Участие генов LSU в контроле цветения Arabidopsis thaliana

Мякушина, Юлия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие генов LSU в контроле цветения Arabidopsis thaliana
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие генов LSU в контроле цветения Arabidopsis thaliana"

□03485735

На правах рукописи /./

Мя кушана Юлия Александровна

УЧАСТИЕ ГЕНОВ ЬБи В КОНТРОЛЕ ЦВЕТЕНИЯ АКАВШОРБШ ТНЛЫАКЛ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- з ДЕН 2009

Москва-2009

003485735

Работа выполнена в лаборатории сигнальных систем контроля онтогенеза им. акац. М.Х. Чайлахяна Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва и в Институте молекулярной физиологии растений им. Макса Планка, г. Гольм, Германия

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 22 декабря 2009 г. в 11 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (495) 977-80-18, e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан 21 ноября 2009 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

Романов Георгий Александрович Никифорова Виктория Юлиановна

Хавкин Эмиль Ефимович Носов Александр Владимирович

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы достигнут большой прогресс в изучении молекулярных механизмов роста и развития растений. Обнаружены гены, активность которых необходима для протекания важнейших физиологических процессов в растительном организме (Лутова и др., 2000).

В настоящее время одним из основных подходов в исследовании механизмов протекания и регуляции физиологических и биохимических процессов растений является использование трансгенных растений с избирательным подавлением «работы» индивидуальных или групп генов методами инсерционного мутагенеза и РНК-интерференции (RNAi) (Krysan et al, 1999; Matthew, 2004).

Наиболее популярным модельным объектом в изучении биологии развития растений является Arabidopsis thaliana (Ежова и др., 2003). В 2000 году было полностью завершено секвенирование его генома (Arabidopsis Genome Initiative, 2000), что упростило работу по идентификации новых генов и генетических сетей, вовлеченных в различные стадии роста и развития растений.

Несмотря на то, что растения А. thaliana интенсивно изучаются в течение десятков лет, в настоящее время идентифицированы функции лишь части его генов. В соответствии с базой данных Gene Ontology участие в определенных биологических процессах обнаружено для ~50% генов, а для -49% генов найдены клеточные компоненты, с которыми могут быть связаны их белковые продукты (Haas et al., 2005; Swarbreck et al., 2008).

Среди более чем 25000 белок-кодирующих генов арабидопсиса (The Arabidopsis Information Resource, TAIR) ген At3g49580, получивший название LSU1, недавно привлек наше внимание в связи с участием в ответе на дефицит серы (Nikiforova et al., 2005). Однако до сих пор этот и гомологичные ему гены А. thaliana никем специально не изучались.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение возможной роли LSU-генов в онтогенезе растений арабидопсиса. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести структурный анализ генов LSU А. thaliana и кодируемых ими белков методами биоинформатики.

2. Провести морфофизиологический анализ инсерционных мутантов по генам LSU.

3. Получить мутант с одновременным подавлением экспрессии нескольких генов LSUc использованием технологии RNAi.

4. Провести морфофизиологический анализ RNAi-мутанта.

5. Проанализировать экспрессию генов, потенциально ответственных за формирование фенотипических признаков, подвергшихся изменениям у инсерционных мутантов и RNAi-мутанта A. thaliana. Найти корреляции с изменениями фенотипа.

Научная новизна работы. Впервые проведен анализ аминокислотных последовательностей белков семейства LSU методами биоинформатики и обнаружено наличие протяженных участков, формирующих альфа-спирали, а также потенциальных двухспиральных доменов димеризации coiled-coil. С помощью биоинформатических программ предсказана ядерная локализация белков LSU.

Впервые проведены молекулярно-физиологические исследования мутантных линий арабидопсиса по генам LSU. В ходе работы обнаружено, что подавление экспрессии генов LSU вызывает позднее зацветание, подавление роста главного цветоноса, а также нарушение развития цветков и формирования семян у A. thaliana.

Впервые обнаружено, что гены LSU необходимы для координированной работы генов АВСЕ-модели цветения.

Практическое значение работы. Полученные результаты имеют как фундаментальный характер, так и предоставляют возможность практического применения. Данные фундаментального характера о свойствах /sti-мутантов могут быть использованы при подготовке лекционного материала для чтения курсов физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений, а также послужить базой для дальнейших исследований функции генов семейства LSU. В перспективе полученные результаты могут найти применение в генно-инженерной биотехнологии при создании растений с определенными хозяйственно-ценными признаками и измененными характеристиками цветения. Цветение - один из ключевых процессов в жизни растений, оно определяет продуктивность многих с/х культур. Поэтому управление цветением является перспективным подходом для повышения их урожайности.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на 7-й Международной конференции «Sulfur metabolism in plants» (Варшава, 2008), на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск,

2008), на Международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера» (Апатиты, 2009), на 13-й Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), на Республиканской конференции молодых ученых «Развитие биотехнологии в Республике Мордовия» (Саранск, 2009), на VI-й Международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе в журнале Доклады РАН из списка ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на О страницах машинописного текста, содержат ? таблиц и 39 рисунков. Список литературы включает источников, из которых зарубежной литературы - .

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись трансформированные и нетрансформированные факультативно длиннодневные растения A. thaliana экотипа Columbia-0:

1. ^трансформированный контроль - растения дикого типа (WT).

2. Трансформированный контроль - растения с введенным вектором pK7GWIWG2(II) без целевого гена.

3. Три линии инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4, мутации которых были вызваны интеграцией Т-ДНК вектора pROK2 в 5'- нетранслируемый регион гена LSU2 (SALK_031648) и в экзон гена LSU4 (SALK_069114), а также интеграцией Т-ДНК вектора рАС161 в промоторную область гена LSU3 (GABI 207B03). Семена инсерционных мутантов lsu2 и lsu4 получены из Nottingham Arabidopsis Stock Center (Великобритания). Инсерционный мутант lsu3 был произведен в рамках проекта «GABI-Kat» (Rosso et. al., 2003) и получен от Bernd Weisshaar (MPI for Plant Breeding Research; Cologne, Германия).

4. Мутант LSUl-RNAi - растения с введенным вектором pK7GWIWG2(II), содержащим фрагменты гена LSU1.

Условия выращивания растений. Дикий тип и мутантные растения A. thaliana выращивали в почве при температуре 22°С днем и 18°С ночью в условиях длинного дня (ДД, 16 ч света и 8 ч темноты) и короткого дня (КД, 8 ч света и 16 ч темноты). Для освещения использовали флуоресцентные лампы с интенсивностью света 120 мкмоль м'2 сек"1. Сроки зацветания растений арабидопсиса определяли путем подсчета числа листьев в розетке 20 растений после появления первого бутона (Koornneef et al., 1991). Для морфологического анализа было использовано также по 20 растений каждой мутантной линии и контрольных растений.

Получение мутанта LSUl-RNAi. Мутант LSUl-RNAi получен с использованием механизма РНК-интерференции (Hannon, 2002) в результате интегрирования в геном А. thaliana экспрессируемой ДНК под конститутивным промотором 35S CaMV, содержащей два повторяющихся фрагмента гена LSU1 в смысловой и антисмысловой ориентации. Для клонирования был взят фрагмент гена LSU1 длиной 272 нуклеотида (с 9 по 330 нуклеотид), располагающийся в области максимальной гомологии нуклеотидных последовательностей генов семейства LSU (70-89%), определенной путем выравнивания нуклеотидных последовательностей генов LSU с помощью программы ClustalW2 (Larkin et. al., 2007). При создании LSUl-RNAi мутанта была использована технология клонирования Gateway (Invitrogen), которая основана на реакциях сайт-специфической рекомбинации бактериофага X.

Трансформация арабидопсиса агробактериями. Для трансформации использовали Agrobacterium tumefaciens штамма GV3101, несущего бинарный вектор pK7GWIWG2(II) с целевым геном или без него. Трансформацию растений А. thaliana в возрасте 5-6 недель проводили методом вакуумной инфильтрации (Bechtold et al., 1993).

Количественная ПЦР в реальном времени. В качестве растительного материала для выделения РНК использовали надземную часть растений, находящихся на стадии цветения после формирования первых 5-10 цветков. Количественную ПЦР в реальном времени проводили на системе ABI PRISM 7900НТ Sequence Detection System (Applied Biosystems, Великобритания) с использованием SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Результаты ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения SDS 2.0 (Applied Biosystems). Эффективность ПЦР определяли с помощью программы LinRegPCR (Ramskers et al., 2003). Содержание индивидуальных мРНК рассчитывали относительно уровня мРНК гена UBIQUITIN10 (UBQ10).

Компьютерные методы анализа. Множественные выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и определение степени их сходства осуществляли с использованием программы ClustalW2 (Larkin et al., 2007). Анализ вторичной структуры белков LSU выполняли с применением программы GOR4 (Combet et al., 2000). Поиск coiled-coil доменов в последовательностях белков LSU проводили с использованием программы MULTICOIL (Wolf et al., 1997). Предсказание субклеточной локализации белков LSU осуществляли при помощи биоинформатических программ BaCelLo (Pierleoni et al., 2006), CELLO (Yu et al., 2006), MultiLoc (Hoeglund et al., 2006) и SubLoc (Chen et al., 2006). Анализ промоторных последовательностей генов LSU выполняли с использованием программ Arabidopsis thaliana Map (AthaMap) (Bülow et al., 2009) и Arabidopsis Gene Regulatory Information Server (AGRIS) (Davuluri et al., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ генов семейства LSU и кодируемых ими белков средствами биоинформатики.

С помощью программы BLAST базы данных TAIR дополнительно к LSU1 было выявлено ещё три близких по структуре гена, которые вместе образуют небольшое семейство: LSU1 (AÚg49580), LSU2 (At5g24660), LSU3 (At3g49570) и LSU4 (At5g24655).

Относительно короткие гены LSU1, LSU2, LSU3 и LSU4, длиной 509, 556, 492 и 525 нуклеотидов соответственно, не содержат интроны и расположены попарно на третьей (LSUJ и LSU3) и пятой (LSU2 и LSU4) хромосомах A. thaliana. Они кодируют белки соответствующей длины в 94, 94, 97 и 92 аминокислоты, молекулярной массы 10.6-11.2 кДа (рис. 1).

Анализ нуклеотидных последовательностей генов семейства LSU и аминокислотных последовательностей, кодируемых этими генами белков, с помощью программы ClustalW2 показал, что их гомология составляет 63-77% для генов и 60-89% для белков. Это с большой степенью вероятности указывает на то, что исследуемые гены выполняют сходную функцию у A. thaliana.

Компьютерное предсказание вторичной структуры белков семейства LSU, выполненное с использованием программы GOR4, выявило наличие протяженных участков, формирующих альфа-спирали. Дальнейший анализ аминокислотных последовательностей с помощью программы MULTICOIL

установил наличие потенциальных двухспиральных доменов димеризации соПес1-соП, богатых остатками глутаминовой кислоты (01и/Е) (рис. 1).

LSU1 MANRGGCVWAÁEEMPEÍSSl К СИ QRTWAEEAEEQLCSQLAEL 60

LSU4 EAESLDQARDYHTRIIFLTNQLSRFSSDSASP-----92

LSU2 EAESLDQAM3YHSRXIFEMHELSRLSSDSASASP--- 94 LSU3 EVESLDQARDYHSRIVFLMDQISRLSSSSLEWVTNS 97 LSU1 EVESLEQARDYHDRMLFLMDQISRLSSSSWSSS---94

Рис. 1. Аминокислотные последовательности белков семейства LSU A. thaliana. Области белков, образующие альфа-спирали выделены голубым цветом. Потенциальные coiled-coil домены выделены красным цветом. (*) - идентичные аминокислотные остатки; (:) - консервативные аминокислотные замены; (.) -полуконсервативные аминокислотные замены. Значения в конце строк соответствуют номеру последнего в строке аминокислотного остатка.

Coiled-coil домены состоят из повторов, представляющих собой гептады вида «abcdefg». При этом в положениях «а» и «d» располагаются гидрофобные, а в положениях «е» и «g» - полярные аминокислотные остатки (Lupas, 1996; Mason, Arndt, 2004). Такой повторяющийся мотив из 7-ми аминокислотных остатков характерен для белков, способных к образованию сверхспиралей, состоящих из двух и более альфа-спиралей (Moutevelis, Woolfson, 2009).

Белки с короткими coiled-coil доменами, содержащими около 6-7 гептад, характерны для семейств транскрипционных факторов арабидопсиса «лейциновая застежка» (leucine zipper) (bZIP) и «спираль-петля-спираль» (helix-loop-helix) (bHLH) (Jakoby et al., 2002; Toledo-Ortiz et al., 2003). Таким образом, обнаружение коротких потенциальных coiled-coil доменов в аминокислотных последовательностях всех белков семейства LSU указывает на возможность осуществления ими межбелковых взаимодействий (т.е. формирования белковых димеров), а также на вероятное участие в регуляции экспрессии генов.

Предположение о вовлеченности белков семейства LSU A. thaliana в регуляцию генной экспрессии подкрепляется предсказанием их ядерной локализации с помощью компьютерных программ BaCelLo, CELLO, MultiLoc и SubLoc.

2. Анализ промоторных последовательностей генов LSU.

Анализ промоторных областей (длиной 1500 нуклеотидов) генов LSU с использованием программ Arabidopsis thaliana Мар (AthaMap) и Arabidopsis Gene Regulatory Information Server (AGRIS) выявил наличие предполагаемых сайтов связывания для ряда транскрипционных факторов, таких, как: LEAFY (LFY), SEPALLATA1 (SEP1), SEPALLATA 4 (SEP4), AGAMOUS (AG), AGAMOUS-LIKE 15 (AGL15) и LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2).

Белковый фактор LFY распознает 5'-CCANTG-3' ДНК-участки (N -аденин (А), тимин (Т), гуанин (G) или цитозин (С)) (William et al., 2004). Его основная функция состоит в индукции цветения. Кроме того, после инициации перехода арабидопсиса к репродуктивной фазе развития, LFY активирует работу генов, формирующих органы цветка (Weigel and Ñilsson, 1995; Lohmann, Weigel, 2002).

Транскрипционные факторы SEP1 и SEP4, которые связываются с ДНК в соответствующих областях 5'-TT(A/T)CC(A/T)4NNGG(A/T/C)(A/T)2-3' и 5'-TT(A/T)C(C/T)A(A/T)4T(A/G)G(A/T)AA-3' (Huang et al., 1995, 1996), участвуют в регуляции развития чашелистиков, лепестков, тычинок и пестика, а также выполняют важную роль в детерминации флоральной меристемы (Pelaz et al., 2000; Ditta et al., 2004).

Транскрипционный фактор AG связывается с последовательностями ДНК 5'-NN(A/T)NCCA(A/T)4T(A/G)G(A/T)(A/T)AN-3' (Huang et al., 1993) и определяет развитие тычинок и пестика в цветках арабидопсиса, а также поддерживает детерминированность флоральной меристемы (Jack, 2004; Vijayraghavan et al., 2005).

Главная роль генов AGL15 и LEC2 заключается в регуляции процессов развития и созревания семян (Perry et al., 1996; Santos-Mendoza et al., 2008). Белковые факторы AGL15 и LEC2 осуществляют регуляцию транскрипции, связываясь с 5' -ТТ АСТ АТ АТ АТ AGT А А-3' и 5'-CATGCA-3' последовательностями в промоторных областях генов арабидопсиса (Tang, Perry, 2003; Braybrook et al., 2006).

Следовательно, согласно результатам анализа промоторов, функция генов семейства ЬБи может быть связана со следующими процессами, происходящими в онтогенезе А. ЛаИапа: переходом к цветению, развитием цветков, а также формированием семян.

3. Морфофизиологические особенности инсерционных мутантов Ьи, выращенных в условиях КД.

Функциональная роль индивидуального гена в организме особенно четко проявляется при подавлении его экспрессии. В этой связи в современной физиологии и биохимии растений активно применяются методы так называемой функциональной генетики, которые позволяют подавить экспрессию исследуемого гена и таким образом приблизиться к пониманию его роли в онтогенезе растения.

Инсерционный мутагенез является одним из широко используемых способов «выключения» гена. Подавление экспрессии гена у инсерционных мутантов происходит в результате встраивания протяженной чужеродной ДНК в его последовательность.

При изучении функции генов семейства ЬБи было использовано три инсерционных мутанта Ьи2, ЬиЗ и Ьи4, в которых соответственно нарушена транскрипция генов ЬБШ, ЬБШ и Ь81]4.

В работе были исследованы рост и развитие мутантов Ьи2, ЬиЗ и Ьи4 в различных фотопериодических условиях: ДД (длинный день) или КД (короткий день).

Анализ развития мутантных растений не выявил каких-либо явных различий в скорости прорастания семян, образовании проростков, формировании корневой системы и листьев по сравнению с диким типом А. ЖаИапа.

Изменения в развитии мутантных линий проявлялись при переходе растений к цветению и выражались в различии времени зацветания, изменении архитектуры соцветий и нарушении развития репродуктивных органов арабидопсиса. При этом сроки зацветания исследуемых мутантных растений варьировали в зависимости от условий выращивания.

В условиях ДЦ не было выявлено существенных различий в скорости зацветания мутантных растений по сравнению с диким типом (табл. 1).

Значительное запаздывание перехода к цветению исследуемых мутантов было обнаружено в условиях КД. Инсерционный мутант ЬиЗ зацветал на 22 дня

позднее, чем дикий тип. Еще более значительные различия во времени зацветания были выявлены у мутантов Ьи2 и lsu4, которые переходили к цветению на 36-37 дней позже дикого типа A. thaliana.

Данные в таблице свидетельствуют о важности функционирования генов LSU при переходе арабидопсиса к цветению в неиндуктивных для зацветания условиях КД.

Табл. 1. Сроки зацветания мутантов Ьи2, ЬиЗ и Ьи4 по сравнению с диким типом А. ЛаИапа в условиях короткого дня (КД) и длинного дня (ДД)

Растение ДД КД

Время Число Время Число

зацветания листьев зацветания листьев

(число дней)а в розетке 6 (число дней) в розетке

Дикий тип 27,5 ±1,2 12,2 ±1,2 73 ± 2,8 61,2 ±2,4

Ьи2 мутант 28,2 ±1,4 13,6 ±1,3 109 ±4,1 71,8 ±3,1

ЬиЗ мутант 28,3 ±1,3 13,7 ±1,2 91 ±3,1 68,1 ±2,6

Ьи4 мутант 28,7 ±1,3 14,1 ±1,1 110 ±4,5 74,0 ± 2,5

а Данные представляют среднее значение и стандартное отклонение числа дней от посадки до формирования первого бутона у 20-ти растений.

6 Данные представляют среднее значение и стандартное отклонение числа листьев в розетке у 20-ти растений.

По сравнению с диким типом, в условиях КД инсерционные мутанты lsu2, ЬиЗ и lsu4 проявляли заметные фенотипические отличия.

На ранней стадии цветения у 85% мутантов lsu2 и 80% мутантов ЬиЗ и Ьи4 наблюдалось подавление роста главного цветоноса, вследствие чего первые 510 цветков на центральной оси соцветия образовывали плотные кластеры (рис. 2 Б, В, Г). При дальнейшем развитии мутантов Ьи2 рост главного цветоноса восстанавливался и расстояния между цветками, образованными на поздней стадии цветения, выравнивались (рис. 3 Б, В). Среди мутантов Ьи2 и Ьи4 наблюдалось как восстановление (рис. Г, Ж), так и отсутствие восстановления роста главного цветоноса (рис. 3 Д, Е, 3). При этом, средняя высота центральной оси соцветия инсерционных мутантов Ьи была в 1,5-2 раза меньше, чем у дикого типа А. thaliana (рис. 4 Б, В, Г).

Рис. 2. Подавление роста главного цветоноса инсерционных мутантов Ьи2, ЬиЗ и Ьи4 А. ЛаИапа на начальных стадиях цветения в условиях короткого дня. А - дикий тип; Б - мутант Ьи2\ В - мутант ЬиЗ; Г - мутант Ьи4.

Рис. 3. Рост главного цветоноса инсерционных мутантов Ьи2, ЬиЗ и Ьи4 А. ЛаЧапа на поздних стадиях цветения в условиях короткого дня. А - дикий тип; Б, В - мутант Ьи2; Г, Д, Е - мутант ЬиЗ', Ж, 3 - мутант Ьи4. Стрелками показаны кластеры, состоящие из цветков и стручков.

Рисунок 4. Архитектура соцветий инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4, выращенных в условиях короткого дня. А - дикий тип A. thaliancr, Б - мутант lsu2\ В -мутант lsu3\ Г - мутант lsu4. Главные цветоносы показаны стрелками.

Причина подавления роста главного цветоноса инсерционных мутантов Isu, возможно, заключалась в изменении гормонального гомеостаза арабидопсиса, что выражалось также в позднем зацветании мутантных линий.

Кроме представленных выше фенотипических изменений, в условиях КД инсерционные мутанты lsu2, lsu3 и lsu4 характеризовались образованием дефектных цветков на главной оси соцветия. В отличие от цветков растений дикого типа, дефектные цветки мутантов не раскрывались и оставались в виде бутонов. Первые 3-4 цветка инсерционных мутантов lsu2 и lsu4, образованные на начальной стадии цветения, имели нормальные чашелистики, но редуцированные, неразвитые лепестки, тычинки и пестик (рис. 5 Б, 3). Такие нераскрывшиеся цветки не образовывали стручков и со временем просто опадали. Пестик первых 3-4 цветков инсерционного мутанта lsu3 развивался нормально, но при этом разрастания завязи и формирования стручков не происходило (рис. 5 Д, Е). Цветки мутантных растений Isu, формирующиеся позднее, наряду с нормальными чашелистиками, неразвитыми лепестками и тычинками имели объемный пестик, занимавший почти все внутреннее пространство (рис. 5 В, Ж, И). Такие аберрантные цветки формировали стручки, но не образовывали жизнеспособных семян. В то же время цветки мутантов Isu, сформированные на поздней стадии цветения, развивались совершенно нормально.

Рис. 5. Морфология цветков инсерционных мутантов Ыи2, ЬиЗ и Ьи4 А. ЖаИапа. А - цветок дикого типа, находящийся на стадии бутона; Б, В, Г - цветки мутанта Ьи2; Д, Е, Ж - цветки мутанта ЬиЗ~, 3, И - цветки мутанта Ьи4. Растения выращены в условиях короткого дня (кроме Г - в условиях длинного дня). На всех фотографиях бар = 200 мкм.

Подобно Ify и api мутантам (Weigel et al., 1992; Huala, Sussex, 1992; Schultz, Haughn, 1993; Bowman et al., 1993), у исследуемых нами растений с мутацией генов LSU2, LSU3 или LSU4 наиболее значительные нарушения в развитии цветков наблюдались в нижней части соцветия, что могло быть связано с подавлением экспрессии генов LFYили APETALA 1 (API).

Кроме того, гены LFY и API, а также APETALA 2 (АР2), APETALA 3 (АРЗ), PISTILLATA (PI), AG и SEP1-4 являются основными генами, регулирующими развитие цветка (Jack, 2004). Поэтому мы предположили, что формирование дефектных цветков в условиях КД у инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4 связано с изменением экспрессии вышеуказанных генов.

Таким образом, по сравнению с диким типом, в условиях КД инсерционные мутанты lsu2, lsu3 и lsu4 характеризовались следующими признаками: 1) поздним зацветанием, 2) подавлением роста главного цветоноса и 3) формированием дефектных цветков.

4. Морфологические особенности инсерционных lsu-мутантое, выращенных в условиях ДД.

В условиях ДД развитие инсерционных мутантов lsu3 и lsu4 не отличалось от дикого типа A. thaliana: растения развивались с одинаковой скоростью; архитектура соцветий мутантных растений соответствовала дикому типу арабидопсиса; инсерционные мутанты формировали совершенного нормальные цветки.

В отличие от lsu3 и lsu4, в условиях ДД инсерционный мутант lsu2 формировал дефектные цветки (рис. 5 Г). Нарушение развития проявлялось у первых 5-7 цветков, образованных в начальный период цветения на главной оси соцветия. Цветки характеризовались наличием редуцированных лепестков, тычинок и пестика, при нормальных чашелистиках (рис. 5 Г). Такие дефектные цветки не раскрывались, оставаясь в виде бутонов, и со временем опадали, не образовывая стручков. В то же время на поздней стадии цветения мутанта lsu2 формировались совершенно нормальные цветки, образующие стручки с жизнеспособными семенами.

Таким образом, нарушения в развитии инсерционных мутантов lsu3 и lsu4 обнаружены при определенных условиях фотопериода (КД). Нарушения в развитии инсерционного мутанта lsu2 наблюдались при различных фотопериодах (ДД и КД) с более ярким проявлением мутантных признаков в условиях КД.

5. Изменение экспрессии генов семейства LSU у инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4.

Экспрессия генов семейства LSU у исследуемых инсерционных мутантов была оценена по содержанию мРНК с помощью метода количественной ПЦР в реальном времени.

Анализ экспрессии генов семейства LSU у инсерционных мутантов Isu2, lsu3 и lsu4 (рис. 6) показал следующее:

1. Экспрессия гена LSU2 в инсерционном мутанте lsu2 была подавлена примерно в 9 раз (на ~90%). При этом экспрессия гена LSU4 снижалась в среднем в 11 раз (на ~90%), а содержание мРНК генов LSU1 и LSU3 увеличивалось в среднем в 2 раза. Таким образом, в инсерционном мутанте lsu2 была подавлена экспрессия одновременно двух генов: LSU2 и LSU4.

2. В мутанте lsu3 экспрессия гена LSU3 была снижена примерно в 6 раз (на ~80%). При этом содержание мРНК генов LSU1 и LSU2 увеличивалось в 2-3 раза. Экспрессия гена LSU4 не изменялась.

3. Экспрессия гена LSU4 в инсерционном мутанте lsu4 была подавлена примерно в 11 раз (на ~90%). При этом содержание мРНК гена LSU2 увеличивалось в среднем в 4.5 раза, а генов LSU1 и LSU3 - не изменялось.

4. Значительного варьирования экспрессии генов семейства LSU в зависимости от длины дня (ДД или КД) не наблюдалось.

Isu2 Isu3 Isu4 Isu2 Isu3 Isu4

Короткий день Длинный день

Рис. 6. Уровень экспрессии генов семейства ЬБЦ у инсерционных мутантов !.ш2, ЬиЗ и Ьи4. Приведено содержание мРНК относительно дикого типа А. ЛаИапа (принято за 1) ± стандартное отклонение при трех биологических повторностях.

Из приведенных данных видно, что гены семейства LSU взаимно компенсируют недостаточную экспрессию друг друга. Подавление транскрипции одного из LSU-генов вызывает усиление экспрессии других генов этого семейства от 2 до 5 раз. Исключение составляет снижение экспрессии LSU4 у инсерционного мутанта lsu2, содержащего Т-ДНК инсерцию в гене LSU2.

Исходя из анализа экспрессии собственных генов семейства LSU у исследуемых инсерционных мутантов следует, что подавление экспрессии одновременно двух генов семейства LSU вызывало усиление фенотипических признаков у инсерционного мутанта lsu2: нарушение развития цветков не только при КД, но и при ДД. Все это служит еще одним указанием на то, что гены LSU2, LSU3 и LSU4 могут быть вовлечены в одни и те же процессы развития A. thaliana.

6. Анализ экспрессии гена LFY и генов АВСЕ-модели у исследуемых инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4.

Основными генами, ответственными за формирование цветка у арабидопсиса, являются гены идентичности органов цветка (гены АВСЕ-модели): API, АР2, АРЗ, PI, AG и SEP 1-4 (Coen, Meyerowitz, 1991; Pelaz et al., 2000; Ditta et al., 2004), a также ген идентичности флоральной меристемы LFY, выполняющий важную роль в активации транскрипции генов API, АРЗ и AG (Zik, Irish, 2003; Krizek, Fletcher, 2005). Подавление экспрессии этих генов приводит к нарушению развития органов цветка (Bowman et al., 1991; Krizek, Fletcher, 2005).

С помощью метода количественной ПЦР в реальном времени мы изучили экспрессию основных генов идентичности флоральной меристемы и органов цветка и выявили значительные изменения содержания их мРНК у инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4 по сравнению с диким типом A. thaliana в условиях КД.

Так, уровень экспрессии генов LFY, API, АРЗ, PI и SEP3 снижался примерно вдвое. С другой стороны, экспрессия генов АР2, AG и SEP2 значительно увеличивалась, в среднем в 10, 7 и 3 раз(а), соответственно (рис. 7 А). Следовательно, можно предположить, что подавление экспрессии генов LSU2, LSU3 или LSU4 у A. thaliana вызывало в условиях КД изменение работы гена LFY и генов АВСЕ-модели, что приводило к нарушениям в развитии органов цветка и, следовательно, семян.

¡.Г/ АР1 АР2 АРЗ

Р/

Ав БЕР2 ЭЕРЗ

¿.РУ АР1 АР2 АРЗ Р1 ЯIвы2 Ш киЗ

Ав ЭЕР2 БЕРЗ Ш1зи4

Рис. 7. Уровень экспрессии генов идентичности флоральной меристемы и органов цветка у инсерционных мутантов Ьи2, ЬиЗ и Ьи4 в условиях короткого дня (КД) и длинного дня (ДД). Приведено содержание мРНК относительно дикого типа А. ЛаИапа (принято за 1) ± стандартное отклонение при трех биологических повторностях. А - КД, Б - ДД.

В условиях ДД экспрессия генов идентичности флоральной меристемы и органов цветка у инсерционных мутантов ЬиЗ и Is и 4 практически не менялась по сравнению с диким типом (исключение составлял ген SEP2, экспрессия которого увеличивалась в среднем в 4 раза) (рис. 7 Б). Это объясняет, почему в индуктивных условиях (арабидопсис является факультативным растением длинного дня) мутантные растения образовывали нормально развитые цветки.

В отличие от мутантов ЬиЗ и lsu4, в мутантном растении lsu2 в условиях ДД экспрессия генов LFY, АРЗ, PI, AG и SEP3 была подавлена по сравнению с диким типом примерно в 2 раза (рис. 7 Б). Это, очевидно, и является причиной формирования дефектных цветков у инсерционного мутанта Ьи2 при индуктивных для зацветания арабидопсиса условиях длинного светового дня.

7. Получение RNAi-мутанта арабидопсиса. Данные экспрессии генов семейства LSUу мутанта LSU1-RNAL

В настоящее время чрезвычайно бурное развитие получило применение механизма РНК-интерференции в качестве мощного и удобного способа специфического подавления экспрессии генов для выяснения их функций. В этом случае используются гомологичные исследуемым генам двуцепочечные РНК как "экзогенные", так транскрибированные с интегрированных в геном конструкций, что вызывает «выключение» работы исследуемого гена (Harmon, 2002).

Механизм РНК-интерференции был использован нами для получения мутанта LSUl-RNAi путем интегрирования в геном арабидопсиса экспрессируемой ДНК под конститутивным промотором 35S CaMV, содержащей два повторяющихся фрагмента гена LSU1 в смысловой и антисмысловой ориентации.

В результате транскрипции встроенной в геном арабидопсиса плазмиды фрагменты гена LSU1 комплементарно соединяются друг с другом, образуя двуцепочечную РНК-шпильку, которая распознается специальными белками клетки и уничтожается. При этом должно происходить разрушение всех комплементарных ей последовательностей мРНК, вследствие чего экспрессия гена LSU1 подавляется.

Мы предположили, что, вследствие высокой гомологии последовательностей генов семейства LSU (63-77%), у мутанта LSUl-RNAi будет нарушена экспрессия не только LSU1, но также и других генов LSU.

о.

4,0

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

—к— Мя

¿.5(7?

[.виг

¡-виз

Рис. 8. Экспрессия генов ¿5(7 у мутанта в условиях длинного дня.

Приведено содержание мРНК относительно дикого типа (принято за 1) ± стандартное отклонение при трех биологических повторностях.

Из рисунка 8 видно, что в результате применения механизма РНК-интерференции у мутанта Ь81Л-ША1 действительно произошло подавление экспрессии как гена ЬБ1Л (в 10 раз, на -90%), так и генов ЬБ1]2 (в 2.6 раза, на -60%) и ЬБиЗ (в 8.2 раза, на -90%). В то же время, транскрипция гена Ь81]4 увеличивалась в 2.9 раза, что, вероятно, связано с компенсацией слабой экспрессии остальных генов семейства ЬБ1/.

Таким образом, в результате использования механизма РНК-интерференции была подавлена экспрессия сразу трех генов семейства ЬЯи (15(77,15112 и ЬБиЗ) из четырех.

8. Морфологические особенности LSUl-RNAi мутанта.

В условиях ДД не обнаружено разницы во времени зацветания между мутантом Ь81Л-ИЫА1 и контрольными растениями А. (каНапа. Формирования кластеров цветков у мутанта Ь81Л-КЫА1 также выявлено не было.

Тем не менее, подобно исследуемым инсерционным мутантам Ьи, выращенным в условиях КД, мутант ЬБШ-КМА! в условиях ДД характеризовался подавлением роста главного цветоноса (рис. 9 Б) и формированием дефектных цветков (рис. 10 Б, В). При этом аберрантные цветки образовывались не только на центральной оси соцветия, но и на боковых осях.

Рис. 9. Фенотип растений дикого типа (А) и мутанта (Б), выращенных в

условиях длинного дня. Стрелками показана главная ось соцветий.

Рис. 10. Морфология цветков мутанта А. ЛаИапа, выращенного в

условиях длинного дня. А - препарированный цветок дикого типа, находящийся на стадии бутона; Б, В - цветки мутанта 1£Ш-1ША1. На всех фотографиях бар=200 мкм.

В отличие от инсерционных мутантов Ьи, первые 2-3 цветка, сформированные на начальной стадии цветения на главной оси соцветия мутанта ЬЗШ-ЯАГА1, развивались совершенно нормально. При дальнейшем развитии главного цветоноса наблюдалось формирование цветков с нормальными чашелистиками, но с редуцированными, неразвитыми лепестками, тычинками и пестиком (рис. 10 Б), а также цветков с нормальными чашелистиками, но неразвитыми лепестками и тычинками и с объемным пестиком, занимавшим почти все внутреннее пространство (рис. 10 В). Первые цветки не образовывали стручков и со временем опадали, последующие -формировали стручки, но не жизнеспособные семена. В отличие от боковых

осей соцветия мутанта LSUl-RNAi, развития нормальных цветков в верхней части главного цветоноса на поздней стадии цветения не происходило.

9. Анализ экспрессии генов идентичности флоральной меристемы и органов цветка у LSUl-RNAi мутанта.

Анализ экспрессии гена LFY и генов АВСЕ-модели с помощью количественной ПЦР в реальном времени у LSUl-RNAi мутанта в условиях ДД выявил значительные изменения. Так, экспрессия гена LFY уменьшилась в 2.9 раза, АРЗ - в 2.9 раза, AG - в 9.1 раза, SEP2 - в 4.2 раза, а также SEP3 - в 2 раза. При этом экспрессия генов API и АР2 не изменилась, а содержание мРНК гена PI возросло в 7.1 раза (рис. 11).

Ген LFY выполняет важную роль в активации транскрипции API, АРЗ и AG (Zik, Irish, 2003; Krizek, Fletcher, 2005). Подавление его экспрессии вызывает снижение активности API, АРЗ и AG и, как следствие, приводит к образованию вегетативных побегов на месте цветков (Weigel et al., 1992, Weigel et al., 1993). Данные рисунка 11 подтверждают важность LFY в активации экспрессии АРЗ и AG: одновременно с подавлением экспрессии LFY наблюдается подавление экспрессии генов АРЗ и AG.

Рис. 11. Экспрессия гена ¿-ГУ и генов АВСЕ-модели у мутанта /ЛШ-Л/УЛ/. Приведено изменение содержания мРНК относительно дикого типа А. ЖаИапа (принято за 1) ± стандартное отклонение при трех биологических повторностях. Растения мутанта /.¿ГШ-ЛЛ^/ и дикого типа выращены в условиях длинного дня.

Из рисунка 11 также видно, что, в отличие от АРЗ и AG, активность гена API по сравнению с диким типом не изменилась. Возможно, это связано с тем, что транскрипция гена API в условиях ДД, кроме LFY, регулируется комплексом белков фотопериодического пути инициации цветения FT и FD (Abe et al., 2005; Wigge et al., 2005). Поэтому трехкратное подавление экспрессии LFY не вызвало снижения уровня экспрессии API.

Также с активацией генов фотопериодического пути возможно связано формирование совершенно нормальных цветков у мутанта LSUl-RNAi на ранней стадии цветения на главной оси соцветия в условиях ДД.

Таким образом, в результате подавления экспрессии одновременно трех генов семейства LSU у мутанта LSUl-RNAi произошли более значительные (от 3-х до 9-ти раз) изменения экспрессии гена LFY и генов АВСЕ-модели по сравнению с инсерционными мутантами Isu (примерно в 2 раза). Кроме того, по сравнению с исследуемыми инсерционными мутантами Isu, мутантный фенотип LSUl-RNAi был выражен сильнее: подавление роста центральной оси соцветия в условиях ДД, а также формирование дефектных цветков не только на главном, но и на боковых цветоносах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гены семейства LSU характеризуются высокой степенью сходства нуклеотидных последовательностей (63-77%). Уровень гомологии аминокислотных последовательностей, кодируемых генами белков, равен 60-89%. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что исследуемые гены выполняют сходную функцию в регуляции развития A. thaliana.

Анализ аминокислотных последовательностей белков LSU показал наличие протяженных участков, формирующих альфа-спирали, и потенциальных двухспиральных доменов димеризации coiled-coil. Это указывает на вероятное участие белков LSU в регуляции экспрессии генов и подтверждается указаниями на их локализацию в клеточном ядре.

Анализ промоторных последовательностей генов LSU выявил наличие сайтов связывания для ряда транскрипционных факторов, регулирующих процессы перехода к цветению, развитие органов цветка и семян арабидопсиса: LFY, AG, SEP1, SEP2, AGL15 и LEC2. Это свидетельствует о том, что гены LSU могут быть вовлечены в процессы цветения A. thaliana.

В условиях КД инсерционные мутанты lsu2, lsu3 и lsu4 переходили к цветению соответственно на 36, 22 и 37 дней позже дикого типа А. thaliana и характеризовались заметными фенотипическими отличиями. Так, у инсерционных мутантов Isu наблюдалось подавление роста главного цветоноса и формирование кластеров из первых 5-10 цветков. Кроме того, мутации генов LSU2, LSU3 и LSU4 вызывали образование дефектных цветков на главной оси соцветия А. thaliana с нарушением развития лепестков, тычинок и пестика.

В условиях ДД развитие инсерционных мутантов lsu3 и lsu4 не отличалось от дикого типа А. thaliana, а инсерционный мутант lsu2 формировал дефектные цветки с нарушением развития лепестков, тычинок и пестика.

Следовательно, мутантные признаки у lsu3 и lsu4 проявлялись только в условиях КД. В то же время нарушения в развитии инсерционного мутанта lsu2 наблюдались при различных фотопериодах (ДД и КД) с более ярким проявлением мутантных признаков в условиях КД.

При изучении экспрессии основных генов идентичности флоральной меристемы и органов цветка установлены значительные изменения содержания их мРНК у инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4 по сравнению с диким типом, что, вероятно, привело к нарушениям в развитии органов цветка.

В результате подавления экспрессии одновременно трех генов семейства LSU у мутанта LSUl-RNAi произошли более значительные изменения экспрессии гена LFY и генов АВСЕ-модели по сравнению с инсерционными мутантами Isu. При этом мутантный фенотип LSUl-RNAi был выражен сильнее: наблюдалось подавление роста главного цветоноса в условиях ДД, а также формирование дефектных цветков не только на центральной, но и на боковых осях соцветия.

Таким образом, в настоящей работе впервые представлены конкретные экспериментальные данные относительно функции генов семейства LSU, показавшие, что исследуемые гены, по всей видимости, кодируют транскрипционные факторы и вовлечены в контроль процессов цветения А. thaliana.

выводы

1. Гены семейства ЬБи А. ЛаНапа и кодируемые ими белки характеризуются высокой степенью гомологии (соответственно 63-77% и 60-89%). Обнаружение потенциальных соПес!-сой доменов и предположительная локализация белков ЬБи в клеточном ядре указывают на возможность выполнения белками ЬБи функции транскрипционных факторов.

2. Инсерционные мутанты по генам ¿Б(13 или ЬБ114 характеризуются поздним зацветанием, подавлением роста главного цветоноса, нарушением развития цветков и семян, что проявляется в условиях короткого светового дня. При этом других изменений фенотипа не отмечено.

3. Подавление экспрессии сразу нескольких X¿'¿/-генов усиливает фенотипические признаки мутантных растений. Инсерционный мутант Ьи2 (подавлена транскрипция генов Ь8Ш и ЬБи4) и мутант 1Б1Л-КЫА1, полученный с использованием технологии РНК-интеференции (нарушена экспрессия трех генов ЬБШ, ЬБШ и ЬБиЗ), формируют дефектные цветки в условиях не только короткого, но и длинного дня.

4. Дефектные цветки, формирующиеся на центральной оси соцветия у инсерционных мутантов и на центральной и боковых осях соцветия у Ш<Ш-мутанта, характеризуются нарушениями развития лепестков, тычинок и пестика.

5. У мутантов по генам семейства установлены изменения экспрессии генов АВСЕ-модели цветения и гена ЬРУ. Это указывает на необходимость генов ЬБи для координированной работы регуляторных генов, ответственных за формирование соцветий и цветков у А. ЛаНапа.

6. Гены семейства ЬБи могут компенсировать недостаточную экспрессию друг друга. Подавление транскрипции одного или нескольких ЬБИ-генов вызывает, как правило, активацию работы других генов этого семейства от 2 до 5 раз.

7. Таким образом, в работе впервые описана возможная роль генов ЬБи в онтогенезе арабидопсиса. Результаты работы позволяют предположить, что гены семейства вовлечены в процессы регуляции транскрипции и участвуют в формировании органов цветка и определении сроков зацветания растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мякушина Ю.А., Миляева Э.Л., Романов Г.А., Никифорова В.Ю. Мутация гена LSU4 растения Arabidopsis thaliana вызывает изменения в развитии органов цветка // Доклады Академии Наук. 2009. Т 428. N. 4. С. 556-559.

2. Мякушина Ю.А., Миляева Э.Л., Романов Г.А., Никифорова В.Ю. Гены семейства LSU (RESPONSE ТО LOW SULFUR) растения арабидопсис регулируют экспрессию друг друга и могут быть вовлечены в один биологический процесс // Материалы Республиканской конференции молодых ученых «Развитие биотехнологии в Республике Мордовия». Саранск. 2009. С. 35-39.

3. Lewandowska M., Moniuszko G., Kaminska J., Wawrzynska A., Myakushina Y., Nikiforova V., Sirko A. Investigating function of the genes induced by a short-term sulfur deficit: pleiotropic effects of changes in UP9 expression level // Abstracts of the 7th Workshop on «Sulfur metabolism in plants». Warsaw. 2008. P. 43.

4. Мякушина Ю.А., Никифорова В.Ю. Гены HRS1, HRS2, HRS3, HRS4 участвуют в ответе на дефицит серы и развитии растения Arabidopsis thaliana II Материалы Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)». Саранск. 2008. С. 256-257.

5. Мякушина Ю.А., Никифорова В.Ю., Миляева Э.Л., Романов Г.А. Изменения в развитии цветка у инсерционного мутанта lsu4 арабидопсиса // Материалы Международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера». Апатиты. 2009. С. 240-242.

6. Мякушина Ю.А., Миляева Э.Л., Романов Г.А., Никифорова В.Ю. Гены LSU2 и LSU3 являются гомологами гена LSU4 и выполняют сходную функцию в Arabidopsis thaliana II Сборник тезисов 13-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. 2009. С. 32.

7. Мякушина Ю.А., Миляева Э.Л., Романов Г.А., Никифорова В.Ю. Гены семейства LSU (RESPONSE ТО LOW SULFUR) участвуют в регуляции развития органов цветка Arabidopsis thaliana II Материалы VI-й международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Минск, 2009. С. 114.

Подписано в печать:

19.11.2009

Заказ № 3100 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мякушина, Юлия Александровна

Список условных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Генетический контроль времени зацветания A. thaliana.

1.1. Гормональная теория цветения растений М.Х. Чайлахяна.

1.2. Фотопериодический путь инициации зацветания.

1.3. Влияние качества света на время зацветания A. thaliana.

1.4. Яровизационный путь инициации зацветания.

1.5. Автономный путь инициации зацветания.

1.6. Гиббереллиновый путь инициации зацветания.

2. Гены-интеграторы путей инициации зацветания A. thaliana.

2.1. Ген-интегратор SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1.

2.2. Ген-интегратор LEAFY.

2.3. Ген-интегратор FLOWERING LOCUS T.

3. Гены идентичности флоральной меристемы A. thaliana.

3.1. Ген идентичности флоральной меристемы LEAFY.

3.2. Гены идентичности флоральной меристемы APETALA 1 и CAULIFLOWER.

3.3. Гомологи LFYи API A. thaliana у других растений.

3.4. Ген TERMINAL FLOWER 1.

3.5. Другие гены идентичности флоральной меристемы A. thaliana.

4. Генетический контроль развития цветка A. thaliana.

4.1. Структура и развитие цветка A thaliana.

4.2. Математическое моделирование цветка A. thaliana.

4.3. Гомеозисные мутанты A. thaliana.

4.4. ABC-модель развития цветка A. thaliana.

4.5. Регуляция экспрессия генов идентичности органов цветка

A. thaliana.

4.6. Антагонизм между генами классов А и С модели развития цветка

A. thaliana.

4.7. Гипотеза Гете о листовом происхождении элементов цветка.

4.8. Гены идентичности органов цветка класса Е. Развитие ABC-модели A. thaliana.

4.9. Молекулярные механизмы контроля идентичности органов цветка.

5. Гены семейства RESPONSE ТО LOW SULFUR (LSU).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Условия выращивания растений A. thaliana. Морфометрия.

2. Линии инсерционых мутантов A. thaliana.

3. ПЦР-метод определения наличия вставок у инсерционных мутантов Isu.

3.1. Выделение ДНК из растений.

3.2. Амплификация ДНК.

3.3. Электрофорез в агарозном геле.

4. Получение LSUl-RNAi мутанта.

4.1. Механизм РНК-интерференции.

4.2. Амплификация фрагмента гена LSU1.

4.3. Перенос фрагмента гена LSU1 в вектор pDC)NR207.

ВР-реакция рекомбинации.

4.4. Трансформация компетентных клеток Escherichia coli конструкцией pDONR207-I5't/7.

4.5. Перенос фрагмента гена LSU1 из конструкции pDONR207-Z5'Lr7 в бинарный вектор pKGWIWG2(II). LR-реакция рекомбинации.

4.6. Трансформация компетентных клеток Е. coli конструкцией pKGWIWG2(II)-ZS'L7.

4.7. Трансформация агробактерий.

4.8. Выращивание агробактерий для трансформации A. thaliana.

4.9. Трансформация арабидопсиса методом вакуумной инфильтрации.

4.10. Стерилизация и проращивание трансгенных семян.

4.11. Определение трансгенности растений.

5. Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени.

5.1. Выделение РНК растений.

5.2. Очистка выделенной РНК от примесей ДНК.

5.3. Синтез кДНК.

5.4. Количественная ПЦР в реальном времени.

6. Компьютерные методы анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Анализ генов семейства LSU и кодируемых ими белков средствами биоинформатики.

1.1. Структурный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

1.2. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей белков LSU A. thaliana и их гомологов у других растений.

1.3. Анализ промоторных последовательностей генов LSU.

1.4. Анализ экспрессии генов LSU1, LSU2 и LSU4 с помощью компьютерной базы данных GENEVESTIGATOR.

1.4.1. Характер экспрессии генов семейства LSU в ходе онтогенеза

A. thaliana.

1.4.2. Анализ экспрессии генов семейства LSU в различных органах

A. thaliana.

1.5. Краткие выводы.

2. Рост и репродуктивное развитие инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4 A. thaliana.

2.1. Скорость зацветания инерционных мутантов Isu в условиях

ДДиКД.

2.2. Морфологические особенности инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4.

2.2.1. Морфофизиологические особенности инсерционных мутантов

Isu, выращенных в условиях КД.

2.2.2. Морфологические особенности мутантов Isu, выращенных в условиях ДД.

2.2.3. Краткие выводы.

2.3. Изменение экспрессии генов семейства LSUу инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4.

2.4. Анализ экспрессии гена LFYи генов АВСЕ-модели у исследуемых инсерционных мутантов lsu2, lsu3 и lsu4.

3. Подавление экспрессии генов LSU с помощью механизма

РНК-интерференции.

3.1. Данные экспрессии собственных генов семействаLSU у LSUl-RNAi мутанта.

3.2. Морфологические особенности LSUl-RNAi мутанта.

3.3. Анализ экспрессии генов идентичности флоральной меристемы и органов цветка у LSUl-RNAi мутанта.

3.4. Краткие выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие генов LSU в контроле цветения Arabidopsis thaliana"

В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении молекулярных механизмов роста и развития растений. Обнаружены гены, активность которых необходима для протекания важнейших физиологических процессов в растительном организме (Лутова и др., 2000).

В современной физиологии и генетике растений одним из основных подходов в исследовании механизмов протекания и регуляции физиологических и биохимических процессов является использование трансгенных растений с избирательным подавлением «работы» индивидуальных или групп генов методами инсерционного мутагенеза и РНК-интерференции (RNAi).

Подавление экспрессии гена у инсерционных мутантов происходит в результате встраивания плазмидной ДНК агробактерий в последовательность гена. Механизм РНК-интерференции является другим удобным способом специфического подавления экспрессии генов для выяснения их функций. В этом случае используются гомологичные исследуемому гену "экзогенные" двуцепочечные РНК или короткие РНК, которые могут быть синтезированы in vitro или же транскрибироваться с интегрированных в геном конструкций. Такие РНК вызывают «выключение» работы данного гена или группы близкородственных генов (Krysan et al., 1999; Matthew, 2004).

Наиболее популярным объектом в изучении биологии развития растений является маленький сорняк из семейства крестоцветных Arabidopsis thaliana (Ежова и др., 2003). В 2000 году было полностью завершено секвенирование его генома {Arabidopsis Genome Initiative, 2000), что упростило работу по идентификации новых генов и генетических сетей, вовлеченных в различные стадии роста и развития растений. Наиболее полная версия генома арабидопсиса поддерживается интернет-сайтом «The Arabidopsis Information Resource» (TAIR).

В настоящее время хорошо известны коллекции инсерционных мутантов арабидопсиса, которые активно применяются для анализа функций генов данного растения (SALK, GABI-Kat и др.).

A. thaliana характеризуется небольшим размером генома (около 157 миллионов пар нуклеотидов), миниатюрностью, самоопыляемостью, высокой плодовитостью, а также коротким жизненным циклом. Малый размер A. thaliana позволяет легко выращивать его в лабораторных условиях, осуществлять манипуляции со сменой условий произрастания. Благодаря короткому репродуктивному циклу можно относительно быстро проводить опыты по скрещиванию и отбору. Арабидопсис ранее не имел прямой хозяйственной ценности, поэтому его геном долгое время рассматривался как модельный. Однако сейчас отношение к этому растительному объекту кардинально меняется, т.к. результаты исследования арабидопсиса оказали большое влияние как на растениеводство, так и медицину (Jones et al., 2008).

Приоритет открытия этого генетического объекта принадлежит отечественным ученым. В 1932-1933 гг. Б.М. Козо-Полянским была организована целевая экспедиция ленинградского ботанического института в район озера Эльтон для поиска новых объектов для генетических исследований. Искали подходящие растения-эфемеры, обладающие коротким жизненным циклом и малым числом хромосом. Результаты экспедиции были опубликованы в работе Н.Н. Титовой, 1935, «Поиски ботанической дрозофилы». Главным выводом работы была рекомендация использовать A. thaliana в качестве перспективного генетического объекта.

Огромный материал, полученный в результате расшифровки генома арабидопсиса, становится основой для широкомасштабного изучения генов растений методами сравнительной генетики и открывает перед наукой широкие перспективы. Так, выявление генов и механизмов регуляции их экспрессии позволяет существенно повысить продуктивность сельскохозяйственных растений на основе современных биотехнологических подходов. Обнаружение генов, отвечающих за такие важнейшие функции растительного организма, как размножение и продуктивность, а таюке устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды, позволяет усовершенствовать и ускорить процесс селекции культурных растений.

Таким образом, изучение отдельных генов, ответственных за синтез индивидуальных белков, определяющих конкретные функции организма растения, является важнейшим направлением биологии в целом и физиологии растений в частности.

Несмотря на то, что растения A. thaliana интенсивно изучаются в течение десятков лет, в настоящее время идентифицированы функции лишь части его генов. В соответствии с базой данных Gene Ontology участие в определенных биологических процессах обнаружено для -50% генов, а для -49% генов найдены клеточные компоненты, с которыми могут быть связаны их белковые продукты (Swarbreck et al., 2008).

Среди более чем 25000 белок-кодирующих генов арабидопсиса (база данных TAIR) ген At3g49580, получивший название LSU1, недавно привлек наше внимание в связи с участием в ответе на дефицит серы (Nikiforova et al., 2005). Однако до сих пор этот и гомологичные ему гены A. thaliana никем специально не изучались.

Целью данного исследования являлось изучение возможной роли LSU-генов в онтогенезе растений арабидопсиса.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести структурный анализ генов LSU A. thaliana и кодируемых ими белков методами биоинформатики.

2. Провести морфофизиологический анализ инсерционных мутантов по генам LSU.

3. Получить мутант с одновременным подавлением экспрессии нескольких генов LSU с использованием технологии RNAi.

4. Провести морфофизиологический анализ RNAi-мутанта.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Согласно результатам диссертационной работы подавление экспрессии генов LSU вызывает позднее зацветание в условиях короткого дня, подавление роста главного цветоноса, нарушение развития цветков и семян арабидопсиса. В связи с этим, в обзоре будет рассмотрена основная литература, относящаяся к генетическому контролю перехода к цветению, а также развитию соцветия и цветка A. thaliana.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Мякушина, Юлия Александровна

выводы

1. Гены семейства LSU A. thaliana и кодируемые ими белки характеризуются высокой степенью гомологии (соответственно 63-77% и 60-89%). Обнаружение потенциальных coiled-coil доменов и предположительная локализация белков LSU в клеточном ядре указывают на возможность выполнения белками LSU функции транскрипционных факторов.

2. Инсерционные мутанты по генам LSU3 или LSU4 характеризуются поздним зацветанием, подавлением роста главного цветоноса, нарушением развития цветков и семян, что проявляется в условиях короткого светового дня. При этом других изменений фенотипа не отмечено.

3. Подавление экспрессии сразу нескольких LSU-renoB усиливает фенотипические признаки мутантных растений. Инсерционный мутант lsu2 (подавлена транскрипция генов LSU2 и LSU4) и мутант LSUl-RNAi, полученный с использованием технологии РНК-интеференции (нарушена экспрессия трех генов LSU1, LSU2 и LSU3), формируют дефектные цветки в условиях не только короткого, но и длинного дня.

4. Дефектные цветки, формирующиеся на центральной оси соцветия у инсерционных мутантов и на центральной и боковых осях соцветия у RNAi-мутанта, характеризуются нарушениями развития лепестков, тычинок и пестика.

5. У мутантов по генам семейства LSU установлены изменения экспрессии генов АВСЕ-модели цветения и гена LFY. Это указывает на необходимость генов LSU для координированной работы регуляторных генов, ответственных за формирование соцветий и цветков у A. thaliana.

6. Гены семейства LSU могут компенсировать недостаточную экспрессию друг друга. Подавление транскрипции одного или нескольких LSU-tqhok вызывает, как правило, активацию работы других генов этого семейства от 2 до 5 раз.

7. Таким образом, в работе впервые описана возможная роль генов LSU в онтогенезе арабидопсиса. Результаты работы позволяют предположить, что гены семейства LSU вовлечены в процессы регуляции транскрипции и участвуют в формировании органов цветка и определении сроков зацветания растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гены семейства LSU характеризуются высокой степенью сходства нуклеотидных последовательностей (63-77%). Уровень гомологии аминокислотных последовательностей кодируемых генами белков, равен 60-89%. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что исследуемые гены выполняют сходную функцию в регуляции развития A. thaliana.

Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей белков семейства LSU, проведенный с использованием программ GOR4 (Combet et al., 2000) и MULTICOIL (Wolf et al., 1997), показал наличие протяженных участков, формирующих альфа-спирали и потенциальных двухспиральных доменов димеризации coiled-coil, богатых остатками глутаминовой кислоты. Это указывает на вероятное участие белков LSU в регуляции экспрессии генов и подтверждается данными их локализации в клеточном ядре, полученными с помощью методов биоинформатики.

Данные GENEVES TIGATOR (Zimmermann et al., 2004) показали возрастание экспрессии генов LSU1 и LSU2 в периоды развития розетки листьев и при формировании стручков и семян, а гена LSU4 также в период образования цветков. Экспрессия всех трех генов семейства LSU особенно сильно возрастает в период образования зрелых стручков и семян, что говорит о важности их функционирования на этой стадии развития A. thaliana. Также можно предположить, что возрастание активности генов LSU в период развития листовой розетки подготавливает условия для последующего перехода растений к цветению.

Анализ развития инсерционных мутантов Isu не выявил каких-либо различий в скорости прорастания семян, образовании проростков, формировании корневой системы и листьев по сравнению с диким типом А. thaliana. Изменения в развитии мутантных линий проявлялись лишь при переходе растений к цветению и выражались в различии времени зацветания, подавлении роста главного цветоноса и нарушении развития репродуктивных органов арабидопсиса.

Значительное запаздывание перехода к цветению исследуемых мутантов было обнаружено в условиях короткого светового дня. Одиночные инсерционные мутанты lsu2, lsu3 и lsu4 переходили к цветению соответственно на 36, 22 и 37 дней позже дикого типа A. thaliana. В условиях ДД существенных различий в скорости зацветания мутантных растений по сравнению с диким типом выявлено не было. Однако у растений с подавленной экспрессией сразу 2-х или нескольких генов LSU мутантный фенотип проявляется и в условиях длинного дня. Таким образом, гены LSU выполняют важную роль при переходе арабидопсиса к цветению. В частности, роль генов LSU в растении существенно возрастает при создании неиндуктивных для зацветания арабидопсиса условий короткого светового дня.

Поздний переход к цветению у исследуемых инсерционных мутантов в условиях КД может быть связан с изменением экспрессии генов гиббереллинового пути инициации цветения A. thaliana (Bernier, Perilleux, 2005). Это следует из того, что, подобно инсерционным мутантам Isu, мутанты по генам гиббереллинового пути характеризуются поздним зацветанием в условиях КД, в то время как в условиях ДД они переходят к цветению лишь незначительно позднее (Wilson et al., 1992; Reeves, Coupland, 2001). Что касается мутаций генов остальных путей инициации цветения (фотопериодческий, автономный и путь яровизации), то они вызывают позднее зацветание арабидопсиса либо только в условиях ДД, либо при обоих условиях фотопериода (ДД и КД) (Becker, Theissen, 2003; Boss et al., 2004; Komeda, 2004).

В условиях КД, по сравнению с диким типом, одиночные инсерционные мутанты Isu характеризовались заметными фенотипическими отличиями.

Во-первых, нокаут-мутации генов LSU2, LSU3 и LSU4 вызывали изменение архитектуры соцветия арабидопсиса. На ранней стадии цветения из 20 исследуемых растений каждой мутантной линии у 85% инсерционных мутантов lsu2 и 80% инсерционных мутантов lsu3 и lsu4 наблюдалось подавление роста главного цветоноса, вследствие чего первые 5-10 цветков на центральной оси соцветия образовывали плотные кластеры. При дальнейшем развитии мутантов lsu2 рост соцветий восстанавливался и расстояния между цветками, образованных на поздней стадии цветения на главном цветоносе, выравнивались. Среди мутантов lsu2 и lsu4 наблюдалось как восстановление, так и отсутствие восстановления роста соцветий. Причина подавления роста главного цветоноса инсерционных мутантов Isu, возможно, заключалась в изменении гормонального гомеостаза арабидопсиса, что выражалось также в позднем зацветании мутантных линий.

Во-вторых, мутации генов LSU приводили к образованию дефектных цветков на главной оси соцветия A. thaliana. При этом на ранней стадии развития на главном цветоносе A. thaliana наблюдалось формирование аберрантных цветков с нормальными чашелистиками, но редуцированными, неразвитыми лепестками, тычинками и пестиком. Такие цветки не образовывали стручков. Цветки, формирующиеся позднее, наряду с нормальными чашелистиками, неразвитыми лепестками и тычинками имели объемный пестик, занимавший почти все внутреннее пространство. Такие аберрантные цветки формировали стручки, но не образовывали жизнеспособных семян.

В условиях ДД развитие инсерционных мутантов lsu3 и lsu4 не отличалось от дикого типа A. thaliana, в то время как инсерционный мутант lsu2 формировал дефектные цветки с нарушением развития лепестков, тычинок и пестика.

Анализ экспрессии генов семейства LSU у исследуемых инсерционных мутантов подтвердил репрессию мутантных генов и показал, что гены семейства LSU взаимно компенсируют недостаточную экспрессию друг друга. Так, подавление транскрипции одного из LSU-тенов вызывало усиление экспрессии других генов этого семейства от 2 до 5 раз. Исключение составлял инсерционный мутант lsu2, у которого наблюдалось снижение экспрессии гена LSU4, которое может быть связано с нарушением функционирования его промотора в результате встраивания плазмидной инсерции в последовательность примыкающего гена LSU2.

Надо отметить, что, несмотря на компенсаторное повышение уровня экспрессии немутированных генов LSU у /szz-мутантов, полной компенсации репрессии мутантных генов не происходит, что проявляется при переходе к цветению, особенно в условиях КД. Это указывает на определенную специфику каждого из генов LSU и необходимость экспрессии каждого из них в указанных условиях. Вместе с тем нельзя исключить, что взаимная компенсация экспрессии генов LSU способствует отсутствию проявления фенотипических изменений у /га-мутантов в вегетативной фазе онтогенеза.

При изучении экспрессии основных генов идентичности флоральной меристемы и органов цветка установлены значительные изменения содержания их мРНК у инсерционных мутантов Isu по сравнению с диким типом, что, вероятно, привело к нарушениям в развитии органов цветка.

Так, в условиях КД уровень экспрессии генов LFY, API, АРЗ, PI и SEP3 у инсерционных мутантов Isu снижался примерно вдвое. В то же время, экспрессия генов АР2, AG и SEP2 значительно увеличивалась, в среднем в 10, 7 и 3 раз(а), соответственно.

В условиях ДД экспрессия генов идентичности меристемы и органов цветка у инсерционных мутантов lsu3 и lsu4 практически не менялась, что

122 объясняет образование нормально развитых цветков. В то же время экспрессия генов развития цветка (LFY, АРЗ, PI, AG и SEP3) у мутантных растений lsu2 была подавлена примерно в 2 раза, что, по всей видимости, является причиной формирования дефектных цветков у данного мутанта при индуктивных для зацветания арабидопсиса условиях длинного светового дня.

В результате применения механизма РНК-интерференции был получен мутант LSUl-RNAi, у которого подавлена экспрессия трех генов семейства LSU: LSU1 - в 10 раз, LSU2 - в 2.6 раза и LSU3 - в 8.2 раза. При этом транскрипция гена LSU4 увеличивалась в 2.9 раза, что, вероятно, связано с компенсацией недостаточной экспрессии остальных генов семейства LSU.

В результате подавления экспрессии одновременно трех генов семейства LSU у мутанта LSUl-RNAi происходили более значительные изменения экспрессии гена LFY и генов АВСЕ-модели по сравнению с инсерционными мутантами Isu. Так, экспрессия гена LFYуменьшилась в 2.9 раза, АРЗ - в 2.9 раза,' AG - в 9.1 раза, SEP2 - в 4.2 раза, а также SEP3 - в 2 раза. При этом экспрессия генов API и АР2 не изменилась, а содержание мРНК гена PI возросло в 7.1 раза.

При этом мутантный фенотип LSUl-RNAi был выражен сильнее: в условиях ДД наблюдалось подавление роста главного цветоноса, а также формирование дефектных цветков, с нарушением развития лепестков, тычинок и пестика, не только на центральной, но и на боковых осях соцветия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мякушина, Юлия Александровна, Москва

1. Аксенова Н.П., Миляева Е.Л., Романов Г.А. Флориген обретает молекулярный облик. К 70-летию теории гормональной регуляции цветения // Физиология растений. 2006. Т 53. № 3. С. 449-454.

2. Воробьев В.А., Мартынов В.В., Панкин А.А., Хавкин Э.Е. Полиморфизм гена LEAFY у растений Brassica II Физиология растений. 2005. Т. 52. №6. С. 919-925.

3. Дробязина П.Е., Хавкин Э.Е. Гомологи APETALA1/FR UITFULL у растений рода Solanum II Физиология растений. 2006. Т. 53. № 2. С. 243249.

4. Ежова Т.А., Лебедева О.В., Огаркова О.А., Пеннин А.А., Солдатова О.П., Шестаков С.В. Arabidopsis thaliana модельный объект генетики растений. М.: МАКС Пресс. 2003. 219 с.

5. Ежова Т.А., Пенин А.А. Новый ген BRACTEA (BRA), контролирующий формирование открытого абрактеозного соцветия у Arabidopsis thaliana //Генетика. 2001. Т. 37. № 10. С. 935-938.

6. Ежова Т.А., Склярова О.А. Гены, контролирующие структуру соцветия, и их возможная роль в эволюции // Онтогенез. 2001. Т. 32. № 6. С. 462470.

7. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А., Ходжайова Л.Т., Шишкова С.О. Генетика развития растений // Санкт-Петербург, «Наука». 2000. 539 с.

8. Миляева Э.Л., Романов Г.А. Молекулярная генетика возвращается к основным положениям теории флоригена // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 4. С. 492-499.

9. Ленин А.А., Чуб В.В., Ежова Т.А. Правила формирования терминального цветка // Онтогенез. 2005. Т. 36. С. 90-95.

10. Титова Н.Н. Поиски ботанической дрозофилы // Советская ботаника. 1935. №2. С. 61-67.

11. Тиходеев О.Н. Молекулярно-генетические основы структурного разнообразия цветков // Труды IX школы по теоретической морфологии растений «Типы сходства и принципы гомологизации в морфологии ратсений». Санкт-Петербург, 2001. С. 200-213.

12. Чайлахян М.Х. Гормональная теория развития растений // М.: АН СССР, 1937. 198 с.

13. Чайлахян М.Х. Гормональные факторы цветения растений // Физиология растений. 1958. Т. 5. С. 541-560.

14. Чуб В.В., Ленин А.А. Структура цветка Arabidopsis thaliana (L.) Heynh: разметка положения органов // Онтогенез. 2004. Т. 35. № 4. С. 280-284.

15. Abe М., Kobayashi Y., Yamamoto S., Daimon Y., Yamaguchi A., Ikeda Y., Ichinoki H., Notaguchi M., Goto K, Araki T. FD, a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex // Science. 2005. V. 309. P. 1052-1056.

16. Achard P., Herr A., Baulcombe D.C., Harberd N.P. Modulation of floral development by a gibberellin-regulated microRNA // Development. 2004. V. 131. P. 3357-3365.

17. Adrian J., Torti S., Turck F. From decision to commitment: the molecular memory of flowering // Molecular Plant. 2009. V. 2. P. 628-642.

18. W.L., Berry C.C., Ecker J.R. Genome-Wide Insertional Mutagenesis of Arabidopsis thaliana H Science. 2003. V. 301. P. 653-657.

19. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W„ Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs //Nucleic Acid Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.

20. Alvarez J., Guli C.L., Yu X.-H., Smyth D.R. terminal flower: a gene affecting inflorescence development in Arabidopsis thaliana II Plant J. 1992. V. 2. P. 103-116.

21. Amador V., Monte E., Garcia-Martinez J.L., Prat S. Gibberellins signal nuclear import of PHOR1, a photoperiod-responsive protein with homology to Drosophila armadillo // Cell. 2001. V. 106. P. 343-354.

22. An H., Roussot C., Suarez-Lopez P. CONSTANS act in the phloem to regulate a systemic signal that induces photoperiodic flowering of Arabidopsis // Development. 2004. V. 131. P. 3615-3626.

23. Arabidopsis Genome Initiative Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana I/ Nature. 2000. V. 408. P. 796-815.

24. Ausin I., Alonso-Blanco C., Jarillo J.A., Ruiz-Garcia L., Martinez-Zapater J.M. Regulation of flowering time by FVE, a retinoblastoma-associated protein // Nat. Genet. 2004. V. 36. P. 162-166.

25. Ausin I., Alonso-Blanco C., Martinez-Zapater J.-M. Environmental regulation of flowering // Int. J. Biol. 2005. V. 49. P. 689-705.

26. Ballare C.L. Keeping up with the neighbours: phytochrome sensing and other signalling mechanisms // Trends Plant Sci. 1999. V. 4. P. 201.

27. Baurle L, Dean C. 2006. The timing of developmental transitions in plants // Cell. 2006. V. 125. P. 655-664.

28. Bechtold D., Ellis J., Pelletier G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants // C. R. Acad. Sci., Life Sci. 1993. V. 316. P. 1194-1199.

29. Becker A., Theissen G. The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants // Mol. Phyl. Evol. 2003. V. 29. P. 464-489.

30. Benlloch R., Berbel A., Serrano-Mislata A., Madueno F. Floral initiation and inflorescence architecture: a comparative view // Annals of Botany. 2007. V. 100. P. 659-676.

31. Bernier G., Perillewc C. A physiological overview of the genetics of flowering time control // Plant Biotech. J. 2005. V. 3. P. 3-16.

32. Blazquez M.A., Ferrandiz C., Madueno F., Farcy F. How floral meristems are built // Plant Mol. Biol. 2006. V. 60. P. 855-870.

33. Blazquez M.A., Green R., Nilsson O., Sussman M.R., Weigel D. Gibberellins promote flowering of Arabidopsis by activating the LEAFY promoter // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 791-800.

34. Blazquez M.A., Soowal L.N., Lee I., Weigel D. LEAFY expression and flower initiation in Arabidopsis //Development. 1997. V. 124. P. 3835-3844.

35. Blazquez M.A., Weigel D. Integration of floral inductive signals in Arabidopsis II Nature. 2000. V. 404. P. 889-892.

36. Boss P.K., Bastow R.M., Mylne J.S., Dean C. Multiple pathways in the decision to flower: enabling, promoting, and resetting // Plant Cell. 2004. V. 16. P. S18-S31.

37. Bowman J.L., Alvarez J., Weigel D., Meyerowitz E.M., Smyth D.R. Control of flower development in Arabidopsis thaliana by APETALA1 and interacting genes 11 Development. 1993. V. 119. P. 721-743.

38. Bowman J.L., Smyth D.R., Meyerowitz E.M. Genes directing flower development in Arabidopsis 11 Plant Cell. 1989. V. 1. P. 37-52.

39. Bowman J.L., Smyth D.R., Meyerowitz E.M. Genetic interactions among floral homeotic genes of Arabidopsis II Development. 1991. V. 112. P. 1-20.

40. Bruckner C. Clarification of the carpel number in Papaverales, Capparales, and Berberidaceae // Bot. Rev. 2000. V. 66. P. 155-309.

41. Billow L., Engelmann S., Schindler M., Hehl R. AthaMap, integrating transcriptional and post-transcriptional data //Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. D983-D986.

42. Burkhard P., Stetefeld J., Strelkov S. V. Coiled coil: a highly versatile protein folding motif// Trends in Cell Biology. 2001. V. 11. P. 82-88.

43. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J. of Mol. Endocrinology. 2000. V. 25. P. 169-193.

44. Calonje M., Cubas P., Martinez-Zapater J.M., Carmona M.J. Floral meristem identity genes are expressed during tendril development in grapevine // Plant Physiol. 2004. V. 135. P. 1491-1501.

45. Castillejo C., Romera-Branchat M., Pelaz S. A new role of the Arabidopsis SEPALLATA3 gene revealed by its constitutive expression // Plant J. 2005. V. 43. P. 586-596.

46. Cerdan P.D., Chory J. Regulation of flowering time by light quality // Nature. 2003. V. 423. P. 881-885.

47. Chandler J., Wilson A., Dean C. Arabidopsis mutants showing an altered response to vernalisation // Plant J. 1996. V. 10. P. 637-644.

48. Liu C., Chen H., Er H.L., Soo H.M., Kumar P.P., Han J.-H., Liou Y.C., Yu H Direct interaction of AGL24 and SOC1 integrates flowering signals in Arabidopsis II Development. 2008. V. 135. P. 1481-1491.

49. Chen H., Huang N. Sun Z. SubLoc: a server/client suite for protein subcellular location based on SOAP // Bioinformatics. 2006. V. 22. P. 376377.

50. Chuang C.-F., Meyerowitz E.M. Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana // PNAS. 2000. V. 97. P. 49854990.

51. Chung Y.-Y., Kim S.-R., Finkel D., Yanofsky M.F., Gynheung A.G. Early flowering and reduced apical dominance result from ectopic expression of a rice MADS box gene// PlantMol. Biol. 1994. V. 26. P. 657-665.

52. Coen E.S., Meyerowitz E.M. The war of the whorls genetic interactions controlling flower development //Nature. 1991. V. 353. P. 31-37.

53. Conti L., Bradley D. TERMINAL FLOWER 1 is a mobile signal controlling Arabidopsis architecture // Plant Cell. 2007. V. 19. P. 767-778.

54. Combet C., Blanchet C., Geourjon C., Deleage G. NPS@: network protein sequence analysis // Trends Biochem. Sci. 2000. V. 25. P. 147-150.

55. Corbesier L., Coupland G. Photoperiodic flowering of Arabidopsis: integrating genetic and physiological approaches to characterization of the floral stimulus // Plant, Cell and Environment. 2005. V. 28. P. 54-66.

56. Covington M.F., Panda S., Liu X.L., Strayer C.A., Wagner D.R., Kay S.A. ELF3 modulates resetting of the circadian clock in Arabidopsis II Plant Cell. 2001. V. 13. P. 1305-1315.

57. Davletova S., Schlauch K., Coutu J., Mittler R. The zinc-finger protein Zatl2 plays a central role in reactive oxygen and abiotic stress signaling in Arabidopsis II Plant Physiol. 2005. V. 139. P. 847-856.

58. Ditta G„ Pinyopich A., Robles P., Pelaz S„ Yanofsky M. F. The SEP4 gene of Arabidopsis thaliana functions in floral organ and meristem identity // Current Biology. 2004. V. 14. P. 1935-1940.

59. Doennes P., Hoeglund A. Predicting protein subcellular localization: past, present, and future // Genomics, Proteomics, Bioinformatics. 2004. V. 2. P. 209-215.

60. McWatters H.G., Kolmos E., Hall A., Doyle M.R., Amasino R.M., Gyula P., Nagy F., Millar A.J., Davis S.J. ELF4 is required for oscillatory properties of the circadian clock // Plant Physiol. 2007.V. 144. P. 391-401.

61. Doyle J. J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. 1987. V. 19. P. 11-15.

62. Drews G. N., Bowman J. L., Meyerowitz E. M. Negative regulation of the Arabidopsis homeotic gene AGAMOUS by the APETALA2 product // Cell. 1991. V. 65. V. 991-1001.

63. Eriksson S., Bohlenius H., Moritz Т., Nilsson O. GA4 is the active gibberellin in the regulation of LEAFY transcription and Arabidopsis floral initiation // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 2172-2181.

64. Fan H.-Y., Ни Y., Tudor M., Ma H. Specific interactions between the К domains of AG and the AGLs, members of the MADS domain family of DNA binding proteins//Plant J. 1997. V. 11. P. 999-1010.

65. Fang S.-C., Fernandez D.E. Effect of regulated overexpression of the MADS domain factor AGL15 on flower senescence and fruit maturation // Plant Physiol. 2002. V. 130. P. 78-89.

66. Favaro R., Pinyopich A., Battaglia R., Kooiker M., Borghi L., Ditta G., Yanofsky M. F., Kater M.K., Colombo L. MADS-Box protein complexes control carpel and ovule development in Arabidopsis I I The Plant Cell. 2003. V. 14. P. 2603-2611.

67. Ferrandiz C., Gu O., Martienssen R., Yanofsky M.F. Redundant regulation of meristem identity and plant architecture by FRUITFULL, APETALA1 and CAULIFLOWER //Development. 2000. V. 127. P. 725-734.

68. Fridborg I., Kuusk S., Moritz Т., Sundberg E. The Arabidopsis dwarf mutant shi exhibits reduced gibberellin responses conferred by overexpression of a new putative zinc finger protein // Plant Cell. 1999. V.11. P. 1019-1031.

69. Gardner M. J., HubbardK.E., Hotta C.T., DoddA.N., Webb A.A. How plants tell the time // Biochem. J. 2006. V. 397. P. 15-24.

70. Gendall A.R., Levy Y.Y., Wilson A., Dean C. The VERNALIZATION 2 gene mediates the epigenetic regulation of vernalization in Arabidopsis II Cell. 2001. V. 107. P. 525-535.

71. Goethe J. W. Versuch die Metamorphose der Pflanzen zu erklaren // Gotha: C.W. Ettinger, 1790. Translated by A. Arber. Goethe's Botany. Chronicals of Botany. 1946. V. 10. P. 63-126.

72. Gustafson-Brown C., Savidge В., Yanofsky M. F. Regulation of the Arabidopsis floral homeotic genqAPETALAI И Cell. 1994. V. 76. P. 131-143.

73. Halliday K.J., Salter M.G., Thingnaes Е., Whitelam G.C. Phytochrome control of flowering is temperature sensitive and correlates with expression of the floral integrator FTII Plant J. 2003. V. 33. P. 875-885.

74. Hames С., Ptchelkine D., Grimm C., Thevenon E., Moyroud E., Gerard F, Martiel J.-L„ Benlloch R., Parcy F„ Miiller C.W. Structural basis for LEAFYfloral switch function and similarity with helix-turn-helix proteins 11 EMBO J. 2008. V. 27. P. 2628-2637.

75. Harmon G.J. RNA interference //Nature. 2002. V. 418. P. 244-251.

76. Hartley J. L., Temple G. F., Brasch M. A. DNA Cloning Using in vitro Site-Specific Recombination // Genome Research. 2000. V. 10. P. 1788-1795.

77. Hazen S.P., Schultz T.F., Pruneda-Paz J.L., Borevitz J.O., Ecker J.R., Kay S.A. 2005. LUX ARRHYTHMO encodes a Myb domain protein essential for circadian rhythms //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005 102, 10387-10392.

78. He Y., Michaels S.D., Amasino R.M. Regulation of flowering time by histone acetylation in Arabidopsis II Science. 2003. V. 302. P. 1751-1754.

79. Helliwell C.A., Wood C.C., Robertson M., Peacock W.J., Dennis E.S. The Arabidopsis FLC protein interacts directly in vivo with SOC1 and FT chromatin and is part of a high-molecular-weight protein complex // Plant J. 2006. V. 46. P. 183-192.

80. Henderson I.R., Dean C. Control of Arabidopsis flowering: the chill before the bloom // Development. 2004. V. 131. P. 3829-3838.

81. Hepworth S.R., Valverde F., Ravens croft D., Mouradov A., Coupland G. Antagonistic regulation of flowering-time gene SOC1 by CONSTANS and FLC via separate promoter motifs // EMBO J. 2002. V. 21. P. 4327-4337.

82. Hirano K, Ueguchi-Tanaka M., Matsuoka M. GID1-mediated gibberellin signaling in plants // Trends in Plant Science. 2008. V. 13. P. 192-199.

83. Hisamatsu Т., King R. The nature of floral signals in Arabidopsis. II. Roles for FLOWERING LOCUS T (FT) and gibberellin // Journal of Experimental Botany. 2008. V. 59. P. 3821-3829.

84. Hoeglund A., Doennes P., Blum Т., Adolph H.-W., Kohlbacher O. MultiLoc: prediction of protein subcellular localization using N-terminal targeting sequences, sequence motifs and amino acid composition // Bioinformatics. 2006. V. 22. P. 1158-1165.

85. Honma Т., Goto К Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs //Nature. 2001. V. 409. P. 525-529.

86. Huala E., Sussex I.M. LEAFY interacts with floral homeotic genes to regulate Arabidopsis floral development // Plant Cell. 1992. V. 4. P. 901-913.

87. Huang H., Mizukami Y, Ни Y, Ma H. Isolation and characterization of the binding sequences for the product of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUSIINucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 4769-4776.

88. Huang S.S., Raman A.S., Ream J.E., Fujiwara H., Cerny R.E., Brown S.M. Overexpression of 20-oxidase confers a gibberellin-overproduction phenotype in Arabidopsis II Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 773-781.

89. Huang H., Tudor M., Su Т., Zhang Y, Ни Y, Ma H. DNA binding properties of two Arabidopsis MADS domain proteins: binding consensus and dimer formation // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 81-94.

90. Huang H., Tudor M., Weiss C.A., Ни Y., Ma H. The Arabidopsis MADS-box gene AGL3 is widely expressed and encodes a sequence-specific DNA-binding protein // Plant Mol. Biol. 1995. V. 28. P. 549-567.

91. Huijser P., Klein J., Lonnig W.E., Meijer H., Saedler H., Sommer H. Bracteomania, an inflorescence anomaly, is caused by the loss of function of the MADS-box gene squamosa in Antirrhinum majus II EMBO Journal. 1992. V. 11. P. 1239-1249.

92. Imaizumi Т., Kay S.A. Photoperiodic control of flowering: not only by coincidence // Trends in Plant Science. 2006. V.l 1. P. 550-558.

93. Irish V.F., Sussex I.M. Function of the APETALA 1 gene during Arabidopsis floral development // The Plant Cell. 1990. V. 2. P. 741-753.

94. Itoh К, Ueguchi-Tanaka M., Matsuoka М. Molecular biology of gibberellins signaling in higher plants // International Review of Cell and Molecular Biology. 2008. V. 268. P. 191-221.

95. Jack T. Molecular and genetic mechanisms of floral control // Plant Cell. 2004. V. 16. P. S1-S17.

96. Jarillo J.A., del Olmo I, Gomez-Zambrano A., Lazaro A., Lopez-Gonzalez L., Miguel E., Narro-Diego L,, Saez D., Pineiro M. Review. Photoperiodic control of flowering time // Spanish J. of Agricultural Research. 2008. V. 6. P. 221-244.

97. Johanson U., West J., Lister C., Michaels S., Amasino R., Dean C. Molecular analysis of FRIGIDA, a major determinant of natural variation in Arabidopsis flowering time // Science. 2000. V. 290. P. 344-347.

98. Wl.Kania Т., Russenberger D., Peng S., Apel K., Melzer S. FPF1 promotes flowering in Arabidopsis II Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1327-1338.

99. Koornneef M., Alonso-Blanco C., Blankestijin-de Vries H., Hanhart C.J., Peeters A.J. Genetic interactions among late-flowering mutants of Arabidopsis II Genetics. 1998. V. 148. P. 885-892.

100. Koornneef M., Hanhart C.J., van der Veen J.H. A genetic and physiological analysis of late flowering mutants in Arabidopsis thaliana // Mol. Gen. Genet. 1991. V. 229. P. 57-66.

101. Krizek B.A., Fletcher J.С. Molecular mechanisms of flower development: an armchair guide //Nature Reviews: Genetics. 2005. V. 6. P. 688-698.

102. Krizek B.A., Meyerowitz E. M. The Arabidopsis homeotic genes APETALA3 and PISTILLATA are sufficient to provide the В class organ identity function // Development. 1996. V. 122. P. 11-22.

103. Larsson A.S., Landberg К, Meeks-Wagner D.R. The TERMINAL FLOWER2 (TFL2) gene control the reproductive transition and meristem identity in Arabidopsis thaliana II Genetics. 1998. V. 149. P. 597-605.

104. Lee H„ Suh S.-S., Park E., Cho E., Ahn J.H., Kim S.-G., Lee J.S., Kwon Y.M., Lee I. The AGAMOUS-LIKE 20 MADS domain protein integrates floral inductive pathways in Arabidopsis II Genes Dev. 2000. V. 14. P. 2366-2376.

105. Yll.Lee I., Wolfe D.S., Weigel, D. A LEAFY co-regulator encoded by UNUSUAL FLORAL ORGANS II Curr. Biol. 1997. V. 7. P. 95-104.

106. Lee J., Oh M., Park H., Lee I. SOC1 translocated to the nucleus by interaction with AGL24 directly regulates LEAFYII Plant J. 2008. V. 55. P. 832-843.

107. Levy Y.Y., Mesnage S., Mylne J.S., Gendall A.R., Dean C. Multiple roles of Arabidopsis VRN1 in vernalization and flowering time control // Science. 2002. V. 297. P. 243-246.

108. Lin C. Photoreceptors and regulation of flowering time 11 Plant Physiol. 2000. V. 123. P. 39-50.

109. Lin С., Yang H., Guo H., Mockler Т., Chen J., Cashmore A.R. Enhancement of blue-light sensitivity of Arabidopsis seedlings by a blue light receptor cytochrome 2 I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 2686-2690.

110. Liu J., Rost B. Comparing function and structure between entire genomes // Protein Sci. 2001. V. 10. P. 1970-1979.13e.Lohmann J.U., Weigel D. Building beauty: the genetic control of floral patterning//Dev. Cell. 2002. V. 2. P. 135-142.

111. Ybl.Lupas A. Coiled coils: new structures and new functions // Trends Biochem. Sci. 1996. V.21.P. 375-382.

112. Maizel A., Busch M.A., Tanahashi Т., Perkovic J., Kato M, Hasebe M., Weigel D. The floral regulator LEAFY evolves by substitutions in the DNA binding domain // Science. 2005. V. 308 P. 260-263.

113. Mandel M.A., Gustafson-Brown C., Savidge В., Yanofsky M.F. Molecular characterization of the Arabidopsis floral homeotic gene APETALA 1 II Nature. 1992. V. 360. P. 273-277.

114. Martinez-Zapater J.M. Effect of light quality and vernalization on late-flowering mutants of Arabidopsis thaliana II Plant Physiol. 1990. V. 92. P. 770-776.

115. Maruyama-Nakashita A., Nakamura Y., Tohge Т., Saito K., Takahash H. Arabidopsis SLIM1 is a central transcriptional regulator of plant sulfur response and metabolism// The Plant Cell. 2006. V.18. C. 3235-3251.

116. Maruyama-Nakashita A., Nakamura Y., Watanabe-Takahashi A., Inoue E., Yamaya Т., Takahashi H. Indentifikation of a novel c/s-acting element conferring sulfur deficiency response in Arabidopsis roots // Plant J. 2005. V. 42. P. 305-314.

117. Mas P. Circadian clock signalling in Arabidopsis thaliana: from gene expression to physiology and development // Int. J. Dev. Biol. 2005. V. 49. P. 491-500.

118. Mason J.M., Arndt К. M. Coiled coil domains: stability, specifity, and biological implications // ChemBioChem. 2004. V. 5. P. 170-176.

119. Mathieu J., Warthmann N., Kuttner F., Schmid M. Export of FT protein from phloem companion cells is sufficient for floral induction in Arabidopsis // Curr. Biol. 2007. V. 17. P. 1055-1060.

120. Matthew L. RNAi for plant functional genomics // Comparative and Functional Genomics. 2004. V. 5. P. 240-244.

121. McClung C.R. 2006. Plant circadian rhythms // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 792-803.

122. Mello C.C., Conte J. D. Revealing the world of RNA interference //Nature. 2004. V. 431. P. 338-342.

123. Michaels S.D., Amasino R.M. Memories of winter: Vernalization and the competence to flower // Plant Cell Environ. 2000. V. 23. P. 1145-1153.

124. Michaels S.D., Amasino R.M. Loss of FLOWERING LOCUS С activity eliminates the late-flowering phenotype of FRIGIDA and autonomous pathway mutations, but not responsiveness to vernalization // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 935-941.

125. Michaels S.D., Ditta G., Gustafson-Brown C., Pelaz S., Yanofsky M., Amasino R.M. AGL24 acts as a promoter of flowering in Arabidopsis and is positively regulated by vernalization // Plant J. 2003. V. 33. P. 867-874.

126. Mimida N., Goto K., Kobayashi Y., Araki Т., Ahn J.H., Weigel D. Functional divergence of the TFLl-like gene family in Arabidopsis revealed by characterization of a novel homologue // Genes to Cells. 2001. V. 6. P. 327336.

127. Mizukami Y., Ma H. Determination of Arabidopsis floral meristem identity by AGAMOUSH Plant Cell. 1997. V. 9. P. 393-408.

128. Mockler Т., Yang II., Yux H., Parikh D., Cheng Y.C., Dolan S., Lin C. Regulation of photoperiodic flowering by Arabidopsis photoreceptors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 2140-2145.

129. Moon J., Lee LI., Kim M., Lee I. Analysis of flowering pathway integrators in Arabidopsis II Plant Cell Physiol. 2005. V. 46. P. 292-299.

130. Moon J., Suh S.S., Lee H., Choi K.R., Hong C.B., Paek N.C., Kim S.G., Lee I. The SOCI MADS-box gene integrates vernalization and gibberellin signals for flowering in Arabidopsis II Plant J. 2003. V. 35. P. 613-623.

131. Murase K, Hirano Y., Sun T.P., Hakoshima T. Gibberellin-induced DELLA recognition by the gibberellin receptor GID1 // Nature. 2008. V. 456. P. 459463.

132. Mutasa-Goettgens E., Hedden P. Gibberellin as a factor in floral regulatory networks // J. Exp. Bot. 2009. V. 60. P. 1979-1989.

133. Ng M., Yanofsky M. F. Activation of the Arabidopsis В class homeotic genes by APETALA1 //Plant Cell. 2001. V. 13. P. 739-753.

134. Okamuro J.К., Caster В., Villarroel R., Van Montagu M., Jofuku K.D. The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis 11 Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1997. V. 94. P. 7076-7081.

135. Onouchi H., Igeno M.I., Perilleux С., Graves K, Coupland G. Mutagenesis of plants overexpressing CONSTANS demonstrates novel interactions among Arabidopsis flowering-time genes // The Plant Cell. 2000. Vol. 12. P. 885900.

136. Page Т., Macknight R., Yang C.-H., Dean C. Genetic interactions of the Arabidopsis flowering time gene FCA, with genes regulating floral initiation // Plant J. 1999. V. 17. P. 231-239.

137. Pierleoni A., Martelli P. L., Fariselli P., Casadio R. BaCelLo: a balanced subcellular localization predictor // Bioinformatics. 2006. V. 22. P. e408-e416.

138. Pelaz S., Ditta G. S., Baumann E., Wisman E. В and С floral organ identity functions require SEPALLATA MADS-box genes // Nature. 2000. V. 405. P. 200-203.

139. MA. Pelaz S., Gustafson-Brown C., Kohalmi S.E., Crosby W.L., Yanofsky M.F. APETALA1 and SEPALLATA3 interact to promote flower development // Plant J. 2001. V. 26. P. 385-394.

140. Putterill J., Robson F., Lee K, Simon R„ Coupland G. The CONSTANS gene of Arabidopsis promotes flowering and encodes a protein showing similarities to zinc Finger transcription factors // Cell. 1995. V. 80. P. 847-857.

141. Ramakers C., Ruijter J. V., Lekanne Deprez R. H., Moorman A. F. M. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data//Neuroscience Letters. 2003. V. 339. P. 62-66.

142. Ratcliffe O.J., Amaya I., Vincent C.A., Rothstein S., Carpenter R., Coen E.S., Bradley D.J. A common mechanism controls the life cycle and architecture of plants//Development. 1998. V. 125. P. 1609-1615.

143. Ratcliffe O.J., Bradley D.J., Coen E.S. Separation of shoot and floral identity in Arabidopsis // Development. 1999. V. 126. P. 1109-1120.

144. Ratcliffe O.J., Kumimoto R.W., Wong B.J., Riechmann J.L. Analysis of the Arabidopsis MADS AFFECTING FLOWERING gene family: MAF2 prevents vernalization by short periods of cold // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 1159-1169.

145. Ш.Rosso M.G., Li Y, Strizhov N., Reiss В., Dekker K, Weisshaar B. An Arabidopsis thaliana T-DNA mutagenized population (GABI-Kat) for flanking sequence tag-based reverse genetics // Plant Mol. Biol. 2003. V. 53. P. 247-259.

146. Santos-Mendoza M., Dubreucq В., Baud S., Parcy F., Caboche M., Lepiniec L. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis II The Plant J. 2008. V. 54. P. 608-620.

147. Sawa M., Nusinow D.A., Kay S.A., Imaizumi T. FKF1 and GIGANTEA complex formation is required for day-length measurement in Arabidopsis II Science. 2007. V. 318. P. 261-264.

148. Schomburg F.M., Patton D.A., Meinke D.W., Amasino R.M. FPA, a gene involved in floral induction in Arabidopsis, encodes a protein containing RNA-recognition motifs // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 1427-1436.

149. Schultz E.A., Haughn G.W. LEAFY, a homeotic gene that regulates inflorescence development in Arabidopsis II Plant Cell. 1991. V. 3. P. 771781.

150. Schultz E.A., Haughn G.W. Genetic analysis of the floral initiation process (FLIP) in Arabidopsis // Development. 1993. V. 119. P. 745-765.

151. Schultz T.F., Kiyosue Т., Yanovsky M., Wada M, Kay S.A. A role for LKP2 in the circadian clock of Arabidopsis II Plant Cell. 2001. V. 13. P. 2659-2670.

152. Sheldon C.C., Burn J.E., Perez P.P., Metzger J., Edwards J.A., Peacock W.J., Dennis E.S. The FLF MADS box gene: A repressor of flowering in

153. Arabidopsis regulated by vernalization and methylation. Plant Cell. 1999. V. 11. P. 445-458.

154. Sheldon C.C., Finnegan E.J., Dennis E.S. Peacock W.J. Quantitative effects of vernalisation on FLC and SOC1 expression // Plant J. 2006. V. 45. P. 871883.

155. Sheldon C.C., Finnegan E.J., Rouse D.T., Tadege M., Bagnall D.J., Helliwell C.A., Peacock W.J., Dennis E.S. The control of flowering by vernalization // Curr. Opin. Plant Biol. 20006. V. 3. P. 418-422.

156. Sheldon C.C., Rouse D.T., Finnegan E.J., Peacock W.J., Dennis E.S. The molecular basis of vernalization: the central role of FLOWERING LOCUS С (FLC) II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000a. V. 97. P. 3753-3758.

157. Silver stone A.L., Ciampaglio C.N., Sun, T.P. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway//Plant Cell. 1998. V. 10. P. 155-169.

158. SiIverstone A.L., Jung H.S., Dill A., Kawaide II., Kamiya Y., Sun T.P. Repressing a repressor: Gibberellin-induced rapid reduction of the RGA protein in Arabidopsis //Plant Cell. 2001. V. 13. P. 1555-1565.

159. Silver stone A. L., Tseng T.-S., Swain S.M., Dill A., Jeong S.Y., Olszewski N.E., Sun T.-P. Functional analysis of SPINDLY in gibberellin signaling in Arabidopsis И Plant Physiol. 2007. V. 143, P. 987-1000.

160. Simpson G.G., Dijkwel P.P., Quesada V., Henderson I., Dean C. FY is an RNA 39-end processing factor that interacts with FCA to control the Arabidopsis floral transition // Cell. 2003. V. 113. P. 777-787.

161. Smyth D.R., Bowman J.L., Meyerowitz E.M. Early flower development in Arabidopsis I I Plant. Cell. 1990. V. 2. P. 755-767.

162. Soltis D.E., Chanderbali A.S., Kim S„ Buzgo M., Soltis P.S. The ABC model and its applicability to basal angiosperms // Annals of Botany. 2007. V. 100. P.155-163.

163. Sun T.-P., Gubler F. Molecular mechanism of gibberellin signaling in plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2004. V. 55. P. 197-223.

164. Sun T.P., Kamiya Y. The Arabidopsis gal locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase-A of gibberellin biosynthesis // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1509-1518.

165. Sung S., Amasino R.M. Vernalization and epigenetics: how plants remember winter // Curr. Opin. Plant Biol. 2004. V. 7. P. 4-10.

166. Tang W., Perry S.E. Binding site selection for the plant MADS domain protein AGL15: an in vitro and in vivo study // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 28154-28159.

167. Thomas B. Light signals and flowering // J. Exp. Bot. 2006. V. 57. P. 33873393.

168. Toledo-Ortiz G., Huq E., Quail P.H. The Arabidopsis Basic/Helix-Loop-Helix transcription factor family // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 1749-1770.

169. Turck F., Fornara F., Coupland G. Regulation and identity of florigen: FLOWERING LOCUS T moves center stage // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. V. 59. P. 573-594.

170. Ueguchi-Tanaka M., Nakajima M., Motoyuki A., Matsuoka M. Gibberellin receptor and its role in gibberellin signaling in plants // Annual Review of Plant Biology. 2007. V. 58. P. 183-198.

171. Valverde F., Mouradov A., Soppe W., Ravenscroft D., Samach A., Coupland G. Photoreceptor regulation of CONSTANS protein in photoperiodic flowering // Science. 2004. V. 303. P. 1003-1006.

172. Vijayraghavan U., Prasad K., Meyerowitz E. Specification and maintenance of the floral meristem: interactions between positively-acting promoters of flowering and negative regulators // Current Science. 2005. V. 89. P. 18351843.

173. Wagner D., Sablowski R.W.M., Eyerowitz E.M. Transcriptional activation of APETALA1 by LEAFY. Science. 1999. V. 285. P. 582-584.

174. Wawrzynska A., Lewandowska M., Hawkesford M.J., Sirko A. Using a suppression subtractive library-based approach to identify tobacco genes regulated in response to short-term sulfur deficit // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 1575-1590.

175. Weigel D., Alvarez J., Smyth D.R., Yanofsky M.F., Meyerowitz E.M. LEAFY control floral meristem identity in Arabidopsis II Cell. 1992. V. 69. P. 843859.

176. Weigel D., Meyerowitz E.M. Activation of floral homeotic genes in Arabidopsis 11 Science. 1993. V. 261. P. 1723-1726.

177. Weigel D., Meyerowitz E.M. The ABCs of floral homeotic genes // Cell. 1994. V. 78. P. 203-209.

178. Weigel D., Nilsson O. A developmental switch sufficient for flower initiation in diverse plants // Nature. 1995. V. 377. P. 495-500.

179. Wellmer F., Riechmann J.L., Alves-Ferreira M., Meyerowitz E.M. Genome-wide analysis of spatial gene expression in Arabidopsis flowers // The Plant Cell. 2004. V. 16. P. 1314-1326.

180. Wen С-К., Chang С. Arabidopsis RGL1 encodes a negative regulator of gibberellin responses // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 87-100.

181. Wigge P.A., Kim M.C., Jaeger K.E., Busch W., Schmid M., Lohmann J.U., Weigel D. Integration of spatial and temporal information during floral induction in Arabidopsis // Science. 2005. V. 309. P. 1056-1059.

182. Western T.L., Haughn G.W BELLI and AGAMOUS genes promote ovule identity in Arabidopsis thaliana II Plant J. 1999. V. 18. P. 329-336.

183. William D.A., Su Y, Smith M.R., Lu M., Baldwin D.A., Wagner D. Genomic identification of direct target genes of LEAFY II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 10. P. 1775-1780.

184. Wilson R.N., Heckman J. W., Somerville C.R. Gibberellin is required for flowering in Arabidopsis thaliana under short days // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 403-408.

185. Wolf E., Kim P.S., Berger B. MultiCoil: a program for predicting two- and three-stranded coiled coils // Protein Sci. 1997. V. 6. P. 1179-1189.

186. Yamaguchi S. Gibberellin metabolism and its regulation // Annual Review of Plant Biology. 2008. V. 59. P. 225-251.

187. Yu C.-S., Chen Y.-C., Lu C.-H., Hwang J.-K. Prediction of protein subcellular localization // Proteins. 2006. V. 64. P. 643-651.

188. Zik M., Irish V.F. Flower development: initiation, differentiation, and diversification // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2003. V. 19. P. 119-140.

189. Zimmermann P., Hirsch-Hoffmann M., Hennig L., Gruissem W. GENEVETIGATOR. Arabidopsis microarray database and analysis toolbox // Plant Physiol. 2004. V. 136. P. 2621-2632.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Мякушина, Юлия Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.12

Диссертация

Участие генов LSU в контроле цветения Arabidopsis thaliana - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Участие генов LSU в контроле цветения Arabidopsis thaliana ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие генов LSU в контроле цветения Arabidopsis thaliana"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мякушина, Юлия Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие генов LSU в контроле цветения Arabidopsis thaliana"

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Мякушина, Юлия Александровна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мякушина, Юлия Александровна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие генов LSU в контроле цветения Arabidopsis thaliana
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений