Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и анализ трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh с повышенной экспрессией генов
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh с повышенной экспрессией генов"
ОС
На правах рукописи
ПОГОРЕЛКО Геннадий Владимирович
ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ Arabidopsis tlialiana (L.) Heynh С ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ
03 00 15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК
Москва-2008
17113S
003171138
Работа выполнена в лаборатории изменчивости генома Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
Доктор биологических наук, профессор Тарасов Валентин Алексеевич
Институт общей генетики им Н И Вавилова РАН
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Доктор биологических наук Дейнеко Елена Викторовна
Институт цитологии и генетики СО РАН
Кандидат биологических наук Татьяна Викторовна Коростылева
Институт общей генетики им Н И Вавилова РАН
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Кафедра генетики и селекции Биологического Факультета Московского Государственного Университета им МВ Ломоносова
Защита состоится « » _ 2008 г в _ часов на заседании
Диссертационного совета Д 002 214 01 при Институте общей генетики им Н И Вавилова РАН, по адресу 119991, ГСП-1, Москва, ул Губкина, д 3
С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института общей генетики им Н И ВавиловаРАН, по адресу 119991, ГСП-1, Москва, ул Губкина, д 3
Автореферат разослан «_»_2008 г
Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат биологических наук
Полухина Галина Николаевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Расшифровка полной нуклеотидной последовательности генома Arabidopsis thaliana в конце 2000 года позволила реально перейти к решению центральной проблемы молекулярной генетики высших растений - идентификации функции генов Для определения функций генов используются методы как прямой, так и обратной генетики В случае использования подходов прямой генетики создается коллекция мутантов, среди которой проводится отбор кандидатных генов по фенотипу Подход обратной генетики используют уже полученные данные о состояния генома, о наличии и локализации мутаций В этом случае возможен перенос данных, полученных на любых растениях
Основным методом при определении функциональной значимости генов у высших растений, и в первую очередь у A thaliana, является метод инсерционного мутагенеза
Несмотря на то, что кроме A thaliana существует ряд других видов высших растений, изучение структурной организации генома которых активно ведется во многих лабораториях мира, A thaliana остается самым удобным объектом для функциональной геномики Так, например, размеры геномов Atabidopsis thaliana и Oryza sativa отличаются в 4 раза, тогда как общее количество генов в гаплоидном состоянии у этих двух растений приблизительно одинаковое Таким образом, эффективность использования инсерционного мутагенеза на О Sativa значительно ниже
В последние 15-20 лет были разработаны методы для эффективного массового получения инсерционных мутантов A thaliana В результате были созданы представительные коллекции мутантных линий A thaliana, семена которых собраны в коллекционных центрах ABRC (http //www arabidopsis org/abrc/), NASC (http //arabidopsis mfo/), SALK (http //signal salk edu/), SAIL
(http //www tmn org/en/partnership/sail_collection aspx) и GABI (http //www gabi-kat de/)
Однако большинство созданных коллекций инсерционных мутантов содержат линии, несущие ии/-мутации, или так называемые loss-of-fimction мутации, которые
позволяют определять функции только стабильно экспрессирующихся в ходе развития растений генов Этот факт заранее свидетельствует о том, что исследовать функции всех генов, используя только 1о55-о/-/ипсПоп тип мутаций, невозможно Это ограничение спектра инсерционных мутаций является осложняющим моментом при исследовании связи между событиями в ДНК хромосом и их фенотипическим выражением В частности, инсерционные мутации этого типа в генах, функционирующих в экстремальных условиях среды, в стандартных условиях не приводят к проявлению мутантного фенотипа В этой связи актуальной является задача расширения спектра мутаций, вызванных инсерцией в геном клеток растений Этим обусловлен интерес к индукции мутаций другого типа, например, мутаций, вызывающих суперэкспрессию генов Индукция мутаций такого рода достигается с помощью векторов, Т-ДНК которых содержит около одного из бордеров сильный промотор (или энхансер транскрипции) Инсерция Т-ДНК в этом случае может вызывать увеличение во много раз экспрессии как близлежащих генов, так и, в некоторых случаях, генов, располагающихся за несколько тысяч пар оснований нуклеотидов Такой тип мутаций получил название galn-of-functюn мутаций
Однако когда структура инсерции содержит энхансер транскрипции, при ее встраивании в геном растения, могут возникать мутации двух типов »»/-мутации, связанные с инактивацией гена при встраивании в него инсерции, и мутации, обусловленные наличием сильного промотора в структуре инсерции При массовом получении и анализе инсерционных мутаций, полученных с помощью такого рода векторов, необходимо иметь относительно простую и эффективную систему идентификации 1озз-о/-/ипсиоп и ga¡n-of-functюn мутаций
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлось получение коллекции инсерционных мутантов А ЛаЬапа с повышенной экспрессией близлежащих к инсерции Т-ДНК генов и идентификация генов, супер-экспрессия которых приводит к изменению морфогенеза растений
В процессе работы решались следующие задачи
1 Создание специальной системы векторов для трансформации двудольных растений, обеспечивающей реверсию мутаций, обусловленных СаМУ 358 промотором Т-ДНК
2 Создание коллекции инсерционных мутантов А ЛаЬапа при помощи специального уникального вектора, Т-ДНК которого содержит сильный СаМУ 358 промотор
3 Разработка эффективного, простого и относительно недорогого метода точного определения локализации сайтов интеграции инсерций в геномной ДНК
4 Отбор и анализ новых морфологических мутантов А Лакана с повышенной экспрессией близ лежащих к инсерции Т-ДНК генов
Научная новизна Создана и проверена принципиально новая система векторов рЕпЬох/рСге (СепЬапк Ю 0(3645630, 00645631) для трансформации двудольных растений Получена и охарактеризована коллекция супер-экспрессирующих инсерционных мутантов А Ла1шпа, на данный момент состоящая из 156 линий, несущих Т-ДНК с сильным 35в промотором Разработан модифицированный метод определения локализации инсерций Т-ДНК в геноме трансгенного объекта Впервые идентифицированы и функционально охарактеризованы гены At5gl0080, А1^33390 и At5gl3760 А Лакапа, конститутивная экспрессия которых влияет на нормальных морфогенез А ЛаЬапа Впервые экспериментально получена полноразмерная кДНК гена А1^33390 и определена ее нуклеотидная последовательность, продукт которого относится к классу ОЕАН-Ьох АТФ-зависимых хеликаз А ЛаЬапа
Практическая значимость работы. Созданная система векторов рЕпЬох/рСге может быть использована для получения и легкого анализа коллекций трансгенных двудольных растений Разработанный модифицированный метод определения локализации инсерций Т-ДНК в геноме, отличающийся высокой эффективностью, может быть использован для широкого спектра трансгенных объектов Функционально охарактеризованные гены At5gl0080, А11§33390 и At5gl3760 А
thaliana представляют интерес для исследования как генетического контроля морфогенеза A thaliana, так и дополняют исследования в области функциональной организации геномов как модельного растения A thaliana, так и других высших растений
Апробация результатов работы. Основные положения и результаты работы были представлены на «Gene manipulation of microbial production of valuable products» (Thessaloniki, Greece, 2002), «Forces, Growth and Form in Soft Condensed Matter At the Interface between Physics and Biology» (Geilo, Norway, 2003), «Frontiers in Neurodegenerative Disorders and Aging Fundamental Aspects, Clinical Perspectives and New Insights» (Antalya, Turkey, 2003), «Biotechnology of Vegetable, Flower and not Widely Spread Crops», International Scientific Conference (Moscow, Russia, 2004), «Atomic Force Microscopy Applications in Biology» (Oeiras, Portugal, 2004), «Nuclear Receptors and their Ligands in Metabolism and Disease» (Bregenz, Austria, 2005), «ABC Proteins From Multidrug Resistance to Genetic Disease» (Innsbruck, Austria, 2006), "Human and Microbial Genomics DNA Arrays applied to Human Pathogens and Diseases" (Athens, Greece, 2006), «International Scientific Conference "Genetics in Russia and m a World"» (Moscow, Russia, 2006), «Plant Genomic European Meeting Plant GEMs 5» (Venice, Italy, 2006), «Bridging the Gap Between Gene Expression and Biological Function» (Luxembourg, 2006), «EMBL 8th International PhD Student Symposium "Biology of Disease - A Molecular Battlefield"» (EMBL, Heidelberg, Germany, 2006), «Systems Dynamics of Intracellular Communication - Overcoming Distance in Signalling Networks» (Jerusalem, Israel, 2007), «Biophysics of Membrane-Active Peptides» (Lisbon, Portugal, 2007), и на межлабораторном семинаре Института общей генетики им Н И Вавилова РАН (Москва, 2008)
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов, приложений и списка литературы Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц, 62 рисунка и 6 схем Список цитируемых литературных источников включает 158 наименований
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. В главе приведены перечни использованных в работе плазмид (pGEM-7Zf(-), pGEM-T Easy, pMDC32, pSKIOlS, JJ45, pQE32, pSheó, pRH43, pMLBart, pART7) любезно предоставленных коллегами из российских и зарубежных (Канада, США, Австралия, Германия, Франция) институтов, перечень антибиотиков (Gm, Str, Km, Hg, Cm, Am, Cb, Rif Spm, Баста), растительного материала (A thaliana Columbia-0), бактериальных штаммов (7 штамов Е coli JM 109, JM 110, МС1061, XLlBlu, DH5a, HBIOI, BL21(DE3)pLysS, и 2 штамма A tumefaciens GV 3101, C58) и сред для культивации Е coll, A tumefaciens (LB, SOC, SOB, YEB, Mac CONCEY AGAR), A thaliana (Квитко, Milieu Arabidopsis, B5), составы использованных буферов
Приведены методы выделения и очистки (хроматография, трубчатый электрофорез и др ) ДНК и РНК из бактерий (3 метода) и растений (4 метода), различные методы получения компетентных клеток Е coli (3 метода) и A tumefaciens (3 метода) и по 3 варианта их трансформации
Особое внимание уделено разделам, посвященным культивации, трансформации и отбору трансгенных растений A thaliana m vitro и m vivo Описаны процедуры необходимые для проведения блот-гибридизации по Саузерну (Остерман, 1983, Маниатис 1984, в модификации) и ручного секвенирования ДНК по Сэнгеру (Sanger and Coulbon, 1975)
Приведены условия для проведения синтеза кДНК и получения ESTs и полноразмерной кДНК
Метод быстрого клонирования
Подробно описан разработанный метод быстрого клонирования применимый в случае переклонирования фрагмента одной плазмиды в другой вектор, отличающихся селективными генами устойчивости к антибиотикам Основные отличия этого метода заключаются в отсутствии стадий электрофореза, элюирования ДНК-фрагментов из геля, и укорочены во времени все основные стадии
1 мкг донорной плазмиды обрабатывался Юед/акт рестриктазы (либо смесью рестриктаз) в соответствующем буфере 30-60 минут Таким же образом обрабатывался и вектор реципиент Затем обе реакции прогревали до +65°С 10 минут, смешивали в одной пробирке и переосаждали этанолом в присутствии 2-5 мкг гликогена на -70°С, 10 минут После центрифугирования, бОООоб/мин 10 минут, осадок, не промывая 70%-ым этанолом, подсушивали на 65°С 5 минут, и растворяли в заранее приготовленных 20 мкл лигазного раствора (2мкл х10 лигазного буфера, Юед/акт лигазы, Н20) Инкубировали 30 минут и 2 мкл этой смеси использовали для элетропорации компетентных клеток, которые затем высевали на среду с селективным маркером реципиентной плазмиды Остальной объем смеси оставляли на+10°С на ночь
Полученные через 12-16 часов колонии проверяли прямым ПЦР (ПЦР-скрининг бактериальных колоний) Использовали пару праймеров, один из которых имел сайт отжига на реципиентной плазмиде рядом с сайтом клонирования, и был направлен на него, а второй праймер отжигался на клонированном фрагменте в ориентации, необходимой для протекания реакции Результаты и обсуждения.
Создание системы векторов дчя индукции супер-экспрессии генов у двудочьных растений
В работе описана созданная нами система двух векторов pEnLox и рСге (Погорелко и др , 2007) (Рисунок 1) Вектор pEnLox предназначен для индукции инсерционных мутаций, а вектор рСге - для получения трансгенных линий растений с экспрессирующимся геном рекомбиназы Сге Энхансер транскрипции (4 повтора промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, CaMV 35S) в составе Т-ДНК плазмидного вектора pEnLox окружен fox-сайтами При скрещивании исследуемого инсерционного мутанта, полученного путем трансформации вектором pEnLox, с другой трансгенной линией A thahana, несущей ген сге, происходит удаление последовательности CaMV 35S промотора Созданная система векторов позволяет индуцировать инсерционные мутации и дифференцировать возможное влияние на
мутантный фенотип, которое может быть связано либо с подавлением функции гена при встраивании в него инсерции, либо с суперэкспрессией близлежащих генов за счет наличия в структуре инсерции СаМУ 355 промотора. Система векторов рЕпЬох/рСге.
Система двух векторов рЕпЬох и рСге используется следующим образом. Энхансер в составе Т-ДНК плазмидного вектора рЕпЕох окружен /<?хР-сайтами.
иношш-синтеташын промотор
fo.xP
9 BASTA С»М Y35S
1 ■ - С*яМ\ 35S ' / r.iMV35S íaM\35S
CaMVltS *OS.t-t—
сити. ^ ,,„R2
лшый «ордер ¡tal' " левый ворлср
pE„L0I —ь,к J }
Рисунок 1. Физическая карта векторов pEnLox и рСге
Следующее поколение от скрещивания исследуемого инсерционного мутанта, полученного путем трансформации вектором pEnLox и отобранного при помощи гербицида БАСТА, с другой трансгенной линией A. thaliana, несущей ген ere, высевается in vitro на селективную среду с антибиотиком гигромицином и после отбора устойчивых растений обрабатывается экзогенно дексаметазоном, в результате чего происходит удаление энхансерной последовательности. После вырезания энхансера, в последовательности Т-ДНК, по прежнему встроенной в геномную ДНК, остается ген гербицид устойчивости с промотором и один из loxР-сайтов. Таким образом, этот остаток Т-ДНК преобразуется в обычный тип инсерций, которые используются для получения «»/-мутантов, а сам мутант, после вырезания энхансера, преобразуется в обычного >ш/-мутанта. Необходимо еще раз подчеркнуть, что целью создания представленной системы векторов является получение коллекции инсерционных мутантов с конститутивной экспрессией генов, а так как для индукции суперэкспрессии необходимым требованием является локализация
инсерции в межгенном пространстве, то этот остаток в последствии никак не влияет на функционирование окружающих генов
При удалении из состава Т-ДНК последовательности СаМУ 35Б промотора, уровень транскрипции исследуемого гена падает и соответственно исчезает мутантный фенотип Реверсия к дикому типу не всегда проявляется на 100% в первом после скрещивания поколении «двойных мутантов» и зависит от стадии развития растения, на которой началась обработка дексаметазоном, но во втором поколении фенотип полностью соответствует дикому типу
Учитывая тот факт, что вырезание сге -рекомбиназой фрагментов ДНК, заключенных между /ох-сайтами, является высокоэффективным процессом, восстановление инсерционным мутантом фенотипа растения дикого типа происходит уже во втором поколении
Почучение кочлекции инсерг^юнных мутантов АгаЫс/орзм ¡ИаНапа, с повышенной экспрессией бчизчежащих к инсерции Т-ДНК генов
Целью данной задачи являлось получение новых линий мутантов, несущих в геноме инсерцию Т-ДНК плазмиды рЕпЬох Таким образом, эти линии образовали отдельный кластер мутантов, характеризующихся конститутивной экспрессией генов, близлежащих к инсерции
На первом этапе анализа семян Т2 поколения было отобрано 156 устойчивых к гербициду Баста растений (Е-линий), и 8 вспомогательных растений, устойчивых к антибиотику гигромицину (С-линии)
Учитывая тот факт, что в первую очередь целью данной работы было идентификация функций генов вовлеченных в контроль морфогенеза высших растений, мы сфокусировались на поиске фенотипически отличающихся от растений дикого типа мутантов среди трансгенных линий, полученных с помощью вектора рЕпЬох, тогда как среди линий, полученных с помощью вектора рСге, мы были заинтересованы, наоборот, в растениях с фенотипом дикого типа
Среди растений, содержащих инсерцию вектора рЕпЕох нами были отобраны 3 фенотипических мутанта (линии Е9, Е78, Е134) Однако для проверки
работоспособности системы векторов pEnLox/pCre мы не ограничились только этими линиями, а исследовали еще 18 мутантов (линии El, Е4, Е7, ЕЮ, Е12, Е13, Е14, Е15, Е17, Е18, Е20, Е21, Е23, ЕЗО, Е31, Е35, Е37, Е40), не имеющих никаких морфологических отличий от растений дикого типа Atabidopsis thaliana В дальнейшем описании работы мы будем рассматривать только мутантов, полученных с помощью вектора pEnLox (Е-линии), так как растения, содержащие инсерцию Т-ДНК плазмиды рСге (С-линии) являются вспомогательными, и более детальное исследование этих линий не представляло интереса
Для подтверждения наличия инсерции/инсерций Т-ДНК в геноме мутантов анализируемых линий, а также для определения их количества, было осуществлено два последовательных эксперимента Три четверти анализируемых линий показали в ТЗ-поколении наследование маркера устойчивости к гербициду по моногенному типу, что соответствовало расщеплению 3 1, и одна четверть мутантов содержала в геноме 2 независимо интегрированных инсерции Данные, полученные путем анализа расщеплений по признаку устойчивости к селективному маркеру в ТЗ-поколении отобранных линий, были проверены более точно с помощью блот-гибридизации по Саузерну рестрицированной геномной ДНК растений Е-линий с фрагментом Т-ДНК плазмиды pEnLox Геномную ДНК, выделенную из мутантов линий El, Е4, Е7, ЕЮ, Е12, Е13, Е14, Е15, Е17, Е18, Е20, Е21, Е23, ЕЗО, Е31, Е35, Е37 и Е40 использовали в качестве матрицы для проверки наличия инсерции Т-ДНК методом ПЦР
Установчение точной локализации инсерции в геноме
Одним из ключевых этапов в исследовании инсерционных мутантов является определение точной локализации сайта интеграции Т-ДНК в геном Для этого используются несколько вариантов специальных методов ПЦР, описанных в разделе, посвященном обзору литературы Однако все 3 перечисленных метода обладают рядом недостатков, которые в отдельных случаях не позволяли получить однозначного результата
В связи с этим, в нашей лаборатории был разработан модифицированный метод идентификации локализации инсерций, включающий в себя отдельные элементы всех вышеперечисленных подходов с дополнениями Модифицированный метод ЯС-РСЯ (гтРСЯ)
Недостатком ПЦР с вырожденными праймерами является дороговизна метода наряду с большим количеством не специфических продуктов реакции, среди которых иногда практически невозможно выделить специфический
Наличием большого числа побочных продуктов также характеризуется и второй метод - ТАП--РСЯ с адаптерами Несмотря на ингибирование элонгации 3'-конца короткой цепи адаптера за счет присутствия ЫН2-группы, как показала практика, невозможно синтезировать 100% фрагментов с МН2-грушгай, что также зачастую приводит к появлению не специфических продуктов ПЦР-реакции, за счет наработки геномных фрагментов фланкированных адаптерами с двух сторон, что связано с расщеплением всего генома одинаковой рестриктазой
Недостатком третьего метода, инвертированного ПЦР (щуегее-РСК.), является использование редкощепящих рестриктаз, сайты узнавания которых зачастую находятся на расстоянии нескольких т п н от бордера, что делает невозможным амплификацию нужного фрагмента Гяд-полимеразой
За основу модифицированного метода был взят принцип инвертированного ПЦР Для того чтобы исключить основной недостаток этого метода - использование редкощепящих рестриктаз и последующего анализа расщепленной геномной ДНК при помощи блот-гибридизации по Саузерну, мы использовали частощепящие рестриктазы, такие как Ога\, Nае\ и Яsal Такого типа рестриктазы используются в методе ТА1Ь-РСЯ с адаптерами, однако они не подходят для стандартного туегее-РСЯ, так как в ходе обработки геномной ДНК частощепящими рестриктазами образуется огромное количество небольших фрагментов, которые могут полиндромно лигироваться с необходимым фрагментом ДНК, содержащим бордер и около бордерную неизвестную последовательность Однако очевидно, что количество в лигазной смеси таких рекомбинантных самолигированных кольцевых
молекул ДНК, содержащих в своей структуре также и не специфический фрагмент, намного меньше, чем нормальных кольцевых молекул и амплификации неспецифических фрагментов можно избежать, если использовать принцип ступенчатого 11ЦР, как в методе ТА1Ь-РСЯ с вырожденными праймерами. Это предполагает использовать не одну, а три пары специфических к Т-ДНК праймеров таким образом, что один праймер направлен в обратную сторону от трех других, которые в свою очередь однонаправлено расположены друг за другом на заранее известном расстоянии порядка 100 п.н. В данном варианте, как и в методе ТА1Ь-РСЯ с вырожденными праймерами. амплификация идет в 2 этапа. Однако этот вариант амплификации ЕБТ также обладает недостатком присутствия не специфически амплифицированных фрагментов ДНК.
Эта проблема отпадает, когда на первом и втором этапе используются совершенно не зависимые пары праймеров (Рис. 2).
А
В
Рестрикция и самолигированис геномной ДНК
О
само.ни пропан ими сайг рестрикции
сайт рестрикции
4
:аПт рестрикции
геномной ДНК
11с твесшии поелглжшсльнопь I томной ДНК
ПЦР-реаккия со специфическими праймерами на Т-ДНК
50(1 п.н.. ■100 п.н.-ЗШ) fi.fi.-
Рисунок 2. Амплификация в 2 этапа с помощью метода ниРС Н с использованием частощепящих рестриктаз и независимых пар праймеров на первом и втором этапах.
A) Принципиальная схема метода ииРСЯ с использованием частощепящих рестриктаз и независимых пар праймеров ни первом и втором этапах.
B) Электрофорез продуктов второго этапа амлификации с помощью метода ппРСК с использованием частощепящих рестриктаз и двух пар праймеров.
М. Маркер 1кЬ(+) (¡тчпо^епе)
1. Продукт амплификации с помощью праймеров 2а+2Ь
2. Продукт амплификации с помощью праСтеров 2а+2с
Отличием метода гтРСЯ является использование на первом этапе отдельной
пары праймеров 1а+1Ь. Полученный амплификат разбавляется и используется на
втором этапе амплификации с помощью 2-х пар праймеров 2а+2Ь и 2а+2с. Таким образом, не специфические ДНК-продукты, полученные в ходе первого этапа, не реамплифицируются на втором этапе, так как сайты узнавания праймеров второго этапа находятся на Т-ДНК и отсутствуют в не специфических фрагментах полученных с одного или пары праймеров первого этапа.
Таким образом, miPCR представляет собой достаточно дешевый, простой и быстрый способ получения FSTs (Flanking Sequence Tags) из любых организмов, где есть необходимость амплифицировать фрагмент ДНК, нуклеотидный состав которого частично не известен.
Амплификация примыкающей к бордеру последовательности не известной геномной ДНК На следующем этапе анализа геномную ДНК мутантов линий: El, Е4, Е7, ЕЮ, Е12, Е13, Е14, Е15, Е17, Е18, Е20, Е21, Е23, ЕЗО, Е31, Е35, Е37 и Е40 использовали для miPCR. В результате были амплифицированы 36 независимых «гибридных» фрагментов ДНК, состоящих из околобордерной последовательности Т-ДНК и примыкающей к ней неизвестной геномной (Рис.3).
Рисунок 3. Электрофорез 2-ой и 3-ей ступени wiPCR анализируемых линий мутантов.
ДНК фрагменты, полученные в результате 2-ой ступени амплификации, были изолированы из геля и определена их нуклеотидная последовательность Компьютерный анализ полученных нуклеотидных последовательностей амплифицированных «гибридных» фрагментов ДНК проводили с использованием базы данных «GenBank» (www nebí nih gov), в которой представлена информация о последовательностях ДНК и белков организмов, относящихся к различным таксонам, а также специализированной для A thahana базы данных «TAIR» (www arabidopsis org) Для поиска и компьютерного анализа использовали программы «BLAST» (Basic Local Alignment Search Tool), находящиеся на серверах TAIR и NCBI Полученные данные по локализации инсерций в 19-ти исследуемых линиях приведены в таблице 1
Проверка работоспособности системы векторов pEnLox/pCi е Для доказательства работоспособности системы векторов pCre/pEnlox мы использовали 18 E-мутантов (линии El, Е4, Е7, ЕЮ, Е12, Е13, Е14, Е15, Е17, Е18, Е20, Е21, Е23, ЕЗО, Е31, Е35, Е37, Е40) и 8 гомозиготных С-линий (CI, С2, СЗ, С4, С5, С6, С7, С8) не отличающихся по фенотипу от растений дикого типа, с экспрессирующимся геном ere В связи с тем, что для скрещивания необходимы зрелые растения, в работе использовались растения 4-х недельного возраста
Неопыленные бутоны E-растений (акцепторы) были скрещены со зрелыми цветами С-линий (доноры) путем непосредственного тесного контакта таким образом, чтобы донорная пыльца максимально покрыла поверхность бутона Известно, что для максимальной эффективности оплодотворения сторонней пыльцой у однодомных растений самоопылителей с обоеполыми цветками необходимо удалить андроцей до созревания гинецея и раскрыть бутон для увеличения вероятности попадания пыльцы на поверхность пестика Такие кропотливые процедуры, требующие большого опыта, часто приводят к гибели цветков Однако, в случае системы pCre/pEnLox, как упоминалось выше, скрещиваемые растения несут разные селективные маркеры и процесс получения мутантов, несущих Т-области обоих векторов значительно упрощается
Табчица 1 Локализация инсерций в исследуемых линиях и номер, присвоенный в _ СепВапк при регистрации соответствующих ДНК маркеров_
№ 1ИНИИ Ген/Длина Описание продукта Структура ■ ена Локализация/Ориентация инсерции GenBa к AccJV«
El AT5G67230 2202п н Белок семейства 43 тликозил-трансфсраз 3 экзона Иисерция за 200п и до старг-кодона 35S промотор направлен па старт-кодон DX57597
Е4 AT1G68050 2214пн Флавин-связывающий, Кслч-домсн содержащий F -box белок 2 экзона Инсерция в середине 2-го экзона 35S промотор направлен на сгарт-кодои DX573S2,
Е7 AT4g27260 2587п н Белок вовлеченный в ауксиновый ответ и гомсостаз 3 экзона Инсерция за 450п н до старт-кодона 35S промотор направлен в обратную сторону DX57597
ЕЮ AT5G06700 2553пн Белок неизвестен 5 экзонов Иисерция за 800п н до старг-кодона 35S промотор направлен на старт-кодон DX57504
Е12 A13G15115 1498п н Белок неизвестен 2 экзона Иисерция за 50п и после стоп-кодона 35S промотор направлен на сгоп-кодон DX57504I
Е13 AT2G12740 Пссвдогсн семейства Джипси рстротранспозонов Нет данных Нет данных DX57504
Е14 At3g30!22 2367пн Пссвдогсн Нет данных Инсерция в конце ORF 35S промотор направлен на нромогер DX57504
Е15 AT5G02910 1957пн F-box белок схожий со специфической лиазой апуриновых сайтов рибосомальной РНК 3 экзона Инсерция в конце 1-ого экзона 35S промотор направлен на нромогер DX57503
Е17 AT2G45750 2929пн Предполагаемая метилтрансфераза 5 экзонов Инсерция в начале 1-ого экзона 35S промотор направлен на стоп-кодон DX57504
El 8 AT5G07010 1429п н Сулъфотрансфераза 1 экзон Инсерция в 800н н после старт-кодона 35S промотор направлен на с гарт-кодон DX57503
Е20 AT1G05S05 2920пн Белок семейства Basic hclix-Ioop-hchx (bHLH) 6 экзонов Инсерция в 5'-UTR 35S промотор направлен на старт-кодон DX57503
E2I At]g77880 393пн Циклин-подобный F-box белок 1 экзон Инсерция за 1 8т п п до старг-кодона 35S промотор направлен на старт-кодон DX57503
Е23 AT4G02733 1340пн Циклин-подобный F-box белок 5 экзонов Инсерция нескольких нуклеотидах до старт-кодона 35S промотор направлен на стоп-кодон DX57594
ЕЗО AT1G06840 5626п н Предполагаемая лейцин богатая трансмембранная протсин-киназа 20 экзонов Инсерция за 50п н до старт-кодоиа 35S промотор направлен в другую сторону - на старт-кодон предыдущего гена Atlg06830 (bZIP транскрипционный фактор), коюрый расположен в 1 7 т и н DX57503
Е31 AT4G28500 1253пн Белок семейства NAM 3 экзона Инсерция за ЮОп н до старт-кодона 35S промотор направлен на старт колой DX57594
Е35 Центромерный район 4ой хромосомы DX57594
Е37 At2g25730 15979пн Белок неизвестен 32 экзона Инсерция в 8-ом интропе 35S промотор направлен на старт-кодон DXS7504
Е40 AT1G56690 2115пн Пснтатрикопсптид (PPR) повтор содержащий белок 1 экзон Инсерция за 200п н до старт-кодопа 35S промогор направлен на старт-кодон DX57503
Для получения «двойных мутантов», названных СЕ-линии, использовалось по одному Е-растению от каждой исследуемой Е-линии, которое было оплодотворено пыльцой одного из С-растений. Каждый искусственно опыленный бутон был помечен, и через 1-2 недели, после формирования спелого стручка, семена были собраны отдельно от остальных. Для исключения влияния эффекта положения, при объединении в одном геноме двух инсерций, при скрещивании использовались растения Е-линий и растения всех восьми С-линий в различных комбинациях
Потомство каждого скрещивания было проращено in vitro на среде содержащей ЗОмг/л гигромицина. 3-8% проросших растений показали устойчивость к антибиотику и через 2 недели были пересажены в почву.
Удаление энхансера из состава интегрированной в геном Т-ДНК. Через 2-3 дня после пересадки в открытый грунт, устойчивые к гигромицину растения опрыскивались 0.1 мкМ дексометазоном один раз в день 6 дней и гербицидом Баста (250мг/л) 6 раз через день. После обработки вторым селективным маркером и дексометазоном - стимулятором изменения третичной структуры GR-домена рекомбинантного белка CreGR, в течение нескольких часов происходило проникновение в ядра клеток рекомбиназы Сге и удаление 35S промотора из геномной ДНК под ее воздействием.
Ml 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 1J 13 14 15 16 17 18 19 21) 21 22 23 24 25^6 27 28 29Т0 31 32 33 34 35 36
~"ттЯ~* — — — ."% "и"" "в
Рисунок 3. ПЦР-тест вырезания 355 промотора из геномной ДНК СЕ-гибридов после обработки дексометазоном с помощью прайм еров \1NS_PiDinRer и рЕп/ЬВОИеу. В качестве контроля использовалась ДНК исходных родительских растений соответствующих Е-линий.
м . 1 kb+ Invitrogen ДНК маркер 9. пул Е12+С5 18. Е17 27. пул Е30+С6
/. пул ЕI+С1 10. Е12 19. пул Е18+С2 2S. Е30
2. Е1 11. пул Е13+С6 20. Е18 29. пул Е31+С7
3. пул Е4+С2 12. Е 13 21. пул Е20+СЗ 30. Е31
4. Е4 13. пул Е14+С7 22. Е20 31. пул Е35+С8
5. пул Е7+СЗ 14. Е14 23. пул Е21+С4 32. Е35
6. Е7 15. пул Е15+С8 24. Е21 33. пул Е37+С1
7. пул Е10+С4 16. Е15 25. пул Е23+С5 34. Е37
8. ЕЮ 17. пул E17+CI 26. Е23 35. пул Е40+С2 36. Е40
Через неделю после обработки, геномную ДНК растений проанализировали при помощи ПЦР используя фланкирующие 35Б промотор праймеры и показали 100% эффективность вырезания внутреннего фрагмента между двумя /ох-сайтами (Рис 3) Мы использовали геномную ДНК - пул из 5-ти независимых СЕ-гибридов, полученных от каждой Е-линии
Морфочогические мутанты АгаЬк^орэм IЪаЬапа
Важно отметить, что одной из главных задач данной работы было получение и изучение коллекции суперэкспрессирующих мутантов АгаЬ^орзгя ЛаЬапа Как видно из таблицы 7, среди 18-ти проанализированных линий, 8 линий (Е1, ЕЮ, Е20, Е21, Е23, Е30, Е31, Е40) несут инсерцию в такой ориентации, что 358 промотор в составе Т-ДНК направлен на старт кодон трансляции рядом расположенного гена и потенциально может вызывать его суперэкспрессию Так как мы были заинтересованы только в мутантах с необычным фенотипом, мы не проверяли экспрессию всех генов, содержащих 35Б промотор перед старт кодоном, поскольку представленная часть мутантов не отличалась фенотипом от растений дикого типа Однако среди остальных анализируемых трансформантов нам удалось выявить 3 линии Е9, Е78 и Е134, отличающихся от растений дикого типа по морфологическим признакам
Анализ расщеплений и блот-гибридизация по Саузерну показали наличие одной копии инсерции Т-ДНК в данных линиях (Табл 3)
Таблица 3 Расщепления морфоюгических Е-мутантов ТЗ-поколения под воздействием
гербицида Баста
Линия Устойчивые НЕ устойчивые * Расщепление Количество инеерций
Е9 140 55 1,07<3,84 (для уровня значимости 0 05) 3 1 1
Е78 43 17 0,56<3,84 (для уровня чначимос ги 0 05) 3 1 1
Е134 94 30 0,04<3,84 (для уровня значимости 0 05) 3 1 1
Проверка точной локализации инеерций в морфологических мутантах показала, что во всех трех линиях Т-ДНК встроилась непосредственно перед генами
таким образом, что энхансер направлен на етарт-кодоны и потенциально может вызывать суперэкспрессию этих генов (Табл 4)
Тиб 'ищи 4 Локализация инсерций в линиях с измененной иорфоюгиеи
№ линии Ген/Длима Описание продукта С1р)ю>ра 1 епа Локализация/Ориентация ипсершш СепВапк ЛссЛ»
Е9 АТ5а0080 2538п н Белок семейства аспартил протеаз 9 экзонов Инсерция за 400п н до старт-кодона 35Э промотор направлен на старт-кодон 0X575044
Е78 АТЮ33390 4371 пн ОЕАН-Ьох АТФ- зависимая хеликаза 8 экзонов Инсерция за 530 п н до старт-кодона 35Э промотор направлен на старт-кодон ЕИ 83464
Е134 АТ5в 13760 2922 п н Неизвестный белок содержащий пролин богатый домен 5 экзонов 355 промотор за 270 и н до старт-кодона и направлен на старт-кодон £1232171
Хотелось бы также отметить, что получение супер-экспрессирующих мутантов обладает еще одним важным аспектом В случае, когда мутант характеризуется супер-экспрессией гена, который в растениях дикого типа не экспрессируется, либо обладает низкой органо/ткане специфической экспрессией, мы получаем уникальную возможность экспериментально получить кДНК этого гена что весьма затруднительно осуществить, используя растения дикого типа Линия Е9
Линия Е9 обладала сильно выраженным мутантным фенотипом (Рис 4 (А)), который наследовался по типу доминирования Все растения этой линии несущие Т-ДНК проявляли мутантный фенотип и содержат одну инсерцию Т-ДНК
Как уже было указано в таблице 4 инсерция встроилась в 5'-некодирующую область гена At5gl0080 за 400 п н до старт кодона трансляции По данным специализированной для А Макета базы данных «ТА11Ъ> ген At5gI0080 имеет размер 2538 пни состоит из 9-ти экзонов, а предположительный продукт гена относится к классу аспартиловых протеаз А1, обладает активностью схожей с пепсином А, участвует в процессах протеолиза и локализуется в клеточных мембранах
Рисунок 4. Сравнение фенотипов растений Е9, Е9/С4 Е78, Е78/С4, Е134, Е134/С4 и растения дикого типа Л.ЛаЧапа СоЮ. Возраст 7 недель.
(A) Исходный мутант Е9 с повышенной экспрессией гена А15^Ю080
(B) СЕ9-гибрид с нормальной экспрессией гена At5gl0080
(C) Исходный мутант Е78 с повышенной экспрессией гена АЧ%33390 (й) СЕ78-гибрид с нормальной экспрессией стл А1^33390
(Е) Исходный мутант Е134 с повышенной экспрессией тt«лAt5gl3760 (К) СЕ134-гибрид с нормальной экспрессией гена А/5^13760 (С) Растение дикого типа А. гйаНапа СоЮ
Линия Е78
Морфологическим отличием линии Е78 является сильно выраженный фасциированный стебель, состоящий из 7-12 сросшихся стеблей (Рис.4 (С)). Мутангный признак наследовался по доминантно-моногенному типу. Инсерция встроилась в 5'-некодирующую область за 530 п.н. до старт кодона трансляции гена Atlg33390. Ген A/lg33390 имеет размер 4371 п.н. и состоит из 8-и экзонов, а продукт его относится к классу DEAH-box АТФ-зависимых хеликаз. Линия El 34
Растения линии Е134 характеризовались темно-зелеными розеточными
листьями с ненормальным «зубчатым» краем. Остальные листья характеризовались
сильным загибом, ассиметричным жилкованием и нестандартной формой листа
(Рис.4 (Е)). Мутантный признак наследовался по доминантно-моногенному типу.
Инсерция встроилась в 5'-некодирующую область за 270 п.н. до старт кодона
18
трансляции гена At5gl3760 Ген At5gl3760 имеет размер 2922 пни состоит из 5-и экзонов и кодирует белок длиной 570 амк, где фрагмент с 210-ои по 550-ую амк приходится на консервативный домен, характеризующийся высоким содержанием пролиновых остатков
Поиск возможных гомологов целого гена At5gl0080 A thahana в «GenBank» сервера «NCBI» при помощи программы «BLAST» показал отсутствие других гомологичных последовательностей генов у А thahana, однако выявил наличие гена 80А08_5 (3621 пн) у Репы огородной (Brassica тара L), обладающего на 85% гомологичной последовательностью ДНК и схожими функциями Информация о гомологах генов Atlg33390 и At5gl3760 А thahana в «GenBank» сервера «NCBI» обнаружена не была
По данным сервера Riken (http //rarge gsc nken jp/cdna/cdna_keyword pl) -одного из самых представительных по количеству экспериментально полученных мРНК генов различных организмов, полноразмерная мРНК ни одного из генов At5gl0080, Atlg33390, At5gl3760 еще не получена, что может быть связано с отсутствием или очень низкой экспрессией исследуемых нами генов Этот факт позволил нам дополнить недостающую информацию о мРНК гена At5gl0080, представленную в базе данных Riken, определив нуклеотидную последовательность кДНК значительной части данного гена
Также нам удалось дополнить информацию о структуре кДНК гена Atlg33390 На данный момент в базе Riken содержится информация о двух фрагментах кДНК этого гена, которые не дают представления о полноразмерной мРНК Наличие супер-экспрессирующего мутанта Е78 позволило впервые экспериментально получить полноразмерную кДНК гена Atlg33390, определить 5' и 3' не кодирующие области, а также точно локализовать сайты сплайсинга мРНК
Проверка уровня экспрессии бшзчежащих к инсерциям генов При помощи метода ПЦР на продукты обратной транскрипции суммарных РНК Е9, Е78 и El34 мутантов и растения дикого типа (СоЮ) мы сравнили экспрессию этих генов в розеточных листьях 3-х недельных растений и нашли, что
гены At5gl0080, Аг^33390 и At5gl3760 не экспрессируются в растениях дикого типа тогда как в Е-мутантах была обнаружена их сильная экспрессия (Рис 5).
Рисунок 5. Электрофореграмма ПЦР продуктов полученных с реакции
обратной транскрипции на гены At5gl0080, А1^33390 и А15£13760.
М. 1кЬ+ 1пУ1П-(^еп ДНК маркер
1. Е9-мутант (анализ экспрессии гена At5gl0080)
2. СоЮ (анализ экспрессии гена А15^10080)
3. Е9-мутант с удаленным энхансером (анализ экспрессии гена А/5^10080)
4. Е-78 мутант(анализ экспрессии гена А1^33390)
5. СоЮ (анализ экспрессии гена А1^33390)
6. Е78-мутант с удаленным энхансером (анализ экспрессии гена Atlg33390)
7. Е134-мутант(анализ экспрессии геш At5gI3760)
8. СоЮ (анализ экспрессии гена At5gI3760)
9. Е134-мутант с удаленным энхансером (анализ экспрессии гена At5gl3760)
Реверсия Е-мутантов к фенотипу дикого типа.
После удаления 358 промотора из геномной ДНК Е-мутантов экспрессия генов At5gl0080, А1^33390 и At5gI3760 была остановлена (Рис.5), тогда как остаток Т-ДНК присутствовал в геноме. Растения мутантной линии с удаленным 35Б промотором обладали фенотипом растений дикого типа (Рис.4 (в)), т.е. являлись фенотипическими ревертантами (Рис.4 (В), (О), (Р)).
Основываясь на полученных данных можно утверждать, что суперэкспрессия гена At5gl008U. кодирующего белок класса аспартиловых протеаз А1, локализирующегося в клеточных мембранах, приводит к нарушениям нормального морфогенеза растений - замедляет рост, изменяет окраску и приводит к уменьшенному габитусу взрослых растений. Суперэкспрессия гена А1^33390, ! кодирующего белок класса АТФ-зависимых хеликаз вызывает нарушения нормального развития стеблей растений, а именно вызывает развитие
фасциированного стебля Изменение экспрессии гена At5gl3760, кодирующею белок, содержащий пролин-богатый домен, приводит к нарушениям нормального развития растений, вызывает замедление роста и уменьшение фертильности
Заключение
На современном этапе развития функциональной геномики высших растений использование методов «knock out» для исследования функций экспрессирующихся генов не может позволить охватить весь геном из-за присутствия, так называемых, «молчащих», в стандартных условиях развития растения, генов Созданные на данный момент вектора для получения суперэнспрессирующих мутантов не используются широко из-за неудобств анализа такого типа мутантов Описанная в данной работе уникальная система векторов позволяет обойти такого рода проблемы На примере 3-х мутантов показана работоспособность новой системы, которая позволила уже на первых этапах определить 3 гена, изменение уровня экспрессии которых влияет на морфогенез A thaliana Этому способствовала также разработка высокоэффективного модифицированного метода определения локализаций инсерций в геноме растения Также было продемонстрировано, что суперэкспрессирующие мутанты являются удобным инструментом для получения полноразмерных кДНК генов, экспрессия которых очень низкая или вовсе отсутствует в растениях дикого типа
Выводы
1 Создана и проверена уникальная система векторов pEnLox/pCre для получения и анализа мутантов A thaliana, характеризующихся повышенной экспрессией, близлежащих к Т-ДНК, генов Впервые фаговая система рекомбинации Cre/lox была использована в активационном векторе для трансформации растений с целью определения функций генов растений, экспрессия которых отсутствует в норме в растениях дикого типа Показана высокая эффективность удаления 35S промотора из состава встроенной в геном Т-ДНК плазмиды pEnLox, что гарантирует эффективное получение ревертантов трансгенных растений
2 При помощи системы векторов pEnLox/pCre создана базовая коллекция инсерционных мутантов A thahana, состоящая из 156 трансгенных линий, в 21 из которых, при помощи специально разработанного модифицированного метода miPCR, определена локализация инсерций
3 Установлена функциональная значимость 3-х новых генов A thaliana At5gl0080, Atlg33390 и At5gI3760, изменение уровня экспрессии которых влияет на морфогенез A thaliana Впервые было показано, что изменение экспрессии независимых генов, продукты которых аннотированы как члены семейств аспартиловых протеаз, DEAH-box АТФ-зависимая хеликаз и пролин богатых белков приводит к нарушению нормального морфогенеза растений A thahana
4 Благодаря созданию уникального суперэкспрессирующего мутанта A thahana, линия Е78, впервые получена полноразмерная кДНК гена Atlg33390 и определена ее нуклеотидная последовательность, продукт которого относится к классу DEAH-box АТФ-зависимых хеликаз A thaliana Впервые экспериментально были определены сайты сплайсинга, 5' и 3' некодирующие области РНК, а также точный размер мРНК
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1) Огаркова О А , Томилов А А , Томилова Н Б , Погорелко Г.В., Тарасов В А Идентификация гена, инсерция в котором вызывает возникновение летальных проростков у Arabidopsis thaliana Онтогенез 2005 -Т 36, N3 -С 222-224
2) Погорелко Г.В., Фурсова О В , Огаркова О А , Тарасов В А Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений Генетика 2007 -Т 43, N2 -С 194-202
3) Огаркова О А , Томилов А А , Погорелко Г.В , Фурсова О В , Тарасов В А Инсерционный мутагенез Arabidopsis thahana коллекция морфологических инсерционных мутантов Биотехнология овощеводства, цветоводства и культур злаковых Москва 22-25 марта 2004 г, с 138-141
4) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA A new technique for activation tagging in Atabidopsis Gene 2008, V 414, №1-2, p 67-75
5) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA Functional Genomics of Arabidopsis thaliana Cloning of genes «Gene manipulation of microbial production of valuable products» Thessaloniki, Greece, September 1 - 7, 2002
6) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Functional Genomics of Arabidopsis thaliana Cloning of genes «Forces, Growth and Form m Soft Condensed Matter At the Interface between Physics and Biology», 24 March - 3 April, 2003, Geilo, Norway
7) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA Transgenic plants as the way to discover and validate novel genes and they functions «Frontiers in Neurodegenerative Disorders and Aging Fundamental Aspects, Clinical Perspectives and New Insights», May 26 - June 1, 2003, Antalya, Turkey
8) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA Functional Genomics of Arabidopsis thaliana «Atomic Force Microscopy Applications in Biology», July 7-9,2004 Institute Gulbenkian de Ciencia, Oeiras, Portugal
9) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA Comparative Genomics Finding Orthologeous Genes m Human and Plants «Nuclear Receptors and their Ligands m Metabolism and Disease» July 31 - August 4, 2005 Bregenz, Austria
10) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA Transgenic plants as the way to discover and validate novel genes and their functions in different organisms «ABC Proteins From Multidrug Resistance to Genetic Disease» Innsbruck, Austria, March 4-10,2006
11) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA Finding Orthologeous Genes in Human and Plants Controlling Disease Development "Human and Microbial Genomics DNA Arrays applied to Human Pathogens and Diseases", Hellenic Pasteur Institute, March 30 - April 7, 2006, Athens, Greece
12) Погорелко Г.В., Фурсова О В , Огаркова О А , Тарасов В А Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений Тез
докл на «Международная конференция Генетика в России и Мире», Июнь 28- Июль 2, 2006, ИОГен РАН, Москва, Россия
13) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA A New System of Vectors for Creation and Analyzing of Gain-of-Function Mutants of A thalina «Plant Genomic European Meeting Plant GEMs 5», October 11-14, 2006 Venice, Italy
14) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA From the variety to the integrity Studying genes functions of higher plants on model object Arabidopsis thahana «Bridging the Gap Between Gene Expression and Biological Function», 11-14 October, 2006, Luxembourg
15) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA Finding Orthologeous Genes in Human and Plants Controlling Disease Development «EMBL 8th International PhD Student Symposium "Biology of Disease - A Molecular Battlefield"», 30 November - 2 December 2006, EMBL, Heidelberg, Germany
16) Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding Genes of Cell Metabolism Control «Systems Dynamics of Intracellular Communication -Overcoming Distance in Signalling Networks» Maale HaChamisha, Jerusalem Hills, Israel, March 18-22, 2007
17) Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA Influence of Cell Membrane Integrated Proteins to the Plant Development «Biophysics of Membrane-Active Peptides» Lisbon, Portugal, April 1 - 4, 2007
Зарегистрированные данные
Название Описание GenBank ID
pEnLox Вектор для трансформации растений DQ645630
рСге Вектор для трансформации растений DQ645631
El FST мутантной линии A thaliana DXS75973
Е4 FST мутантной линии A thaliana DX573828
Е7 FST мутантной линии A thaliana DX575974
ЕЮ FST мутантной линии A thaliana DX575046
Е12 FST мутантной линии A thaliana DX575040
Е13 FST мутантной линии A thaliana DX575041
Е14 FST мутантной линии A thaliana DX575045
El 5 FST мутантной линии A thaliana DX575034
Е17 FST мутантной линии A thaliana DX575042
Е18 FST мутантной линии A thaliana DX57503S
Е20 FST мутантной линии A thaliana DX575036
Е21 FST мутантной линии A thaliana DX575039
Е23 FST мутантной линии A thaliana DX575942
ЕЗО FST мутантной линии A thaliana DX575037
Е31 FST мутантной линии A thaliana DX575943
Е35 FST мутантной линии A thaliana DX575944
Е37 FST мутантной линии A thaliana DX575043
Е40 FST мутантной линии A thaliana DX575038
Е9 FST мутантной линии A thaliana DX575044
Е78 FST мутантной линии A thaliana Ell 83464
Е134 FST мутантной линии A thaliana EI232171
Е9 Partial cDNA EST гена At5gl0080 A thaliana EL740208
Arabidopsis thaliana helicase-like (Atlg33390) mRNA, complete sequence Полноразмерная кДНК гена Atlg3339Q EF630362
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N00510 от01 12 99 г Подписано к печати 23 05 2008 г Формат 60x90 1/16 Уел печл 1,5 Тираж 100 зкз Заказ 203 Тел 939-3890 Тел /Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МЛ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Погорелко, Геннадий Владимирович
1. Введение
1.1 Актуальность темы.
1.2 Цель и задачи работы.
1.2.1 Цель работы:
1.2.2 Задачи:
1.3 Научная новизна.
1.4 Практическая,значимость работы.
2. Обзор литературы 11 2.1 Состояние проблемы.
• 2.2 Определение взаимосвязи между последовательностями ДНК и их функциями
2.2.1 Инсерционный мутагенез.
2.2.1.1 Индукция инсерционных мутаций при помощи транспозонов
2.2.1.2 Индукция инсерционных мутаций при помощи Т-ДНК
2.2.1.3 Векторы для трансформации растений
2.2.1.4 Энхансеры.
2.2.1.5 Векторы специального назначения на основе фаговых систем рекомбинации.
2.3 Использование Arabidopsis thaliana в качестве модельного объекта молекулярно- ^у генетических исследований высших растений.
2.3.1 Общие характеристики
2.3.2 Коллекции инсерционных мутантов A.thaliana
2.3.2.1 Коллекции loss-of-function мутантов
2.3.2.2 Коллекции gain-of-function мутантов
2.3.3 Морфологические мутанты.
2.4 Методы агробактериальной трансформации растений
2.5 Идентификация генов, меченных с помощью Т-ДНК
2.5.1 Амплификация методом ПЦР последовательностей ДНК, нуклеотидный состав ^ которых неизвестен.
3.5.2 Метод инвертированного ПЦР (inverse PCR).
3.5.3 Метод «ТА1Ь»-ПЦР с адаптерами.
3.5.4 Метод «ТА1Ь»-ПЦР с вырожденными праймерами.
2.6 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК. 45 2.6.1 Интернет базы данных.
2.7 Итоги 47 Экспериментальная часть
3.Материалы и методы
3.1 Растительный материал
3.2 Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе
3.2.1 Бактериальные штаммы
3.2.2 Плазмиды 49 3.3. Среды, использованные в работе. 50 3.3.1 Среды для культивирования бактерий. 50 3.3.2. Среды для выращивания растений А. thaliana.
3.3.2.1 Среда для выращиваниг растений A.thaliana in vitro
3.3.2.2 Среда для скрининга инсеционных мутантов A.thaliana in vitro
3.3.2.3 Среда для выращивания растений А.thaliana in vitro в присутствии A. tumefaciens
3.3.3 Антибиотики, использованные в работе. 52 3.4 Приготовление компетентных клеток E.coli 52 3.4.1 Приготовление клеток E.coli с низкой компетентностью.
3.4.2 Приготовление клеток E.coli со средней компетентностью.
3.4.3 Приготовление клеток E.coli с высокой компетентностью для электропорации.
3.5 Трансформация штаммов E.coli
3.5.1 Быстрая трансформация клеток с низкой компетентностью.
3.5.2 Трансформация клеток со средней компетентностью.
3.5.3 Трансформация клеток с высокой компетентностью (электропорация).
3.5.4 Отбор рекомбинантных плазмид.
3.6 Метод быстрого клонирования.
3.7 ПЦР-скрининг бактериальных колоний.
3.8 Трансформация A. tumefaciens.
3.8.1 Конъюгативный перенос.
3.8.2 Прямой перенос.
3.8.3 Трансформация при помощи электропорации.
3.9 Поверхностная стерилизация семян A. thciliana.
3.9.1 Быстрая стерилизация
3.9.2 Долгая стерилизация
3.10 Выращивание растений A. thaliana
3.10.1 Выращивание растений A. thaliana в стерильных условиях.
3.10.2 Выращивание растений A. thaliana в открытом грунте.
3.10.3 Выращивание трансгенных линий A. thaliana в стрессовых условиях.
3.11 Агробактериальная трансформация A. thaliana
3.11.1 Трансформация прорастающих семян.
3.11.2 Трансформация неопыленных бутонов взрослых растений.
3.12 Отбор трансгенных растений A. thaliana.
3.12.1 Отбор трансгенных растений A. thaliana in vitro.
3.12.2 Отбор трансгенных растений A. thaliana с помощью гербицида Баста.
3.12.2.1 Отбор трансгенных растений A. thaliana в почве. •
3.12.2.2 Отбор трансгенных растений A. thaliana на песке.
3.13 Выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana.
3.13.1 Выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana для ПЦР-тестирования.
3.13.2 Мини-препаративное выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana
3.13.3 Выделение ДНК без примесей из тканей A.thaliana для клонирования и блот- ^ гибридизации.
3.13.4 Выделение ДНК без примесей из тканей A.thaliana для получения FST.
3.14 Выделение плазмидной ДНК из клеток бактерий.
3.14.1 Мини-препаративное выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток.
3.14.2 Препаративное выделение плазмидной ДНК из штаммов E.coli тепловым ^ методом.
3.14.3 Выделение плазмидной ДНК с минимальным количеством примесей.
3.15 Очистка ДНК от примесей белков.
3.16 Очистка ДНК от примесей РНК.
3.17 Уменьшение объема пробы изо-бутанолом
3.18 Хроматографическая очистка ДНК
3.19 Очистка ДНК от агарозы.
3.19.1 Очистка ДНК при помощи трубчатого электрофореза.
3.19.2 Очистка ДНК при помощи электроэлюирования.
3.19.3 Очистка ДНК при помощи центрифугирования.
3.20 Стадии клонирования: рестикция, модификация и лигирование фрагментов ДНК.
3.20.1. Клонирование ПЦР-фрагментов
3.20.2. Приготовление Т-вектора.
3.21 Блот-гибридизация по Саузерну.
3.21.1 Рестрикция геномной ДНК.
3.21.2 Электрофорез и перенос на мембрану переваренной геномной ДНК.
3.21.3 Приготовление меченного зонда.
3.21.4 Гибридизация и радиоавтографирование.
3.22 Тестирование ДНК растений при помощи ПЦР.
3.23 ПЦР-амплификация области геномной ДНК A. thaliana, примыкающей к Т-ДНК инсерции.
3.23.1 Модифицированный метод ПЦР для локализаций инсерций.
3.24 Выделение РНК из растений 7В
3.25 Синтез кД1 IK (обратная транскрипция).
3.25.1 Реакция обратной транскрипции.
3.25.2 Получение EST гена At3gl8780 (геи «домашнего хозяйства», актин)
3.25.3 Получение EST гена At5g 10080.
3.25.4 Получение EST reuaAtlg33390.
3.25.5 Получение EST гена At5g 13760.
3.25.6 Поучение полноразмерной кДНК гена At 1 g
3.26 Секвенирование Д1IK.
3.26.1 Секвенирование в лаборатории
3.26.1.1. Подготовка стёкол 8 Г'
3.26.1.2. Приготовление геля.
3.26.1.3. Заливка '
3.26.1.4. Форез
3.26.1.5. Послефорезная обработка
3.26.1.6. Автограф
3.26.2 Автоматическое секвенирование
3.27 Активизация гена Сге в трансгенных линиях A.thaliana
3.27.1 Обработка дексометазоном в стерильных условиях.
3.27.2 Обработка дексометазоном в открытом грунте.
3.28 Тестирование растений на наличие эмбриональных леталей 82 4. Результаты и обсуждение. 83 4.0. Постановка задачи
4.1 Создание системы векторов для индукции супер-экспрессии генов у двудольных растений.
4.1.1. Создание вектора pEnLox для получения индуцирующих инсерционных мутаций.
4.1.1.1. Проверка вектора pEnLox
4.1.1.2. Свойства вектора pEnLox
4.1.2. Создание вспомогательного вектора рСге для реверсий мутаций супер-экспрессии генов, вызванных действием энхансера.
4.1.2.1. Проверка вектора рСге
4.1.2.2. Свойства вектора рСге
4.1.3. Система векторов pEnLox/pCre.
4.2 Расширение коллекции инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana. 98 4.2.1. Трансформация растений Arabidopsis thaliana.
4.3 Анализ инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana.
4.3.1. Отбор трансгенных растений.
4.3.2. Установление наличия и количества инсерций.
4.3.2.1. Анализ расщеплений в ТЗ поколении '
4.3.2.2. Проверка при помощи блот-гибридизации по Саузерну
4.3.2.3. Проверка наличия энхансера Т-ДНК, интегрированной в геном методом ПЦР
4.3.3. Установление точной локализации инсерций в геноме.
4.3.3.1. Модифицированный метод RC-PCR (miPCR)
4.3.3.2. Амплификация примыкающей к бордеру последовательности не известной геномной Д1IK
4.3.3.3. Определение нуклеотидной последовательности ПЦР фрагментов
4.3.3.4. Компьютерный анализ полученных данных. 111 4.4. Проверка работоспособности системы векторов pEnLox/pCre.
4.4.1. Скрещивание Е-линий с С-линиями.
4.4.2. Отбор мутантов по двум селективным маркерам.
4.4.3. Удаление энхансера из состава интегрированной в геном Т-ДНК.
4.4.4. Проверка эффективности удаления методом ПЦР 115 4.5 Морфологические мутанты Arabidopsis thaliana
4.5.1. Поиск мутантов с измененной морфологией.
4.5.2. Идентификация генов, супер-экспрессия которых влияет на морфогенез ^ ^ Arabidopsis thaliana.
4.5.2.1 Линия Е
4.5.2.2. Компьютерный анализ гена At5gl
4.5.2.3 Линия Е
4.5.2.4. Компьютерный анализ гена Atlg33390.
4.5.2.5. Линия El
4.5.2.6. Компьютерный анализ гена At5gl3760.
4.5.2.7. Поиск возможных гомологов исследуемых генов A.thaliana.
4.5.2.8. Поиск информации об экспрессии исследуемых генов.
4.5.2.9. Проверка уровня экспрессии близлежащих к инсерциям генов.
4.5.3. Реверсия Е-мутантов к фенотипу дикого типа.
4.5.4. Обсуждение проблемы дистального действия энхансеров
Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и анализ трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh с повышенной экспрессией генов"
1.1 Актуальность темы.
Расшифровка полной нуклеотидной последовательности генома Arabidopsis thaliana в конце 2000 года позволила реально перейти к решению центральной проблемы молекулярной генетики высших растений1 -идентификации функции генов: Для определения функций генов-используются методы как прямой, так и обратной генетики. В' случае использования подходов прямой генетики создается коллекция' мутантов, среди которой'проводится отбор-кандидатных генов* по > фенотипу. Подход обратной генетики используют уже полученные данные о состоянии генома, о наличии и локализации.мутаций. В этом случае возможен перенос-данных, полученных на любых растениях.
При изучении таких объектов, как микроорганизмы и животные для определения функциональной значимости отдельных генов, широко используется ген-направленный мутагенез, связанный с замещением интактных генов мутантными путем гомологичной рекомбинации (Bouchez, Höfte, 1998; Rijkers et al., 1998). Однако у высших растений применение такого подхода затруднено, если вообще возможно. Это связано с относительно низкой эффективностью гомологичной рекомбинации (Klutstein et al., 2008) и, напротив, высокой эффективностью незаконной рекомбинации в соматических клетках (Puchta, Hohn, 1996). В этой связи основным методом при определении функциональной значимости генов у i высших растений, и в первую очередь у A. thaliana, является метод инсерционного мутагенеза (Огаркова и др., 1997; Томилов и др., 1999).
Несмотря на то, что кроме A. thaliana существует ряд других видов высших растений, изучение структурной организации генома^ которых активно ведется во многих лабораториях мира, A. thaliana остается самым удобным объектом для функциональной геномики. Так, например, размеры геномов Arabidopsis thaliana и Oryza sativa отличаются в 4 раза, тогда как общее количество генов в гаплоидном состоянии у этих двух растений приблизительно одинаковое. Таким образом, эффективность, использования, инсерционного мутагенеза на О. Sativa значительно ниже.
В последние 15-20 лет были разработаны методы для эффективного массового получения инсерционных мутантов-Л. thaliana (Feldmann et: al., 1987, Bechtold et. al., 1993). В результате были созданы представительные коллекции мутантных линий A. thaliana, семена, которых собраны в коллекционных центрах ABRG (http://www.arabidopsis.org/abrc/), NASC (http://arabidopsis.info/); S ALK (http://signal.salk.edu/), SAIL http://www.tmri:org/en/partnership/sair collèction.aspx) и GABI http ://www. gabi-kat.de/).
Анализ этих коллекций приводит к тому, что число идентифицированных генов стремительно растет (D. Bouchez, H. Höfte, 1998). Если в начале 90-х годов их число исчислялось десятками, то в конце 90-х годов число таких генов составило уже около 1000 (Meinke, Koornneef, 1997), а в начале 2008г. в интернет базе данных TAIR содержалась информация о функциях более чем 6400 генов, разделенных" на 866 семейств (http://www.arabidopsis.org/info/genefamily/genefamily.htnil).
Однако большинство созданных коллекций, инсерционных мутантов содержат линии, несущие ям/-мутации, или так называемые loss-of-fimction мутации, которые позволяют определять функции только стабильно экспрессирующихся в ходе развития растений генов. Этот факт заранее .свидетельствует о том, что исследовать функции всех генов, используя только loss-of-fimction тип мутаций-, невозможно. Это ограничение спектра инсерционных мутаций является»осложняющим моментом при исследовании связи между событиями в ДНК хромосомой их фенотипическим выражением. В частности, инсерционные мутации этого типа в генах, функционирующих в экстремальных условиях среды, в стандартных условиях не приводят к проявлению мутантного фенотипа. В этой связи актуальной является'задача расширения спектра мутаций, вызванных инсерцией в геном клеток растений. Этим обусловлен интерес к индукции мутаций другого типа, например, мутаций, вызывающих суперэкспрессию генов. Индукция мутаций такого рода достигается с помощью векторов, Т-ДНК которых содержит около одного из бордеров сильный промотор (или энхансер транскрипции). Инсерция Т-ДНК в этом случае может вызывать увеличение во много раз экспрессии как близлежащих генов, так и, в некоторых случаях, генов, располагающихся за несколько тысяч пар оснований нуклеотидов (Weigel et al., 2000). Такой тип мутаций получил название gain-of-function мутаций.
Однако когда структура инсерции содержит энхансер транскрипции, при ее встраивании в геном растения, могут возникать мутации двух типов: nul-мутации, связанные с инактивацией гена при встраивании в него инсерции, и мутации, обусловленные наличием сильного промотора в структуре инсерции. При массовом получении и анализе инсерционных мутаций, полученных с помощью такого рода векторов, необходимо иметь относительно простую и эффективную систему идентификации loss-of-function и gain-of-function мутаций.
В этой связи в данной работе были поставлены следующие цели и задачи.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Погорелко, Геннадий Владимирович
6. Выводы
1. Создана и проверена уникальная система векторов рЕпЬох/рСге для получения и анализа мутантов АлкаИапа, характеризующихся повышенной экспрессией, близлежащих к Т-ДНК, генов. Впервые фаговая система рекомбинации Сге/1ох была использована в активационном векторе для трансформации растений с целью определения функций генов растений, экспрессия которых отсутствует в норме в растениях дикого типа. Показана высокая эффективность удаления 35Б промотора из состава встроенной в геном Т-ДНК плазмиды рЕпЬох, что гарантирует эффективное получение ревертантов трансгенных растений.
2. При помощи системы векторов рЕпЬох/рСге создана базовая коллекция инсерционных мутантов АлкаНапа, состоящая из 156 трансгенных линий, в 21 из которых, при помощи специально разработанного модифицированного метода пиРСИ, определена локализация инсерций.
3. Установлена функциональная значимость 3-х новых генов АлНаИапа: At5gl0080, Аг]^33390 и Аг5^13760, изменение уровня экспрессии которых влияет на морфогенез АлкаИапа. Впервые было показано, что изменение экспрессии независимых генов, продукты которых аннотированы как члены семейств аспартиловых протеаз, ЭЕАН-Ьох АТФ-зависимая хеликаз и пролин богатых белков приводит к нарушению нормального морфогенеза растений АлИаИапа.
4. Благодаря созданию уникального суперэкспрессирующего мутанта АлкаИапа, линия Е78, впервые получена полноразмерная кДНК гена Аь1^33390 и определена ее нуклеотидная последовательность, продукт которого относится к классу БЕАН-Ьох АТФ-зависимых хеликаз АлНаНапа. Впервые экспериментально были определены сайты сплайсинга, 5' и 3' некодирующие области РНК, а также точный размер мРНК.
7. Публикации I
1. Фурсова OB, Погорелко ГВ, Авсюк АИ, Томилова НБ, Томилов АА, Тарасов ВА, Огаркова OA. Идентификация потенциального гена контролирующего развитие семядолей у проростков Arabidopsis thaliana. Докл. Ак. Наук. 2004. 395:161-2
2. Огаркова OA, Томилов АА, Томилова НБ, Погорелко ГВ, Тарасов ВА. Идентификация гена, мутация в котором приводит к нарушению развития гипокотиля у Arabidopsis thaliana. Генетика. 2005. т.41 №2: 165-170
3. Огаркова OA, Томилов АА, Томилова НБ, Погорелко ГВ, Тарасов В А'. Идентификация гена, мутация в котором приводит к возникновению летальных проростков у Arabidopsis thaliana. Онтогенез. 2005. т.36 №3
4. Погорелко ГВ, Фурсова ОВ, Огаркова OA, Тарасов В А. Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений. Генетика. 2007. т.43 №2: 194-202
5. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. A new technique for activation tagging in Arabidopsis. Gene. 2008. v. 414, №1-2, p. 67-75.
6. Огаркова ОА, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Фурсова ОВ, Тарасов В А. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis МаИапа: коллекция морфологических инсерционных мутантов. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 138-141
7. Огаркова ОА, Фурсова ОВ, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Тарасов ВА. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis МаИапа: идентификация нового гена вовлеченного в контроль развития семядолей. Материалы международной ' научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 142-145.
Te3HCi>i KOH^epeHi^HH, ycnn>ie h CTenAOBBie /1, oicjiaAt»i
1. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. New Mutant of Arabidopsis thaliana resistant to high concentration of hydrogen peroxide. «Free Radicals, Nitric Oxide, and Inflammation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects», September 23 - October 3, 2001, Antalya, Turkey
2. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Functional Genomics of Arabidopsis thaliana. Cloning of genes. «Gene manipulation of microbial production of valuable products». Thessaloniki, Greecc, September 1 - 7, 2002
3. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Functional Genomics of Arabidopsis thaliana. Cloning of genes. «Forces, Growth and Form in Soft Condensed Matter: At the Interface between Physics and Biology», 24 March - 3 April, 2003, Geilo, Norway
4. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding New Genes Involved in Peroxides Response. «Receptors and Cell Signaling in Oxidative Stress», Hungarian Academy of Sciences, April 3-5, 2003, Budapest, Hungary
5. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Transgenic plants as the way to discover and validate novel genes and they functions. «Frontiers in Neurodegenerative Disorders and Aging: Fundamental Aspects, Clinical Perspectives and New Insights», May 26 - June 1, 2003, Antalya, Turkey
6. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding genes of controlling of lipid signaling in transgenic plants. «Lipid Signaling and Membrane Transport», June 20-25, 2003, Chieti, Italy
7. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA.Investigation of Genes Controlling Protein Phosphorilation. «EuroPhosphatases 2003», June 29 -July 3, 2003, Barcelona, Spain
8. Огаркова OA, Томилова НБ, Томилов AA, Погорелко ГВ, Фурсова OB, Тарасов ВА. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis thaliana: коллекция морфологических инсерционных мутантов. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 138-141
9. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov УА. Functional Genomics of Arabidopsis thaliana. «Atomic Force Microscopy Applications in Biology», July 7-9, 2004. Instituto Gulbenkian de Ciencia, Oeiras, Portugal
10. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Studying of House Keeping Genes on A.thalina. «Dynamics of Complex Interconnected Systems: Networks and Bioprocesses», April 11-21, 2005, Geilo, Norway
11. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Comparative Genomics. Finding Orthologeous Genes in Human and Plants. «Nuclear Receptors and their Ligands in Metabolism and Disease». July 31 - August 4, 2005. Bregenz, Austria
12. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA.Transgenic plants as the way to discover and validate novel genes and their functions in different organisms. «ABC Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Disease». Innsbruck, Austria, March 4-10, 2006
13. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding Orthologeous Genes in Human and Plants Controlling Disease Development. "Human and Microbial Genomics: DNA Arrays applied to Human Pathogens and Diseases", Hellenic Pasteur Institute, March 30 - April 7, 2006, Athens, Greece
14. Фурсова OB, Погорелко ГВ, Огаркова OA, Тарасов BA. Убиквитин-зависимый протеолиз. «14я Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии"», Май 31 - Июнь 9, 2006, Крым, Гурзуф, Украина.
15. Огаркова OA, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Фурсова ОВ, Тарасов В А. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis thaliana: коллекция морфологических инсерционных мутантов. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 138-141
16. Огаркова OA, Фурсова ОВ, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Тарасов ВА. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis thaliana: идентификация нового гена вовлеченного в контроль развития семядолей. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 142-145.
17. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. A New System of Vectors for Plant Transformation., «International Scientific Conference "Genetics in Russia and in a World"», June 28 - July 2, 2006, N1 Vavilov Institute of General Genetics, Moscow, Russia
18. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov УА. Creation and Analyzing of Collection of Gain-of-Function mutants of A.thaliana. Microarray & Genosensor Techniques in Biomedical Applications, September 22 - 30, 2006, Prague, Czech Republic
19. Pogorelko GV. Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. A New System of Vectors for Creation and Analyzing of Gain-of-Function Mutants of A.thalina. «Plant Genomic European Meeting: Plant GEMs 5», October 11-14, 2006, Venicc, Italy. (*Постерная презентация была признана одной из пяти лучших презентаций молодых ученых и удостоена премии).
20. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA.From the variety to the integrity. Studying genes functions of higher plants on model object Arabidopsis thaliana. Bridging the Gap Between Gene Expression and Biological Function, 11-14 October, 2006, Luxembourg
21. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Studying genes functions of higher plants on model object Arabidopsis thaliana. New concepts in lipidology: from lipidomics to disease, October 21 - 25, 2006, Congress Center 'Leeuwenhorst', Noordwijkerhout, The Netherlands
22. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding Orthologeous Genes in Human and Plants Controlling Disease Development. «EMBL 8th International PhD Student Symposium "Biology of Disease - A Molecular Battlefield"», 30 November - 2 December 2006, EMBL, Heidelberg, Germany
23. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Identification of Transcription Factors Involved in Regulation in the Cold. Plant Transformation Technologies. February 4-7, 2007, Vienna, Austria
24. Фурсова OB, Погорелко ГВ, Томилова НБ, Томилов АА, Брускин СА, Огаркова OA, Тарасов ВА. Создание трансгенных растений с суперэкспрессией генов, кодирующих регуляторы индуцируемых холодом транскриптом, отвечающих за устойчивость к заморозкам. 4-ый московский международный конгресс «Биотехнологии». Март 12-16. 2007. Москва, Россия.
25. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding Genes of Cell Metabolism Control. Systems Dynamics of Intracellular Communication -Overcoming Distance in Signalling Networks. Maale HaChamisha, Jerusalem Hills, Israel, March 18-22, 2007
9. Зарегистрированные данные I
Название Описание GenBank ID pEnLox Вектор для трансформации растений DQ645630 рСгс Вектор для трансформации растений DQ645631
El FST мутантной линии A.thaliana DX575973
Е4 FST мутантной линии A. thaliana DX573828
Е7 FST мутантной линии A.thaliana DX575974
ЕЮ FST мутантной линии A.thaliana DX575046
Е12 FST мутантной линии A.thaliana DX575040
Е13 FST мутантной линии A. thaliana DX575041
Е14 FST мутантной линии A.thaliana ' DX575045
Е15 FST мутантной линии A.thaliana DX575034
Е17 FST мутантной линии A.thaliana DX575042
Е18 FST мутантной линии A.thaliana DX575035
Е20 FST мутантной линии A.thaliana DX575036
Е21 FST мутантной линии A.thaliana DX575039
Е23 FST мутантной линии A.thaliana DX575942
Е30 FST мутантной линии A.thaliana DX575037
Е31 FST мутантной линии A.thaliana DX575943
Е35 FST мутантной линии A.thaliana DX575944
Е37 FST мутантной линии A.thaliana DX575043
Е40 FST мутантной линии A.thaliana DX575038
Е9 FST мутантной линии A.thaliana DX575044
Е78 FST мутантной линии A.thaliana Ell83464
Е134 FST мутантной линии A.thaliana EI232171
Atlgl2860l EST мутантной линии A.thaliana EG030730
Atlgl28602 EST мутантной линии A.thaliana EH643295
At5g61270 Arabidopsis thaliana O-linc EST гена At5g61270 A.thaliana EH669233
Atlgl2850 Arabidopsis thaliana X-line EST гена Atlgl2850 A.thaliana EH667252
E9PartialcDNA EST гена At5gl0080 A.thaliana EL740208
Arabidopsis thaliana helicase-like (AtJg33390) mRNA, complete sequence Полноразмерная кДНК гена AtJg33390 EF630362
5. Заключение
На современном этапе развития функциональной геномики высших растений использование методов «knock out» для исследования функций экспрессирующихся генов не может позволить охватить весь геном из-за присутствия, так называемых, «молчащих», в стандартных условиях развития растения, генов. Созданные на данный момент вектора для получения» суперэкспрессирующих мутантов не используются широко из-за неудобств анализа такого типа мутантов. Описанная в данной работе уникальная система векторов позволяет обойти такого рода проблемы. На примере 3-х мутантов показана работоспособность новой системы, которая позволила уже на первых этапах определить 3 гена, изменение уровня экспрессии которых влияет на морфогенез A.thaliana. Этому способствовала также разработка высокоэффективного модифицированного метода определения локализаций инсерций в геноме растения. Также было 'продемонстрировано, что суперэкспрессирующие мутанты являются удобным инструментом для получения полноразмерных кДНК генов, экспрессия которых очень низкая или вовсе отсутствует в растениях дикого типа.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Погорелко, Геннадий Владимирович, Москва
1. Гапеева Т.А., Огаркова O.A., Тарасов В.А., Волотовский И.Д. Новые вектора для трансформации двудольных растений // Генетика. 1995. Т. 31. № 8. С. 1085-1091.
2. Гловер Д. Клонирование ДНК // М.: Мир, 1988. 538 с.
3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика // М.: Мир, 1991.544 с.
4. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений // М.: Мир, 1991.408 с.
5. Ли А., Тинланд Б. Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 354-359.
6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование // М.: Мир, 1984. 480 с.
7. Огаркова O.A., Томилова Н.Б., Томилов А.А, Тарасов В.А. Создание коллекции морфологических инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana II Генетика. 2001. Т. 37. № 8. С. 1081-1087.
8. Патрушев Л.И. Экспрессия генов // М.: Наука, 2000. 526 с.
9. Погорелко Г.В., Фурсова О.В., Огаркова O.A., Тарасов В.А. Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений // Генетика. 2007. Т. 43. №2. С. 194-201
10. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии // С.-П.: СПбГТУ, 1999. 360381 с.
11. П.Сингер М., Берг П. Гены и геномы // М.: Мир, 1998. Т. 1-2. 765 с.
12. Спирин A.C., Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот // М.: Высшая школа, 1990. 201-210 с.
13. Томилов А.А, Томилова Н.Б., Огаркова O.A., Тарасов В.А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: Увеличение эффективности трансформациипрорастающих семян в результате предобработки их ультразвуком // Генетика. 1999. Т. 35. № 9. С. 1214-1222.
14. Томилов А.А, Томилова Н.Б., Огаркова О.А., Тарасов В.А. Идентификация гена, включенного в контроль развития корневой системы у Arabidopsis thaliana //Генетика. 2001. Т. 37. №4. С. 1-10.
15. Томилова Н.Б., Томилов А.А, Огаркова О.А., Тарасов В.А. Идентификация гена, мутация в котором обуславливает возникновение некрозов семядолей при развитии проростков Arabidopsis thaliana II Генетика. 2001. Т. 37. №1. С. 36-45.
16. Филипенко Е.А., Филипенко M.JL, Мурашева С.В., Денеко Е.В., Загорская А.А., Сидорчук Ю.В. Анализ сайтов встраивания Т-ДНК у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом // Доклады Академии Наук. Т.370. № 2. С. 273-276.
17. Abremski К., Hoess R., Sternberg N. Studies on the properties of PI site-specific recombination: evidence for topologically unlinked products following recombination // Cell. 1983. V. 32 № 4. P.1301-11
18. Aeschbacher RA, Hauser MT, Feldmann KA, Benfey PN. The SABRE gene is required for normal cell expansion in Arabidopsis.Genes Dev. 1995 Feb 1;9(3):330-40.
19. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10.
20. An G. High efficiency transformation of culture tobacco cells // Plant Physiol. 1985. V. 79. P. 568-570%
21. An, Gynheung. Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis. Methods in Enzymol. 1987. 153: 292-305
22. Azpiroz-Leehan R., Feldmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth II TIG. 1997. V. 13. № 4. C. 152-156.
23. Baulcombe D.C. RNA as a target and an initiator of post-transcriptional gene silencing in transgenic plants // Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 79-88.
24. Bechtold N., Ellis J., Palletier G. In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. // Paris: C.R. Acad. Sci. Sciences de la vie / Life sciences, 1993. V. 316. P. 1194-1199
25. Benson DA, Boguski MS, Lipman DJ, Ostell J, Ouellette BF. GenBank. Nucleic Acids Res. 1998 Jan l;26(l):l-7.
26. Bevan M., Bancroft I., Bent E., Love K., Goodman H., Dean C., Bergkamp R., Dirkse W., Vanstaveren M., Stiekema W. Analysis of a 1.9 Mb of contigous sequence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana II Nature. 1998. V. 391. P. 485-488.
27. Blackwood EM, Kadonaga JT. Going the distance: a current view of enhancer action. // Science 1998 Jul 3; V. 281(5373): P. 61-3
28. Borner, G., Lilley, K., Stevens, T., Dupree, P., 2003. Identification of Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Proteins in Arabidopsis. A Proteomic and Genomic Analysis. Plant Physiol. 132-2, 568—577
29. Bouchez D., Camilleri C., Caboshe M. A binary vector based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana // Paris: C.R. Acad. Sei. Sciences de la vie / Life sciences, 1993. V. 316. P. 1188-1193
30. Bouchez D., Höfte H. Functional genomics in plants // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 725-732.
31. Brendel V, Kleffe J, Carle-Urioste JC, Walbot V. Prediction of splice sites in plant pre-mRNA from sequence properties. J Mol Biol. 1998 Feb 13;276(1):85-104.
32. Brian Sauer. Inducible Gene Targeting in Mice Using the Crdlox System. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 14, 381-392 (1998)
33. Burge C, Karlin S. Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J Mol Biol. 1997 Apr 25;268(l):78-94.
34. Castle L.A., Meinke D.W. Fusca gene of Arabidopsis encodes a novel protein essential for plant development // Plant Cell. 1994. V. 6. № 1. P. 15-41.
35. Chalfun-Junior A, Mes JJ, Mlynarova L, Aarts MG, Angenent GC. Low frequency of T-DNA based activation tagging in Arabidopsis is correlated with methylation of CaMV 35S enhancer sequences // FEBS Lett. 2003. V. 18;555(3). P. 459-63.
36. Cheng S., Chang S.-Y., Gravitt P., Respess R. Long PGR II Nature. 1994. V. 369. P. 684-685.
37. Chunlin S, Zhen Z, Guifang X, Altosaar I, Pingzhang F. Construction of plant vectors withhigh level expressionofBit; toxin gene andstudies on their expression behavior in transgenic tobaccos. // Chin J Biotechnol 1999;15(4):203-10
38. Corneille S., Lutz K., S vab Z;, Maliga P. Efficient elimination of selectable marker genes from the plastid genome by the CRE-lox site-specific recombination system; The Plant Journal, 2001. 27 (2), 171-178
39. Davis S., Vierstra R. Soluble, highly fluorescent variants of green fluorescent protein (GFP) for use in rhigher plants // Plant Molecular Biology, 1998. 36: 521' 528 .' ■
40. Feidmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis. Mutational spectrumi // Plant J. 1991. V. 1. P. 71-82 ' '
41. Feidmann K.A., Marks M.D; Agrobacterium-mediated' transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: A. non-tissue culture approach // Molt, Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 1-9. ;
42. Finkelstein R., Somerville C.R. Introduction of transposable elements into Arabidopsis II J. Cell Biochem. UCLA Symp. Molec. Cell Biol.: Abstr. New York: A.R. Liss, 1987. Suppl lib. P. 16.
43. Forsthoefel N.R., Wu Y., Schulz B., Bennett M.J., Feldmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: prospects and perspectives // Aust. J. Plant Physiol. 1992. V. 19. P. 353-366.
44. Fortunati A, Piconese S, Tassone P, Ferrari S, Migliaccio F. A new mutant of Arabidopsis disturbed in its roots, right-handed slanting, and gravitropism defines a gene that encodes a heat-shock factor // J Exp Bot. 2008;59(6): 1363-74. Epub 2008 Apr 1.
45. Franzmann L.H., Yoon E.S., Meinke D.W. Saturating the genetic map of Arabidopsis thaliana with embryonic mutations // Plant J. 1995. V. 7. P. 341-350.
46. Frey M., Stettner C., Gierl A. A general method for gene isolation in tagging approaches: amplification of insertion mutagenised sites (AIMS) // Plant J. 1998. V. 13. P. 717-721.
47. Fridborg I., Kuusk S., Moritz T., Sundberg E. The Arabidpsis dwarf mutant shi exibits reduced gibberellin responses conferred by overexpression of a new putative zinc finger protein//Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1019-1031.
48. Gailus-Durner V, Scherf M, Werner T. Experimental data of a single promoter can be used for in silico detection of genes with related regulation in the absence of sequence similarity. // Mamm Genome 2001 Jan; V. 12(1): P. 67-72
49. Gallois J.-L., Woodward C., Reddy G., Sablowski R. Combined SHOOT MERISTEMLESS and WUSCHEL trigger ectopic organogenesis in Arabidopsis II Development. 2002. V. 129. 3207-3217.
50. Gish W, States DJ. Identification of protein coding regions by database similarity search.
51. Nat Genet: 1993 Mar;3(3):266-72.
52. Gleave A.P. A versatile binary vector system with a T-DNA organizational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome // Plant Mol Biol. 1992. V.20. № 6. P. 1203-7.
53. Gondor A, Ohlsson R. Chromatin insulators and cohesions // EMBO Rep. 2008; 9(4):327-9.
54. Gui-Li W, Wen ZQ, Xu WP, Wang ZY, Du XL, Wang F. Inhibition of Lysophosphatidic Acid Receptor-2 Expression by RNA Interference Decreases Lysophosphatidic Acid-induced Urokinase Plasminogen Activator Activation,
55. Gell Invasion, and Migration in Ovarian; Cancer SKOV-3 Cells // Croat Med J: 2008; 49(2): 175-181 •
56. Herman PX., Jacobs A., Van Montagu M;, Depicker A. Plant chromosome marker, gene fusion assay for study of normal and truncated T-DNA integration events // Mol: Gen. Genet. 1990; V. 224; № 2. P: 148-156. '
57. Herman P;L., Marks M: D. Trichome development in Arabidopsis thaliana. II. Isolation and complementation of the GIABROUS I gene // Plant Cell. 1989; V. l . P. 1051-1055.
58. Hoff T., Schnorr! K.M., Mundy J. A recombinase-mediated transcriptional; induction system:in transgenic Plants // Plant Molecular Biology. 2001. V. 45.P.' ,41-49:., ■ . ' , . •'. ' ' '' '; . '
59. Hiei Y, Komari T. Agrobacterium-mediated transformation- of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nat Protoc. 2008;3(5):824-34.* ' f
60. Holrnberg N., Btillow L. Improving stress tolerance in: plants by gene transfer //
61. Jefferson R A., Kavanagh T.A., Bevan M.V. GUS fusions: ß-glucuronidase as a sensitive'and versatile gene fusion marker in higher plant // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3901-3907.
62. Keplinger BL, Guo X, Quine J, Feng Y, Cavener DR. Complex Organization of Promoter and Enhancer Elements Regulate the Tissue- and Developmental Stage-Specific Expression of the Drosophila melanogaster Gld Gene. // Genetics 2001 Feb; 157(2):699-716
63. Kerbach S, Lorz H, Becker D. Site-specific recombination in Zea mays // Theor Appl Genet. 2005;111(8):1608-16.
64. Kertbundit S., De Greve H., Deboeck F., Van Montagu M., Hernalsteens J. In vivo random (3-glucoronidase gene fusions in Arabidopsis thaliana // Proc. Natl Acad. Sci. 1991. V. 88. P. 5212-5216.
65. Kleckner N, Chan RK, Tye BK, Botstein D. Mutagenesis by insertion of a drug-resistance element carrying an inverted repetition. J Mol Biol. 1975 Oct 5;97(4):561-75.
66. Kleffe J, Hermann K, Vahrson W, Wittig B, Brendel V. Logitlinear models for the prediction of splice sites in plant pre-mRNA sequences. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 1;24(23):4709-18.
67. Klutstein M, Shaked H, Sherman A, Avivi-Ragolsky N, Shema E, Zenvirth D, Levy AA, Simchen G. Functional Conservation of the Yeast and Arabidopsis RAD54-Like Genes // Genetics. 2008; 178(4):2389-97.
68. Kojima M, Arai Y, Iwase N, Shirotori K, Shioiri H, Nozue M. Development of a simple and efficient method for transformation of buckwheat plants (Fagopyrum esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. // Biosci Biotechnol Biochem 2000 Apr;64(4):845-7
69. Koncz C., Martini N., Mayerholer R., Koncz-Kalman Z., Korber H., Redei G.P., Schell J. High-frequency T- DNA mediated gene tagging in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86. P. 8467-8471.
70. Koncz C., Martini N., Szabados L., Hrouda M., Bachmair A., Schell J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies // In Plant Molecular Biology Manual. V. B2. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Press, 1994. P. 122.
71. Koncz C., Mayerhofer R., Koncz-Kalman Z., Nawrath C., Reiss B., Redei G. P., Schell J. Isolation of a gene encoding a novel chloroplast protein by T-DNA tagging in Arabidopsis thaliana IIEMBO J. 1990. V. 9. P. 1337-1346.
72. Koncz C., Nemeth K., Redei G.P., Schell J. T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis II Plant Mol. Biol. 1992. V. 20. P. 963-976. 1
73. K00 JT, Choe J, Moseley SL.HrpA, a DEAH-box RNA helicase, is involved in mRNA processing of a fimbrial operon in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2004 Jun;52(6): 1813-26
74. Kooter J.M., Mol J.N.M. 7ran.v-inactivation of gene expression in plants // Current Opinion in Biotechnology. 1993. V. 4. P. 166-171.
75. Krysan P.J., Young J.C., Sussman M.R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis II The Plant Cell. 1999. V. 11 P. 2283-2290.
76. Kubo H., Peeters A. J.M., Aarts M.G.M., Pereira A., Koornneef M. ANTHOCYANINLESS2, a homeobox gene affecting anthocyanin distribution and root development in Arabidopsis II Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1217-1226.
77. Kushiro T., Shibuya M., Ebizuka Y. Beta-amyrin synthase cloning of oxidosqualene cyclase that catalyzes the formation of the most popular triterpene among higher plants // Eur. J. Biochem. 1998. V. 256. № 1. P. 238-244.
78. Laat WL, Appeldoorn E, Sugasawa K, Weterings E, Jaspers NGJ, Hoeijmakers JHJ. DNA-binding polarity of human replication protein A positions nucleases in nucleotide excision repair. Genes & Dev. 1998 12: 2598-2609
79. Laibach F. Zür frage nach der individualitai der Chromosomen im pflanzeinreich II Beich. Bot. Col. I Abt 1907. V. 22. P. 191-210.
80. Laibach F., 1943. In Meyerowitz E.M. History of Arabidopsis thaliana II http/www.arabidopsis.org. 1998.
81. Lee L, Sadowski PD. Directional resolution of synthetic holliday structures by the Cre recombinase. J Biol Chem. 2001 Aug 17;276(33):31092-8.
82. Leutwiler L.S., Hough-Evans B.R., Meyerowitz E.M. The DNA of A. thaliana II Mol. Gen. Gen. 1984. V. 194. P. 15-23.
83. Li S, Hartman GL, Domier LL, Boykin D. Quantification of Fusarium solani f. sp. glycines isolates in soybean roots by colony-forming unit assays and real-time quantitative PCR // Theor Appl Genet. 2008 Epub ahead of print.
84. Liao BY, Zhang J. Null mutations in human and mouse orthologs frequently result in different phenotypes // Proc Natl Acad ScL 2008 USA. Epub ahead of print.
85. Liu Y.G., Mitsukawa N., Vazquez-Tello A., Whittier R.F. Generation of a high quality PI library of Arcibidopsis thaliana-suitable for chromosome walking // Plant J. 1995. V.7. P. 351-358.
86. Liu YG, Whittier RF. Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from PI and YAC clones for chromosome walking//Genomics. 1995 Feb 10;25(3):674-81
87. Lloyd A.M., Bamanson A.R., Rogers S.G. Transformation of Arabidopsis thaliana with Agrobacterium tumefaciens // Science. 1986. V. 234. №4775. P. 464-466
88. Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, Darnell. Molecular Cell Biology, 2000. Chapter 12. DNA Replication, Repair, and Recombination. Section 12.5. Recombination between Homologous DNA Sites
89. Masclaux FG, Pont-Lezica R, Galaud JP. Relationship between allelic state of T-DNA and DNA methylation of chromosomal integration region in transformed Arabidopsis thaliana plants // Plant Mol Biol. 2005. V. 58(3). P. 295-303.
90. Mark D. Curtis, Ueli Grossniklaus. A Gateway Cloning Vector Set for High-Throughput Functional Analysis of Genes in Planta // Plant Physiology. 2003. V. 133. P. 462-469
91. McClintock B. Mutable locus in maize // Carnegie Inst. Wash. Yearbook. 1948. V. 47. P. 155-169.
92. McCormac AC, Elliott MC, Chen DF. pBECKS2000: a novel plasmid series for the facile creation of complex binary vectors, which incorporates "clean-gene" facilities. // Mol Gen Genet 1999 Mar;261(2):226-35
93. McKinney E.C., Ali N., Traut A., Feldmann K.A., Belostotsky D.A., McDowell J.M., Meagher R.B. Sequence-based identification of T-DNA insertion mutations in Arabidopsis: actin mutants act2-l and act4-l II Plant J. 1995. V. 8. P. 613-622.
94. Meinke, D.W., Koornneef M. Community Standards for Arabidopsis Genetics // Plant J. 1997. V. 12. № 2. P. 247-253.
95. Mejia J.E., Larin Z. The Assembly of Large BACs by in Vivo Recombination. Genomics, 2000. 70, 165-170
96. Mullins L., Kotelevtseva N., Boyd A.C., Mullins J.J. Efficient Cre-lox linearisation of BACs: applications to physical mapping and generation of transgenic animals. ©1997 Oxford University Press, 2539-2540
97. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific systhesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. // Methods Enzymol. 1987. V. 155. P. 335-348.
98. Nimmo DD, Alphey L, Meredith JM, Eggleston P. High efficiency site-specific genetic engineering of the mosquito genome // Insect Mol Biol. 2006, 15(2): 129-36.
99. Oono Y, Chen Q.G., Overvoorde P.J., Köhler C., Theologis A. age mutants of Arabidopsis exhibit altered auxin-regulated gene expression // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1649-1662.
100. Pandey S, Monshausen GB, Ding L, Assmann SM. Regulation of Root-Wave Response by Extra Large and Conventional G Proteins in Arabidopsis thaliana. Plant J. 2008 Apr 4 Epub ahead of print.
101. Pan X, Li Y, Stein L. Site Preferences of Insertional Mutagenesis Agents in Arabidopsis // Plant Physiology. 2005. V. 137. P. 168-175
102. Pang P.P., Meyerowitz E.M. Arabidopsis thaliana: a model system for plant molecular biology//Biotechnology. 1987. V. 5. № 11. P. 1177-1181.
103. Parinov S., Sevugan M., Ye D., Yang W.C., Kumaran M., Sundaresan V. Analysis of flanking sequences from Dissociation insertion lines: a database for reverse genetics in Arabidopsis II The Plant Cell. 1999. V. 11. P. 2263-2270.
104. Pickett FB, Champagne MM, Meeks-Wagner DR. Temperature-sensitive mutations that arrest Arabidopsis shoot development. Development. 1996 Dec;122(12):3799-807.
105. Pruilt R.E., Meyerowitz E.M. Characterization of the genome of Arabidopsis thaliana II J. Mol. Biol. 1986. V. 187. № 1. P. 169-183.
106. Puchta H., Hohn B. From centimorgans to base pairs: homologous recombination in plants // Trends Plant Sci. 1996. V. 1. P. 340-348.
107. Rastegar S, Hess I, Dickmeis T, Nicod JC, Ertzer R, Hadzhiev Y, Thies WG, Scherer G, Strahle U. The words of the regulatory code are arranged in a variable manner in highly conserved enhancers // Dev Biol. 2008 Epub ahead of print.
108. Reinholz E., 1947. In: Meyerowitz E.M. History of Arabidopsis thaliana II http/www.arabidopsis.org. 1998.
109. Richmond TA, Bleecker AB. A defect in beta-oxidation causes abnormal inflorescence development in Arabidopsis. Plant Cell. 1999 Oct;ll(10):1911-24.
110. Riechmann J.L., Meyerowitz E.M. MADS domain proteins in plant development II J. Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 1079-1101.
111. Rijkers T, Ouweland JVD, Morolli B, Rolink AG, Baarends WM, Sloun P, Lohman P, Pastink A. Targeted Inactivation of Mouse RAD52 Reduces Homologous Recombination but Not Resistance to Ionizing Radiation // Mol Cell Biol. 1998; 18(11): 6423-6429.
112. Roe JL, Rivin CJ, Sessions RA, Feldmann KA, Zambryski PC. The Tousled gene in A. thaliana encodes a protein kinase homolog that is required for leaf and flower development. Cell. 1993 Dec 3;75(5):939-50.
113. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition"// Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
114. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase, J. Mol. Biol., 1975, v. 94, p. 444-448.
115. Santarem E.R., Trick H.N., Essing J.S., Finer J.J. Sonication-assisted Agrobacterium-med\ate,d transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression // Plant Cell Reports. 1998. V. 17. P. 752759.
116. Sauer B. Inducible Gene Targeting in Mice Using the Crdlox System // Methods. 1998. V.14. №4. P.381-92
117. Shaikh A.C., Sadowski P.D. The Cre Recombinase Cleaves the lox Site in trans.Volume 272, Number 9, Issue of February 28, 1997 pp. 5695-5702. JBC by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.
118. Shang CH, Zhu F, Li N, Ou-Yang X, Shi L, Zhao MW, Li YX. Cloning and Characterization of a Gene Encoding HMG-CoA Reductase from Ganoderma lucidum and Its Functional Identification in Yeast // Biosci Biotechnol Biochem. 2008 Epub ahead of print.
119. Shibata F, Matsusaki Y, Hizume M. AT-richsequences containing Arabidopsis-type telomere sequence and their chromosomal distribution in Pinus densiflora // Theor Appl Genet. 2005. V. 110(7). P. 1253-8
120. Shibuya M., Zhang H., Endo A., Shishikura K., Kushiro T., Ebizuka Y. Two branches of the lupeol synthase gene in the molecular evolution of plant oxidosqualene cyclascs // European Journal Biochemistry. 1999. V. 266. № 1. P. 302-307.
121. Singh-Gasson S., Green R.D., Yue Y., Nelson C., Blattner F., Sussman M.R., Cerrina F. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 974-978.
122. Souer E., Quattrocchio F., de Vetten N., Mol J., Koes R. A general method to isolate genes tagged by a high copy number transposable element // Plant J. 1995. V. 7. P. 677-685.
123. Speulman E., Metz P. L. J., Van Arkel G., Hekkert B.L., Stiekema W.J., Pereira A. Two-component Enhancer-Inhibitor transposon mutagenesis system for functional aanalysis of the Arabidopsis genome // The Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1853-1866.
124. Spradling AC, Stern DM, Kiss I, Roote J, Laverty T, Rubin GM. Gene disruptions using P transposable elements: an integral component of the Drosophila genome project.
125. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Nov 21 ;92(24): 10824-30.
126. Strizhov N, Li Y, Rosso MG, Viehoever P, Dekker KA, Weisshaar B. High, throughput generation of sequence indexes from T-DNA mutagenized
127. Arabidopsis thaliana lines // Biotechniques. 2003. V. 35(6). P. 1164-8.
128. Sugita K, Kasahara T, Matsunaga E, Ebinuma H. A transformation vector for the production of marker-free transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency.// Plant J 2000 Jun;22(5):461-9
129. Takeda K., Akira S. STAT family of transcription factors in cytokine-mediated biological responses // Reviews. 2000. V. 11. P. 199-207.
130. Tani H, Chen X, Nurmberg P, Grant JJ, SantaMaria M, Chini A, Gilroy E, Birch PR, Loake GJ. Activation tagging in plants: a tool for gene discovery // Funct Integr Genomics. 2004. V. 4(4). P. 258-66.
131. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes // Trends in Plant Science. 1996. V. 1. № 6. 1360-1385.
132. Topping J.F., Wei W., Lindsey K. Functional tagging of regulatory elements in the plant genome//Development. 1991. V. 112. P. 1009-1019.
133. Van Lijsebettens M., Vanderhaughen R., Van Montagu M. Insertional mutagenesis in Arabidopsis thaliana: isolation of a T-DNA-linked mutation that, alters leaf morphology // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81. № 1. P. 177-284.
134. Vergunst AC, Hooykaas PJ. Cre/lox-mediatcd site-specific integration of Agrobacterium T-DNA in Arabidopsis thaliana by transient expression of ere. // Plant Mol Biol 1998 Dec;38(6):1269
135. Wan F, Miao X, Quraishi I, Kennedy V, Creek KE, Pirisi L.Gene expression changes during HPV-mediated carcinogenesis: a comparison between an in vitro cell model and cervical cancer // Int J Cancer. 2008 ;123(1):32-40
136. Wang Y, Yin G, Yang Q, Tang J, Lu X, Korban SS, Xu M. Identification and isolation of Mu-flanking fragments from maize // J Genet Genomics. 2008; 35(4):207-13.
137. Wheeler JC, Shigesada K, Gergen JP, Ito Y. Mechanisms of transcriptional regulation by Runt domain proteins. // Semin Cell Dev Biol 2000 Oct; V. 11(5): P. 369-75
138. Xiang C, Han P, Lutziger I, Wang K, Oliver DJ. A mini binary vector series for plant transformation.// Plant Mol Biol 1999 Jul;40(4):711-7
139. Yamaguchi H, Nagaoka K, Imakawa K, Sakai S, Christenson RK. Enhancer regions of ovine interferon-tau gene that confer PMA response or cell type specific transcription. // Mol Cell Endocrinol 2001 Feb 22;173(l-2): 147-155
140. Yanofsky M.F., Ma H., Bowman J.L., Drews J.N., Feidmann K.A., Meyerowitz E.M. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors // Nature. 1990. V. 346. P. 35-39.
141. Zhang K, Wang G, Zou Z, Jia X, Wang S, Lin P, Chen Y, Zhang Z, Wang Y. Cloning, characterization and TBT exposure response of CuZn superoxide dismutase from Haliotis diversicolor supertexta // Mol Biol Rep. 2008 Mar 24 Epub ahead of print.
142. Zhiming R, Zheng M, Wei S, Huiying F, Jian Z. Transformation of Industrialized Strain Candida glycerinogenes with Resistant Gene zeocin via Agrobacterium tumefaciens // Curr Microbiol. 2008 Epub ahead of print.
-
Погорелко, Геннадий Владимирович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.15
- Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
- Молекулярно-генетические механизмы ответа на абиотические стрессовые факторы у мутанта nfz24 Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.
- Роль гена Bractea в регуляции развития структуры соцветия и цветка у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh
- Создание коллекции инсерционных мутантов и идентификация генов, контролирующих морфогенез у Arabidopsis thaliana
- Взаимодействие генетических и фитогормональных факторов в контроле развития растений
