Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутривидовой полиморфизм генов пероксидаз у Arabidopsis thaliana

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Внутривидовой полиморфизм генов пероксидаз у Arabidopsis thaliana"

На правах рукописи

003448819

Куприянова Евгения Владимировна

ВНУТРИВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ПЕРОКСИДАЗ У АгаЫйоряп ЛаИапа

Специальность 03 00 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биолошческих наук

1 6 О КТ 2008

Москва 2008

003448819

Работа выполнена на кафедре генетики Биологического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ-

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ-

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ'

доктор биологических наук, доцент Ежова Татьяна Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Хавкин Эмиль Ефимович

кандидат биологических наук, доцент Хадеева Наталья Васильевна

Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита диссертации состоится «11» ноября 2008г в 12°° ч на заседании Диссертационного совета Д 002 214 01 в Институте общей генетики им Н И Вавилова РАН по адресу 119991, ГСП-1, Москва, ул Губкина, д 3

Факс (499) 132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им НИ Вавилова РАН по адресу 119991, ГСП-1, Москва, ул Губкина, д 3

Автореферат разослан« (р » УР 2008г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Полухина Г Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Пероксидазы растений, участвующие во многих жизненно важных процессах, кодируются десятками паралогичных генов В геноме A thaliana обнаружено более 70 пероксидазных гена, распределенных по всем хромосомам (Tognolli et al, 2002, Wehnder et al, 2002), однако, информация о функциях конкретных генов и соответствии между генами и конкретными изоформами белков остается ограниченной

Результаты секвенирования генома модельного растения Arabidopsis thaliana открыли новые возможности для анализа внутривидового полиморфизма генов, изучения эволюционной динамики генов и генных семейств Эти исследования выявили высокий уровень нуклеотидного полиморфизма многих генов этого самоопыляющегося растения и отсутствие для многих исследованных генов прямой связи генетической вариабельности полиморфизма с географическим происхождением линий Обнаружено явление диморфизма ряда генов, относящихся к разным генным семействам и имеющим разную функцию Диморфизм генов может быть связан как с историей происхождения вида и случайными изменениями частот аллелей, так и с действием балансирующего отбора, который может поддерживать существование разных гаплотипов, обеспечивающих адаптацию к локальным условиям обитания Для того, чтобы доказачь действие отбора в поддержании диморфизма исследуемого гена, необходимо убедиться в различии свойств гаплотипов, а также в наличии особого характера распределения сайтов синонимичных замен («молчащего» полиморфизма) в этом гене. В настоящее время действие балансирующей селекции доказано только для единичных генов Поиск и анализ мишеней действия естественного отбора на геномном уровне создают основу для моделирования эволюционного процесса и изучения эволюционной динамики видов (Orr, Coyne, 1992) Разработка новых модельных систем изучения закономерностей полиморфизма различных генов и генных семейств, играющих важную роль в онтогенезе и адаптации к разным условиям среды, являются актуальной задачей молекулярной и эволюционной генетики растений В данной работе исследовали внутривидовой полиморфизм пероксидазных генов A thaliana, локализованных в хромосоме 5, где по ранее полученным на кафедре генетики МГУ данным (Лебедева и др, 2004) локализован ген PXD, предположительно контролирующий образование трех изоформ анионной пероксидазы

Целью работы является молекулярно-генетическое изучение гена РХО и анализ внутривидового полиморфизма других генов пероксидаз, расположенных в районе локализации этого гена

Задачи работы:

1 Генетическое картирование гена РХО, кодирующего анионную пероксидазу

2 Изучение уровня и характера молекулярного полиморфизма генов пероксидаз А1Ргх52 - А1Ргх56, локализованных в верхнем плече хромосомы 5

3 Выявление связи между изоформами и генами пероксидаз у разных рас А /ЬаЪапа и мутантной линии рхс!

4 Анализ экспрессии генов пероксидаз в разных органах растения при действии стрессовых и гормональных факторов

Научная новизна Впервые проведено исследование внутривидового полиморфизма генов пероксидаз Показаны существенные различия в уровнях и характере полиморфизма 5-ти сцепленных генов пероксидаз, выявлено наличие диморфизма в гене А1Ргх53 и доказана его идентичность гену РХО На основе анализа спектра изоформ анионных пероксидаз у рас, относящихся к разным гаплотипам, установлена связь гена А1Ргх53 с изоформами белка Проведено изучение транскрипции генов пероксидаз в различных органах на разных стадиях развития растений и установлено, что ген А1Ргх53 активно экспрессируется во всех надземных органах растений Впервые показано изменение экспрессии (уровня транскрипции и активности изоформ) гена ЛгРгх53 в ответ на действие стрессовых факторов, установлено участие гена АгРгх53 в контроле количественных признаков (число листьев розетки, время появления цветоноса, скорость его развития, конечная высота цветоноса, число розеточных побегов, время отмирания листьев, время зацветания) Выявленные особенности полиморфизма и данные, свидетельствующие о проявлении различий между гаплотипами гена А[Ргх53 на транскрипционном и фенотипическом уровне, позволяют рассматривать диморфизм этого гена в качестве новой молекулярно-генетической модели для изучения роли балансирующего отбора в адаптивном эволюции генов растений

Научно-практическая значимость работы Изучение генов пероксидаз имеет практическое значение, поскольку пероксидазы (прежде всего, пероксидаза хрена) являются наиболее востребованными маркерами в иммуноферментном анализе Несмотря на огромную потребность в данном ферменте, существует проблема поиска аналогичного фермента с более высокой стабильностью и повышенной каталитической способностью Именно поэтому актуален поиск аналогов пероксидазы хрена и кодирующих генов пероксидаз из других растений,

2

разрабатываются методы их экспрессии в различных векторных системах Одним из таких генов является исследованный в данной работе ген A thahana AtPrx53/PXD Результаты работы вносят вклад в изучение функции этого гена, который может быть рекомендован для клонирования в экспрессионных векторах, используемых в генной инженерии

Положения, выносимые на защиту.

1 Ген AtPrx53/PXD A thahana, являющийся гомологом гена хрена HRPA2, экспрессируется во всех органах побега и кодирует три изоформы анионной пероксидазы, участвующей в процессах развития и защиты растения от действия стрессовых факторов

2 Ген AtPrx53/PXD A thahana характеризуется высоким уровнем внутривидового полиморфизма и представлен двумя основными гаплотипами (Dj и Col), которые различаются по характеру экспрессии и кодируют изоформы, отличающиеся по электрофоретической подвижности

3 Диморфизм гена AtPrx53/PXD A thahana поддерживается балансирующим отбором, что позволяет рассматривать этот ген как модель для изучения роли балансирующего отбора в адаптивной эволюции растений

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (г Минск, Беларусь 2004), на Международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва 2006), XII и XV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», «Ломоносов-2008» Москва, на XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, Германия 2008), на конференции FESPB (Tampere, Финляндия 2008), на межлабораторном семинаре «Генетика растений» и «Мутагенез и генетическая безопасность» (ИОГен им Н И Вавилова, 2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 'i 30 страницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы, включающего-/ЗРисточника Работа содержит с/^Грисунков и -/ ^таблиц

Работа выполнена по грантам РФФИ (проекты 07-04-01515-а и 07-04-12077-офи), и поддержана грантами ФЦП «Ведущие научные школы» (НШ-4202 2008 4) и программ РАН «Происхождение и эволюция биосферы» и «Динамика генофондов растении, животных и человека»

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал и условия выращивания В работе использовали расы и мутантную линию А ЛаЬапа из коллекции кафедры генетики МГУ (Янушкевич, 1985), а также линии, полученные из международного банка семян (табл 1) Растения выращивали в смеси почвы и вермикулита (2 1) в условиях теплицах или в асептических условиях на агаризованной среде Квитко

Таблица 1 Линии А thaliana, использованные в работе

Название линии № линии Происхождение

Dj-M (Dijon) K-l Франция

En-M (Enkheim) K-2 Германия

Kl-M (Köln) K-4 Германия

Li-M (Limburg) K-5 Германия

Bla-M (Blanes) K-6 Испания

Pet-M (Petergoph) K-7 Россия

Col-M (Columbia) K-8 США

Est-M (Estland) K-9 Эстония

мутантная линия pxd K-l 56 Россия

Ler (Landsberg erecta) Ler Германия

Ws (Wassilewskija) CS915 Украина

Sav-0 (Slavice) CS6856 Чешская Республика

Kas-1 (Kashmir) CS903 Индия

Cvi-0 (Cape Verdi Islands) CS902 Республика Кабо Верде

Co-1 (Coimbra) CS1084 Португалия

Hi-0 (Hilversum) CS1226 Нидерланды

Ita-0 (Ibel Tazekka) CS 1244 Марокко

Gel-1 (Geleen) CS22533 Нидерланды

Wci-0 (Wemmgen) CS22626 Швейцария

An-1 (Antwerpen) CS22626 Бельгия

En-1 (Eriengsboda) CS22548 Швеция

Морфологический анализ. Морфометрические измерения проводились не менее, чем на 15 растениях в двух повторностях (два разных сезона)

Воздействие стрессовых факторов При изучении влияния гипер- или гипотермии, растения выдерживали при температуре 42'С в течение 5 ч, либо при температуре 3°С в течение 4-х суток Растворами индолил-3-уксусной кислоты (ИУК 10 мкМ), параквата (50 мкМ) и гиббереллина растения обрабатывали в течение 3 дней, измерения активности пероксидаз и выделение РНК проводили на четвертые сутки после обработки

Генетическое картирование с использованием ДНК-маркеров. Использовали CAPS маркеры, выявляющие рестрикционный полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК Выделение ДНК проводили по методу Dcllaporta et al (1983) Для проведения полимеразной ценной реакции (ПЦР) использовали прайчеры, синтезированные в фирмах «Синтол» и «Евроген» (Россия), реактивы и протоколы фирмы «Силекс» (Россия) Для рестрикционного анализа использовали эндонуклеазы фирмы "Сибэнзим" (Россия) Анализ продуктов ПЦР и рестрикции проводили с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле с использованием электрофоретической камеры фирмы "Хеликон" (Россия) Частоту рекомбинации рассчитывали по формуле Koornneef, Stam (1987) Для клонирования фрагментов ДНК был использован лабораторный штамм Е coli JM109 и набор для клонирования pGEM-T vector system II (Promega, США)

Определение изоферментного состава пероксидаз Белки выделяли из листьев, стеблей, цветков и стручков взрослых растений Вертикальный гель-электрофорез в полиакриламидном (ПААГ) геле проводили по методике Davis (Davis, 1964) с модификациями Гели окрашивали в буфере с pH 4,7 (ацетат натрия, бензидин)

Изучение транскрипции генов проводили на основе полуколичественного метода оценки уровня мРНК в растениях, с помощью ПЦР-анализа продуктов обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) Выделение РНК проводили с использованием набора фирмы «Qiagen» (Германия) по протоколу фирмы-производителя Для синтеза первой цепи кДНК использовали реактивы и протокол фирмы «Силекс» Анализировали выход продукта при разных циклах амплификации с использованием праймеров к консервативным участкам исследуемых генов Для контроля за количеством выделенной мРНК анализировали транскрипцию гена APT! (аденинрибозилфосфотрансфераза 1), который характеризуется конститутивной экспрессией в растениях A thaliana (Cowling et al, 1998) Относительный уровень

транскрипции исследуемого гена определяли по стандартным методикам (Marone et al, 2001, Пенин и др , 2007) Секвенирование амплифицированных и клонированных нуклеотидных последовательностей ПЦР-продуктов проводили в межинститутском ЦКП «Геном»

Компьютерные методы анализа. Трансляцию т sihco последовательностей генов проводили с использованием программы Translate (http //en expasv org/tools/) Для поиска гомологичных белковых и нуклеогидньгх последовательностей использовали программу BLAST (http //www nebí nlm nih gov/BLAST) Множественные выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием программы ClustalW (http //www ebi ас uk/clustalw/), визуализацию осуществляли в программе GeneDoc Информацию о последовательности генов пероксидаз расы Columbia брали из базы данных TAIR (http //www arabidopsis org) Последовательность полноразмерной копии гена AtPrx53 и отдельных фрагментов генов AtPrx52, AtPrx55 и AtPrxSó линии Ler найдена в базе данных Monsanto Arabidopsis polymorphism and LER sequence collection (http //www arabidopsis org/Cereoii/index isp)

Оценку уровня внутривидового полиморфизма нуклеотидов, отклонений наблюдаемого полиморфизма нуклеотидов от нейтральности, неравновесия по сцеплению полиморфных сайтов проводили с использованием программы DnaSP Version 4 0 (http //www ub es/dnasp) Обработка морфометрических данных (ANOVAs) велась с помощью программы STATISTICA версия 6 0 (http //www statsoff com)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Локализация гена PXD на молекулярно-генетической карте A. thahana Для

картирования использовали растения F2 поколения, полученные от скрещивания мутанта pxd (линия К-156 с измененной подвижностью трех изоформ анионной пероксидазы) с растениями расы Dj-M Из растений, гомозиготных по мухатному гену pxd и гену PXD дикого типа, выделяли ДНК, которую анализировали с использованием CAPS-маркеров Среди 136 гомозиготных растений выявлена рекомбинация у 2 растений между мутацией pxd и CAPSp53 и у 4 растений -рекомбинация между pxd и CAPSp54 На основании этих данных определено генетическое расстояние между pxd и CAPSp53, которое составляет 0,7 сМ, а между pxd и CAPSp54 - 1,5 сМ Эти результаты свидетельствуют о том, что мутация pxd локализована в 3'-области гена AtPrx53 и подтвердили предположение (Лебедева и др, 2004) об идентичности гена PXD с геном AtPrx5S, кодирующим анионную пероксидазу

б

Неожиданный факт обнаружения рекомбинации между тандемно дуплицированными генами А1Ргх53 и А1Ргх54 и внутри гена А1Ргх53 (рис 1) указывают на повышение частоты рекомбинации в этом районе По результатам анализа растений поколения Р2 от скрещивания расы Ц)-М с линией К-156 на участке между 1енами А1Ргх53 и А1Ргх54 отношения генетических расстояний к физическим (253,4) в 49 раз выше, чем среднее по хромосоме (5 1), а внутри самого 1ена А1Ргх53 (1988,6) - в 390 раз. Таким образом, район локализации гена А1Ргх53 является горячей точкой рекомбинации

0,7 СМ «£-

CAPSp53 830

< 1291 П.н

AtPrx53/PXD

1,5 сМ

0,75 сМ

1349 п н

<

CAPSP54 300

1415 П,Н

AtPrx54

2960 п н

3900 п M

Рисунок 1 Локализация гена PXD на молекулярно-генетической карте хромосомы 5 A thaliana AtPrx53 AtPrx54 - гены, кодирующие пероксидазы Указаны генетические расстояния между геном PXD и маркерами CAPSps3 и CAPSPs4 в сМ и физические расстояния в п н

Наличие внутригенной рекомбинации было подтверждено и путем секвенирования клонированных последовательностей гена AtPrx53 из рекомбинантных растений Установлено, что рекомбинантные последовательности этого гена имеют мозаичную структуру, указывающую на прохождение рекомбинации по типу генной конверсии (рис 2)

Вторым неожиданным фактом явилось обнаружение различий между мутантным и диким аллелем по 22 нуклеотидам, хотя по данным автора линии С И Янушкевича мутантная линия К-156 была получена с помощью мутагенеза из расы Dijon (Янушкевич 1985) Данные о внутривидовом полиморфизме генов пероксидаз в

литературе отсутствуют В связи с этим следующей задачей работы было исследование уровня полиморфизма гена РХОШРгхЗЗ и расположенных на данном участке хромосомы пероксидазных генов - А1Ргх52, А1Ргх54, А1Ргх55, АгРгх5б

гЧ м м и К п а сч 10 о т <п 10 я 10 <Х 10 01 (71 п I т о г» о N г>. п N ю V N о чГ г- 10 8 10 о а 808 ст N О 1093 1098 1167 14 я 1-1

с А С с Т <3 - ) Т с в А А Т т т С А А С А С т

с А с С Т с - Т а С А А т т Л А А 1А- 16' т

с '¡.ХР.Г * ^ Г-- - '.с- с а1, I с йг Т с С ■ т т

X, т 1 р'А С с. 0 с А •X т т т с А .Т ш. , т

уТ г-т-: ■ж ч и ' к: *>т 1-е,, ! т "С 1 т- ' Й

Рисунок 2 Мозаичная структура рекомбинантных аллелей, выявленных у рекомбинантных потомков ¥2 поколения от скрещивания растений расы Ц)-М и К-156 Аллели представлены как совокупность последовательных полиморфных сайтов (номер сайта указан сверху) Верхняя и нижняя - аллели А1Ргх53 родительских линий Между ними аллели из рекомбинантных растений

Изучение полиморфизма генов А(Ргх52 - А(Ргх56. Сравнительный анализ полиморфизма 5 генов пероксидаз проводили на растениях 4-х рас и 2-х лабораторных линий Минимальный уровень полиморфизма обнаружен в гене А/Ргх56 (0 00048, табл 2) Показатель нуклеотидного полиморфизма 1г для генов А(Ргх52 и А1Ргх55 имел сходный уровень (0 00344 и 0 00224, соответственно), который не превышает среднего значения показателя ж, рассчитанного для большинства ядерных генов (0 007) А Лакапа (УоэИкк й а1 2003) Показатель нуклеотидного полиморфизма т для гена А1Ргх53 (0 00915) в 3-4 раза выше, чем для генов А1Ргх52 и А1Ргх55 и примерно в 20 раз выше, чем для А/Ргх56 Показатель нуклеотидного полиморфизма т для гена А1Ргх54 (0 00703) несколько ниже, чем для гена АгРгхЗЗ, но выше, чем для остальных генов

Оценка возможности отклонения наблюдаемого полиморфизма генов от гипотезы нейтральности изменений пуклеотидных последовательностей (по параметрам Э и Б*) не выявила достоверных отклонений от нейтральной гипотезы

эволюции в генах AtPrx52, AtPrx55, AtPrxSó (табл 2) Эти показатели имеют отрицательные значения (кроме интронов AtPrx52), что указывает на некоторый избыток низкочастотного полиморфизма. Хотя применимость гипотезы нейтральности не отвергается статистически и для генов AtPrx53, AíPrx54, ее проверка на основе показателя ZnS (ZnS=0 63, Р<0 05 и 0 85, Р<0 05, соответственно), свидетельствует о неслучайности ассоциации полиморфных сайтов в этих генах (Kelly, 1997) Положительные значения показателей D и D* для генов AtPrx53 и AtPrx54 также свидетельствуют об избытке множественных полиморфных изменений между последовательностями этих генов из разных линий (табл 2)

Поскольку только в гене AíPrx53 изменения нуклеотидной последовательности вызывают значимые изменения аминокислотной последовательности, дальнейшие исследования проводили на гене AtPrx53

Изучение полиморфизма гена AtPrx53. При исследовании полноразмерной нуклеотидной последовательности гена AtPrx53 из 20-ти рас и линий выявлено 29 сайтов замен, распределенных по всему гену Среди них 20 информативных сайтов (замены, встречающиеся не менее, чем у двух последовательностей), 5 замен, свойственных только отдельным расам (однонуклеотидные замены - SNP, 2 инсерции, 2 делении) (табл 3) Выявлена неоднородность распределения полиморфных сайтов наиболее часто они обнаруживаются во 2-м и 3- м интронах и 3-м экзоне По 18 полиморфным сайтам (16 нуклеотидных замен и 2 сайта делеций/инсерций отмечены в таблице 3 серым цветом) 20 рас и линий разделяются на 2 гаплотнпа, обозначенные как гаплотип Dj или Col Наряду с этим обнаружены также единичные замены, относящиеся к отдельным расам (Eri-1, Wei-o, Di-M, Sav-0, Kas-1), однако эти замены не приводят к изменению аминокислотной последовательности

Анализ нуклеошдной последовательности гена AtPrx53 не выявил ассоциации между четким диморфизмом и географическим происхождением рас В каждом гаплотипе присутствуют аллели гена, характерные для линий из разных континентов Так, гаплотип Col соответствует расе из Марокко (lta-0), США (Со1-М), Индии (Kas-1), России (Pet-M) и западной Европы (Германии К1-М, Бельгии Ап-1, Швеции Eri-1)

Таблица 2 Оценка уровня внутривидового полиморфизма (т) и его отклонения от

нейтральности (О, Б*)

Ген П s N 7Г D D*

ÁtPrx52 экзоны 5 6 972 0,00247 -1,14554 -1,14554

интроны 5 6 703 0,00455 0,76369 0,76369

весь ген 5 12 1675 0,00344 -0,20090 -0,20090

AtPrx53 экзоны 6 13 1008 0,00694 1,40307 0,93041

интроны 6 9 285 0,01708 1,29710 0,93211

весь ген 6 22 1293 0,00915 1,40907 0,96620

AtPrx54 экзоны 6 7 1080 0,00365 1,64712 1,14854

интроны 6 10 339 0,01840 2,22223 1,62884

весь ген 6 17 1417 0,00703 2,01733 1,49503

AtPrx55 экзоны 5 6 981 0,00263 -0,66823 -0,66823

интроны 5 0 180 0,0000 0,00000 0,00000

весь ген 5 6 1161 0,00224 -0,66823 -0,66823

AtPrx56 экзоны 5 1 991 0,00040 -0,81650 -0,81650

интроны 5 1 661 0,00061 -0,81650 -0,81650

весь ген 5 2 1652 0,00048 -0,97256 -0,97256

7Г - показатель уровня полиморфизма, в - число полиморфных сайтов , п - число последовательностей

Четыре из выявленных сайтов полиморфизма (сайт 61, находящийся в 1-ом экзоне, 720 и 745- в 3-ем экзоне и 1093 - в 4-ом экзоне) обуславливают полиморфизм аминокислотных последовательностей в белке AtPrx53 В сигнальном пептиде этого белка в позиции 21 у рас с гаплотипом Col находится валин, а у рас с гаплотипом Dj -лейцин (сходные свойства) В позиции 172 у гагаютипа Col находится изолейцин, а у гаплотипа Dj - валин, обе аминокислоты имеют алифатические группы и не несут заряда, поэтому этот полиморфизм функционально не значим В позиции 180 у гаплотипа Dj находится серии (гидроксильная группа), а у гаплотипа Col -фенилаланин (ароматическая группа) Эта позиция находится в вариабельном участке

белка, находящимся в непосредственной близости от потенциального сайта гликозилирования (Welinder et al, 2002), поэтому выявленный полиморфизм, возможно, оказывает влияние на эффективность присоединения гликана В позиции 270 у гаплотипа Dj находится аспарагин (не несет заряда), а у гаплотипа Col -аспарагиновая кислота (заряд отрицательный) (табл 4) Поскольку в ближайшей позиции глицин 271 является консервативным сайтом и предположительно влияет на структуру белка (Wehnder et al, 2002), различие в заряде полиморфных аминокислот может оказывать влияние на конформацию белка Уникальный полиморфный сайт в четвертом экзоне гена AtPrx53 расы Dj-M (позиция 1291) отражает утрату стоп-кодона, что может привести к изменению длины пептида Таким образом, диморфизм гена AtPrx53 проявляется и на уровне белка

Объяснение полиморфизма на основе гипотезы нейтральности (случайности ассоциаций полиморфных сайтов в аллелях AtPrx53) было отвергнуто на выборке из 20 рас с использованием показателя Zns, величина которого (0 725) достоверно превышает значение, ожидаемое при нейтральной эволюции (Р<0 025) Отклонение характера наблюдаемых изменений нуклеотидных последовательностей от гипотезы нейтральности отражалось и в значениях показателей D и D*, оценивающих не только степень, но и направление этих отклонений (табл 4) Положительные значения показателей D и D* для rem AtPrx53 для 20 рас свидетельствуют об избытке множественных полиморфных изменений между последовательностями аллелей AtPrx53 О неслучайной ассоциации полиморфных сайтов свидетельствуют попарные сравнения последовательностей без учета SNP с использованием теста (Kelly ,1997) Из общего числа (190) таких сравнений 72% (137 попарных сравнений) показали статистическую значимость ассоциации полиморфных сайтов (Р<0 05)

Анализ полиморфизма каждого из гаплотипов показал, что в гаплотипе Col уровень общего полиморфизма несколько выше, чем в Dj Разница обусловлена большим числом нуклеотидных замен в кодирующей части гена (табл 3) Это может быть связано как с более древним происхождением гаплотипа Col по сравнению с гаплотипом Dj, так и с ограниченностью выборки для гаплотипа Dj Возможно также, что гаплотип Dj подвергается жесткому селекционному давлению, в пользу чего свидетельствует отрицательное значение показателя D. указывающего на избыток низкочастотного полиморфизма (табл 4)

Таблица 3 Полиморфные сайты пероксидазного гена AtPrx53

I - гаплотип Coi, II - гаплотип Dj, цифрами отмечены полиморфные сайты, отличающие между собой гаплотипы и расы, звездочками

отмечены нуклеотиды, идентичные Col, Del - делеции, Ins - инсерции

12

В пользу этого предположения свидетельствуют также результаты изучения гомологов гена AtPrx53 друшх представителей семейства крестоцветных Установлена полная идентичность амплифицированных последовательностей гомологов AtPrx53 из геномов Arabidopsis arenosa и шести инбредных линий Brasica olerácea разного происхождения гаплотипу Dj A thahana по наиболее полиморфному участку 3-его экзона (рис 3)

604

со"1-м TATI GIT

Dj-M TAT! АГ

a.Arenosa TAT! А

В oleracea Li TAT! АГ

В oleracea L2 TATI АГ

В oleracea l3 TATI ДГ

В, oleracea l4 TAT! АГ

СоЧ-М Di-M

A.Arenosa

В oleracea U. В oleracea i_2

B. oleracea l3 В. oleracea l4

Co"l-M DJ-M

A Arenosa В oleracea Ll B oleracea L2 В oleracea l3 8 oleracea l4

Col-M D1-M

A.Arenosa

В oleracea Ll

B. oleracea L2 В oleracea i_3 В oleracea l4

HWHW—iU11*<14,U1<U1fK1*U'H1<KU1*U1iV1<V1<HK1tHK'k'H'k1t HWti<U*iitifk-tfUKK1t1tHK ÜHHWUUtil*

704

GGÄAGÄAGAGATAGTCTCACGGCCAACCTCGCCGGTGCAAATTqT GGAAGAAGAGATAGTCTCACGGCCAACCTCGCCGGTGCAAATTQG GGAAGAAGAGATAGTCTCACGGCCAACCTCGCCGGTGCAAATTCG GGAAGAAGAGATAGTCTCACGGCCAACCTCGCCGGTGCAAATTCG GGAAGAAGAGATAGTCTCACGGCCAACCTCGCCGGTGCAAATTCG GGAAGAAGAGATAGTCTCACGGCCAACCTCGCCGGTGCAAATTCG GGAAGAAGAGATAGTCTCACGGCCAACCTCGCCGGTGCAAATTCG

Ъ-иЪ-кЪЪ-иниЪЬЪиЫг-и-Ь'ЬЪКЬК'к-К'иЫскЪЪНЫШЬиЪЪЪЪЬКЫ*—TfUhKHKV * KHKRWti

12 O 731 745,746

■arCGAAAGCCtffltkGCAACATCACA7 A TCGAAAGCCT i AGCAACATCACAT A TCGAAAGCCT Д AGCAACATCACA7 A TCGAAAGCCT ßAGCAACATCACAT A TCGAAAGCCT A AGCAACATCACAT A TCGAAAGCCT Л AGCAACATCACAT A TCGAAAGCCT 4 AGCAACATCACAT

ГССАТТССТТСТССС ¡(ГССАТТССТТСТССС ГССАТТССТТСТССС ГССАТТССТТСТССС ГССАТТССТТСТССС ГССАТТССТТСТССС ГССАТТССТТСТССС

CG AAATTTTCGGCTGTCGGGCTTAATAC AAACG AT TT AAATTTTCGGCTGTCGGGCTT AATACAAACGAT AAATTTTCGGCTGTCGGGCTTAATACAAACGAT TT AAATTTTCGGCTGTCGGGCTT AATACAAACGAT TT AAATTTTCGGCTGTCGGGCTT AATACAAACGAT TT AAATTTTCGGCTGTCGGGCTTAATACAAACGAT AAATTTTCGGCTGTCGGGCTT AATACAAACGAT

K'MlIfti-UH-k'HlJ-J-kHKH-kHHWUHKHt}-<i<-tll4l<-Hl4lftrii1<H<Ui<H1<WU'H1t UU-b-H-ftUUV WtfKI*

CTGGTAGCCTTATCTGGT CTGGTAGCCTTATCTGGT CTGGTAGCCTTATCTGGT CTGGTAGCCTTATCTGGT CTGGTAGCCTTATCTGGT CTGGTAGCCTTATCTGGT CTGGTAGCCTTATCTGGT

UKWttKliKVIfUUVItVUHWi

Рисунок 3 Множественное выравнивание участка нуклеотидных последовательностей гена AíPrx53 у растений рас Col-M, Dj-M Arabidopsis thahana, растений Brassica oleracea (LI, L2, L3, L4 - номера линий) и Arabidopsis arenosa Цифрами отмечены позиции сайтов полиморфизма

Эти данные позволяют предполагать, что эта гаплотип Dj присутствовал у предковых форм крестоцветных и имеет более древнее происхождение, чем гаплотип Col

Таблица 4 Оценка уровня внутривидового полиморфизма (х) и его отклонения от нейтральности (Б, Б*) в гене А1Ргх53

TtYlAtPrx53 параметры линии (n=20) Col- гаплотип (n-12) Dj-гаплотип (n=8)

Весь ген S 25 (20/5) 5 (3/2) 4(1/3)

я 0,00768 0,00127 0,00091

х silent 0,01374 0,00200 0,00223

Tapma's D 1,56713 NS -0,04304 NS -1,02972 NS

Fu and Li's D* 0,52975 NS -0,13525 NS -0,92081 NS

Интроны S 10(9/1) 2 (2/0) 2(1/1)

ж 0,01447 0,00228 0,00326

Экзоны все нуклеотиды S 15(12/3) 3(2/1) 2 (0/1)

X 0,00576 0,00098 0,00025

синонимичные замены IT 0,01289 0,00168 0,00102

несинонимичныс замены X 0,00347 0,00087 0,00000

N8- статистически недостоверные данные

Если вид А Лакапа произошел в результате слияния двух популяций или интрогрессии части генома из какого-то другого вида, то многие гены А МаИапа должны быть диморфными, что уже показано для нескольких десятков генов Если привнесенные в результате вышеуказанных событий гены эволюционируют в соответствии с теорией нейтральной эволюции, то можно ожидать постепенную утрату диморфизма в результате процессов мутагенеза и рекомбинации В случае гена А1Ргх53, в отличие от других диморфных генов А ЛаЬапа, например, АЛк (Тппал й а!, 1996), СН1 (КшШпеп й а1, 2000), рассчитанный показатель Кт (минимальное число рекомбинационных событий) равен нулю Это свидетельствует в пользу реализации каких-то механизмов поддержания строгого диморфизма в этом гене и указывает на то, что диморфизм гена А(Ргу53 не является простым следствием истории происхождения вида

В пользу поддержания диморфизма за счет балансирующей селекцией свидетельствуют результаты анализа распределения "молчащих" полиморфных сайтов по гену АгРгх53 Известно, что естественный и искусственный отбор должны приводить к накоплению незначимых ("молчащих") замен вокруг мишени действия

естественного отбора. Отчетливый пик "молчащего" полиморфизма присутствует в дисталыюм районе 3-его экзона гена А1Ргх53, где находится замена двух соседних нуклеотидов (положения 745-746), которая обуславливает несинонимичную замену серина на фенилаланин (рис.4).

внутри гаплотипа Col Позиция куклеогидов о внутри гаплотипа Dj -между Col и Dj гаплотипами

Рисунок 4. Распределение "молчащих" полиморфных сайтов по гену AtPrx53.

Эти данные подтверждают участие балансирующей селекции в возникновении и (или) поддержании аллельного диморфизма и указывают на эволюционную значимость выявленной замены и возможные функциональные особенности изоферментов, кодируемых разными гаплотипами (аллелями) гена AíPrx53.

Связь аллельного диморфизма гена AtPrxSS с подвижностью изоформ белка. Поскольку диморфизм нуклеотидной последовательности гена AtPrx53 приводит к диморфизму аминокислотной последовательности продукта (трансляция in silico), было проведено исследование изоформ анионной пероксндазы в 20 расах А. ihaliana. Проведенный анализ подтвердил обнаруженные ранее (Лебедева и др. 2003) различия в подвижности трех изоформ в растениях расы Dj-M и Col-М. Более того, выявлены такие же различия в подвижности трех изоформ пероксидазы между всеми расами гаплотипа Dj (всего 8 рас) и Col (12 рас) и сходство спектров пероксидаз среди линий каждого из гаплотипов (рис. 5).

Гашштш! Dj Dj-M En-M Ws

Гаплотшт Col

Kl-M Bla-M Li-M Pet-M Col-M Est-M

Гисунок 5. Спектр изоформ анионной пероксидазы из верхушек цветоноса 3-х рас гаплотипа Dj и б-и рас гаплотипа Col. Элекгрофоретическая подвижность изоформ в расах Kas-1, An-1, Eri-1, Ita-0, Со-1 и Cvi-О как в расе Col-М, в Gel-1, Ler, Sav-0, Hi-Ои Wei-О как в Dj-M (10,9, 8 / 10', 9', 8'- номера изоформ, кодируемых гаплотипами гена AtPrx53/PXD).

Соответствие между электрофоретической подвижностью изоформ анионной пероксидазы и гаплотипами по гену АгРгх53 позволяет сделать вывод о том, что разная подвижность изоформ обусловлена проявлением диаллельного полиморфизма аминокислотной последовательности в белке А1Ргх53. Полученные данные свидетельствуют о том, что все три изоформы анионной пероксидазы кодируются геном А1Ргх53. Это подтверждает предположение об идентичности генов РХО и А(Ргх53.

Анализ транскрипции гена А1Ргх53 в разных органах на разных стадиях развития и при различных гормональных и стрессовых воздействиях. Ген

А1Ргх53 активно экспрессируется во всех исследуемых органах. Наибольшая экспрессия наблюдалась в цветках и розеточных листьях. В стебле и стручках уровень экспрессии несколько ниже (рис. 6). Экспрессия в 3-недельных розеточных листьях ниже, чем в листьях 6 - недельной розетки.

60 50 40 30 20 ю о

Рисунок 6. Относительный уровень транскрипции гена А1ргх53 в разных органах растений расы Ц]-М (ОТ-ПЦР). Опыт проводили на выборке из 3-х растений.

При воздействии индуктора окислительного стресса параквата активировалась транскрипция гена в стручках и в меньшей степени в листе и стебле. В цветках не наблюдалось повышения уровня транскрипции по сравнению с контролем (растения без обработки). Под влиянием ауксина активировалась транскрипция в розеточном листе, но подавлялась - в стручке. Незначительно увеличивался уровень транскрипции Л(Ргх53 в стебле и в цветках относительно контроля. Под действием гиббереллина значительно активировалась транскрипция в стебле, и подавлялась транскрипция в стручке, увеличивался уровень экспрессии в цветках и листьях. У растений, выращенных на коротком дне, значительно активировалась транскрипция в стебле, но подавлялась транскрипция в листе. Таким образом, из полученных данных следует, что уровень экспрессии гена Л?Ргх5.? зависит от органоспецифичности, онтогенетических этапов и действия стрессовых и гормональных факторов.

Анализ экспрессии в ответ на различные гормональные и стрессовые воздействия (ауксин, паракват, гиббереллин, гипертермия, гипотермия, засуха, развитие на коротком дне) показал также существенные различия в уровне

ювенильная стебель цветки стручки лист

розетка

транскрипции аллелей в разных органах. Видно, что аллели, принадлежащие разным гаплотипам, по-разному реагируют на стрессовые и гормональные воздействия. Например, в листе под действием параквата и гиббереллина более значительно активировалась транскрипция аллеля гаплотипа Со], по сравнению с аллелем гаплотипа Dj (рис.7).

В листьях растений выращенных на коротком дне, активировалась транскрипция аллеля гаплотипа Col, но подавлялась транскрипция аллели Dj.

0 Dj-M S К-156

Рисунок 7. Экспрессия гена AtPrx53 в листе в ответ на действия ауксина (ИУК), параквата, гиббереллина (ГА), засухи, развития на коротком дне (КД). Уровень экспрессии указан в относительных единицах и вычислялся как разница между уровнем экспрессии в опытном и контрольном образце (зрелый лист, с выращенного в нормальных условиях растения). Опыт проводили на выборке из 3-х разных растений.

Проявление аллельного диморфизма гена AtPrx53 на уровне морфологических признаков. Для выяснения функциональных различий между аллелями гена AtPrx53 на уровне фенотипа проведен анализ количественных признаков у растений разных природных рас. При сравнительном анализе особенностей развития растений с разными гаплотипами AtPrxS3 учитывали число листьев розетки, время появления цветоноса, скорость его развития, а также конечную высоту цветоноса, число розеточных побегов, время отмирания листьев. Эти исследования показали, что большинство рас гаплотипа Dj (исключение составляет раса Ап-1) зацветают раньше и имеют более короткий жизненный цикл (раннее отмирание розеточных листьев), меньшее число розеточных и стеблевых листьев, более короткий стебель, чем растения расы гаплотипа Col (табл.5).

Результаты дисперсионного анализа подтвердили наличие достоверной связи между гаплотипом и всеми исследованными количественными признаками (табл 5)

Таблица 5. Однофакторный дисперсионный анализ связи между гаплотипами Col и Dj гена AtPrx53 и количественными признаками (F-тсст, значение р< 0 05)

Признак Гаплогап Col Гаплотип Dj Р (р<0 05)

Среднее Станд откл Станд ошибка Среднее Станд откл Станд ошибка F

Число листьев розетки 15,0 7,4 0,7 8,3 1,2 0,1 65,6 0,00

Число стеблевых листьев 5,1 2,5 0,5 3,6 0,8 0,1 29,2 0,00

Число розеточпых побегов 1,6 1,2 0,3 1,2 1,2 0,1 4,4 0,04

Высота цветоноса на 40 день 12,5 6,5 0,5 17,6 10,6 1,1 24,4 0,000001

Конечная высота цветоноса 38,9 5,8 0,8 36,7 7,1 0,7 6,2 0,03

Время цветения 42,4 8,2 2,4 31,8 1,4 0,5 12,4 0,003

Время отмирания розеточных листьев 60,4 9,6 2,5 48,3 4,6 1,7 10,2 0,005

Проведенные исследования выявили ассоциацию между гаплотипами перокидазного гена А1Ргх53 и исследованными количественными признаками Диморфизм гена А1Ргх53 и связь между гаплотипом и всеми исследованными количественными признаками позволяют предполагать, что гаплотипы функционально отличаются и ген находится под влиянием балансирующего отбора

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование внутривидового полиморфизма пяти генов пероксидаз {А1Ргх52 -А1Ргх56) выявило существенные различия в уровне и характере геномного полиморфизма А Лакапа В гене А1Ргх53, который оказался идентичным гену РХО, среди растений 20 природных рас выявлено существование двух гаплотипов, которые отличались множественными нуклеотидными заменами, большинство из которых показывали неслучайную ассоциацшо Диморфизм проявлялся и на уровне белка Связи между географией обитания и гаплотипом не выявлено, что находится в соответствии с предположением о молодости вида А ОгаЬапа и его быстрым распространением по планете

Диморфизм генов самоопыляющегося вида А Макета может быть связан с историей происхождения вида, со случайными колебаниями частот аллелей, а также с явлением балансирующей селекции, которая обеспечивает поддержание определенных аллелей, контролирующих признаки, определяющие адаптацию к локальным условиям существования Те же особенности полиморфизма могут наблюдаться не только в самом гене - мишени действия отбора, но и в сцепленных с ним участках ДНК (межгенных участках и генах) Поэтому при обнаружении отклонений от гипотезы нейтральности необходимо убедиться в различии свойств гаплотипов, а значит и возможности действия отбора именно на данный локус

Проведенные исследования гена А1Ргх53 свидетельствует о том, что явление диморфизма может быть обусловлено действием балансирующего отбора именно на этот ген, а не на сцепленный с ним локус Во-первых, пероксидаза, кодируемая геном А1Ргх53. является мажорной формой анионной пероксидазы, которая активно экспрессируется в листе, стебле, цветках и стручках и, по-видимому, играет важную роль в развитии растений и устойчивости к стрессовым факторам Нуклеотидный диморфизм этого пероксидазного гена проявляется на уровне белка (в электрофоретической подвижности трех изоформ), что может влиять на свойства пероксидазы, ее субстратную специфичность и конформацию

Во-вторых, вблизи функционально значимой замены в 3-ем экзоне обнаружен пик «молчащего» полиморфизма, который исчезает, если анализировать каждый гаплотип в отдельности Только одна из двух неконсервативных замен аминокислот (РЬе/Зег180), различающихся у гаплотипов, находится в гипервариабельном районе

Эти данные являются существенным свидетельством действия балансирующего отбора (Hudson and Kaplan, 1988, Tian et al, 2002) и указывают на то, что именно это значимое изменение может отвечать за функциональный диморфизм аллозимов и являться мишеныо балансирующего отбора

В-третьих, выявлена корреляция между гаплотипами по гену AtPrx53 и рядом количественных показателей, связанных с такими клеточными процессами, как деление и растяжение Известно, что пероксидазы участвуют в контроле растяжения клеток, способствуя размягчению клеточной стенки (за счет действия радикалов кислорода, образуемых пероксидазой), а также предотвращают растяжение, укрепляя клеточную стенку (за счет продукции перекиси водорода) Выявленные различия в характере количественных признаков у разпых гаплотипов AtPrx53, могут быть связаны с особенностями функции в реализации вышеуказанных процессов Обнаруженные различия в картине экспрессии аллелей, представляющих разные гагшотипы гена AtPrx53, могут быть обусловлены нуклеотидными заменами в регуляторных районах этого гена Таким образом, показано, что диморфизм гена AtPrxS3 проявляется на нескольких уровнях (1) на уровне транскрипции аллелей, обуславливая различия в тканеспецифичности и ответе на действие стрессовых факторов, (2) на уровне подвижности аллозимов и их ферментативной активности после действия стрессовых факторов, (3) на уровне статистически значимых различий количественных фенотипических признаках у растений, имеющих разный гаплотип Данные о различии свойств гаплотипов, и результаты изучения полиморфизма гена AtPrx53 указывают на то, что диморфизм этого гена, кодирующего мажорную анионную пероксидазу, поддерживается балансирующим отбором Отметим, что в настоящее время подобные всесторонние аргументы в пользу поддержания генного диморфизма балансирующим отбором получены лишь для единичных локусов. Полученные результаты позволяют рассматривать ген AtPrx53 как модель для изучения роли балансирующего отбора в адаптивной эволюции растений на геномном уровне

Полученные сведения о нуклеотидных последовательностях пяти генов из природных рас отправлены в GenBank Информация о CAPS маркерах отправлена в базу данных TAIR

выводы

1 Локализованные в 5-ой хромосоме А Лакана гены пероксидаз (А1Ргх52, А/Ргх53, АгРгх54, А1Ргх55, А1Ргх56) различаются по уровню внутривидового полиморфизма нуклеотидной последовательности - наименьший характерен для гена Л!Ргх56, наибольший - А1Ргх53

2 Ген А1Ргх53 идентичен гену РХВ и кодирует 3 изоформы анионной пероксидазы, которые проявляют разную тканеспецифическую активность

3 Для гена А!Ргх53 характерен аллельный диморфизм, который проявляется на уровне белкового продукта и обуславливает различия в электрофорстической подвижности аллозимов

4 Различия между двумя гаплотипами А1Ргх53 проявляются как на уровне транскрипции аллелей в разных органах и в ответ на действие стрессовых факторов, так и на уровне активности фермента

5 Выявлена корреляция между гаплотипом по гену А1Ргх53 и рядом количественных показателей (продолжительность вегетационного периода, время зацветания, продолжительность жизненного цикла и др)

6 Данные, свидетельствующие о дивергенции функциональных свойств ганлотипов гена А(Ргх53 позволяют рассматривать этот пероксидазный ген в качестве информативной модели для изучения роли балансирующего отбора в адаптивной эволюции растений на геномном уровне

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Куприянова Е. В., Ежова Т А, Лебедева О В , Шестаков С В Внутривидовой полиморфизм пероксидазпых генов, локализованных в 5-ой хромосоме Arabidopsis thaliana // Известия АН, серия биол 2006 ТЗЗ №4 С 353-362

2 Kupriyanova Е. V., Ezhova Т А, and Shestakov S V Dimorphic DNA variation in the anionic peroxidase gene AtPrx53 of Arabidopsis thaliana II Genes Genet Syst 2007 82, 377-385

3 Куприянова E. В , Новокрегценова M Г Молекулярно-генетическое картирование генов Arabidopsis thaliana, участвующих в защите от стрессовых факторов // Материалы Международной конференции «Молекулярная генетики, геномика и Биотехнология» Минск, Беларусь 2004, стр 79

4 Куприянова Е. В Роль генных конверсии в сохранении генетической информации и создании внутривидовои генетической изменчивости у Arabidopsis thaliana // Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире» Москва 2006 С 106

5 Куприянова Е. В. Эволюционная динамика нуклеотидной последовательности генов пероксидаз Arabidopsis thaliana (L) Ileynh // Материалы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», Москва, с 124-125

6 Куприянова Е. В, Сравнительный анализ экспрессии генов пероксидаз, локализованных в 5-ой хромосоме Arabidopsis thaliana // Материалы докладов XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, с 71-72

7 Kupriyanova Е. V. Peroxidase gene AtPrx53 is a mitotic recombination hotspot in Arabidopsis thaliana The XX International Congress of Genetics 2008, Berlin, Germany, с 202

8 Kupriyanova E. V The Arabidopsis thaliana AtPrx53 peroxidase gene naturally occurring dimorphism association with developmental traits and allozymc mobility FESPB conference 2008, Tampere, Finland, с 24

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю Татьяне Анатольевне Ежовой за неоценимую помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы

Глубокую признательность Солдатовой Ольге Павловне, а также сотрудникам нашей лаборатории Новокрещеновой Марии Габриэловне и Ленину Алексею Александровичу за разностороннюю помощь в работе

Автор приносит глубокую благодарность заведующему кафедрой генетики МГУ академику РАН Сергею Васильевичу Шестакову за всестороннюю поддержку и интерес к работе, а также всем сотрудникам кафедры генетики за полученные знания в области генетики Профессору Б.Гримму, а также ¡С М Мусину! за предоставленную возможность выполнения части работы в руководимых ими лабораториях

Своим друзьям и коллегам Василевскому Александру и Скрыпник Ксении за неоценимую помощь в исследованиях и поддержку

Отпечатано в копицептре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stpnnt ru e-mail zakaz@stpnnt ru тел 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 03 10 2008 г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Куприянова, Евгения Владимировна

ВВЕДЕНИЕ 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Пероксидазы растений

1.1. Структура и функции пероксидаз

Участие пероксидаз в процессе прорастания семян

• Участие пероксидаз в лигнификации, суберинизации, в ^ процессах растяжения и уплотнению клеточных стенок

• Участие пероксидазы в катаболизме ауксина

• Участие пероксидаз в защите от стрессовых воздействий

• Изучение экспрессии генов пероксидаз A.thaliana

П. Происхождение и эволюция семейства пероксидазных генов растений

HI. Изучение эволюции генов с помощью анализа их внутривидового ^ полиморфизма

IV. Балансирующий отбор

V. Методы и результаты изучения эволюционной динамики генов ^д растений

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутривидовой полиморфизм генов пероксидаз у Arabidopsis thaliana"

Пероксидазы растений, участвующие во многих жизненно важных реакциях, кодируются десятками паралогичных генов. В геноме Arabidopsis thaliana обнаружено 73 пероксидазных гена, распределенных по всем хромосомам (Tognolli et al., 2002; Welinder et al., 2002). Такое количество генов свидетельствует о важности выполняемой ими функции, однако, несмотря на активные исследования растительных пероксидаз, информация о функциях конкретных генов пероксидаз, а также о соответствии между генами и конкретными изоформами остается ограниченной.

Секвенирование генома модельного растения A. thaliana открыло новые возможности для анализа внутривидового полиморфизма генов, изучения на его основе эволюционной динамики генов и генных семейств. Эти исследования выявили неожиданные феномены - высокий уровень нуклеотидного разнообразия генов этого самоопыляющегося растения, сопоставимый с таковым у родственных перекрестно опыляющихся видов, отсутствие связи генетического полиморфизма с географическим происхождением, а также диморфизм ряда генов, относящихся к разным генным семействам и имеющим разную функцию. Диморфизм генов может быть как результатом истории происхождения вида, так и следствием балансирующего отбора, который может поддерживать существование разных гаплотипов, обеспечивающих локальную адаптацию к разным условиям обитания (King et al., 1993; Price et al., 1994; Innan et al. 1996, 1997). Для того, чтобы доказать действие отбора в поддержании генного диморфизма, необходимо убедиться в различии свойств гаплотипов, а также в наличии особого характера распределения сайтов синонимичных замен («молчащего» полиморфизма) вокруг мишени естественного отбора. В настоящее время этот факт можно считать доказанным лишь для единичных генов, контролирующих устойчивость к патогенам. Поиск таких мишеней действия естественного отбора открывает возможности для создания моделей эволюционного процесса и изучения эволюционной динамики видов

Orr, Coyne, 1992). Расширение исследований по молекулярной эволюции, включение в них новых генов и генных семейств, играющих важнейшую роль в развитии и адаптации к разным условиям среды, ускорит решение этой глобальной проблемы. В данной работе исследование полиморфизма проводили на пероксидазных генах. Среди 73 генов A.thaliana были выбраны гены, локализованные в хромосоме 5, где по данным ранее проведенных в нашей лаборатории исследований локализован ген PXD, предположительно контролирующий образование 3-х изоформ пероксидазы.

Целью работы является молекулярно-генетическое изучение гена PXD и анализ внутривидового полиморфизма генов пероксидаз, расположенных в районе локализации этого гена.

Задачи работы:

1. Генетическое картирование гена PXD, кодирующего анионную пероксидазу.

2. Изучение уровня и характера молекулярного полиморфизма генов, пероксидаз AtPrx52 - AtPrx56, локализованных в верхнем плече хромосомы 5.

3. Выявление связи между изоформами и генами пероксидаз у разных рас А. thaliana и мутантной линии pxd.

4. Анализ экспрессии генов пероксидаз в разных органах растения при действии стрессовых и гормональных факторов.

Научная новизна. Впервые проведено исследование внутривидового полиморфизма генов пероксидаз. Показаны существенные различия в уровнях и характере полиморфизма 5-ти сцепленных генов пероксидаз, выявлено наличие диморфизма в гене AtPrx53 и доказана его идентичность гену PXD. На основе анализа спектра изоформ анионных пероксидаз у рас, относящихся к разным гаплотипам, установлена связь гена AtPrx53 с изоформами белка. Проведено изучение транскрипции генов пероксидаз в различных органах на разных стадиях развития растений и установлено, что ген AtPrx53 активно экспрессируется во всех надземных органах растений. Впервые показано изменение экспрессии (уровня транскрипции и активности изоформ) гена AtPrx53 в ответ на действие стрессовых факторов, установлено участие гена AtPrx53 в контроле количественных признаков (число листьев розетки, время появления цветоноса, скорость его развития, конечная высота цветоноса, число розеточных побегов, время отмирания листьев, время зацветания). Выявленные особенности полиморфизма и данные, свидетельствующие о проявлении различий между гаплотипами гена AtPrx53 на транскрипционном и фенотипическом уровне, позволяют рассматривать диморфизм этого гена в качестве новой молекулярно-генетической модели для изучения роли балансирующего отбора в адаптивной эволюции генов растений.

Научно-практическая значимость работы. Изучение генов пероксидаз имеет практическое значение, поскольку пероксидазы (прежде всего, пероксидаза хрена) являются наиболее востребованными маркерами в иммуноферментном анализе. Несмотря на огромную потребность в данном ферменте, существует проблема поиска аналогичного фермента с более высокой стабильностью и повышенной каталитической способностью. Именно поэтому актуален поиск аналогов пероксидазы хрена и кодирующих генов пероксидаз из других растений, разрабатываются методы их экспрессии в различных векторных системах. Одним из таких генов является исследованный в данной работе ген A.thaliana AtPrx53/PXD. Результаты работы вносят вклад в изучение функции этого гена, который может быть рекомендован для клонирования в экспрессионных векторах, используемых в генной инженерии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Ген AtPrx53/PXD A.thaliana, являющийся гомологом гена хрена HRPA2, экспрессируется во всех органах побега и кодирует три изоформы анионной пероксидазы, участвующей в процессах развития и защиты растения от действия стрессовых факторов.

2. Ген AtPrx53/PXD A.thaliana характеризуется высоким уровнем внутривидового полиморфизма и представлен двумя основными гаплотипами (Dj и Col), которые различаются по характеру экспрессии и кодируют изоформы, отличающиеся по электрофоретической подвижности.

3. Диморфизм гена AtPrx53/PXD A.thaliana поддерживается балансирующим отбором, что позволяет рассматривать этот ген как модель для изучения роли балансирующего отбора в адаптивной эволюции растений. 7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Куприянова, Евгения Владимировна

1. Локализованные в 5-ой хромосоме A.thaliana гены пероксидаз (AtPrx52, AtPrx53, AtPrx54, AtPrx55, AtPrx56) различаются по уровню внутривидового полиморфизма нуклеотидной последовательности наименьший характерен для гена AtPrx56, наибольший - AtPrx53 .2. Ген AtPrx53 идентичен гену PXD и кодирует 3 изоформы анионной пероксидазы, которые проявляют разную тканеспецифическую активность.3. Для гена AtPrx53 характерен аллельный диморфизм, который проявляется на уровне белкового продукта и обуславливает различия в электрофоретической подвижности аллозимов.4. Различия между двумя гаплотипами AtPrx53 проявляются как на уровне транскрипции аллелей в разных органах и в ответ на действие стрессовых факторов, так и на уровне активности фермента.5. Выявлена корреляция между гаплотипом по гену AtPrx53 и рядом количественных показателей (продолжительность вегетационного периода, время зацветания, продолжительность жизненного цикла и др.).6. Данные, свидетельствующие о дивергенции функциональных свойств гаплотипов гена AtPrx53 позволяют рассматривать этот пероксидазный ген в качестве информативной модели для изучения роли балансирующего отбора в адаптивной эволюции растений на геномном уровне.СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куприянова Е.В., Ежова Т.А., Лебедева О.В., Шестаков СВ. (2006) Внутривидовой полиморфизм пероксидазных генов, локализованных в 5-ой хромосоме Arabidopsis thaliana II Известия АН, серия биол., т.ЗЗ, №4, с.353-

2. Kupriyanova E.V., Ezhova Т.А., and Shestakov S.V. (2007) Dimorphic DNA variation in the anionic peroxidase gene AtPrx53 of Arabidopsis thaliana II Genes Genet. Syst, v.82, p.377-385.3. Куприянова E.B., Новокрещенова М.Г. (2004) Молекулярно-генетическое картирование генов Arabidopsis thaliana, участвующих в защите от стрессовых факторов // Материалы Международной конференции «Молекулярная генетики, геномика и Биотехнология» Минск, Беларусь,

4. Куприянова Е.В. (2005) Эволюционная динамика нуклеотидной последовательности генов пероксидаз Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Материалы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», Москва, с.124-125.5. Куприянова Е.В. (2006) Роль генных конверсии в сохранении генетической информации и создании внутривидовой генетической изменчивости у Arabidopsis thaliana II Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире». Москва, с. 106.6. Куприянова Е.В. (2008) Сравнительный анализ экспрессии генов пероксидаз, локализованных в 5-ой хромосоме Arabidopsis thaliana. II Материалы докладов XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, с. 71-72.7. Kupriyanova E.V. (2008) Peroxidase gene AtPrx53 is a mitotic recombination hotspot in Arabidopsis thaliana II The XX International Congress of Genetics, Berlin, Germany, p.202.8. Kupriyanova E.V. (2008) The Arabidopsis thaliana AtPrx53 peroxidase gene naturally occurring dimorphism: association with developmental traits and allozyme mobility // FESPB conference, Tampere, Finland, p.24.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куприянова, Евгения Владимировна, Москва

1. Алтухов Ю.П. (1989) Балансирующий отбор как фактор поддержания аллозимного полиморфизма // Успехи современной биологии, т. 107, № 3, с.323-340.

2. Бургутин А.Б., Мусин СМ., Бутенко Р.Г. (1994) Сегрегация биохимических генетических детерминант у сомаклональных вариантов межвидового соматического гибрида картофеля // Физиология растений, т.41, №6,с.843-852.

3. Газарян И.Г. (1992) Пероксидазы растений // Биотехнология пероксидаз растений и грибов / Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, т.36, 328 с.

4. Горлов И.П. и Горлова О.Ю. (2007) Движущий отбор в ходе эволюции человека//Вестник ВОГиС, т.11, №2, с.363-371.

5. Грант В. (1991) Эволюционный процесс // М.: Мир, 277 с.

6. Ежова Т.А. (1999) Arabidopsis thaliana (L.) как модельный объект для изучения генетического контроля морфогенеза // Генетика, т.35, №11, с.1522-1537.

7. Квитко К.В. (1960) Асептическая культура Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. и перспективы ее использования в ботанических исследованиях // Вестник Ленинградского университета, серия биол., тЗ, с.47 -56.

8. Кимура М. (1985) Молекулярная эволюция:Теория нейтральности // Мир, с.398.

9. Лакин Г.Ф.(1990) Биометрия // Высшая школа, 352 с.

10. Лебедева О.В., Ежова Т.А., Шестаков СВ. (2004) Локализация и молекулярный анализ гена PXD, кодирующего анионную пероксидазу Arabidopsis thaliana II Доклады академии наук, т.394, №1, с.41-43.

11. Лебедева О.В., Ежова Т.А., Шестаков СВ. (2004) Локализация и молекулярный анализ гена PXD, кодирующего анионную пероксидазу Arabidopsis thaliana II ДАН, т.394, №1, с.41^-3.

12. Лебедева О.В. (2004) Изучение генетической и гормональной регуляции развития цветоноса Arabidopsis thaliana // Автореф. дисс. канд. биол. наук. М.: МАКС-Пресс.

13. Лебедева О.В., Ежова Т.А., Мусин СМ., Радюкина Н.Л., Шестаков СВ. (2003) Ген PXD контролирует образование трех изоформ анионных пероксидаз Arabidopsis thaliana II Изв. АН. Сер. Биол., №2, с. 159-168.

14. Пенин А.А (2003) Анализ генетического контроля и моделирование развития структуры соцветия у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. М.: МАКС-Пресс, с.24.

15. Хедрик Ф. (2003) Генетика популяций // Сер. Мир биологии, 592 с.

16. Шарова Е.И. (2004) Клеточная стенка растений // СПб. Изд-во СПбГУ 156 с.

17. Щербаков Д.Ю., Трибой Т.И. (2007) Влияние совместно эволюционирующих аминокислотных остатков на топологию филогенетических древ //Биохимия, т.72, с. 1683 - 1689.

18. Янушкевич СИ. (1985) Использование арабидопсис в практических занятиях по общей генетике // М: Изд. МГУ, 62 с.

19. Alba СМ. (1997) Isoperoxidases and laccase like ensymes related with indole-acetic acid oxidation activity and lignification on peach fruits // Plant perox. newslett, v.l 1. p.382-387.

20. Ambros V. and Horvitz H.R. (1984) Heterochronic mutants of the nematode Caenorhabditis elegans II Science, v.226, p.409-^416, цитировано no Nei, 2005.

21. Bakker E.G., Toomajian C, Kreitman M. and Bergelson J. (2006) A Genome-Wide Survey of R Gene Polymorphisms in Arabidopsis // Plant Cell, v. 18, p. 1803-1818).

22. Botella M.A., Quesada M.A., Kononowicz A.K., Bressan R.A., Pliego F., Hasagawa P.M., Valpuesta V. (1994) Characterization and in situ localization of a salt-induced tomato peroxidase mRNA. // Plant. Mol. Biol., v.25, p.105-114.

23. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding // Anal Biochem, v.72, p.248-252.

24. Bradley D., Ratcliffe O., Vincent C, Carpenter R., and Coen E. S. (1997) Inflorescence commitment and architecture in Arabidopsis // Science, v.275, p.80-83.

25. Breda C, Huystee R.B., Esnault R. (1993) Differential expression of two peanut peroxidase cDNA clones in peanut plants and cells in suspension culture in response to stress.// Plant Cell Rep., v. 12, p.268-272.

26. Cella R., Carbonera D. (1997) Peroxidases and morphogenesis. // Plant Perox. Newslett., v. 10, p.24-29.

27. Chance В., Maehly A.C. (1955) Assay of catalases and peroxidases // Methods in Enzymol., v.2, p.764-775.

28. Clauss M.J., Mitchell-Olds Т. (2004) Functional Divergence in Tandemly Duplicated Arabidopsis thaliana Trypsin Inhibitor Genes // Genetics., v. 166, p. 1419 - 1436.

29. Cork M. J. and. Purugganan M.D. (2005) High-Diversity Genes in the Arabidopsis Genome // Genetics, v. 170, p. 1897-1911.

30. Corre V., Roux R, Reboud X. (2002) DNA polymorphism at the FRIGIDA gene in Arabidopsis thaliana: extensive nonsynonymous variation is consistent with local selection for flowering time // Mol. Biol. Evol., V.19,p.l261-1271.

31. Davis B.I. (1964) Disc electrophoresis 2. Metod and application to human serum proteins // Ann. N.Y. Acad. Sci., v. 121, №2, p.404-427.

32. Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. (1983) A plant DNA minipreparation: version П // Plant Mol. Biol. Rep., v.l, p. 19-21.

33. Dobzhansky T. (1955) A review of some fundamental concepts and problems of population genetics // Cold Spring Harb Symp Quant Biol., v.20, p.1-15.

34. Dowd P.F., Hermis D.A., Berhow M.A., Lagrimini L.M. (2000) Mechanism of insect resistance in transgenic plants (over) expressing a tobacco anionic peroxidase // Plant perox. newslett, v. 14, p.93-101.

35. Du J., Wang X., Zhang M., Tian D., Yang Y.H. (2007) Unique nucleotide polymorphism of ankyrin gene cluster in Arabidopsis // J Genet., v.86(l),p.27-35.

36. Dunand C, Tognolli M., Overney S., von Tobel L., de Meyer M., Simon P. and Penel С (2002) Identification and characterisation of Ca2+-pectate binding peroxidases in Arabidopsis thaliana II J. Plant Physiol., v.l59,p.l 165-1171.

37. Dunand C.,Meyer M., Crevecoeur M., Penel C. (2003) Expression of a peroxidase gene in zucchini in relation with hypocotyl growth // Plant Physiology and Biochemistry, v. 41, p.805-811.

38. Dunford H.B. (1991) Horseradish peroxidase: structure and kinetic properties // In Peroxidase in Chemistry and Biology, p.1-23.

39. Duroux L and Welinder K.G. (2003) The peroxidase gene family in plants: a phylogenetic overview // J.Mol.Evol., v.57, p.397-407.

40. Filatov D.A. and Charlesworth D. (1999) DNA Polymorphism, Haplotype Structure and Balancing Selection in the Leavenworthia PgiC 1.ocus // Genetics, v. 153, p.1423-1434.

41. Filiault D.L., Wessinger C.A., Dinneny J.R., Lutes J., Borevitz J.O., Weigel D., Chory J. and. Maloof J.N (2008) Amino acid polymorphisms in Arabidopsis phytochrome В cause differential responses to light // PNAS, v. 105, p.3157-3162.

42. Flor H.H. (1956) The complementary genic system in flax and flax rust // Adv. Genet, v.8, p.29-54.

43. Fu H.H., Zheng Z.W. and Dooner H.K. (2002) Recombination rates between adjacent genic and retrotransposon regions in maize vary by two orders of magnitude //Proc. Natl. Acad. Sci., v.99, p.1082-1087.

44. Fu Y.-X., Li W.-H. (1993) Statistical tests of neutrality of mutations // Genetics, v. 133, p.693-709.

45. Gaspar T, Penel C, Thorpe T, Greppin H. (1982) Peroxidases: a survey of their biochemical and physiological roles in higher plants // Centre de Botanique, University of Geneva Press. Geneva, 324 p.

46. Gaspar Т., Penel C, Greppin H. (1986) Peroxidases: structures and catalytic reactions, biosynthesis, transport and location, physiological roles // Bull Groupe Polyphenols, v. 13, p. 159-176.

47. Gaut B.S, Wright S.I., Rizzon C, Dvorak J. and Anderson L.K. (2007) Recombination: an underappreciated factor in the evolution of plant genomes //Nature Reviews Genetics, v.8, p.77-84.

48. Gazaryan I.G., Lagrimini L.M., Ashby G.A., Thorneley R.N. (1996) Mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by plant peroxidases: anaerobic stopped-fiow spectrophotometric studies on horseradish and tobacco peroxidases // Biochem J., v.l, p.841-847.

49. Gazzani S., Gendall A. R., Lister C, Dean C. (2003) Analysis of the molecular basis of flowering time variation in Arabidopsis accessions // Plant Physiol., v. 132, p. 1107-1114.

50. Halliwell B. (1977) Generation of hydrogen peroxide, superoxide and hydroxyl radicals during the oxidation of dihydroxyfumaric acid by peroxidase //Biochem.J., v.163, p.441-448.

51. Hanzawa Y., Money T. and Bradley D. (2005) A single amino acid converts a repressor to an activator of flowering // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.102, p.7748-7753, цитировано no Nei, 2005.

52. Hedge P. J. and Spratt B.G. (1985) Resistance to beta-lactam antibiotics by re-modelling the active site of an E. coli penicillin-binding protein // Nature, v.318, p.478-480, цитировано no Nei, 2005.

53. Higgins D.G., Thompson J.D. and Gibson T.J. (1996) Using Clustal for multiple sequence alignments // Methods Enzymol., v.266, p.383-402.

54. Hiraga S., Yamamoto K., Ito H., Sasaki K., Matsui H., Honma M., Nagamura Y., Sasaki Т., Ohashi Y. (2000) Diverse expression profiles of 21 rice peroxidase genes // FEBS Lett., v. 14, p.245-250.

55. Hirschberg J. and Mcintosh L. (1983) Molecular basis of herbicide resistance in Amaranthus hybridus II Science, v.222, p.l346-1348, цитировано no Nei, 2005.

56. Ни C, van Huystee R.B. (1989) Role of carbohydrate moieties in peanut peroxidases // Biochem J., v.263, p.129-135.

57. Hudson R., Kreitman M. and Aguade M. (1987) A test of neutral molecular evolution based on nucleotide data // Genetics, v. 116, p. R.R. 153-159.

58. Hudson R.R and Kaplan NX. (1985) Statistical properties of the number of recombination events in the history of a sample of DNA sequences // Genetics v. I l l , p. 147-164.

59. Hudson R.R. and Kaplan N.L. (1988) The coalescent processing models with selection and recombination // Genetics, v. 120, p.831-840.

60. Innan H., Tajima E, Terauchi R., Miyashita N.T. (1996) Intragenic Recombination in the Adh Locus of the Wild Plant Arabidopsis thaliana II Genetics, v.143, p.1761-1770.

61. Innan H., Terauchi R. and Miyashita N. T. (1997) Microsatellite polymorphism in natural populations of the wild plant Arabidopsis thaliana II Genetics, v. 146, p. 1441-1452.

62. Kawabe A. ,Yamane K., Miyashita N.T. (2000) DNA polymorphism at the cytosolic phosphoglucose isomerase (PgiC) locus of the wild plant Arabidopsis thaliana II Genetics, v.156, p.1339-1347.

63. Kawabe A., Innan H., Terauchi R. and Miyashita N.T. (1997) Nucleotide Polymorphism in the Acidic Chitinase Locus (ChiA) Region of the Wild Plant Arabidopsis thaliana//Mol. Biol. Evol., v.14, p.1303-1315.

64. Kawabe A., Miyashita N.T. (1999) DNA Variation in the Basic Chitinase Locus (ChiB) Region of the Wild Plant Arabidopsis thaliana II Genetics, v. 153, p. 1445-1453.

65. Kelly J.K. (1997) A test of neutrality based on interlocus associations // Genetics , v. 146, p. 1197-1206.

66. King G., Nienhuis J., and Hussey C. (1993) Genetic similarity among ecotypes of Arabidopsis thaliana estimated by analysis of restriction fragment length polymorphisms // Theor. Appl. Genet, v.86, p. 1028-1032.

67. Klotz K.L., Lagrimini L.M. (1996) Phytohormone control of the tobacco anionic peroxidase promoter // Plant. Mol. Biol., v.31, p.565-573.

68. Kondrashov A.S., Sunyaev Sh. and Kondrashov F. (2002) Dobzhansky- Muller incompatibilities in protein evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.99, p.14878-14883.

69. Kondrashov F.A., Rogozin LB., Wolf Y. I., Koonin E.V. (2002) Selection in the evolution of gene duplications // Genome Biology, v.3, p. 1-9.

70. Koornneef M., Elgersma A., Hanhart C.J., van Loenen-Martinet E.P., van Rign L., Zeevart J.A. (1985) A gibberellin insensitive mutant of Arabidopsis thaliana II Physiol. Plant., v.65, p.33-39.

71. Koornneef M., Stam P. (1987) Procedure for mapping by using F2 and F3 population//Arabidopsis Inf. Serv., v.25, p.35-40.

72. Kuittinen H, Sillanpaa M.J, Savolainen O. (1997) Genetic basis of adaptation: flowering time in Arabidopsis thaliana II Theor Appl Genet., v.95, p.573-583.

73. Kuittinen, H., Aguade' M. (2000) Nucleotide variation at the Chalcone Isomerase locus in Arabidopsis thaliana II Genetics, v.155, p.863-872.

74. Lagrimini L.M. (1993) Analysis of peroxidase function in transgenic plants // In: KG Welinder, SK Rasmussen, С Penel & H Greppin, eds, Plant Peroxidases: Biochemistry and Physiology, Univ Geneva, p.301-306.

75. Lagrimini L.M. (1996) The role of tobacco anionic peroxidase in growth and development. // In Plant Peroxidases: Biochemistry and Physiology, University of Geneva, p.23 5-242.

76. Lagrimini L.M., Gingas V., Finger F., Rothstein S., Liu T. (1997) Characterization of antisense transformed plants deficient in the tobacco anionic peroxidase. // Plant Physiol., v.l 14 (4), p. 1187-1196.

77. Laurie C.C., Bridgham J.T., Choudhary M. (1991) Associations between DNA sequence variation and variation in expression of the Adh gene in natural populations of Drosophila melanogaster II Genetics, v.29, p.489-499.

78. Lee I., Michaels S. D., Masshardt A. S., Amasino R. M. (1994) The late-flowering phenotype of Frigida and mutations in Luminidependens is suppressed in the Landsberg erecta strain of Arabidopsis // Plant J., v.6, p.903-909.

79. Lempe J., Balasubramanian S., Sureshkumar S., Singh A., Schmid M. (2005) Diversity of flowering responses in wild Arabidopsis thaliana strains //PLoS Genet., v.l, p. 109-118.

80. Michaels S. D., He Y., Scortecci K. C., Amasino R. M. (2003) Attenuation of Flowering locus С activity as a mechanism for the evolution of summer-annual flowering behavior in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.l00, p. 10102-10107.

81. Miyashita N.T. (2003) Trimorphic DNA variation in the receptor-like protein kinase gene in the F18L15-130 region of the wild plant Arabidopsis thaliana II Genes Genet.Syst., v.78, p.221-227.

82. Miyashita N.T., Kawabe.A., Innan,H. (1999) DNA variation in the wild plant Arabidopsis thaliana revealed by amplified fragment length polymorphism analysis // Genetics, v.152, p.1723-1731.

83. Nei M (2005) Selectionism and Neutralism in Molecular Evolution // Mol. Biol. Evol., v.22(12), p.2318-2342.

84. Nei M. (1987) Molecular Evolutionary Genetics // Columbia University Press, New York, NY.

85. Nordborg M., Borevitz J.O., Bergelson J., Berry C.C., Chory J. (2002) The extent of linkage disequilibrium in Arabidopsis thaliana // Nat. Genet.,v.30, p.190-193.

86. Olsen K.M, Halldorsdottir S.S., Stinchcombe J.R., Weinig C , Schmitt J, Purugganan M.D. (2004) Linkage Disequilibrium Mapping of Arabidopsis CRY2 Flowering Time Alleles // Genetics, v. 167, p. 1361-1369.

87. Orr H., Coyne J. (1992) The genetics of adaptation: a reassessment // Am. Nat., v. 140, p.725-742.

88. Ostergaard L., Abelskov A.K., Mattsson O., Welinder K.G. (1996) Structure and organ specificity of an anionic peroxidase from Arabidopsis thaliana cell suspension culture // FEBS Lett., v.2, p.243-247.

89. Ostergaard L., Pedersen A.G., Jespersen H.M., Brunak S., Welinder K.G. (1998) Computational analyses and annotations of the Arabidopsis peroxidase gene family // FEBS Lett., v. 14, p.98-102.

90. Passardi F., Longet D., Penel C, Dunand С (2004) The class III peroxidase multigenic family in rice and its evolution in land plants // Phytochemistry, v.65, p. 1879-1893.

91. Penel C, Carpin S., Crevecoeur M., Simon P., Greppin H. (2000) 0-4-Binding of peroxidase to Ca -pectate: Possible significance for peroxidase function in cell wall // Plant Perox. Newslett., v. 14, p.33-40.

92. Penel C, Gaspar T. (1992) Plant Peroxidases // University of Geneva, Switzerland.

93. Penel C, Greppin H. (1994) Binding of plant isoperoxidases to pectin in the presence of calcium // FEBS Lett., v.343, p.51-55.

94. Perutz M. F. (1983) Species adaptation in a protein molecule // Mol.Biol. Evol., v.l, p.1-28, цитировано no Nei, 2005.

95. Piccinini M., Kleinschmidt Т., Jurgens K.D. and Braunitzer G. (1990) Primary structure and oxygen-binding properties of thehemoglobin from guanaco (Lama guanacoe, Tylopoda) // Biol.Chem. Hoppe-Seyler, v.371, p.641-648, цитировано no Nei, 2005.

96. Purugganan M.D., Suddith J.I. (1998) Molecular population genetics of the Arabidopsis CAULIFLOWER regulatory gene: Nonneutral evolution and naturally occurring variation in floral homeotic function // Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A, v.95, p.8130-8134.

97. Quiroga M., Guerrero C, Botella M.A., Barcelo A., Amaya I., Medina M.I., Alonso F J., de Forchetti S.M., Tigier H., Valpuesta V. (2000) A tomato peroxidase involved in the synthesis of lignin and suberin // Plant Physiol., v. 122(4), p. 1119-1127.

98. Ratcliffe O.J., Amaya I., Vincent C.A., Rothstein S., Carpenter R., Coen E.S. and Bradley D.J. (1998) A common mechanism controls the life cycle and architecture of plants // Development, v. 125, p. 1609-1615.

99. Rose L.E., Bittner-Eddy P.D., Langley C.H., Holub E.B., Michelmore R.W. and Beynon J.L. (2004) The Maintenance of Extreme Amino Acid Diversity at the Disease Resistance Gene, RPP13 in Arabidopsis thaliana // Genetics, v. 166, p. 1517-1527.

100. Rozas J., Sanchez-DelBarrio J.C. and Messeguer X. (2003) DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods // Bioinformatics, v. 19, p.2496-2497.

101. Savitsky P.A., Gazaryan I.G., Tishkov V.I., Lagrimini L.M., Ruzgas Т., Gorton L. (1999) Oxidation of indole-3-acetic acid by dioxygen catalysed by plant peroxidases: specificity for the enzyme structure // Biochem J., v. 15(340), p.579-583.

102. Sharbel T.F., Haubold B. and Mitchell-olds T. (2000) Genetic isolation by distance in Arabidopsis thaliana: biogeography postglacial colonization of Europe // Mol. Ecol., v.9, p.2109-2118.

103. Sheldon C.C., Burn J.E., Perez P.P., Metzger J., Edwards J.A., Peacock WJ. and Dennis E.S. (1999) The FLF MADS box gene. A repressor of flowering in Arabidopsis regulated by vernalization and methylation // Plant Cell, v.ll,p.445-458.

104. Shepard K.A. and Purugganan M.D. (2003) Molecular Population Genetics of the Arabidopsis CLAVATA2 Region: The Genomic Scale of Variation and Selection in a Selfing Species // Genetics, v.163, p.1083-1095.

105. Tajima F. (1989) The effect of change in population size on DNA polymorphism // Genetics, v. 123, p.597-601.

106. Tajima F., Nei M. (1984) Estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences // Mol. Biol. Evol., v.l, p.269-285.

107. Tian D., Araki H., Stahl E., Bergelson J. and Kreitman M. (2002) Signature of balancing selection in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.99, p.l 1525-11530.

108. Tognolli M., Penel С, Greppin H., Simon P. (2002) Analysis and expression of the class III peroxidase large gene family in Arabidopsis thaliana II Gene, v.288, p. 129-138.

109. Valerio L., Mireille De Meyer, Penel C, Dunand C. (2004) Expression analysis of the Arabidopsis peroxidase multigenic family // Phytochemistry, v.65, p. 1331-1342.

110. Welinder K.G. (1992) Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases // Curr. Opin. Struct. Biol., v.2, p.388-393.

111. Welinder K.G., Justesen A.F., Kjaersgard I.V., Jensen R.B., Rasmussen S.K., Jespersen H.M., Duroux L. (2002) Structural diversity and transcription of class III peroxidases from Arabidopsis thaliana II Eur J Biochem., v.269(24),p.6063-6081.

112. Whetten R.W., MacKay J.J., Sederoff R.R. (1998) Recent advances in understanding lignin biosynthesis // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., v.49, p.585-609.

113. Yamamoto F. and Hakamori S. (1990) Sugar-nucleotide donor specificity of histo-blood group A and В transferases is based on amino acid substitutions // J. Biol. Chem., v.265, p. 19257-19262, цитировано no Nei, 2005.

114. Yokoyama R. and Yokoyama S. (1990) Convergent evolution of the red- and green-like visual pigment genes in fish, Astyanax fasciatus and human // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.87, p.9315-9318, цитировано no Nei, 2005.

115. Yokoyama S. and. Radlwimmer F.B. (2001) The molecular genetics and evolution of red and green color vision in vertebrates // Genetics, v. 158, p.1697-1710, цитировано noNei, 2005.

116. Yoshida K., Kamiya Т., Kawabe A., Miyashita N.T. (2003) DNA polymorphism at the ACAULIS5 locus of the wild plant Arabidopsis thaliana II Genet.Syst, v.78, p.l 1-21.

117. Zhang L. and Gaut B.S. (2003) Does Recombination Shape the Distribution and Evolution of Tandemly Arrayed Genes (TAGs) in the Arabidopsis thaliana Genome? // Genome Res., v. 13, p.2533-2540.