл. 2.2) - ген ICE2 обуславливает выживание акклиматизированных растений после глубокого промораживания при -20°С, тогда как для гена ICE1 было показано, что повышенная конститутивная экспрессия ICE1 после предварительной акклиматизации растений приводит к устойчивости при относительно низкой температуре -6°С.

Закономерно, что изменения экспрессии какого-либо транскрипционного фактора может приводить к изменению профиля транскриптома в трансгенных растениях. При анализе экспрессии генов группы CBF (гены холодового ответа (гл. 2.4.)) в трансгенных линиях с повышенной конститутивной экспрессией ICE2, было установлено, что в анализируемых растениях уровень экспрессии гена CBF3 одинаковый, тогда как уровень экспрессии гена CBF1 различен. Также было показано, что по сравнению с контрольными растениями дикого типа (СоЮ), уровень экспрессии гена CBF1 в трансгенных линиях с повышенной экспрессией ICE2 увеличен в 7 раз.

Так как в гене Atlgl2860 обнаружен только один терминатор (Табл. 4.3.), была проанализирована возможность альтернативнго сплайсирования транскриптов этого гена, а именно между 1-ым и 2-ым экзонами гена Atlgl2860. Ни один вариант альтернативного сплайсинга обнаружен не был, но было выявлено, что в трансгенных растениях с повышенной конститутивной экспрессией ICE2, экспрессируется ген At5g61270, который содержит домен СОЕ, до настоящего момента не изученный у растений и участвующий в «созревании» антимикробных пептидов семейства кателлицидины у млекопитающих.

Таким образом, можно утверждать, что транскрипционный фактор ICE2 контролирует уровень транскрипции генов CBF1 и At5g61270 и, таким образом, является транскрипционным активатором, вовлеченным в регуляцию ответа на холодовой стресс (Рис. 4.49.).

Рисунок 4.49. Регуляторная цепь, от момента воздействия сигнала холодового стресса до момента фенотипического проявления признака холодоустойчивости транскрипционный активатоо ICE1 транскрипционный активатог» ICE2 у транскрипционный фактор CBF3 транскрипционный фактор CBF1 сигнальная трансдукция: группа CBF i активация cis-элементов (CRT: G/ACCGAC)

1 г экспрессия генов (COR; протеазы: RD19.RD21)

1 функция (устойчивость к холодовому стрессу)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фурсова, Оксана Васильевна, Москва

1. Патрушев J1. И. «Искусственные генетические системы» Том 1, Москва, Наука, 2004.

2. Abe Н, Urao Т, Ito Т, Seki М, Shinozaki К, Yamaguchi-Shinozaki К. Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling //Plant Cell. 2003 Jan;15(l):63-78.

3. Al-Shehbaz I.A., O'Kane S.L. Taxonomy and phylogeny of Arabidopsis (Brassicaceae) // The Arabidopsis book, 2002, American Society of Plant Biologists

4. Anthony-Cahill SJ, Benfield PA, Fairman R, Wasserman ZR, Brenner SL, Stafford WF 3rd, Altenbach C, Hubbell WL, DeGrado WF. Molecular characterization of helix-loop-helix peptides // Science. 1992 Feb 21;255(5047):979-83

5. Atchley WR, Fitch WM. A natural classification of the basic helix-loop-helix class of transcription factors // Proc Natl Acad Sci USA. 1997 May 13;94(10):5172-6.

6. Bai C, Richman R, Elledge SJ. Human cyclin F // EMBO J. 1994 Dec 15;13(24):6087-98.

7. Baulcombe DC. Molecular biology. Unwinding RNA silencing //Science. 2000 Nov 10;290(5494): 1108-9.

8. Baulcombe D. RNA silencing in plants // Nature. 2004 Sep 16;431(7006):356-63. Review.

9. Baker SS, Wilhelm KS, Thomashow MF.The 5'-region of Arabidopsis thaliana cor 15a has cis-acting elements that confer cold-, drought- and ABA-regulated gene expression // Plant Mol Biol. 1994 Mar;24(5):701-13.

10. Beclin C, Boutet S, Waterhouse P, Vaucheret H A branched pathway for transgene-induced RNA silencing in plants // Curr Biol. 2002 Apr 16;12(8):684-8.

11. Birchler JA, Bhadra MP, Bhadra U. Making noise about silence: repression of repeated genes in animals //Curr Opin Genet Dev. 2000 Apr;10(2):211-6. Review.

12. Buck MJ, Atchley WR. Phylogenetic analysis of plant basic helix-loop-helix proteins // J Mol Evol. 2003 Jun;56(6):742-50

13. Cenciarelli C, Chiaur DS, Guardavaccaro D, Parks W, Vidal M, Pagano M. dentification of a family of human F-box proteins // Curr Biol. 1999 Oct 21;9(20):1177-9.

14. Chan SW, Zilberman D, Xie Z, Johansen LK, Carrington JC, Jacobsen SE. RNA silencing genes control de novo DNA methylation // Science. 2004 Feb 27;303(5662):1336

15. Chinnusamy V, Schumaker K, Zhu JK.Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants // J Exp Bot. 2004 Jan;55(395):225-36. Epub 2003 Dec 12. Review.

16. Chinnusamy V, Ohta M, Kanrar S, Lee BH, Hong X, Agarwal M, Zhu JK. ICE1: a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis // Genes Dev. 2003 Apr 15; 17(8): 1043-54. Epub 2003 Apr 2.

17. Chinnusamy V, Zhu J, Zhu JK. Cold stress regulation of gene expression in plants // Trends Plant Sci. 2007 0ct;12(10):444-51. Epub 2007 Sep 12.

18. Choi DW, Rodriguez EM, Close TJ. Barley Cbf3 gene identification, expression pattern, and map location // Plant Physiol. 2002 Aug; 129(4): 1781-7.

19. Cogoni С, Macino G. Homology-dependent gene silencing in plants and fungi: a number of variations on the same theme // Curr Opin Microbiol. 1999 Dec;2(6):657-62. Review.

20. Crozatier M, Valle D, Dubois L, Ibnsouda S, Vincent A. Collier, a novel regulator of Drosophila head development, is expressed in a single mitotic domain //Curr Biol. 1996 Jun 1;6(6):707-18

21. Dalmay T, Hamilton A, Rudd S, Angell S, Baulcombe DC. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus // Cell. 2000 May 26;101(5):543-53.

22. Dawe RK. RNA interference on chromosomes // Nat Genet. 2004 Nov;36(ll):l 141-2.

23. Dong CH, Agarwal M, Zhang Y, Xie Q, Zhu JK. The negative regulator of plant cold responses, HOS1, is a RING E3 ligase that mediates the ubiquitination and degradation of ICE 1. Proc Natl Acad Sci USA. 2006 May 23; 103(21):8281-6

24. Downward J. RNA interference // BMJ. 2004 May 22;328(7450): 1245-8. Review.

25. Dubois L, Vincent A., The COE-Collier/Olfl/EBF-transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions // Mech Dev. 2001 Oct; 108(1 -2):3-12

26. Dunn MA, White AJ, Vural S, Hughes MA. Identification of promoter elements in a low-temperature-responsive gene (blt4.9) from barley (Hordeum vulgare L.) //Plant Mol Biol. 1998 Nov l;38(4):551-64.

27. Eckardt N. A. F-box proteins take center stage // The plant cell, 2004, March,vol. 16, 558-561

28. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs // Genes Dev. 2001 Jan 15; 15(2): 188-200.

29. Ellenberger T, Fass D, Arnaud M, Harrison SC. Crystal structure of transcription factor E47: E-box recognition by a basic region helix-loop-helix dimmer // Genes Dev. 1994 Apr 15;8(8):970-80.

30. Farras R, Ferrando A, Jasik J, Kleinow T, Okresz L, Tiburcio A, Salchert K, del Pozo C, Schell J, Koncz C. SKPl-SnRK protein kinase interactions mediate proteasomal binding of a plant SCF ubiquitin ligase // EMBO J. 2001 Jun l;20(ll):2742-56.

31. Ferre-D'Amare AR, Pognonec P, Roeder RG, Burley SK. Structure and function of the b/HLH/Z domain ofUSF // EMBO J. 1994 Jan 1; 13(1): 180-9.

32. Fowler SG, Cook D, Thomashow MF.Low temperature induction of Arabidopsis CBF1, 2, and 3 is gated by the circadian clock // Plant Physiol. 2005 Mar;137(3):961-8. Epub 2005 Feb 22.

33. Fowler S, Thomashow MF. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway // Plant Cell2002 Aug; 14(8): 1675-90.

34. Gagne JM, Downes BP, Shiu SH, Durski AM, Vierstra RD. The F-box subunit of the SCF E3 complex is encoded by a diverse superfamily of genes in Arabidopsis // Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Aug 20;99(17):11519-24. Epub 2002 Aug 8.

35. Gao MJ, Allard G, Byass L, Flanagan AM, Singh J. Regulation and characterization of four CBF transcription factors from Brassica napus // Plant Mol Biol. 2002 Jul;49(5):459-71.

36. Garrell J, Campuzano S. The helix-loop-helix domain: a common motif for bristles, muscles and sex // Bioessays. 1991 Oct;13(10):493-8. Review.

37. Gazzani S, Lawrenson T, Woodward C, Headon D, Sablowski R. A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis // Science. 2004 Nov 5;306(5698): 1046-8.

38. Gilmour SJ, Fowler SG, Thomashow MF. Arabidopsis transcriptional activators CBF1, CBF2, and CBF3 have matching functional activities // Plant Mol Biol. 2004 Mar;54(5):767-81.

39. Gilmour SJ, Sebolt AM, Salazar MP; Everard JD, Thomashow MF. Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation // Plant Physiol. 2000 Dec; 124(4): 1854-65.

40. Gleave AP. A versatile binary vector system with a T-DNA organisational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome // Plant Mol Biol. 1992 Dec;20(6): 1203-7.

41. Guo A, He K, Liu D, Bai S, Gu X, Wei L, Luo J. DATF: a database of Arabidopsis transcription factors // Bioinformatics. 2005 May 15;21(10):2568-9. Epub 2005 Feb 24.

42. Gutierrez RA, Green PJ, Keegstra K, Ohlrogge JB'. Phylogenetic profiling of the Arabidopsis thaliana proteome: what proteins distinguish plants from other organisms //Genome Biol. 2004;5(8):R53. Epub 2004 Jul 15.

43. Hagman J£ Lukin K. Early B-cell factor 'pioneers' the way for B-cell development // Trends Immunol. 2005 Sep;26(9):455-61

44. Hagman J, Lukin K. Transcription factors drive В cell development // Curr Opin Immunol. 2006 Apr; 18(2): 127-34. Epub 2006 Feb 7.

45. Hamilton A, Voinnet O, Chappell L, Baulcombe D. Two classes of short interfering RNA in RNA silencing // EMBO J. 2002 Sep 2;21(17):4671-9

46. Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells // Nature. 2000 Mar 16;404(6775):293-6.

47. Hatfield PM, Gosink MM, Carpenter ТВ, Vierstra RD. The ubiquitin-activating enzyme (El) gene family in Arabidopsis thaliana // Plant J. 1997 Feb;l 1(2):213-26.

48. Heim MA- Jakoby M, Werber M, Martin C, Weisshaar B, Bailey PC. The basic helix-loop-helix transcription factor family in plants: a genome-wide study of protein structure and functional diversity // Mol Biol Evol. 2003 May;20(5):735-47. Epub 2003 Apr 2.

49. Helliwell C, Waterhouse P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants // Methods. 2003 Aug;30(4):289-95.

50. Hennig L, Gruissem W, Grossniklaus U, Kohler C. Transcriptional programs of early reproductive stages in Arabidopsis // Plant Physiol. 2004 Jul;135(3):1765-75. Epub 2004 Jul 9.

51. Herr AJ. Pathways through the small RNA world of plants // FEBS Lett. 2005 Oct 31 ;579(26):5879-88. Epub 2005 Sep 2. Review

52. Hirano T, Yamauchi N, Sato F, Soh T, Hattori MA. Evaluation of RNA interference in developing porcine granulosa cells using fluorescence reporter genes // J Reprod Dev. 2004 0ct;50(5):599-603.

53. Hongyun W., Jian H., Zhao L., Yongbiao X. F-box proteins in flowering plants // Chinese Science Bulletin, 2002, Sep, vol. 47(8), 1497-1502

54. Itaya A, Folimonov A, Matsuda Y, Nelson RS, Ding B. Potato spindle tuber viroid as inducer of RNA silencing in infected tomato // Mol Plant Microbe Interact. 2001 Nov; 14(11): 1332-4.

55. Jaglo-Ottosen KR, Gilmour SJ, Zarka DG, Schabenberger O, Thomashow MF Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance // Science. 1998 Apr 3;280(5360):104-6.

56. Jin J, Cardozo T, Lovering RC, Elledge SJ, Pagano M, Harper JW. Systematic analysis and nomenclature of mammalian F-box proteins // Genes Dev. 2004 Nov l;18(21):2573-80.

57. Jones AL, Thomas CL, Maule AJ. De novo methylation and co-suppression induced by a cytoplasmically replicating plant RNA virus // EMBO J. 1998 Nov 2;17(21):6385-93.

58. Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B. MicroRNAS and their regulatory roles in plants // Annu Rev Plant Biol. 2006;57:19-53. Review.

59. Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor // Nat Biotechnol. 1999 Mar;17(3):287-91.

60. Kim J A, Lee M, Kim YS, Woo JC, Park CM. A basic helix-loop-helix transcription factor regulates cell elongation and seed germination // Mol Cells. 2005 Jun 30;19(3):334-41.69)

61. Kipreos ET, Pagano M. The F-box protein family // Genome Biol. 2000;1(5):REVIEWS3002. Epub 2000 Nov 10. Review.

62. Kobe B, Kajava AV. The leucine-rich repeat as a protein recognition motif// Curr Opin Struct Biol. 2001 Dec;l l(6):725-32. Review.

63. Kondorosi E, Redondo-Nieto M, Kondorosi A. Ubiquitin-mediated proteolysis. To be in the right place at the right moment during nodule development // Plant Physiol. 2005 Apr; 137(4): 1197-204.

64. Kreps JA, Wu Y, Chang HS, Zhu T, Wang X, Harper JF. Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress // Plant Physiol. 2002 Dec;130(4):2129-41.

65. Kuroda H, Takahashi N, Shimada H, Seki M, Shinozaki K, Matsui M. Classification and expression analysis of Arabidopsis F-box-containing protein genes // Plant Cell Physiol. 2002 0ct;43(10): 1073-85

66. Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs // Science. 2001 Oct 26;294(5543):853-8.

67. Ledent V, Vervoort M. The basic helix-loop-helix protein family: comparative genomics and phylogenetic analysis // Genome Res. 2001 May;l l(5):754-70.

68. Lee RC, Ambros V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans // Science. 2001 Oct 26;294(5543):862-4.

69. Lee BH, Henderson DA, Zhu JK. The Arabidopsis cold-responsive transcriptome and its regulation by ICE1 // Plant Cell. 2005 Nov; 17(11):3155-75.

70. Li FN, Johnston M.Grrl of Saccharomyces cerevisiae is connected to the ubiquitin proteolysis machinery through Skpl: coupling glucose sensing to gene expression and the cell cycle // EMBO J. 1997 Sep 15;16(18):5629-38

71. Lippman Z, May B, Yordan C, Singer T, Martienssen R: Distinct mechanisms determine transposon inheritance and methylation via small interfering RNA and histone modification // PLoS Biol. 2003 Dec;l(3):E67. Epub 2003 Dec 22.

72. Littlewood TD, Evan GI Transcription factors 2: helix-loop-helix // Protein Profile 1995;2:621-702.

73. Livak, K., Schmittgen, Т., 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2"лла Method. Methods. 25, 402-408.

74. Matzke M, Matzke AJ, Kooter JM. RNA: guiding gene silencing // Science. 2001 Aug 10;293(5532): 1080-3.

75. Matzke MA, Matzke AJ, Pruss GJ, Vance VB. RNA-based silencing strategies in plants // Curr Opin Genet Dev. 2001 Apr; 11(2):221-7. Review

76. Meng-Hsuan Han, Saiprasad Goud, Liang Song, and Nina Fedoroff The Arabidopsis double-stranded RNA-binding protein HYL1 plays a role in microRNA-mediated gene regulation // Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jan 27; 101 (4): 1093-8. Epub 2004 Jan 13.

77. Mette MF, van der Winden J, Matzke MA, Matzke AJ. Production of aberrant promoter transcripts contributes to methylation and silencing of unlinked homologous promoters in trans // EMBO J. 1999 Jan 4;18(l):241-8.

78. Mocellin S, Provenzano M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology // Transl Med. 2004 Nov 22;2(1):39.

79. Moon J, Parry G, Estelle M. The ubiquitin-proteasome pathway and plant development // Plant Cell. 2004 Dec; 16(12):3181-95. Review.

80. Mooney BP, Miernyk JA, Randall DD. Cloning and characterization of the dihydrolipoamide S-acetyltransferase subunit of the plastid pyruvate dehydrogenase complex (E2) from Arabidopsis // Plant Physiol. 1999 Jun; 120(2):443-52.

81. Mourrain P, Beclin C, Vaucheret H. Are gene silencing mutants good tools for reliable transgene expression or reliable silencing of endogenous genes in plants?

82. Genet Eng (N Y). 2000;22:155-70. Review.

83. Murre C., Bain G., Dijk M.A., Engel I, Furnari B.A., Massari M.E., Matthews J.R., Quong M.W., Rivera R.R., Stuiver M.H. Structure and function of helix-loop-helix proteins // Biochim Biophys Acta. 1994 Jun 21; 1218(2): 129-35

84. Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans// Plant Cell. 1990 Apr;2(4):279-289

85. Papp I., Mette M. F., Aufsatz W., Daxinger L., Schauer S. E., Ray A.,Winden J., Matzke M., Matzke J.M. Evidence for nuclear Processing of plant micro RNA and short interfering RNA precursors // Plant Physiology, July 2003, vol. 132, 1382-1390

86. Pigliucci M. Ecology and evolutionary biology of Arabidopsis // The Arabidopsis book, 2002, American Society of Plant Biologists

87. Pederson Т. RNA interference and mRNA silencing, 2004: how far will they reach? // Mol Biol Cell. 2004 Feb;15(2):407-10. Epub 2003 Dec 2. Review.

88. Rand ТА, Ginalski K, Grishin NV, Wang X. Biochemical identification of Argonaute 2 as the sole protein required for RNA-induced silencing complex activity // Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Oct 5;101(40):14385-9. Epub 2004 Sep 27.

89. Ramsay NA, Walker AR, Mooney M, Gray JC. Two basic-helix-loop-helix genes (MYC-146 and GL3) from Arabidopsis can activate anthocyanin biosynthesis in a white-flowered Matthiola incana mutant // Plant Mol Biol. 2003 Jun;52(3):679-88.

90. Riechmann JL, Meyerowitz EM. The AP2/EREBP family of plant transcription factors // Biol Chem. 1998 Jun;379(6):633-46.

91. Romano N, Macino G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences // Mol Microbiol. 1992 Nov;6(22):3343-53.

92. Schiebel W, Haas B, Marinkovic S, Klanner A, Sanger HL. RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. II. Catalytic in vitro properties // Biol Chem. 1993 Jun5;268(16):l 1858-67.

93. Schiebel W, Haas B, Marinkovic S, Klanner A, Sanger HL. RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. I. Purification and physical properties //J Biol Chem. 1993 Jun 5;268(16): 11851-7.

94. Schiebel W, Pelissier T, Riedel L, Thalmeir S, Schiebel R, Kempe D, Lottspeich F, Sanger HL, Wassenegger M. Isolation of an RNA-directed RNA polymerase-specific cDNA clone from tomato //Plant Cell. 1998 Dec;10(12):2087-101.

95. Schwechheimer C, Calderon Villalobos LI. Cullin-containing E3 ubiquitin ligases in plant development // Curr Opin Plant Biol. 2004 Dec;7(6):677-86. Review.

96. Scott M. Hammond Dicing and slicing The core machinery of the RNA interference pathway //*FEBS Letters 579 (2005) 5822-582.

97. Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. Global analysis of gene networks to solve complex abiotic stress responses // CAB international 2006. Cold Hardiness in plantsA molecular genetics, Cell Biology and Phisiology

98. Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, Seki M. Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses // Curr Opin Plant Biol. 2003 Oct;6(5):4tO-7.

99. Sijen T, Fleenor J, Simmer F, Thijssen KL, Parrish S, Timmons L, Plasterk RH, Fire A. On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing //Cell. 2001 Nov 16;107(4):465-76.

100. Sijen T, Vijn I, Rebocho A, van Blokland R, Roelofs D, Mol JN, Kooter JM. Transcriptional and posttranscriptional gene silencing are mechanistically related //Curr Biol. 2001 Mar 20;ll(6):436-40.

101. Smith TF, Gaitatzes C, Saxena K, Neer EJ. The WD repeat: a common architecture for diverse functions // Trends Biochem Sci. 1999 May;24(5):181-5. Review.

102. Smalle J, Vierstra RD. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway // Annu Rev Plant Biol. 2004; 55:555-90. Review.

103. Slcowyra D, Craig KL, Tyers M, Elledge SJ, Harper JW F-box proteins are receptors that recruit phosphorylated substrates to the SCF ubiquitin-ligase complex//Cell 1997;91:209-219.

104. Steponkus PL, Uemura M, Joseph RA, Gilmour SJ, Thomashow MF. Mode of action of the COR15a gene on the freezing tolerance of Arabidopsis thaliana // Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Nov 24;95(24): 14570-5.

105. Sullivan JA, Deng XW. From seed to seed: the role of photoreceptors in Arabidopsis development // Dev Biol. 2003 Aug 15;260(2):289-97. Review.

106. Tabata S, Sequence and analysis of chromosome 5 of the plant Arabidopsis thaliana. //Nature. 2000 Dec 14;408(6814):823-6

107. Tabata S "The Arabidopsis Genome Initiative", Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana": Nature 408, 796-815, 2000

108. Takeda A, Mise K, Okuno T. Rna silencing suppressors encoded by viruses of the family Tombusviridae // Plant Biothechnology 2005,22, 447-454

109. Taji T, Ohsumi C, Iuchi S, Seki M, Kasuga M, Kobayashi M, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Important roles of drought- and cold-inducible genes for galactinol synthase in stress tolerance in Arabidopsis thaliana // Plant J. 2004 Feb;29(4):417-26.

110. Takeda A, Tsukuda M, Mizumoto H, Okamoto K, Kaido M, Mise K, Okuno T. A plant RNA virus suppresses RNA silencing through viral RNA replication // EMBO J. 2005 Sep 7;24(17):3147-57. Epub 2005 Aug 11.

111. Thomann A, Dieterle M, Genschik P. Plant CULLIN-based E3s: phytohormones come first // FEBS Lett. 2005 Jun 13;579(15):3239-45. Epub 2005 Mar 13. Review.

112. Toledo-Ortiz G, Huq E, Quail PH. The Arabidopsis basic/helix-loop-helix transcription factor family // Plant Cell. 2003 Aug; 15(8): 1749-70.

113. Thomashow MF. PLANT COLD ACCLIMATION: Freezing Tolerance Genes and Regulatory Mechanisms // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1999 Jun;50:571-599

114. Thomashow MF. So what's new in the field of plant cold acclimation? Lots! //Plant Physiol. 2001 Jan;125(l):89-93.

115. Tomilova NB, Tomilov AA, Ogarkova OA, Tarasov VA. Identification of mutant gene responsible for cotyledons necrosis in developing seedlings of Arabidopsis thaliana //Genetika. 2001 Apr;37(4):494-503. Russian.

116. Vaucheret H, Beclin C, Fagard M. Post-transcriptional gene silencing in plants // J Cell Sci. 2001 Sep;l 14(Pt 17):3083-91. Review.

117. Vaucheret H. MicroRNA-dependent trans-acting siRNA production // Sci STKE. 2005 Sep 6;2005(300):pe43. Review.

118. Vazquez-Tello A, Ouellet F, Sarhan F. Low temperature-stimulated phosphorylation regulates the binding of nuclear factors to the promoter of Wcsl20, a cold-specific gene in wheat // Mol Gen Genet. 1998 Jan;257(2): 157-66.

119. Verma NK, Dey CS. RNA-mediated gene silencing: mechanisms and its therapeutic applications // J Clin Pharm Ther. 2004 0ct;29(5):395-404. Review.

120. Vijay-Kumar, S., Bugg, С. E., Cook, W. J.Ubiquitin structure reference-Structure of ubiquitin refined at 1.8 A resolution // J Mol Biol 1987,194 pp. 531

121. Vogel J.T. CBF cold response pathway // CAB international 2006. Cold Hardiness in plantsA molecular genetics, Cell Biology and Phisiology144)

122. Voinnet O. RNA silencing as a plant immune system against viruses // Trends Genet. 2001 Aug;17(8):449-59. Review.

123. Wang L, Dong L, Zhang Y, Zhang Y, Wu W, Deng X, Xue Y. Genome-wide analysis of S-Locus F-box-like genes in Arabidopsis thaliana // Plant Mol Biol. 2004 Dec;56(6):929-45. Epub 2005 Apr 7.

124. Wang M., Waterhi\ouse P.M., Application of gene silencing in plants // current Opinion in Plant Biology, 2001, 5: 146-150

125. Wassenegger M, Pelissier T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants // Plant Mol Biol. 1998 May;37(2):349-62. Review.

126. Winston JT, Koepp DM, Zhu C, Elledge SJ, Harper JW. A family of mammalian F-box proteins // Curr Biol. 1999 Oct 21;9(20):1180-2.

127. Wray GA. Transcriptional regulation and the evolution of development // Int J Dev Biol. 2003;47(7-8):675-84. Review.

128. Xiao W, Jang J. F-box proteins in Arabidopsis // Trends Plant Sci. 2000 Nov;5(l l):454-7

129. Xin Z, Mandaokar A, Chen J, Last RL, Browse J.Arabidopsis ESK1 encodes a novel regulator of freezing tolerance // Plant J. 2007 Mar;49(5):786-99.

130. Xue GP. Characterisation of the DNA-binding profile of barley HvCBFl using an enzymatic method for rapid, quantitative and high-throughput analysis of the DNA-binding activity // Nucleic Acids Res. 2002 Aug 1 ;30(15):e77.

131. Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature, or high-salt stress // Plant Cell. 1994 Feb;6(2):251-64.

132. Zanetti M. The role of cathelicidins in the innate host defenses of mammals // Curr Issues Mol Biol. 2005 Jul;7(2): 179-96.

133. Zanetti M, Gennaro R, Romeo D Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain // FEBS Lett 1995;374:1-5.

134. Zhao D, Ni W, Feng B, Han T, Petrasek MG, Ma H. Members of the Arabidopsis-SKPl-like gene family exhibit a variety of expression patterns and may play diverse roles in Arabidopsis // Plant Physiol. 2003 Sep;133(l):203-17.

135. Zhu J, Dong CH, Zhu JK.Interplay between cold-responsive gene regulation, metabolism and RNA processing during plant cold acclimation // Curr Opin Plant Biol. 2007 Jun;10(3):290-5. Epub 2007 Apr 30.

136. Zhu B, Choi DW, Fenton R, Close TJ. Expression of the barley dehydrin multigene family and the development of freezing tolerance // Mol Gen Genet. 2000 Sep;264(l-2): 145-53.

137. Ziros P., Papavassiliou Eukaryotic gene regulation: a flew over the transcription factor nesr // Haema 2001; 4(1): 15-23

Информация о работе

Фурсова, Оксана Васильевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы