Разработка методологии идентификации функции генов Arabidopsis thaliana

Огаркова, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методологии идентификации функции генов Arabidopsis thaliana
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка методологии идентификации функции генов Arabidopsis thaliana"

___пРаеахрукописи

ОГАРКОВА Ольга Александровна

Разработка методологии идентификации функции генов АгаЫйоряк ЛаНапа.

Специальность 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

1 6 ОНТ 2008

003448337

Работа выполнена в лаборатории изменчивости генома Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской Академии Наук Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Бурьянов Ярослав Иванович Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН Доктор биологических наук, профессор Пухальский Виталий Анатольевич

Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН Доктор биологических наук Гапоненко Александр Константинович

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РОССЕЛЬХОЗ Академии

Защита состоится « 28 » октября 2008 года в « '7 » часов на заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991 ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д. 3 Факс: (499) 132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН Авторефепат разослан « ^ » ¿З^^^О7 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.НЛолухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Проблема гена, его структурной и функциональной организации является центральной на всем протяжении существования генетики как экспериментальной науки. После фундаментальных открытий, касающихся роли ДНК как материального носителя наследственности, расшифровки ее структуры и генетического кода, принципиальным шагом в решении этой проблемы стало создание технологии клонирования фрагментов ДНК самых разнообразных видов. Это открыло широкие перспективы для перехода исследований гена на молекулярный уровень. Трудно переоценить значимость открытия возможности клонирования отдельных генов. В частности, оно привело к расшифровке нуклеотидных последовательностей геномов целого ряда видов, включая человека. Последнее событие произошло в 2000 году и на его фоне достаточно громко прозвучало другое событие - в этом же году впервые была расшифрована полная нуклеотидная последовательность генома одного из видов высших растений, а именно ЛгаЫ/Зорягз iha.lia.na.

Однако функции уже расшифрованных нуклеотидных последовательностей в большинстве случаев остаются невыясненными. В результате основная проблема генетики сегодня связана с выяснением функции генов, нуклеотидный состав которых известен.

Следует отметить, что число локализованных, клонированных и секвенированных генов высших растений на порядок меньше, чем у животных, в первую очередь млекопитающих и в том числе у человека. Эта ситуация была характерна для конца 90-х годов прошлого столетия и она сохраняется до настоящего времени. Вместе с тем, высшие растения позволяют в полной мере реализовать идеи и методы генной инженерии на пути создания методологии направленной модификации геномов для получения видов с заданным набором хозяйственно - полезных признаков.

При реализации этого подхода ключевую роль играет А. (каИапа • модельный объект высших растений, для которого определена полная

нуклеотидная последовательность генома. Перспективы использования А. thaliana в качестве основного источника генов для модификации хозяйственно - ценных культур очевидны (Flavell R.B. Crop Improvement -The Role of Discoveries in Model Species. Plant & Animal Genomes XIII Conference. Januaiy 15-19, 2005. San Diego, CA). Цели исследований:

1). Создание методологии идентификации функции генов A. thaliana.

2). Проведение генетического и молекулярно-генетического анализа идентифицированных генов A. thaliana.

Задачи исследований:

1). Получение и скрининг клонотек Arábidopsis thaliana и Pisum sativum.

2). Клонирование и изучение структурной организации фрагментов хпДНК P. sativum и A. thaliana, имеющих гомологию с ДНК хромосом растительной клетки.

3). Разработка методологии изучения структурно-функциональной организации генома A. thaliana, включающая создание эффективной системы агробактериальной трансформации, получение новых систем векторов для проведения трансформации, создание представительной коллекции инсерционных мутантов.

4). Идентификация функциональной роли ранее не исследованных генов А. thaliana.

Научная новизна:

1. Впервые показано, что природа последовательностей «смешанной» ДНК, представленных одновременно в ядерном и хлоропластном геномах А. thaliana, связана с наличием нескольких семейств консервативных нуклеотидных последовательностей размером 17-32 п.н., которые идентифицированы также в геномах млекопитающих, насекомых и цианобактерий.

2. Впервые показано различие в протекании процесса энзиматического метилирования ДНК в ядерном и хлоропластном геномах P. sativum и А. thaliana.

3. Развита методология получения и отбора инсерционных мутантов А. thaliana, а также локализации инсерции в геноме. С использованием этой методологии созданы коллекции трансгенных растений и инсерционных мутантов A. thaliana.

4. Разработан метод компенсации гормонального дисбаланса для спасения инсерционных летальных мутантов и мутантов со сниженной жизнеспособностью и фертильностью у A. thaliana.

5. Идентифицированы возможные функции ряда генов A. thaliana.

6. Показана функциональная значимость ретротранспозонов.

Научно - практическая значимость работы:

Создана коллекция инсерционных Т-ДНК мутантов, являющаяся основой для изучения структурно-функциональной организации генома А. thaliana. При создании этой коллекции были использованы разные векторные системы для индукции либо исключительно «ш/»-мутаций», которые позволяют изучать функции только стабильно экспрессирующихся в ходе развития растений генов, либо смеси, состоящей из «яи/»-мутаций и мутаций, вызывающих суперэкспрессию «молчащих» генов, которые участвуют в контроле ответа на абиотические и биотические стрессы.

Разработан метод компенсации гормонального дисбаланса для спасения инсерционных летальных мутантов A. thaliana и мутантов со сниженной жизнеспособностью и фертильностью, что позволяет проводить идентификацию фенотипа и генетический анализ этих мутантов. Показана функциональная значимость ретротранспозонов. Клонированы, идентифицированы и функционально охарактеризованы не известные ранее гены A. thaliana, которые могут быть использованы для фундаментальных исследований в области генетического контроля процессов развития растений, а также для поиска гомологичных генов у

сельскохозяйственных видов растений и для анализа экспрессии генов устойчивости к стрессовым воздействиям в трансгенных растениях. В международной базе данных «Gen Bank» зарегистрировано 9 векторов для трансформации растений и 26 линий инсерционных мутантов A. thaliana.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на VII Всесоюзн. Симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва, 1990); II Всесоюзн. Съезде физиологов растений (Минск, 1990); I Всесоюзн. Симпозиуме «Новые методы биотехнологии растений» (Пущино-на-Оке, 1991); Internation. Symposium «Plant Biotechnology and Genetic Engineering» (Киев, 1994); VII Межд. Конференции «Биология клеток in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997); Межд. Симпозиуме «Молекулярные механизмы стрессовых ответов у растений» (Москва, 1998); II Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (С.-Петербург, 2000); Internat. Conf. «Genetik collections, isogenic and alloplasmic lines» ( Novosibirsk, 2001); Междунар. Симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 2001); ЕМВО conference/FEBS Advanced Course «EuroPhosphatases» (Barselona, Spain, 2003); Physiological Society Spring Workshop Hungarian Academy of Sciences «Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress» (Budapest, Hungary, 2003); NATO/OTAN Advanced Research Workshop «Frontiers in Neurodegenerative Disorders and Aging: Fundamental Aspects, Clinical Perspectives and New Insights» (Antalya, Turkey, 2003); NATO Advanced Study Institute «Forces, Growth and Form in Soft Condensed Matter: At the Interface between Physicsand Biology» (Geilo, Norway, 2003); Proceedings of international scientific practicalconference «Biotechnology of vegetable, flower and not widely spread crops» (Moscow, 2004); «Plant Genomics European Meetings» (Venice, 2006); FEBS Special Meeting «АТР-Binding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases» (Innsbruck, 2006); Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что гены Synechocystis РСС 6803 - suhB, кодирующий экстрагенный супрессор SuhB из семейства инозитол монофосфатаз, и peîF, продуктом которого является ферредоксин, участвуют в контроле фотосинтеза.

2. Показано, что природа «смешанной» ДНК связана с наличием в ядерном и хлоропластном геномах высших растений нескольких семейств консервативных нуклеотидных последовательностей размером 17-32 п.н.

3. Показано, что хлоропластная ДНК растений либо не метилирована совсем, либо метилирована в очень малой степени.

4. Создана методология получения и отбора инсерционных мутантов А. thaliana, которая включает в себя разработку эффективной системы агробактериальной трансформации, конструирование векторных систем для индукции «nul» мутантов и мутантов, обусловленных суперэкспрессией генов, и использование технологии ПЦР-анализа для создания коллекции трансгенных линий и инсерционных мутантов A. thaliana.

5. Разработан метод компенсации гормонального дисбаланса для А. thaliana. Это позволило провести молекулярно-генетический анализ ряда условно летальных мутантов и мутантов со сниженной фертильностью.

6. Установлена функциональная значимость ретротранспозонов на примере рецессивного летального мутанта гипокотиля у A. thaliana. Ген At2g09920, инактивация которого инсерцией Т-ДНК приводит к возникновению мутантного фенотипа, представляет собой ретротранспозон.

7. Идентифицированы функции гена Atlgl2860 у A. thaliana, в структуру которого входит F-box домен, играющий ключевую роль в убиквитин-зависимом протеолизе, и транскрипционный активатор типа «спираль-петля-спираль». Показано, что катаболическая функция связана с контролем развития семядолей, тогда как его анаболическая функция - с контролем ответа на холодовой стресс.

8. Показано, что потеря функции гена А1^78950, кодирующего фермент из семейства оксидоскваленциклаз, приводит к дефектам развития проростков у А. tha.lia.na.

9. Установлено, что суперэкспрессия гена Аг^33390, контролирующего синтез АТФ-зависимой хеликазы из семейства ПЕАБ-Ьох белков, обусловливает образование фасциированного стебля у растений А. ¡каИапа.

10. Показано, что суперэкспрессия гена At5gl0080, кодирующего белок А1 класса аспартил протеаз, приводит к замедлению развития растений А. ОтЧапа, изменению их окраски и снижению фертильности.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 275 страницах, включает 40 таблиц и 55 рисунков. Материал представлен в виде общего введения, двух частей (первая состоит из 4-х глав, вторая - из 3-х глав), каждая из которых включает обзор литературы, результаты и обсуждение, общего заключения, выводов, списка основных опубликованных по теме диссертации работ, списка цитируемой литературы (376 наименований) и приложения, в которое вошел раздел «Материалы и методы». Работа выполнена в лаборатории изменчивости генома Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из лаборатории, с кафедры генетики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, а также с аспирантами и студентами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежат разработка программы исследований, схема основных экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ЧАСТЬ 1. СОЗДАНИЕ И СКРИНИНГ КЛОНОТЕК ВЫСШИХ

РАСТЕНИЙ Глава 1. Введение в проблему

С начала семидесятых годов прошлого столетия, после открытия и введения в практику генетических исследований эндонуклеаз рестрикции,

американскими учеными Коэном и Чангом (Cohen, Chang, 1973) была разработана стратегия клонирования, то есть перемещения отдельных фрагментов ДНК из генома одного организма в геном другого вне зависимости от их видовой принадлежности. Реализация этой принципиальной возможности для высших растений на первом этапе была связана с получение полноразмерных геномных клонотек и клонотек кДНК, а также с поиском и созданием зондов для анализа этих клонотек. В рамках этого подхода решающим стала проблема специфичности зондов для скрининга созданных клонотек.

В этой связи первая часть настоящей работы была связана главным образом с изучением фрагментов ДНК цианобактерий, содержащих гены фотосинтеза, с целью определения целесообразности их использования в качестве зондов для скрининга клонотек геномов Arabidopsis thaliana и Pisum sativum. Однако проведенные исследования показали низкий уровень специфичности использовавшихся зондов. В этой связи для идентификации не известных ранее генов нами был использован другой подход, связанный использованием Т-ДНК инсерционного мутагенеза.

Следует отметить, что развитие целого ряда методов, таких как определение нуклеотидной последовательности генов и геномов в целом, ПЦР-анализ, генетическая трансформация, инсерционный мутагенез и т.д., существенным образом повлияло на стратегию исследований, направленных на идентификацию генов высших растений - центр тяжести проблемы сместился в сторону изучения функций уже расшифрованных последовательностей ДНК генов и отдельных их частей. Параллельное развитие компьютерных методов привело к созданию алгоритмов для идентификации генов, основанных на характеристиках нуклеотидных последовательностей (Rogic et al., 2001; Griffiths, Stotz, 2006). В результате же создания многочисленных представительных коллекций инсерционных мутантов А. thaliana и расшифровки в конце 2000г. полной нуклеотидной последовательности этого вида (Arabidopsis Genome Initiative, 2000) сделали

его основным модельным объектом в исследовании структурно-функциональной организации геномов высших растений.

Использование разработанной нами методологии получения и отбора инсерционных мутантов, а также локализации инсерции в геноме A. thaliana позволило идентифицировать ряд ранее не известных генов. Глава 2. Идентификация гена suhB и его локализация в геноме Arabidopsis thaliana

2.1. Создание клонотек генома A. thaliana и P. sativum

В конце 80-х годов нами была создана полноразмерная клонотека ядерного генома A. thaliana в фаговом векторе замещения EMDL3. Фрагментированную ядерную ДНК размером -15-20 т.п.н. получали путем неполной рестрикции мелкощепящей рестрицирующей эндонуклеазой Mbol. Клонотека включала в себя порядка 14500 рекомбинантных клонов. Таким образом, каждый фрагмент яДНК присутствовал в ней 3,8 раза.

Кроме того, была получена клонотека хпДНК P. sativum. В этом случае в плазмидный вектор pUC19 клонировали HindIII-фрагменты хпДНК размером от 0.3 до 13 т.п.н. Всего было выделено 142 рекомбинантных клона.

2.2. Скрининг клонотеки генома A thaliana

Хотя сам факт создания полноразмерных геномных клонотек представлял собой достаточно трудоемкую процедуру, основная проблема в реализации этой стратегии заключалась в выборе специфических зондов для их скрининга. На первом этапе для скрининга в качестве гетерологичных зондов мы использовали клонированные фрагменты ДНК цианобактерии Synechocystis 6803, содержащие гены фотосинтеза (банк таких фрагментов к этому времени был получен на кафедре генетики Биологического факультета МГУ). В этом случае мы столкнулись не с отсутствием чувствительности используемых зондов, что можно было ожидать, а с отсутствием в подавляющем большинстве случаев их специфичности.

Учитывая тот факт, что у высших растений, в отличие от цианобактерий, гены, контролирующие фотосинтез, расположены как в хлоропластном, так и в ядерном геномах, на следующем этапе работы мы решали задачу, в каком из геномов находятся гены, гомологичные клонированным генам цианобактерии. При этом использовали прямой скрининг фаговой клонотеки ядерного генома A. thaliana, скрининг плазмидной клонотеки хлоропластного генома P. sativum, методы дот- и блот-гибридизации. Оказалось, что основная часть более чем 40 фрагментов гибридизовалась со многими клонами как ядерного, так и хлоропластного геномов. Наблюдаемое отсутствие специфичности зондов могло быть связано с тем, что достаточно протяженные клонированные фрагменты цианобактерий могли содержать несколько близко сцепленных генов (или их частей), которые, однако, у высших растений расположены в разных геномах - ядерном или хлоропластном. Чтобы исследовать эту возможность мы провели серию субклонирований, результаты которых представлены на примере 4 фрагментов (рис. 1, табл. 1).

Е в н s РВН Е

2,85 2,75

Е В Н EH Н ВН Е

pi62«i—jj; ь-41]

™23 2!

р744

; н н вн е

Е В Е Н Н ВН Е

1 тпн.

1,7 1,6 2,4

1.5 2,3 1,3 1,2 2,0 im.„.„.

В ИНН н н н н в 1

р39

ТТЛ—

S 5 5 Rl RI

1 2 3 4 5

Рисунок 1. Рестрикционные карты рекомбинантных плазмид р31, р1624, р744 и р39, трансформирующих к фотоавтотрофности фотосинтетические мутанты Synechocystis sp. РСС 6803. Е или RI - EcoRI; B-BamHI; S- Snial; P— PvuII; H-HindIII

Таблица 1. Локализация в пределах отобранных фрагментов ДНК цианобактерии участков гомологии с ядерной или хлоропластной ДНК P. sativum и А. tha.lia.na

Фраг- Плазмида Субфрагменты Сайты клонирования Сигнал блот-

мент (т.п.н.) субфрагментов гибридизации

(т.п.н.) сяДНК с хпДНК

5.6 Р31 2.85 BamHI-Hind 111 -

2.75 Hind III-BamHI + +

8.8 Р1624 2.1 BamHI-HindIII -

1.9 Hind III-Hind III

2.3 Hind III-Hind III - -

2.5 Hind III-BamHI + +

5.7 Р744 1.7 BamHI-HindIII +

1.6 Hind III-Hind III +

2.4 Hind III-BamHI +

11.0 Р39 1.5 BamHI-HindIII -

2.3 Hind III-Hind III +

1.9 Hind III-Hind III +

1.2 BamHI-HindIII

2.0 Hind III-BamHI + -

2.3. Идентификация генов suhB и petF

В составе рекомбинантной плазмиды р 1624.4 нами был выделен и субклонирован Hindlll - BamHI фрагмент ДНК размером 2.5 т.п.н., восстанавливающий способность к фотоавтотрофному росту при трансформации одного из фотосинтетических мутантов и гибридизующийся с хпДНК и яДНК P. sativum и A. thaliana. Более точно область гомологии была локализована в пределах Hindlll-HincII участка ДНК размером 0.7 т.п.н., входящего в состав этого субфрагмента и имеющего внутренний сайт рестрикции CfrlOl. После определения нуклеотидной последовательности этого фрагмента v примыкающих к нему участков ДНК (1140 п.н.) оказалось, что он несет в своем составе ген suhB, размером 628 п.н., кодирующий «экстрагенный супрессор SuhB» из семейства инозитол монофосфатаз размером 288 аминокислот. Таким образом, ген suhB является новым, ранее не идентифицированным геном цианобактерий.

В тот период времени, когда проводилась эта работа, полные нуклеотидные последовательности геномов A. thaliana и Synechocystis sp. РСС 6803 еще не были расшифрованы. Позднее, после их расшифровки мы идентифицировали в геноме Synechocystis sp. РСС 6803 непосредственно перед геном suhB на расстоянии 70 п.н. от стоп-кодона ген petF, продуктом которого является ферредоксин - белок, участвующий в транспорте электронов.

Анализ нуклеотидной последовательности A. thaliana с помощью базы данных TAIR на сервере NCBI для поиска гомологий с секвенированным фрагментом цианобактериальной ДНК показал, что уровень гомологии фрагмента цианобактериальной ДНК с геномной ДНК A. thaliana недостаточен для идентификации генов. Полное совпадение нуклеотидного состава возможно лишь для 18-19 п.н. Кроме того, было установлено наличие трех коротких последовательностей по 17-18 п.н., имеющих 95-100% гомологию с генами A. thaliana: последовательность GATTGTTCTCCTCGGATC - с 60 генами, последовательность GAGATTTGGTTACGGAAG - с 43 генами и последовательность CACCACCAACTTTGCCA - с 50 генами.

Сравнение аминокислотного состава продукта цианобактериального гена suhB с белковыми продуктами генов A. thaliana позволило установить, что геном A. thaliana содержит по крайней мере три гена, кодирующих белки семейства инозитол монофосфатаз. Это семейство представлено в большом количестве организмов, главным образом прокариот, причем у более чем 60 видов прокариот уровень гомологии белков составляет от 100 до 37%.

Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белкового продукта гена petF Synechocystis sp. РСС 6803 позволил идентифицировать в геноме A. thaliana по крайней мере четыре гена, белковые продукты которых имеют достаточно высокий уровень гомологии с цианобактериальным геном petF. Как и в случае гена suhB, существенной

гомологии секвенированного цианобактериального фрагмента с нуклеотидной последовательностью генома A. thaliana выявить не удалось.

Таким образом, нам удалось идентифицировать гены A. thaliana, имеющие высокий уровень гомологии по аминокислотному составу белковых продуктов с генами suhB (Atlg31190, At3g02870, At4g39120) и petF (At4g14890, Atlgl0960, At5g26990, At3g55530 и четыре не идентифицированных гена) Synechocystis sp. РСС 6803. Глава 3. Исследование гомологии между ядерной и хлоропластнои ДНК различных видов семейства Fabaceae и A. thaliana

Когда в результате проведенных исследований стало ясно, что если не вся нуклеотидная последовательность генов Synechocystis sp. РСС 6803, то, по крайней мере, ее часть представлена как в ядерном, так и в хлоропластном генома, возникла достаточно старая проблема существования так называемой «смешанной» ДНК, то есть ДНК, которая одновременно присутствует в ядерном и хлоропластном геномах растений. Это явление связывали с эндосимбиотическим происхождением хлоропластов и в этой связи на следующем этапе работы мы пытались разобраться в природе «смешанной» ДНК.

3.1. Скрининг генома хпДНК

Из клонотек хлоропластных генома P. sativum был выделен и клонирован фрагменты ДНК размером около 700 п.н., показавший гомологию с ядерным геномом этих видов. Наличие такого рода фрагментов было обнаружено нами и у ряда видов двудольных растений, главным образом сем. Fabaceae: P. sativum, Vicia sativa, Lathyrus sativum, Lens esculenta, Cicer arietinum, а также A. thaliana (рис. 2).

Было установлено, что яДНК пяти их шести исследовавшихся видов (кроме Lens esculenta) имеет области гомологии с 0.7 т.п.н. фрагментом хпДНК P. sativum, причем число и места расположения участков гомологии в ядерном геноме меняются при переходе от одного вида к другому.

Зоф-ж.ДККгероха (С7тпнУ

Блот-гибридизация эгР-мененого 0.7 т.п.н,-фрагмента хпДНК P. sativum с Hindlil-фрагментами хлДНК и яДНК P. sativum (1,2), L sativus (3,4), V sativa (5,6) и A. thaliana (7,8): 1. 3, 5,7- Hindlll-фрагменты хлДНК; 2, 4, 6, В - Hlndill-фрагменты яДНК. Размер указан в т.п.н.

Рисунок 2. Обнаружение «смешанной» ДНК

Из результатов нашей работы, как и из данных других авторов (Ayliffe et al., 1988), следует, что явление «смешанной» ДНК достаточно широко распространено среди растений сем. Chenopodiaceaea и сем. Fabaceae. Судя по выявленным различиям в степени гомологии, числе и размерах гомологичных фрагментов, «смешанная» ДНК в составе яДНК находится в разном окружении.

Изучавшийся фрагмент ДНК является высоко консервативной структурой, так как в хпДНК даже у таких филогенетически удаленных видов, как P. sativum и A. thaliana он имеет высокую степень гомологии и представлен фрагментами сходного размера.

Анализ числа и размеров гомологичных хлоропластных последовательностей ДНК в составе яДНК представителей сем. Fabaceae позволяет предположить, что процесс обмена генетической информацией между хлоропластами и ядром является относительно недавним событием, произошедшим после эволюционного обособления этих видов. 3.2. Клонирование и молекулярный анализ последовательностей хпДНК P. satinum и A. thaliana Было установлено, что 0.7 т.п.н. - фрагмент хпДНК P. sativum и А. thaliana несут в своем составе часть гена гр!2, кодирующего белок L2

большой субъединицы рибосомы хлоропластов, часть гена трт/9, кодирующего белок Б19 малой субъединицы рибосомы хлоропластов и спейсер между этими генами. Это А-Т богатые последовательности, в спейсере выявлено значительное количество прямых и обратных повторов.

Компьютерный анализ секвенированного фрагмента хпДНК А ЛаНапа

позволил установить наличие гомологичных ему последовательностей

разного размера в ядерном геноме А. ¡каНапа (табл. 2) - это девять коротких

последовательностей (от 17 до 32 п.н.), на 93 - 100% гомологичных яДНК,

которые присутствуют в количестве от 2 до 38 копий. Были

идентифицированы 33 гена А. йаНапа, несущие короткие фрагменты

«смешанной» ДНК, а также кодируемые ими белковые продукты.

Таблица 2. Нуклеотидный состав и частота встречаемости в ядерном геноме А. ¡Шита и геноме фрагментов «смешанной» ДНК в составе фрагмента хпДНК А. ЖаИапа размером 670 п.н.

№ п/п Последовательность нуклеотидов (размер п.н.) Позиция на фрагменте Встречаемость в геноме

1 TCTTTATTTTTCTTAATAAATGA (23 п.н.) 3-27 25

2 GATTTTTTATTCGTGAA (17 п.н.) 41-57 3

3 TGTCATAGTTAATTATTCCTCCTATAAA (28 п н ) 60-87 2

4 CTATAAATAACTAAAAAAGT (20 п.н.) 81-99 3

5 AAAAAAGTTAATTTTGTTCTCTTATATTCCAATT (34 п.н.) 92-125 6

6 AAATTGCTATTTTCTTTTGTA (21 п.н.) 173-193 3

7 GTAAAGAGGAAGAAACAAATTCTATTTTAT (30 п н.) 191-220 38

8 TTTTTCTGGTTCTTCTTC (18 п н ) 283-300 7

9 AAACGGACCTCGCCAGAAGGTAATTTTAATGT (32 п.н.) 524-555 3

Сравнительный анализ этих девяти коротких последовательностей нуклеотидов из фрагмента хпДНК с нуклеотидными последовательностями геномов Drosophila melanogaster, Mus musculus и Homo sapiens показал, что одни и те же короткие нуклеотидные последовательности в составе

фрагмента хпДНК A, thaliana встречаются не только в ядерном геноме А. thaliana и Synechocystis sp. РСС 6803, но и в геномах разных видов эукариот (на примере человека, мыши, дрозофилы). Не исключено, что их наличие связано с посттранскрипционной регуляцией генной активности и определяет существование в клетках miPHK и siPHK - некодирующих РНК размером 2030 п.н., которые, наряду с рРНК, мРНК и тРНК, негативно регулируют экспрессию их генов-мишеней в растениях и животных, играя важную каталитическую, структурную и регуляторную роль в клетках. 3.3. Уровень метилирования генома хлоропластов у некоторых видов

двудольных растений

В пользу эндосимбиотической гипотезы происхождения хлоропластов свидетельствует не только наличие «смешанной» ДНК, но и особенности организации и функционирования генома хлоропластов. Данный раздел работы посвящен выяснению вопроса, содержат ли хпДНК и яДНК растений остатки т6А, могут ли у этих ДНК быть in vivo метилированными остатки аденина в последовательности GATC. Для этой цели использовали сравнительный анализ продуктов действия чувствительных и нечувствительных к метилированию адениновых остатков рестриктаз (Cful, Mbol и Sau3A, соответственно) на хпДНК и яДНК P. sativum и V. sativa.

Рисунок 3. Электрофореграмма в 2% агарозном геле: 1-3 -хпДНК P. sativum, обработанные Mbol (1), Sau3A (2) или СМ (3); 4-6- хпДНК V. sativa, обработанные Mbol (4), Sau3A (5) или Mbol (1), Sau3A (2) или Cful (3); (6); 7 - ДНК фага X, обработанная Cful; 8-10 - яДНК P. sativum, обработанные Mbol (8), Sau3A (9) или СМ (10); 11-13 - яДЬЖ V. sativa, обработанные Mbol (11), Sau3A (12) или Mbol (13)

На рис. 3 можно видеть, что хпДНК гороха (дорожка 3) и вики (дорожка 6) не гидролизуются рестриктазой СМ, которая расщепляет ДНК по Gm6ATC-, но не GATC-сайтам. Не подвергаются заметному гидролизу под действием этой рестриктазы и яДНК этих же бобовых (дорожки 10 и 13, соответственно; рис. 4, дорожка 5). Как хпДНК, так и яДНК данных видов бобовых гидролизуются рестриктазами Mbol и Sau3A, то есть они содержат GATC-последовательности, в которых адениновые остатки не метилированы. Фермент Sau3A гидролизует ДНК как по Gm6ATC-, так и по GATC-сайтам, но не гидролизует по ОАТт5С-сайтам. Поскольку в хпДНК т5С не найден, гидролиз этой нуклеазой дает представление о суммарном количестве GATC-сайтов. Фермент Mbol гидролизует GATC-, но не Gm6ATC -сайты. Сходство продуктов гидролиза хпДНК рестриктазами Mbol и Sau3A свидетельствует о том, что у этих ДНК во всех последовательностях GATC адениновые остатки не метилированы. На это же однозначно указывает и выявленная устойчивость хпДНК к эндонуклеазе СМ. Значит, действительно хпНК Р. sativum и V. sativa лишены метилированных Gm6АТС-участков.

Рисунок 4. Электрофореграмма в 0.6% агарозном геле ДНК и продуктов их деградации эндонуклеазой СМ, гидролизующей ДНК по Gm6АТС-сайтам: 1 - хпДНК P. sativum, обработанная СМ; 2 - хпДНК P. sativum; 3 - ДНК фага X; 4 - ДНК фага X, обработанная СМ; 5 - яДНК P. sativum-, 6 - яДНК Р. sativum, обработанная СМ

При выявленном отсутствии метилированных остатков аденина в GATC-сайтах обнаруженные нами заметные различия по продуктам гидролиза яДНК рестриктазами Mbol и Sau3A могут указывать на то, что в

отличие от хпДНК у яДНК бобовых растений имеются GATm'C-последовательности. Таким образом, нами впервые было установлено, что в хпДНК P. sativum нет метилированных цитозиновых остатков, по крайней мере, в CCGG сайтах и метилированных адениновых остатков в GATC сайтах. Это является отличительным признаком хпДНК и, наряду с секвенированием, это важно для дискриминации ДНК из разных геномов растительной клетки.

Глава 4. Взгляд на использование методологии гибридизации при идентификации новых генов

Использование в качестве гетерологичных зондов фрагментов геномной ДНК цианобактерий, содержащих гены фотосинтеза, показало, что в подавляющем большинстве эти фрагменты гибридизовались как с фрагментами хпДНК, так и с фрагментами яДНК A. thaliana и P. sativum. Сам факт наличия «смешанной» ДНК в 80-е годы был известен и эта проблема обсуждалась в литературе в связи с эндосимбиотической теорией происхождения хлоропластов. Однако наличие таких сходных последовательностей ДНК в различных геномах в пределах клеток одного вида или разных видов рассматривалось еще сравнительно недавно скорее как исключение, чем как правило. Нами было проведено определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК Synechocystis sp. РСС 6803, которые использовались в качестве зондов и показали наличие гомологии как в отношении яДНК, так и в отношении хпДНК A. thaliana. Сравнительный компьютерный анализ фрагментов «смешанной» ДНК А. thaliana с полной нуклеотидной последовательностью генома A. thaliana показал наличие коротких последовательностей (от 17 до 32 п.н.), гомологичных генам A. thaliana, которые встречаются не только в ядерном геноме A. thaliana и Synechocystis sp. РСС 6803, но и в геномах разных видов эукариот (на примере человека, мыши, дрозофилы). В конце 80-х годов, когда выполнялись исследования, вошедшие в данный раздел работы, повторы в транскрибирующихся участках генома растений рассматривались в двух

аспектах. Во-первых, в связи с проблемой происхождения хлоропластов и природой «смешанных» ДНК и, во-вторых, в связи с проблемой специфичности гетерологичных зондов при скрининге клонотек. Биологическое значение этих коротких повторяющихся последовательностей ДНК стали проясняться позже, после открытия явления РНК - направленного подавления активности генов и выяснения механизмов, лежащих в основе этого явления. В настоящее время есть все основания полагать, что эти повторы ДНК являются одной из причин формирования в клетке двунитевых коротких РНК и таким образом участвуют в регуляции активности генов Кленов, Гвоздев, 2005; Zeng, Cullen, 2006; Lu et al., 2006).

Однако, возвращаясь к проблеме специфичности зондов при скрининге клонотек для идентификации новых генов, следует сказать, что наличие таких повторяющихся последовательностей накладывает существенные ограничения на использование гетерологичных зондов. Фактически, при использовании гетерологичных зондов нам необходимо иметь не только клонированные гены - кандидаты на роль зондов, но и знать их подробную структурно-функциональную организацию для выбора уникальных последовательностей в пределах гена, которые могут быть эффективно использованы в качестве зондов.

Низкая специфичность гетерологичных зондов, с одной стороны, и развитие техники секвенирования ДНК - с другой, обусловили развитие другого подхода, который мог быть использован для решения проблемы идентификации структуры и функции генов, в частности, генов высших растений. В случае бактерий, цианобактерий и млекопитающих для этих целей широко используется ген-направленный мутагенез (Bouchez, Höfte, 1998), связанный с замещением в геноме нормальной копии гена на мутантную в результате протекания гомологичной рекомбинации. Для высших растений и, в частности, для A. thaliana, этот подход не может быть использован в силу низкой эффективности протекания процесса гомологичной рекомбинации по сравнению с незаконной рекомбинацией.

В этой связи основную роль в изучении функциональной организации генома А. ¡ИаНапа играют коллекции инсерционных мутантов. Процесс создания такого рода мутантов начался в конце 80-х - начале 90-х годов прошлого столетия и примерно в это же время подобные работы начались у нас.

ЧАСТЬ 2. ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ИНСЕРЦИОННЫХ

МУТАНТОВ АПАВЮОРЗШ ТНАЫАЫА Глава 1. Коллекции инсерционных мутантов

Для создания представительных коллекций инсерционных мутантов необходима прежде всего высокая частота получения растений -трансформантов, а это, в свою очередь, требует разработки эффективной системы генетической трансформации растений, удобных векторных систем для селекции и последующей идентификации генов, в которые встроилась инсерция, а также для локализации инсерции в геноме. Когда нами были начаты работы по созданию коллекции инсерционных мутантов А. гкаИаш, предполагалось клонировать, а затем определять нуклеотидный состав генов, в которые встроилась инсерция.

1.1. Конструирование бинарных векторов для агробактериальной трансформации А. г/гаПапа

В случае бинарной векторной системы для генетической трансформации (использующейся в работе) функции по ферментативному обеспечению процесса интеграции Т-ДНК в геном растений и перемещающаяся структура Т-ДНК разделены. В интегрирующейся в геном Т-ДНК существенным для процесса перемещения является наличие концевых «бордерных» участков размером 25 п.н. Это позволяет вводить в ее структуру самые разные нуклеотидные последовательности, которые не имеют отношения к функции перемещения Т-ДНК, но оказываются удобными для других целей. В частности, эти последовательности могут нести маркеры резистентности, использующиеся для отбора трансформантов, полилинкеры, репортеры и т.д., а также элементы, создающие удобные

условия для последующего клонирования мутантных генов, несущих в своей структуре Т-ДНК. К числу последних относятся бактериальные оп-сайты, которые обеспечивают репликацию кольцевых структур ДНК, содержащих эти сайты в клетках Е. coli, а также гены резистентности к бактериальным ядам, в частности, к антибиотикам, находящиеся под контролем бактериальных промоторов.

Рисунок 5. Схема конструирования бинарных векторов рЫЭЗ, р1ЛЭ4, рС01

Именно для этих целей нами на базе вектора рВ1121были сконструированы три бинарных вектора р1ЛЭЗ, рЬБ4 и рОО, несущие в Т-области выражающиеся в клетках Е. соН бактериальные гены резистентности к антибиотикам - хлорамфениколу, тетрациклину и ампициллину (рис. 5).

На рис. 6 представлена подробная карта векторной плазмиды р1ЛЭЗ, дальнейшее использование которой для генетической трансформации прорастающих семян А. ЛаНапа позволило нам получить около 400 растений - трансформантов.

1Л

СивА-депе

.Час] (16165) Рци1 (16149) \ ИОЗ^егт \ ЕсоШ (15390) РшИ (15802) РШЦ15773) По Л (15345) ВуШ (14724)

\гтс1Т (8Р4) »7101(886)

/ ВатШтч)

Л1м1 (8%)

СоМУ-ргот^вг

(1752) Рии I (1877} • РииП (2818) £соИ <2918)

С£я1 (4159)

'ЛЛ'ПШП (4164) , д РиЛ) 14347) V в' \ \у\ СЫ (4579)

Л \ \\%М084ит

И Ч\\ \\

\ \\\ \ \р™1(509й) м Ара.1 (5219)

^ \ Рии II (6О46) \ ЯйЦбЮЗ) И08-ргот

№751) 83/П (6770)

Рисунок 6. Карта векторной плазмиды рЬБЗ

Однако в связи с развитием техники ПЦР-анализа и расшифровкой полной нуклеотидной последовательности генома А. ЖаИапа были развиты и успешно используются в настоящее время более эффективные и экономичные методы локализации инсерции Т-ДНК в геноме А. £каИапа.

1.2. Системы векторов для индукции суперэкспрессии генов

В векторных системах такого типа Т-область содержит энхансер. В этом случае, наряду с генами, в которые произошло встраивание инсерции, могут быть идентифицированы гены, расположенные на некотором расстоянии от инсерции. Использование энхансерных векторов значительно расширяет спектр получаемых при проведении инсерционного мутагенеза мутаций.

В своей работе мы использовали бинарный вектор рРСУЯШ (Кбпсг е1 а1., 1994), несущий в Т-области маркерный ген 1i.pt, который обеспечивает резистентность растений к гигромицину, фрагмент из плазмиды рВЯ322, содержащий маркерный ген Ыа, обусловливающий резистентность агробактерий к карбенициллину, и точку оп, создающую возможность клонирования в клетках Е. соИ участков геномной ДНК растения, прилегающих к Т-ДНК инсерции. В Т-ДНК вектора рРСУКЫ4 присутствуют четыре копии энхансерного домена промотора 358 РНК САМУ.

Следует отметить, что когда структура инсерции содержит энхансер, могут возникать мутации двух типов: им/-мутации, связанные с инактивацией гена при встраивании в него инсерции, и мутации, обусловленные наличием энхансера в структуре инсерции. При массовом получении и анализе инсерционных мутаций, полученных с помощью такого рода векторов, необходимо иметь относительно простую и эффективную систему идентификации ии/-мутаций и мутаций, связанных с суперэкспрессией генов.

маннопин-синтетазный промотер Ара I

Лра1 ¡ОХР

Ваз1аР ген ___________СаМУЗЙ

окгопин-синтетазный терминатор " ...... СаМУЗИ

№ I' ^^^ГСаМУЗВв Левый бордер_Л.х^СаМУЗбЗ

(охР

Правый бордер

Рисунок 7. Карта вектора рЕпЬох

Нами была создана принципиально новая, не имеющая аналогов в мире, система для массовой индукции и отбора инсерционных мутантов, обусловленных суперэкспрессией генов у А. 1каИапа. Эта система включает в себя плазмиду рЕпЬох (рис. 7) для индукции инсерционных мутантов при

агробактериальной трансформации двудольных растений и тестерную линию A. thaliana, в геном которой включен ген ere в составе плазмиды рСге (рис. 8).

Рисунок 8. Карта вектора рСге

Продукт этого гена осуществляет контролируемую экспериментально специфическую рекомбинацию по прямым повторам /сос-сайтов. В свою очередь энхансер (тетрамер промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты) в составе Т-ДНК плазмиды, использующейся для получения инсерционных мутантов, окаймлен /ох-сайтами в прямой ориентации. В результате, при скрещивании инсерционных мутантов с тестерной линией происходит удаление энхансера из структуры Т-ДНК, интегрированной в геном мутантного растения. Если при этом исчезает мутантный фенотип, то это означает, что он обусловлен суперэкспрессией близлежащего по отношению к инсерции гена (рис. 9). Учитывая тот факт, что частота вырезания ere - рекомбиназой фрагментов ДНК, заключенных между lox -сайтами, составляет более 90%, восстановление инсерционным мутантом фенотипа растения дикого типа происходит уже во втором поколении.

Таким образом, созданная система позволяет индуцировать инсерционные мутации и дифференцировать мутантные фенотипы, которые могут быть связаны либо с подавлением функции гена при встраивании в

CRE эщонЗ

---------------------интрок касторового боба

pBR322 Ori—

него инсерции, либо с суперэкспрессией близлежащих генов за счет наличия в структуре инсерции энхансерной последовательности.

Рисунок 9. Мутантная линия с фасциированным стеблем

Слева - электрофореграмма ПЦР продуктов, полученных с реакции обратной транскрипции на ген Atlg33390: М lkb+ Invitrogen ДНК маркер; 1 -мутант; 2 - растение дикого типа. Справа - сравнение фенотипов морфологического мутанта линии (А), «двойного мутанта» (С) и растения дикого типа (В). Возраст 7 недель.

1.3. Разработка эффективной системы генетической трансформации у A. thaliana

Несмотря на то, что к концу прошлого столетия были разработаны самые различные методы генетической трансформации A. thaliana, о которых мы говорили ранее, одним из наиболее перспективных для массового получения инсерционных мутантов на наш взгляд являлся метод трансформации прорастающих семян, предложенный Фельдманном и Марксом (Feldmann, Marks, 1987). Суть метода сводится к сокультивированию предварительно замоченных в жидкой питательной среде семян A. thaliana с ночной культурой штамма A. tumefaciens, использовавшегося для трансформации. По окончании экспозиции семена

тщательно промываются водой и нестерильно высеваются в почву. Через 910 недель с выросших фертильных растений (поколение Т1) собирают зрелые семена (поколение Т2). Отбор растений - трансформантов проводится стерильно в Т2-поколении.

К преимуществам этого метода следует отнести отсутствие стадии работы с культурой ткани, исключающее возникновение сомаклональной изменчивости, эпигенетических изменений и морфозов, возможность проводить трансформацию сразу большого количества растений, короткие сроки получения трансформантов. Все это делает его удобным для работы с А. гкаИапа. Недостатком метода является низкая частота трансформации (около 0,1%).

Как известно, агробактерии проникают в растение через микропиле (Ре1ётапп, 1995), и логично было бы предположить, что, облегчив им доступ внутрь семян, можно существенно повысить выход трансформантов. В связи с этим нами была разработана модификация метода Фельдмана и Маркса, связанная с нанесением незрелым проросткам А. МаНапа перед сокультивированием с агробактериями микроповреждений с помощью ультразвука.

Модификация оригинального метода заключалась в обработке ультразвуком семян, которое проводили в двух вариантах.

1. Выборку семян (500 штук) подвергали воздействию ультразвуком частотой 44 кГц и мощностью 400 Вт на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1 в течение 1 мин.

2. Равноценную выборку семян подвергали воздействию ультразвуком частотой 44 кГц и мощностью 400 Вт на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1 в течение 1 мин. в присутствии равной по весу семян навески окиси алюминия АЬОз.

В качестве контрольного варианта использовали равноценную выборку семян, проведенных через стадии стерилизации, замачивания и

сокультивирования с агробактериями наряду с опытными выборками, но не подвергавшихся воздействию ультразвуком.

Детальное описание стерилизации семян, обработки их ультразвуком и сокультивирования с агробактериями, а также отбор растений -трансформантов представлено в Приложении, гл. «Материалы и Методы». Таким образом, были получены три варианта:

1) прорастающие семена А. ¡ИаИапа, культивировавшиеся с агробактериями без предварительной обработки;

2) семена А. МаНапа, подвергшиеся воздействию ультразвуком;

3) семена А. 7каИапа, подвергшиеся воздействию ультразвуком в присутствии окиси алюминия.

В результате оценки данных по процентному содержанию трансформантов в Т2-поколении для каждого режима обработки семян Т1-поколения при использовании вектора рЬЛЭЗ было установлено, что обработка семян ультразвуком увеличивала эффективность трансформации до 0.66%, то есть почти в 2 раза по сравнению с контрольным вариантом. Обработка семян ультразвуком с окисью алюминия позволила достигнуть эффективности трансформации равной 1.15%, что более чем в 3 раза превысило контрольный показатель (табл. 3).

Таблица 3. Оценка эффективности трансформации А. IНаИста в зависимости от режима обработки семян Т1-поколения перед сокультивированием с А. ¡ите/аЫет

Метод обработки семян Т1-поколения Выборка семян Т2 поколения* Количество трансформантов

штук %

Без обработки (контроль) 2800 10 0,36

Ультразвук 3200 21 0,66

Ультразвук + Окись алюминия 2000 23 1,15

♦Выборка семян Т2-поколения, тестированных на среде с Кш.

1.4. Отбор растений - трансформантов

Эффективность и простота процедуры отбора трансформированных растений зависит от присутствующего в Т-ДНК маркера, по которому проводится отбор.

Отбор трансформированных растений по критерию резистентности к канамицину в наших экспериментах при использовании вектора pLD3 не давал результатов, полностью совпадающих с результатами последующих гистохимического и ПЦР анализов. Невозможность жесткого отбора на канамицине в результате определила стратегию использования ступенчатой системы отбора. В частности, на первом этапе в Т2-поколении мы отбирали резистентные к канамицину растения, на втором этапе определяли наличие активности GUS у отобранных вариантов растений и на третьем этапе наличие инсерции в геноме Km-резистентных растений Т2, давших GUS-окрашивание, подтверждалось ПЦР-амплификацией участка размером 608 п.н. гена uidA Т-ДНК, встроенного в геном растения. Для оценки эффективности ступенчатой системы отбора растений-трансформантов и определения числа Т-ДНК инсерций в геноме проводили блот-гибридизацию по Саузерну геномной ДНК независимых линий трансформантов, обработанной рестрицирующей эндонуклеазой BamHl, с меченным 32Р фрагментом ДНК гена uidA размером 608 п.н.

В настоящей работе для агробактериальной трансформации использовались также два других вектора, несущих в составе Т-ДНК энхансер - pPCVRN4 и pEnLox. Бинарный вектор pPCVRN4, в Т-области содержит маркерный ген hpt под контролем промотора pnos гена нопалин-синтетазы, который обеспечивает резистентность растений к гигромицину. В Т-области вектора pEnLox находится ген bar под контролем промотора нопалин-синтетазы, обеспечивающий трансгенным растениям устойчивость к гербициду BASTA, что позволяет проводить отбор в нестерильных условиях в почве или на песке.

В случае вектора pPCVRN4, благодаря высокой селективной эффективности гигромицина, отбор трансформантов проводили только по резистентности растений к этому антибиотику. Кроме того, ДНК отобранных на гигромицине вариантов анализировали путем ПЦР-амплификации фрагмента Т-области. Количество инсерций определяли методом блот-гибридизации.

1.5. Получение коллекции растений - трансформантов A. thaliana

Трансформации были подвергнуты 200 тысяч семян A. thaliana: 100 тысяч семян расы Köln трансформировали с помощью вектора pLD3 и 100 тысяч семян расы Dijon - с помощью вектора pPCVRN4. С каждого зрелого растения Т1-поколения было собрано от 300 до 500 семян. Таким образом, с учетом 50% всхожести семян Т1-поколения, было получено около 40 миллионов семян Т2-поколения.

Далее, 130 тысяч семян (30 тысяч трансформированных вектором pLD3 и 100 тысяч - вектором pPCVRN4) Т2-поколения было проанализировано на наличие генетических маркеров Т-области. В результате осуществлявшегося в Т2 - поколении отбора, описанного выше, было получено 2175 линий трансгенных растений (табл. 4). Таблица 4. Коллекция трансгенных растений A. thaliana

Векторная плазмида Количество трансформированных семян Т1, штук Количество проанализированных семян Т2, штук Количество растений-трансформантов

штук %♦

pLD3 100.000 ЗО.ООО 396** 1.3

pPCVRN4 100.000 100.000 1779*** 1.8

pEnLox 2.600 157 6.0

"■относительно числа проанализированных семян Т2.

♦♦Проростки Т2, резистентные к канамицину, экспрессирующие [5-глкжуронидазу и давшие сигнал при ПЦР-анализе.

♦♦♦Растения Т2, резистентные к гигромицину, часть из которых была проанализирована методом ПЦР.

♦♦♦♦При работе с этим вектором трансформацию проводили методом «floral dip».

Видно, что эффективность трансформации прорастающих семян в случае вектора pPCVRN4 примерно в 1.5 раза выше, чем у вектора pLD3

(t=1.93; p=0.053). По-видимому, это связано с наличием у вектора pPCVRN4 энхансера.

Кроме линий трансформантов, полученных методом агробактериальной трансформации прорастающих семян с использованием двух векторов (pLD3 и pPCVRN4), методом трансформации «floral dip» с помощью описанной выше оригинальной системы индукции и отбора инсерционных мутантов с суперэкспрессией генов была получена серия из 157 линий трансформантов. Подробное описание этой части работы не входило в наши задачи.

Таким образом, созданная нами коллекция трансгенных растений А thaliana состоит из 2332 линий. 1.6. Отбор морфологических мутантов

Таблица 5. Классификация морфолопгческих инсерционных мутантов по Фельдману (Feldmann, 1991)

№ Фенотип

1 Летальные проростки*

2 Мутанты измененного размера**

3 Эмбриональные летали

4 Мутанты со сниженной фертильностью, стерильные

5 Мутанты пигментации: желто-зеленые альбиносы

6 Мутанты с измененными органами: цветковые корневые *** мутанты трихом/опушения мутанты листьев/семядолей мутанты гипокотиля мутанты с нарушенной дифференцировкой органов

7 Физиологические мутанты времени цветения

Другие

* К данному классу отнесены мутанты, характеризовавшиеся летальностью. В возрасте до 2-х недель, не формировавшие настоящих листьев.

** В данный класс не включены микромутанты и мутанты, уменьшенный размер которых был обусловлен общими значительными изменениями морфологии.

***В данный фенотипический класс не включены мутанты с нарушениями морфологии корня, которые являлись, по-видимому, вторичным эффектом.

Следующий этап работы заключался в отборе из полученной коллекции трансгенных растений линий, имеющих визуально регистрируемые морфологические изменения. Этот отбор осуществляли в первом (Т1), втором (Т2) и третьем (ТЗ) после агробактериальной трансформации поколениях. Регистрируемые изменения касались главным образом морфологии растений, но включали также и такие показатели, как скорость развития, степень фертильности и жизнеспособность. Все полученные мутации были отнесены к семи общим фенотипическим классам (табл. 5).

1.6. Генетический анализ морфологических мутантов А. ¡ИаПапа

Получение в ходе отбора фенотипически измененных вариантов требовало выяснения характера наследуемости наблюдаемых морфологических изменений. Поэтому для каждого изучаемого морфологического мутанта проводили генетический анализ расщепления потомства в последующих поколениях (ТЗ, Т4, Т5). Одновременно каждое последующее поколение исходного мутанта анализировали с помощью косегрегационного анализа, то есть проверяли сцепленность наследования мутантного признака с наличием в геноме растения инсерции Т-ДНК, используя ПЦР.

Таблица 6. Отбор морфологических мутантов из коллекции линий трансформантов А. ЖаИапа

Вектор Проанализировано растений Т2,ТЗ, штук Отобрано линий в Т2и ТЗ, штук Отобрано линий, несущих доминантные морфологические мутации, штук Отобрано линий, несущих рецессивные мутации, штук

рП)3 100 16 0 16

рРСУЯЖ 209 59 5 54

рЕпЬох 157 21 3 -

Всего: 348 78 8 70

Всего нами было проанализировано 348 растений, из них 100

полученных с помощью вектора р1ЛЭЗ, 209 и 157 - с помощью энхансерных

векторов рРСУИЖ и рЕпЬох, соответственно (табл. 6).

Таблица 7. Классификация выщеплявшихся в ТЗ-поколении линий рецессивных мутантов А. ¡ИаИапа по их жизнеспособности и фертильности

Классификация рецессивных мутантов ТЗ-поколения Количество, штук

Вектор для трансформации

р1Х>3 рРСУ1Ш4

Летальные 9 26

Стерильные 2 0

фертильные 6 24

Всего 17 50

Стерильность данных мутантов явилась, по-видимому, следствием общих значительных нарушений в развитии органов. Следует отметить, что в литературе широко представлены данные, свидетельствующие о том, что такого рода мутации, связанные с глобальными изменениями морфологии растения, часто являются доминантными и обусловлены нарушением функции генов, вовлеченных в сигнальную трансдукцию, в частности, в формирование гормонального сигнала или ответа. Большинство этих генов остаются не охарактеризованными, что увеличивает ценность отбора и исследования генома таких мутантов. Вместе с тем известно, что проведение сегрегационного анализа сопровождается появлением ложных спонтанных деталей, обусловленных неблагоприятным воздействием на семена разнообразных факторов окружающей среды. Поэтому необходимо определить природу наблюдаемых деталей, а это, в свою очередь, определяет необходимость проведения дальнейшего генетического анализа выщепляющихся летальных растений.

1.7. Использование экзогенных фитогормонов для спасения условно летальных мутантов А. /ИаНапа и мутантов со сниженной жизнеспособностью и фертильностью

Значительная часть возникающих инсерционных морфологических мутаций характеризуется пониженной жизнеспособностью либо фертильностью. По крайней мере частично это явление определяется косвенными причинами, связанными с дисбалансом процесса развития мутантных растений. С другой стороны установлено, что процессы роста и дифференцировки (либо дедифференцировки при образовании каллуса) определяются балансом в клетках растений различных фитогормонов. При этом реализуется генетическая потенция, имеющаяся у клеток, и путь этой реализации зависит от соотношения концентраций фитогормонов в растительной клетке, причем в отношении каждого гормона могут возникать морфологические изменения, характерные для повышенного или пониженного уровня гормона либо нарушения транспорта данного гормона в организме растения.

В том случае, когда мутации приводят к нарушению синтеза гормонов, их дефицит в растении может быть функционально компенсирован путем введения экзогенных гормонов. В связи с этим данный раздел работы посвящен разработке метода «спасения» инсерционных мутантов А. tha.lia.na со сниженной жизнеспособностью и фертильностью путём культивирования их на синтетических средах с экзогенным ауксином и цитокинином. 1.7.1. Подбор гормональных сред для спасения летальных инсерционных мутантов А. МгаИапа и мутантов со сниженной жизнеспособностью и фертильностью

На основании результатов предварительных опытов были подобраны условия для компенсации летального эффекта или нарушений генеративной функции морфологических мутантов А. 1каИапа. Гибнущие проростки и экспланты стерильных мутантов культивировали в течение 2-3 недель на агаризованной среде Квитко с сахарозой, витаминами и экзогенными гормонами ИМК (2.0 мг/л) и 6-БАП (0.5 мг/л), после чего пересаживали на среду того же состава, но без гормонов.

1.7.2. Спасение условно летальных мутантов

Летальные проростки. Класс «летальные проростки» составляет 3-5% от всех получаемых инсерционных мутантов. К этому фенотипическому классу отнесли линии растений, которые в ТЗ-поколении показывали расщепление по фенотипу на нормальные и морфологически измененные формы, представлявшие собой проростки замедленного развития, прекращавшие рост на стадии семядолей, не формировавшие первую пару настоящих листьев и характеризовавшиеся летальностью в возрасте до 2-4 недель.

а__б

2J 1 ррг

• S ■ Ж , '

в г

Рисунок 10. Аномалии в морфологии семядолей рецессивных летальных мутантов A. thaliana: верхняя (а) и нижняя (б) поверхность семядоли проростка; проростки двух других линий (в) и (г). Масштаб: (а) - бар = 150 мкм; (б) - бар = 120 мкм; (в), (г) - бар = 300 мкм

Растения нормальной морфологии к 10-м суткам проращивания имели значительно больший по сравнение с морфологически измененными формами размер, к 14-м суткам у них, в отличие от морфологически измененных форм, образовывалась первая пара настоящих листьев.

Семядоли мутантных проростков имели нарушения клеточной дифференцировки, аномальное развитие клеток эпидермиса (рис. 10) часто приводило к практически полному их отсутствию (рис. 106). Семядоли были неправильной формы (рис. 10в), часто пережатые в основании (рис. Юг), встречались варианты проростков с измененным количеством семядолей (рис. 11а). Изменения морфологии касались также уменьшения размеров

гипокотиля (не более 5мм) и полной или частичной редукции корня (рис. 11) часто сопровождавшейся его некрозами.

а б

в г

Рисунок 11. Общий вид рецессивных летальных 10-суточных проростков А. (каПапа линий 27 (а), 1955 (б), 1603 (в) и корень проростка дикого типа того же возраста (г). Масштаб: (а) - бар = 600 мкм; (б), (в), (г) - бар = 800 мкм

Проростки мутантного фенотипа на 3-10-е сутки проращивания помещали на среды с экзогенными гормонами, где уже через трое суток из апикальной меристемы начинали образовываться листья, а через 2-3 недели - побеги, которые переносили на среду без гормонов, где они развивались в фертильные растения, дававшие через 5-10 недель семена.

Использование экзогенных фитогормонов позволило с высокой эффективностью функционально компенсировать генетические дефекты (в 6 из 13 случаев), лежащие в основе мутации типа «летальный проросток». Это в свою очередь определило возможность проведения дальнейшего генетического и молекулярно-генетического анализа спасенных мутантов. Летальные мутанты гипокотиля. У растений, в Т2-поколении фенотипически не отличавшихся от растений дикого типа, в последующих поколениях происходило выщепление летальных проростков с морфологическими изменениями гипокотиля. Это были проростки с изогнутым редуцированным гипокотилем длиной не более Змм, погибавшие на стадии семядолей или первой пары настоящих листьев, в случае одной

линии, или проростки с фенотипически нормальными семядолями, укороченным, но в целом нормальным корнем и извитым гипокотилем, образующим один или несколько левоспиральных витков, в случае второй линии. Они погибали на стадии семядолей или первой пары настоящих листьев. Спасение двух таких летальных мутантов гипокотиля позволило провести косегрегационный анализ этих линий.

Таким образом, разработанный метод культивирования на средах с экзогенными фитогорионами позволил «спасти» 8 (45%) мутантов и провести их фенотипический и генетический анализ.

Глава 2. Локализация иисерций и идентификация генов A. thaliana,

маркированных инсерцией Т-ДНК 2.1. Использование методов ПЦР-анализа для локализации генов

A. thaliana, маркированных инсерцией Т-ДНК

В нашей работе при идентификации генов, маркированных инсерцией, использовали метод TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced) (Liu et al., 1995). Специально для этого метода с помощью компьютерного анализа нуклеотидной последовательности геномов различных видов были подобраны и синтезированы серии стандартных наборов таких вырожденных праймеров. Каждый набор серии содержит семейство коротких (14-16 п.н.) последовательностей, по крайней мере один из которых с высокой степенью вероятности присутствует в любом участке генома размером в несколько сотен нуклеотидов. Этот метод не требует рестрикционной фрагментации геномной ДНК исследуемого мутантного растения. Использование по крайней мере трех специфических праймеров позволяет контролируемо регулировать на величину шага размер фрагмента в процессе его амплификации и таким образом выделять его среди неспецифически амплифицирующихся фрагментов геномной ДНК. Таким образом удается амплифицировать короткие фрагменты ДНК (95-120 п.н.), примыкающие к инсерции.

2.2. Идентификация ранее не известных генов А. <ИаИапа

Определение нуклеотидного состава фрагментов ДНК вблизи инсерции, позволило нам с помощью компьютерных баз данных, доступных на специальных серверах (http://www.arabidopsis.org/;

Ьйр/ти1апизе.ок81а1е^и/; Шр/кагиБа-ог^р/; http://www.ncbi.nIm.nih.gol/), идентифицировать ряд генов, характеристики которых представлены в табл.11.

Таблица 11. Идентифицированные гены А. IИаИапа

№ линии Ген/Размер Описание продукта Структура гена Локализация/Ориентация инсерции

1 (137) Atlgl2860 4438 п.н. F-box домен; 2-членный домен-детерминанта внутриядерной локализации; «спмраль-петля-спираль» 5 экзонов 1-ый экзон

2 (27) At3g31320 1987 п.н. Белок неизвестен. Доменов нет 6 экзонов 1-ый экзон

3 (76) Atlg78950 9698 п.н. Оксидосквален-циклаза 33 экзона 32-ой экзон

4 (176) At2g09920 2500 п.н. Ретротранспо-зон Протяженный терминальный повтор Нет данных

5 (281) Atlgl5760 609 п.н. Белок неизвестен. Доменов нет 1 экзон 1-ый экзон

6 (Е1) AT5G67230 2202 п.н. Белок семейства 43 гликозил-трансфераз 3 экзона Инсерция за 200п.н. до старт-кодона. Энхансер направлен на старт-кодон

7 (Е4) AT1G68050 2214 п.н. Флавин-связьшающий, Келч-домен содержащий F -box белок 2 экзона Инсерция в середине 2-го экзона. Энхансер направлен на старт-кодон

8 (Е7) AT4g27260 2587 п.н. Белок вовлеченный в ауксяновый ответ и гомеостаз 3 экзона Инсерция за 450 п.н. до старт-кодона. Энхансер направлен в обратную сторону

9 (Е9) AT5G10080 2538 п.н. Белок семейства аспартилпротеаз 9 экзонов Инсерция за 400п.н. до старт-кодона. Энхансер направлен на старт-кодон

10 (ЕЮ) AT5G06700 2553 п.н. Белок неизвестен 5 экзонов Инсерция за 800 п.н. до старт-кодона. Энхансер направлен на старт-кодон

11 (El 2) AT3G15115 1498 п.н. Белок неизвестен 2 экзона Инсерция за 50 п.н. после стоп-кодона. Энхансер направлен на стоп-кодон

12 (E13) AT2G12740 Псевдоген семейства ретротранспозонов Джипси Нет данных Нет данных

13 (El 4) At3g30122 2367П.Н. Псевдоген Нет данных Инсерция в конце ОМ5. Энхансер направлен на промотер.

14 (El 5) AT5G02910 1957п.н. F-box белок схожий со специфической лиазой апуриновых сайтов рибосомальной РНК 3 экзона Инсерция в конце 1-ого экзона. Энхансер направлен на промотор.

15 (El 7) AT2G45750 2929п.н. Поедполагаемая метилтрансфераза 5 экзонов Инсерция в начале 1-ого экзона. Энхансер направлен на стоп-кодон.

16 (El 8) AT5G07010 1429п.н. и Сульфотрансфераза 1 экзон Инсерция в 800п.н. после старт-кодона. Энхансер направлен на старт-кодон.

17 (E20) AT1G05805 2920п.н. Белок семейства Basic helix-loop-helix (bHLH) 6 экзонов Инсерция в 5'-иТЯ. Энхансер направлен на старт-кодон

18 (E21) Atlg77880 393п.н. Пиклин-подобный F-box белок 1 экзон Инсерция за 1,8т.п.н. до старт-кодона. Энхансер направлен на старт-кодон.

19 (E23) AT4G02733 1340П.Н. Пиклин-подобный F-box белок 5 экзонов Инсерция нескольких нуклеотидах до старт-кодона. Энхансер направлен на стоп-кодон

20 (E30) AT1G06840 5626n.H. Предполагаемая лейцин богатая трансмембранная протеин-киназа 20 экзонов Инсерция за 50 п.н. до старт-кодона. Энхансер направлен на старт-кодон предыдущего гена А^06830 (Ь21Р транскрипционный фактор), который расположен в 1 7 т.п.н.

21 (E31) AT4G28500 1253П.Н. Белок семейства NAM 3 экзона Инсерция за ЮОп.н. до старт-кодона. Энхансер направлен на старт-кодон

22 (E35) Центромерн ый район 4ой хромосомы

23 (E37) At2g25730 15979п.н. Белок неизвестен 32 экзона Инсерция в 8-ом интроне. Энхансер направлен на старт-кодон.

24 (E40) ATI G56690 2115п.н. Белок, содержащий пентатрикопептид (PPR) 1 экзон Инсерция за 200 п.н. до старт-кодона. Энхансер направлен на старт-кодон

25 (Е78) АТЮ33390 4371 п.н. БЕАН-Ьох АТФ-зависимая хеликаза 8 экзонов Инсерция за 530 п.н. до старт-кодона. Энхансер направлен на старт-кодон

26 (Е134) АТ5013760 2922 п.н. Неизвестный белок содержащий богатый пролином домен 5 экзонов Энхансер расположен за 270 п.н. до старт- кодона и направлен на него

Таким образом, нами было идентифицировано 26 генов. В настоящее время нами идентифицировано 26 генов А. МаНапа.

В их число входят пять генов, содержащих Р-Ьох домены, три псевдогена типа ретротранспозонов. Четыре идентифицированных гена кодируют неизвестные белки, не несущие никаких доменов, пятый ген кодирует неизвестный белок, содержащий богатый пролином домен. 2.3. Генетический и фенотипический анализ мутантов А. ЛаНапа с измененной морфологией

В этом разделе работы представлены результаты, полученные для ряда наиболее подробно изученных мутантов.

Так, на примере рецессивного летального мутанта гипокотиля А. &аИапа была установлена функциональная значимость ретротранспозонов. Ген At2g09920, инсерция в который привела к возникновению мутантного фенотипа, представляет собой ретротранспозон, несущий в своей структуре один протяженный терминальный повтор.

Особый интерес представляет ген Atlgl28б0, инсерция Т-ДНК в который приводит к возникновению некрозов семядолей на ранних стадиях развития растений. В его структуру входит Р-Ьох домен, играющий ключевую роль в распознавании белков в процессе их убиквитин-зависимого протеолиза, а также транскрипционный активатор типа «спираль-петля-спираль», который полностью гомологичен таковому в гене 1СЕ1 - одном из ключевых регуляторов ответа на холодовой стресс. Эти данные предполагают, что ген А1^12860 включен в ответ на холодовой стресс у А. йаИапа. Таким образом, катаболическая функция гена Atlgl2860 связана с

контролем развития семядолей, в то время как его анаболическая функция связана с контролем ответа на холодовой стресс.

Потеря функции гена А1^78950, относящегося к семейству генов, кодирующих ферменты класса оксидоскваленциклаз, катализирующих превращение (8)-2,3-эпоксисквалена в стерольные и тритерпеновые соединения, обусловливает морфологически регистрируемые дефекты развития проростков (рецессивный летальный проросток).

Установлено, что суперэкспрессия гена /Ш^ЗЗЗРО, кодирующего АТФ-зависимую хеликазу из семейства БЕАБ-Ьох белков, играющих важную роль в метаболизме РНК, и гена At5gl0080, кодирующего белок А1 класса аспартил протеаз, обусловливает изменения структуры стебля. В случае гена А1^33390 повышение экспрессии приводит к образованию фасциированного стебля (рис. 9), а в случае гена At5gl0080 - к замедленному темпу развития растений, изменению их окраски, уменьшению габитуса и понижению фертильности.

Суперэкспрессия гена Аг^33390, кодирующего АТФ-зависимую хеликазу из семейства БЕАБ-Ьох белков, играющих важную роль в метаболизме РНК, и гена At5gl0080, кодирующего белок А1 класса аспартил протеаз, обусловливает изменения структуры стебля. В случае гена Л^ЗЗЗРО повышение экспрессии приводит к образованию фасциированного стебля, а в случае гена At5gl0080 - к замедленному темпу развития растений, изменению их окраски, уменьшению габитуса и понижению фертильности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

и др., центр тяжести в решении этой проблемы сместился в область определения функциональной значимости уже расшифрованных нуклеотидных последовательностей генома. При этом в случае растений и, в первую очередь A. thaliana, основные успехи связаны с созданием представительных коллекций инсерционных мутантов. И в этой связи разработка методологии получения инсерционных мутантов и определения нуклеотидной последовательности генов, инсерция в которые обусловливает мутантный фенотип, являлась одним из центральных и актуальных направлений развития генетики высших растений.

Следует, однако, сказать, что принципиальная возможность идентификации нуклеотидной последовательности генов, ответственных за конкретные признаки, появилась в конце 70-х годов прошлого столетия после разработки Коэном и др. методологии клонирования фрагментов ДНК генома. Это привело к созданию полноразмерных клонотек ДНК генома самых разнообразных видов про- и эукариот с целью их скрининга с помощью меченых зондов. Основная трудность при реализации этого подхода была связана с получением специфических зондов для скрининга. Работая в этом направлении, в конце 80-х годов прошлого столетия мы столкнулись с проблемой специфичности гетерологичных зондов. Оказалось, что фрагменты генома цианобактерии Synechocystis РСС 6803, несущие гены фотосинтеза, показывали гомологию с хлоропластным и ядерным геномами A. thaliana и P. sativum. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК зондов позволил получить ряд приоритетных результатов. Во-первых, были идентифицированы два новых гена, включенные в контроль фотосинтеза у цианобактерии Synechocystis РСС 6803. Во-вторых, было показано, что существование «смешанной» ДНК связано с наличием нескольких семейств нуклеотидных последовательностей размером 17-32 п.н. По крайней мере некоторые из этих последовательностей консервативны, поскольку они присутствуют в геноме и других видов - Synechocystis РСС 6803, Drosophila melanogaster, Mus musculus, Homo sapiens.

После открытия явления РНК - направленного замолкания генов стала проясняться и функциональная роль такого рода последовательностей, связанная с негативной, а в некоторых случаях и с позитивной (Check, 2007; Li et al., 2006) регуляцией генной активности в процессе развития растений. Однако их наличие в геноме существенным образом снижало специфичность гетерологичных зондов, которые мы использовали при скрининге созданных геномных клонотек A. thaliana и Р. sativum.

В этой связи с конца 80-х годов для решения проблемы идентификации структуры и функции генов высших растений нами начал осуществляться другой подход, связанный с развитием методов массового получения инсерционных мутантов у А. thaliana. Был разработан эффективный метод агробактериальной трансформации, связанный с использованием ультразвука и окиси алюминия при обработке семян А. thaliana перед их сокультивированием с агробактериями. Для получения «нокаут» - мутаций было создано семейство векторов, в Т-ДНК которых введены экспрессирующиеся в клетках Е. coli гены резистентности к антибиотикам с целью проведения селекции клонированных мутантных генов. Для получения и отбора мутантов А. thaliana с обусловленным суперэкспрессией генов фенотипом, была разработана система, включающая в себя вектор для индукции инсерционных мутантов и тестерную линию А. thaliana, в геном которой введен ген ere. Продукт гена ere осуществляет специфическую рекомбинацию по так называемым lox - сайтам, окаймляющим сильный конститутивный промотор. В результате, при скрещивании инсерционных мутантов с тестерной линией происходит удаление промотора из структуры Т-ДНК и исчезновение мутантного фенотипа, если он обусловлен суперэкспрессией гена. Разработка метода компенсации гормонального дисбаланса для A. thaliana обеспечила проведение фенотипического, генетического и молекулярно-генетического анализа ряда условно летальных мутантов и мутантов со сниженной фертильностью. Все это дало нам

возможность получить коллекции трансгенных линий растений и инсерционных мутантов A. thaliana.

Успехи в развитии методологии идентификации генов высших растений с использованием инсерционного мутагенеза в значительной степени связаны с выбором в качестве экспериментального объекта A, thaliana. Компактность его генома позволила с высокой эффективностью индуцировать инсерционные мутанты, которые, как мы уже говорили, являются в настоящее время базой для исследования функции генов.

ВЫВОДЫ

1. Показано существование последовательностей ДНК, представленных одновременно в ядерном и хлоропластном геномах A. thaliana. Природа такого рода «смешанной» ДНК связана с наличием нескольких семейств консервативных нуклеотидных последовательностей размером 17-32 п.н., которые идентифицированы также в геномах млекопитающих, насекомых и цианобактерий.

2. При анализе фрагментов ДНК Synechocystis РСС 6803, использовавшихся в качестве зондов при скрининге геномной клонотеки A. thaliana, идентифицированы новые гены, участвующие в контроле фотосинтеза. Это ген suhB, кодирующий экстрагенный супрессор SuhB из семейства инозитол монофосфатаз, и ген petF, продуктом которого является ферредоксин.

является ее отличительным признаком, который важен для дискриминации ДНК из разных геномов растительной клетки.

4. Развита методология получения и отбора инсерционных мутантов А. ¡ИаНапа, а также локализации инсерции в геноме. Она включает в себя разработку эффективной системы агробактериальной трансформации, конструирование векторов для индукции «нуль» - мутантов и мутантов, фенотип которых обусловлен суперэкспрессией генов, и применение технологии ПЦР-анализа для локализации инсерции. С использованием этой методологии созданы коллекции трансгенных растений и инсерционных мутантов А. ЛаПапа с измененной морфологией.

5. Разработан метод компенсации гормонального дисбаланса для А. ЖаИапа, что обеспечило проведение фенотипического, генетического и молекулярно-генетического анализа условно летальных мутантов и мутантов со сниженной фертильностью.

6. Установлена функциональная значимость ретротранспозонов на примере рецессивного летального мутанта гипокотиля А. ХкаМапа. Ген А¡2^0992О, инсерция в который привела к возникновению мутантного фенотипа, представляет собой ретротранспозон, несущий в своей структуре один протяженный терминальный повтор.

7. Идентифицированы функции гена Atlgl28б0. В его структуру входит Б-Ьох домен, играющий ключевую роль в распознавании белков в процессе их убиквитин-зависимого протеолиза, а также транскрипционный активатор типа «спираль-петля-спираль». Показано, что катаболическая функция гена

связана с контролем развития семядолей, в то время как его анаболическая функция связана с контролем ответа на холодовой стресс.

8. Показано, что потеря функции гена А1^78950, относящегося к семейству генов, кодирующих ферменты класса оксидоскваленциклаз, катализирующих превращение (8)-2,3-эпоксисквалена в стерольные и тритерпеновые

соединения, обусловливает морфологически регистрируемые дефекты развития проростков.

9. Установлено, что суперэкспрессия гена Atlg33390, кодирующего АТФ-зависимую хеликазу из семейства DEAD-box белков, играющих важную роль в метаболизме РНК, и гена AtSg10080, кодирующего белок А1 класса аспартил протеаз, обусловливает изменения структуры стебля. В случае гена Atlg33390 повышение экспрессии приводит к образованию фасциированного стебля, а в случае гена At5gl0080 - к замедленному темпу развития растений, изменению их окраски, уменьшению габитуса и понижению фертильности.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мазин A.JL, Бойко JI.M., Огаркова О.А.. Ванюшин Б.Ф. Потеря динуклеотидов CpG из ДНК. VI. Метилирование генов митохондрий и хлоропластов // Молекуляр. Биол. 1988. Т. 22. Вып. 6. С. 1688-1696.

2. Ванюшин Б.Ф., Александрушкина Н.И., Огаркова О.А. Цитокинины заметно не изменяют метилирование адениновых остатков ДНК в культуре клеток Escherichia coli В II Биохимия. 1989. Т. 54. Вып. 10. С. 1666-1672.

3. Ванюшин Б.Ф., Огаркова О.А. Отсутствие содержащих метилированный аденин Gm6АТС-последовательностей в хлоропластных и ядерных ДНК бобовых растений // Биохимия. 1990. Т. 55. Вып. 5. С. 946-951.

4. Лысенко Е.С., Гапеева Т.А., Ермакова С.Ю., Еланская И.В., Огаркова О.А.. Тарасов В.А. Гомология клонированных фрагментов ДНК цианобактерии Synechocystis 6803 с хлоропластной и ядерной ДНК высших растений //Генетика. 1991. Т. 27. № 4. С. 581-588.

5. Тарасов В.А., Огаркова О.А.. Денисенко Ю.В. Гомология между ядерной и хлоропластной ДНК у некоторых видов двудольных растений // Сборник докладов VII Всесоюзного симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов». М. 1990. С. 140-151.

6. Котлярова Е.Г., Денисенко Ю.В., Огаркова O.A.. Тарасов В.А. Гомология между хлоропластной и ядерной ДНК различных видов сем. Fabaceae и Arabidopsis thaliana II Генетика. 1992. T. 29. № 9. С. 5-10.

7. Лысенко Е С., Огаркова O.A.. Тарасов В.А. Локализация клонированных генов фотосинтеза цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 в ядерном и хлоропластной геномах высших растений // Генетика. 1993. Т. 29. № 2. С. 348-353.

8. Лысенко Е.С., Огаркова O.A.. Еланская Е.В., Тарасов В.А., Шестаков C.B. Новая открытая рамка считывания в геноме цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803II Генетика. 1995. Т. 31. № 2. С. 162-169.

9. Гапеева Т.А., Огаркова O.A.. Тарасов В.А., Волотовский И.Д. Новые вектора для трансформации двудольных растений // Генетика. 1995. Т. 31. №8. С. 1085-1091.

10. Огаркова O.A.. Хадеева Н.В., Гордон Н.Ю., Гапеева Т.А., Тарасов В.А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: получение морфологических мутантов // Генетика. 1997. Т. 33. № 2. С. 223-228.

11. Огаркова O.A.. Хадеева Н.В., Яковлева Е.Ю., Тарасов В.А. Трансгенные линии табака для регистрации индуцированной рекомбинации по прямым повторам ДНК //Генетика. 1998. Т. 34. № 3. С. 435-437.

12. Ежова Т.А., Огаркова O.A.. Солдатова О.П. Инсерционный мутагенез у растений // Методическое пособие к практикуму по генетики растений на кафедре генетики и селекции Биологического факультета МГУ. Москва. ДИАЛОГ МГУ. 1997.43 С.

13. Томилов А.А, Томилова Н.Б., Огаркова O.A.. Тарасов В.А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: Увеличение эффективности трансформации прорастающих семян в результате предобработки их ультразвуком // Генетика. 1999. Т. 35. № 9. С. 1214-1222.

14. Tomilov A.A., Tomilova N.B., Oearkova O.A.. Tarasov V.A. Insertional mutagenesis in Arabidopsis thaliana-. Presonication of germinating

seeds increases the efficiency of their transformation // http://www.shef-ac-press.co.uk/subis

15. Томилов А.А, Томилова Н.Б., Огаркова O.A.. Тарасов В.A. Идентификация гена, включенного в контроль развития корневой системы у Arabidopsis thaliana // Генетика. 2001. Т. 37. № 1. С. 36-45

16. Томилова Н.Б., Томилов А.А, Огаркова О.А.. Тарасов В.А. Идентификация гена, мутация в котором обуславливает возникновение некрозов семядолей при развитии проростков Arabidopsis thaliana II Генетика. 2001. Т. 37. №1. С. 36-45.

17. Огаркова О.А.. Томилова Н.Б., Томилов А.А, Тарасов В.А. Создание коллекции морфологических инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana И Генетика. 2001. Т. 37. № 8. С. 1081-1087.

18. Томилова Н.Б., Томилов А.А., Огаркова О.А.. Солдатова О.П., Тарасов В.А. Гормон-зависимые инсерционные мутанты Arabidopsis thaliana со сниженной жизнеспособностью и фертильностью. Генетика. 2001. Т. 37. №9. С.1251-1257.

19. Ezhova Т.A., Soldatova О.Р., Ondar U.N., Penin A.A., Qgarkova О.А., Tomilov А.А., Tomilova N.B., Tarasov V.A. Genetic collection of Arabidopsis thaliana development mutants. In: Internat. Conf. "Genetic collections, isogenic and alloplasmic lines". Novosibirsk. Russia. 2001. C. 149153.

20. Ежова T.A., Лебедева O.B., Огаркова O.A.. Пенин А.А., Солдатова О.П., Шестаков С.В. Arabidopsis thaliana - модельный объект генетики растений // Учебно-методическое пособие по генетике растений. Москва. МАКС Пресс. 2003. 220 С.

21. Огаркова О.А.. Томилов А.А., Томилова Н.Б., Тарасов В.А. Спасение инсерционных рецессивных летальных мутантов Arabidopsis thaliana II Онтогенез. 2004. Т.35. №.3. С.220-228.

22. Фурсова О.В., Погорелко Г.В., Авсюк А.Ю., Томилова Н.Б., Томилов А.А., Тарасов В.А., Огаркова О.А. Идентификация потенциального

гена - регулятора развития семядолей у проростков Arabidopsis thalianaH Докл. Акад. Наук. 2004. Т. 395. №. 5. С. 1-3.

23. Oearkova О.А.. Tomilov А.А., Tomilova N.B., Pogorelko G.V., Fursova О.V., Tarasov V.A. Insertional mutagenesis in Arabidopsis thaliana : Collection of morphological insertion mutants // In: Proceedings of international scientific practical conference "Biotechnology of vegetable, flower and not widely spread crops". Moscow. 2004. P. 138-141.

24. Oearkova O.A.. Fursova O.V., Tomilova N.B., Tomilov A.A., Pogorelko G.V., Avsiuk A.Yu., Tarasov V.A. Insertional mutagenesis in Arabidopsis thaliana : Identification of a novel gene implicated in cotyledon development // In: Proceedings of international scientific practical conference "Biotechnology of vegetable, flower and not widely spread crops". Moscow. 2004. P. 142-145.

25. Огаркова O.A.. Томилов А.А., Томилова Н.Б. Тарасов В.A. Идентификация гена, мутация в котором приводит к возникновению рецессивных летальных проростков у Arabidopsis thaliana И Онтогенез. 2005. Т. 36. №. 3. С. 222-224.

26. Огаркова О.А.. Томилов А.А., Томилова Н.Б., Тарасов В.А. Идентификация гена, мутация в котором приводит к тропизму гипокотиля у Arabidopsis thaliana И Генетика. 2005. Т. 41. № 3,. С. 427-429.

27. Огаркова О.А.. Томилов А.А., Томилова Н.Б., Погорелко Г.В.,Тарасов В.А. Идентификация гена, мутация в котором приводит к морфологическим изменениям гипокотиля у Arabidopsis thaliana // Генетика. 2005. Т. 41. №2. С. 166-170.

28. Погорелко Г.В., Фурсова О.В., Огаркова О.А.. Тарасов В.А. Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений //Генетика.2007.Т.43.№2.С. 194-201.

29. Pogorelko G.V., Fursova O.V., Oearkova О.А., Tarasov V.A. A new technique for activation tagging in Arabidopsis II Gene. 2008. V. 44. P. 67-75.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ФС - фотосинтез

ФС1 - фотосистема 1

ФС2 - фотосистема 2

ФС" фенотип - отсутствие способности к фотоавтотрофному росту

я ДНК - ядерная ДНК

хпДНК - хлоропластная ДНК

мтДНК - митохондриальная ДНК

п.н.(пн, bp) - пара нуклеотидов

т.п.н. (тпн) - тысяча пар нуклеотидов

ИМК - у-индолил-3-масляная кислота

НУК - а-нафтилуксусная кислота

6-БАП - 6-бензиламинопурин

кДа (ГО) - килодальтон

GUS - ß-глюкуронидаза

HDGS - зависимое от гомологии замолкание генов

PTGS - посттранскрипционное замолкание генов

TGS - транскрипционное замолкание генов

siRNA - малые однонитевые РНК

RNAi - РНК - интерференция

RISC - полибелковый комплекс, в который кроме протеинов входит siRNA

dsRNA - двунитевая РНК

RdDM - РНК направленное метилирование ДНК

RdDP - РНК направленная РНК-полимераза

miRNA - микроРНК

Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического ф-та МГУ Тираж ¡03 экз. Заказ №ЗЛ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Огаркова, Ольга Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1. Актуальность темы.

2. Цели и задачи исследований.

3. Научная новизна.

4. Научно-практическая значимость работы.

ЧАСТЬ 1. ПОЛУЧЕНИЕ И СКРИНИНГ ГЕНОМНЫХ КЛОНОТЕК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

ГЛАВА 1. Введение в проблему.

ГЛАВА 2. Идентификация гена suhB и его локализация в геном

Arabidopsis thaliana.

2.1. Стратегия и первые успехи в клонировании индивидуальных генов высших растений.

2.2. Особенности фотосинтеза у высших растений и цианобактерий.

2.3. Характеристика фотосинтетических генов цианобактерий как гетерологичных зондов.

2.3.1. Предпосылки.

2.3.2. Гибридизация с ядерной и хлоропластной ДНК P. sativum и

A. thaliana.

2.3.3. Анализ возможности сцепления в геноме цианобактерий генов, представленных у растений в ядерном и хлоропластном геномах.

2.4. Скрининг клонотеки генома A. thaliana.

2.4.1. Общие характеристики A. thaliana.

2.4.2. Особенности строения генома A. thaliana.

2.4.3. Создание клонотеки генома A. thaliana.

2.4.4. Скрининг созданной клонотеки генома A. thaliana.

2.5. Идентификация гена suhB.

ГЛАВА 3. Исследование гомологии между ядерной и хлоропластной ДНК различных видов семейства Fabaceae и A. thaliana.

3.1. Происхождение хлоропластов и митохондрий.

3.2. Существование «смешанной» ДНК.

3.3. Особенности организации хпДНК.

3.3.1. Энзиматическое метилирование.

3.4. Скрининг клонотеки яДНК A. thaliana.

3.5. Скрининг генома хпДНК.

3.6. Клонирование и молекулярный анализ последовательности хпДНК

A. thaliana, гомологичной 0.7 т.п.н.- фрагменту хпДНК P. sativum.

3.7. Компьютерный анализ 0.7 т.п.н.- фрагмента хпДНК A. thaliana.

3.8. Уровень метилирования геномов хлоропластов и митохондрий у некоторых видов двудольных растений.

ГЛАВА 4. Взгляд на использование методологии гибридизации при идентификации новых генов двадцать лет спустя.

ЧАСТЬ 2. ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ИНСЕРЦИОННЫХ

МУТАНТОВ ARABIDOPSIS THALIANA.

ГЛАВА 1. Мобильные элементы генома.

1.1. История открытия.

1.2. Контролирующие элементы растений.

1.3. IS — последовательности и транспозоны.

1.4. Ti и Ri плазмиды.

ГЛАВА 2. Коллекции инсерционных мутантов.

2.1. Создание векторных системы для инсерционного мутагенеза

А. thaliana.

2.1.1. Векторы для получения инсерционных мутантов и клонирования мутантных генов.

2.1.2. Конструирование бинарных векторов для агробактериальной трансформации A. thaliana.

2.1.3. Конструирование новой системы векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений.

2.2. Системы генетической трансформации у A. thaliana.

2.3. Разработка эффективной системы генетической трансформации у A. thaliana.

2.4. Отбор растений - трансформантов A. thaliana.

2.5. Создание коллекции морфологических мутантов A. thaliana.

2.5.1. Существующие в мире коллекции инсерционных Т-ДНК мутантов A. thaliana.

2.5.2. Получение коллекции растений - трансформантов A. thaliana.

2.5.3. Отбор морфологических мутантов.

2.5.4. Генетический анализ полученных морфологических мутантов

A. thaliana.

2.5.5. Отбор доминантных морфологических мутантов A. thaliana в Т2-поколении.

2.5.6. Линии морфологических инсерционных мутантов A. thaliana, отобранные в ТЗ-поколении.

2.6. Использование экзогенных фитогормонов для спасения условно летальных мутантов A. thaliana и мутантов со сниженной жизнеспособностью и фертильностью.

2.6.1. Подбор гормональных сред для спасения летальных инсерционных мутантов A. thaliana и мутантов со сниженной жизнеспособностью и фертильностью.

2.6.1.1. Индукция и формирование каллуса.

2.6.1.2. Индукция корней.

2.6.2. Спасение доминантных условно летальных мутантов A. thaliana.

2.6.3. Спасение рецессивных условно летальных мутантов.

ГЛАВА 3. Локализация инсерций и идентификация генов A. thaliana, маркированных инсерцией Т-ДНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методологии идентификации функции генов Arabidopsis thaliana"

1. Актуальность темы

Проблема гена, его структурной и функциональной организации являлась центральной на всем протяжении существования генетики как экспериментальной науки. После фундаментальных открытий, касающихся роли ДНК как материального носителя наследственности, расшифровки ее структуры и генетического кода, принципиальным шагом в решении этой проблемы стало создание технологии клонирования фрагментов ДНК самых разнообразных видов. Это открыло широкие перспективы для перехода исследований гена на молекулярный уровень. До этого единственная возможность исследования природы гена была связана с использованием традиционных генетических методов и методов мутационного анализа.

Трудно переоценить значимость открытия возможности клонирования отдельных генов. В частности, это открытие привело к созданию генной инженерии, расшифровке нуклеотидных последовательностей геномов целого ряда видов, включая человека. Последнее событие произошло в 2000 году и на его фоне достаточно громко прозвучало и другое событие - в этом же году впервые была расшифрована полная нуклеотидная последовательность генома одного из видов высших растений, а именно Arabidopsis thaliana.

Необходимость детального изучения геномов наиболее важных в хозяйственном отношении растений была подчеркнута еще в 1997 году на международном совещании по геномике растений в США. Однако функции уже расшифрованных нуклеотидных последовательностей в большинстве случаев остаются невыясненными. В результате основная проблема генетики сегодня связана с выяснением функции генов, нуклеотидный состав которых известен.

Следует отметить, что число локализованных, клонированных и секвенированных генов высших растений на порядок меньше, чем у животных, в первую очередь у млекопитающих, в том числе у человека. Эта ситуация была характерна для конца 90-х годов прошлого столетия и она сохраняется до настоящего времени. Вместе с тем, высшие растения являются именно теми видами, которые позволяют в полной мере реализовать идеи и методы генной инженерии на пути создания методологии направленной модификации геномов для получения высших растений с заданным набором хозяйственно - полезных признаков.

При реализации этого подхода ключевую роль играет модельный объект высших растений Arabidopsis thaliana - первый представитель высших растений, для которого осуществлено определение полной нуклеотидной последовательности генома. Перспективы использования A. thaliana в качестве основного источника генов для модификации хозяйственно -ценных культур очевидны (Flavell R.B. Crop Improvement - The Role of Discoveries in Model Species. Plant & Animal Genomes XIII Conference. January 15-19, 2005. San Diego, CA).

Исходя из всего вышесказанного, в ходе выполнения настоящей работы нами планировалось решить ряд последовательных задач, каждая из которых является необходимой для достижения основной цели и имеет самостоятельное значение.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Огаркова, Ольга Александровна

176 ВЫВОДЫ

2. При анализе фрагментов ДНК Synechocystis РСС 6803, использовавшихся в качестве зондов при скрининге геномной клонотеки А. thaliana, идентифицированы новые гены, участвующие в контроле фотосинтеза. Это ген suhB, кодирующий экстрагенный супрессор SuhB из семейства инозитол монофосфатаз, и ген petF, продуктом которого является ферредоксин.

3. Впервые показано различие в протекании процесса энзиматического метилирования ДНК в ядерном и хлоропластном геномах P. sativum и А. thaliana. Установлено, что хлоропластная ДНК растений либо не метилирована совсем, либо метилирована в очень малой степени. Это является ее отличительным признаком, который важен для дискриминации ДНК из разных геномов растительной клетки.

4. Развита методология получения и отбора инсерционных мутантов А. thaliana, а также локализации инсерции в геноме. Она включает в себя разработку эффективной системы агробактериальной трансформации, конструирование векторов для индукции «нуль» - мутантов и мутантов, фенотип которых обусловлен суперэкспрессией генов, и применение технологии ПЦР-анализа для локализации инсерции. С использованием этой методологии созданы коллекции трансгенных растений и инсерционных мутантов A. thaliana с измененной морфологией.

5. Разработан метод компенсации гормонального дисбаланса для А. thaliana, что обеспечило проведение фенотипического, генетического и молекулярно-генетического анализа условно летальных мутантов и мутантов со сниженной фертильностью.

6. Установлена функциональная значимость ретротранспозонов на примере рецессивного летального мутанта гипокотиля A. thaliana. Ген At2g09920, инсерция в который привела к возникновению мутантного фенотипа, представляет собой ретротранспозон, несущий в своей структуре один протяженный терминальный повтор.

7. Идентифицированы функции гена Atlgl2860. В его структуру входит F-box домен, играющий ключевую роль в распознавании белков в процессе их убиквитин-зависимого протеолиза, а также транскрипционный активатор типа «спираль-петля-спираль». Показано, что катаболическая функция гена Atlgl2860 связана с контролем развития семядолей, в то время как его анаболическая функция связана с контролем ответа на холодовой стресс.

8. Показано, что потеря функции гена Atlg78950, относящегося к семейству генов, кодирующих ферменты класса оксидоскваленциклаз, катализирующих превращение (8)-2,3-эпоксисквалена в стерольные и тритерпеновые соединения, обусловливает морфологически регистрируемые дефекты развития проростков.

9. Установлено, что суперэкспрессия гена Atlg33390, кодирующего АТФ-зависимую хеликазу из семейства DEAD-box белков, играющих важную роль в метаболизме РНК, и гена At5gl0080, кодирующего белок А1 класса аспартил протеаз, обусловливает изменения структуры стебля. В случае гена Atlg33390 повышение экспрессии приводит к образованию фасциированного стебля, а в случае тепа. At5g10080 - к замедленному темпу развития растений, изменению их окраски, уменьшению габитуса и понижению фертильности.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Мазин A.JI, Бойко JI.M, Огаркова О.А, Ванюшин Б.Ф. Потеря динуклеотидов CpG из ДНК. VI. Метилирование генов митохондрий и хлоропластов//Молекуляр. Биол. 1988. Т. 22. Вып. 6. С. 1688-1696.

2. Ванюшин Б.Ф, Александрушкина Н.И, Огаркова О.А. Цитокинины заметно не изменяют метилирование адениновых остатков ДНК в культуре клеток Escherichia coli ВII Биохимия. 1989. Т. 54. Вып. 10. С. 1666-1672.

3. Ванюшин Б.Ф, Огаркова О.А. Отсутствие содержащих метилированный аденин От6АТС-последовательностей в хлоропластных и ядерных ДНК бобовых растений // Биохимия. 1990. Т. 55. Вып. 5. С. 946-951.

4. Лысенко Е.С, Гапеева Т.А, Ермакова С.Ю, Еланская И.В, Огаркова О.А, Тарасов В.А. Гомология клонированных фрагментов ДНК цианобактерии Synechocystis 6803 с хлоропластной и ядерной ДНК высших растений // Генетика. 1991. Т. 27. № 4. С. 581-588.

5. Тарасов В.А, Огаркова О.А, Денисенко Ю.В. Гомология между ядерной и хлоропластной ДНК у некоторых видов двудольных растений // Сборник докладов VII Всесоюзного симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов». М. 1990. С. 140-151.

6. Котлярова Е.Г, Денисенко Ю.В, Огаркова О.А, Тарасов В.А. Гомология между хлоропластной и ядерной ДНК различных видов сем. Fabaceae и Arabidopsis thaliana. Генетика. 1992. Т. 29. № 9. С. 5-10.

7. Лысенко Е С, Огаркова О.А, Тарасов В.А. Локализация клонированных генов фотосинтеза цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 в ядерном и хлоропластной геномах высших растений // Генетика. 1993. Т. 29. №2. С. 348-353.

8. Лысенко Е.С., Огаркова О.А., Еланская Е.В., Тарасов В.А., Шестаков С.В. Новая открытая рамка считывания в геноме цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 II Генетика. 1995. Т. 31. № 2. С. 162-169.

9. Гапеева Т.А., Огаркова О.А., Тарасов В.А., Волотовский И.Д. Новые вектора для трансформации двудольных растений // Генетика. 1995. Т. 31. №8. С. 1085-1091.

10. Огаркова О.А., Хадеева Н.В., Гордон Н.Ю., Гапеева Т.А., Тарасов В.А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: получение морфологических мутантов // Генетика. 1997. Т. 33. № 2. С. 223-228.

11. Огаркова О.А., Хадеева Н.В., Яковлева Е.Ю., Тарасов В.А. Трансгенные линии табака для регистрации индуцированной рекомбинации по прямым повторам ДНК // Генетика. 1998. Т. 34. № 3. С. 435-437.

12. Ежова Т.А., Огаркова О.А., Солдатова О.П. Инсерционный мутагенез у растений // Методическое пособие к практикуму по генетики растений на кафедре генетики и селекции Биологического фукультета МГУ. Москва. ДИАЛОГ МГУ. 1997. 43 С.

13. Томилов А.А, Томилова Н.Б., Огаркова О.А., Тарасов В.А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: Увеличение эффективности трансформации прорастающих семян в результате предобработки их ультразвуком//Генетика. 1999. Т. 35. № 9. С. 12141222.

14. Tomilov A.A., Tomilova N.B., Ogarkova О.А., Tarasov V.A. Insertional mutagenesis in Arabidopsis thaliana: Presonication of germinating seeds increases the efficiency of their transformation // http://www.shef-ac-press.co.uk/subis

15. Томилов А.А, Томилова Н.Б., Огаркова О.А., Тарасов В.А. Идентификация гена, включенного в контроль развития корневой системы у Arabidopsis thaliana //Генетика. 2001. Т. 37. № 1. С. 36-45

16. Томилова Н.Б., Томилов А.А, Огаркова О.А., Тарасов В.А. Идентификация гена, мутация в котором обуславливает возникновение некрозов семядолей при развитии проростков Arabidopsis thaliana II Генетика. 2001. Т. 37. №1. С. 36-45.

17. Огаркова О.А., Томилова Н.Б., Томилов А.А, Тарасов В.А. Создание коллекции морфологических инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana //Генетика. 2001. Т. 37. № 8. С. 1081-1087.

18. Томилова Н.Б., Томилов А.А., Огаркова О.А., Солдатова О.П., Тарасов В.А. Гормон-зависимые инсерционные мутанты Arabidopsis thaliana со сниженной жизнеспособностью и фертильностью // Генетика. 2001. Т. 37. №9. С.1251-1257.

19. Ezhova Т.A., Soldatova О.Р., Ondar U.N., Penin A.A., Ogarkova О.А., Tomilov А.А., Tomilova N.B., Tarasov Y.A. Genetic collection of Arabidopsis thaliana development mutants // In: Internat. Conf. "Genetic collections, isogenic and alloplasmic lines". Novosibirsk. Russia. 2001. C. 149-153.

20. Ежова T.A., Лебедева O.B., Огаркова O.A., Пенин А.А., Солдатова О.П., Шестаков С.В. Arabidopsis thaliana — модельный объект генетики растений // Учебно-методическое пособие по генетике растений. Москва. МАКС Пресс. 2003. 220 С.

21. Огаркова О.А., Томилов А.А., Томилова Н.Б., Тарасов В.А. Спасение инсерционных рецессивных летальных мутантов Arabidopsis thaliana II Онтогенез. 2004. Т.35. №.3. С.220-228.

22. Фурсова О.В., Погорелко Г.В., Авсюк А.Ю., Томилова Н.Б., Томилов А.А., Тарасов В.А., Огаркова О.А. Идентификация потенциального гена - регулятора развития семядолей у проростков Arabidopsis thaliana II Докл. Акад. Наук. 2004. Т. 395. №. 5. С. 1-3.

23. Ogarkova О.А., Tomilov А.А., Tomilova N.B., Pogorelko G.Y., Fursova O.Y., Tarasov Y.A. Insertional mutagenesis in Arabidopsis thaliana : Collection of morphological insertion mutants // In: Proceedings of international scientific practical conference "Biotechnology of vegetable, flower and not widely spread crops". Moscow. 2004. P. 138-141.

24. Ogarkova O.A., Fursova O.V., Tomilova N.B., Tomilov A.A., Pogorelko G.V., Avsiuk A.Yu., Tarasov V.A. Insertional mutagenesis in Arabidopsis thaliana : Identification of a novel gene implicated in cotyledon development // In: Proceedings of international scientific practical conference "Biotechnology of vegetable, flower and not widely spread crops". Moscow.

2004. P. 142-145.

25. Огаркова O.A., Томилов А.А., Томилова Н.Б. Тарасов В.A. Идентификация гена, мутация в котором приводит к возникновению рецессивных летальных проростков у Arabidopsis thaliana II Онтогенез.

2005. Т. 36. №. 3. С. 222-224.

26. Огаркова О.А., Томилов А.А., Томилова Н.Б., Тарасов В.А. Идентификация гена, мутация в котором приводит к тропизму гипокотиля у Arabidopsis thaliana II Генетика. 2005. Т. 41. № 3,. С. 427429.

27. Огаркова О.А., Томилов А.А., Томилова Н.Б., Погорелко Г.В.,Тарасов В.А. Идентификация гена, мутация в котором приводит к морфологическим изменениям гипокотиля у Arabidopsis thaliana II Генетика. 2005. Т. 41. № 2. С. 166-170.

28. Погорелко Г.В., Фурсова О.В., Огаркова О.А., Тарасов В.А. Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений // Генетика. 2007. Т. 43. № 2. С. 194-201.

29. Pogorelko G.V., Fursova O.V., Ogarkova О.А., Tarasov V.A. A new technique for activation tagging in Arabidopsis II Gene. 2008. V. 44. P. 67-75.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На протяжении всего времени существования генетики как экспериментальной науки центральной проблемой была и остается проблема установления структурной организации и функциональной значимости генетических детерминант. После определения нуклеотидной последовательности геномов целого ряда видов организмов, включая человека и высшие растения, такие как арабидопсис, рис, подсолнечник, кукуруза, клен и др., центр тяжести в решении этой проблемы сместился в область определения функциональной значимости уже расшифрованных нуклеотидных последовательностей генома. При этом в случае растений и, в первую очередь A. thaliana, основные успехи связаны с созданием представительных коллекций инсерционных мутантов. И в этой связи разработка методологии получения инсерционных мутантов и определения нуклеотидной последовательности генов, инсерция в которые обусловливает мутантный фенотип, являлась одним из центральных и актуальных направлений развития генетики высших растений.

Основная трудность при реализации этого подхода была связана с получением специфических зондов для скрининга геномных клонотек. Работая в этом направлении, в конце 80-х годов прошлого столетия мы столкнулись с проблемой специфичности гетерольгичных зондов. Оказалось, что как фрагменты генома цианобактерии Synechocystis РСС 6803, несущие гены фотосинтеза, так и их субфрагменты, показывали гомологию с хлоропластным и ядерным геномами A. thaliana и P. sativum. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК зондов позволил получить ряд приоритетных результатов. Во-первых, были идентифицированы два новых гена, включенные в контроль фотосинтеза у цианобактерии Synechocystis РСС 6803. Это ген suhB, кодирующий экстрагенный супрессор SuhB из семейства инозитол монофосфатаз, и ген petF, продуктом которого является ферредоксин. Во-вторых, при анализе так называемой «смешанной» ДНК, представленной одновременно в ядерном и хлоропластном геномах А. thaliana, было показано, что ее существование связано с наличием нескольких семейств нуклеотидных последовательностей размером 17-32 п.н. По крайней мере некоторые из этих последовательностей консервативны, поскольку они присутствуют в геноме и других видов - Synechocystis РСС 6803, Drosophila melanogaster, Mus muscuius, Homo sapiens.

После открытия явления РНК - направленного замолкания генов стала проясняться и функциональная роль такого рода последовательностей, связанная с негативной, а в некоторых случаях и с позитивной (Check, 2007; Li et al, 2006) регуляцией генной активности в процессе развития растений. Однако их наличие в геноме существенным образом снижало специфичность гетерологичных зондов, которые мы использовали при скрининге созданных геномных клонотек A. thaliana и P. sativum.

В этой связи с конца 80-х годов для решения проблемы идентификации структуры и функции генов высших растений нами начал разрабатываться другой подход, связанный с развитием методов массового получения инсерционных мутантов у A. thaliana.

В результате был разработан эффективный метод агробактериальной трансформации, связанный с использованием ультразвука и окиси алюминия при обработке семян A. thaliana перед их сокультивированием с агробактериями. Для получения «нокаут» - мутаций было создано семейство векторов, в Т-ДНК которых введены экспрессирующиеся в клетках Е. coli гены резистентности к антибиотикам с целью проведения селекции клонированных мутантных генов. Для получения и отбора мутантов А. thaliana с обусловленным суперэкспрессией генов фенотипом, была разработана система, включающая в себя вектор для индукции инсерционных мутантов, Т-ДНК которого вблизи правого бордера содержит сильный конститутивный промотор, и тестерную линию A. thaliana, в геном которой введен ген сге. Продукт гена сге осуществляет специфическую рекомбинацию по так называемым lox — сайтам, окаймляющим сильный конститутивный промотор. В результате, при скрещивании инсерционных мутантов с тестерной линией происходит удаление промотора из структуры Т-ДНК и исчезновение мутантного фенотипа, если он обусловлен суперэкспрессией гена. Разработка метода компенсации гормонального дисбаланса для А. thaliana обеспечила проведение фенотипического, генетического и молекулярно-генетического анализа ряда условно летальных мутантов и мутантов со сниженной фертильностью. Все это дало нам возможность получить коллекции трансгенных линий растений и инсерционных мутантов A. thaliana.

Использование методов ПЦР для амплификации примыкающих к Т-области фрагментов ДНК, у которых лишь частично известна нуклеотидная последовательность, и компьютерных баз данных по нуклеотидной последовательности генома A. thaliana, позволило идентифицировать ряд генов, участвующих в контроле различных этапов развития растений. Так, впервые было показано, что интеграция инсерции в ретротранспозон (ген At2g09920) привела к возникновению рецессивного летального мутанта гипокотиля. Потеря функции гена Atlg78950, относящегося к семейству генов, кодирующих ферменты класса оксидоскваленциклаз, катализирующих превращение (8)-2,3-эпоксисквалена в стерольные и тритерпеновые соединения, обусловливает морфологически регистрируемые дефекты развития проростков. Суперэкспрессия гена Atlg33390, кодирующего АТФ-зависимую хеликазу из семейства DEAD-box белков, играющих важную роль в метаболизме РНК, и гена At5gl0080, кодирующего белок А1 класса аспартил протеаз, обусловливает изменения структуры стебля. В случае гена

Atlg33390 повышение экспрессии приводит к образованию фасциированного стебля, а в случае гена At5gl0080 - к замедленному темпу развития растений, изменению их окраски, уменьшению габитуса и понижению фертильности.

Особый интерес представляет ген Atlgl2860. Он содержит F-box домен, играющий ключевую роль в распознавании белков в процессе их убиквитин-зависимого протеолиза, а также транскрипционный активатор типа «спираль-петля-спираль», который полностью гомологичен таковому в гене ICE1, являющимся одним из ключевых регуляторов ответа на холодовой стресс. Эти данные предполагают, что ген Atlgl2860 включен в ответ на холодовой стресс у A. thaliana. Возможная функция гена A thaliana в качестве регулятора ответа на холодовой стресс подтверждена экспериментально. Показано, что конститутивная суперэкспрессия этого гена приводит к увеличению толерантности растений к кратковременному снижению температуры (Фурсова О.В., Огаркова О.А., Тарасов В.А., неопубликованные данные).

Успехи в разработке методологии идентификации генов высших растений с использованием инсерционного мутагенеза в значительной степени связаны с выбором в качестве экспериментального объекта А. thaliana. Компактность его генома позволила с высокой эффективностью индуцировать инсерционные мутанты, которые, как мы уже говорили, являются в настоящее время базой для исследования функции генов.

Разработка эффективной системы трансформации, а также системы векторов позволяет в полной мере использовать методологию «обратной» генетики у этого вида, связанную с получением не только так называемых «нокаут» мутантов, но и «нокдаун» мутаций (Voorhoeve, Agami, 2003). В последнем случае речь идет об идентификации функции генов, когда, в отличие от «прямой» генетики, вектор исследований меняется на противоположный — от направленного изменения функции гена к изменению фенотипа. Первые шаги при экспериментальной реализации этого подхода были сделаны на примере гена тимидин-киназы, когда в геном клеток, культивируемых in vitro, были введены генно-инженерные конструкции, экспрессирующие РНК в антисмысловой ориентации (Izant, Weintraub, 1984). Новые возможности для экспериментальной реализации идей «обратной» генетики связаны с открытием и исследованием механизма процессов РНК — направленного замолкания генов. В этом случае пусковым механизмом индукции процессов является наличие в клетке независимо от ее происхождения двунитевой молекулы РНК (dsRNA).

Выяснение природы инициирующего события для запуска процесса РНК — направленного замолкания генов открывает возможности экспериментально контролируемого направленного подавления функции отдельных генов у широкого круга организмов. Это в полной мере относится и к высшим растениям. В настоящее время показано, что введение в геном генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез РНК, структура которых содержит шпильки (hpRNA), с высокой эффективностью приводит к подавлению функций как эндо - , так и трансгенов, а также сопровождается увеличением резистентности к вирусам у высших растений (Sijen et al., 2001; Wang, Waterhouse, 2000; Chuang, Meyerowitz, 2000; Wesley et al., 2001).

В случае двудольных растений введение в геном трансгенов, при транскрипции которых образуются hpRNA, осуществляется как правило с помощью агробактериальной трансформации, когда эти трансгены находятся в структуре Т-ДНК. Примером векторов такого рода могут являться pHannibal и pKannibal (Westley et al., 2001), а также pHELLSGATE (Westley et al., 2001). На примере A. thaliana развита двухкомпонентная система для РНК — направленного транскрипционного замолкания генов и для метилирования ДНК промоторов (Aufsatz et al., 2002; Kanno et al., 2004).

Уже сейчас путем применения методов «обратной» генетики удалось выяснить функции тысяч генов у традиционно использующихся в генетике видов животных и растений, таких как дрозофила, нематода, арабидопсис, кукуруза (McGinnis et al., 2005). Одним из самых важных преимуществ, связанных с использованием методов «обратной» генетики, является возможность исследования функции генов у видов, для которых применение традиционных методов «прямой» генетики в настоящее время либо резко затруднено, либо вообще невозможно. Это в полной мере относится к высшим растениям, многие виды которых являются полиплоидами. Примером успешного использования методов «обратной» генетики для исследования функции генов может служить пшеница, которая является гексаплоидом (Travella et al., 2006).

Таким образом, A. thaliana в настоящее время представляет собой наиболее удобный объект для исследования функции генов высших растений, позволяющий в полной мере использовать методы как «прямой», так и «обратной» генетики. Эти его преимущества в значительной степени обусловлены развитием методов агробактериальной трансформации, системы векторов, которые дали возможность получить представительные коллекции инсерционных «нокаут» - мутантов, а также эффективно использовать экспериментальный метод получения «нокдаун» - мутантов, связанный со специфическим подавлением активности отдельных генов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Огаркова, Ольга Александровна, Москва

1. Антонов А.С. Основы геносистематики высших растений //

2. Наука/Интерпериодика». 2000. 135 С.

3. Бродский Л.И., Драчев А.Л., Леонтович A.M. Новый методмножественного выравнивания последовательностей биополимеров (программа Н-Align и пакета GenBee) // Биополимеры и клетка. 1991. Т. 7. №. 1.С. 14-22.

4. Ванюшин Б. Ф. Апоптоз у растений // Успехи Биол. Химии. 2001. Т. 41. С.3.38.

5. Гапеева Т.А., Огаркова О.А., Тарасов В.А. и др. Новые векторы длятрансформации двудольных растений //Генетика. 1995. Т. 31 (8). С. 1085-1091.

6. Гловер Д. Клонирование ДНК // М.: Мир, 1988. 538 С.

7. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженериярастений // М.: Мир. 1991. 544 С.

8. Ежова Т.А. Эпигенетика и онтогенез //Экологическая генетика. 2005. T.III.1. В. 2. С. 32.

9. Ежова Т.А., Солдатова О.П., Коф Э.М. Участие гена abruptus,контролирующего морфогенез Arabidopsis thaliana (L) Heynh в регуляции роста и морфогенеза в культуре in vitro II Физиол. Рас. 1999. Т. 46 (6). С. 865-870.

10. Ю.Зеленин А.В., Бадаева Е.Д., Муравенко О.В. Введение в геномику растений

11. Мол. Биол. 2001. Т. 35. С. 339-348. И.Зеленин А.В. Геном растений // Вестник РАН. 2003. Т. 73. С. 797-806.12.3енгбуш П.С. Молекулярная и клеточная биология // М.: Мир. 1982. Т. 1-3. 1149 С.

12. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.Ф. 5-метилцитозин в пиримидиновых последовательностях ДНК растений и животных: специфичность метилирования //Биохимия. 1981. Т. 46. С. 1458-1474.

13. Кленов М.С., Гвоздев В.А. Формирование гетерохроматина: роль коротких РЖ и метилирования ДНК // Биохимия. 2005. Т. 70 (11). С. 1445-1458.

14. Кокшарова О.А. Изучение мутантов цианобактерии Synechocystis РСС 6803 неспособных к фотоавтотрофному росту // В сб.: Проблемы современной биологии. Труды 17 Конференции молодых ученых МГУ. М. 1986. С. 40-44.

15. Кулаева О.Н. Хлоропласт и его полуавтономность в клетке //Соровский Образовательный Журнал. 1997. № 7. С. 2-9.

16. Лавров С.А., Кибонов М.В. Некодирующие РНК и структура хроматина //

17. Успехи Биол. Химии. 2007. Т. 47. С. 53-88.

18. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений //Генетика. 1998. Т.34 (2). С. 165-182.

19. Мазин A.JI, Гимадутдинов О.А., Туркин С.И. и др. Неэнзиматическое метилирование ДНК под действием S-аденозилметионина с образованием из цитозина остатков минорного тимина и 5-метилцитозина // Молекуляр. Биол. 1985. Т. 19. С. 903-914.

20. Макарова Ю.Ф, Крамеров Д.А. Некодирующие РНК // Биохимия. 2007. Т. 72 (11). С. 1427-1448.

21. Огаркова О.А, Хадеева Н.В, Гордон Н.Ю. и др. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: получение морфологических мутантов // Генетика. 1997. Т. 33 (2). С. 223-228.

22. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии // 1988. М.: Наука. 303 С.

23. Погорелко Г.В, Фурсова О.В, Огаркова О.А. и др. Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений // Генетика. 2007. Т. 43 (2). С. 194-201.

24. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии // 1999. С.-П.: СПбГТУ. С. 1081- 1087.

25. Сартбаев М.М, Тарасов В.А. Регенерация фертильных растений из трансформированных клеток незрелых зародышей Arabidopsis thaliana (L) Heynh //Генетика. 1992. Т. 28. № 3. С. 202-207.

26. Томилов А.А, Томилова Н.Б, Огаркова О.А. и др. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: увеличение эффективности трансформации прорастающих семян в результате предобработки их ультразвуком//Генетика. 1999. Т. 35 (9). С. 1214-1222.

27. Уоринг Ф, Филипс И. Рост растений и дифференцировка // М.: Мир. 1984. 512 С.3О.Чумаков М. И. Механизмы агробактериальной трансформации // Саратов: Слово. 2001.256 С.

28. Шестаков С.В, Кокшарова О.А, Грошев В.В. и др. Дефектные по фотосинтезу мутанты цианобактерии Synechocystis sp. 6803 II Биол. Науки. 1988. № 1. С. 75-80.

29. Шестаков С.В., Еланская И.В., Ермакова С.Ю. и др. Клонирование фрагментов ДНК, трансформирующих к фотоавтотрофности дефектные по фотосинтезу мутанты цианобактерии Synechocystis sp. 6803// Докл. АН СССР. 1989. Т. 308. С. 211.

30. Шестаков С.В. Молекулярная генетика фотосинтеза // СОЖ. 1998. № 9. С. 22-27.

31. Шестаков С.В. Функциональная геномика цианобактерий // Вестник ВОГиС. 2004. Т. 8 (2). С. 67-72.

32. Akama К., Junker V., Beier Н. Molecular cloning and characterization of a nuclear gene encoding a putative subunit of tRNA splicing endonuclease from Agrobacterium-rnQdiated plant transformation // Nucleic Acids Symp. Ser. 1999. V. 442. P. 261-262.

33. Alabadi D., Devoto A., Eckardt N.A. Arabidopsis research heats up in Seville // Plant Cell. 2002. V. 14 (9). P.1987-1994.

34. Altshul S.F., Madde T.L., Schaffer A.A. et al. Gapped BLAST and PSIBLAST: A new generation of protein database serch programs // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.

35. Alton N.K., Vapnek D. Nucleotide sequence analysis of the chloramphenicolresistance transposon Tn9 // Nature. 1979. V. 282. P. 864-869.

36. Alwen A., Moreno R.M.B., Vicente O. et al. Plant endogenous P-glucuronidase as a reporter gene in transgenic plants // Transgenic Research. 1992. V. 1. P. 63-70.

37. An G. High efficiency transformation of cultured tobacco cell // Plant. Physiol.1985. V. 79. P. 568-570.

38. An G., Watson B.D., Chiang C.C. Transformation of tobacco, tomato, potato and

39. Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector system // Plant Physiol. 1986. V.81.P. 241-245.

40. An G., Watson B.D., Stachel S. New cloning vehicles for transformation of higher plants // EMBO J. 1985. V. 4. P. 277-284.

41. Anandalakshmi R., Marathe R., Ge X., et al. A calmodulin-related protein that suppresses posttranscriptional gene silencing in plants // Science. 2000. V. 290. P. 142-144.

42. Andrade M.A., Gonzalez-Guzman M., Serrano R., et al. A combination of the F-box motif and ketch repeats defines a large Arabidopsis family of F-box proteins // Plant Mol. Biol. 2001. V. 46 (5). P. 603-614.

43. Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of theflowering plant Arabidopsis thaliana II Nature. 2000. V. 408. P. 796-815.

44. Aufrsatz W., Mette M.F., van der Winder J., et al. RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 16,499- 16,506.

45. Azpirpoz-Leehan R., FeldmannK.A. T-DNA mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth // Trends in Genet. 1997. V. 13 (4). P. 152-156.

46. Ayliffe M.A., Timmis J.N., Scott N.S. Homologies to chloroplast DNA in the nuclear DNA of number of Chenopod species // Theor. Appl. Genet. 1988. V. 75. P. 282-285.

47. Ayliffe M.A., Timmis J.N. Tobacco nuclear DNA contains long tracts of homology to chloroplast DNA // Theor. Appl. Genet. 1992. V. 85. P.229-238.

48. Barber J. Photosystem two // Biochem. Biophys. Acta. 1998. V. 1365. P. 269277.

49. Barber J. The structure of photosystem I // Nature Struct. Biol. 2001. V. 8. P. 577-579.

50. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function //Cell. 2004. V. 116. P. 2891-297.

51. Beclin С., Boutet S., Waterhouse P., et al. A branched pathway for transegene-induced RNA silencing in plants // Curr. Biol. 2002. 12. 684-688.

52. Blackwood E.M., Kadonaga J.T. Going the distance: a current view of enhancer action // Science. 1998. V. 281. P. 61-63.

53. Baulcombe D.C. RNA silencing in plants // Nature. 2004. V. 431. P. 356-363.

54. Bechtold N., Pelletier G. In planta Agrobacterium mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration I I Methods Mol. Biol. 1998. V. 82. P. 259-266.

55. Bent A.F. Arabidopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects for transformation of other species // Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 1540-1547.

56. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., et al. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference // Nature. 2001. V. 409. P. 363-366.

57. Bevan M., Barns W.M., Chilton M.D. Structure and transcription of nopaline synthasevgene region of T-DNA // Nucl. Acids Res. 1983. V. 11(2). P. 369379.

58. Blanc G., Hokamp K., Wolfe K.H. A recent polyploidy superimposed on older large-scale duplications in the Arabidopsis genome I I Genome Res. 2003. V. 13 (2). P. 137-144.

59. Blanchard J.L., Schmidt G.W. Pervasive migration of organellar DNA to the nucleus in plants // J. Mol. Evol. 1995. V. 41. P. 397-406.

60. Blum W., Hinsch K.D., Schultz G., et al. Identification of GTP-binding proteins in thq plasma membrane of hight plants // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 156(2). P. 954-959.

61. Bonhomme S., Horlow C., Vezon D., et al. T-DNA mediated disruption of essential gametophytic genes in Arabidopsis is unexpectedly rare and cannot be inferred from segregation distortion alone // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 260. P. 44-52.

62. Boogart P., Samallo J., Agsteribbe E. Similar genes for a mitochondrial ATPase subunit in the nuclear and mitochondrial genomes of Neurospora crassa/I Nature. 1982. V. 298. P. 187-189.

63. Borst P., Gziwell L.A., Groot G.S.P. Organelle DNA // Trends Biochem. Sci. 1984. V. 9. P. 128-130.

64. Bosher J.M., Labouesse M. RNA interference: genetic wand and genet watchdog // Nat. Cell Biol. 2000. V. 2. P. ЕЗ1-E36.

65. Bouchez D., Camilleri C., Caboshe M. A binary vector based on BASTA resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana И Paris: C.R. Acad. Sci. Sciences de la vie /Life sciences. 1993. V.316. P. 1188-1193.

66. Bouchez D., Hofte H. Functional genomics in plant // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 725-732.

67. Bowman J.L., Smyth D.R., Meyerowitz E.M. Genes directing flower development in Arabidopsis И Plant Cell. 1989. V. 1. P. 37-52.

68. Braun C.J., Levings C.S. III. DNA sequence homology between the maize mitochondrial and chloroplast genome // Maize Genet. Coop. Newslett. 1986. V. 60. P. 111.

69. Brunaud V., Balzergue S., Dubreucq В., et al. T-DNA integration into the Arabidopsis thaliana genome depends on sequences of pre-insertion sites // EMBO Reports. V. 3 (12). P. 1152-1157.

70. Caelles C., Ferrer A., Balcells L., et al. Isolation and structural characterization of cDNA encoding Arabidopsis thaliana 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase // Plant Mol. Biol. 1989. V.13 (6). P. 627-638.

71. Calos M.P., Miller J. Molecular sequences of deletion formation mediated by the transposon Tn9 // Nature. 1980a. V. 285. P. 3841.

72. Calos M., Miller J.H. Transposable elements // Cell. 1980b. V. 20. P. 579-595.

73. Cameron J.R., Loh E.Y., Davies R.W. Evidence for transposition of dispersedrepetitive families in yeast // Cell. 1979. V. 16. P. 739-751.

74. Campbell A., Berg D.F., Lederberg E. Nomenclature of transposable elements in prokaryotes //Plasmid. 1979. V. 2. P. 466-473.

75. Chaleff D.T., Fink C.R. Genetic events assotiated with an insertion mutation in yeast//Cell. 1980. V. 21. P. 227-237.

76. Chang C., Meyerowitz E.M. Molecular cloning and DNA sequence of the Arabidopsis thaliana alcochol dehydrogenase gene // Proc. Natl. Acad. Sci. 1986. V. 83 (5). P. 1408-1412.

77. Chen H.C., Wintz H., Weil J.H., et al. Three mitochondrial tRNA genes from Arabidopsis thaliana: evidence for the conversion of a tRNAPhe gene into tRNATyr gene I I Nucleic Acids Res. 1989. V. 17(7). P. 2613-2621.

78. Check E. RNA interference: hitting the on switch // Nature. 2007. V. 448 (7156). P. 855-858.

79. Cheung W.Y., Scott N.S. A contiguous sequence in spinach nuclear DNA is homologous to three separated sequences in chloroplast DNA // Theor. Appl. Genet. 1989. V. 77. P. 625-637.

80. Chitnis V.P., Nechusthai R. Function and organization of photosystem I polypeptides // Photosynth. Res. 1995. V. 44. P. 23-40.

81. Chitnis P.R. Photosystem I: Function and Physiology // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 593-626.

82. Chung S.-M., Staub E.J. The development and evalution of consensus chloroplast primer pairs that possess highly variable sequense regions in a diverse array of plant taxa // Theor. Appl. Genet. 2003. V.107. P.757-767.

83. Clouse S.D. Plant development: a role for sterols in embryogenesis // Curr. Biology. 2000. V. 10. P. 601-604.

84. Coleman D.C, Chopra I, Shales S.W, et al. Analysis of tetracycline resistance encoded by transposon TnlO: deletion mapping of tetracycline-sensitive point mutations and identification of two structural genes // J. Bacterid. 1983. V. 153. P. 921-929.

85. Cogoni C, Macino G. Post-transcriptional gene silencing across kingdoms // Curr, Opin. Genet. Dev. 2000. V. 10. P. 638-643.

86. Cohen S.N, Chang A.C.Y, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria Genetic transformation of E. coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 2110-2114.

87. Cohen S.N, Chang A.C.Y. Recircularization and autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment in Escherichia coli transformants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. V. 70. P. 1293-1303.

88. Cornelis G, Sommer H, Saedler H. Transposone Tn951 (Tnlac) is defective and related to Tn3 // Mol. Gen. Genet. 1981. V. 184. P. 241-248.

89. Cox G. The origins of chloroplast in eukariotes // Nature. 1986. Vol. 322. P. 412.

90. Cranford N.M, Campbell W.H, Davis R.W. Nitrate reductase from squash: cDNA cloning and nitrate regulation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83 (21). P. 8073-8076.

91. Deshaies R.J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. V. 15. P. 435-467.

92. Depicker A, Stachel S, Dhaese P. Nopalin synthase transcript mapping and dna sequence // J. Mol. Appl. Genet. 1982. V. 1 (6). P. 561-573.

93. Ding S.W. RNA silencing // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 152-156.

94. Dron M., Hartmann С., Rode A. et al. Homologous chloroplast-mitochondrial DNA sequences in Brassica and wheat // Plant Mol. Biol. Jerusalem. 1984. B-25.

95. Ecker J.R., Theologis A. Ethylene: a unique plant signaling molecule // In: Arabidopsis. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994. P. 485521.

96. Ellis R.J. Mobile genes of chloroplast and promiscuity of DNA // Nature. 1982. V.299. P. 678.

97. Elmayan Т., Balzergue S., Beon F., et al. Arabidopsis mutant simpaired in cosuppression // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1447-1457.

98. Ermakova S.Y., Elanskaya I.V., Kallins K.U. et al. Cloning and sequencing of mutant psbB gene of the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 II Photosynthetica. 1992. V. 12. P. 396-407.

99. Estelle M.A., Klee H.J. Auxin and cytokinin in Arabidopsis II In: Arabidopsis. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994. P. 555-578.

100. Fagard M., Vaucheret H. (Trans)gene silencing in plants: how many mechanisms? // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. V. 51. P. 167-194.

101. Fagard M., Boutet S., Morel J.B., at al. AGO-1, QDE-2 and RDE-1 are related proteins required for PTGS in plants, quelling in fungi and RNAi in animals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 11650-11654.

102. Farabaugh P. J., Fink G.R. Insertion of the eukaryotic transposable element Tyl creates a 5-basepair duplication // Nature. 1980. V. 286. P. 352-356.

103. Farelly F., Butow R.A. Rearranged mitochondrial genes in the yeast nuclear genome //Nature. 1983. V. 301. P. 296-301.

104. Faugeron G. Diversity of homology-dependent gene silencing strategies in fungi // Curr. Opin. Microbiol. 2000. V. 3. P. 144-148.

105. Fedoroff N.V., Wessler S., Shure M. Isolation of transposable maize controlling elements Ac and Ds II Cell. 1983. V. 35. P. 235-242.

106. Fedoroff N.V. Maize transposable elements. Mobile DNA // Washington DC: Am. Soc. Microbiol. 1989. P. 375-411.

107. Federspiel N.A., Palm C.J. Conway A.B., et al. Direct Submission // NCBI. Submitted 17-MAY-1999. DNA sequencing and technology Center, Stanford University, 855 California Avenue, Palo Alto, CAA 94304, USA.

108. Feldmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: mutational spectrum // Plant J. 1991. V. 1. P. 71-82.

109. Feldmann K.A., Marks M.D. Rapid and efficient regeneration of plant from explants of Arabidopsis thaliana // Plant Sci. 1986. V. 47. P. 63-69.

110. Feldmann K.A., Marks M.D. Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach I I Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 1-9.

111. Feinbaum R.L., Ausubel F.M. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana chalcone synthase gene //Mol. Cell. Biol. 1988. V. 8(5). P. 19851992.

112. Fenner G.P., Raphiou I. Growth of Cucurbita maxima L. plants in the presence of the cycloartenol synthase inhibitor U18666A // Lipids. 1995. V. 30 (3). P. 253-256.

113. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 1998. V. 391. P. 806-811.

114. Finkelstein R.R., Lynch T.J. The Arabidopsis abscisic acid response gene AB15 encodes a basic leucine zipper transcription factor // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 599-609.

115. Finkelstein R.R., Somerville C.R. Three classes of abscisic acid (ABA) -insensitive mutations of Arabidopsis define genes that control overlapping subsets of ABA responses // Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 1172-1179.

116. Finkelstein R.R., Zeevaart J.A.D. Gibberellin and abscisic acid biosynthesis and response // In: Arabidopsis. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994. P. 523-553.

117. Finnegan E.J., Taylor B.H., Craig S. et al. Transposable element can be used to study cell lineages in transgenic plants // Plant Cell. 1989. V. 1. P. 757-764.

118. Forsthoefel N.R., Wu Y., Schulz В., et al. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: prospects and perspectives //Aust. J. Plant Physiol. 1992. V. 19. P. 353-366.

119. Foster T.J., Davis M.A., Roberts D.E. et al. Genetic organization of transposon TnlO // Cell. 1981. V. 23. P. 201-213.

120. FranszP. About Arabidopsis II 1998. http/www.arabidopsis.org.

121. Frey M., Stettner C., Gierl A. A general method for gene isolation in tagging approaches: amplification of insertion mutagenised sites (AIMS) // Plant J. 1998. V. 13. P. 717-721.

122. Fridborg I., Kuush S., Moritz T. et al. The Arabidopsis dwarf mutant shi exhibits reduced gibberellin responses conferred by overexpression of a new putative zinc finger protein // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1019-1031.

123. Fukuzawa H., Kohchi Т., Shirai H. et al. Structure and organization of Marshantia polymorpha chloroplast genome. Gene organization of the large single copy region from rbcL to trnl (CAU) // J. Mol. Biol. 1988. V. 203. P. 333-351.

124. Gagne J.M., Downes B.P., Shiu S.-H., et al. The F-box subunit of the SCF E3 complex is encoded by a diverse superfamily of genes in Arabidopsis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 11519-11524.

125. Gailus-Durner V., Scherf M., Wetrner T. Experiments date of a single promoter can be used for in silico detection of genes with related regulation in the absence of sequence similarity // Mamm. Genome. 2001. V. 12. P. 67-72.

126. Gamborg O.L., Phillips G.S. Plant cell, tissue and culture. Fundamental methods //Berlin Heidelberg: Springer - Verlag. 1995. 358 P.

127. Gerstein M. В., Bruce С., Rozowsky J.S., et al. What is gene, post-ENCODE? Histori and updated definition // Genome Res. 2007. V. 17. P. 669-681.

128. Gray M.W. The evolutionary origin of organelles // TIG. 1989. V. 5. P. 294298.

129. Geever R.F., Huiet L., Baum J.A. et al. DNA sequence, organization and regulation of the qa gene claster of Neurospora crassa II J. Mol. Biol. 1989. V. 207. P. 15-34.

130. Gellissen G., Bradfield J.Y., White B.N. et al. Mitochondrial DNA sequences in the nuclear genome of locust // Nature. 1983. V. 301. P. 631-634.

131. Gellissen G., Michaelis G. Gene-transfer-mitochondria to nucleus // Annals N.Y.Acad. Sci. 1987. V. 503. P. 391-401.

132. Georgiev G.P., Ilyin Yu. V., Ryskov A.P. et al. Isolation of eukaryotic DNA fragments containing structural genes and adjacent sequences // Science. 1977. V. 195 (4278). P. 394-397.

133. Gierl A., Saedler H. The En/Spm transposable element of Zea mays II Plant Mol. Biol. 1989. V. 13. P. 261-266.

134. Golbeck J.H. Photosystem I in cyanobacteria I I In: The Molecular Biology of Cyanobacteria (Ed. Bryant D.A.) Dordrecht, Kluwer. 1994. P. 319-360.

135. Gray W.M., Estelle M. Biochemical genetics of Arabidopsis thaliana II Curr. Opin. Biotechnol. 1998. V. 9. P. 196-201.

136. Griffiths P.E., Stotz K. Genes in postgenomic era // Theor. Med. Bioeth. 2006. V. 27. P. 499-521.

137. Grigorieva G., Shestakov S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp. 6803 IIFEMS Microbiol. Lett. 1982. V. 13. P. 367-370.

138. Gruenbaum Y., Naveh-Many Т., Cedar H., et al. Sequence specificity of methylation in higher plant DNA // Nature. 1981. V. 292. P. 860-862.

139. Goldberg R.B., Hoshek G., Kamalaay J.C. Sequence complexity of nuclear and polysomal RNA in leaves and tabacco plants // Cell. 1978. V. 14 (1). P. 123131.

140. Goff S.A., Ricke D., Lan T.N., et al. A draft sequence of the rice genome

141. Oryza sativa L. ssp. Japonica) // Science. 2002. V. 296 (5565). P. 92-100.

142. Golden S.S., Brusslan J., Haselkorn R. Expression of a family of psbA genes encoding a photosystem II polypeptide in the cyanobacterium Anacystis nidulans R2 IIEMBO J. 1986. V. 5. P. 2789-2798.

143. Golden S.S., Nalty M.S., Cho D.S. Functional psbB genes in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 7942II J. Bacteriol. 1989. V. 171. P. 4707-4713.

144. Golbeck J.H., Bryant D.A. Photosystem III Curr. Top. Bioenerget. 1991. V. 16. P. 83-177.

145. Gowher H, Leismann O, Jeltsch A DNA of Drosophila melanogaster contains 5-methylcytosine // EMBO J. 2000. V. 19. P. 6918-6923.

146. Gray W.M. The evolutionary origin of organelles // Theor. Appl. Genet. 1989. V. 5. P. 294-298.

147. Green M.M. The genetics of mutable gene at the white locus of Drosohpila melanogaster II Genetics. 1967. V. 56 (3). P. 467-482.

148. Gregory R., Chendrimada N., Cooch N., et al. Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing // Cell. 2005. V. 123 (4). P. 631-640.

149. Guarente L.P., Isberg R.R., Syvanen M. et al. Conferral of transposable properties to a chromosomal genes in Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1980. V. 141. P. 235-248.

150. Hamilton A.J., Baulcombe D.C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants // Science. 1999. V. 286. P. 950952.

151. Hammond S.M., Caudy A.A., Hannon G.J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA // Nature Rev Gen. 2001. V. 2. P. 110-119.

152. Hansch R., Koprek Т., Mendel R.R. et al. An improved protocol for eliminating endogenous {3-glucuronidase background in barley // Plant Science. 1995. V. 105. P. 63-69.

153. Hedges R.W, Jacob A.E. Transposition of ampicillin resistaance from RP4 to other replicons I I Mol. Gen. Genet. 1974. V. 132. P. 31-40.

154. Heffron F, Bedinger P, Champoux J.J, et al. Deletions affecting the transposition of an antibiotic resistance gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 702-706.

155. Heffron F, McCarthy J.B, Ohtsubo H, et al. DNA sequence analysis of the transposon Tn3: three genes and three sites involved in transposition of Tn3 // Cell. 1979. V. 18. P.l 153-1163.

156. Hehl R, Baker B. Induced transposition of Ds by a stable Ac in cross of transgenic tabacco plants //Mol. Gen. Genet. 1989. V. 217. P. 53-59.

157. Hellens R.P, Edwards E.A, Leyland N.R, et al. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium — mediated plant transformation // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 819-832.

158. Herbst A, Hemann M.T, Tworkowski K.A, et al. A conserved element in Мус that negatively regulates its proapoptotic activity // EMBO Rep. 2005 V. 6. P. 177-183.

159. Herman P.L, Marks M.D. Trichome development in Arabidopsis thaliana. II. Isolation and complementation of the GLABROUS I gene // Plant Cell. 1989. V. l.P. 1051-1055.

160. Herman P.L, Jacobs A, Van Montagu M. et al. Plant chromosome marker gene fusion assay for study of normal and truncated T-DNA integration events // Mol. Gen. Genet. 1990. V. 224 (2). P. 148-256.

161. Herrera J.B.R, Bartel B, Wilson W.K, et al. Cloning and characterization of the Arabidopsis thaliana lupeol synthase gene // Photochemistry. 1998. V. 49 (7). P. 1905-1911.

162. Hicks J, Strathern J.N, Klar A.J. Transposable mating type genes in Saccharomyces cerevisiae II Nature. (L.) 1979. V. 282. P. 478-483.

163. Hirochika H., Okamoto H., Kakutani T. Silencing of retrotransposons in Arabidopsis and reactivation by the ddml mutation // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 357-368.

164. Ни C., Chee P.P., Chersney R.H., et al. Intrinsic GUS-like activities in seed plants // Plant Cell Rep. 1990. V. 9. P. 11-5.

165. Huang S., Raman A.S., Ream J.E., et al. Overexpression of 20-oxidase confers a gibberillin-overproduction phenotype in Arabidopsis II Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 773-781.

166. Iida S., Mollet B. Functional characterization of the prokaryotic mobile genetic element IS26 // Mol. Gen. Genet. 1985. V. 198. P. 84-89.

167. Ilyin Y. V., Chmeliauskaite V.G. Kulguskin V.V., et al. Mobile dispersed genetic element MDC1 of Drosophila melanogaster. transcription pattern // Nucl. Ac. Res. 1980. V. 8. P. 5347-5362.

168. Ingelbrecht I., Van Houdt H., Van Montagu M., et al. Posttranscriptional silencing of reporter transgenes in tobacco correlates with DNA methylation // Proc Natl Acad. Sci USA. 1994. 91: 10502-10506. (Abstract, PDF of Article).

169. Ishiguro H., Sato G., Sasakawa C., et al. Identification of citrate utilisation transposone Tn3411 from a naturally occurring citrate utilisation plasmid // J. Bacteriol. 1982. V. 149. P 961-968.

170. Jacobs H.T., Posacony J.W., Grula J.W. et al. Mitochondrial DNA sequences in the nuclear genome of Strongylocentrotus purpuratus II J. Mol. Biol. 1983. V. 165. P. 609-632.

171. Jansson S, Douglas C.J Populus: A model system for plant biology // Annu. Rev. Plant. Biol. 2007. V. 58. P. 435-458.

172. Jefferson R.A., Kavanagh Т.A., Bevan M.V. GUS functions: P-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3901-3907.

173. Jones-Rhoades M., Bartel D., Bartel B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants //Annu. Rev. Plant Biol. 2006. V. 57. P. 19-53.

174. Jordan E., Saedler H., Starlinger P. Strong-polar mutations in the gal operon are insertions //Mol. Gen. Genet. 1968. V. 102. P. 353-363.

175. Jean M., Pelletier J., Hilpert M., et al. Isolation and characterization of AtMLHl, a MutL homologue from Arabidopsis thaliana II Mol. Gen. Genet. 1999. V. 262(4-5). P. 633-642.

176. Jones A.L., Thomas C.L., Maule A.J. De novo methylation and cosupression induced by cytoplasmically replicating plant RNA virus // EMBO J. 1998. V. 17. P. 6385-6393.

177. Kallas Т., Spiller S., Malkin R. Primaty structure of cotranscribed genes encoding the Reiske Fe-S and cytochrome of proteins of the cyanobacterium Nostoc PCC 7906 U Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 5794-5798.

178. Kain S.R., Adams M., Kondepudi A., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization // Biotechniques. 1995. V. 19. P. 650-655.

179. Kaneko Т., Sato S., Kotani H. et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 // DNA Res. 1996. V. 3.P. 109-136.

180. Katavic V., Haught G., Reed D., et al. In planta transformation of Arabidopsis thaliana //Mol. Gen. Genet. 1994. V. 245. P. 363-370.

181. Kemble R.J., Mans R.J., Gabay-Laughnan S. et al. Sequences homologous to episomal mitochondrial DNAs in the maize nuclear genome // Nature. 1983. V. 304. P. 744-747.

182. Kemp J. Enzymes in octopine and nopaline methabolism. The Molecular biology of plant tumors // New York London: Acad. Press. 1982. Chapt. 17. P. 461-474.

183. Kende H. Etthylene biosynthesis //Ann. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 1993. V. 44. P. 283-307.

184. Kende H., Zeevaart J.A.D. The life "classical" plant hormones // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1197-1210.

185. Kertbundit S., De Greve H., Deboeck F., et al. In vivo random ^-glucuronidase gene fusions in Arabidopsis thaliana II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 5212-5216.

186. Kertbundit S., Linacero R., Rouze P., et al. Analysis of T-DNA-mediated translation (3-glucuronidase gene fusions // Plant Mol. Biol. 1998. V. 36. P. 205-217.

187. Kim S.Y., Herbst A., Tworkowski K.A., et al. Skp2 regulates Мус protein stability and activity // Mol. Cell. 2003. V. 11. P. 1177-1188.

188. Kipreos E.D., Pagano M. The F-box protein family // Genome Biology. 2000. V. 1(5). P. 1-7.

189. Kleckner N. Translocatable elements in prokariotes. Cell. 1977. V. 11. P. 1123.

190. Kleckner N. Transposable elements in prokariotes. Ann. Rev. Genet. 1981. V. 15. P. 341-404.

191. Kleczkowski L.A., Sokolov L.N., Luo C., et al. Molecular cloning and spatial expression of an ApLl cDNA for the large subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase from Arabidopsis thaliana IIZ. Naturforsch С. 1999. V. 54. P. 353-358.

192. Klee H.J., Muskopf Y.M., Gasser C.S. Cloning of Arabidopsis thaliana gene encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase: sequence analysis and manipulation to obtain glyphosate-tolerant plants //Mol. Gen. Genet. 1987. V. 210(3). P. 437-442.

193. Knapp S., Coupland G., Uhrig H. et al. Transposition of the maize transposable element Ac in Solanum tuberosum II Mol. Gen. Genet. 1988. V. 213. P. 185-290.

194. Kolodner R., Tewari K.K. The molecular size and conformation of the chloroplast DNA from higher plants // Biochem. Biophys. Acta. 1975. V. 402. P. 372-390.

195. Konieczny A., Voytas D.F., Cummings M.P. et al. A superfamily of Arabidopsis thaliana retrotransposones // Genetics. 1991. V. 127 (4). P. 801809.

196. Koncz C., Martini N., Mayerholer R., et al. High-frequency T-DNA mediated gene tagging in plants // Proc. Natl. Acad. Sci/USA. 1989. V. 86. P. 84678471.

197. Koncz C., Mayerholer R., Koncz Kalman Z., et al. Isolation of a gene encoding a novel chloroplast protein by T-DNA tagging in Arabidopsis thaliana //EMBO J. 1990. V. 9. P. 1337-1346.

198. Koncz C., Nemeth K., Redei G.P., et al. T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis II Plant Mol. Biol. 1992. V. 20. P. 963-976.

199. Koncz C., Martini N., Szabados L., et al. Specialized vectors for gene tagging and expression studies // In: Plant Molecular Biology Manual. V. B2. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Press. 1994. P. 1-22.

200. Krysan P.J., Young J.C., Sussman M.R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis /I Plant Cell. 1999. V. 11. P. 2283-2290.

201. Kubo H., Peeters A.J.M., Aarts M.G.M., et al. ANTHOCYAANINLESS2, a homeobox gene affecting anthocyanin distribution and root development in Arabidopsis //Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1217-1226.

202. Kurihara Y., Watanabe Y. Arabidopsis micro-RNA biogenesis through Dicerlike 1 protein functions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V.101. P. 1275312758.

203. Kurkela S., Franck M. Cloning and characterization of a cold- and ABA-induible Arabidopsis gene // Plant Mol. Biol. 1990. V. 15(1). P. 137-144.

204. Kuroda H., Takahashi N., Shimada H., et al. Classification and expression analysis of Arabidopsis F-box-containing protein genes // Plant Cell. Physiol. 2002. V. 43 (10). P. 2987-1994.

205. Kushiro Т., Shibuya M., Ebizuka Y. Beta-amyrin synthase-cloning of xidosqualene cyclase that catalyxes the formation of the most popular triterpene among higher plants // Eur. J. Biochem. 1998. V. 256 (1). P. 238244.

206. Kyte J., Doollittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein // J. Mol. Biol. 1982. V. 157. P. 105-132.

207. Lang J. D., Haselkorn R. Isolation, sequence and transcription of the gene encoding the photosystem-II chlorophyll-binding protein, CP-47, in the Cyanobacterium anabaena-7120 II Plant Mol. Biol. 1989. V. 13. P. 441-456.

208. Laughnan J.R., Gabay S.J. Genetic and cytological studies on the aberrant behavior of an X-chromosome duplication in the germ line of Drosohpila melanogaster males // Genetics. 1968. V. 60 (1). Pt. 2. P. 195 (abstr.).

209. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 II Cell. 1993. V. 75. P.843-854.

210. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. A short history of a short RNA // Cell. 2004. V. 116. P. S89-S92.

211. Lee Y., Jeon K., Lee J.T., et al. MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization // EMBO J. 2002. V. 21. P. 4663-4670.

212. Von der Lehr N., Johansson S., Wu S., et al. The F-box protein Skp2 participates in c-Myc proteosomal degradation and acts as a cofactor for c-Myc-regulated transcription // Mol. Cell. 2003. V. 11. P. 1189-1200.

213. Leister D., Schneider A. From genes to photosynthesis in Arabidopsis thaliana II International Review of Cytology. 2003. P. 31-83.

214. Leutwiler L.S, Meyerowitz E.M, Tobin E.M. Structure and expression of three light-harvesting chlorophyll a/b binding proteins in Arabidopsis thaliana //Nucl. Acids Res. 1986. V. 14 (10). P. 4051-4064.

215. Levings C.S. Ill, SedoroffR.R. Nucleotide sequence of the S-2 mitochondrial DNA from the S cytoplasm of maize // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 4055-4059.

216. Li L.C, Okino S.T, Zhao H, et al. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103 (46). P. 17337-17342.

217. Liebman S.W, Newnam G. A ubiquitin-conjugating enzyme, RAD6, affects the distribution of Tyl retrotransposon integration positions // Genetics. 1993. V. 133. P. 499-508.

218. Lin X, Kaul S, Rounsley S.D, et al. Sequence and analysis of chromosome II of Arabidopsis thaliana II Nature. 1999. V. 40. P. 761-768.

219. Lippman Z, Martienssen R. The role of RNA interference in heterochromatin silencing // Nature. 2004. V.431. P.364-370.

220. Liu J, Beacham I.R. Transcription and regulation of the cpdB gene in Escherichia coli K12 and Salmonella typhimurium LT2: evidence for modulation of constitutive promoters by cyclic AMP-CRP complex //Mol. Gen. Genet. 1990. V. 222. P. 161-165.

221. Liu Y.G, Mitsukawa N, Vazquez-tello A, et al. Generation of a high quality PI library of Arabidopsis thaliana suitable for chromosome walking // Plant J. 1995. V. 7. P. 351-358.

222. Liu Y.G, Whittier R.F. Thermal asymmetric interplaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert and fragments from PI and YAAC clones for chromosome walking // Genomics. 1995. V. 25. P. 674-681.

223. Lonsdale D.H. Movement of genetic material between the chloroplast and mitochondrion in higher plants // Plant gene research, flux in plants. Ed. B. Hohn, E.S. Dennis. Wien; N.Y.: Springer. 1985. P. 51-60.

224. Lonsdale D.H., Hodge T.P., Howe С J., et al. Maize mitochondrial DNA contains a sequence homologous to the ribuloso-l,5-bisphosphate carboxylase large subunit gene of chloroplast DNA // Cell. 1983. V. 34. P. 1007-1014.

225. Lopato S., Kalina M., Dorner S., et al. AtSRp30, one of two SF2/ASF-like proteins from Arabidopsis thaliana, regulates splicing of specific plant genes // Genes Dev. 1999. V. 13(8). P. 987-1001.

226. Lovegrove A., Barratt D.H.P., Beale M.H., et al. Gibberellin-photoaffinity labeling of two polypeptides in plant plasma membranes // Plant J. 1998. V. 15 (3). P. 311-320.

227. Lu C., Kulkarni K., Souret F.F. et al., MicroRNAs and other small RNAs enriched in Arabidopsis RNA-dependent RNA polymerase-2 mutant // Genome Res. 2006. V. 16(10). P. 1276-1288.

228. Majors J.E., Varmus H.E. Nucleotide sequences at host-proviral junctions for mouse mammary tumor vims // Nature. 1981. V. 289. P. 253-258.

229. Malamy M.H. Some mutations in the lactose operon of E. coli II Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1966. V.31. P. 189.

230. Malamy M.H. Fiondt M., Szybalski W. Electron microscopy of polar insertions in the lac operon of Escherichia coli II Mol. Gen. Genet. 1972. V. 119. P. 207-222.

231. Manna E., Brennicke A. A site-specific circularization in Oenothera mitochondria //Mol. Gen. Genet. 1986. V. 203. P. 377-381.

232. Marchant A., Kargul J., May S.T., et al. AUX1 regulates root gravitropism in Arabidopsis by facilitating auxin uptake within root apical tissues // EMBO J. 1999. V. 18 (8). P. 2066-2073.

233. Marks M.D., Feldmann K.A. Trichome development in Arabidopsis thaliana 1. T-DNA tagging of the glabrous I gene // Plant Cell. 1989. V. 1 (11). P. 1043-1050.

234. Marshallsay C., Kiss Т., Filipowicz W. Amplification of plant U3 and U6 suRNA gene sequences using primers specific for an upstream promoterelement and conserved intragenic regions // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18(12). P. 3459-3466.

235. Mathur J., Szabados L., Schaefer S., et al. Gene identification with sequenced T-DNA tags generated by transformation of Arabidopsis cell suspension //Plant J. 1998. V. 13. №5. P. 707-716.

236. Mathieu O., Bender J. RNA-directed DNA methylation // J. Cell Sci. 2004. 117(Pt 21). 4881-4888.

237. Matsui M., Sasamoto S., Kunieda Т., et al. Cloning of ara, a putative Arabidopsis thaliana gene homologous to the ras-related gene family // Gene. 1989. V. 76(2). P. 313-319.

238. Matzke M.A., Mette M.F., Matzke A.I.M. Transgene silencing by the host genome defense: implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates // Plant. Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 401415.

239. Maxwell E.S., Fournier M.J. The small nucleolar RNAs // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 897-934.

240. Matzke M.A., Matzke A.J.M., Pruss G.J., et al. RNA-based silencing strategies in plants // Current Opin. Genet. Devel. 2001. V. 11. P. 221-227.

241. Mazur B.J., Chui C.F., Smith J.K. Isolation and characterization of plant genes coding for acetolactate synthase, the target enzyme for two classes of herbicides // Plant Physiol. 1987. V. 85(4). P. 1110-1117.

242. McClintock B. Mutable locus in maize // Carnegie Inst. Wash. Yeabook. 1948. V. 47. P. 155-169.

243. McClintock B. The origin and behavior of mutable loci in maize // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1950. V. 36. P. 344-345.

244. McClintock B. Chromosome organization and genetic expression // Cold Spring Harb. Symp. Quant Biol. 1951. V. 16. P. 13-47.

245. McClintock B. Mutations in maize and chromosomal aberrations in Neurospora II Carnegie Inst. Wash. Yeabook. 1954. V. 53. P. 254-260.

246. McClintock В. Controlling elements and gene // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1956. V. 21. P. 197-216.

247. McClintock B. Some parallels between gene control systems in maize and bacteria // Amer. Nat. 1961. V. 95. P. 265-277.

248. McClintock B. The control of gene action in maize // In: Genetic Control of Differentiation. Brookhaven Symp. in Biology. 1965. V. 18. P. 162-184.

249. McGinnisK., Chandler V., Cone K., et al. Transgene-induced RNA interference as a tool for plant functional genomics // Methods Enzymol. 2005. V. 392. P. 1-24.

250. McKinney E.C., AH N., Traut A., et al. Sequence-based identification of T-DNA insertion mutations in Arabidopsis: actin mutants act2-l and act4-l II Plant J. 1996. V. 8. P. 613-622.

251. Mette M.F., van der Winden J., Matzke M.A., et al. Production of aberrant promoter transcripts contributes to methylation and silencing of unlinked homologous promoters in trans // EMBO J. 1999. V. 18. P. 241-248.

252. Meyerowitz E.M. Structure and organization of the Synechocystis sp. 6803 thaliana nuclear genome // In: Arabidopsis (Meyerowitz E.M., Somerville C.R., eds.). Cold Spring Harbor. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1991. H. 21-36.

253. Miao Z.-H., Lam E. Targeted disruption of the TGA3 locus in Arabidopsis thaliana II Plant J. 1995. V. 7 (2). P. 359-365.

254. Montgomery M.K. RNA interference historical overview and significance // Methods Mol. Biol. 2004. V. 265. P. 3-21.

255. Moore G. Cereal chromosome structure, evolution, and pairing // Ann. Rev. Riant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. V. 51. P. 195-222.

256. Moore R.C., Purugganan M.D. The early stages of duplicate gene evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 23. P. 15682-15687.

257. Mourrain P., Beclin C., Elmayan Т., et al. Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance // Cell. 2000. V. 101. P. 533-542.

258. Mowla S.B., Cuypers A., Driscoll S.P., et al. Yeast complementation reveals a role for an Arabidopsis thaliana late embryogenesis abundant (LEA)-like protein in oxidative stress tolerance // Plant J. 2006. V.8. (Epub ahead of print).

259. Mullis K.B. The unusual origin of the Polymerase Chain Reaction // Scientific American. 1990. April. P. 36-43.

260. Murai N., Li Z., Kawagoe Y. et al. Transposition of the maize activator element in transgenic rice plants // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 617-622.

261. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans // Plant Cell. 1990. V. 2. P. 279-289.

262. Ngernprasirtsiri J, Kobayashi H, Akazawa T. DNA methylation as a mechanism of transcriptional regulation in nonphotosynthetic plastids in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. V. 85. P. 4750-4754.

263. Ngernprasirtsiri J, Akazawa T. Modulation of DNA methylation and gene expression in cultured sycamore cells treated by hypomethylating base analog //Eur. J. Biochem. 1990. V. 194. P. 513-520.

264. Nomiyama H., Fukuda M., Wakasugi S., et al. Molecular structures of mitochondrial DNA-like sequences in human nuclear DNA // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 1649-1658.

265. Neuwlad A.F., Krishnan B.R., Brikun I., et al., Cis Q, a gene needes for cystein synthesis in Escherichia coli K12 only by during aerobic growth // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 415-425.

266. Nevers P., Shepherd N.S., Saedler H. Plant transposable elements // Adv. Bot. Res. 1986. V. 12. P. 102-103.

267. Nugent J.M., Palmer J.D. Location, identify, amount and serial entry of chloroplast DNA sequences in crucifer mitochondrial DNAs // Curr. Genet. 1988. V. 14. P. 501-509.

268. Ohyama K., Kohchi Т., Sano Т., et al. Chloroplast gene organization deduced from complete sequence of liverwort Marshantia polymorpha chloroplast DNA // Nature. 1986. V. 322. P. 591-597.

269. Oono Y., Chen Q.G., Overvoorde P .J., et al. age mutants of Arabidopsis exhibit altered auxin-regulated gene expression // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1649-1662.

270. Palmer J.D. Comparative organization of chloroplast genomes // Annu. Rev.Genet. 1985. Vol. 19. P. 325-354.

271. Palmer J.D., Ozorio В., Aldrich J., et al. Evolutionary significance of inversion in legume chloroplast DNAs // Curr. Genet. 1988. Vol. 14. P. 65-74.

272. Palmer J.D., Thompson W.F. Rearrangements in the chloroplast genomes of mung bean and pea // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78 (9). P. 55335537.

273. Palmer J.D. Isolation and structural analysis of chloroplast genome DNA // Plant. Mol. Biol. 1986. V. 118. P. 167-186.

274. Parinov S., Sevugan M., Ye D. et al. Analysis of flanking sequences from Dissociation insertion lines: a database for revers genetics in Arabidopsis II Plant Cell. 1999. V. 11. P. 2263-2270.

275. Peterson P. A. A mutable pale creen locus in maize // Genetics. 1953. V. 38 (5). P. 835-841.

276. Peterson P.A. Controlling elements and mutable loci in maize: their relationship to bacterial episomes // Genetics. 1970. V. 41. P. 33-56.

277. Peterson-Burch B.D., Voytas D.E. Genes of Pseudoviridae (Tyl/copia retrotransposones) // Mol. Biol. Evol. 2002. V. 19 (11). P. 1832-1845.

278. Pichersky E., Tanksley S.D. Chloroplast DNA-sequences integrated into an intron of a tomato nuclear gene // Mol. Gen. Genet. 1988. V. 215. P. 65-68.

279. Pichersky E., Logsdon J.M., McGrath J.M. et al. Fragments of plastid DNA in the nuclear genome of tomato, prevalence, chromosomal location and possible mechanisms of integration // Mol. Gen. Genet. 1991. V. 225. P. 453-458.

280. Plasterk RHA, Ketting R.F. The silence of the genes // Curr. Opin. Genet. Dev. 2000. V. 10. P. 562-567.

281. Potter S., Truett M., Phillips M. et al. Eucaryotic transposable genetic elements with inverted terminal repeats // Cell. 1980. V. 20. P. 639-647.

282. Pickart C.M. Mechanisms underlying ubiqutination // Ann. Rev. Biochem. 2002. V. 70. P. 503-533.

283. Rafalski J. A. Two strands of DNA are not equivalent as probes in hybridization at low stringency // Anal. Biochem. 1988. V. 173(2). P. 383-386.

284. Reddy E.P., Smith M.J., Canaani E. et al. Nucleotide sequence analysis of the transforming region and large terminal redundancies of Moloney murine sarcoma virus // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 5234-5238.

285. Redei G.P. Arabidopsis thaliana (L.) Heyhh. A review of genetics and biology // Bibliographia Genetica. 1969. V. 21 (1). P. 1151-1165.

286. Redei G.P., Koncz C., Schell J. Transgenic Arabidopsis II Chromosome structure and function. New-York London: Plenum. 1988. P. 175-200.

287. Reed R.S., Brady S.R., Muday G.K. Inhibition of auxin movement from the shoot into the root inhibits lateral root development in Arabidopsis II Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1369-1378.

288. Rhoders P.K., Vodkin L.O. Organization of Tgm family of transposable elements in soybean // Genetics. 1988. V. 120. P. 597-604.

289. Rocheleau C.E., Downs W.D., Line R., et al. Wnt signaling and an APC-related gene specify endoderm in early C. elegans embryos // Cell. 1997. 90: 707-716.

290. Rodriguez A, Griffiths-Jones S, Ashurst J.L, et al. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units // Genome Res. 2004. V. 14. P. 1902-1910.

291. Roeder G.S, Fink G.R. DNA rearrangements associated with a transposable element in yeast // Cell. 1980. V. 21. P. 239-249.

292. Rogic S, Mackworth A.K, Ouellette F.B. Evalution of gene-finding programs on mammalian sequences // Genome Res. 2001. V. 11. P. 817-832.

293. Romano N, Macino G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences // Mol. Microbiol. 1992. V. 6. P. 3343-3353.

294. Rosberg M, Theres K, Arkan, et al. Comparative sequence analysis reveals extensive microcolinearity in the Lateral Suppressor regions of the tomato, Arabidopsis, and capsiella genomes // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 979-988.

295. Rothstein S.J, Jorgensen R.A, Postle K. et al. The inverted repeats of Tn5 are functionally different // Cell. 1980. V. 19. P. 795-805.

296. Rubin G.M, Finnegan D.J, Hogness D.S. The chromosomal arrangement of coding sequences in a family of repeated genes // Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. 1976. V. 19. P. 221-226.

297. Saedler H, Starlinger P. 0° mutations in the galactose operon in E. coli. I. Genetic characterization // Mol. Gen. Genet. 1967. V. 100. P. 173-189.

298. Saedler H, Nevers P. Transposition in plants: A molecular model // EMBO J. 1985. V. 4. P. 585-590.

299. Rubin G.M, Finnegan D.J, Hogness D.S. The chromosomal arrangement of coding sequences in a family of repeated genes // Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. 1976. V. 19. P. 221-226.

300. Santarem E.R, Trick H.N, Essing J.S, et al. Sonication-assisted Agrobacterium-rnQdiated transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression // Plant Cell Reports. 1998. V. 17. P. 752759.

301. Sasaki Т. The rice genome project in Japan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 2027-2028.

302. Schmidt-Rogge Т., Weber В., Burner T. Transposition and behavior of the maize transposable element Ac in transgenic Dature innoxia И Mill. Plant. Sci. 1994. V. 99. P. 63-74.

303. Schneider G.J., Lang J.D., Haselkorn R. Promoter recognition by the RNA polymerase from vegetative cells of the cyanobacterium Anabaena 7120 //Gene. 1991. V. 105. P. 51-60.

304. Schuster W., Brennicke A. Plastid, nuclear and reverse transcriptase sequences in the mitochondrial genome of Oonotera: Is genetic international transferred between organelle via RNA? // EMBO J. 1987a. V. 6. P. 2857-2863.

305. Schuster W., Brennicke A. Plastid DNA in the mitochondrial genome of Oonotera'. Intra- and interorganellar rearrangements involving part of the ribosomal cistron //Mol. Gen. Genet. 1987b. V. 210. P. 44-51.

306. Schuster W., Brennicke A. Interorganellar sequence transfer: plant mitochondrial DNA is nuclear, is plastid, is mitochondrial // Plant Science. 1988. Vol.54. P.l-10.

307. Scott N.S., Timmis J.N. Homologies between nuclear and plastid DNA in spinach // Theor. Appl. Genet. 1984. V.67. P. 279-288.

308. Shani Z., Dekel M., Tsabaary G., et al. Cloning and characterization of elongation specific endo-l,4-beta-glucanase (cell) from Arabidopsis thaliana II Plant. Mol. Biol. 1997. V. 34(6). P. 837-842.

309. Shapiro J.A. Molecular model for the transposition and replication of bacteriophage Mu and other transposable elements // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 1933-1937.

310. Shibuya M., Zhang H., Endo A., et al. Two branches of the lupeol synthase gene in the molecular evolution of plant oxidosqualene cyclases // Eur. J. Biochem. 1999. V. 266 (1). P. 302-307.i

Информация о работе

Огаркова, Ольга Александровна
доктора биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Разработка методологии идентификации функции генов Arabidopsis thaliana - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы