Клонирование и характеристика генов, отвечающих за формирование соцветия представителя сложноцветных - хризантемы

Щенникова, Анна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клонирование и характеристика генов, отвечающих за формирование соцветия представителя сложноцветных - хризантемы
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и характеристика генов, отвечающих за формирование соцветия представителя сложноцветных - хризантемы"

На правах рукописи

ЩЕННИКОВА АННА ВЛАДИМИРОВНА

КЛОНИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ, ОТВЕЧАЮЩИХ ЗА ФОРМИРОВАНИЕ СОЦВЕТИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЯ СЛОЖНОЦВЕТНЫХ - ХРИЗАНТЕМЫ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 2003

1Й1*

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии Центра «Биоинженерия» РАН и в группе архитектуры растений Plant Research International (Wageningen, The Netherlands)

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Академик РАСХН, профессор Скрябин К. Г. Кандидат химических наук Шульга О. А.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор биологических наук Ежова Т. А.

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук Корочкин Л. И.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт Цитологии и Генетики СО РАН

Защита состоится _ 2003 г. в _ часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте Молекулярной биологии РАН

Автореферат разослан_2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

Кандидат химических наук Крицын А. М.

ЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Цветение представляет собой высоко консервативный процесс у отдаленных видов цветковых растений, который определяется регуляторной сетью иерархически взаимодействующих генов - в большинстве своем кодирующих факторы транскрипции (Blazquez, 2001). В основании иерархии находятся гены раннего и позднего цветения. Они переключают развитие растения с вегетативной на репродуктивную стадию, активируя гены идентичности меристемы соцветия и цветковых меристем. Далее включаются гены идентичности цветковых органов, пространственную активность которых ограничивают кадастральные гены, способствуя дифференцировке кругов цветковых органов.

Изучение процесса формирования и развития цветка в модельных двудольных растениях - Arabidopsis thaliana (A. thaliana), Antirrhinum majus (A. majus) и Petunia hybrida (Р. hybrida) - привело к созданию консервативной ABCDE модели, утверждающей, что активность А определяет идентичность чашелистиков и лепестков, В - лепестков и тычинок, С - тычинок и плодолистиков, D - семязачатков и Е - лепестков, тычинок и плодолистиков (Bowman et al., 1989; Angenent and Colombo, 1996; Pelaz et al., 2000, 2001; Honma and Goto, 2000, 2001). Каждой активности соответствует группа генов, в основном кодирующих MADS факторы транскрипции. Предполагается, что MADS белки работают в составе «квартетов», а именно: идентичность лепестков цветка A. thaliana определяет комплекс АР 1 /SEP3/PI/AP3 (А/Е/В/В активности), тычинок -AG/SEP3/PI/AP3 (С/Е/В/В), и плодолистиков - SEP3/SEP3/AG/AG (Е/Е/С/С) (Pelaz et al., 2001; Honma and Goto, 2001).

Цветковые органы представляют собой видоизмененные листья. Предшественники MADS генов эволюционировали в цветковые гомеотические гены, определяющие идентичность околоцветника и репродуктивных органов. На примере MADS генов, таким образом, изучается эволюция морфологии растений. Семейство сложноцветных считается вершиной эволюции цветковых растений. Отличительной особенностью семейства является соцветие-корзинка, состоящее обычно из цветков разных типов. При этом соцветие выглядит и функционирует как один большой цветок. Изучая его морфогенез, возможно получить дополнительные знания об ABCDE модели и эволюции семенных растений. На данный момент опубликованы три работы, касающиеся представителя сложноцветных - Gerbera hybrida (G. hybrida) (Yu et al., 1999; Kotilainen et al., 1999; Kotilainen et al., 2000). Мы выбрали в качестве объекта исследования другого представителя семейства - хризантему Dendrathema grandiflora (D. grandiflora) cv. Parliament.

Научная новизна работы. Получена кДНК библиотека, содержащая кДНК генов, экспрессирующихся в соцветии D. grandiflora на ранней стадии развития. Впервые обнаружены и секвенированы кДНК MADS генов (CDM) хризантемы D. grandiflora. Проведен сравнительный филогенетический анализ аминокислотных последовательностей белков CDM с известными

MADS белками A. thaliana и Р. hybrida. ОпрффВДВДАф|ад0ГО|Жда1ологи

БИБЛИОТЕКА } С.П ОЭ

выделенных CDM генов и гена FBP2. Проведен функциональный анализ гена CDM111, а также анализ возможных взаимодействий белков CDM друг с другом и MADS белками A. thaliana и P. hybrida. В ходе исследований получены данные, подтверждающие явление дупликации MADS генов и модификации характеристик дуплицированных генов в процессе эволюции семенных растений.

Практическая ценность работы. Хризантема - самая распространенная декоративная цветковая культура в мире. С практической точки зрения обнаруженные и охарактеризованные нами гомеотические гены, оказывающие влияние на морфологию соцветия хризантемы, могут быть использованы для получения новых декоративных сортов растения. Апробация работы. Результаты работы доложены на конференции «Физико-Химическая Биология» (2000, Пущино, Россия) и международных конгрессах «Plant Biotechnology 2002 and Beyond» (10th IAPTC&B Congress, 23-28 июня, 2002, Orlando, USA), "Plant Reproduction" (14th Penn State Congress, 16-18 мая, USA) и «Plant Molecular Biology» (23-28 июня, 2003, Barcelona, Spain). Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.

Работа изложена на_страницах машинописного текста, содержит_

таблиц и_рисунков. Библиография включает_ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы: штаммы Е. coli XLl-blue и XLOLR, А. íumerfaciens С58С1рМР90, S. cerevisiae Pj69-4a; растения D. grandiflora cv. Parliament, A. thaliana (экотипы Columbia и Landsberg erecta apl-1), P. hybrida W115; вектора pBinl9-P35S-NOST (трансформация растений), pGEMT-easy и pUC19 (промежуточное клонирование), HYBRIZAP (создание кДНК библиотеки), pAD-GAL4, pBDCam-GAL4, pRED-NLSa и pTFTl (анализ кДНК библиотеки и MADS генов в двухгибридной GAL4 дрожжевой системе).

Манипуляции с бактериальными штаммами, выделение плазмидной ДНК и клонирование осуществляли по Маниатису и др. (1984), выделение геномной ДНК и суммарной РНК из растений - по Dellaporta et al. (1987) и Choczynski and Sacchi (1987), соответственно. Получение кДНК библиотеки из соцветий хризантемы, ее анализ и анализ выделенных генов в GAL4 дрожжевой системе - согласно Маниатису и др. (1984) и протоколу фирмы Stratagene. Гибридизационный анализ кДНК библиотеки, Нозерн и In situ анализы мРНК тканей хризантемы и петунии проводили по Маниатису и др. (1984) и Cañas et al. (1984). Пробы для In situ гибридизации получали согласно Angenent et al. (1995). Растения A. thaliana трансформировали по Clough and Bent (1998) и Desfeux et al. (2000). Сравнительный и филогенетический анализ последовательностей MADS генов осуществляли с помощью программ BLAST (Altschul et al., 1997) (www.ncbi.nlm.nih.gov). ClustalX (ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalX1 и Tree-View (http://taxonomyvzoologv.gla.ac.uk/rod/treeview.htmn.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и гибридизационный анализ кДНК библиотеки. Анализ последовательностей выделенных кДНК MADS генов хризантемы.

Общепринятый подход к выяснению молекулярных механизмов развития цветка состоит в поиске, выделении и характеристике соответствующих генов. На РНК, выделенной из ткани соцветия хризантемы на ранней стадии развития, нами получена кДНК библиотека. С помощью молекулярной гибридизации кДНК библиотеки с MADS доменом гена НАМ75 (Helianthus annuus MADS, выделен Шульгой О.А.) обнаружено восемь полноразмерных кДНК CDM генов (Chrysanthemum Dendraíhema grandiflora MADS) (табл. 1). В процессе дальнейшего анализа кДНК библиотеки в двухгибридной дрожжевой GAL4 системе (см. п. 4) были обнаружены также кДНК CDM36, CDM19 и CDM115 (табл. 1).

Современная классификация генов включает в себя определение нуклеотидной последовательности, ее сравнительный анализ с известными последовательностями банка данных и филогенетический анализ, отражающий генетическую эволюцию, параллельную эволюции целых организмов. Согласно результатам филогенетического анализа MIK (MADS, I, К области) последовательностей CDM и MADS белков A. thaliana и Р. hybrida, выделенные CDM гены кодируют белки, принадлежащие к различным подсемействам MADS семейства факторов транскрипции растений (рис. 1, табл. 1).

Таблица 1. Характеристики кДНК CDM генов.

Ген CDMS CDM41 CDM111 CDM44 CDM77 CD№6

Кодируемый белок,ах ni 243 246 249 246 216

Номер доступа в GenBank AY173056 AY 173055 AY 173054 AY 173057 AY 173058 AY 173065

Гомолог в A. thaliana FUL (AGL8) FUL/API API SEP3 (AGL9) SEP1(AGL2)/ SEP2(AGL4) SOCI (AGUO)

Ген CDM86 CDM19 CDM11S CDM104 CDM37

Кодируемый белок, ак 196 231 229 250 265

Номер доступа в GenBank AY173061 AY173064 AY173060 AY 173062 AY173059

Гомолог в A. thaliana Р1 АРЗ АРЗ AGL6 AG

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей CDM и MADS белков A. thaliana и P. hybrida (консервативные MADS, I и К области - МПС). Белок USP А использован в качестве представителя другой филогенетической группы.

CDM111

В QUA

API

CDM41

CDMB

FUL

COM4 4

FBP2

SEP3

CDM111

SQUA

API

CDM41

CDM8

FUL

CDM44

FBP2

SEP3

CDMlll

SQUA

API

CDM41

CDMB

FUL

CDM44

FBP2

SEP3

60 Isle

MGRG4V 64RIENKInRQVTF KRR GLLKKA E6SVLCDAeVAL66FS 4GKL E5 3 S И -MADS-

100

120

LE4Y 4

'ATD-AT-PRSBTi •SNEP0S-PANj«Tb APESDV-NTNB3M APENET-QASWTL STHNES-OGSWiL GRDVSQ-SEN ISAREAL—ELS SQO IsTREAL—PISSQQ GAPjgPNf P S RBALAVSLSSQQ 6

4LKa4 e L24 К домен

180 EKDKTITENVQ IKE—IAQQPQ BKIL-RAQQEQ ' ¡KN—SEQQNE ;KD—AAHHDK ÍKK—TGQpEG QVTSLHBHPH STLN-bQWQQN .DGYQMP-LQLNPN 6 e

63 63 63 63 63 63 63 63 63

122 123 123 123 123

123

124 124 126

IBS 184 IBS 184 184 184 187 186

* 200 * 220 * 240 «

CDMlll : WEQHNYVDHDTSFLMPQP------P--------PGUfflGGNYNQSGGCAGER---ADGMJNEL H: 231

SQUA : BEHHR--HHTNASIHPPP------PQYSMAPQF PCINVGNTYE—GEGANE-----D-RJNEL 231

API : eD®2NQ-GHNMPPECPPQQHOrQHPYMLSHQPSPFMffIGGLYQEDD»fAMR--------gPJDL I: 239

CDM41 : RV£LP— QPPPPPPSI^P------------YSVPSFATSRPFIGAAMREEE-----LARAHHV : 228

CDM8 : —-----EPQIHAAVBBL------------HLGILNNCDAHQAGSDMEVED-----IPRPAQP : 223

FUL : —OLVQCSNSSSVLbBOY--------------CVTSSRDGFVERVGGENGG------ASSLTE : 225

CDK44 : V-QQEMGYDQQHE PQHQN----------GEAFFHPLDCGPTLQMGYPSDSLTAEAAASVAGPS : 239

FBP2 : —AQDVGYGRQATQTQ------------GDGFF HPLECEPTLQIGYQND----PITVGGAGPS : Z31

SEP3 : Q-BEVDHYGRHHHQQÍÍQK----------SQAFFQPLECEPILQIGYQGQ-----QDGMGAGPS : 235

260

CDMlll

SQUA

API

CDM41

CDM8

FUL

CDM44

FBP2

SEP3

CS1 VHN' VNNYRLi

SCHMRipFPSfl SCHLGftFAA I CNLGtFAA I HLNQ— IHMSK— PTTTNE

■Ъ-------

•P-------

DTNSI-

246

248 256 243 237 242

249 241 251

Рис. 2. Сравнительный анализ CDM8, CDM41, CDM44 и CDM111 с MADS белками API/FUL и SEP3 подсемейств A. thaliana и P. hybrida. Двойной линией выделены консервативные последовательности MADS белков API ветви, сплошной линией - FUL, прерывистой - SEP3. Сплошными линиями подчеркнуты MADS и К домены.

Так как структурные гомологи обладают гомологичными функциями, мы предположили, что СОМШ определяет идентичность лепестков, СБМ86, СБМ19 и СБМ115 представляют В активность, СБМ37 - С активность, а СБМ44 и СБМ77 - Е активность, СБМ8, СБМ41 и СБМ104 участвуют в развитии плодолистика и семянки, а СБМ36 принимает участие в инициации цветения хризантемы. Факторы СОМ111, (ЛЖ8 и СОМ41, возможно, также участвуют в определении идентичности цветковых

меристем хризантемы. Именно поэтому мы остановились на детальном изучении этих трех генов, а также - гена CDM44, как представителя Е активности, без которой в модельных растениях невозможно формирование лепестков, тычинок и карпелей. Параллельно мы провели функциональный анализ гена FBP2 (P. hybrida) (Angenent et al., 1992), поскольку он является ближайшим гомологом CDM44, и, следовательно, его изучение может помочь нам в понимании функции CDM44.

Таблица 2. Сравнительный анализ CDM8, CDM41, CDM44, CDM111 и MADS белков растений отдела покрытосеменных. L esculenthum - Lycopersicon esculentkum. Н. annuus -

Helianthus annuus.

CDM Гомолог Идентичность, % Группа активности

мпсс MIK

СРМШ НАМ75 (Я. annuus) 92 98 A

НАМ92 (Я. annuus) 87 95

SQVA (A. thallana) «7 82

GSQUA (G. hybnda) - 81

API (A. thaliana) 60 75

CAL (A. thaliana) 56 68

CDM41 FBP29 (P. hybrida) 65 78 AC?

DEFH28 (A. majus) 62 77

FBP26 (P. hybrida) 60 74

P fG (P. hybnda) 62 73

TDR4 (I. esculenthum) 58 71

SQUA (A majus) - 70

CDM 8 58 72

CDM111 - 70

FUL (A. thaluma) - 68

CDM8 FBP26 (P. hybrida) 65 78 AC?

PFG (P. hybrida) 62 78

TDR4 (L. esculenthum) 59 74

FUL(y<. thaliana) - 73

CTM41 58 72

CDM111 - 70

FBP29 (P. hybrida) - 70

DEFH28 (A. majus) - 73

CDM44 FBP9 (P. hybrida) - 93 E

DEFH72 (A. majus) 80 92

DEFH200 (A. majus) 78 93

FBP2 (P. hybrida) 78 93

SEP3 (A. thaliana) 71 85

SEP2 (A. thaluma) 63 77

SEP1 (A thaliana) 63 77

GRCD1 (G. hybrida) 60 68

HAM137 (Я. annuus) 59 68

FBP23 (P. hybnda) 57 72

FBP5 (P. hybnda) 57 70

CDM белки, как и другие представители MADS семейства растений, состоят из консервативных MADS- и К-доменов, соединяющей их низко консервативной I-области и вариабельного С-конца (рис. 2). Сравнительный анализ CDM белков с известными растительными MADS белками [BLAST] выявил наиболее гомологичные из них (табл. 2). Филогенетический анализ последовательностей CDM8, CDM41, CDM44 и CDM111 с выявленными наиболее гомологичными MADS факторами транскрипции покрытосеменных растений показал, что ближайшими гомологами CDM111 являются MADS

белки семейств Compositae (Д. annuus и G. hybrida) и Veronicaceae (A. majus) (табл. 2, рис. 3). А ближайшими гомологами CDM41 являются MADS белки Veronicaceae и Solanaceae (P. hybrida). Все три упомянутых семейства относятся к одному из двух надсемейств покрытосеменных растений Asterids (Soltis et al., 2002). Это предполагает большее функциональное сходство CDM111 и CDM41 с гомологами API и FUL этого надсемейства, соответственно. В то же время ближайшие гомологи CDM44 и CDM8 относятся к представителям обоих надсемейств - Asterids и Rosids.

АРЗ (A. thahana)

SEH (A. thaliana)

CDM44 (D. grandiflora)

FBP2 (P. hybrida)

DEFH72 (A. majus)

DEFH200 (A majus)

SEP1 (A. thaliana) 1000

SEP2 (A thaliana)

C~ ЯВР5 (P. hybrida) 1000

- pMADS12 (p. hybnda) (P. hybnda) (P. hybnda) (P. hybrida) (A thaliana) (G. hybrida)

AGL3

GRCD1 1000

НЛМ137 (H.annuus)

API (A thaliana)

CAL (A thaliana)

SQUA (A, majus)

GSQUA (G hybrida)

HAM92 (H. annuus)

СРМ1Ч (D grandiflora)

HAM75 (H annuus)

CDM4I (D. grandiflora)

FBP29 (P. hybrida)

DEFH28 (A. majus)

FUL (A. thaliana)

PFO (P. hybnda)

TDR4

(L esculenthum) (P. hybrida) (D grandiflora)

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей (МК) CDM8, CDM41, CDM44, CDM111 и известных MADS белков, принадлежащих AP1/FUL и SEP3 подсемействам. MADS белок АРЗ использован как представитель другого подсемейства MADS белков.

Данные согласуются с теорией эволюционного происхождения генов гомологов API от генов гомологов FUL в результате процесса дупликации генов (Shepard and Purugganan, 2002; Irish and Litt, 2002), и свидетельствуют о более консервативной роли гомологов FUL и SEP3, нежели API, в развитии цветка.

Известно, что MADS белки ветви FUL подсемейства API /FUL характеризуются наличием в области С-конца консервативного мотива LPGWML, который присутствует также в белках подсемейства SEP3 и потерян белками ветви API. Гомологи API имеют новый консервативный мотив RNDLELTL и сайт фарнезилирования СааХ на С-конце (Rodriguez-Concepcion et al., 1999; Yalovsky et al., 2000a, 2000b; Irish and Litt, 2002). Анализ аминокислотных последовательностей CDM белков показал, что в CDM8 имеется последовательность MPPWMV, в CDM41 - MPLWMI, в CDM111 CFPS и TNELDLSL, и в CDM44 - MPGW (рис. 2). Это подтверждает то, что CDM8 и CDM41 являются гомологами FUL, CDM111 -API и CDM44 - SEP3. CDM41, по всей видимости, является продуктом гена, паралогичного гену CDM8.

2. Анализ паттерна экспрессии генов CDM111, CDM41, CDM8 и CDM44

Функциональный анализ генов включает в себя определение паттерна экпрессии гена в различных тканях организма-хозяина на разных стадиях его развития. В настоящее время для этого существует несколько методов, используемых по отдельности или в комбинации: Нозерн и In situ гибридизации, Вестерн анализ, использование маркерных генов (например, GUS), экспрессируемых под контролем промотора исследуемого гена. По результатам анализа паттерна экспрессии гена мы можем судить об участии гена в развитии определенных структур организма.

Паттерны экспрессии CDM генов исследовали блот гибридизацией суммарной РНК, выделенной из различных тканей хризантемы, с пробами, специфичными полной кДНК CDM111, CDM8, CDM41 и CDM44 (рис. 4).

Согласно результатам анализа, мРНК всех четырех генов присутствует в тканях закрытого бутона соцветия хризантемы на ранних стадиях развития. Транскрипты CDM8 и CDM41 обнаружены в стебле и стеблевых листьях, а CDM41 и CDM111 - в прицветниках цветоложа. В соцветии экспрессия CDM8 отмечена в лепестках и карпелях язычковых и трубчатых цветков, CDM41 - в лепестках и карпелях трубчатых и в карпелях язычковых цветков, CDM111 - в лепестках язычковых и трубчатых цветков. мРНК CDM44 присутствует во всех органах язычковых (лепестки и карпели) и трубчатых (лепестки, тычинки и карпели) цветков.

С помощью In situ гибридизации РНК в тканях соцветия хризантемы со специфичными CDM8, CDM41, CDM111 и CDM44 пробами определен паттерн экспрессии генов на ранних стадиях развития соцветия (см. цветные фото в диссертации). На стадии, предшествующей появлению цветковых меристем, не зарегистрировано никакого явного сигнала. мРНК всех четырех CDM генов появляется в примордиях язычковых и трубчатых цветков -сильный сигнал регистрируется в случае CDM111, CDM41 и CDM44, и

слабый - в случае СОМ8. Транскрипты СОМ41 обнаружены также (слабый сигнал) в цветоложе, при этом экспрессии СйМ41 в прицветниках цветоложа на данной стадии не наблюдалось. В развивающихся цветках соцветия транскрипты СОМ8, СВМ41 и СйМШ накапливаются в лепестках, тычинках и карпелях, а СИМ44 - в лепестках (слабый сигнал), тычинках, карпелях и сосудистых пучках.

а о

CDM111

CDM41

CDM8

1Г>

^Ж^

• шш ш

CDM44

RNA

т т

-т^ -тт -щ* тт »

Рис. 4. Нозерн анализ паттерна экспрессии генов CDM8, CDM41, CDM44 и CDM111. Суммарную РНК выделяли из следующих тканей D. grandiflora: корни, стебель, лист, закрытое соцветие 1-2 мм в диаметре, закрытое соцветие 4-5 мм в диаметре, лепестки язычковых и трубчатых цветков, тычинки трубчатых цветков и карпели язычковых и трубчатых цветков соцветия.

Отметим, что на более поздних стадиях развития (Нозерн) паттерны экспрессии CDM8, CDM41 и CDM111 отличаются от таковых на ранних стадиях (/и siíu): мРНК CDMI11 исчезает в тычинках и карпелях и появляется в прицветниках цветоложа; мРНК CDM41 исчезает в тычинках и лепестках язычковых цветков и появляется в прицветниках цветоложа; мРНК CDM8 пропадает в тычинках. И только CDM44 демонстрирует неизменный паттерн экспрессии.

При одинаковой концентрации РНК и проб разная интенсивность сигнала свидетельствует о разных уровнях экспрессии генов. Однако, наличие мРНК в определенных тканях еще не говорит о том, что в данной области присутствует белок. Поэтому делать однозначные выводы о функциях генов, основываясь на результатах Нозерн и In siíu анализов, нельзя. Мы сравнили паттерны экспрессии CDM111, CDM41, CDM8 и

охарактеризованных представителей API/FUL подсемейства, которым, как известно, часто свойственны значительные расхождения в паттернах экспрессии. Согласно результатам блот гибридизации, CDM111 повторяет паттерн экспрессии API (Bowman et al., 1989) и SQUA (Huijser et al, 1992). Ha ранних стадиях развития соцветия (In situ) наличие мРНК CDMlll в тычинках и плодолистиках отличает его от API. SQUA же на ранних стадиях транскрибируется в нижней части карпеля, что еще раз свидетельствует о большем сходстве CDMlll с гомологами API представителей Asterids.

Паттерны экспрессии CDM8 и CDM41 практически (со ссылкой на разное строение соцветий и цветков D. grandiflora и A. thaliana) повторяют паттерн экспрессии FUL (Mandel и Yanofsky, 1995). Исключение составляет экспрессия CDM8 и CDM41 в лепестках, что роднит эти гены с API, Паттерны экспрессии CDM8 и CDM41 напоминают также паттерн экспрессии PFG (гомолог FUL из Р. hybrida) (Immink et al., 1999), различие заключается в присутствии мРНК CDM8 и CDM41 в тычинках и отсутствии в прицветниках ложа соцветия. Что касается CDM44, паттерн экспрессии гена повторяет паттерн экспрессии SEP3 и своего ближайшего гомолога FBP2 (Angenent et al., 1992,1994).

Проанализировав данные блот гибридизации и In situ, мы пришли к заключению, что CDM8 и CDM41 являются гомологами FUL, практически повторяя паттерн его экспрессии. То же можно сказать в отношении пар CDMlll и API, и CDM44 и SEP3. Сходство паттернов экспрессии генов гомологов свидетельствует об их возможной ортологии.

3. Функциональный анализ генов CDMlll, CDM41 и FBP2

Окончательное заключение о функции гена обычно делают на основе анализа мутантных или трансгенных растений с выключенной или эктопической экспрессией анализируемого гена. Поэтому следующим этапом анализа CDM генов стало получение трансгенных растений, конститутивно экспрессирующих данные гены, и последующее сравнение этих растений с описанными ранее растениями, конститутивно экспрессирующими гены, гомологичные анализируемым. Исследования возможны как в гомологичной системе (Pnueli et al., 1994; Kenpin et al., 1993; Tsuchimoto et al., 1993; Mizukami and Ma, 1992; Jack et al., 1994), так и в гетерологичной (Mandel et al., 1992; Chung et al., 1994; Muller et al. 2001; Elo et al. 2001). Мы использовали гетерологичную систему, а именно получили трансгенные растения A. thaliana экотипов Columbia и Landsbeg erecta apl-1 с конститутивной экспрессией генов CDMlll и CDM41.

Конститутивная экспрессия API в растении A. thaliana экотипа Columbia вызывает раннее цветение, эффект скручивания листьев и трансформацию открытого соцветия в сложный верхушечный цветок, состоящий из нескольких пестиков в окружении большого количества беспорядочно расположенных тычинок, лепестков и чашелистиков (Mandel and Yanofsky, 1995а). Конститутивная экспрессия API в растении A. thaliana экотипа Landsberg erecta apl-1 вызывает раннее цветение и частичную или почти полную комплементацию функции API: появление лепестков во

втором круге цветка, уменьшение количества или отсутствие пазушных цветков (Mandel et al., 1992). Конститутивная экспрессия FUL и его гомологов в растениях A. thaliana экотипа Columbia дает такой же эффект, что и эктопическая экспрессия API. Кроме того, наблюдаются серьезные изменения в развитии плодолистиков и, как результат, в морфологии стручочков (Ferrandiz et al., 2000а).

Конститутивная экспрессия CDM111 в растениях A. thaliana экотипа Columbia приводит к раннему цветению (после 4 розеточных листьев по сравнению с 8-10 в растении дикого типа), скручиванию стеблевых и розеточных листьев и трансформации открытого соцветия в сложный верхушечный цветок, состоящий из 2-4 пестиков, окруженных множеством лепестков, тычинок и чашелистиков. В отличие от 35S::AP1 растений, цветки 35Sv.CDMlll содержат мозаичные тычинки с признаками лепестков, при этом один из пестиков в верхушечных цветках часто раскрыт (рис. 5, цветные фото см. в диссертации).

На селективной среде нами были отобраны 47 трансгенных растений поколения ТО, полученных из семян трансформированного растения А. thaliana Columbia. Семнадцать из них демонстрировали 35S"CDM1I1 фенотип с разной степенью выраженности. Экспрессия CDM111 подтверждена блот гибридизацией суммарной РНК, выделенной из тканей трансгенных растений, с CDMI11 пробой, специфичной 3' концу кДНК CDM111. Т1 поколение шести трансгенных линий из семнадцати характеризовалось усилением 35S::CDM111 фенотипа. Это проявлялось в наличии только одного короткого стебля (4-7 см) вместо нескольких побегов, увенчанного сложным верхушечным цветком с 2-4 пестиками, один из которых почти всегда раскрыт. Кроме мозаичных тычинок появились мозаичные чашелистики с лепестковой тканью (рис. 5, см. цветное фото в диссертации). Соцветия редких латеральных побегов также трансформировались в сложные верхушечные цветки.

Из девятнадцати ТО растений А. thaliana Landsberg erecta apl-1 с конститутивной экспрессией CDM111 в девяти наблюдалась комплементация функции API - уменьшение количества пазушных цветков (один - в верхушечном цветке, и их отсутствие в цветках латеральных побегов), а также появление одного лепестка в пазушном цветке верхушечного цветка и четырех заостренных лепестков в цветках латеральных побегов (рис. 5, цветное фото см. в диссертации). Транскрипция CDM111 и низкий уровень экспрессии API в соцветиях трансгенных растений ТО A. thaliana Landsberg erecta apl-1 подтверждены блот гибридизацией. Проанализированное Т1 поколение четырех линий из девяти показало тот же фенотип, что и ТО.

Результаты фенотипического анализа 35S'.:CDM111 растений говорят о том, что CDM111 является ортологом API, проявляя также слабое функциональное сходство с FUL.

Конститутивная экспрессия CDM41 в растениях A. thaliana экотипов Columbia и Landsberg erecta apl-1 (ГО, TI и Т2 поколения) не повлияла на исходные характеристики вегетативных и цветковых органов. Транскрипция CDM41 в трансгенных растениях подтверждена блот гибридизацией. Одним

из возможных объяснений отсутствия трансгенного фенотипа может быть замалчивание экспрессии чужеродного гена на стадии трансляции. Можно также предположить, что CDM41 может быть активным только в комплексе с каким-либо еще MADS белком D. grandiflora, который отсутствует в А. thaliana. И, наконец, третья возможная причина - CDM41, несмотря на сходство последовательности и паттерна экспрессии, не является функциональным гомологом FUL и выполняет в развитии соцветия хризантемы другую, невыясненную нами роль.

'4%

Рис. 5. а - цветок дикого типа A. thaliana экотипа Columbia; b-j - цветки 35Sv.CDMlH Columbia: bj - цветки, содержащие 2 лепестка и раскрытый пестик; с -мозаичный чашелистик (чл) с характеристиками лепестка; d - сложный

верхушечный цветок, состоящий из трех пестиков, окруженных множеством тычинок, лепестков и чашелистиков; е - сложный верхушечный цветок, состоящий из трех пестиков, окруженных множеством тычинок, лепестков и чашелистиков, при этом один из пестиков раскрыт (оп); f - сложный верхушечный цветок, состоящий из двух пестиков, окруженных множеством тычинок, лепестков и чашелистиков, один из пестиков раскрыт, три тычинки с характеристиками лепестков (тл); g - сложный верхушечный цветок, состоящий из двух пестиков, окруженных множеством тычинок, лепестков и чашелистиков; h - латеральный цветок, содержащий тычинку с характеристиками лепестка; i - латеральный цветок, содержащий тычинку с характеристиками лепестка; к -цветок A. thaliana экотипа Landsberg erecta apl-1; 1, m - цветки 35Sv.CDMlll api-] Ler: 1 -цветки содержат по четыре лепестка, а верхушечный цветок имеет лишь один пазушный цветок с двумя лепестками; m - латеральный цветок, содержащий четыре лепестка.

Конститутивная экспрессия SEP3 в растениях A. thaliana экотипа Columbia вызывает карликовость, скрученные листья, раннее цветение и трансформацию открытого соцветия в сложный верхушечный цветок (Honma and Goto, 2001). Мы трансформировали A. thaliana Columbia бинарным вектором с кассетой экспрессии 35S::CDM44 и собрали семена, которые находятся в стадии анализа. В то же время у нас была возможность изучить проявление функциональной активности FBP2 - ближайшего гомолога CDM44. Ранее Angenent et al. (1994) получены трансгенные растения петунии с эффектом замалчивания FBP2. Фенотип fbp2 растений повторяет фенотип A. thaliana Columbia sepl sep2 sep3 - цветок состоит из трех кругов

чашелистиков и нового цветка вместо пестика, состоящего из чашелистиков, в котором опять же вместо пестика новый цветок и т.д. (Mandel and Yanofsky, 1995) (рис. 6, цветные фото см. в диссертации).

Рис. 6. Растения А. thaliana и P. hybrida, несущие sepallata

мутации, и растения А. thaliana, в которых конститутивная экспрессия гена FBP2 частично обеспечивает функцию SEP3. А -растение A. thaliana дикого типа, цветение после 9-12 розегочных листьев (rl). В 35S::FBP2 A. thaliana -раннее цветение после формирования лишь одного скрученного розеточного листа (rl), завершение развития образованием верхушечного цветка (tfl). С - s ер J sep2 sep3 цветок A. thaliana: чашелистики в первых трех кругах (1, 2, 3) и новый бутон с тем же паттерном развития в четвертом круге (4). D -соцветие P. hybrida дикого типа W115: i — соцветие (inflorescence), b - прицветник (bract), f - цветок (flower). Е - соцветие P. hybrida ßp2 (косупрессия FBP2). F - fbp2 цветок P. hybrida с фенотипом, повторяющим фенотип sepl sep2 sep3 цветка A. thaliana. G - один из первых цветков sepl sep2 sep3 35S::FBP2 растения A. thaliana с комплементацией функции SEP3: второй круг органов с признаками лепестков, в четвертом круге развиваются два частично сросшихся карпеля. H - цветок верхнего соцветия sepl sep2 sep3 35S::FBP2 растения A. thaliana с комплементацией функции SEP3: лепестки во втором круге, тычинко-подобные органы в третьем круге и подобие завязи в круге четвертом с тканью стигмы (st) на верхушке. I - поздний цветок sepl sep2 sep3 35S::FBP2 растения A. thaliana с комплементацией функции SEPS (часть лепестков и чашелистиков удалена): в третьем круге есть тычинки, несущие пыльцу. J - увеличенное изображение тычинки с пыльцой (I). К - увеличенное изображение «завязи» в четвертом круге цветка sepl sep2 sep3 3SS::FBP2 A. thaliana: два карпеля практически срослись, на их верхушке -стигма, внутри «завязи» развиваются чашелистико-подобиые ткани (не показано). Линия в (А) и (В) = 1 см.

Нами были получены растения A. thaliana Columbia sepl sep2 sep3 с конститутивной экспрессией FBP2. Растения A. thaliana, несущие только две из трех sep мутаций, имеют фенотип цветка дикого типа (за исключением sepl sep3 растений, цветки которых имеют частично выраженный фенотип sepl sep2 sep3). Если FBP2 является ортологом SEP3, его эктопическая

экспрессия в sepl sep2 sep3 растениях может комплементировать (по крайней мере, частично, поскольку система гетерологичная) функцию SEP3, возвращая органам цветка их идентичность. Поскольку sepl sep2 sep3 и sepl sep3 растения стерильны, то для трансформации мы взяли sepl/+ sep2/+ sep3/sep3 растения. Полученные семена анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа на наличие экспрессии GFP (бинарный вектор, кроме, кассеты экспрессии гена FBP2, содержит маркерный ген GFP под контролем 35S промотора). Из семидесяти семи отобранных растений с экспрессией GFP и наличием FBP2 восемь оказались гомозиготными по всем трем sepl sep2 sep3 мутациям (проверено с помощью ПЦР согласно Pelaz et al. (2000)). Шесть из них показали комплементацию функции SEP3 - от частичной до почти полной (рис. 6) (Ferrario et al., 2003). Первый круг цветка sepl/sepl sep2/sep2 sep3/sep3 35S::FBP2 содержит четыре чашелистика, второй - четыре лепестка. Третий и четвертый круги цветка в случае частичной комплементации функции SEP3 имеют sepl sep2 sep3 фенотип. В случае же почти полной комплементации третий круг содержит шесть органов с характеристиками тычинок (изредка обнаруживаются тычинки с пыльцой на пыльнике), а четвертый круг представляет собой цветоножку в центре цветка, несущую структуру, оболочка которой состоит из карпеллоидной ткани, увенчанной стигма-подобными образованиями. Внутри структуры, однако, находятся подобные чашелистикам органы (вместо ожидаемых семязачатков). Судя по результатам, ген FBP2 способен частично выполнять функцию SEP3 в A. thaliana и принимает участие не только в определении идентичности органов трех внутренних кругов цветка, но и в дифференцировке центральных клеток цветковой меристемы, поскольку нокаут гена в P. hybrida приводит к развитию недетерминированной структуры вместо пестика (рис. 6-E,F). Так как ген FBP2 является ближайшим гомологом CDM44, мы предполагаем, что данные гены являются ортологичными.

Основываясь на результатах проведенного анализа, мы можем предположить, что CDM111 является функциональным гомологом API, а CDM44 - ортологом SEP3. Относительно же функциональной роли CDM41 и CDM8 мы пока не можем делать заключений.

4. Изучение белок-белковых взаимодействий CDM и FBP белков в двухгибридной дрожжевой GAL4 системе

Известно, что MADS белки для проявления функциональной активности должны образовывать гомо-, гетеро- и мультимеры с другими MADS белками (Egea-Cortines et al., 1999; Honma and Goto, 2001; Martinez, 2002). Специфичность подобных взаимодействий в большинстве случаев консервативна среди представителей покрытосеменных. Таким образом, идентификация белок-белковых взаимодействий служит дополнительным средством обнаружения паралогов и функциональных гомологов MADS белков - внутри- и межвидовых, соответственно. В настоящее время взаимодействия растительных MADS белков исследуются в основном в двухгибридной дрожжевой GAL4 системе, иногда - с помощью других

методов (Immink and Angenent, 2002; Causier and Davies, 2002; Hink et al., 2002; Immink et al., 2002,2003).

Таблица 3. Известные взаимодействия MADS факторов транскрипции (Davies et al., 1996b; Fan et al., 1997; Cho et al., 1999; Egea-Cortines et al., 1999; Yalovsky et al., 2000; Pelaz et al., 2001; Honma and Goto, 2001; Immink and Angenent, 2002; Immink et al., 2003).

pM3 - pMADS3 (FBP14); pM12 - pMADS12; pM4 - pMADS4; pMl - pMADSl (GP); FBP3 - pMADS2; SEP3 - AGL9; SEP1 - AGL2; SEP2 - AGL4; SOC1 - AGUO; UNS - FBP20._

Гомодимеры AG; SEP3; FBP2; SQUA

формируют FBP4; FBP13

Гетеродимеры с SEP3 API AG SQUA pM12 pMl FBP6 FBP9

формируют: AG; AP1;FBP7 SEP3 SEP1 PLE FBP3 pM2 FBP2 FBP6

FBP11;UNS SOC1 SEP2 UNS FBP1 FBP5 FBPU

FBP21;FBP22 AGL24 SEP3 FBP21 FBP9 UNS

FBP28; FBP29 AGL27 AGL6 FBP11 FBP23 FBP21

pM3 SVP FBP26 FBP22

pM12 FBP28

SEP3 рМЗ

Гетеродимеры с FBP5 FBP21 FBP22 FBP13 FBP28 FBP29 FBP23 FBP2

формируют. FBP6, pM3, FBP7 FBP2 FBP2 FBP5 FBP2 FBP2 FBP2 FBP6

FBPtl, FBPI3 FBP4 FBP5 FBP13 FBP5 FBP5 FBP5 рМЗ

UNS, FBP21 FBP5 FBP9 UNS FBP9 FBP13 FBP6 FBP7

FBP22, FBP23 FBP9 FBP13 FBP28 FBP13 FBP21 FBP11 FBP11

FBP28, FBP29 FBP13 FBP26 FBP29 FBP23 FBP22 UNS UNS

PFG FBP26 FBP29 PFG FBP29 FBP23 FBP26 FBP21

FBP29 pM4 FBP21 pM4 FBP26 FBP28 FBP22

pM4 PFG FBP22 PFG FBP2S FBP29 FBP23

pM12 SEP3 FBP2G SEP3 SEP3 рМЗ FBP26

PFG PFG FBP28

SEP3 FBP29

Третичные SEP3/AP3/PI

комплексы SQUA/DEF/GLO

«Квартеты» AG/AG/SEP3/SEP3

AP3/PI/SEP3/AP1

AP3/PI/SEP3/AG

Автоахтивация в API; SEP3; FBP2; FBP23;

GAL4 системе FBP4; FBP5; FBP9; pM12

Гомологи: SEP3: FBP2, FBP4, AGL24: Ml: FUL: m AP3: И: AGL6:

SOC1: FBP20 FBP5, FBP9, FBP13 SQUA FBP29 FBP6 pMl FBP1 pM4

(UNS), FBP21, FBP23, pM12 PFG рМЗ pM2

FBP22, FBP28 FBP26 (FBP14)

PLE

Мы использовали GAL4 систему для характеристики паттернов белок-

белковых взаимодействий белков CDM и FBP2 и сравнили полученные результаты с литературными данными (табл. 3, рис. 7 и 8). Анализ белок-белковых взаимодействий проводили при 30°С и комнатной температуре (22°С). Первая является оптимальной для роста дрожжевого штамма. Вторая - для роста исследуемых растений: используя ее, мы пытались приблизить условия взаимодействия белков к условиям in vivo (Honma and Goto, 2001). Большинство положительных результатов анализа белок-белковых взаимодействий было получено нами при комнатной температуре, что подтверждает целесообразность нашего подхода.

Из исследуемых нами CDM белков только CDM44 был способен активировать транскрипцию репортерного гена в GAL4 системе, что подтверждает принадлежность CDM44 к подсемейству SEP3 и наличие в CDM44 активаторного домена. По аналогии с охарактеризованными белками

активности Е (в частности, FBP2), активаторный домен, вероятно, находится в С-концевой области CDM44.

В результате скрининга кДНК библиотеки в GAL4 системе при комнатной температуре с CDM111 в качестве "наживки" мы обнаружили девять неполных кДНК MADS генов, начинающихся с К-домена, - пять копий нового MADS гена CDM36 и четыре - ранее выделенного CDM44. Насколько правомерно рассуждать о взаимодействии CDM111 с полными продуктами этих генов? Поскольку в MADS белках за белок-белковое взаимодействие отвечает К-домен (Fan et al., 1997; Moon et al., 1999b), отсутствие MADS и I областей теоретически не должно повлиять на способность полноразмерного белка CDM111 димеризоваться с полноразмерными белками CDM44 или CDM36. Проверив в GAL4 системе пару CDM111 и CDM44 на предмет взаимодействия, мы получили положительный результат (при комнатной температуре). Таким образом, CDM111 и CDM44 демонстрируют характеристики своих гомологов API и SEP3, соответственно.

С помощью ПЦР со специфичными праймерами на кДНК соцветия хризантемы мы выделили полноразмерную копию CDM36, после чего проверили, димеризуются ли полноразмерные CDM111 и CDM36, и получили отрицательный результат. Тем не менее, мы уверены, что in vivo взаимодействие существует, поскольку обнаружение пяти копий CDM36 при скрининге кДНК библиотеки в GAL4 системе не может быть случайным событием. Возможно, неправильный фолдинг полноразмерного белка CDM36 в составе гибридного белка ADgal4-CDM36 в дрожжевых клетках приводит к недосягаемости этой области.

Заметим для сравнения, что гомолог CDM36 в A. thaliana - SOC1 -является партнером API (гомолога CDM111) (табл. 3). Димеризуется ли CDM111 с CDM-гомологами других известных партнеров API (AGL24, SVP и AGL27), неизвестно, поскольку эти гомологи еще не обнаружены. Отличием CDM111 от API является то, что CDM111 не способен активировать транскрипцию репортерного гена в GAL4 системе. Однако, SQUA также не проявляет активирующих свойств. Вероятно, способность гомологов API активировать транскрипцию не является их неотъемлемой характеристикой, как и гомодимеризация - в отличие от SQUA (Egea-Cortines et al., 1999) CDM111 не образует гомодимера, как и API (R. Immink, личное сообщение). Кроме того, ни CDM111, ни API не являются партнерами MADS белков С-активности, что характерно для SQUA (Davies et al., 1996b).

Подобные несоответствия подтверждают эволюционное происхождение гомологов API от генов, гомологичных FUL, и отсутствие общего АР ./-предка. Если функциональная роль гомологов API в развитии цветка относительно совпадает (согласно результатам влияния эктопической экспрессии генов, гомологичных API, на морфологию и развитие растений), то в свойствах самих факторов транскрипции наблюдается выраженная вариабельность.

Подобно FUL и его гомологам (табл. 3), CDM8 и CDM4Î не образуют гомодимеров (в дрожжевой системе). Кроме того, они не взаимодействуют

друг с другом и с СБМ36 - гомологом 80С1. В настоящий момент хорошо изучен паттерн взаимодействий соответствующих белков Р. ИуЬпйа (табл. 3, Ьттпк й а1., 2003).

Рис. 7. Схематическое изображение взаимодействий MADS белков A. thaliana, P. hybrida и D. grandiflora в двухгибридной дрожжевой GAL4 системе. А - взаимодействия между SEP3, CDM44, FBP2 и некоторыми MADS белками A. thaliana, P. hybrida и D. grandiflora (дополнительно - см. табл. 3). Партнеры белков подсемейства SEP выстроены в линии в соответствии с принадлежностью к определенному MADS подсемейству (см. дендрограмму на рис. 1). Прерывистой линией обозначены предполагаемые взаимодействия. В - взаимодействия MADS белков В группы друг с другом и белками API /FUL подсемейства (формирование третичных комплексов). С - третичные комплексы, образуемые с участием MADS белков В-, С- и E-активностей. D -формирование «квартетов» с участием MADS белков В-, С- и Е-активностей.

Гомологи FUL и SOC1 P. hybrida взаимодействуют друг с другом избирательно (рис. 8). Из возможных двенадцати гетеродимеров «гомолог SOC1/ гомолог FUL» формируются восемь, а из шести возможных гетеродимеров «гомолог FUL/ гомолог FUL» - один.

Существование в Р. hybrida нескольких гомологов SOC1 и FUL позволяет предположить аналогичное наличие в хризантеме паралогов CDM8, CDM41 и CDM36, и, как следствие, избирательный паттерн белок-белковых взаимодействий. С другой стороны, мы не проверяли возможность взаимодействия CDM8 и CDM41 с неполным белком CDM36 (без MADS и I областей). Поэтому мы допускаем, что димеризация происходит (как в случае CDM111/CDM36). Гомологи FUL Р. hybrida избирательно взаимодействуют с FBP2 и другими MADS белками подсемейства SEP Р. hybrida (табл. 3, рис. 8). В нашем случае и CDM8, и CDM41 димеризуются с CDM44 при комнатной температуре. Картина взаимодействий CDM8 и CDM41 в итоге противоречива: она похожа на паттерн взаимодействий гомологов как FUL, так и API. Принимая во внимание результаты сравнительного и филогенетического анализов, мы считаем, что оба фактора являются гомологами FUL и продуктами паралогичных генов.

Партнерами CDM44, кроме CDM8, CDM41 и CDM111, являются CDM86 и CDM19 - при комнатной температуре, и CDM37 - при комнатной температуре и 30" С (CDM19 и CDM115 выделены одновременно в результате скрининга кДНК библиотеки в GAL4 системе при комнатной температуре с CDM86 в качестве «наживки», табл. 1). Полноразмерные белки CDM44 и CDM36 в GAL4 системе не димеризуются. Мы не анализировали взаимодействие CDM44 с неполным белком CDM36. Возможно, in vivo гетеродимер образуется (подобно CDM111/CDM36), что соответствовало бы факту димеризации всех гомологов SEP3 с гомологами SOC1 в Р. hybrida, а также SEP3 с гомологами SOC1 из Р. hybrida (табл. 3). Добавим, что неполный белок CDM36 димеризуется в GAL4 системе с CDM37, чему нет аналогов в Р. hybrida.

Рис. 8.

Схематическое изображение взаимодействий MADS белков подсемейства FUL с MADS белками подсемейств SEP и SOC1 {P. hybrida. A. thaliana и D. grandiflora). Сплошная линия -

реальное взаимодействие белков в GAL4 или CytoTrap дрожжевых системах. Прерывистая линия - возможное взаимодействие.

Поскольку гены подсемейства SEP имеют общего эволюционного предшественника (Munster et al., 1997), свойства их более консервативны,

нежели свойства гомологов API. Поэтому мы позволили себе продолжить аналогии между CDM44, FBP2 и SEP3. Во-первых, подобно FBP2 и SEP3, CDM44 может гомодимеризоваться (из-за активаторных свойств CDM44 в GAL4 системе мы этого не проверили). Во-вторых, CDM44 может взаимодействовать с белками D активности (нам неизвестны D гены из D. grandiflora). В-третьих, опираясь на факт существования димеров CDM44/CDM111 и SEP3/AP1, мы можем рассуждать о взаимодействии FBP2 с еще неизвестным пока гомологом API Р. hybrida.

Таблица 4. Анализ взаимодействия CDM и FBP белков в модифицированной двухгибридной GAL4 дрожжевой системе. RT - 22 С. -LTA, -LTH + 10 мМ ЗАТ -селективные среды. pBD, pAD, pRED - плазмиды, использованные при анализе. «++» -сильное взаимодействие (сильный рост культуры на селективной среде), «+» - слабое взаимодействие (слабый рост культуры на селективной среде), «-» - отсутствие взаимодействия._

Комплекс, его составляющие -LTA RT -LTH, 10 mM 3AT, RT -LTA 30°C -LTH, ЮмМЗАТ, ЗО^С

pBD -pMADSl + pRED -FBP! + pAD-FBP2 ++ ++ ++ ++

pBD-pMADSl + pRED-FBP1 + pAD-API + +

pBD-pMADSl + pKED-FBPl + pAD-CDM44 ++ ++ ++ ++

X>BD-pMADSl + P&ED-FBP3 + pAD-FBP2 ++ ++ ++ ++

pBO-pMADS1 + pKED-FBP3 + pAD-API + + + +

pBD-pMADSl + pRED-FBP3 + pKD-CDM44 ++ ++ ++ ++

pBD-CDM86 + pRBD-CDUIlS + pAD-CDMS ++ ++ - -

pBD-CDMÍÍ + pRED-CDAfl 15 + pXD-CDM41 ++ ++ - -

pBD-CDM86 + pKED-CDMl 15 + pKD-CDMlll 4+ ++ - -

pBD-CDMSÓ + pRED-OW/15 + pAD-CDM44 ++ ++ ++ ++

pBD-CDM86 + pRED-CDM/15 + pAD-FBP2 ++ ++ ++ ++

PBD-CDM86 + pRED-CDMUS + pAD-API + + - -

PBD-CDM86 + pRED-CDM19 + pKD-CDM8 - - - -

PBD-CDM86 + PRED-CDM19 + pAD-CDM4¡ - - -

pBb-CDM86 + pKED-CDM/9 + pAD-CDMlll - - - -

pBD-CDM86+pSED-CDMJ9 + pAD-CDM44 ++ ++ ++ ++

pBD-CDM86 + pRED-CDAflP + pKD-FBP2 ++ ++ ++ ++

pBD-CDM86 + pKED-CDM19 + pAD-API - - - -

pBD-CDM86 + pRED-СШ/15 + pAD-CDM37 ++ ++ - -

pBD-CDM86+pRED-CZW/9 + pAD-CDM3 7 - - - -

Определив схему двухгибридных взаимодействий CDM белков, мы решили проверить возможность формирования третичных комплексов CDM111 (CDM8, CDM41, CDM44) с гетеродимером белков активности В. С этой целью кДНК библиотеку проанализировали при 22° С в модифицированной GAL4 системе с CDM86/CDM115 в качестве «наживки». В результате были обнаружены девять неполных кДНК двух видов гомологов SEP1.2 и пять неполных кДНК CDM44. Гомологи API выделены не были. Мы проверили возможность взаимодействия гетеродимеров белков В-активности хризантемы и петунии с полноразмерными CDM111, CDM8, CDM41, CDM44, FBP2 и API. В результате (рис. 7, табл. 4) обнаружили, что при 22' С и 30' С образуются комплексы CDM86/CDM115/CDM44(FBP2), CDM86/CDM19/CDM44(FBP2), pMADSl/FBPl/CDM44(FBP2) и

pMADS 1 /FBP3/CDM44(FBP2). Только гетеродимер CDM86/CDM115 взаимодействовал с API, CDM111, CDM8 и CDM41 и только при 22° С.

Способность FBP2 и CDM44 формировать третичные комплексы с гетеродимерами белков В-типа петунии и хризантемы подтверждает их функциональное сходство. Следуя литературным данным о формировании «квартета» AG/SEP3/AP3/PI, мы проверили возможность образования комплексов pMADS 1/FBP3/FBP2/FBP6, pMADS 1 /FBP1/FBP2/FBP14, pMADS 1 /FBP3/FBP2/FBP14, pMADSl/FBPl/FBP2/FBP6 (рис. 7, табл. 5). Два из них действительно формируются в GAL4 системе: pMADSl/FBPl/FBP2/FBP14 и pMADS 1/FBP3/FBP2/FBP6. К сожалению, проверить возможность образования «квартетов»

CDM86/CDM19(115)/CDM37/CDM44 мы не смогли, так как CDM37 уже сам взаимодействует с гетеродимером В-белков хризантемы.

Таблица 5. Анализ взаимодействия FBP бежов в модифицированной двухгибридной GAL4 дрожжевой системе. Образование «квартетов». FBP3 = pMADS2; FBP14 = pMADS3. pBD, pAD, pRED, pTFTl - плазмиды, использованные при анализе. «++» - сильное взаимодействие (сильный рост культуры на селективной среде), «+» - слабое взаимодействие (слабый рост культуры на селективной среде), «-» - отсутствие взаимодействия._

Комплекс, его составляющие Селективная среда -LTH ЮшМЗАТ, RT

pTFTl-pMADSl + pAD-FBPl + pRED-FBP2AC + pBD-FBP6 -

pTFTl-pMADSl + pAD-FBPl + pRED-FBP2AC + pBD-pMADS3 ++

pTFTl-pMADSl + pAD-pMADS2 + pRED-FBP2AC + pBD-FBP6 +

pTFTl-pMADSl + pAD-pMADS2 + pRED-FBP2AC + pBD-pMADS3 -

pBD-pMADSl +pRED-FBPl +pAD-FBP6 -

pBD-pMADSl + pRED-FBPl + pAD-pMADS3 -

pBD-pMADSl + pRED-pMADS2 + pAD-FBP6 -

pBD-pMADSl + pRED-pMADS2 + pAD-pMADS3 -

Определенный нами паттерн взаимодействий CDM белков полностью коррелирует с литературными данными о том, что MADS белки регулируют транскрипцию генов-мишеней в составе мультимерных комплексов с другими MADS белками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кратко суммируя проделанную работу, отметим, что нами впервые получена кДНК библиотека на основе мРНК соцветий хризантемы и выделены кДНК копии одиннадцати CDM генов, кодирующих MADS факторы транскрипции. Проведен сравнительный филогенетический анализ CDM генов с уже известными MADS генами покрытосеменных растений. Определены паттерны экспрессии четырех CDM генов. Семейство CDM белков охарактеризовано на предмет белок-белковых взаимодействий с помощью модифицированной GAL4 системы. Паттерн таких взаимодействий в сочетании с данными перекрестного анализа белок-белковых взаимодействий растительных MADS белков разного происхождения еще раз подтвердили межвидовую консервативность происходящих в растении процессов (модели ABCDE и «квартет»). Один из CDM генов - CDM111 -бьи функционально охарактеризован посредством трансгенеза растений А. thaliana. Результаты свидетельствуют о функциональном сходстве этого гена и охарактеризованных генов гомологов других покрытосеменных растений и, следовательно, о консервативности процессов развития соцветия и цветка. Это позволило провести аналогии между функционально охарактеризованным нами геном FBP2 и гомологичным ему геном хризантемы CDM44, а именно - предположить, что CDM44, подобно FBP2, проявляет свойства Е-активности в развитии цветка.

Детально проанализировав полученные нами результаты и учтя существующие модели развития цветка (ABODE и «квартет») и огромную базу соответствующих генетических и молекулярно-биологических данных, мы постарались нарисовать картину развития соцветия и отдельного цветка хризантемы (рис. 51). Переход к цветению растения хризантемы, по всей вероятности, сопровождается активацией неизвестного пока генов-ортологов LFY и других известных «генов времени цветения». В частности, немаловажную роль в данном процессе должен играть ген CDM36 - в качестве ключевого участника сигнального фотопериод-зависимого пути инициации цветения. На стадии образования цветковых меристем активируется экспрессия всех четырех детально исследуемых нами генов -CDM8, CDM41, CDM44 и CDM111. Совокупность паттернов экспрессии этих генов, паттернов белок-белковых взаимодействий продуктов этих генов и результатов анализа соответствующих трансгенных растений позволяет предположить, что идентичность лепестков трубчатых и язычковых цветков хризантемы определяет транскрипционный квартет

CDM44/CDM86/CDM115/CDM111, идентичность тычинок трубчатых цветков хризантемы определяет комплекс CDM44/CDM86/CDM115/CDM37, а идентичность плодолистиков трубчатых и язычковых цветков - квартет CDM44/CDM44/CDM37/CDM37. Паралог CDM115 - CDM19 - может заменять CDM115 в указанных комплексах, что происходит, видимо, при смене неких условий роста и цветения хризантемы (например, температурного режима). Вероятно также, что CDM77 (гомолог генов SEP1/SEP2) является членом Е-группы хризантемы и работает в одной «упряжке» с CDM44 и другими неизвестными пока членами SEP семейства

хризантемы. Паралогичные гены CDM8 и CDM41, по аналогии с известными гомологами гена FUL, могут оказывать немалое влияние на развитие плодолистиков цветков хризантемы, что происходит в составе, к сожалению, пока неизвестных нам белковых комплексов и, возможно, задействует дополнительные и неизвестные, опять же, гены, гомологичные описываемым.

Рис. 9. Мультимерные комплексы СОМ белков определяют идентичность цветковых структур: лепестков -

ОЭМ44/СОМ86/СОМ115/СОМ111, тычинок-

СОМ44/СОМ86/СОМ115/СОМ37, плодолистиков -СОМ44/СОМ44/СОМ37/СОМ37. Не ясна функциональная роль комплексов СТ>М44/СОМ8б/СОМ115/СОМ8(СОМ41).

Полученные нами результаты могут быть применены на практике. Имея в своем распоряжении гомеозисные гены, можно использовать их для получения новых декоративных сортов хризантемы (гомологичная экспрессия генов) или других видов растений (гетерологичная экспрессия генов), поскольку конститутивная экспрессия таких генов может привести к изменениям морфогенеза растений. Например, выключение СОМ44 и СйМ37 могло бы привести каждый трубчатый цветок соцветия хризантемы к паттерну развития «цветок в цветке». В случае СОМ44 такие цветки состояли бы из органов, подобных чашелистикам, и в случае СОМ37 - из лепестков. А совместная конститутивная экспрессия СБМ44 и генов В-активности могла бы изменить морфологию стеблевых листьев, сделав их похожими на лепестки.

Данное исследование имеет также большое фундаментальное значение, является вкладом в исследования морфогенеза соцветия и цветка, в частности, его эволюционных аспектов, и свидетельствует о межвидовой консервативности данного процесса.

выводы

1. Впервые нами получена кДНК библиотека, содержащая кДНК генов, экспрессирующихся в соцветии хризантемы Dendrathema grandiflora cv. Parliament на ранней стадии развития соцветия.

2. Впервые нами выделены полноразмерные кДНК одиннадцати CDM (Chrysanthemum Dendrathema grandiflora MADS) генов хризантемы, кодирующих факторы транскрипции MADS семейства. Проведен филогенетический анализ и определена принадлежность CDM генов к различным структурно-функциональным подсемействам MADS семейства.

3. Установлено, что CDM111 является ортологом APETALA1 (АР1, ген А-активности Arabidopsis thaliana, участвует в определении идентичности цветковой меристемы и околоцветника), обладает частичной функциональной гомологией с FRUITFUL (FUL, ген идентичности цветковой меристемы, плодолистиков и стручочков Arabidopsis thaliana) и может принимать участие в определении идентичности цветковых меристем, лепестков и плодолистиков хризантемы.

4. Показано, что CDM44 является ортологом SEPALLATA3 (SEP3, ген Е-активности, участвует в определении идентичности лепестков, тычинок, плодолистиков и семязачатков Arabidopsis thaliana) и участвует в определении идентичности лепестков, тычинок, плодолистиков и семязачатков цветков хризантемы, действуя в составе мультимерных комплексов с белками A-, В-, С- и D-активностей (так называемая ABCDE модель постулирует существование A-, B-, C-, D-и Е-активностей, в разных комбинациях определяющим идентичность органов цветка).

5. Продемонстрировано, что CDM41 и CDM8 являются продуктами паралогичных генов и гомологами FUL.

6. Показано, что CDM белки работают в составе мультимерных белковых комплексов, что свидетельствует в пользу консервативности так называемой модели «квартет» (модель полагает, что MADS белки регулируют транскрипцию генов-мишеней в составе тетрамеров).

Список публикаций.

1. Щенникова А.В., Шульга О.А., Ангенент Г.К., Скрябин К.Г. (2003) О генетической регуляции развития соцветия хризантемы. Доклады Академии Наук, т. 391, № 5, стр. 1-3.

2. Ferrario S., Immink R.G.H., Shchennikova A., Busscher-Lange J., Angenent G.C. (2003) The MADS box gene FBP2 is required for the SEPALLATA function in petunia. Plant Cell J. Vol. 15, no. 4, pp. 914-925.

3. Shulga 0., Shchennikova A., Sizeneva E., Skryabin K., Angenent G. (2003) Characterizarion of organ identity MADS-box genes from Asteraceae. Abstract S20-59. - 7th International Congress of Plant Molecular Biology, 23-28th June, Barcelona, Spain.

4. Angenent G., Ferrario S., Shchennikova A., Immink R. (2003) MADS-box transcription factor complexes in Petunia and Arabidopsis. Abstract S20-71. -7th International Congress of Plant Molecular Biology, 23-28th June, Barcelona, Spain.

5. Shulga O.A., Shchennikova A.V., Skryabin K.G., Angenent G.C. (2002) MADS-box genes involved in inflorescence development in Asteraceae. Abstract (poster P-1297). The International Association for Plant Tissue Culture and Biotechnology - 10th IAPTC&B Congress. Plant Biotechnology 2002 and Beyond, p. 108-A, June 23-28, Orlando, USA.

6. Immink R.G.H., Ferrario S., Shchennikova A., Busscher M., Angenent G. (2002) Identification of MADS-box transcription factor functions based on protein-protein interactions. Abstract. 14th Penn State Symposium "Plant Reproduction 2002: From evolutionary and physiological analyses to molecular and genetic studies". May 16-18, USA.

7. Сизенева E.C., Щенникова A.B., Шульга О.А., Скрябин К.Г. (2000) Молекулярный контроль развития соцветия сложноцветных. Материалы конференции «Горизонты физико-химической биологии». Пущино, Россия, стр.128.

8. Bagyan I.L., Gulina I.V., Kraev A.S., Mironov V.N., Padegimas L.V., Pooggin M.M., Revenkova E.V., Shchennikova A.V., Shoulga O.A., Sokolova M.A., Vicente-Carbajosa J., Yakovleva G.A., Skryabin K.G. (1996) Plant Gene Technology. Genome Structure and Function. From Chromosomes Characterization to Genes Technology. Edited by Claudio Nicolini. High technology. Vol. 31. Pp.279-318.

9. Skryabin K.G., Bagyan I.L., Konov A.L., Kraev A.S., Padegimas L., Pooggin M.M., Pozmogova G.E., Revenkova E.V., Shchennikova A.V., Shulga O.A., Sokolova M.A. (1994) Production of transgenic plants and optimization of transgenic expression. Abstract. International Symposium "Plant Biotechnology and Genetic Engineering", Ukraine, Kiev, p.36.

lO.Skryabin K.G., Bagyan I.L., Gulina I.V., Kraev A.S., Padegimas L., Pooggin M.M., Pozmogova G.E., Revenkova E.V., Shchennikova A.V., Shulga O.A., Sokolova M.A. (1994) Production of transgenic plants resistant to viruses, insects and gerbicides: optimization of heterologous gene expression. Abstract. 10th Anniversary Otto Warburg Symposium "Molecular Biology and Plant breeding: Theoretical, Practical and Legal Aspects", March 21-22.

Р1653 3 ^

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД №00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 20.08.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ 395. Тел. 939-3890, 928-2227,928-1042. Факс 939-3891. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Щенникова, Анна Владимировна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ РАСТЕНИЯ. ИНИЦИАЦИЯ ЦВЕТЕНИЯ.

1.1.1. Цветковое разнообразие. Цветок A. thaliana и основные стадии его развития. Клеточная дифференциация.

1.1.2. Переход растения к репродуктивной стадии развития.

1.2. ABCDE МОДЕЛЬ ФОРМИРОВАНИЯ ЦВЕТКА.

1.3. ФАКТОРЫ ТРАНСКРИПЦИИ РАСТЕНИЙ. MADS СЕМЕЙСТВО.

1.4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАЗВИТИЯ ЦВЕТКА.

1.4.1. Генетическая регуляция формирования и развития меристемы побега А. thaliana.

1.4.2. Определение идентичности цветковой меристемы.

1.4.3. Околоцветник.

1.4.4. В активность. Лепестки и тычинки.

1.4.5. С активность. Гинецей.

1.4.6. D активность. Развитие семязачатка.

4 1.4.7. Е активность. Модель «квартет» развития цветка.

1.5. ABCDE МОДЕЛЬ И ДРУГИЕ ВИДЫ ЦВЕТКОВЫХ РАСТЕНИЙ.

1.6. ГЕНЕТИКА ЭВОЛЮЦИИ МОРФОЛОГИИ РАСТЕНИЙ.

1.7. СЛОЖНОЦВЕТНЫЕ.

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

П. 1. Бактериальные и дрожжевые штаммы. Растения.

П.2. Выделение суммарной РНК из ткани соцветий и цветков хризантемы.

П.З. кДНК библиотека из соцветий хризантемы.

П.4. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli и A. tumefaciens.

П.5. Секвенирование. Сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями из банка данных.

4, П.6. In situ гибридизация тканей соцветия хризантемы со специфичными пробами.

П.7. Получение кассет экспрессии MADS генов хризантемы и петунии.

П.8. Получение агробактериального штамма с бинарным вектором и трансформация им растений.

П.9. Выделение геномной ДНК из растительной ткани.

П. 10. Трансформация дрожжевого штамма Pj69-4a плазмидной ДНК и анализ кДНК библиотеки и MADS белков хризантемы и петунии в дрожжевой GAL системе.

П. 11. Выделение плазмидной ДНК из дрожжевых колоний и трансформация ею Е.

1 coli.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование и характеристика генов, отвечающих за формирование соцветия представителя сложноцветных - хризантемы"

Растение в стремлении к воспроизводству проходит две стадии - вегетативную и репродуктивную. В попытках понять механизмы перехода от одной стадии к другой и непосредственно самого процесса цветения исследователи бьются не один год.

Усилия физиологов увенчались созданием многофакторной модели, учитывающей комбинированное влияние условий окружающей среды, гормонов и микроэлементов на индукцию цветения.

Молекулярные биологи и генетики рассматривают развитие соцветия и цветка высших цветковых растений как высоко консервативный процесс, который определяется сетью регуляторных генов, организованных иерархическим образом. В основании иерархии находятся гены раннего и позднего цветения. Они переключают развитие растения с вегетативной на репродуктивную фазу и активируют гены идентичности меристемы, инициируя с их помощью образование цветковых меристем. Далее в дело вступают гены-посредники, пробуждая к жизни гены идентичности цветковых органов. Области активности последних ограничивает группа кадастральных генов; в результате происходит дифференцировка кругов цветковых органов.

Молекулярно-биологические исследования показали, что большинство вышеперечисленных генов кодируют факторы транскрипции. Нарушения их экспрессии, как правило, вызывают существенные изменения в растении. Поэтому в практическом плане инженерия генов факторов транскрипции предоставляет массу возможностей для использования модифицированных растений в сельском хозяйстве, садоводстве и пр. Успех при этом зависит от того, насколько хорошо понята функциональная роль соответствующих генов.

Что касается фундаментального значения исследований факторов транскрипции растений, то оно достаточно многогранно. Это не только проникновение в молекулярные тайны развития цветка, но и возможность более глубокого понимания эволюции растительных форм.

В последние годы существенный прогресс достигнут в изучении молекулярно-генетических механизмов процесса формирования и развития цветка двух модельных двудольных растений — Arabidopsis thaliana (A. thaliana) и Antirrhinum majus (A. majus, львиный зев,). Обнаружение и функциональный анализ гомологов известных и охарактеризованных генов модельных растений способствуют исследованиям развития цветка других видов растений.

Целью данной работы является изучение молекулярного контроля формирования соцветия представителя семейства сложноцветных (Compositae) - хризантемы Dendrathema grandiflora cv. Parliament.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ КОНТРОЛЬ ФОРМИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ ЦВЕТКА

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Щенникова, Анна Владимировна

ВЫВОДЫ

3. Установлено, что CDM111 является ортологом APETALA1 (API, ген А— активности Arabidopsis thaliana, участвует в определении идентичности цветковой меристемы и околоцветника), обладает частичной функциональной гомологией с FRUITFUL (FUL, ген идентичности цветковой меристемы, плодолистиков и стручочков Arabidopsis thaliana) и может принимать участие в определении идентичности цветковых меристем, лепестков и плодолистиков хризантемы.

4. Показано, что CDM44 является ортологом SEPALLATA3 (SEP3, ген Е-активности, участвует в определении идентичности лепестков, тычинок, плодолистиков и семязачатков Arabidopsis thaliana) и участвует в определении идентичности лепестков, тычинок, плодолистиков и семязачатков цветков хризантемы, действуя в составе мультимерных комплексов с белками А-, В-, С- и D-активностей (так называемая ABCDE модель постулирует существование А-, В-, С-, D- и Е-активностей, в разных комбинациях определяющим идентичность органов цветка).

5. Продемонстрировано, что CDM41 и CDM8 являются продуктами паралогичных генов и гомологами FUL.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я искренне признательна:

- своим научным руководителям - заведующему лабораторией, академику РАСХН Скрябину Константину Георгиевичу и к.х.н. Шульге Ольге Альбертовне - за чуткое и грамотное руководство;

- сотрудникам лаборатории "Plant Architecture" (Plant Research International, Wageningen, the Netherlands) Silvia Ferrario, Richard Immink, John Franken и Gerco Angenent - за полезные дискуссии, всестороннюю помощь в освоении новых методик и неоценимое дружеское участие;

- моим замечательным коллегам в Центре «Биоинженерия» РАН - за моральную поддержку;

- правительственным организациям Нидерландов NWO и IAC - без чьих грантов этот проект не состоялся бы; моему мужу - потому что он хороший, без его решимости и терпения ничего бы и не было на этом месте;

- лично Ольге Шульге - именно она заставила родиться эту работу, невзирая на бури и шторма!

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кратко суммируя проделанную работу, отметим, что нами впервые получена кДНК библиотека на основе мРНК соцветий хризантемы и выделены кДНК копии одиннадцати CDM генов, кодирующих MADS факторы транскрипции. Проведен сравнительный филогенетический анализ CDM генов с уже известными MADS генами покрытосеменных растений. Определены паттерны экспрессии четырех CDM генов. Семейство выделенных CDM белков охарактеризовано на предмет белок-белковых взаимодействий с помощью модифицированной GAL4 системы. Паттерн таких взаимодействий в сочетании с данными перекрестного анализа белок-белковых взаимодействий растительных MADS белков разного происхождения еще раз подтвердили межвидовую консервативность происходящих в растении процессов (модели ABCDE и «квартет»). Один из CDM генов -CDM111 - был функционально охарактеризован посредством трансгенеза растений А. thaliana. Результаты свидетельствуют о функциональном сходстве этого гена и охарактеризованных генов гомологов других покрытосеменных растений и, следовательно, о консервативности процессов развития соцветия и цветка. Это позволило провести аналогии между функционально охарактеризованным нами геном FBP2 и гомологичным ему геном хризантемы CDM44, а именно - предположить, что CDM44, подобно FBP2, проявляет свойства Е-активности в развитии цветка.

Детально проанализировав полученные нами результаты и учтя существующие модели развития цветка (ABCDE и «квартет») и огромную базу соответствующих генетических и молекулярно-биологических данных, мы постарались нарисовать картину развития соцветия и отдельного цветка хризантемы (рис. 51). Переход к цветению растения хризантемы, по всей вероятности, сопровождается активацией неизвестного пока генов-ортологов LFY и других известных «генов времени цветения». В частности, немаловажную роль в данном процессе должен играть ген CDM36 - в качестве ключевого участника сигнального фотопериод-зависимого пути инициации цветения. На стадии образования цветковых меристем активируется экспрессия всех четырех детально исследуемых нами генов - CDM8, CDM41, CDM44 и CDM111. Совокупность паттернов экспрессии этих генов, паттернов белок-белковых взаимодействий продуктов этих генов и результатов анализа соответствующих трансгенных растений позволяет предположить, что идентичность лепестков трубчатых и язычковых цветков хризантемы определяет транскрипционный квартет CDM44/CDM86/CDM115/CDM111, идентичность тычинок трубчатых цветков хризантемы определяет комплекс CDM44/CDM86/CDM115/CDM37, а идентичность плодолистиков трубчатых и язычковых цветков — квартет

CDM44/CDM44/CDM37/CDM37. Паралог CDM115 - CDM 19 - может заменять CDM115 в указанных комплексах, что происходит, видимо, при смене неких условий роста и цветения хризантемы (например, температурного режима). Вероятно также, что CDM77 (гомолог генов SEP1/SEP2) является членом Е-группы хризантемы и работает в одной «упряжке» с CDM44 и другими неизвестными пока членами SEP семейства хризантемы. Паралогичные гены CDM8 и CDM41, по аналогии с известными гомологами гена FUL, могут оказывать немалое влияние на развитие плодолистиков цветков хризантемы, что происходит в составе, к сожалению, пока неизвестных нам белковых комплексов и, возможно, задействует дополнительные и неизвестные, опять же, гены, гомологичные описываемым.

Рис. 51. Мультимерные комплексы CDM белков определяют идентичность цветковых структур (смотри пояснения в тексте): лепестков - CDM44/CDM86/CDM115/CDM111, тычинок - CDM44/CDM86/CDM115/CDM37, плодолистиков - CDM44/CDM44/CDM37/CDM37. Функциональная роль комплексов

CDM44/CDM86/CDM115/CDM8(CDM41) не ясна. ?

Полученные нами результаты могут быть применены на практике. Имея в своем распоряжении гомеозисные гены, можно использовать их для получения новых декоративных сортов хризантемы (гомологичная экспрессия генов) или других видов растений (гетерологичная экспрессия генов), поскольку конститутивная экспрессия таких генов может привести к изменениям морфогенеза растений. Например, выключение CDM44 и CDM37 могло бы привести каждый трубчатый цветок соцветия хризантемы к паттерну развития «цветок в цветке». В случае CDM44 такие цветки состояли бы из органов, подобных чашелистикам, и в случае CDM37 — из лепестков. А совместная конститутивная экспрессия CDM44 и генов В-активности могла бы изменить морфологию стеблевых листьев, сделав их похожими на лепестки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Щенникова, Анна Владимировна, Москва

1. Д. Гловер. Клонирование ДНК. Методы. Москва «Мир» (1988) IRL Press, Oxford

2. Под редакцией акад. А.Л. Тахтаджяна Г.П. Яковлев, В.А. Челомбитько Ботаника. Москва «Высшая школа» (1990) Под редакцией И.В. Грушвицкого

3. Angenent G.C., Busscher M., Franken J., Mol J.N.M., van Tunen A.J. (1992) Differential expression of two MADS box genes in wild-type and mutant petunia flowers. The Plant Cell 4:983-993

4. Angenent G.C., Franken J., Busscher M., Colombo L., van Tunen A.J. (1993) Petal and stamen formation in petunia is regulated by the homeotic gene fbpl. The Plant J 4(1):101-112

5. Angenent G.C., Franken J., Busscher M., Weiss D., van Tunen A.J. (1994) Co-suppression of the petunia homeotic gene /bp 2 affects the identity of the generative meristem. The Plant J 5:233-244

6. MADS box genes is involved in ovule development in petunia. The Plant Cell 7:1569-1582 Angenent G.C., Colombo L. (1996) Molecular control of ovule development. Trends Plant Sci 1:228-232

7. Benfey P.N., Weigel D. (2001) Transcriptional networks controlling plant development. J Plant Physiology 125:109-111

8. Bernier G., Havelange A., Houssa C., Petitjean A., Lejeune P. (1993) Physiological signals thatinduce flowering. The Plant Cell 5:1147-1155 Bewan M.W. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucl Acids Res 12:8711-8721

9. Bisseling T. (1999) The role of plant peptides in intercellular signaling. Curr Opin In Plant Biol 2:365-368

10. Bossinger G., Smyth D. (1996) Initiation patterns of flower and floral organ development in

11. Arabidopsis thaliana. Development 122:1093-1102 Bowman J.L., Smyth D.R., Meyerowitz E.M. (1989) Genes directing flower development in

12. Plant Physiol 47:393-399 Burn J.E., Smyth D.R., Peacock W.J., Dennis E.S. (1993) Genes conferring late flowering in

13. Arabidopsis thaliana. Genetica 90:147-155 Busch M.A., Bomblies K., Weigel D. (1999) Activation of floral homeotic gene in Arabidopsis. Science 285:585-587

14. Byrne M.E., Barley R., Curtis M., Arroyo J.M., Dunham M., Hudson A., Martienssen R.A. (2000) Asymmetric leaves 1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature 408:967-971

15. Cardon G.H., Hohmann S., Nettesheim K., Saedler H., Huijser P. (1997) Functional analysis of the Arabidopsis thaliana SBP-box gene SPL3: a novel gene involved in the floral transition. The Plant J 12:367-377

16. Carpenter R., Coen E.S. (1990) Floral homeotic mutations produced by transposon-mutagenesisin Antirrhinum majus. Genes Dev 4:1483-1493 Carre I.A. (1996) Genetic analysis of the photoperiodic clock in Arabidopsis. Flowering Newsletter 22:20-24

17. Carre I.A. (2002) ELF3: a circadian safeguard to buffer effects of light. Trends in Plant Science 7(1):46

18. Chung Y.-Y., Kim S.-R., Kang H.-G., Noh Y.-S., Park M.C., Finkel D., An G. (1995) Characterization of two rice MADS box genes homologous to GLOBOSA. Plant Science 109:45-56

19. Conner J., Liu Z. (2000) LEUNIG, a putative transcriptional corepressor that regulates

20. AGAMOUS expression during flower development. PNAS 97(23):12902-12907 Coupland G. (1995) Genetic and environmental control of flowering time in Arabidopsis. Trends Genet 11:393-397

21. Deyholos M.K., Sieburth L.E. (2000) Separable whorl-specific expression and negative regulation by enhancer elements within the AGAMOUS second intron. The Plant Cell 12:1799-1810

22. Doebley J., Lukens L. (1998) Transcriptional regulators and the evolution of plant form. The Plant Cell 10:1075-1082

23. Ezhova T.A., Penin A.A. (2001) A new BRACTEA (BRA) gene controlling the formation of an indeterminate bractless inflorescence in Arabidopsis thaliana. Russian J of Genetics 37(7):935-938

24. Fan H.Y., Hu Y, Tudor M., Ma H. (1997) Specific interactions between the К domains of AG and AGLs, members of the MADS domain family of DNA binding proteins. The Plant J 12:999-1010

25. Ferrandiz С., Liljegren S.J., Yanofsky M.F. (2000a) Negative regulation of the SHATTERPROOF genes by FRUITFULL during Arabidopsis fruit development. Science 289:436-438

26. Ferrandiz C., Gu Q., Martienssen R., Yanofsky M.F. (2000b) Redundant regulation of meristem identity and plant architecture by FRUITFULL, APETALA1 and CAULIFLOWER. Development 127:725-734

27. Ferrario S., Immink R.G.H., Shchennikova A., Busscher-Lange J., Angenent G.C. (2003) The MADS box gene FBP2 is required for the SEPALLATA function in petunia. Plant Cell 15(4);914-925

28. Finkelstein R., Somerville C. (1990) Three classes of abscisic acid (ABA)-insensitive mutations of Arabidopsis define genes that control overlapping subsets of ABA responses. J Plant Physiol 94:1172-1179

29. Finkelstein R.R., Wang M.L., Lynch T.J., Rao S., Goodman H.M. (1998) The Arabidopsis abscisic acid response locus ABI4 encodes an APETALA2 domain protein. The Plant Cell 10:1043-1054

30. Finkelstein R.R., Lynch T.J. (2000) The Arabidopsis abscisic acid response gene ABI5 encodes a basic leucine zipper transcription factor. The Plant Cell 12:599-609

31. Fischer A., Baum N., Saedler H., Theissen G. (1995) Chromosomal mapping of the MADS-box multigene family in Zea mays reveals dispersed distribution of allelic genes as well as transposed copies. Nucl Acids Res 23:1901-1911

32. Flanagan C.A., Hu Y., Ma H. (1996) Specific expression of the AGL1 MADS-box gene suggests regulatory functions in Arabidopsis gynoecium and ovule development. The Plant J 10:343353

33. Fletcher J.C., Brand U., Running M.P., Simon R., Meyerowitz E.M. (1999) Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science 283:1911-1914

34. Fletcher J.C. (2002) Shoot and Floral meristem maintenance in Arabidopsis. Annu. Rev. Plant Biol. 53:4566

35. Fujime Y, Fujime Y., Okuda N. (1996) Morphological observations on capitulum initiation and floret development of Garland Chrysanthemum (Chrysanthemum coronarium L.). J Japan Soc Hort Sci 64(4):867-874

36. Furner I J., Ainscough I.F.-X., Pumfrey J. A., Petty L.M. (1996) Clonal analysis of the late flowering fca mutant of Arabidopsis thaliana: cell fate and cell autonomy. Development 122:1041-1050

37. Gaiser J.C., Robinson-Beers K., Gasser C.S. (1995) The Arabidopsis SUPERMAN Arabidopsis SUPERMAN gene mediates asymmetric growth of the outer integument of ovules. The Plant Cell 7:333-345

38. Gasser C.S. (1996) Homeodomains ring a BELL in plant development. Trends Plant Sci 1:134136

39. Gasser C.S., Broadhvest J., Hauser B.A. (1998) Genetic analysis of ovule development. Annu

40. Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49:1-24 Goldberg R.B., Depaiva G., Yadegari R. (1994) Plant embryogenesis: Zygote to seed. Science 266:605-614

41. Gu Q., Ferrandiz C., Yanofsky M.F., Martienssen R. (1998) The FRUITFULL MADS-box gene mediates cell differentiation during Arabidopsis fruit development. Development 125:15091517

42. Heck G.R., Perry S.E., Nichols K.W., Fernandez D.E. (1995) AGL15, a MADS domain proteinexpressed in developing embryos. The Plant Cell 7:1271-1282 Helens R., Mullineaux P., Klee H. (2000) A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in

43. Hicks K.A., Millar A.J., Carre I.A., Somers D.E., Straume M., Meeks-Wagner D.R., Kay S.A. (1996) Conditional circadian dysfunction of the Arabidopsis early-flowering 3 mutant. Science 274:790-792

44. Huang H., Tudor M., Weiss C.A., Hu Y., Ma H. (1995) The Arabidopsis MADS-box gene AGL3 is widely expressed and encodes a sequence-specific DNA-binding protein. Plant Molecular Biology 28:549-567

45. Huang H., Tudor M., Su Т., Zhang Y., Hu Y., Ma H. (1996) DNA binding properties of two Arabidopsis MADS domain proteins: binding consensus and dimer formation. The Plant Cell 8:1548-1560

46. Kim G.-T., Tsukaya H., Uchimiya H. (1998) The CURLY LEAF gene controls both division and elongation of cells during the expansion of the leaf blade in Arabidopsis thaliana. Planta 206:175-183

47. Koornneef M., Alonso-Blanco C., Peeters A.J.M., Soppe W. (1998) Genetic control of flowering time in Arabidopsis. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49:345-370

48. Functional domains, evolution and regulation. Eur J Biochem 262:247-257 Liljegren S.J., Ferrandiz C., Alvarez-Buylla E.R., Pelaz S., Yanofsky M.F. (1998) Arabidopsis

49. Mandel M.A., Yanofsky M.F. (1995a) The Arabidopsis AGL8 MADS box gene is expressed in inflorescence meristems and is negatively regulated by APETALA1. The Plant Cell 7:17631771

50. Martinez E. (2002) Multi-protein complexes in eukaryotic gene transcription. Plant Mol Biol 50:925-947

51. Mayer K.F.X., Schoof H„ Haecker A., Lenhard M., Jurgens G., Laux T. (1998) Role of

52. WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem. Cell 95:805-815 McConnell J.R., Barton M.K. (1998) Leaf polarity and meristem formation in Arabidopsis.

53. McNellis T.W., von Arnim A.G., Araki Т., Komeda Y., Misera S., Deng X.-W. (1994) Genetic and molecular analysis of an allelic series of copl mutants suggests functional roles for the multiple protein domains. The Plant Cell 6:487-500

54. McSteen P.C.M., Vincent C.A., Doyle S., Carpenter R., Coen E.S. (1998) Control of floral homeotic gene expression and organ morphogenesis in Antirrhinum. Development 125:2359-2369

55. McSteen P., Hake S. (1998) Genetic control of plant development. Curr Opin In Biothechnol 9:189-195

56. Meer van der, I.M. (1999) Agrobacterium-mediated transformation of Petunia leaf disks.

57. Michaels S.D., Amasino R.M. (1999a) FLOWERING LOCUS С encodes a novel MADS-domainprotein that acts as a repressor of flowering. The Plant Cell 11:949-956 Michaels S.D., Amasino R.M. (1999b) The gibberellic acid biosynthesis mutant gal-3 of

58. Moussian В., Schoof H., Haecker A., Jurgens G., Laux T. (1998) Role of the ZWILLE gene in the regulation of central shoot meristem cell fate during Arabidopsis embryogenesis. EMBO J 17:1799-1809

59. Ng M., Yanofsky M.F. (2000) Three ways to learn the ABCs. Curr Opin In Plant Biol 3:47-52 Ng M., Yanofsky M.F. (2001) Activation of the Arabidopsis В class homeotic genes by

60. Okamuro J.K., Caster В., Villarroel R., Van Montagu M., Jofuku K.D. (1997) The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis. PNAS 94:7076-7081

61. Okamuro J.K., Szeto W., Lotys-Prass C., Jofuku K.D. (1997) Photo and hormonal control of meristem identity in the Arabidopsis flower mutants apetala2 and apetalal. The Plant Cell 9:37-47

62. Parcy F., Bomblies K., Weigel D. (2002) Interaction of LEAFY, AGAMOUS and TERMINAL FLOWER 1 is maintaining floral meristem identity in Arabidopsis. Development 129:25192527

63. Pnueli L., Hareven D., Broday L., Hurwitz C., Lifschitz E. (1994a) The TM5 MADS box gene mediates organ differentiation in the three inner whorls of tomato flowers. The Plant Cell 6:175-186

64. Pnueli L., Hareven D., Rounsley S.D., Yanofsky M.F., Lifschitz E. (1994b) Isolation of the Tomato AGAMOUS gene TAG1 and analysis of its homeotic role in transgenic plants. The Plant Cell 6:163-173

65. Ponticelli A.S., Pardee T.S., Struhl K. (1995) The glutamine-rich activation domains of human

66. Reed J.W., Nagatani A., Elich T.D., Fagan M., Chory J. (1994) Phytochrome A and phytochrome В have overlapping but distinct functions in Arabidopsis development. J Plant Physiol 104:1139-1149

67. Riechmann J.L., Meyerowitz E.M. (1998) The AP2/EREBP family of plant transcription factors. Biol Chem 379:633-646

68. Riechmann J.L., Ratcliffe O.J. (2000) A genomic perspective on plant transcription factors.

69. Rounsley S.D., Ditta G.S., Yanofsky M.F. (1995) Diverse roles for MADS box genes in

70. Sablowsky R.W.M., Meyerowitz E.M. (1998) A homo log of NO APICAL MERISTEM is animmediate target of the floral homeotic genes APETALA3/PISTILLA ТА. Cell 92:93-103 Sakai H., Medrano L.J., Meyerowitz E.M. (1995) Role of SUPERMAN in maintaining

71. Sanda S., John M., Amasino R. (1997) Analysis of flowering time in ecotypes of Arabidopsisthaliana. J Hered 88:69-72 Sanda S.L., Amasino R.M. (1996) Interaction of FLC and late-flowering mutations in Arabidopsis thaliana. Mol Gen Genet 251:69-74

72. Savidge В., Rounsley S.D., Yanofsky M.F. (1995) Temporal relationship between the transcription of two Arabidopsis MADS box genes and the floral organ identity genes. The Plant Cell 7:721-733

73. Sawa S., Watanabe K., Goto К., Kanaya E., Morita E.H., Okada K. (1999a) FILAMENTOUS FLOWER, a meristem and organ identity gene of Arabidopsis encodes a protein with a zinc finger and HMG-related domains. Genes and Development 1079-1088

74. Sawa S., Ito Т., Shimura Y., Okada K. (1999b) FILAMENTOUS FLOWER controls the formation and development of Arabidopsis inflorescence and floral meristems. The Plant Cell 11:69-86

75. Savidge В., Rounsley S.D., Yanofsky M.F. (1995) Temporal relationship between the transcription of two Arabidopsis MADS box genes and the floral organ identity genes. The Plant Cell 7:721-733

76. Schaffer R., Ramsay N., Samach A., Corden S., Putterill J., Carre I.A., Coupland G. (1998) The late elongated hypocotyl mutation of Arabidopsis disrupts circadian rhythms and the photoperiodic control of flowering. Cell 93:1219-1229

77. Schmidt R.J., Veit В., Mandel M.A., Mena M., Hake S., Yanofsky M.F. (1993) Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS. The Plant Cell 5:729-737

78. Schmitz J., Franzen R., Ngyuen Т.Н., Garcia-Maroto F., Pozzi C., Salamini F., Rohde W. (2000) Cloning, mapping and expression analysis of barley MADS-box genes. Plant Mol Biol 42:899-913

79. Schneitz K., Hulskamp M., Kopczak S., Pruitt R. (1997) Dissection of sexual organ ontogenesis: a genetic analysis of ovule development in Arabidopsis thaliana. Development 124:13671376

80. Schneitz K., Balasubramanian S., Schiefthaler U. (1998) Organogenesis in plants: the molecular and genetic control of ovule development. Trends in Plant Science 3(12):468-472

81. Schneitz K. (1999) The molecular and genetic control of ovule development. Curr Opin Plant Biol 2:13-17

82. Schranz M.E., Quijada P., Sung S.-B., Lukens L., Amasino R., Osborn T.C. (2002) Characterization and effects of the replicated flowering time gene FLC in Brassica rapa. Genetics 162:1457-1468

83. Schoof H., Lenhard M., Haecker A., Mayer K.F.X., Jurgens G., Laux T. (2000) The stem cell population of Arabidopsis shoot meristems is maintained by a regulatory loop between the CLAVATA and WUSCHEL genes. Cell 100:635-644

84. Opinion in Plant Biology 5:49-55 Shore P., Sharrocks A.D. (1995) The MADS-box family of transcription factors. Eur J Biochem 229:1-13

85. Simon R., Carpenter R., Doyle S., Coen E. (1994) FIMBRIATA controls flower development by mediating between meristem and organ identity genes. Cell 78:99-107

86. Simon R., Igeno M.I., Coupland G. (1996) Activation of floral meristem identity genes in

87. Arabidopsis. Nature 384:59-62 Simpson G.G., Gendall A.R., Dean C. (1999) When to switch to flowering. Annu. Rev. Cell Dev Biol 99:519-550

88. Smyth D.R., Bowman J.L., Meyerowitz E.M. (1990) Early flower development in Arabidopsis.

89. Stewart W.N., Rothwell G.W. (1993) Paleobotany and the evolution of plants. 2nd ed.

90. Theipen G., Saedler H. (1999) The golden decade of molecular floral development (1990-1999):

91. A cheerful obituary. Dev Genet 25:181-193 Theipen G., Saedler H. (2001) Floral quartets. Nature 409, 469-471.

92. TheiBen G. (2001) Development of floral organ identity: stories from the MADS house. Current

93. Trobner W., Ramirez L., Motte P., Hue I., Huijser P. (1992a) GLOBOSA: a homeotic gene which interacts with DEFICIENS in the control of Antirrhinum floral organogenesis. EMBO J 11:4693-4704

94. Vollbrecht E., Hake S. (1995) Deficiency analysis of female gametogenesis in maize. Dev Genet 16:44-63

95. Waites R., Hudson A. (1995) phantastica: a gene required for dorsoventrality of leaves in

96. APETALA1 by LEAFY. Science 285:582-584 Wang Z., Tobin E.M. (1998) Constitutive expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) gene disrupts circadian rhythms and suppresses its own expression. Cell 93:12071217

97. Wellmann E. (1983) UV irradiation in photomorphogenesis. In Mohr H. and Shropshire W. (eds), Encyclopedia of Plant Physiology, NS 16B. Springer-Verlag, Berlin, Germany, pp 745-756

98. Wilson R.N., Heckman J.W., Somerville C.R. (1992) Gibberellin is required for flowering in

99. Yalovsky S., Kulukian A., Rodriguez-Concepcion M., Young C.A., Gruissem W. (2000b) Functional requirement of plant famesyltransferase during development in Arabidopsis. The Plant Cell 12:1267-1278

100. Yanofsky M.F. (1995) Floral meristems to floral organs: genes controlling early events in

Информация о работе

Щенникова, Анна Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.03

Диссертация

Клонирование и характеристика генов, отвечающих за формирование соцветия представителя сложноцветных - хризантемы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы