Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического контроля передачи гиббереллинового сигнала у Arabidopsis thaliana

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического контроля передачи гиббереллинового сигнала у Arabidopsis thaliana"

На правах рукописи

Склярова Ольга Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПЕРЕДАЧИ ГИББЕРЕЛЛИНОВОГО СИГНАЛА У АгаЫ(1ор$1$ Оий'шпа

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена на кафедре генетики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук Ежова Татьяна Анатольевна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Коф Элла Михайловна

кандидат биологических наук Огаркова Ольга Александровна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится «/^» 2006г. в _ч. на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (095) 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3.

Автореферат разослан « ^ » Сг.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Работа посвящена изучению генетической регуляции гормональных сигнальных путей, управляющих ростом стебля у модельного растительного объекта арабидопсис (Arabidopsis thaliana). Исследования в этой области представляют актуальную научную задачу современной генетики и биологии развития. Важнейшим классом фитогормонов, контролирующих различные процессы онтогенеза у растений (прорастание семян, рост стебля, инициация цветения), являются гиббереллины (ГА). В настоящее время у A. thaliana и некоторых других видов растений хорошо изучены гены, контролирующие основные этапы биосинтеза гормона. Значительно меньше известно о регуляции процессов передачи ГА сигнала. Так, выявлено несколько генов, кодирующих негативные регуляторы передачи сигнала {GAI, RGA, SPY1), однако, мало известно о генах — позитивных регуляторах этого процесса и не идентифицирован рецептор ГА. Процессы прорастания семян и рост стебля контролируются и другими гормонами, в частности брассиностероидами. Механизмы взаимодействия различных сигнальных путей практически не изучены. Получение и анализ мутантов с нарушением роста стебля и чувствительности к гормонам является эффективным подходом для выявления недостающих компонентов передачи гормонального сигнала, а также координации действия разных гормонов.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось генетическое и морфофизиологическое изучение мутантов па, spy2, le-2 из коллекции кафедры генетики МГУ, а также создание схемы генетического контроля передачи гиббереллинового сигнала у Arabidopsis thaliana на основе анализа генных взаимодействий и изучения экспрессии генов.

Задачи исследования:

1. Морфофизиологический и генетический анализ мутантов из коллекции кафедры генетики МГУ.

2. Локализация генов NA и SPY1 на генетической и физической карте A. thaliana с использованием морфологических и ДНК-маркеров.

3. Изучение взаимодействия генов NA и SPY2 с другими генами, контролирующими рост побега, на основе анализа фенотипа двойных мутантов.

4. Анализ экспрессии генов биосинтеза ГА и генов, контролирующих рост побега, в растениях мутанта па.

Научная новизна. Выявлены два новых компонента пути передачи ГА сигнала — гены ЫА и БРУ2 и впервые установлено, что один из генов (ЛТА) обеспечивает взаимодействие ГА и брассиностероидного сигнала, влияя на уровень экспрессии гена биосинтеза гиббереллина йЛ4 и гена биосинтеза брассиностероидов Б\УР51ЬЕ. Показано, что ген ЫА контролирует одновременно растяжение клеток междоузлий и деление клеток апикальной меристемы побега.

На основании изучения генных взаимодействий впервые установлено, что гены А'А и С¿VI, СЬУ2, СЬУЗ участвуют в последовательных процессах, связанных с ограничением пула клеток апикальной меристемы побега.

С использованием морфологических маркеров и ДНК-маркеров установлено место локализации гена АТА на молекулярно-генетической и физической карте хромосомы 1 А. /ЬаИапа.. Эти сведения открывают возможность для последующего позиционного клонирования гена №4.

Построена новая схема передачи ГА сигнала у А. МаИапа с участием генов Ш, БРУ2 и П1УГ5/ЬЕ.

Научно-практическая значимость работы. Данные, представленные в диссертационной работе, имеют большое практическое значение, поскольку рост стебля является одним из наиболее важных признаков в селекции растений. Выявление новых компонентов сигнальных путей и изучение их взаимодействия с ранее идентифицированными генами позволяет искать оптимальные пути для управления процессами роста и создания новых форм устойчивых к полеганию хозяйственно ценных растений.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены: на VII молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2000г.); I научной конференции памяти Грегора Менделя (Москва, 2001г.); 2-й конференции МОГиС им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003 г.), на XVI школе по биологии развития (Звенигород, 2005г.), на семинаре кафедры генетики МГУ (протокол № 0406, 2006г.), на межлабораторном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" (ИОГен им. Н.И. Вавилова, 200бг).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на '¿¿-iстраницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы, включающего 'Zfù&l источников. Работа содержит рисунков и Jтаблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№01-0449191; №04-04-49643), ФЦНТП "Интеграция" (№2.1-А0075), "Приоритетные направления генетики", "Научные школы" (№00-15-97791; №4202.2006.4).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал и условия выращивания. В работе использованы линии A. thaliana из коллекции кафедры генетики МГУ (Янушкевич, 1985): К-164 (мутанты na, spy2), К-156 (мутант le-2), К-102 (мутант asi). Для генетического анализа использовалась маркерная линия mmlL из коллекции института Генетики растений г. Гатерслебен (Германия). Для изучения взаимодействия генов использовались мутанты из международного банка семян NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Center) (мутанты ga3, ga5, gai, spyl, elvi, clv2, clv3). Растения выращивали при 16-часовом (ДД) или 8-часовом (КД) фотопериоде при интенсивности освещения 4000 лк.

Морфологический анализ. Все измерения проводились на 10-30 растениях A. thaliana 4-8 недельного возраста. Исследования структуры апикальных частей цветоносов и измерение размера эпидермальных клеток проводили на изображениях, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии. В исследовании использовали СЭМ S-450A фирмы "Hitachi" (Япония) с ускоряющим напряжением 15 кВ.

Тесты на чувствительность к гормонам и паклобутразолу (ПБЗ). Изучение чувствительности растений к иафтилуксусиой кислоте (НУК), бензиламинопурину (БАП), эпибрассинолиду (ЭБР): анализировали длину корней и гипокотилей 7-дневных проростков, выращенных на средах с различными концентрациями каждого из гормонов: 0,01-10 мкМ НУК и БАП, 0,0001 - 10 мкМ — ЭБР. Влияние ГА на всхожесть семян: использовали семена трех типов с растений, выращенных в почве в условиях теплицы: 1) недозрелые семена из зелено-желтых стручков; 2) недозрелые семена из желтых стручков; 3) покоящиеся семена из подсохших стручков. Семена всех

типов высаживали на 10 мкМ раствор гибберелловой кислоты. Учет всхожести проводили на 10-е сутки. Влияние ГА на рост стебля: растения выращивали в почве в условиях теплицы и, начиная со стадии 4-листной розетки, ежедневно опрыскивали 50 мкМ раствором гибберелловой кислоты в течение месяца. Влияние ПБЗ на прорастание семян и рост стебля: анализировали растения, выращенные на среде, содержащей ПБЗ в концентрации 0.1 мкМ.

Изучение экспрессии генов. Для анализа экспрессии генов использовали полуколичественный метод оценки уровня мРНК в растениях — метод ПЦР продуктов обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Выделение РНК проводили с использованием кита фирмы «Qiagen» (США) по протоколу фирмы-производителя. Для синтеза первой цепи кДНК использовали реактивы и протокол фирмы «Силекс». Анализировали выход продукта при разных циклах амплификации с использованием праймеров к консервативным участкам исследуемых генов. Для контроля за количеством выделенной мРНК анализировали транскрипцию гена АРТ1 (аденинфосфорибозил-трансфераза), характеризующегося конститутивной экспрессией в растениях A. thaliana (Cowling et al., 1998). Относительный уровень транскрипции исследуемого гена определяли по Лебедевой, 2004 г.

Генетическое картирование с использованием морфологических маркеров. Для обнаружения сцепления генов использовали метод разложения х2 на компоненты (Серебровский, 1970). Частоту рекомбинации определяли методом произведений (Серебровский, 1970). Для преобразования % рекомбинации в сМ использовали функцию Косамби (Захаров, 1979).

Генетическое картирование с использованием ДНК-маркеров.

Использовали CAPS-маркеры, выявляющие рестрикционный полиморфизм амплифицированных фрагментов, и SSLP-маркеры, выявляющие полиморфизм длин простых повторяющихся последовательностей в геноме растений. Выделение ДНК проводили по методу Dellaporta et al. (1983). Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали праймеры, синтезированные в фирмах «Синтол» и «Евроген» (Россия), реактивы и протоколы фирмы «Силекс» (Россия). Для рестрикционного анализа использовали эндонуклеазы рестрикции, синтезированные в фирме "Сибэнзим" (Россия). Анализ продуктов ПЦР и рестрикции проводили с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле с

использованием электрофоретической камеры фирмы "Хеликон" (Россия). Частоту рекомбинации рассчитывали по формуле Koornneef, Stam (1987).

Морфологический анализ мутантов па и ъру2. В потомстве гетерозигот по полудоминантной карликовой мутации папа (па) наряду с высокими растениями можно выделить 2 типа карликов (гетерозиготных и гомозиготных растений по мутации па) (рис.1). У гетерозиготных растений формируется 5-10 побегов одинаковой высоты, они зацветают и дают семена. Гомозиготные растения обладают пониженной жизнеспособностью и плодовитостью (число гомозигот, дающих семена в условиях теплицы, составляет не больше 10% от всей популяции).

Известно, что практически все гиббереллиновые и брассиностероидные карликовые мутанты имеют не только укороченный стебель, но и укороченный в 2-3 раза гипокотиль за счет уменьшения длины клеток (С1оизе е1 а1., 1996). Однако сравнение длины гипокотиля и размера его клеток не показало наличие существенных различий у растений дикого типа и мутантов па.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

а)

Рисунок 1. а) растения дикого типа; б) гетерозиготные растения по мутации па; в) гомозиготные растения по мутации па.

Микроскопический анализ размера и числа клеток стебля показал, что эпидермальные клетки междоузлий мутантных растений значительно мельче (в 23 - 27 раз), чем у дикого типа, а их число примерно в 3 раза выше, чем у растений дикого типа. Следовательно, наблюдаемое у мутанта па уменьшение длины цветоноса связано исключительно с уменьшением размера составляющих их клеток. Размер эпидермальных клеток всех латеральных органов (листьев, цветоножек, всех органов цветка) мутанта па не отличался от таковых у дикого типа. Таким образом, действие гена ИА проявляется только на тканях стебля.

Мутант па характеризуется нарушением апикального доминирования и снижением числа узлов цветоносов, что является следствием нарушения развития апикальной меристемы побега (АМ). У гомозигот по мутации па после формирования нескольких цветков нормальной морфологии и фертильных стручков пул клеток АМ истощается и АМ прекращает пролиферацию. Уменьшение пула клеток АМ в 2-3 раза по сравнению с АМ растений дикого типа наблюдается и для гетерозигот по мутации па. Поскольку размер клеток АМ мутантов и растений дикого типа одинаков, уменьшение размера АМ у мутанта па связано с уменьшением числа клеток АМ. Таким образом, неспособность карликового мутанта к поддержанию постоянного пула клеток АМ цветоноса свидетельствует о нарушении у мутанта процессов деления клеток АМ или о нарушении механизмов поддержания АМ в недифференцированном состоянии. Нарушение этих процессов характерно для мутантов с отсутствием активности гомеобоксных НОХ-генов ГШ (¡УиЗСИЕЬ), БТМ (ЗНООТМЕШБТЕМЬЕБЗ) (ЬепЬагс! е1 а1„ 2002), а также трансгенных растений с высокой экспрессией гена СЬУЗ (СЬАУАТАЗ) (Вгапс! е1 а1., 2000),. Однако мутант па имеет ряд значимых отличий от всех этих форм: у него не наблюдается изменения морфологии цветков, но он характеризуется укорочением междоузлий из-за существенного нарушения растяжения клеток. Таким образом, мутант па характеризуется плейотропными изменениями ряда признаков, сочетание которых является уникальным.

Рецессивная мутация яртс11у2 ($ру2) вызывает удлинение междоузлий и приводит к более светлой окраске листьев. По сравнению с растениями дикого типа у мутанта наблюдается достоверное удлинение вегетативных (у дикого типа - 2,1 ±0,17 см, у мутанта - 3,3±0,23 см) и генеративных

междоузлий (у дикого типа - 0,7±0,04 см, у мутанта - 1,0±0,1 см), а также увеличение общей высоты цветоноса мутантных растений (у дикого типа -15,5±1,04, у мутанта - 21,6±1.06). Выявлено также небольшое уменьшение числа розеточных листьев (у дикого типа - 7,1±0,38, у мутанта - 6,1±0,17). Точно такие же особенности онтогенеза побега и светло-зеленый цвет листьев характерны для изученных ранее мутантов А. thaliana spyl, конститутивно экспрессирующих ГА-ответ (Silverstone et al., 1997). Однако, в отличие от мутантов spyl, длина гипокотиля мутанта spy2 не отличается от длины гипокотиля проростков дикого типа, и у мутантов spyl никогда (ни в условиях теплицы, ни в пробирках) не наблюдали более раннего зацветания по сравнению с диким типом (они зацветали одновременно или чуть позже, чем растения дикого типа расы Enkheim).

Анализ физиологической природы мутаций па и sp\>2. Фенотип мутантов па и spy2 характерен для мутантов с нарушением биосинтеза или передачи фитогормонального сигнала, в связи с этим были проведены различные физиологические тесты. Анализ чувствительности к ауксину (ИУК) и цитокинину (БАП) не выявил различий между проростками растений дикого типа и гомозигот по мутации па. Чувствительность гипокотилей проростков мутанта па к эпибрассинолиду (ЭБР) также не была изменена, однако на среде с концентрацией ЭБР 0,001мкМ наблюдали восстановление роста корня карликового мутанта.

В данной работе был проведен анализ чувствительности мутанта па к ГА на разных стадиях онтогенеза. Обработка стебля гомозигот по мутации па экзогенным ГА не приводила к растяжению клеток междоузлий и увеличению числа узлов. Следовательно, клетки цветоноса мутанта па обладают пониженной чувствительностью к ГА. При ежедневной обработке ГА у мутанта па наблюдали образование наплывов и утолщение стебля, что, по-видимому, связано с активацией интеркалярных меристем. Увеличение длины стебля при этом не наблюдали. Таким образом, у А. thaliana активность интеркалярной меристемы вносит минимальный вклад в увеличение длины междоузлий, и рост стебля определяется главным образом исходным пулом клеток, который зависит от активности AM побега и способности клеток к растяжению.

Нечувствительность мутанта па к экзогенному ГА была показана и на стадии прорастания семян. Семена с растений расы Enkheim и гетерозигот по

мутации па не были способны всходить на среде без ГА. При добавлении гормона значительно повышалась всхожесть семян дикого типа, повышение всхожести семян карликового мутанта было незначительным (рис.2).

■ недозрелые семена из зелено-желтых стручков

□ недозрелые семена из желтых стручков

□ покоящиеся семена

Рисунок 2. Влияние экзогенного ГА на всхожесть недозрелых и покоящихся семян.

Мутанты нечувствительные к ГА характеризуются также нечувствительностью и к ингибитору биосинтеза ГА паклобутразолу (ПБЗ), снижающему уровень эндогенного ГА. Выращивание растений дикого типа в присутствии ПБЗ приводит к существенному снижению (в 3 раза) длины цветоносов этих растений (табл.1). У мутанта па снижение длины цветоносов на среде с ПБЗ незначительное (табл.1). Эти данные свидетельствуют о том, что в отличие от мутанта па клетки цветоноса растений дикого типа обладают высокой чувствительностью к уровню эндогенного ГА. Однако выращивание растений в присутствии ПБЗ приводит к более темной окраске листьев как у растений дикого типа, так и у мутантных растений (табл.1). У высоких и карликовых растений наблюдается незначительное увеличение числа розеточных листьев, время до цветения увеличивается в среднем на 10 дней, сокращается длина стручка (табл.1). Это свидетельствует о том, что ПБЗ значительно задерживает цветение у обоих генотипов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что

нечувствительностью к ПБЗ, а соответственно и к уровню эндогенного ГА, у мутанта па обладают только клетки междоузлий и АМ цветоноса, но не клетки латеральных органов.

Мутант $ру2 также обладает пониженной чувствительностью к паклобутразолу: на среде с ПБЗ снижение длины цветоносов мутанта не наблюдается (различия недостоверны) (табл.1).

Таблица 1. Влияние ПБЗ на рост растений дикого типа и мутантов па и

Признаки Дикий тип

Контроль среда с ПБЗ % от контроля

Высота цветоноса (см) 20.3+1.1 5.9Ю.5*** 29.1

Число вегетативных узлов 2.6Ю.2 2.010.1 * 76.9

Число генеративных узлов 7.410.5 З.ЗЮ.2*** 44.6

Длина вегетативного междоузлия (см) 3.1 ¿0.2 1.6Й.1*** 51.6

Длина генеративного междоузлия (см) 1.4+0.1 1.2Ю.1 85.7

Длина стручка (мм) 10.6+0.5 8.8Ю.4*** 83

Число листьев розетки 5.0Ю.4 6.5Ю.З* 130

Время до цветения (дни) 19+2 2813* 147

Окраска листьев зеленая темно-зеленая -

Мутант па

контроль среда с ПБЗ % от контроля

Высота цветоноса (см) 3.3+0.4 З.ОЮ.З 90.9

Длина стручка (мм) 12.5+0.36 6.1+0.26*** 48.8

Число листьев розетки 6.3Ю.4 7.5Ю.5 119

Время до цветения (дни) 3014 4314* 143.3

Окраска листьев зеленая темно-зеленая -

Мутант ¡ру 2

контроль среда с ПБЗ % от контроля

Высота цветоноса (см) 4.310.9 4.8Ю.5 111.6

Число листьев розетки 5.510.9 5.8Ю.5 105.5

Окраска листьев светло-зеленая зеленая -

Примечание. *,*** -средние величины растений, выращенных на среде Квитко с ПБЗ, достоверно отличаются от показателей растений, выращенных на контрольной среде Квитко при уровнях значимости Р>0.95, Р>0.999, соответственно.

Мутант $ру2 демонстрирует нечувствительность к уровню эндогенного ГА и на стадии прорастания семян. Всхожесть семян мутанта на среде с ПБЗ достигала почти 100%, тогда как семена растений дикого типа практически не всходили (рис.3).

120

Рисунок 3. Динамика прорастания семян на среде с паклобутразолом.

.....♦ Д.т

-spy2

Анализ аллелизма и генных взаимодействий. Для изучения аллелизма полудоминантных мутантов па и gai был исследован фенотип гибридов F1 и F2 поколений от реципрокных скрещиваний мутантов. В F2 поколение выщеплялись как карликовые растения фенотипа па и gai, так и ратения дикого типа. Двойные мутанты па gai имели карликовый фенотип, характерный для гетерозиготного мутанта па: в отличии от мутанта gai, у которого главный побег всегда опережает в развитии дополнительные розеточные побеги, у гибридов наблюдали формирование 5-10 побегов одинаковой высоты как у мутанта па. Эти данные свидетельствуют о том, что мутации па и gai не аллельны, и мутация па затрагивает новый ген, определяющий чувствительность растений к ГА. Расщепление в F2 и фенотип двойных мутантов свидетельствуют об эпистатическом (доминантный эпистаз) взаимодействии генов NA и GAI в регуляции роста стебля.

Анализ взаимодействия гена NA с геном SPY1 показал эпистаз мутации па над мутацией spyl по признаку роста цветоноса: двойные гомозиготные

мутанты па spyl имели светло- зеленую окраску листьев и удлиненный гипокотиль, свойственные мутанту spyl, но характеризовались карликовостью и нарушением апикального доминирования, как мутант па.

Эпистаз гена NA над генами GAI и SPY1 в регуляции роста стебля и тот факт, что все три гена регулируют чувствительность к ГА (ГА-ответ), позволяют предположить, что продукты данных генов контролируют одну цепь передачи фитогормонального сигнала.

Анализ взаимодействия гена NA с генами CLV1, CLV2, CLV3, контролирующими размер AM побега, показал, что мутации elvi, clv2, clv3, приводящие к существенному увеличение размера AM (Clark et al., 1995), не способны увеличить размер AM и ее пролиферативную способность у двойных мутантов (двойные мутанты па elvi, clv2, clv3 имели то же число листьев и ту же структуру цветоноса, что и мутант па). Взаимодействие генов NA и CLV1, CLV2, CLV3 можно трактовать как эпистатическое и предполагать, что гены NA и CLV1, CLV2, CLV3 участвуют в последовательных процессах, связанных с ограничением пула AM.

Анализ взаимодействия гена SPY2 с генами NA и GA3, GAS установил, что мутация spy2 способна частично восстанавливать карликовый фенотип мутанта па, нечувствительного к ГА и фенотип мутантов с нарушенем биосинтеза ГА (ga3, gaJ). Анализ двойного мутанта spy2 па показал, что на фоне гомозиготной мутации spy2 высота цветоноса увеличивалась в 2 раза у гетерозиготных и гомозиготных по мутации па растений и более чем в 2 раза увеличивается урожайность растений, гетерозиготных по мутации па.

Двойные мутанты spy2 ga5 и spy2 ga3 характеризовались увеличением общей высоты растений примерно в 2 раза по сравнению с высотой карликовых растений ga5 и ga3 за счет увеличения длины междоузлий (табл.2). Известно, что мутация по гену SPY1, негативно регулирующему передачу ГА сигнала, подавляет проявление карликовости как мутанта gal с нарушенным биосинтезом гиббереллина (Jacobsen, Olszewski, 1993), так и мутанта gai, нечувствительному к ГА (Peng et al., 1997). Это свидетельствует о том, что ген SPY2, также как и ген SPY1, участвует в негативной передаче ГА - сигнала.

Таблица 2. Морфологический анализ двойных мутантов spy2 ga3 и spy2 ga5.

Генотип Число побегов Общая высота цветоноса (см) Средняя длина 1 -го вегетативного междоузлия (см) Средняя длина 1-го генеративного междоузлия (см)

spy2 liO.O 15.4Ю.61 4.1 ±0.4 0.35Ю.034

spy2ga5 310.38 24.7Jfl.65*** 5.210.21*** 0.35Ю.022

ga5 З.Ш.З 9.6Ю.ЗЗ 1.210.23 0.47Ю.076

spy2 ga3 2.9ИЭ.2 20.llfl.56 3.1Ю.34*** 0.83Ю.1***

ga3 2.9+0.18 9.7JÛ.6 1.53Ю.13 0.4Ю.03

Примечание: *** - средние величины двойных мутантов spy2 ga5 и spy2 ga3 достоверно отличаются от средних величин мутантов ga5 и ga3, соответственно, при уровне значимости Р>0.999.

Анализ экспрессии генов. контролирующих биосинтез гиббереллинов и брассиностероидов, и генов, контролирующих рост побега в карликовом мутанте па. Известно, что у мутантов нечувствительных к ГА снижен уровень экспрессии генов биосинтеза ГА (Silverstone et al., 2001). Анализ экспрессии гена GA4, кодирующего ключевой фермент биосинтеза ГА - Зр гидроксилазу, осуществляющий образование активной формы гиббереллина ГА4, показал значительное снижение количества транскрипта этого гена в мутантных растениях по сравнению с растениями дикого типа (рис.4). Количество продукта ОТ-ПЦР контрольного гена АРТ1 (а значит и содержание исходной мРНК) у растений дикого типа и гетерозигот по мутации па было одинаковым (рис.4). Следовательно, разница в содержание кДНК гена GA4 в растениях дикого типа и мутанта па являлась результатом разного уровня его экспрессии. Т.к., уменьшение концентрации исходной матрицы в 2 раза приводит к появлению амплифицированного продукта нужной концентрации на 1,5 цикла позднее (Лебедева, 2004г), то концентрация мРНК гена G A4 в мутантных растениях снижена примерно в 10 раз (рис.4). Таким образом, ген NA, контролирующий передачу ГА-сигнала, также как ген GAI, участвует в процессе авторегуляции содержания ГА.

Мутант 1е-2 из коллекции кафедры генетики МГУ — полукарлик, характеризующийся значительным укорочением длины междоузлий и гипокотилей, связанным с уменьшением длины составляющих их клеток, у которого нарушен биосинтез брассиностероидов (Лебедева, Склярова, Ежова, 2004). Ген ЬЕ (01УР5) кодирует стеролредуктазу - один из ферментов биосинтеза брассиностероидов (СЬое ^ а1., 2000) и является позитивным регулятором процесса растяжения клеток междоузлий. В работе, проведенной совместно с Лебедевой О.В., было показано, что мутантный ген 1е-2 практически полностью эпистатировал мутантный ген па, что проявлялось не только на уровне морфологии по восстановлению апикального доминирования, увеличению длины междоузлий, морфологии и цвету листьев, но и на клеточном уровне (Лебедева, Склярова, Ежова, 2004). Анализ экспрессии гена ВУУГ5 в мутанте па выявил снижение количества мРНК этого гена в карликовых растениях по сравнению с растениями дикого типа примерно в 8 раз (рис.4). Эти данные свидетельствуют о том, что гены ЫА и ЬЕ участвуют в одном процессе роста междоузлий цветоноса, причем продукт гена ЫА подавляет экспрессию гена ЬЕ, отвечающего за растяжение клеток междоузлий.

Таким образом, ген ЫА участвует в координации гиббереллинового и брассиностероидного сигналов, подавляя одновременно транскрипцию генов биосинтеза гиббереллинов (<ЗА4) и брассиностероидов (В!УГ5/ЬЕ).

В связи с тем, что мутант па характеризуется уменьшенным размером апикальной меристемы (АМ), был проведен анализ транскрипции генов, контролирующих развитие АМ побега, в мутанте па. Уровень экспрессии гена СЬУ1, ограничивающего пул стволовых клеток АМ, в карликовых мутантах не изменен (рис.4). Эпистатическое взаимодействие между генами МА и СЬУ], наблюдаемое при скрещивании мутантов по этим генам, по-видимому, происходит на посттранскрипционном уровне.

Анализ экспрессии генов БТМ и И7^, контролирующих формирование и поддержание пула стволовых клеток АМ побега, показал, что уменьшение пула клеток АМ у мутанта па не связано с нарушением транскрипции этих генов (рис.4). Следовательно, ген ЫА не участвует в регуляции поддержания клетками АМ побега меристематической активности.

Ген АРТ1 число циклов

Д.т.

32 36 40

ИАпа

32 36 40

Ген вА4 число циклов

ЯРЧМЧЙ

32 36 40

32 36 40

Ген В\УР5/ЬЕ число циклов

28 32 36

28 32 36

Ген С1У1 число циклов

36 40

36 40

Ген БТМ число циклов

.....I

32 36 40

32 36 40

Ген ШиБ ■ число циклов

36 40 44

36 40 44

Рисунок 4. Анализ транскрипции генов С А 4, В1УР5/ЬЕ, СЬУ1, 5ТЛ/, IV иЯ в растения дикого типа и мутантах па методом ОТ-ПЦР.

Генетический анализ. Для локализации сцепленных мутаций па и spy 2 на классической генетической карте A. thaliana был проведен анализ F2 (выборка составила около 2500 ратений) и F3 (выборка составила около 2000 растений) поколений от скрещивания мутантов па и spyT. с растениями, маркированными множественными морфологическими мутациями, который выявил сцепленное наследование мутаций па и spy2 с морфологическими маркерами верхнего плеча хромосомы 1 (мутации an - суженный лист, мутация disl - аномальные трихомы). С помощью анализа расщепления было установлено, что ген NA локализован в положении 3,5 сМ, а ген SPY2 - в положении 14,5 сМ генетической карты хромосомы 1 (рис.5).

-3.5-

14.4 •

- 12.24 • 14.5 -

AN NA

SPY2 DIS1 GAI

0 19 22

Рисунок 5. Генетическая карта левого плеча хромосомы 1 А. (ИаИапа. Сверху указаны расстояния, полученные в данной работе с помощью генетического анализа; снизу указаны расстояния на классической генетической карте (ЬИр//\тлу.агаЫс1ор51з.о^).

Для локализации гена №4 на молекулярно-генетической и физической картах A. thaliana использовали CAPS и SSLP - маркеры, расположенные в районе локализации мутации па. Анализ F2 поколения от скрещивания линии К-2 и гетерозигот по исследуемой мутации показал тесное сцепление с маркерами РТ14, РТ15 (рекомбинантов обнаружено не было) и 0846А (обнаружен 1 рекомбинант). Расстояние между мутацией па и маркером 0846А составило 1.0 сМ или 250 т.п.н. Следовательно, ген NA должен находиться на физической карте примерно в области от 1360 т.п.н до 1410 т.п.н, соответствующей ВАС-клонам F13M7 (на левом конце клона находится РТ14), Т7А14 (на левом конце содержит РТ15), YUP8H12 (РТ15 на

правом конце) (рис.6). Наиболее вероятное место положения гена Ь'А - клоны Р13М7 и Т7А14.

NF21B7

SM237_110,8 NT1G11

F21B7-1334 SM250_267,1

SM46_137,8 SM14S_3S7,6

f)F20D22 SM19_168,2

¡SM53_187,8

PEX6_139A1 MASC06229 SGCSNP17463

SCCSNP9622 s

PEX6_119F5 MASC03690

s s

PEX6_186D8 MASC03694

s S

BKN000000131 SCCSNP9623 s *

BKN000000132 SCCSNP9624

S s

BKN000Q00192

S

BKN000000193

s

8KN000000194

s

MASC07283

s

MASC07282I

s

BKNOOC

s

1,000,000 '

! F22D16 , a

003

ш

(0846A)

(PT141

a

^ZlHll

ИПСП-

VUP8H12 F3F2(

(PT16)1- ' 1

"mu mm

,f?0P22

NA

Рисунок 6. Локализация гена ЫА на физической карте А. ЛаНапа (выделены ВАС-клоны, с локализованными в них ДНК-маркерами; показано местоположение генаЛС4 в районе 1360-1410 т.п.н физической карты) (www.arabidopsis.org)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы выявлены новые гены NA и SPY2, которые участвуют в передачи ГА-сигнала у A. thaliana. Морфологические особенности мутанта па и его нечувствительность к ГА вместе с данными о доминантном характере наследования карликовости свидетельствует о том, что ген NA, как и ранее идентифицированные гены GAI, SPYI, RGA в растениях дикого типа участвует в негативной регуляции передачи ГА-сигнала. В то же время мутант па существенно отличался от всех описанных ранее карликовых мутантов тем, что у него наблюдались изменения только отдельных, а не всех ГА-регулируемых процессов. Мутант имел нормальную длину гипокотилей, фертильность цветков и плодовитость стручков, у него практически не наблюдалось задержки перехода на репродуктивную стадию развития. У мутанта па не наблюдалось также уменьшения длины клеток гипокотиля, стебля, стручков. Таким образом, мутация па вызывает менее широкий круг плейотропных эффектов, чем мутации в генах GAI, SPYI, которые также являются негативными регуляторами передачи ГА-сигнала.

Эти данные свидетельствуют о том, что продукт гена NA контролирует участки цепи передачи ГА-сигнала после генов GAI, RGA, SPY1 (рис.7). В пользу участия гена NA в единой цепи передачи ГА-сигнала свидетельствует эпистаз гена па над генами gai и spy!.

Мутант spy2 имеет светло-зеленую окраску листьев, удлиненный стебель, характеризуется повышенной устойчивостью к паклобутразолу (ПБЗ) как на стадии прорастания семян, так и на стадии выметывания цветоноса. Эти признаки характерны для мутанта с конститутивным ответом к ГА, spyl (Jacobsen and Olszewski, 1993; Jacobsen et al., 1996). Рецессивный характер наследования мутации spy2 и фенотип мутантного растения говорят о том, что данный ген участвует в негативной регуляции передачи ГА-сигнала. Об этом говорит и эпистаз гена spy2 над геном gai, негативно регулирующим передачу ГА-сигнала, и исследуемой мутацией па. Кроме того, ген spy2 частично эпистатирует мутантные гены ga3 и ga5, восстанавливая карликовость, вызванную нарушением синтеза гиббереллина. Эти данные позволяют предположить, что ген SPY2 контролирует участки цепи передачи ГА-сигнала до или после генов GAI, RGA, SPY1 (рис.7).

Исследования показали, что мутация па блокирует одновременно растяжение клеток междоузлий и деления клеток AM побега, то есть два главных ГА-зависимых процесса, обеспечивающих рост цветоноса. Продуктом гена NA, по-видимому, является регуляторный белок, способный одновременно контролировать экспрессию разных генов. Так, ген NA участвует в регуляции транскрипции гена биосинтеза гиббереллинов - G A4. Кроме того, продукт гена NA подавляет экспрессию гена биосинтеза брассиностероидов - DWF5/LE, который отвечает за растяжение клеток междоузлий. Об этом свидетельствует и восстановление роста корня мутанта па под влиянием экзогенного эпибрассинолида (ЭБР). Таким образом, ген NA участвует в координации гиббереллинового и брассиностероидного сигналов.

Отсутствие влияния мутации па на латеральные органы свидетельствует о том, что ген NA экспрессируется только в клетках главной оси. Это приводит к формированию укороченного побега - розетки на вегетативной стадии развития. При переходе растений на генеративную стадию, который осуществляется при участии ГА-сигнала, негативная регуляция гена NA, по-видимому, снимается либо в результате того, что ГА снимает негативное действие белка NA, либо за счет того, что ГА запрещает экспрессию гена NA.

Активные клеточные деления в АМ побега и последующее растяжение клеток приводят к формированию цветоноса.

Гены биосинтеза ГА: G Al, GA2, G A3, GA4, GAS

активный гиббереллин

индукция цветения

т

GAI, RGA, SPY1, SPY2*

т

M41

ГА4

DWFS/LE*

развитие генеративных органов содержание хлорофилла в листьях

растяжение клеток гнпокотиля

растяжение клеток междоузлий

деление клеток AM прорастание семян

Рисунок 7. Схема передачи ГА-сигнала у A. thaliana.. Жирным шрифтом отмечены гены, исследованные в данной работе, * отмечены новые компоненты передачи ГА-сигнала.

С использованием морфологических маркеров гены NA и SPY2 локализованы в верхнем плече хромосомы 1 A. thaliana.. Установлено, что ген NA тесно сцеплен с CAPS-маркерами 0846А, РТ14 и SSLP-маркером РТ15 и находится на физической карте в районе 1360-1410 т.п.н, соответствующем ВАС-клонам F13M7 и Т7А14. Эти сведения открывают возможность для последующего позиционного клонирования гена/Л4.

Таким образом, морфофизиологический и генетический анализ мутантов по генам NA и SPY2 A. thaliana показал, что это новые гены, контролирующие чувствительность к гиббереллину. Изучение генных взаимодействий говорит об участии этих генов в негативной передаче ГА-сигнала и контроле жизненно важных процессов развития растений, наряду с ранее идентифицированными генами GAI, RGA, SPY1.

21

ВЫВОДЫ

1. Гены NA и SPY2 - новые компоненты негативной регуляции гиббереллинового ответа. Ген NA участвует в регуляции транскрипции гена синтеза гиббереллина GA4 (Зр-гидроксилазы). Ген SPY2 эпистатирует мутации ga3 и ga5, нарушающие синтез гиббереллина и мутацию па, вызывающую нечувствительность к этому гормону.

2. Гены NA и SPY2 локализованы в верхнем плече хромосомы 1 А. thaliana; ген NA тесно сцеплен с CAPS-маркерами 0846А, РТ14 и SSLP-маркером РТ15 и находится на физической карте в районе 1360 - 1410 тпн, соответствующем ВАС-клонам F13M7 и Т7А14.

3. Ген NA блокирует деления клеток апикальной меристемы побега и растяжение клеток междоузлий, контролируя один из конечных участков сигнального пути гиббереллина (после генов GAI и SPY1).

4. Ген NA участвует в контроле взаимодействия разных гормональных сигналов (гиббереллинового и брассиностероидного), регулируя уровень транскрипции гена DWF5/LE, кодирующего стеролредуктазу.

5. Построена новая схема генетического контроля передачи гиббереллинового сигнала у Arabidopsis thaliana с участием генов NA, SPY2 и DWF5/LE, основанная на изучении генных взаимодействий и анализе экспрессии генов

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Склярова O.A. Морфологические особенности карликового мутанта Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. из коллекции кафедры генетики и селекции МГУ // Материалы VII молодежной конференции ботаников. Санкт-Петербург, 2000. С. 157.

2. Ежова Т.А., Склярова O.A. Гены, контролирующие структуру соцветия, и их возможная роль в эволюции // Онтогенез. 2001. Т.32. №6. С. 462-470.

3. Склярова O.A., Солдатова О.П., Ежова Т.А. Идентификация новых генов, регулирующих передачу гиббереллинового сигнала у Arabidopsis thaliana // Материалы научной конференции памяти Грегора Менделя. Москва, 2001. С. 121.

4. Ежова Т.А., Солдатова О.П., Склярова O.A. Ген NANA -регулятор делений и растяжений клеток стебля Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Генетика. 2002. T.38. №1 С. 63-71.

5. Склярова O.A., Лебедева О.В., Ежова Т.А. Эпистатическое взаимодействие мутаций по генам NANA и LEPIDA, контролирующим рост стебля у Arabidopsis thaliana.// Материалы 2-й конференции МОГиС им. Вавилова «Актуальные проблемы генетики». Москва, 2003. Т. 2. С. 254-255.

6. Лебедева О. В., Склярова О. А., Ежова Т. А. Роль генов NANA и LEPIDA в регуляции роста стебля Arabidopsis thaliana Н Генетика. 2004. T. 40. №5.

7. Склярова O.A. Генетический контроль роста цветоноса у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Онтогенез. 2005. T.36. №5. С. 393-394. (Материалы докладов XIV школы по биологии развития, Звенигород).

8. Склярова O.A. Генетический контроль передачи гиббереллинового сигнкала у Arabidopsis thaliana II Материалы Международной Конференции "Генетика в России и мире", посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва, 2006. С. 183.

Заказ № 104/08/06 Подписано в печать 15.08.2006 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,25

^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 1 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Склярова, Ольга Александровна

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. Гиббереллин и его роль в регуляции роста стебля у растений

1.1. Гиббереллины и пути их биосинтеза

1.2. Мутанты с нарушенным биосинтезом гиббереллинов

1.3. Мутанты с измененной чувствительностью к гиббереллинам

1.4. Гены GRAS семейства и их роль в развитии высших растений

1.5. Генетический контроль индукции цветения у A. thaliana: роль 27 генов гиббереллинового пути в инициации цветения у A. thaliana

2. Ауксиновые карликовые мутанты

3. Брассиностероидные карликовые мутанты

4. Генетический контроль развития AM побега 35 Материалы и методы

1. Растительный материал и условия выращивания растений

2. Морфологическая характеристика растений

3. Физиологические тесты

4. Метод сканирующей электронной микроскопии

5. Методы генетического анализа

5.1. Генетическое картирование с использованием морфологических 45 маркеров

5.2. Генетическое картирование с использованием ДНК-маркеров

6. Изучение картирования генов методом ОТ-ПЦР

7. Методы статистического анализа 50 Результаты и обсуждение 51 1 .Морфологический анализ мутантов па и spy

1.1. Анализ мутанта па

1.2. Анализ мутанта spy

2.Генетический анализ

2.1. Локализация генов NA и SPY2 на классической генетической карте 60 A. thaliana

2.2. Локализация гена NA на молекулярно-генетической карте А. 63 thaliana

3.1. Влияние гиббереллина на всхожесть недозрелых и покоящихся 67 семян

3.2. Влияние гиббереллина и паклобутразола на длину гипокотилей 68 проростков высоких и карликовых растений

3.3. Влияние гиббереллина на растяжение клеток стебля карликового 69 мутанта па

3.4. Влияние паклобутразола на прорастание семян мутанта па

3.5. Влияние паклобутразола на рост мутанта па

3.6. Влияние НУК, БАП и брассиностероидов на рост гипокотиля и 72 корня проростков высоких и карликовых растений

4. Анализ физиологической природу мутации spy

4.1. Влияние паклобутразола на прорастание семян мутанта spy

4.2. Влияние паклобутразола на рост цветоноса мутанта spy

4.3. Влияние фотопериода на время зацветания мутантов па и spy

5. Анализ аллелизма и генных взаимодействий

5.1. Анализ аллелизма мутации па с мутацией gai и изучение 81 взаимодействия генов NA, GAI и SPY1, контролирующих чувствительность к гиббереллину

5.2. Анализ взаимодействия гена NA с генами CL VI, CL V2, CL V3 и AS1, 84 влияющими на функционирование апикальной меристемы побега

5.3. Анализ аллелизма мутаций spy2 и spyl и изучение взаимодействия

3. Анализ физиологической природы мутации па генов SPY2 и SPY

5.4. Анализ взаимодействия гена SPY2 с генами GAIuNA

5.5. Анализ взаимодействия гена SPY2 с генами, контролирующими 92 биосинтез гиббереллина GA3 и GA

6. Анализ экспрессии генов, контролирующих биосинтез 94 гиббереллинов и брассиностероидов, и генов, контролирующих рост побега в карликовом мутанте па

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генетического контроля передачи гиббереллинового сигнала у Arabidopsis thaliana"

Гиббереллины (ГА) - важнейший класс фитогормонов, контролирующих различные процессы онтогенеза у растений. Одной из главных функций ГА является регуляция роста стебля. Исследования механизмов этого процесса не только занимают важное место в современной генетике и биологии развития растений, но и имеют большое практическое значение, поскольку рост стебля является одним из наиболее важных признаков в селекции растений. Получение и анализ мутантов с нарушением роста стебля является эффективным подходом для изучения генетического контроля передачи гормональных сигналов, а также координации их действия. Выявление новых компонентов сигнальных путей и изучение их взаимодействия с ранее идентифицированными генами позволяет искать оптимальные пути для управления процессами роста и создания новых форм, устойчивых к полеганию хозяйственно ценных растений.

Изучение генетической и фитогормональной регуляции процессов развития цветоноса удобно проводить на мутантах растений. Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. благодаря малому размеру генома, короткому жизненному циклу, высокой плодовитости, самоопыляемости является идеальным модельным объектом генетических исследований. В 2000 году было завершено полное секвенирование генома A. thaliana, что существенно облегчило эксперименты по молекулярному картированию генов, а также анализу генной экспрессии.

Исследования мутантов A. thaliana, гороха (Pisum sativum), кукурузы (Zea mays), риса (Oryza sativa) и других видов растений позволили показать важнейшую роль ГА и брассиностероидов в регуляции роста стебля и идентифицировать гены, контролирующие биосинтез и катаболизм этих гормонов, а также гены, участвующие в передаче гормональных сигналов. В настоящее время с помощью мутационного анализа идентифицированны гены A. thaliana, негативно регулирующих передачу брассиностероидного и ГА-сигналов, но до сих пор еще мало известно о генах - позитивных регуляторах и генах, кодирующих белки -рецепторы этих гормонов. Для выявления всех недостающих компонентов генетической регуляции, изучения их взаимодействия с ранее идентифицированными генами, а также понимания механизмов координации гормонов в формировании роста цветоноса необходимы дальнейшие исследования по получению и изучению мутантов с измененным ростом стебля.

Диссертационная работа проводилась на мутантах с нарушением роста стебля из коллекции кафедры генетики МГУ и коллекции нотгингемского университета (NASC): карликовых мутантах па, le, ga3, ga5, gai, и мутантах с удлиненным стеблем spyl и spy2. По данным проведенных ранее исследований гены GA3, GA5 кодируют ферменты биосинтеза ГА и нарушают последние этапы биосинтеза этого гормона (Hedden, Proebstin, 1999). Гены GAI и SPY1 участвуют в негативной регуляции передачи ГА-сигнала (Richards et al., 2001); мутация gai вызывает нечувствительность к ГА, а мутация spyl - конститутивную экспрессию ГА-ответа (Wilson, Somerville, 1995; Jacobsen et al., 1996). Роль остальных генов в регуляции роста стебля исследована далеко не полностью. Целью данной работы являлось генетическое и морфофизиологическое изучение мутантов па, spy2, le-2 из коллекции кафедры генетики МГУ, а также создание схемы генетического контроля передачи гиббереллинового сигнала у A. thaliana на основе анализа генных взаимодействий и изучения экспрессии генов.

Задачи исследования:

1. Морфофизиологический и генетический анализ мутантов из коллекции кафедры генетики МГУ.

2. Локализация генов NA и SPY1 на генетической и физической карте А. thaliana с использованием морфологических и ДНК-маркеров.

3. Изучение взаимодействия генов NA и SPY1 с другими генами, контролирующими рост побега, на основе анализа фенотипа двойных мутантов.

4. Анализ экспрессии генов биосинтеза ГА и генов, контролирующих рост побега, в растениях мутанта па.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гиббереллины и их роль в регуляции роста стебля у растений

Гиббереллины (ГА) - важнейший класс фитогормонов, которые требуются для прорастания семян, перехода растения в репродуктивную стадию, развития тычинок и полноценных плодов (Кефели, 1984; Полевой, Саламатова, 1991). Но одной из главных функций ГА является регуляция роста стебля растений. Важнейшее значение в изучении роли ГА сыграли исследования на мутантах растений с изменением роста стебля.

Все имеющиеся гиббереллиновые мутанты с измененным ростом стебля можно разделить на два основных класса: мутанты с измененным биосинтезом ГА и мутанты с измененной чувствительностью к ГА (Reid, 1993). У мутантов первого класса блокированы определенные этапы синтеза ГА, что приводит к укорочению длины стебля. При этом после обработки мутантов активными формами ГА их стебель, как правило, достигает высоты, характерной для растений дикого типа. Это служит одним из критериев отличия мутантов данного класса от мутантов с измененной чувствительностью к ГА. Причиной снижения высоты стебля у дефицитных по ГА мутантов является уменьшение размера клеток или/и их числа. За счет этого сокращается число узлов и длина вегетативных и генеративных междоузлий (Reid, Howell, 1995). Мутанты этого класса описаны у кукурузы, гороха, томатов (Lycopersicon esculentum), пшеницы (Triticum aestivum), A. thaliana.

Второй класс - это многочисленная группа мутантов, у которых нарушения связаны не с биосинтезом ГА, а с нарушением пути передачи гормонального ГА сигнала. Процесс передачи ГА сигнала включает в себя несколько этапов: рецепция гормона, передача сигнала в разные части клетки и собственно гормональный ответ. Растения второго класса, как правило, имеют фенотип сходный с фенотипом мутантов ГА синтеза, но при этом после обработки экзогенными гормонами растения не восстанавливают нормальный фенотип в отличие от мутантов первого класса. Большинство мутантов второго класса характеризуются нормальным или повышенным содержанием ГА. Кроме того, в литературе описаны мутанты с конститутивным гормональным ответом, у которых он ярко выражен даже в присутствии ингибиторов синтеза ГА (например, паклобутразола). Примером мутантов с конститутивным ГА ответом может служить мутант - spy 1, выделенный у A. thaliana, а также мутанты la crys и мутант slender, выделенные из гороха и ячменя (Hordeum vulgare), соответственно (Jacobsen, Olszewski, 1993; Peng et al., 1997).

Рассмотрим каждый класс мутантов подробнее.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Склярова, Ольга Александровна

выводы

1. Гены NA и SPY2 - новые компоненты негативной регуляции гиббереллинового ответа. Ген NA участвует в регуляции транскрипции гена синтеза гиббереллина GA4 (З/З-гидроксилазы). Ген SPY2 эпистатирует мутации ga3 и ga5, нарушающие синтез гиббереллина и мутацию па, вызывающую нечувствительность к этому гормону.

2. Гены NA и SPY2 локализованы в верхнем плече хромосомы 1 A. thaliana; ген NA тесно сцеплен с CAPS-маркерами 0846А, РТ14 и SSLP-маркером РТ15 и находится на физической карте в районе 1360 - 1410 тпн, соответствующем ВАС-клонам F13M7 и Т7А14.

3. Ген NA блокирует деления клеток апикальной меристемы побега и растяжение клеток междоузлий, контролируя один из конечных участков сигнального пути гиббереллина (после генов GAI и SPY1).

4. Ген NA участвует в контроле взаимодействия разных гормональных сигналов (гиббереллинового и брассиностероидного), регулируя уровень транскрипции гена DWF5/LE, кодирующего стеролредуктазу.

5. Построена новая схема генетического контроля передачи гиббереллинового сигнала у Arabidopsis thaliana с участием генов NA, SPY2 и DWF5/LE, основанная на изучении генных взаимодействий и анализе экспрессии генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы выявлены новые гены NA и SPY2, которые участвуют в передачи ГА-сигнала у A. thaliana. У мутанта па, как и у других мутантов с нарушением передачи ГА-сигнала, при обработке ГА не происходило увеличение длины стебля (Ежова и др., 1997). Полудоминантный характер наследования карликовости у мутанта па вместе с данными о его нечувствительности к ГА свидетельствует о том, что ген NA, как и ранее идентифицированные гены GAI, SPY, RGA, SHI, GAR2 в растениях дикого типа участвуют в негативной регуляции передачи ГА-сигнала. О потере мутантом па чувствительности к ГА свидетельствует и неспособнсть экзогенного ГА повышать всхожесть недозрелых или покоящихся семян. Эта особенность характерна и для мутанта gai (Peng et al., 1999). Кроме того, у мутанта па наблюдается задержка времени цветения при коротком дне, что характерно как для ГА-дефицитных мутантов, так и мутантов с нарушением передачи ГА-сигнала (Wilson et al., 1992; Jacobsen, 1993). Это связано с участием ГА в контроле процессов инициации цветения (Mouradov et al., 2002). В то же время мутант па существенно отличался от всех описанных ранее карликовых мутантов тем, что у него наблюдались изменения только отдельных, а не всех ГА-регулируемых процессов. Мутант имел практически нормальную зеленую (а не темно-зеленую как у gai) окраску листьев, длину гипокотилей, фертильность цветков и плодовитость стручков, у него практически не наблюдалось задержки перехода на репродуктивную стадию развития на длинном дне. У мутанта па не наблюдалось также уменьшения длины клеток гипокотиля, стебля, стручков. Более того, эксперименты с ГА и ингибитором биосинтеза ГА паклобутразолом показали, что изменение уровня экзогенного или эндогенного ГА изменяет цвет листьев мутантов (ГА делает листья желто-зелеными, а его ингибитор - темно-зелеными), ускоряет (ГА) или замедляет (ПБЗ) цветение, увеличивает (ГА) или снижает (ПБЗ) длину гипокотилей. Таким образом, мутация па вызывает менее широкий круг плейотропных эффектов, чем мутации в генах GAI, SPY1, которые являются негативными регуляторами передачи ГА-сигнала. Эти данные свидетельствуют о том, что продукт гена NA контролирует участки цепи передачи ГА-сигнала, после генов GAI, RGA, SPYL В пользу участия гена NA в единой цепи передачи ГА-сигнала свидетельствует эпистаз мутации па над мутациями gai и spyl. Местоположение гена NA в цепи передачи ГА-сигнала схематично представлено на рисунке 38.

Мутант spy2 имеет светло-зеленую окраску листьев, удлиненный стебель, устойчив к паклобутразолу как на стадии прорастания семян, так и на стадии выметывания цветоноса. Эти признаки характерны для мутанта с конститутивным ответом к ГА, spyl (см. обзор литературы, с. 18). Рецессивный характер наследования мутации spy2 и фенотип мутантного растения говорят о том, что данный ген участвует в негативной регуляции передачи ГА-сигнала. Об этом говорит и эпистаз мутации spy2 над мутацией gai, негативно регулирующей передачу ГА-сигнала, и исследуемой мутацией па. Кроме того, мутация spy2 частично эпистатирует мутации ga3 и ga5, нарушающие синтез гиббереллина. Эти данные позволяют предположить, что мутация spy2 контролирует участки цепи передачи ГА-сигнала до или после генов GAI, RGA, SPY1 (рис.38).

Гены биосинтеза ГА: GAI, GA2, GA3, GA4, GA5 активный гиббереллин

ГА4 индукция цветения Т

GAI, RGA, SPYl, SPY2* развитие генеративных органов содержание хлорофилла в листьях

17/11 т

NA* h 1

DWF5/LE* растяжение клеток междоузлий деление клеток AM прорастание семян растяжение клеток гипокотиля

Рисунок 38. Схема передачи ГА-сигнала у A. thaliana. Жирным шрифтом отмечены гены, исследуемые в данной работе; * отмечены новые компоненты передачи ГА-сигнала (объяснения в тексте).

Показано, что ген GAI и его гомолог ген RGA относятся к семейству GRAS генов (см. обзор литературы, с. 25). Ген NA пока не клонирован и его структура неизвестна. Проведенный нами анализ генов, локализованных в районе расположения гена NA, не обнаружил последовательностей ДНК, гомологичных GRAS-генам. Следовательно, ген NA, по-видимому, является компонентом другого генного семейства.

Исследования показали, что мутация па блокирует одновременно растяжение клеток междоузлий и деления клеток AM побега, то есть два главных ГА-зависимых процесса, обеспечивающих рост цветоноса. Продуктом гена NA, по-видимому, является регуляторный белок, способный одновременно контролировать экспрессию разных генов. Так, ген NA участвует в регуляции транскрипции гена биосинтеза гиббереллинов - GA4. Кроме того, продукт гена NA негативно регулирует экспрессию гена биосинтеза брассиностероидов - DWF5/LE, который отвечает за растяжение клеток междоузлий. Об этом свидетельствует и восстановление роста корня мутанта па под влиянием экзогенного эпибрассинолида (ЭБР). Таким образом, ген NA участвует в координации гиббереллинового и брассиностероидного сигналов (негативное влияние гена NA на гены GA4 и DWF5/LE схематично показано на рисунке 38 в виде-1). В свою очередь, анализ взаимодействия гена NA с генами, контролирующими размер AM, CLV1, CLV2, CLV3, позволил сделать предположение, что данные гены участвуют в последовательных процессах, связанных с ограничением пула клеток AM.

Отсутствие влияния мутации па на латеральные органы свидетельствует о том, что ген NA экспрессируется только в клетках главной оси. Морфологические особенности мутанта па и его нечувствительность к ГА вместе с данными о доминантном характере наследования карликовости позволяет предположить, что в растениях дикого типа продукт гена NA ограничивает деления и растяжения клеток стебля на вегетативной стадии развития. Это приводит к формированию укороченного побега - розетки. При переходе растений на стадию генеративного развития, который осуществляется при участии ГА-сигнала, негативная регуляция гена NA снимается либо в результате того, что ГА снимает негативное действие белка NA, либо за счет того, что ГА запрещает экспрессию гена NA. Активные клеточные деления в AM побега и последующее растяжение клеток приводят к формированию цветоноса.

Мутация в гене NA приводит к потере чувствительности к ГА белка NA, или к нерегулируемой экспрессии гена NA, поэтому, не смотря на наступление репродуктивной стадии развития, деления клеток AM и растяжение клеток междоузлий по-прежнему оказываются ограниченными действием гена па. В результате, растения либо вообще не могут сформировать цветонос, что наблюдается у гомозигот, либо формируют тонкие цветоносы с малым числом узлов и короткими междоузлиями. Обнаруженное нами увеличение числа клеток междоузлий у мутанта па, по-видимому, связано с усилением активности интеркалярной меристемы в ответ на подавление делений AM. Активизация интеркалярной меристемы у мутанта па свидетельствует о том, что деления клеток апикальной и интеркалярной меристем регулируются разными генетическими системами.

Проведенные исследования показали, что формирование укороченного стебля на вегетативной стадии развития, характерное для многих видов крестоцветных, у A. thaliana находится под контролем гена NA, активность которого регулируется ГА. Подтверждением этого предположения будет получение рецессивной мутации в гене NA, нарушающей его функцию путем мутагенеза мутантов па. Такая мутация должна привести к супрессии карликового фенотипа мутанта па и к нарушению формирования розетки из-за растяжения междоузлий стебля на вегетативной стадии. Обнаружение внутригенной супрессорной мутации позволит также подтвердить, что доминантность мутации па обусловлена постоянной активностью продукта гена NA.

С использованием морфологических маркеров гены NA и SPY2 локализованы в верхнем плече хромосомы 1 A. thaliana. Установлено, что ген NA тесно сцеплен с CAPS-маркерами 0846А, РТ14 и SSLP-маркером РТ15 и находится на физической карте в районе 1360-1410 т.п.н., соответствующем ВАС-клонам F13M7 и Т7А14. Эти сведения открывают возможность для последующего позиционного клонирования гена А^.

Таким образом, морфофизиологический и генетический анализ мутантов по генам NA и SPY2 A. thaliana показало, что это новые гены, контролирующие чувствительность к гиббереллину. Изучение генных взаимодействий говорит об участии этих генов в негативной передачи ГА-сигнала и контроле жизненно важных процессов развития растений, наряду с ранее идентифицированными генами GAI, RGA, SPYL

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Склярова, Ольга Александровна, Москва

1. Бейли Н. Статистические методы в биологии. М.: Изд-во Ин. Лит. 1962. С. 7593.

2. Ежова Т. А., Ондар У. Н., Солдатова О. П., Маманова Л. Б. Генетическое и физиологическое изучение карликовых мутантов Arabidopsis thaliana (L) Heynh // Онтогенез. 1997. Т. 28. № 5. С. 344-351.

3. Захаров И. А. Генетические карты высших организмов. Л.: Изд-во "Наука". 1979. С. 16-17.

4. Квитко К. В. Асептическая культура Arabidopsis thaliana и перспектива ее использования в ботанических исследованиях // Вестн. ЛГУ Сер. Биология. 1960. Т. 15. №3. С. 47-56.

5. Кефели В.И. Рост растений. М.: Наука. 1984. 175 С.

6. Лакин Г. Ф. Биометрия: Учебное пособие для биологических специальностей вузов. М.: Изд-во "Высшая школа". 1990.

7. Лебедева О.В. Изучение генетической и гормональной регуляции развития цветоноса Arabidopsis thaliana II Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. 2004. 150 С.

8. Лебедева О.В., Склярова О.А., Ежова Т.А. Роль генов NANA и LEPIDA в регуляции роста стебля Arabidopsis thaliana // Генетика. 2004. Т.40. №7. С. 940-948.

9. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А., Ходжайова Л.Т., Шишкова С.О. Генетика развития растений. СПб.: Изд-во "Наука". 2000. С. 297-302.

10. Маманова Л.Б. Генетический и биохимический анализ мутантов Arabidopsis thaliana (L) Heynh с измененной чувствительностью к окислительному стрессу: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1999.

11. Манниатис Т., Фрич Э., Сэнбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: "Мир". 1984.

12. Полевой В.В., Саламатова Т.С. Физиология роста и развития растений. JL: ЛГУ. 1991.240 С.

13. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. С-П.: СПбГТУ. 1999. С. 170171.

14. Серебровский А. С. Генетический анализ. М.: Изд-во "Наука". 1970. С. 86-89, 288-290.

15. Achard P., Herr A., Baulcombe D.C., Harberd N.P. Modulation of floral development by a gibberellin-regulated microRNA // Development. 2004. V. 131(14). P. 3357-3365.

16. Azpiroz R., Wu Y., LoCascio J.C., Feldmann K.A. An Arabidopsis brassinosteroid-dependent mutant is blocked in cell elongation // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 219230.

17. Barton M. K., Poethig, R.S. Formation of the shoot apical meristem in Arabidopsis thaliana: an analysis of development of the wild type and in the shoot meristemless mutant//Development. 1993 V.119. P. 823-831.

18. Barton M. Leaving the meristem behind: regulation of KNOX genes // Genome Biol. 2001. V. 2(1). P. 1-3.

19. Benfey P.N., Linstead P.J., Roberts K., Schiefelbein J.W., Hauser M.T., Aeschbacher R.A. Root development in Arabidopsis-. four mutants with dramatically altered root morphogenesis // Development. 1993. V.l 19. P. 57-70.

20. Bennett M.J., Marchant A., Green H.G., May S.T., Ward S.P., Millner P.A., Walker A.R., Schulz В., Feldmann K.A. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism.// Science. 1996. V. 273(5277). P. 948-950.

21. Blazquez M.A., Soowal L.N., Lee I., Weigel D. LEAFY expression and flower initiation in Arabidopsis II Development. 1997. V.124. P. 3835-3844.

22. Blazquez M.A., Green R., Nilsson O., Sussman M.R., Weigel D. Gibberellins promote flowering of arabidopsis by activating the LEAFY promoter // Plant Cell. 1998. V. 10(5). P.791-800.

23. Blazquez M.A., Weigel D. Independent regulation of flowering by phytochrome В and gibberellins in Arabidopsis II Plant Physiol. 1999. V. 120(4). P. 1025-1032.

24. Blazquez M.A., Weigel D. Integration of floral inductive signals in Arabidopsis II Nature. 2000. V. 404(6780). P. 889-892.

25. Boss P.K., Bastow R.M., Mylne J.S., Dean C. Multiple pathways in the dicision to flower: enabling, promoting and resseting // The Plant Cell. 2004. V. 16. P. 18-31.

26. Bouquin Т., Meier C., Foster R., Nielsen M.E., Mundy J. Control of specific gene expression by gibberellin and brassinosteroid // Plant Physiol. 2001. V. 127(2). P. 450-458.

27. Brand U., Fletcher J.C., Hobe M., Meyerowitz E.M., Simon R. Dependent of stem cell fate in Arabidopsis on a feedback loop regulated by CLV3 activity // Science. 2000. V.289 (5479). P.617-619.

28. Byrne M.E., Barley R., Curtis M., Arroyo J.M., Dunham M., Hudson A., Martienssen RA. Asymmetric leavesl mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis II Nature. 2000. V. 408. P. 967-971.

29. Byrne, M.E., Simorowski, J., and Martienssen, R.A. ASYMMETRIC LEAVES 1 reveals knox gene redundancy in Arabidopsis II Development. 2002. V. 129. P. 1957-1965.

30. Callum J., Bell C. J., Ecker J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis II Genomics. 1994. V.19. P. 137-144.

31. Carles C.C., Fletcher J.C. Shoot apical meristem maintenance: the art of a dynamic balance // Trends Plant Sci. 2003. V. 8(8). P. 394-401.

32. Chuck G., Lincoln C., Hake S. KNATI induces lobed leaves with ectopic meristems when overexpressed in Arabidopsis II Plant cell. 1996. V. 8. P. 1277-1289.

33. Chen J.J., Jassen B.J., Willians A., Sinha N. A gene fusion at a homeobox locus: alterations in leaf shape and implications for morphological evolution // Plant Cell. 1997. V. 9(8). P. 1289-304.

34. Chiang H., Hwang I., Goodman H. M. Isolation of the Arabidopsis GA4 Locus // Plant Cell. 1995. V. 7(2). P. 195-201.

35. Choe S., Dilkes B.P., Fujioka S., Takatsuto S., Sakurai A., Feldmann K.A. The DWF4 gene of Arabidopsis encodes a cytochrome P450 that mediates multiple 22-hydroxylation steps in brassinosteroid biosynthesis // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 231-243.

36. Choe S., Fujioka S., Noguchi Т., Takatsuto S., Yoshida S., Feldmann K.A. Overexpression of DWARF4 in the brassinosteroid biosynthetic pathway results in increased vegetative growth and seed yield in Arabidopsis II Plant J. 2001. V. 26(6).5P. 73-82.

37. Clark S.E., Running M.P, Meyerowitz E.M. CLAVATA3 is a specific regulator of shoot and floral meristem development affecting the same processes as CLAVATAl //Development. 1995. V. 121. P. 2057-2067

38. Clark S.E., Jacobsen S.E., Levin J., Meyerowitz E.M. The CLAVATA and SHOOT MERISTEMLESS loci competitively regulate meristem activity in Arabidopsis // Development. 1996. V. 122. P.1567-1575.

39. Clark S.E., Williams R.W., Meyerowitz E.M. The CLAVATAl gene encodes a putative receptor kinase that controls shoot and floral meristem size in Arabidopsis II Cell. 1997. V. 16; 84(4). P. 575-585.

40. Clark G.B., Sessions A., Eastburn D.J., Roux S.J. Differential expression of member of the annexin multigene family in Arabidopsis.// Plant Physiol. 2001. V. 126(3). P. 1072-1084.

41. Clouse S.D., Sasse J.M. BRASSINOSTEROIDS: essential regulators of plant growth and development // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1998. V. 49. P. 427-451.

42. Clouse S.D., Langford M., McMorris T.C. A brassinosteroid-insensitive mutant in Arabidopsis thaliana exhibits multiple defects in growth and development // Plant Physiol. 1996. V. 111(3). P.671-678.

43. Corbesier L., Coupland G. Photoperiodic flowering of Arabidopsis: integrating genetics and physiological approaches to characterization of the floral stimulus // Plant, Cell and Environment. 2005. V. 28. P. 54-66.

44. Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. Aplant DNA minipreparation: version II // Plant Mol. Biol. Rep. 1983. V. 1. P. 19-21.

45. Dill A., Jung H.S., Sun T.P. The DELLA motif is essential for gibberellin-induced degradation of RGA // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98(24). P. 14162-14167.

46. Dill A., Sun T. Synergistic derepression of gibberellin signaling by removing RGA and GAI function in Arabidopsis thaliana //Genetics. 2001. V. 159(2). P. 777-785.

47. Dill A., Thomas S.G., Hu J., Steber C.M., Sun T.P. The Arabidopsis F-box protein SLEEPY1 targets gibberellin signaling repressors for gibberellin-induced degradation //Plant Cell. 2004. V. 16(6). P.1392-405.

48. Ellis С. M., Nagpal P., Young J. C., Hagen G., Guilfoyle T. J., Reed Jason W. AUXIN RESPONSE FACTOR1 and AUXIN RESPONSE FACTOR2 regulate senescence and floral organ abscission in Arabidopsis thaliana II Development. 2005. V. 132. P.4563-4574.

49. Fletcher J.C., Bran, U., Running M.P., Simon R., Meyerowitz E.M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems //Science. 1999. V.283.P. 1911-1914.

50. Fridborg L., Kuusk S., Moritz Т., Sunberg E. The Arabidopsis dwarf mutant shi exhibits reduced gibberellin responses conffered by overexpression of a new putative zinc finger protein//Plant Cell. 1999. V.ll.P. 1019-1031.

51. Fridborg I., Kuusk S., Robertson M., Sundberg E. The Arabidopsis protein SHI represses gibberellin responses in Arabidopsis and barley // Plant Physiol. 2001. V. 127(3). P.937-948.

52. Grill E., Somerville C. Construction and characterization of a yeast artificial chromosome library of Arabidopsis which is suitable for chromosome walking // Mol. Gen. Genet. 1991. V.226. P. 484-490.

53. На С.-Н., Kim G.-T., Kim B.-C., Jun J.-H., Soh M.-S., Ueno Y., Machida Y., Tsukaya H., Nam H.-G. The BLADE-ON-PETIOLE gene controls leaf pattern formation through regulation of meristematic activity // Development. 2003. V. 130. P. 161-172.

54. Harven D., Gutfinger Т., Parnis A., Eshed Y., Lofschitz E. The marking of a compound leaf: genetic manipulation of leaf architectura in tomato // Cell. 1996. V. 84. P.735-744.

55. Hay A., Kaur H., Phillips A., Hedden P., Hake S., Tsiantis M. The gibberellin pathway mediates KNOTTED 1 -type homeobox function in plants with different body plans //Curr. Biol. 2002.V.12.P.1557-1565.

56. Hecht V., Foucher F., Ferrandiz C., Macknight R., Navarro C., Morin J., Vardy M.E., Ellis N., Beltran J.P., Rameau C., Weller J.L. Conservation of Arabidopsis flowering genes in model legumes // Plant Physiology. 2005. V. 137. P. 1420-1434.

57. Hedden P., Kamija Y. Gibberellin biosynthesis: enzymes, genes and their regulation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V.48. P. 431-460.

58. Hedden P., Phillips A.L. Gibberellin metabolism: New insights revealed by the genes // Trends Plant Sci. 2000. V.5. P.523-530.

59. Hedden P., Proebsting W. M. Genetic analysis of gibberellin biosynthesis // Plant Physiol. 1999. V.119. P. 365-370.

60. Helliwell, C.A., Chandler, P.M., Poole, A., Dennis, E.S., and Peacock, W.J. The CYP88A cytochrome P450, en/-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. P.2065-2070.

61. Helliwell, C.A., Sheldon C.C., Olive M.R., Walker A.R., Zeevaart J.A., Peacock W.J., Dennis E.S. Cloning of the Arabidopsis e/tf-kaurene oxidase gene GA3II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. P.9019-9024.

62. Jackson D., Veit В., Hake S. Expression of maize KNOTTED 1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot // Development. 1994. V. 120. P. 405-413.

63. Jacobsen S. E., Olszewski N. E. Mutation at the SPINDLY locus of Arabidopsis alter gibberellin signal transduction // Plant Cell. 1993. V.5. P. 887-896.

64. Jacobsen S.E., Binkowski K.A., Olszewski N.E. SPINDLY, a tetratricopeptide repeat protein involved in gibberellin signal transduction in Arabidopsis II Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93(17). P. 9292-9296.

65. Jeong S., Trotochaud A. E., Clark S. E. The Arabidopsis CLA VATA2 gene encodes a receptor-like protein required for the stability of the CLAVATA1 receptor-like kinase//Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1925 -1934.

66. Kende H., van der Knaap E., Cho H-T. Deepwater rice: a model plant to study stem elongation//Plant Physiol. 1998. V.l 18 (4). P. 1105-1110.

67. Konieczny A., Ausubel F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers // Plant Journal. 1993. V.4. P. 403-410.

68. Koornneef M., Stam P. Procedure for mapping by using F2 and F3 population // Arabidopsis Inf. Serv. V. 25. P. 35-40.

69. Koornneef M., Bosma T. D. G., Hanhart C. J., van der Veen J. H., Zeevaart J. A. D. The isolation and characterization of gibberellin-deficient mutants in tomato // Theor Appl Genet. 1990. V.80. P. 852-857.

70. Koornneef M., van der Veen J. H. Induction and analysis of gibberellin sensitive mutants in Arabidopsis thaliana (L.) Hehyn // Theor. Appl. Genet. 1985. V.58. P. 257-263.

71. Koornneef M., van der Veen J.H. Induction and analysis of gibberellin sensitive mutants in Arabidopsis thaliana (L.) Heyhn // Theor Appl Genet. 1980. V. 58. P. 257-263.

72. Laux Т., Mayer K. F. X., Berger J., Jiirgens G. The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis // Development. 1996. V. 122. P. 87-96.

73. Lenhard M., Jiirgens G. and Laux T. The WUSCHEL and SHOOTMERISTEMLESS genes fulfil complementary roles in Arabidopsis shoot meristem regulation // Development. 2002. V. 129. P. 3195 -3206.

74. Li J., Chory J. A putative leucine-rich repeat receptor kinase involved in brassinosteroid signal transduction // Cell. 1997. V. 5; 90(5). P. 929-938.

75. Li J., Nam K.H., Vafeados D., Chory J. BIN2, a new brassinosteroid-insensitive locus in Arabidopsis II Plant Physiol. 200l.V. 127(1). P. 14-22.

76. Long J. A., Moan E.I., Medford J.I., Barton M.K. A member of the KNOTTED class of homeodomain protein encodes by the STM gene of Arabidopsis //Nature. 1996. V. 4; 379(6560). P. 66-69.

77. Martin D. N., Proebsting W. M., Hedden P. The SLENDER gene of pea encodes a gibberellin 2-oxidase // Plant Phisiol. 1999. V. 121(3). P. 775-781.

78. Matsuoka M., Ichikawa H., Saito A., Tada Y., Fujimura Т., Kano-Murakami Y. Expression of a rice homeobox gene causes altered morphology of transgenic plants //Plant Cell. 1993. V. 5(9). P. 1039-1048.

79. Mayer K. F. X., Schoof H., Haecker A., Lenhard M., Jtirgens G., Laux T. Role of WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem // Cell. 1998. V. 95. P. 805 -815.

80. McGinnis K.M., Thomas S.G., Soule J.D., Strader L.C., Zale J.M., Sun T.P., Steber C.M. The Arabidopsis SLEEPY1 gene encodes a putative F-box subunit of an SCF E3 ubiquitin ligase //Plant Cell. 2003. V. 15(5). P.120-130.

81. Melzer S., Kampmann G., Chandler J., Apel K. FPF1 modulates the competence to flowering in Arabidopsis II Plant J. 1999. V. 18(4). P. 395-405.

82. Mollen G. M., Bahnweg G., Lerman H. S., Geigek H. H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentons fungi, fmit bodies and infected plant tissues // Nucleic Acids Research. 1992. V.20 (22). P.6115-6116.

83. Mouradov A., Cremer F., Coupland G. Control of flowering time: interacting pathways as a basis for diversity // Plant Cell. 2002. V. 14. P.l 11-130.

84. Nagatani A., Reed J.W., Chory J. Isolation and initial characterization of Arabidopsis mutants that are deficient in phytochrome A // Plant Physiol. 1993. V. 102(1). P. 269-277.

85. Nagpal P., Walker L.M., Young J.C., Sonawala A., Timpte C., Estelle M., Reed J.W. AXR2 encodes a member of the Aux/IAA protein family // Plant Physiol. 2000. V. 123(2). P.563-574.

86. Nemhauser J.L., Chory J. BRing it on: new insights into the mechanism of brassinosteroid action // J Exp Bot. 2004. V. 55(395). P. 265-270.

87. Noguchi Т., Fujioka S., Choe S., Takatsuto S., Tax F.E., Yoshida S., Feldmann K.A. Biosynthetic pathways of brassinolide in Arabidopsis II Plant Physiol. 2000. V. 124(1). P. 201-209. Erratum in: Plant Physiol. 2000. V. 124(2). P. 920.

88. Olszewski N., Sunb T-P., Gublerc F. Gibberellin signaling: biosynthesis, catabolism and response pathways // The Plant Cell. 2002. V. 14. P. 61-80.

89. Ori N., Eshed Y., Chuck G., Bowman J. L., Hake, S. Mechanisms that control knox gene expression in the Arabidopsis shoot // Development. 2000. V. 127. P. 55235532.

90. Parks B.M., Quail P.H. hy8, a new class of arabidopsis long hypocotyl mutants deficient in functional phytochrome A // Plant Cell. 1993. V. 5(1). P. 39-48.

91. Peng J., Carol P., Richards D. E., King К. E., Cowling R. J., Murphy G. P., Harberd N. P. The Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively regulates gibberellin response // Genes and Development. 1997. V.ll. P. 31943205.

92. Peng J., Harberd N. P. Derativative alleles of the Arabidopsis gibberellin-insensetive (gai) mutation confer a wild-type phenotype // Plant Cell. 1993. V.5 P. 351-360.

93. Peng J., Richards D. E., Moritz Т., Cano-Delgado A., Harberd N. P. Extragenic supressors of the Arabidopsis gai mutation alter the dose response relationship of diverse gibberellin responses // Plant Physiol. 1999. V.l 19. P. 1199-1207.

94. Phillips A. L., Ward D. A., Uknes S., Appleford N. E.J., Lange Т., Huttly A. K., Gaskin P., Graebe J.E., Hedden P. Isolation and expression of three gibberellin 20 -oxidase cDNA clones from Arabidopsis И Plant Physiol. 1999. V. 108. P. 10491057.

95. Pysh L. D., Wysocka-Dillen J. W., Camilleri C., Bouchez D., Benfey P. N. The GRAS gene family in Arabidopsis: sequence characterization and basic expressionanalysis of the SCARECROW-LIKE genes // The Plant Journal. 1999. V.18. № 1. P. 111-119.

96. Quail P.H., Boylan M.T., Parks B.M., Short T.W., Xu Y., Wagner D. Phytochromes: photosensory perception and signal transduction // Science. 1995. V. 268(5211). P. 675-680.

97. Reed J.W., Nagpal P., Poole D.S., Furuya M., Chory J. Mutations in the gene for the red/far-red light receptor phytochrome В alter cell elongation and physiological responses throughout Arabidopsis development // Plant Cell. 1993. V. 5. P. 147-157.

98. Reed J.W., Nagatani A., Elich T.D., Fagan M., Chory J. Phytochrome A and phytochrome В have overlapping but distinct functions in Arabidopsis development //PlantPhysiol. 1994. V. 104. P. 1139-1149.

99. Reid J. B. Plant hormone mutants // Plant Growth Regul. 1993. V.12. P. 207-226.

100. Reid J. В., Howell S. H. Hormone mutants and plant development // Plant Hormone. 1995. P. 448-485.

101. Richards D.E., King K.E., Ait-Ali Т., Harberd N.P. HOW GIBBERELLIN REGULATES PLANT GROWTH AND DEVELOPMENT: A Molecular Genetic Analysis of Gibberellin Signaling // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 2001. V. 52. P. 67-88.

102. Sakamoto Т., Kobayashi M., Itoh H., Tagiri A., Kayano Т., Tanaka H., Iwahori S., Matsuoka M. Expression of a gibberellin 2-oxidase gene around the shoot apex is related to phase transition in rice // Plant Physiol. 2001 V.125(3). P.1508-1516.

103. Schoof H., Lenhard M., Haecker A., Mayer K.F., Jurgens G., Laux T. The stem cell population of Arabidopsis shoot meristems in maintained by a regulatory loop between the CLAVATA and WUSCHEL genes // Cell. 2000. V. 100(6). P. 635-644.

104. Schomburg F. M., Bizzell С. M., Lee D. J., Zeevaart J. A. D., Amasino R. M. Overexpression of a novel class of gibberellin 2-oxidases decreases gibberellin levels and creates dwarf plants // The Plant Cell. 2003 .V. 15. P. 151-163.

105. Sentoku N., Sato y., Matsuoka M. Overexpression of rice OSH genes induces ectopic shoot on leaf sheaths of transgenic rice plants // Dev Biol. 2000. V. 220. P. 358-364.

106. Serikawa K.A., Martinez-Laborda A., Zambrysky P. Three knottedl like homeobox genes in Arabidopsis //Plant Mol Bio. 1996. V. 32(4). P.673-683.

107. Silverstone A. L., Ciampaglio C. N., Sun T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway // Plant Cell. 1998. V.10. P. 155-169.

108. Silverstone A. L., Мак P. Y. A., Martinez E. C., Sun T. The new RGA locus encodes a negative regulator of gibberellin response in Arabidopsis thaliana 11 Genetics. 1997. V.146.P. 1087-1099.

109. Silverstone A.L., Jung H-S., Dill A., Kawaide H., Kamiya Y., Sun T-P. Repressing a repressor gibberellin-induced rapid reduction of the RGA protein in Arabidopsis II 2001. Plant Cell. V. 13(7). P. 1555-1566.

110. Sinha N.R., Williams R.E., Hake S. Overexpression of the maize homeobox gene, KNOTTED-1, causes a switch from determinate to indeterminate cell fates // Genes Dev. 1993. V 7(5). P. 787-795.

111. Sinha N. Leaf development in angiosperms // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V.50. P. 419-446.

112. Smith L.G., Greene В., Veit В., Hake S. A dominant mutation in the maize homeobox gene, Knotted-1, causes its ectopic expression in leaf cells with altered fates // Development. 1992. V.l 16. P. 21-30.

113. Steber C.M., Cooney S.E., McCourt P. Isolation of the GA-response mutant slyl as a suppressor of ABI1-1 in Arabidopsis thaliana II Genetics. 1998. V.149. P. 509521.

114. Steber C.M., McCourt P. A role for brassinosteroids in germination in Arabidopsis II Plant Physiol. 2001. V. 125(2). P. 763-769.

115. Steeves T.A., Sussex I.M. Patterns in Plant Development // Cambridge Univ. Press, Cambridge, U.K. 1989.

116. Swain S.M., Tseng T-S., Thornton T.M., Gopalraj M., Olszewski N.E. SPINDLY Is a Nuclear-Localized Repressor of Gibberellin Signal Transduction Expressed throughout the Plant // Plant Physiol. 2002. V. 129(2). P. 605-615.

117. Sun Т., Goodman H.M., Frederick M.A. Cloning the Arabidopsis GAI locus by genomic subtraction // Plant Cell. 1992. V.4. P. 119-128.

118. Talon M., Koornneef M., Zeevaart J.A. D. Accumulation of С19 -gibberellins in the gibberellin-insensetive dwarf mutant gai of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Planta. 1990. P. 501-505.

119. Tiwari S.B., Wang X-J., Hagen G., Guilfoyle T.J. AUX/IAA proteins are active repressors, and their stability and activity are modulated by auxin // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 2809-2822.

120. Thomas S.G., Phillips A.L., Hedden P. Molecular cloning and functional expression of gibberellin 2-oxidases, multifunctional enzymes involved in gibberellin deactivation // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V. 96(8). P. 4698-4703.

121. Trotochaud A.E., Нао Т., Wu G., Yang Z., Clark S.E. The CLAVATA1 receptor-like kinase requires CLAVATA3 for its assembly into a signaling complex that includes KAPP and a Rho-related protein // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 393-406.

122. Trotochaud A.E, Jeong S., Clark S.E. CLAVATA3, a multimeric ligand for the CLAVATA1 receptor-kinase// Science. 2000. V. 289(5479). P. 613-617.

123. Tyler L., Thomas S.G., Hu J., Dill A., Alonso J.M., Eeker J.R., Sun T.P. Delia proteins and gibberellin-regulated seed germination and floral development in Arabidopsis II Plant Physiol. 2004. V. 135(2). P. 1008-1019.

124. Weigel D., Alvarez J., Smyth D.R., Yanofsky M.F., Meyerowitz E.M. LEAFY controls floral meristem identity in Arabidopsis II Cell. 1992. V. 69(5). P. 843-859.

125. Wells L., Vosseller K., Hart G.W. Glycosylation of nucleocytoplasmic proteins: signal transduction and O-GlcNAc // Science. 2001. V. 291. P. 2376-2378.

126. Wen C-K., Chang C. Arabidopsis RGL1 encodes a negative regulator of gibberellin responses // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 87-100.

127. Whitelam G.C., Johnson E., Peng J., Carol P., Anderson M.L., Cowl J.S., Harberd N.P. Phytochrome A null mutants of Arabidopsis display a wild-type phenotype in white light // Plant Cell. 1993. V. 5(7). P. 757-768.

128. Williams R.W. Plant homeobox genes: many functions stem from a common motif //BioEssays. 1998. V. 20. P. 280-282.

129. Wilson R.N., Heckman J.W., Somerville C. R. Gibberellin is required for flowering in Arabidopsis thaliana under short days // Plant Physiol. 1992. V. 100(1). P. 403408.

130. Wilson R.N., Somerville C. R. Phenotypic suppression of the gibeberellin-insensitive mutant (gai) of Arabidopsis И Plant Physiol. 1995. V.108. P. 495-502.

131. Wolbang C.M, Chandler P.M, Smith J.J, Ross J.J. Auxin from the developing inflorescence is required for the biosynthesis of active gibberellins in barley stems // Plant Physiology. 2004. V.134. P.769-776.

132. Woodward A.W., Bartel B. Auxin: Regulation, Action, and Interaction // Annals of Botany. 2005. V. 95(5). P.707-735.

133. Zenser N., Ellsmore A., Leasure C., Callis J. Auxin modulates the degradation rate of Aux/IAA proteins // Proc Natl Acad Sci U S A. 2001. V. 98(20). P. 1179511800.