Структурно-функциональный анализ полисахарид-связывающего домена пероксидазы пшеницы

Кузьмина, Ольга Ильинична

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональный анализ полисахарид-связывающего домена пероксидазы пшеницы
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ полисахарид-связывающего домена пероксидазы пшеницы"

На правах рукописи

КУЗЬМИНА ОЛЬГА ИЛЬИНИЧНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИСАХАРИД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА ПЕРОКСИДАЗЫ ПШЕНИЦЫ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА 2010

4855767

Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный

сотрудник

Максимов Игорь Владимирович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бабаков Алексей Владимирович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Маркушева Татьяна Вячеславовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт молекулярной биологии РАН им. В.А.Энгельгардта

Защита состоится «35 » декабря 2010 г. в « jk » ч на заседании диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: http://ibg.anrb.ru /dissov.html:

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «¿¿2_» НО<£д1ъЛ20\0 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследований. Неблагоприятные факторы внешней среды абиотической и биотической природы отрицательно влияют на рост и развитие растений, что проявляется в изменении экспрессионной активности ряда генов, кодирующих белки, ответственные за восстановление гомеостатического физиологического состояния организма. Среди них пероксидаза (ПО) как защитный белок, привлекает значительный интерес [Carpin, 2001; Behle, 2002; Delaxmoy, 2003; Dunand, 2003; Claude, 2004; Passardi, 2004; Газарян и др., 2006; Bacalovic, 2006; Максимов, Черепанова, 2007; Almagro, 2009; Cosío, Dunand, 2009]. Этот интерес обусловлен как разнообразием практического использования фермента, так и множеством выполняемых им в растениях функций, в числе которых важное место занимают участие в лигнификации и суберинизации клеточных стенок, перекрестное сшивание структурных белков клеточных стенок, катаболизм ауксина, защита при окислительном стрессе, регуляция клеточного растяжения, генерация активных форм кислорода (АФК), формирование устойчивости к разным стрессовым факторам, в том числе биотическим [Liu, 2005; Cosío, 2009]. Экспрессирующиеся при патогенезе изопероксидазы (изоПО) отнесены к 9-му классу PR-белков (pathogen related) [Van Loon et al., 2006; Ferreira et al., 2007].

Разнообразие функций ПО предполагает и различия в структурной организации ее молекулы в зависимости от изоформы. Так, при определении физиологической роли патоген-индуцируемых изоПО обнаружилось свойство некоторых из них ионообменно связываться с клеточной стенкой патогенных грибов [Черепанова, 2005]. Однако структурные особенности таких изоПО пока остаются слабо изученными. До сих пор нет детального анализа связи синтезируемых в растениях изоПО с кодирующими их генами. Остаются открытыми вопросы, связанные с доказательством способности молекулы ПО связываться с полисахаридами клеточных стенок патогеннов (хитином).

Цель исследований - провести структурно-функциональный анализ фрагмента гена пероксидазы, кодирующего связывающийся с полисахаридами (хитином) домен у разных видов пшениц.

Задачи исследований: 1. Выделение, секвенирование и межвидовое сравнение фрагмента гена

пероксидазы, кодирующего связывающийся с полисахаридами домен у разных видов пшеницы;

2. Анализ нуклеотидной последовательности искомого фрагмента гена пероксидазы и определение генетического сходства связывающихся с полисахаридами пероксидаз разных видов растений;

3. Создание генно-инженерной конструкции на основе векторов с фрагментом гена пероксидазы, экспрессирующихся в бактериальных системах в смысловой ориентации и в растениях - в антясмысловой ориентации;

4. Получение химерного белка GUS, содержащего полисахарид-связывающий домен пероксидазы пшеницы в штаммах Escherichia coli;

5. Трансформация растений и клеточных культур пшеницы генно-инженерной конструкцией с фрагментом гена пероксидазы, кодирующего связывающийся с полисахаридами домен в антисмысловой ориентации.

Научная новизна. Впервые выделен фрагмент гена, кодирующий связывающийся с полисахаридами домен пероксидаз у различных видов пшеницы. Проведен сравнительный анализ нуклеотидной последовательности и предсказанной аминокислотной последовательности данного фрагмента гена ПО мягкой пшеницы (Triticum aestivum ТС151917) с таковыми других видов пшеницы и Aegilops taushii. Определено генетическое сродство связывающихся с полисахаридами ПО разных видов растений. Получены генно-инженерные конструкции со смысловой и антисмысловой ориентациями этого фрагмента гена пероксидазы мягкой пшеницы, способные экспрессироваться, соответственно, в штаммах бактерий Е. coli и растениях пшеницы. Доказана способность синтезированного в Е. coli химерного белка GUS, содержащего взаимодействующий с полисахаридами домен ПО, связываться с хитином. На основе конструкции, содержащей антисмысловую последовательность этого домена пероксидазы, впервые получены растения пшеницы со сниженной активностью целевого изофермента. Обнаружено, что падение активности анионной пероксидазы приводит к подавлению устойчивости растений пшеницы к возбудителю септориоза.

использовать связывающийся с полисахаридами домен для создания химерных белков с целевыми фрагментами. Эти же конструкции можно использовать для анализа локализации целевых полисахаридов в растениях. Генно-инженерные конструкции с антисмысловой ориентацией искомого домена можно использовать для изучения физиологической роли ПО в защите растений от патогенов.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на XV Межд. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008), 12-й Пущинской межд. школе-конф. молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2008), II Всерос. кошрессе студентов и аспирантов-биологов (Пермь, 2009), Межд. 13-м симп. «SymBioSe» (Казань, 2009), Всероссийской конф. «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем» (Уфа, 2009), Десятой Межд. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010), XVII Congress of the Federation of European of Plant Biology (FESPB) (Valencia, 2010), Межд. симп. «Oxidative enzymes as sustainable industrial biocatalysts» (Santiago de Compostela, 2010).

Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантом РФФИ-ККРНТ 08-04-90259узб_а (2008), проектом № 10234 «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» (2009), госконтрактами Министерства образования и науки РФ № 02.512.11.2051 (2007), №2.1.1-/5676 (2009) и № П339 (2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 1 статья в журнале из Перечня ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, содержащего 254 источника. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 35 рисунками.

Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН к.б.н. О.Б. Сурину, к.б.н. Е.А.Черепанову, к.б.н. А.Ш. Валеева, а также лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН K.6.H. А.В. Князева, к.б.н. Б.Р. Кулуева, к.б.н. Б.Н. Постригань за помощь при выполнении и обсуждении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования были семена, проростки и каллусные культуры различных видов пшеницы и эгилопса из коллекции ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова РАСХН (Triticum aestivum, Т. boeoticum, Т. compactum, Т. durum, Т. fungicidum, Т. macha, Т. топососсит, Т. petropavlovskyi, Т. spelta, Т. timopheevii, Т. turgidum, Т. urartu, Aegilops taushii), а также бактериальные культуры Е. coli (штамм XL1 - Blue) и Agrobacteríum tumefaciens (штамм AGLO), предоставленные сотрудниками лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН. Развитие гриба Septoria nodorum на листьях пшеницы оценивали согласно рекомендациям Г.В. Пыжиковой и Е.В. Карасевой [1985].

ДНК растений выделяли набором Trizol Reagent (Invitrogen Corporation, США), плазмидную ДНК - по методу Бирнбойма [1983]. При анализе рекомбинантных клонов для определения размера вставки применяли метод щелочного лизиса бактериальных колоний [Sambrook et al., 1989]. Расщепление ДНК проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками. Количество и качество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1%-м агарозном геле. Концентрацию ДНК измеряли при А2бо/А28о на спектрофотометре Smart Spec™ Plus (BioRad, США). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе ТП4-11ЦР-01-"Терцик" (ДНК-Технология, Россия) с использованием Taq и Pfu-полимераз. После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза с использованием прибора miniProtean 3 Cell (BioRad, США), согласно описанию Т. Маниатис и др. [1984], в 2% агарозном геле или 7% полиакриламидном геле. Для определения размеров синтезированных ампликонов использовали маркерные ДНК GencRuler™ 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Латвия). Секвенирование ДНК производили на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM 310 Genetic Analyzer» (Applied Biosystems Inc., США).

Для клонирования продуктов амплификации фрагментов генов ПО использовали фагмидные векторы pGEM-T и pALTA. Экспрессионные конструкции на основе промотора вируса мозаики цветной капусты и целевой ДНК в сенс- и антисенс-ориентации встраивались в бинарные векторы pCAMBIA 1305.1 и pCAMBIA 2301 и трансформировались в компетентные клетки £ coli и А. tumefaciens, соответственно, по методу Коэн [Cohen et al., 1972]. Белки из бактерий выделяли

ультразвуковым методом и их содержание определяли по методу Бредфорд [1976]. Изоэлекгрофокусирование (ИЭФ) проводили на приборе фирмы «Хийу-Каллур» (Эстония). Активность уЗ-глюкуронидазы (GUS) определяли с помощью специфического гистохимического окрашивания под действием субстрата X-Gluc.

Биобаллистическая трансформация проводилась с использованием "генной пушки" PDS-1000/He™ (Biolistic Particle Delivery system, США). В качестве микроносителя использовали золотые микрочастицы, средний размер которых составляет 0.6-1.6 мкм. Преципитация проводилась по методике кальций-спермидинового способа [Finer et al, 1992]. Для повышения выживаемости трансформируемой ткани экспланты культивировали на среде MS с гидролизатом казеина, маннитолом и сорбитолом [Фадеев, 2006].

Агробактериальную трансформацию проростков пшеницы проводили по методике, предложенной Даниловой [2009]. Проросшие семена пшеницы (24 ч.) выдерживали в условиях вакуума в течение 2 часов в агробактериалыюй суспензии, содержащей экстракт табака в соотношении 1:3 к суспензии бактерий, и ацегосирингон - в концентрации 10 мг/мл. Потом, на протяжении 3-х сут, проростки, обработанные A. tumefaciens, культивировали на среде MC с половинной концентрацией минеральных солей, без гормонов с добавлением 500 мг/л клафорана [Roussel Uclaf, Франция] для ингибирования последующего роста агробактерий и 100 мг/л канамицина («Ферейн», Россия) как селективного агента [Майсурян, 2006; Bajaj, 2006] при комнатной температуре 20-22° С на светоплощадке с 16-ти часовым светопериодом, освещенностью 12-16 тыс. лк (лампы ЛД-40, ЛБ-40).

Определение экспрессии гена GUS в растительных тканях проводили методом гистохимического окрашивания растительных эксплантатов по Jefferson [1987]. Активность ПО определяли по методу Ермакова [1985]. Компьютерный анализ нуклеотидных (н.п.) и предсказанных аминокислотных последовательностей (а.п.) проводили с помощью пакета компьютерных программ Vector NTI 10.3.0 (Invitrogen Corporation, США), а также DNASIS (Hitachi Software Engineering Со, Япония) и Lasergene (DNASTAR, Inc., США).

В работе анализировали биоматериал каждого из трех повторов одного варианта опыта. Статистическая обработка проводилась компьютерными программами фирмы Stat Soft (Statist! са 6.0).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

I. Сравнительный анализ связывающих полисахариды аминокислотных последовательностей пероксидаз разных видов растений

Ранее была показана способность анионных ПО ряда растений к взаимодействию с хитином клеточных стенок грибных патогенов [Максимов и др., 1995; 2003; 2005]. Такие изоПО, обозначенные как хитин-специфичные, активируются в растениях при инфицировании возбудителями ряда болезней, а также при воздействии элиситоров и сигнальных молекул [Бурханова и др., 2007]. Анализ изоферментного состава связавшихся с хитином ПО выявил, что у всех испытанных видов растений на хитин сорбировались анионные изоПО, в ряде случаев имеющие схожие антигенные детерминанты среди как однодольных, так и двудольных видов [Максимов и др., 2010]. Это позволяет предположить наличие в растениях отдельного, пока не охарактеризованного подкласса изоПО, связывающихся с полисахаридами [Сагрт, 1999; Ципапс!, 2002].

Критерием для поиска связывающегося с полисахаридами домена служило наличие аргинина (Л) или лизина (К) в этом фрагменте ал. в определенной комбинации, которые и определяли сродство проанализированных ПО, например, арабидопсиса и цуккини, к пектинам [Сагрт й а1., 2001]. Поиск среди генов изоПО различных видов растений, в том числе арабидопсиса и пшеницы, позволил выделить фрагмент гена ПО пшеницы, предположительно способный взаимодействовать с полисахаридами. В качестве исходного для сравнения а.п. был отобран участок гена пшеницы ТС151917, кодирующий полисахарид-специфичный фрагмент ПО в зоне от 243-го до 269-й остаток аминокислоты, взятый из базы данных «РегохШаяе» [http://peroxibase.toulouse.inra.fr]. Он был близок по структуре к участкам ПО арабидопсиса ATg08770 (от 217-го до 247-й аминокислотный остаток) и №У1_101321 (от 241-го по 261-й аминокислотный остаток) (табл.1) [Оипапс! й а1., 2002]. Проведенное сравнение а.п. ПО разных видов растений выявило разную степень сходства этого мотива (табл. 1). Например, у белка ЫМ_101321 полисахарид-специфичный домен гомологичен а.п. ПО капусты 75974310, хрена 090115, цуккини 0(5518906, кукурузы 2М004710 и риса 08378734.

Таблица 1.

Сравнение связывающегося с полисахаридами домена у пероксидаз

Вид растения Локус Анализированный фрагмент

Triticum aestivum TC151917 243 fdKqyyhnllnKKglltsdq 269

X56011 238 fdnayytnlmsqKgllhsdq 257

Avena sativa AF078872 249 fdnsyynnllsqKgllhsdq 259

Oryza sativum X66125 243 fdnayysnllsnKgllhsdq 262

D84400 249 fdnryyqnllnqKgllssdq 268

OS378734 255 fdlgyfKnvaKRRglfhsdg 280

Zea mays AF037033 175 fdndyyKnllteRgllssdq 194

AY500792 265 fdnKyyvgltnnlglfKsdv 285

ZM004710 256 fdnKyyfdliaKqglfKsdq 279

Allium cepa TC6261 240 fdnKyyvd11nRqt1ftsdq 259

Armoracia rusticana D90115 253 fdnKyyvnlKenKgliqsdq 273

Raphanus salivus X91172 258 fdnsyfKnlmaqRgllhsdq 277

Brassica oleraceae 75974310 260 fdnKyyvnlKehKgliqtdq 280

Arabidopsis thaliana ATg08770 217 fdnKyyvnlKenKgliqsd 247

NM 101321 241 fdnnyyRnlmqKKgllesdq 261

Solanum tuberosum M21334 271 fdKvyydnlnnnqgimfsdq 290

Nicotiana tabacum L02124 221 fdndyftnlqsnqgllqtdq 240

Petunia hybrida CV299755 22 fdnmyfKnlqRgRglftsdq 41

Cucumis sativus DQ124871 183 fdnnyfKnlvqRKglletdq 203

Cucurbita pepo DQ518906 239 fdKnyytnlqanRglltsdq 259

Arachis hypogaea 71040666 252 ldnnyyRnildnKglllvdh 272

Pisum sativum AF396465 16 fdvgyfKqwKRRglfesda 36

Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки лизина (К) и аргинина (К), предположительно ответственные за связывание ПО с полисахаридами.

Из 135 аминокислотных последовательностей пероксидаз пшеницы из международной базы данных «РегохИЗа.че» только у одной анионной ПО ТС151917 обнаружен подобный мотив [Ьйр://рсгох1ЬазсЛои1ои5с. inra.fr]. Среди других известных а.п. ПО пшеницы, включая патоген-индуцируемые, и риса, данного мотива нами не обнаружено. На основе имеющихся а.п. построено древо их сходства (рис. 1). Гомология полисахарид-связывающего фрагмента анионной ПО пшеницы с таковым у овса АР078872 и риса 1)84400, Х66125 оказалась, соответственно, равна 70 и 68.4 -75%. Обнаружено, что у гена анионной ПО цуккини АРКХ (БС>518906) она составляла 65%, у гена огурца СзаРгх05 (Б<3124871) - 55%. В то же время среди генов, кодирующих ПО, предположительно связывающиеся с полисахаридами, нами были обнаружены изогены, слабо гомологичные к гену анионной ПО пшеницы.

„АиюяйиАГШЯ

Отешйшп.Х66125

фаеНз Нуродгеа 71040666 ЩярзаШт 084400

—---Ыатт (и&егаяйй М21334

СисчгЫШ рера (АРЮО 1*3518906

Й®т $ай\щ 41396465

Лтота октш 75974310 .АттШтйкШ 099115 ЯарктшюйтХШи -—7М0М719 ХкоИапа ЬЬаат Ш124 Систш зяНтЮ 124871 '2и тот А? 037033 РеШа Мгша СТ299755 ЛйиивЗйЯСШ

180 }К> 140 120 100 80 60 Нуишщдные замены (х1 СЮ)

40 20

Рис. 1. Древо сходства видов растений, построенное на

основе сравнения аминокислотных последовательностей фрагментов пероксидаз, ответственных за связывание с

полисахаридами.

Так, фрагмент гена табака Ю2124, предположительно кодирующий анионную полисахарид-специфичную ПО, был гомологичен с фрагментом гена анионной ПО пшеницы ТС151917 только на 43%.

Таким образом, наиболее близкими по расположению на древе сходства аминокислотных последовательностей оказались виды злаковых и бобовых, точно так же как и в случае сравнения их иммуноспецифичности [Максимов и др., 2010].

П. Амплификация фрагмента гена, кодирующего полисахарид-связывающий домен анионной пероксидазы различных видов пшеницы и поиск гомологичных последовательностей

ПЦР-анализ фрагмента гена пероксидазы, ответственного за связывание с полисахаридами

Для выяснения вариабельности участка гена ПО, содержащего полисахарид-специфичный домен, был проведен анализ размера этого фрагмента у разных видов растений. Представленные на рис. 2 электрофореграммы амплифицированных фрагментов после ПЦР с использованием праймеров ЗГотаЫ и ЗЯеуепе показывают, что размер ампликона у всех видов полиплоидного ряда пшеницы и эгилопса был близок (200-220 п.н.) и соответствовал теоретически рассчитанному.

IÍ.H. 200 п.н. 100 п.н.

1 23 4M 567 89 10 11 12

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации гена пероксидазы растений с использованием пары праймеров 3Forward и 3Reverse: 1- Т. spelta, 2- Т. polonicum, 3- Т. boeoticum, 4- Т. petropavlovskyi, 5- Ае. taushii, б- Ае. bicornis, 7- Ае. sharonensis, 8- Ае. speltoides, 9- Т. aestivum, 10- Т. durum, II- A. thaliana, 12-Nicotiana tabacum, М-маркер.

Интересно, что у A. thaliana, в тех же условиях ПЦР, получен ампликон размером всего около 150 п.н.. Анализ генов, кодирующих ПО, по известным из международного генбанка NCBI нуклеотидным последовательностям арабидопсиса показал, что из более чем 70-ти генов, кодирующих этот фермент, только у одного (NM-10132I) имелся подобный фрагмент размером 175 пар нуклеотидов. При использовании ДНК табака, который был слабо гомологичен к фрагменту гена ПО пшеницы, а также ряда злаковых (кукуруза, рис, ячмень, рожь), кроме эгилопсов, и ДНК двудольных видов, формирования искомого ампликона не происходило, что может быть связано с неспецифичносгью подобранных нами праймеров к данному фрагменту ДНК этих видов растений или, возможно, условиями проведения ПЦР.

Анализ нуклеотидиых и предсказанных аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов пероксидаз, кодирующих полисахарид-специфичный домен у разных видов пшеницы

Известно, что гомология между генами, кодирующими ПО, в ряду растений может составлять от 10 до 99% и, в основном, связана с сайтами субстратной специфичности и ферментативной активности [Passardi, 2004; Cosío, Dunand, 2009]. Эта гомология может быть высокой у изоПО из эволюционно отдаленных видов растений, отсутствовать у родственных видов и/или обладать вариабельностью внутри одного вида [Куприянова и др., 2006].

Анализ предсказанных а.п. секвенированных фрагментов ПО разных видов пшеницы и эгилопса с последовательностью из генетического банка данных NCBI не

выявил заметных отличий, что говорит об их консервативности для рода ТгШеит. Процент сходства а.п. исследованных фрагментов ПО с таковой у мягкой пшеницы составлял от 98% до 100%. Сравнительный анализ фрагмента гена ПО мягкой пшеницы с последовательностью риса ОэРгхПб, также отобранной из базы данных МСШ, показал сходство, которое составляет 64%. Наибольшее количество замен нуклеотидов в ДНК было у Т. Иторкее\-и, а наименьшее - у Т. сотрасЫт. Древо, построенное на основе сравнения секвенированных фрагментов гена ПО (рис. 3) показало, что уровень гомологии хитин-специфичных доменов совпадает с уровнем сходства геномов из литературных данных [АПаЬу, 2001; Гончаров, 2008].

Т.ЬоеоПсшп Т.топососсшп Т.ЬяюрЬегаш Т.

Т. (Зпгат Т.йиЕхАви Т.шгШ Т. аяйгал Т. сояюасйиа ТяйсЬЗ

Рис. 3. Древо, построенное на основании анализа секвенированных нуклеотидных последовательностей, содержащих ^рйиДсузЬу! полисахарид-специфичный

сайт.

м.

Ае.&вЬи

Т"---П-Г-Я-:-

Ж.;.,;...,

ЫисЬоМе 8иЬг!;М:СП5 0.100)

Полученные в этом разделе данные позволяют оценить степень эволюционных связей между видами пшеницы и эгалопса. Важно при этом отметить, что среди генов пшеницы нами, так же как и среди генов арабидопсиса, были обнаружены и гомологичные гены пероксидаз, что предполагает необходимость более конкретного анализа генетической структуры ПО внутри одного генома, а также анализа филогенетической эволюции исследованных генов наземных растений.

Создание генно-инженерных конструкций фрагмента гена псроксидазы пшеницы в смысловой и антисмысловой ориентациях

Для доказательства способности полисахарид-специфичного домена ПО пшеницы связываться с хитином нами была получена генно-инженерная конструкция на основе вектора рСатЫа 1305.1, содержащая фрагмент гена ПО пшеницы, кодирующий искомый домен в смысловой ориентации (рис. 4).

ЛЪ!М

CaMV35S промотор Старт трансляции

CaMV35S промотор с энхансером

Гигромицин (R)__—-ж

' ______- AnPerox sense

gUI^"................'%гм>

—eus

pCambial305.1

11824 bp

.Конец трансляции . PolyA сигнал

Канамицин (R)

Рис. 4. Схема генно-инженерной конструкции на основе вектора pCambia 1305.1 со встроенным фрагментом гена анионной пероксидазы в "смысловой" ориентации (AnPerox sense); обозначены сайты рестрикции по которым происходило лигирование фрагмента (Ncol, Spei); CaMV35S промотор - промотор вируса мозаики цветной капусты; GUS - ген /?-глюкуронидазы, R - гены устойчивости к гигромицину и канамицину.

При помощи ПЦР с использованием праймеров (SFanperox и 3Ranperox), комплементарных 5'- и З'-концам фрагмента гена анионной ПО пшеницы и содержащих сайты рестрикции Ncol и Spei, нами был получен ПЦР-продукт длиной 201 п.н. Целевой фрагмент ДНК был встроен внутрь рамки считывания гена ß-глюкуронидазы (GUS) в исходном векторе вместо каталазного интрона, по границам которого находятся сайты рестрикции Ncol и Spei (рис. 5).

3?änperos

■.......... '.....seiKü

уУ - УАоУ: УУ/УУУ: - У/У УУУу ■ У У: У УУ . ' ;.; уУ ; УУГАУ ; уУ "Lyy -А: Уу У^ УУ Ау ууу У A.A.

' тйЙйаЩШвкжк;SlsIliSSj^S^

Уу уЙ'уОУ^УАУСууУАСууУ^^^^СГС^'^^ЛуАУУ^у^С^УУ:^ "у С] у. 1 I ^ t м I - '

«gasp■»гааэтмттгозсзАо:»;^^

_ШШ

ЭКапрешх

Рис. 5. Схема участка генно-инженерной конструкции, содержащей фрагмент гена анионной пероксидазы (AnPerox sense, обозначен подчеркиванием); стрелками показано положение праймеров (3Fanperox и 3Ranperox), использованных для клонирования фрагмента гена; рамками обозначены нуклеотидные последовательности этих праймеров; сайты рестрикции, по которым происходило лигирование фрагмента (Ncol, Spei), показаны серьм цветом.

В исходном векторе ген GUS не может экспрессироваться в прокариотической системе из-за наличия интрона и нарушения структуры гена В полученной нами генно-инженерной конструкции фрагмент гена ПО заменял каталазный интрон, причем праймеры были подобраны так, что рамка считывания гена /?-глюкуронидазы и фрагмента гена ПО совпали. В этом случае при трансляции с ATG-кодона мРНК, полученной транскрипцией с CaMV35S промотора в клетках, должен синтезироваться химерный белок, содержащий полисахарид-специфичный домен ПО и обладающий активностью /?-глюкуронидазы. Поскольку промотор вируса мозаики цветной капусты способен работать как в бактериях, так и в растениях, мы внедрили полученную генно-инженерную конструкцию в клетки Е. coli XL1 - Blue и культивировали их в жидкой среде LB, содержащей 50 мг/мл канамицина. Выросшие на селективной среде бактериальные колонии проверяли на наличие целевой вставки путем ПЦР анализа и искомые штаммы отбирали для выделения плазмидной ДНК, секвенирования с праймером к CaMV35S промотору, ПЦР и анализа способности химерного GUS-белка связываться с хитином. Концентрацию тотального белка, выделенного из «дикого» и трансформированного штаммов Е. coli, выравнивали и подвергали взаимодействию с хитином в том же буфере. Не сорбировавшиеся на хитине белки были отмыты путем многократного его промывания в буфере. Сорбировавшиеся белки элюировали с сорбента раствором IM NaCl. Все фракции белка, в том числе и элюат, анализировали на наличие активности /3-глюкуронидазы (табл. 2).

Таблица 2.

Выход и удельная активность химерного GUS белка на различных этапах очистки

Стадия очистки Варианты Содержание белка, мкг/мл Удельная GUS активность, ед./мг белка

1. Белковый экстракт «дикий» 800 25.20

трансформант 800 60.30

2. Фракция, не взаимодействующая с хитином «дикий» 600 25.00

трансформант 500 10.70

3. Элюция с хитина 1 М раствором ИаС! «дикий» 200 1.40

трансформант 300 50.20

Рис. 6. Сравнительный анализ способности химерного белка, содержащего хитин ~ ~ связывающий фрагмент гена анионной

пероксидазы пшеницы взаимодействовать с хитином. Хитин после нанесения тотального белка из трансформированных вектором pCambia 1305.1, содержащем ген химерного белка, клеток Е. coli (Б) и из клеток «дикого» типа (А). Сорбент после промывки лизис-буфером был окрашен д Б субстратом для /?-ппокуронидазы (X-Gluc).

Часть хитина до элюирования отбирали для доказательства способности химерного GUS белка связываться с хитином. Как видно из рис. 6, хитин, подвергшийся взаимодействию с белками из трансформированных бактериальных клеток, активно окрашивается в темно-синий цвет. Таким образом, химерный белок ß глюкуронидазы, содержащий полисахарид-связывающий домен ПО экспрессируется в клетках E.coli и обладает способностью взаимодействовать с хитином.

В случае штамма кишечной палочки «дикого» типа, белки, обладающие GUS активностью, с хитином не связывались. А в случае использования лизата из бактерий, трансформированных генно-инженерной конструкцией, содержащей химерный белок, после нанесения на хитин и последующей промывки лизис-буфером, значительная часть белков, обладающих GUS активностью, связалась с хитином и их удельная активность составила 50.20 ед/мг.

Проведенные эксперименты по определению молекулярной массы (м.м.) и изоэлектрической точки (р/) химерного белка с помощью ИЭФ и SDS-фореза показали, чго трансформированные клетки Е. coli синтезируют целевой химерный белок, сочетающий в себе свойства взаимодействия с хитином и GUS активностью. Поскольку при создании этой конструкции мы объединили ген, ответственный за синтез GUS-бежа, и фрагмент гена ПО пшеницы путем вставки целевого ампликона вместо каталазного интрона в начале открытой рамки считывания гена GUS бежа (рис. 4), то следовало ожидать синтеза химерного бежа с иной р/ и м.м. (5.2 и 80 кДа, соответственно), в сравнении с GUS белком «дикого» типа (р/ ~ 4.8, м.м. ~ 68 ГОа) [Baragona, 1992; Ruebelt, 2006].

Действительно, SDS-фракционирование в ПААГ обнаружило наличие в трансформированных бактериях Е. coli белка размером 80 - 90 кДа, что совпало с рассчитанным нами (рис. 7).

66Д1

18,4 § 14,41

■ ■ . ■■ | щв Щ^Щ

- fM»

Рис. 7. Электрофореграмма препаратов белков лизата клеток Е. coli. 1 - тотальный белок клеток E.coli XL1 - Blue (контроль), 2 -тотальный белок клеток,

трансформированных плазмидой, несущей химерный белок, М-маркер. Стрелкой на треке 2 показана дополнительная полоса, предположительно соответствующая

химерному белку GUS (м.м. - 80 - 90 кДа), отсутствующая среди белков «дикого» штамма.

М 1

При изоэлектрофокусировании (ИЭФ) была обнаружена дополнительная полоса, соответствующая белку с pl ~ 5.8, что также близко к теоретически рассчитанному для химерного белка (рис. 8). Таким образом, в этой части работы нам удалось получить в бактериях Е. coli химерный белок, обладающий способностью взаимодействовать с хитином.

Рис. 8. Изоэлектрофокусирование белков, выделенных из Е. coli: 1 - белки штамма Е. coli XL1 - Blue (контроль), 2 - белки из трансформированных клеток E.coli. М -маркерный белок, pi - изоэлекгрические точки маркерных белков. Стрелкой показана дополнительная полоса (pi ~ 5.8), предположительно соответствующая

химерному белку GUS.

pl ff..... ) ..................2

Экспрессионные активности генно-инженерной конструкции фрагмента гена пероксидазы пшеницы в антисмысловой ориентации

Основываясь на имеющихся данных о возможности изучения роли того или

иного гена в морфолого-физиологических проявлениях растения с помощью

аягасмысловых РНК нами была создана генно-инженерная конструкция в антисенс-

ориентации участка, содержащего полисахарид-специфичный сайт. Фрагмент гена ПО

был получен с помощью ПЦР с кДНК пшеницы. Этот участок размером 200 п.н.,

4.5 N.

5.1 6.0

кодирующий полисахарид-связывающий домен, был амплифицирован и клонирован в Т-векхоре pKRX. Затем он был секвенирован, полученная п. н. была проверена при помощи пакета программ Vector NTI (Invitrogen, США). Выделенная копия фрагмента гена ПО, полностью совпавшая по я.п. с исследуемым участком кДНК пшеницы, вырезана из вектора pKRX по сайту BsePI, а модифицированный ранее вектор pCambia 2301 разрезан по сайту рестрикции Xbal. Затем «липкие» концы плазмиды и фрагмента гена ПО были обработаны Т4-ДНК-полимеразой, лигированы и использованы для конструирования целевой генно-инженерной конструкции. Для проверки правильной сборки полученной конструкции использовали рестрикционный анализ, ПЦР-ПДРФ и секвенирование.

Она была встроена в геном клеток каллусов, а также проростков пшеницы путем баллистической и агробактериальной трансформации, соответственно (рис. 9). Баллистическая трансформация использовалась для доказательства эффективности функционирования созданной генно-инженерной конструкции. Достоинством этого метода является то, что он позволяет быстро переносить гетерологичные гены в геном растений и за короткое время оценить способность генно-инженерной конструкции работать в эукариотическом организме [Rasco, Gaunt. 2000; Mackintosh, 2005; Johrde, 2008]. Однако внедрение микрочастиц металла в клетку путем пробивания клеточной стенки нарушает структуру клетки и, соответственно, ее нормальное состояние.

Y 1200 п.в

Sinai, ВаЫНХ, Xbal

, А Km 35S прсжстор^^ HL_J—J _ 35s np0SOT0p GUS pp'yA -.....

Рис. 9. Клонирование фрагмента гена анионной пероксидазы пшеницы в "антисмысловой" ориентации в векторе pCambia 2301. Km - ген устойчивости к канамицину; 35S промотор - промотор вируса мозаики цветной капусты; промотор ВМГ-промотор вируса мозаики георгина; GUS - ген /?-глюкуронидазы; Smal, BamHI, Xbal - сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, polyA - сайт полиаденилирования.

Таким образом, поиск оптимальных условий, сочетающих максимальную степень доставки векторных конструкций в клетки и при этом наносящих незначительные повреждения живой ткани, является главной задачей оптимизации параметров трансформации. Для оптимизации условий эксперимента для

Л ...... J 4

Vi- штжщщш^ .

"¡SSe

трансформации клеток пшеницы была проведена сравнительная оценка влияния расстояния от источника частиц до ткани мишени - 3, 6, 9, 12 см. С помощью специфического гистохимического окрашивания субстратом Х^1ис на третьи сутки были выявлены крупные участки, окрашенные в голубой цвет (рис. 10). Высокий уровень транзиентной экспрессии маркерного гена обнаружен при использовании расстояния 6 см до ткани мишени - для Т. топососсит, эти данные совпадают и с литературными данными [Ра1па1к, 2003], в остальных случаях транзиентная экспрессия не наблюдалась, причем при расстоянии 3 см жизнеспособность каллуса была очень низкой, что, видимо, связано с сильным механическим повреждением клеток при выстреле на таком близком расстоянии.

Рис. 10. Транзиентная экспресс-сия GUS-белка в эмбриогенном каллусе Т. топососсит после баллистической трансформации (А - контроль, Б - после трансформации). Трансформированные растительные ткани с высоким уровнем экспрессии GUS на рисунке выделяются потемнением.

Оценка экспрессии GUS-гена в проростках пшеницы при агробакгериальной трансформации

Агробактериальный метод трансформации имеет ряд достоинств: с его помощью можно вводить в реципиентные клетки сравнительно крупные генетические конструкции с минимальными нарушениями в кодирующей последовательности переносимого гена, он обеспечивает включение в геном реципиента ограниченного числа копий чужеродного гена и не требует применения специального оборудования, кроме прибора для вакуумной инфильтрации [Cheng, 1997; Майсурян, 2006].

Среди 600 проростков пшеницы при культивировании на питательной среде Кнопа с канамицином обнаружено 12 полностью зеленых, в то время как большая их часть обесцвечивалась из-за усиленной потери ими хлорофилла. Например, из литературы известно, что проростки ячменя становятся полностью бесхлорофилльными после 3-х суток культивирования на среде с канамицином

[Майсурян, 2006], а по другим данным - на 10-е сутки [Степанова, 2006].

Экспрессия jß-глюкуронидазы (GUS) в трансформированных (Б) проростках пшеницы, содержащих антисмысловую последовательность фрагмента гена пероксидазы пшеницы. А - контроль; Б - опыт.

Рис. 11.

Если в контроле наличие GUS белка в проростках практически не обнаруживалось специфическим субстратом к этому ферменту, то в опытных растениях трансформированные клетки окрашивались в темно-синий цвег (рис. 11).

Из этих растений были выделены белки и проведен анализ изоферментного состава ПО. Как видно из рис. 12, трансформация приводит к активации ряда изоПО с рI ~ 7.2 - 7.6 в опытных проростках, что, вероятно, связано с влиянием агробактерий или антибиотика, содержащегося в питательной среде, на защитные системы растений.

Ранее в лаборатории, где выполнялась работа, было показано, что

инфицирование патогенами приводит к активации у растений ряда изоПО с р1 ~ 3.5 -4.5, ~ 6.0 - 7.5 и ~9.4 - 10.0 [Максимов, 2005], которые можно обозначить как чувствительные к инфицированию. Важно, что активность анионных изоПО (р/~ 3.5 - 4.0) при грибном патогенезе [Бурханова и др., 2007] и инфицировании растений бактериями [Мубинов, 2007; Максимов и др., 2010] повышалась. Интересно, что в опытных проростках, являющихся химерными, то есть содержащими как «нормальные», так и трансформированные клетки, происходило снижение

активности ПО. Однако полного отключения ПО активности в таких растениях мы не наблюдали. Подобная мозаичная экспрессия генов ранее прослежена в трансформированных растениях березы [Данилкович, 2008].

На следующем этапе исследований нами был проведен анализ устойчивости листьев химерных растений пшеницы к возбудителю септориоза. Обнаружено, что внедрение генно-инженерной конструкции с антисмысловым фрагментом приводит к значительному падению устойчивости растений.

Рис. 12. Изменение активности изоферментов пероксидазы в трансформированных колеоптилях химерных проростков пшеницы, содержащих антисмысловую последовательность фрагмента гена пероксидазы пшеницы. 1 - контроль, 2 - проростки, зараженные агробактериями, содержащими целевую генно-инженерную конструкцию; 3 - проростки, зараженные агробактериями, не содержащими целевой генно-инженерной конструкции. Стрелкой указаны изоформы пероксидазы со сниженной (отмечены звездочкой *) или повышенной активностью.

Таким образом, данные по агробактериальной трансформации пшеницы по принципу РНК-сайленсинга, то есть подавления синтеза продуктов экспрессии гена эндогенной ПО, позволяют в определенной степени изменить изоферментный спектр ПО растения. Следовательно, можно заключить, что использование антисмысловых РНК способствует получению новых форм растений с пониженной активностью анионной ПО, которые, впоследствии, можно использовать для анализа физиологической роли этого изофермента.

Заключение

Пероксидаза является одним из растительных ферментов, характеризующихся широкой функциональной активностью. Важное ее свойство - активное включение в защитные механизмы против патогенов. В данной работе впервые показано, что за полисахарид-специфичность некоторых изоПО пшеницы, которая способствует их взаимодействию с клетками патогенных грибов, несет ответственность домен, расположенный между 243 и 269 остатками аминокислот. Анализ этого домена обнаружил формирование на древе сходства предполагаемых а.п. отдельной ветви изоПО. Проверка генетической близости просеквенированных амшгшсонов после ПНР ДНК разных видов пшеницы обнаружила, что анализируемый нами домен характеризуется сходной организацией внутри рода пшениц. При этом полученные

после секвенирования ДНК данные по нуклеотидным заменам в искомой последовательности показали четкое разделение испытанных нами видов пшениц на 2 отдельных кластера. Результаты этой работы подтверждают известные из литературных источников данные о делении рода Triticum на 2 подрода пшеницы Boeoticum и Urartu.

В целях определения функциональной активности полисахарид-связывающего домена нами получены генно-инженерные конструкции в сенс- и антисенс-ориентациях. Показано, что выделенный фрагмент полисахарид-специфичной изоПО является необходимым при взаимодействии белка с важным компонентом клеточных стенок патогенных грибов - хитином. В перспективе предполагается возможность использования отмеченной конструкции для детектирования ацетилированных олигосахаридов в растениях пшеницы. Кроме того, химерные сенс-конструкции на основе выделенного нами полисахарид-связывающего домена представляют значительный интерес в биотехнологической промышленности, так как с их помощью из множества белков, синтезируемых в рекомбинантных организмах, можно фракционировать целевые с меньшим количеством этапов. Причем для этого процесса можно использовать распространенный и дешевый биополимер - хитин. В этих условиях использование ионообменно взаимодействующих с биологической матрицей пептидов, например, таких как у хитин-специфичных пероксидаз, является перспективным наряду с аффинной хроматографией. [Kurek, 2009].

При использовании антисмысловых конструкций может происходить полная блокада экспрессии отдельного гена ПО по механизму РНК-интерференции. Можно предположить, что эта блокада может быть полной при трансформации диплоидных форм пшениц и частичной - у аллополиплоидных. Соответственно, данная технология в перспективе позволяет определить роль отдельных геномов аллоплоидной мягкой пшеницы в реализации синтеза белков, ответственных за развитие защитных реакций. Причем, важным обстоятельством является и то, что целевая изоПО, на отключение синтеза которой направлена генно-инженерная конструкция, характеризуется свойством активироваться под влиянием инфицирования. Полученные нами в этой работе данные показали, что анионная пероксидаза пшеницы является важным компонентом защитной системы растений, и

отключение накопления этой изоформы приводит к снижению их устойчивости к патогенам, например, к возбудителю септориоза.

Таким образом, полученные данные позволяют подойти к оценке степени эволюционного родства разных видов растений и роли полисахарид-связывающего домена изоПО пшеницы в физиологических механизмах ее роста и развития на молекулярном уровне.

ВЫВОДЫ

1. Из большого семейства генов растительных пероксидаз 1П класса выделены в отдельную группу гены, кодирующие изоферменты, связывающиеся с полисахаридами.

2. Впервые охарактеризована молекулярная структура домена изопероксидазы, взаимодействующего с полисахаридами растительного и грибного происхождения.

3. Вьивлено, что степень гомологии хитин-связывающего домена пероксидазы у разных видов двудольных и однодольных растений варьирует от 30% (Allium сера) до 75% (Oryza sativum).

4. Обнаружена высокая степень гомологии фрагментов генов пероксидазы, кодирующих связывающийся с полисахаридами домен из видов пшеницы, что говорит о сходной организации этого участка гена пероксидазы.

5. Доказана способность химерного белка GUS, содержащего полисахарид-связывающий домен пероксидазы пшеницы в смысловой ориентации, взаимодействовать с хитином.

6. Получены трансгенные формы пшеницы, содержащие генетическую конструкцию, кодирующую хитин-связывающий домен анионной пероксидазы в антисмысловой ориентации и показано снижение активности этого фермента в таких растениях по механизму РНК-сайленсинга.

7. Активное развитие возбудителя септориоза S. nodorum на трансформированных растениях пшеницы с подавленньм синтезом полисахарид-специфичной пероксидазы в сравнении с контрольными доказывает ее важную роль в защите растений от патогенов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Кузьмина О.И, Яруллина Л.Г., Ахунов A.A. Молекулярные особенности пероксидаз растений, связывающихся с хитином // Биоорганическая химия. 2010. №2, том 36. С. 1-8.

2. Кузьмина О.И. Анализ хитин-связывающего сайта гена растительных изопероксидаз // Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - М.: Издательство МГУ; СП МЫСЛЬ. 2008. С. 151-152.

3. Кузьмина О.И., Благова Д. К., Бурханова Г. Ф., Максимов И. В. Анализ хитин-связывающего сайта в гене полисахарид-специфичной пероксидазы // IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008. С. 154.

4. Кузьмина О.И., Черепанова Е.А., Максимов И.В. Иммунохимическое и генетическое сходство хитин-специфичных пероксидаз разных видов растений // Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений: тез.докл. Междунар. науч. конф., Екатеринбург, 6-10 окт. 2008. — Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2008. С. 235-237.

5. Кузьмина О.И., Благова Д.К., Бурханова Г.Ф. Анализ хитин-связывающего сайта гена растительных пероксидаз // Материалы 12-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 10-14 ноября 2008 года). С.38-39.

6. Кузьмина О.И., Бурханова Г.Ф., Максимов И.В. Полиморфизм хитин-связывающего сайта гена анионной пероксидазы у разных видов растений // Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты: материалы Междунар. науч. конф., 3-6 дек. 2008 г., Минск. - Минск: Изд. Центр БГУ, 2008. - С. 364

7. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Кузьмина О.И. Хитин-специфичные пероксидазы растений: молекулярная организация и иммуиохимическая специфичность// Материалы международной конференции «Геном растений», Одесса, 2008, с. 88-90.

8. Кузьмина О.И., Благова Д.К. Полиморфизм хитин-специфичного сайга гена анионной пероксидазы у разных видов растений // Материалы Молодежной школы-конференции «Современные методы и подходы в биологии и экологии», посвященной 100-летию со дня рождения В.К. Гирфанова. Москва. Издательство «ФОЛИУМ», 2009. С.122-123.

9. Кузьмина О.И., Благова Д.К., Максимов И.В. Молекулярно-генетическая организация хитин-специфичных пероксидаз растений // Симбиоз Россия 2009: Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов (25-29 мая 2009 г., Пермь). С. 219-221.

10. Кузьмина О.И., Черепанова Е.А., Максимов И.В. Участие изопероксидаз, связывающихся с хитином (ацетилированными полисахаридами), в устойчивости растений к стрессовым факторам // Материалы Всероссийской научной конференции, Иркутск, 24-28 августа, 2009. С. 264-267.

11. Максимов И.В., Кузьмина О.И., Благова Д.К., Кулуев Б.Р., Чемерис A.B. Использование хитин-связывающего домена изопероксидаз для анализа физиологической роли фермента // V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009 г. С. 24.

12. E. A. Cherepanova, О. I. Kuzmina and I.V. Maksimov. Chitin-specific peroxidases and the plant defence // Abstract of FESPB-2008. Physiologia Plantarum 2008. V.133. SHOT.

13. Kuzmina O.I., Blagova D.K., Maksimov I.V. Molecular and genetic organization of «chitin-specific» peroxidases of plants // Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE-Kazan 2009" / Edited by Tatiana V. Baltina. Kazan: printed Kazan State University. P. 58.

14. Кузьмина О.И., Постригань Б.Н., Кулуев Б.Р., Максимов И.В. Создание генно-инженерной конструкции с фрагментом гена анионной пероксидазы пшеницы для анализа биологической роли фермента // Материалы Всероссийской конференции «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем», посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. Акмуллы, Уфа, 2009. С. 143-148.

15. Кузьмина О.И. Структурно-функциональное разнообразие хитин-связывающих доменов растительных пероксидаз и их практическое применение // Материалы доклада XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - М.: МАКС Пресс, 2010. - С. 203-204.

16. Кузьмина О.И., Постригань Б.Н., Максимов И.В. Получение химерного белка GUS, содержащего хитин-связывающий домен анионной пероксидазы пшеницы // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Н. Новгород: ННГУ, 2010.-С. 271-274.

17. Kuzmina О., Maksimov I. Studying of the «chitin-specific» domain of plant peroxidases // Abstracts of XVII Congress of the Federation of European of Plant Biology (FESPB). - Valencia, Spain, 2010. -P. 145.

18. Kuzmina O., Maksimov I., Cherepanova E. Molecular peculiarities of the chitin-binding peroxidases of plants // Proceedings of the «Oxidative enzymes as sustainable industrial biocatalysts». - Santiago de Compostela, Spain, 2010. -P.l09-114.

Список сокращений:

а.п. - аминокислотная последовательность;

ил. - нуклеотидная последовательность;

АФК - активные формы кислорода;

изоПО - изопероксидаза;

ИЭФ - изоэлектрофокусирование;

ПО - пероксидаза;

м.м. - молекулярная масса;

р! - изоэлектрическая точка.

Подписано в печать 19.11.10 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 443. Гарнитура «Тш1ез№\\'11отап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1,1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузьмина, Ольга Ильинична

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ М

1.1. Многообразие пероксидаз растений

1.2. Структура белков с пероксидазной активностью

1.3. Функции пероксидаз в растениях

1.4. Участие пероксидаз в лигнификации и суберинизации клеточных 28 стенок

1.5. Пероксидазы в защите растений от патогенов

1.6. Сигнальная регуляция транскрипционной активности генов 34 пероксидаз

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительный материал

2.2. Бактериальные штаммы, плазмидные вектора, патоген

2.3. Реактивы

2.4. Составы использованных стандартных растворов

2.5. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в ПЦР

2.6. Получение фрагмента гена пероксидазы, содержащего полисахарид- 42 специфичный домен

2.6.1. Выделение ДНК из растений

2.6.2. Измерение концентрации ДНК

2.6.3. Полимеразная цепная реакция нуклеиновых кислот

2.6.4. Электрофорез нуклеиновых кислот после ПЦР в ПААГ и агарозе

2.6.5. Секвенирование фрагмента гена пероксидазы

2.6.6. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных 46 последовательностей

2.7. Получение химерного белка, содержащего полисахарид- 46 специфичный домен

2.7.1. Микробиологические среды

2.7.2. Подготовка компетентных клеток Е. coli

2.7.3. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli

2.7.4. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами

2.7.5. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК

2.7.6. Выделение тотального белка из Е. coli ультразвуком и 49 последующая хроматография белков на хитине в объеме

2.1.1. Колориметрический метод определения белка по Бредфорду

2.7.8. Изоэлектрическое фокусирование белков

2.7.9. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ

2.8. Получение трансгенных растений

2.8.1. Биобаллистическая трансформация каллусов пшеницы

2.8.2. Трансформация А. tumefaciens плазмидными конструкциями

2.8.3. Обработка каллусов и семян пшеницы агробактериями, 52 содержащими генно-инженерные конструкции

2.8.4. Инфицирование растений пшеницы возбудителем септориоза

2.8.5. Оценка пораженности растений грибом S. nodorum

2.9. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнительный анализ связывающих полисахариды аминокислотных 55 последовательностей пероксидаз разных видов растений

3.2. ПЦР анализ фрагмента гена, кодирующего полисахарид- 62 связывающий домен анионной пероксидазы различных видов пшеницы и поиск гомологичных последовательностей

3.2.1. Оптимизация условий ПЦР с подобранными к генам полисахарид- 62 специфичных пероксидаз праймерами

3.2.2. Результаты ПЦР фрагмента гена пероксидазы, ответственного за 64 связывание с полисахаридами у Г С

3.3. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов пероксидаз, кодиру^ощих полисахарид-специфичный домен у разных видов пшеницы

3.4. Создание генно-инженерных конструкций со смысловой и антисмысловой ориентацией фрагмента гена анионной перокоИДазЫ пшеницы

3.4.1 Создание генно-инженерных конструкций со смысловой ориентацией полисахарид-связывающего сайта для изучения морфолого-физиологической роли пероксидазы в растениях

3.4.2 Создание генно-инженерных конструкций с антисмысловой 81 ориентацией полисахарид-связывающего сайта для изучения морфолого-физиологической роли пероксидазы в растениях

3.4.3. Оптимизация параметров баллистической трансформации мят"КоИ пшеницы

3.4.4. Оценка экспрессии вШ-гена в проростках пшеницы лри 88 агробактериальной трансформации

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональный анализ полисахарид-связывающего домена пероксидазы пшеницы"

Актуальность исследований. Неблагоприятные факторы внешней среды абиотической и биотической природы отрицательно влияют на рост и развитие растений, что проявляется в изменении экспрессионной активности ряда генов, кодирующих белки, ответственные за восстановление гомеостатического физиологического состояния организма. Среди них пероксидаза (ПО) как защитный белок, привлекает значительный и постоянный интерес исследователей [Carpin, 2001; Behle, 2002; Delannoy, 2003; Dunand, 2003; Claude, 2004; Passardi, 2004; Газарян и др., 2006; Bacalovic, 2006; Максимов, Черепанова, 2007; Almagro, 2009; Cosío, Dunand, 2009]. Это обусловлено как разнообразием практического использования фермента, так и множеством выполняемых этим ферментом в растениях функций, в числе которых важное место занимают участие в лигнификации и суберинизации клеточных стенок, перекрестное сшивание структурных белков клеточных стенок, катаболизм ауксина, защита при окислительном стрессе, регуляция клеточного растяжения, генерация активных форм кислорода (АФК), формирование устойчивости к разным стрессовым факторам, в том числе биотическим [Liu, 2005; Cosío, 2009]. В связи с чем изоформы пероксидазы (изоПО), экспрессирующиеся при патогенезе, отнесены к 9-му классу PR-белков (pathogen related proteins) [Van Loon et al., 2006; Ferreira et al., 2007].

Разнообразие функций ПО предполагает и различия в структурной организации ее молекулы в зависимости от изоформы. Так, при изучении физиологической роли патоген-индуцируемых изоПО обнаружилось свойство некоторых из них ионообменно связываться с клеточной стенкой патогенных грибов [Максимов и др., 2003]. Однако структурные особенности таких изоПО пока остаются слабо изученными. До сих пор нет детального анализа связи синтезируемых в растениях изоПО с кодирующими их генами. Остаются открытыми вопросы, связанные с доказательством способности молекулы ПО связываться с хитином.

Задачи исследований:

1. Выделение, секвенирование и межвидовое сравнение фрагмента гена пероксидазы, кодирующего связывающийся с полисахаридами домен у разных видов пшеницы;

3. Создание генно-инженерной конструкции на основе векторов с фрагментом гена пероксидазы, экспрессирующихся в бактериальных системах в смысловой ориентации и в растениях — в антисмысловой. ориентации;

Научная новизна. Впервые выделен фрагмент гена, кодирующий связывающийся с полисахаридами домен пероксидаз у различных видов пшеницы. Проведен сравнительный анализ нуклеотидной последовательности и предсказанной аминокислотной последовательности данного фрагмента гена ПО мягкой пшеницы (Triticum aestivum ТС151917) с таковыми других видов пшеницы и Aegilops tanshii. Определено генетическое сродство связывающихся с полисахаридами ПО разных видов растений. Получены генно-инженерные конструкции со смысловой и антисмысловой ориентациями этого фрагмента гена пероксидазы мягкой пшеницы, способные экспрессироваться, соответственно, в штаммах бактерий Е. coli и растениях пшеницы. Доказана способность 7 синтезированного в Е. coli химерного белка GUS, содержащего взаимодействующий с полисахаридами домен ПО, связываться с хитином. На основе конструкции, содержащей антисмысловую последовательность этого домена пероксидазы, впервые получены растения пшеницы со сниженной активностью целевого изофермента. Обнаружено, что падение активности анионной пероксидазы приводит к подавлению устойчивости растений пшеницы к возбудителю септориоза.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных вносит вклад в познание структуры как генов, так и белков пероксидаз растений. Генно-инженерные сенс-конструкции к гену хитин-специфичной ПО позволяют использовать связывающийся с полисахаридами домен для создания химерных белков с целевыми фрагментами. Эти же конструкции можно использовать для анализа локализации целевых полисахаридов в растениях. Генно-инженерные конструкции с антисмысловой ориентацией искомого домена можно использовать для изучения физиологической роли ПО в защите растений от патогенов.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008), 12-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2008), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов (Пермь, 2009), Международном 13-м симпозиуме «SymBioSe» (Казань, 2009), Всероссийской конференции «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем» (Уфа, 2009), Десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010), XVII Congress of the Federation of European of Plant Biology (FESPB) (Valencia, 2010), Международном симпозиуме «Oxidative enzymes as sustainable industrial biocatalysts» (Santiago de Compostela, 2010).

Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантами РФФИ-ККРНТ 08-04-90259узба (2008) и проектом № 10234 «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» (2009), а также госконтрактами Министерства образования и науки Российской Федерации № 02.512.11.2051 (2007), №2.1.1./5676 «Развитие научного потенциала высшей школы» (2009) и № П339 «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России (2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 1 статья в журнале из Перечня ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кузьмина, Ольга Ильинична

выводы

1. Из большого семейства генов растительных пероксидаз III класса выделены в отдельную группу гены, кодирующие изоферменты, связывающиеся с полисахаридами.

3. Выявлено, что степень гомологии хитин-связывающего домена пероксидазы у разных видов двудольных и однодольных растений варьирует от 30% (.Allium сера) до 75% (Oiyza sativum).

5. Доказана способность химерного белка GUS, содержащего -полисахарид-связывающий домен пероксидазы пшеницы в смысловой -ориентации, взаимодействовать с хитином.

7. Активное развитие возбудителя септориоза S. nodorum на трансформированных растениях пшеницы с подавленным синтезом полисахарид-специфичной пероксидазы в сравнении с контрольными доказывает ее важную роль в защите растений от патогенов.

Заключение

Пероксидаза является одним из растительных ферментов, характеризующихся широкой функциональной активностью. Важное ее свойство - активное включение в защитные механизмы против патогенов. В данной работе впервые показано, что за полисахарид-специфичность некоторых изоПО пшеницы, которая способствует их взаимодействию с клетками патогенных грибов, несет ответственность домен, расположенный между 243 и 269 остатками аминокислот. Анализ этого домена обнаружил формирование—тта древе сходства предполагаемых а.п. отдельной ветви изоПО. Проверка генетической близости секвенированных ампликонов после ПЦР ДНК разных видов пшеницы обнаружила, что анализируемый нами домен характеризуется сходной организацией внутри рода пшениц. При этом полученные после секвенирования ДНК данные по нуклеотидным заменам в искомой последовательности показали четкое разделение испытанных нами видов пшениц на 2 отдельных кластера. Результаты этой работы подтверждают известные из литературных источников данные о делении рода Triticum на 2 подрода пшеницы Boeoticum и Urartu.

В целях определения функциональной активности полисахарид-связывающего домена нами получены генно-инженерные конструкции в сенс— и антисенс-ориентациях. Показано, что выделенный фрагмент полисахарид-специфичной изоПО является необходимым при взаимодействии белка с важным компонентом клеточных стенок патогенных грибов - хитином. В перспективе предполагается возможность использования отмеченной конструкции для детектирования ацетилированных олигосахаридов в растениях пшеницы. Кроме того, химерные сенс-конструкции на основе выделенного нами полисахарид-связывающего домена представляют значительный интерес в биотехнологической промышленности, так как с их помощью из множества белков, синтезируемых в рекомбинантных организмах, можно фракционировать целевые с меньшим количеством этапов. Причем для этого процесса можно использовать распространенный и дешевый биополимер — хитин. В этих условиях использование ионообменно взаимодействующих с биологической матрицей пептидов, например, таких как у полсахарид-специфичных пероксидаз, является перспективным наряду с аффинной хроматографией. [Кигек, 2009].

При использовании антисмысловых конструкций может происходить полная блокада экспрессии отдельного гена ПО по механизму РНК-интерференции. Можно предположить, что эта блокада может быть полной при трансформации диплоидных форм пшениц и частичной - у аллополиплоидных. Соответственно, данная технология в перспективе позволяет определить роль отдельных геномов аллоплоидной мягкой пшеницы в реализации синтеза белков, ответственных за развитие защитных реакций. Причем, важным обстоятельством является и то, что целевая изоПО, на отключение синтеза которой направлена генно-инженерная конструкция, характеризуется свойством активироваться под влиянием* инфицирования. Полученные нами в этой работе данные показали, что анионная пероксидаза пшеницы является важным компонентом защитной системы растений, и отключение накопления этой изоформы приводит к снижению их устойчивости к патогенам, например, к возбудителю септориоза.

Таким образом, полученные результаты позволяют подойти к оценке степени эволюционного родства разных видов растений и роли полисахарид-связывающего домена изоПО пшеницы в физиологических механизмах ее роста и развития на молекулярном уровне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузьмина, Ольга Ильинична, Уфа

1. Агеева М.В., Аменицкий С.И., Горшкова Т.А., Гурьянов О.П., Ибрагимова H.H. и др. Биогенез растительных волокон // под ред. Т.А. Горшковой / М.: Наука. 2009. -264 с.

2. Альберте Б., Брей Д. и др. Молекулярная биология клетки // Издательтво «Мир».-1994.-409 с.

3. Бах А.Н. Химизм дыхательных процессов // Собрание трудов по химии и биохимии. М.:Изд-во АН СССР. 1950. - С. 50-109.

4. Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г., Максимов И.В. Пути регуляции хитоолигосахаридами защитных реакций в растениях пшеницы при инфицировании Bipolaris sorokiniana II Физиол. раст. 2007. - Т. 54. №1. - С. 104-110.

5. Валуева Т.В., Ревина Т.А., Гвоздева Е.А., Герасимова Н.Г., Ильинская Л.И., Озерецковская O.J1. Влияние элиситоров на накопление ингибиторов протеиназ в пораненных клубнях картофеля // Прикл. биохим. микробиол. 2001. - Т.37. - С. 601-606.

6. Васюкова Н.И., Озерецковская O.J1. Жасмонат-зависимая защитная сигнальная система в растительных тканях // Физиол. раст. 2009. -Т.56. - С. 643-653.

7. Васюкова Н.И., Придворова С.М., Герасимова Н.Г. и др. Фенилаланинаммиак-лиазы и салициловой кислоты в индуцировании устойчивости томатов, инвазированных галловой нематодой Meloidogine incognita II Доклады АН. 2007. Т. 416. - С. 826 - 829.

8. Викторов А. Г. Влияние .ßi-растений на почвенную биоту и плейотропный эффект А -эндотоксин-кодирующих генов // Физиол. раст.2008. Т.55. - С.823-833.

9. Газарян И.Г. Хушпульян Д.М.,Тишков В.И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений // Усп. Биол. xkivlhzü. -2006. -Т.46. С. 303-322.

10. Гесслер H.H., Аверьянов A.A., Белозерская Т.А. Активные фо^гяугы кислорода в регуляции развития грибов // Биохимия. 2007. - Т. 72. - С. X 3 421364.

11. Глянько А.К., Васильева Г.Г. Активные формы кислорода и: азота при бобоворизобиальном симбиозе // Прикл. биохим. и микробиол. 201 О. — Т. 46.-С. 21-38.

12. Гончаров Н., Кондратенко Е. Происхождение, доместикацр^сзз: и эволюция пшениц // Вестник ВОГиС. 2008. -Т. 12. - № 1/2. - С. 159-179.

13. Горшкова Т.А. Растительная клеточная стенка как динамкпчпная система. М.: Наука, 2007. 429 с.

14. Горшкова Т.А., Микшина П.В., Гурьянов О.П., Чемикосова <З.Б. Формирование надмолекулярной структуры растительной клеточной стенки • * // Биохимия. 2010. - Т. 75. - С. 196-212.

15. Граскова И.А., Боровский Г.Б., Колесниченко A.B., ВойшгИсов, В.К. Пероксидаза как компонент сигнальной системы клеток картофеля: хтри патогенезе кольцевой гнили // Физиол. раст. 2004. - Т.51. - С. 692 - 697.

16. Данилкович A.B. Молчание генов: сборник науч. трудозз. -Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2008. 309 с.

17. Долгов C.B., Тимербаев В.Р., Шестибратов К.А., Лебедев Корнеева И.В. Использование механизма ПТИГ для модификации прогресса созревания плодов // Молчание генов. Сборник научных трудов. 2008. — 309 с.

18. Дорофеев В.Ф., Удачин P.A., и др. Пшеницы мира. — Л.: Агропромиздат, Ленинградское отд-е: 2-е издание, 1987.-560 с.

19. Крючкова Л.А., Маковейчук Т.И., Яворская В.К., КурчиЙ Б.А. Содержание салициловой кислоты в листьях проростков озимой пшеницыразличной устойчивости к фитопатогенам//Физиол. и биохим. культ, раст. -2006.-Т. 38.-С. 45-52.

20. Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В. Формирование адаптивных реакций растений на действие абиотических стрессоров —Киев. Основа, 2010. 352 с.

21. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиол. раст. 1999. - Т. 46. -С. 321-336.

22. Куприянова Е.В., Ежова Т.А., Лебедева О.В., Шестаков C.B. Внутривидовой полиморфизм пероксидазных генов, локализованных в ггятой хромосоме Arabidopsis thaliana II Известия РАН. Сер. биол. 2006. - №4. - С. 437-447.

23. Лебедева О.В., Ежова Т.А., Мусин С.М., Радюкина Н.Л., Шестаков C.B. Ген PXD контролирует образование трех изоформ анионных пероксидаз Arabidopsis thaliana I ! Известия АН. Серия биол. 2003. - №2. -С.159-168.

24. Лебедева О.В., Ежова Т.А., Шестаков C.B. Локализация и молекулярный анализ гена PXD, кодирующего анионную пероксидазу Arabidopsis thaliana II Докл. АН. 2004. - Т.394. - С. 138.

25. Лиу Ю., Пан Ц.Х., и др. Взаимосвязь между Н2Оз и жасмоновой кислотой в ответной реакции листьев гороха на поранение // Физиол. раст. -2008. Т.55. - С.851-862.

26. Майсурян А., Овчинникова В., Долгих Ю., Степанова А., Терешонок Д., Мартиросян Ю., Харченко Г. // Биотехнология. 2006. №3С. 56-61.

27. Максимов И.В., Хайруллин P.M., Ямалеев A.M., Ямалеева A.A. Использование биополимера хитина для разделения изоферментов пероксидазы пшеницы // Вопросы биотехнологии. Под ред. P.P. Ахметова. БГУ, Уфа, 1995. С. 120-127.

28. Максимов И. В., Черепанова Е. А. Хайруллин P.M. «Хитин-специфичные пероксидазы в растениях // Биохимия. 2003. - Т. 68. - С. 133

29. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Яруллина Л.Г., Ахметова И.Э., Выделение «хитин-специфичных» оксидоредуктаз пшеницы // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. - Т. 41. - С.616-620.

30. Максимов И.В., Черепанова Е.А, Муртазина Г.Ф., Чикида Н. Н. Связь устойчивости проростков Aegilops umbellulata к Septoria nodorum Berk, с изоферментным составом пероксидаз // Известия РАН. Сер. биол. 2006. -Т. 33. №5. - С. 575-580.

31. Максимов И.В., Валеев А.Ш., Черепанова Е.А., Яруллина Л.Г. Образование пероксида водорода в листьях пшеницы, инфицированных штаммами гриба Septoria nodorum с различной вирулентностью // Прикл. биохим. и микробиол. 2009. - Т. 45. - С. 481-486.

32. Максимов И. В., Черепанова Е. А., Сурина О. Б. Влияние хитоолигосахаридов на состав изоферментов пероксидазы в совместной культуре каллусов пшеницы с возбудителем твердой головни // Физиол. раст. -2010.-Т. 57. -С. 131-138.

33. Максимов И.В., Черепанова Е.А. Про-/антиоксидантная система и устойчивость растений к патогенам // Усп. соврем, биол. 2006. - Т. 126. -№3.-С. 250-261.

34. Минибаева Ф.В., Гордон Л.Х. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе // Физиол. раст. 2003. - Т. 50. - С. 459-464.

35. Мосолов В.В., Григорьева Л.И., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ из растений как полифункциональные белки // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. - Т. 37. - С. 643-650.

36. Озерецковская О.Л. Проблемы специфического иммунитета //

37. Физиол. раст. 2002. Т.49. - С. 148-154.

38. Озерецковская O.JL, Васюкова Н.И., Панина С., Чаленко Г.И. Действие иммунномодуляторов на устойчивость и восприимчивость картофеля к Phytophthora infestans II Физиол. раст. 2006. - Т. 53. - С. 546 -553.

39. Полевой В.В. Чиркова Т.В. Практикум по росту и устойчивости растений: учебное пособие. Спб.: Изд-во С -Петерб. Ун-та. 2001. - 212 с.

40. Пыжикова Г.В., Карасева Е.В. Методика изучения возбудителейсепториоза на изолированных листьях пшеницы // С.-х. биология. 1985. №.12. С.112-114.

41. Радюкина H.JL, Шашукова A.B., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Участие пролина в системе антиоксидантной защиты у шалфея nppi действии NaCl и параквата // Физиол. раст. 2008. - Т. 55. - С. 721-730.

42. Рич П.Р., Иваки М. Сравнение интермедиантов катализа активных центров цитохром с-оксидазы и перокидаз // Биохимия. 2007. - Т. 72. - С. 1289-1299.

43. Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов СПб.: ГИОРД, 2004. 255 с.

44. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина Т.В. Пероксидаза: строение и механизм действия. Иркутск: Иркутский государственный технический университет. 2004. 200 с.

45. Рогожин В.В., Рогожина Т.В., Влияние индолил-З-уксусной кислоты на окисление о-дианизитдина и гидрохинона в присутствии пероксидазы // Исследовано в России. Эл. журнал, http://zhurnal.ape.relarn.ru /articles/2003/08l.pdf. С. 918-933.

46. Саприн А.Н., Калинина Е.В. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов. // Усп. биол. химии. 1999. - Т.39. - С.289-326.

47. Сахаров И.Ю. Пероксидазы пальм // Биохимия. 2004. - Т. 69. - С.1013-1020.

48. Серова В.В., Ралдугина Г.Н., Красавина М.С. Ингибирование гидролиза каллозы салициловой кислотой нарушает транспорт вируса табачной мозаики // Докл. АН. 2006. - Т. 406. №5. - с. 705-708.

49. Тарчевский И.А. Сигнальные системы растений. М.: Наука. -2002. 294 с.

50. Трошина Н.Б., Максимов И.В., Сурина О.Б., Хайруллин P.M. Развитие Tilletia caries (D.C.) Tul. в каллусных и суспензионных культурах пшеницы // Изв. РАН. Сер. биол. 2000. - №3. - С.377-381.

51. Хайруллин P.M., Максимов И.В., Юсупова З.Р. Повышениеактивности анионных изоформ пероксидазы пшеницы при септориозе ивозможное участие фитогормонов ИУК и АБК в этом процессе // Микол. и фитопатол. 2001. - Т.35. - С.47-53.

52. Холл М. А., Новикова Г.В., Мошков И.Е., Дж. Мур J1.A., Смит А.Р. Протеинкиназы растений в трансдукции абиотических и биотических сигналов // Физиология растений. 2002. - Т.49. -№1. -С.121-135.

53. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. Уфа: Гилем, 2001. 160с.

54. Шарова Е.И. Клеточная стенка растений. Спб.: Изд-во С. Петербургского университета. 2004. - 156 с.

55. Чугункова Т.В., Губанова Н.Я. Неспецифические элиситоры -модуляторы иммунных реакций растений // Физиол. и биохим культ раст. -2005. Т. 37. - С. 198-203.

56. Ясенецкая Е.Г., Булгаков В.П., Горбач В.Ш. и др. Этефон и жасмонат зависимая индукция внутриклеточных патоген-индуцируемых рибонуклеаз в культуре клеток женьшеня //'Физиол. раст. - 2003. - Т.50. - С. 554-560.

57. Abercrombie J., Halihill М., Ranjan P., Rao M., Saxton A., Yuan J., Stewart C. Transcriptional responses of Arabidopsis thaliana plants to As (V). stress // BMC Plant Biology. 2008. - V. 8. - P. 87.

58. Akhunov A.A., Golubenko Z., • Khashimova N.R., Mustakimova E.Ch., Vshivkov S.O. Role of chitin-speciflc peroxidase in wilt-resistant cotton // Chem. Nat. Сотр. 2008. - V. 44. - P. 493-496.

59. Allaby R., Brown T. Network analysis provides insights into evolution of 5S rDNA arrays in Triticum and Aegilopsll Genetics. 2001- V. 157: - P. 13311341.

60. Allen R.G., Tresini M. Oxidative burst and gene regulation // Free Radical Biol. Med. 2000. - V. 28. - P. 463-499.

61. Almagro L., Gomez Ros L.V., Belchi-Navarro S., Bru R., Ros Barcello A., Pedreno M.A. Class III peroxidases in plant defence reactions // J.

62. Exp. Botany. 2009. - V. 60. - P. 377-390.

63. Andersone U., Ievinsh G. Changes of Morphogenic Competence in Mature Pinus sylvestris L. buds in vitro // Ann. Botany. 2002. - V. 90. - P. 293298.

64. Audenaert K., Meyer G.B.D., Hofte M.M. Abscisic acid determines basal susceptibility of tomato to Botrytis cinerea and Suppresses Salicylic Acid-dependent signaling mechanisms // Plant Physiol. 2002. - V.128. - P.491-501.

65. Bacalovic N., Passardi F., Ioannidis v., Cosio C., Penel C., Falquet L., Dunand C. PeroxiBase: A class III plant peroxidase database // Phytochemistry. -2006. V.67. - P. 534-539.

66. Bernards M.A., Fleming W.D., Llewellyn D.B. Priefer R., Yang X., Sabatino A., Plourde G.L. Biochemical characterization of the suberization-associated anionic peroxidase of potato // Plant Physiol. 1999. - V.121. - P. 135145.

67. Bindschedler LV, Dewdney J, Blee KA, et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance // -Plant J. 2006. - V. 47.-P. 851-863.

68. Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. - V. 24.-N7.-P. 1513-1523.

69. Blee KA, Choi JW, O'Connell AP, Schuch W, Lewis NG, Bolwell GP. A lignin-specific peroxidase in tobacco whose antisense suppression leads tovascular tissue modification // Phytochemistry. 2003. - V. 64. - P. 163-176.

70. Boerjan W., Ralph J., Boucher M. Lignin Biosynthesis // Annu. Rev. Plant Biology. -2003. V. 54. - P. 519-546.

71. Brownleader M.D., Hopkins J., Mobasheri A. et al. Role of extension peroxidase in tomato (Lycopercicon esculentum Mill.) seedling growth // Planta. -2002.-V. 210.-P. 668-676.

72. Carpin S, Crevecoeur M, Greppin H, Penel C. Molecular cloning and tissue-specific expression of an anionic peroxidase in zucchini // Plant Physiol. -1999.-V. 120.-P. 799-810.

73. Carpin S., Crevecoeur M., de Meyer M., Simon P., Greppin H. & Penel C. Identification of a

74. Ca -pectate binding site on an apoplastic peroxidase // Plant Cell. 2001. - V.13. - P. 511-520.

75. Caruso C., Chilosi G., Caporale C., Leonardi L., Bertini L., Magro P., Buonocore V. Induction of pathogenesis-related proteins in germinating wheat seeds infected with Fusarium culmorum // Plant Science. 1999. - V. 140. - P. 8797.

76. Chassot C., Nawrath C., Metraux J.P. Cuticular defects lead to full immunity to a major plant pathogen // Plant J. 2007. - V. 49. - P. 972-980.

77. Chen C., Baucher M., Christensen J.H., Boerjan W. Biotechnology in trees: towards improved paper pulping by lignin engineering // Euphytica. 2001. -V. 118. - P. 185-195.

78. Chen EX., Chen Y.A., Chen L.M., Liu Z.H. Effect of copper on peroxidase activity and lignin content in Raphanus sativus // Plant Physiol. Biochem. 2002. - V. 40. - P. 439-444.

79. Cheng M., Fry J., Pang S., Zhou H., Hironaka C., Duncan D., T. Conner, and Wan Y. Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens II Plant Physiol. -1997. -V.l 15. P. 971-980.

80. Cheong YH, Chang HS, Gupta R, Wang X, Zhu T, Luan S. Transcriptional profiling reveals novel interactions between wounding, pathogen, abiotic stress, and hormonal responses in Arabidopsis II Plant Physiology. 2002. -V. 129. - P. 661-677.

81. Chiang HC, Lo JC, Yeh KC. Genes associated with heavy metal tolerance and accumulation in Zn/Cd hyperaccumulator Arabidopsis halleri: a genomic survey with cDNA microarray // Environmental Science Technology. -2006. V. 40. - P. 6792-6798.

82. Choi HW, Kim YJ, Lee SC, Hong JK, Hwang BK. Hydrogen peroxide generation by the pepper extracellular peroxidase CaP02 activates local and systemic cell death and defense response to bacterial pathogens // Plant Physiology. 2007. - V. 145. - P. 890-904.

83. Christensen J.H., Overney S., Rohde A., et al. The syringaldazine-oxidizing peroxidase PXP 3-4 from poplar xylem: cDNA isolation, characterization and expression // Plant Mol. Biol. 2001. - V. 47. - P. 581-593.

84. Coego A., Ramirez V., Ellul P., Mayda E., Vera P. The H202-regulated Ep5C gene encodes a peroxidase required for bacterial speck suscettibility in tomato // The Plant J. 2005. - V. 42. - P. 283-293.

85. Cosio C, Zheng Y, Perry S, Dunand C. Peroxidases involved in pod shatter mechanisms // Physiologia Plantarum. 2008. - V. 133. - P. 10-19.

86. Cosio C., Dunand C. Specific function of individual class III peroxidase genes // J. Exp. Botany. 2009. - V. 60. - P. 391-408.

87. Crockard A., Bjourson A., Cooper J. A new peroxidase cDNA fromwhite clover: its characterization and expression in root tissue challenged Pseudomonas syringae // Molecular Plant-Microbe Interaction. 1999. - V. 12. - P. 825-828.

88. Dat J. F., Capelli N., Van Breusegem F. The interplay between salycilic acid and reactive oxigen species during cell death in plants // Salycilic acid: a plant hormone, Springer-Verlag. Berlin. Heidelberg. 2007. - P. 247-276.

89. Day R. B., Okada M, Ito Y., Tsukada K., Zaghouani H, Shibuya N, Stacey C. Binding Site for Chitin Oligosaccharides in the Soybean Plasma Membrane//Plant Physiol.-2001.-V. 126.-P. 1162-1173.

90. Deepak S. et al. Induction of resístanse against doeny mildew pathogen in pearl millet by a synthetic jasmonate analogon // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2007. - V. 71. - P. 96-105.

91. Demirevska-Kepova K., Simova-Stoilova L., Stoyanova Z., Hôlzer R., Feller U. Biochemical changes in barley plants after excessive supply of copper and manganese // Envir. Exp. Botany. 2004. - V.52. - P.253-266.

92. De Gara L., Pinto M., Tomasi F., The antioxidant system vis-à-vis reactive oxygen species during plant pathogen interaction // Plant Physiol. Biochem. 2003. - V.41. - P.863-870.

93. Diaz-Vivancos P., Rubio M., Mesonero Y., Periago P.M., Ros Barcelo A., Martmez-Gomez P., Hernandez J.A. The apoplastic antioxidant system in Prunus: response to long-term plum pox virus infection // J. Exp Botany. 2006. -V. 57.-P. 3813-3824.

94. Ditt R., Nester E., Cornai L. Plant gene expression response to Agrobacterium tumefaciens // PNAS. 2001. - V. 98. -№19. - 10954-10959.

95. Dowd P.F., Lagrimini L.M. Examination of the biological effects of high anionic peroxidase production in tobacco plants grown under field conditions.

96. Insect pest damage // Transgenic Research. 2006. - V. 15. - P. 197-204.

97. Dunand C., Tognolli M., Overney S., Von Tobel L., De Meyer M., Simon P., Penel C. Identification and characterisation of Ca~ pectate binding peroxidases in Arabidopsis thaliana // J. Plant Physiology. - 2002. - V. 159. - P. 1165-1171.

98. Dunand C., de Meyer M., Crevecoeur M., Penel C. Expression of a peroxidase gene in zucchini in relation with hypocotyl growth // Plant Physiol. Biochemistry. 2003. - V. 41. - P. 805-811.

99. Duroux L, Welinder KG. The peroxidase gene family in plants: a phylogenetic overview // J. Molecular Evolution. 2003. - V. 57. - P. 397-407.

100. Dunford H.B. Heme peroxidase nomenclature // LABPV Newsletter. -1999.-V. 13.-P. 65-71.

101. Duroux L., Welinder K.L. The peroxidase gene family in plants // J. Mol. Evol. 2003. - V.57. - P. 397-407.

102. El Gueddari N.E., Rauchhaus U., Moerschbacher B.M., Deising H.B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi // New Phytologist. 2002. V. 156. - P. 103-112.

103. El-Sayed M, Verpoorte R. Growth, metabolic profiling and enzymes activities of Catharanthus roseus seedlings treated with plant growth regulators // Plant Growth Regulation. 2004. - V.44. - P. 53-58.

104. Felle H.H., Kondorosi E.A., Kondorosi A.A., Schultze M. Nod factors modulate the concentration of cytosolic free calcium differently in growing and non-growing root hairs of Medicago sativa L. // Planta. 1999. - V.209. - P. 207212.

105. Ferreira R.B., Monteiro S., Freitas R., Santos C.N., Chen Z., Batista L., Duarte J., Borges A., Teixeira A.R. The role of plant defense protein in fungalpathogenesis // Mol. Plant Pathology. 2007. - V. 8. - P. 677-700.

106. Foyer C.H., Noctor G. Redox sensing and signaling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxiosomes and mitochondria // Physiol. Plant. -2003.-V.119.-P. 355-364.

107. Galvez-Valdivieso G., Mullineaux P.M. The role of reactive oxygen species in signaling from chloroplasts to the nucleus // Physiologia Plantarum. -2010. V.138.-P. 430-439.

108. Gazaryan I.G., Chubar T.A., Mareeva E.A., Lagrimini M. Aerobic oxidation of indole-3-acetic acid catalysed by anionic and cationic peanut peroxidase // Phytochemistry. 1999. - V. 51. - P. 175-186.

109. Gechev T., Gadiev 1., Van Breusegem F. et al. Hydrogen peroxide protect tobacco from oxidative stress by inducing a set of antioxidant enzymes // Cell. Mol. Life Sci. 2002. - V.59. - P. 708-714.

110. Ghosh M. Antifungal Properties of Haem Peroxidase from Acorus calamus // Ann. Botany. 2006. - V.98. - P. 1 145-1153.

111. Grant M., Mansfield J. Early events in host-pathogen interactions // Cur. Opin. Plant Biol. 1999. - №. 2. - P. 312-319.

112. Gulsen O., Shearman R.C., Heng-Moss T.M., Mutlu N., Lee D.J., Sarath G. Peroxidase gene polymorphism in buffalograss and other grasses // Crop Science. 2007. - V. 47. - P. 767-774.

113. Gustavo G. Yannarelli, Susana M. Gallego and Maria L. Tomaro Effect of UV-B radiation on the activity and isoforms of enzymes with peroxidase activity in sunflower cotyledons // Environ. Exp. Botany. 2006. - V.56. - P. 174181.

114. Harholt J., Suttangkakul A., Scheller H.V. Biosynthesis of Pectin // Plant Physiology. 2010. - V.153, - P.384-395.

115. Hatfield R., Vermeris W. Lignin formation in plants. The dilemma of linkage specifity // Plant Physiol. 2001. - V.126. - P.1351-1357.

116. Hawkins S., Boudet A. Defense lignin and hydroxycinnamyl alcohol dehydrogenase activities in wounded Eucalyptus gunnii // Forest Path. 2003. - V. 33.-P. 91-104.

117. Henriksen A., Mirza O., Indiani C. et al. Structure of soybean seed coat peroxidase: a plant peroxidase with unusal stability and haem-apoprotein interaction // Protein Sci. 2001. - V. 10. - P. 108-115.

118. Heitefuss R. Defense reactions of plants to fungal pathogens: principles and perspectives, using powdery mildew on cereals as an example // Naturwissenschaften. 2001. - V. 88. - P.273-283.

119. Herder I, Lievens S., Rombants S., Holsters M., Goormachting S. A symbiotic plant peroxidase involved in bacterial invasion of the tropical legume Sesbania rostrata II Plant Physiol. 2007. - V. 144. - P. 717-727.

120. Hippeli S., Heiser I., Elstner E. F. Activated oxygen and free oxygen radicals in pathology: New insights and analogies between animals and plants // Plant Physiol. Biochem. 1999. - V. 37. - P.167-178.

121. Hiraga S., Sasaki K., Ito H., Ohashi Y., Matsui H. A large family of Class III Plant Peroxidases // Plant Cell Physiol. 2001. -V. 42. - P. 465-468.

122. Jackson P.A.P., Galinha C.I.R., Periera C.S. et al. Rapid deposition of* extension during the elicitation of grapevine callus cultures is specifically catalyzed by a 40-kilodalton peroxidase // Plant physol. 2001. - V. 127. - P. 10651076.

123. Jansen M.A.K., Van den Noort R.E., Tan M.Y. et al. Phenol-oxidizing peroxidases contribute to the protection of plants from ultraviolet radiation stress // Plant Physiol. 2001. - V. 126. - P. 1012-1023.

124. Jefferson et al. Expression of chimeric genes in Caenorhabditis elegans II Mol. Biol. 1987. -V. 193. - P. 41-46.

125. Johrde A., Schweizer P. A class III peroxidase specifically expressed, in pathogen-attacked barley epidermis contributes to basal resistance // Molecular Plant Pathology. 2008. - V. 9. - P. 687-696.

126. Irshad M., Canut H., Borderies G., Pont-Lezica R., Jamet E. A new picture of cell wall protein dynamics in elongating cells of Arabidopsis thaliana.-. Confirmed actors and newcomers // BMC Plant Biology. 2008. - V. 8:94. -doi: 10.1186/1471 -2229-8-94.

127. Ito H., Higara S., Tsugava H. et al. Xylem-specific expression of wound inducible rice peroxidase genes in transgenic plants // Plant Sci. 2000. - V. 155.-P. 85-100.

128. Ito Y., Kaku H., Shibuya N. Identification of a high-affinity binding protein for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membrane of suspension-cultured rice cells by affinity labeling // Plant J. 1997. - V.12. - P.347-356.

129. Kaothien P., Shimokawatoko Y., Kawaoka A. et al. A cis-element containing PAL-box functions in the expression of the wound-inducible peroxidase gene of horseradish // Plant Cell Reports. 2000. - V. 19. - P. 558-562.

130. Karkonen A., Kautaniemi S. Lignin biosynthesis studies in plant tissue cultures // J. Integr. Plant Biology. 2010. - V. 52. - P. 176-185.

131. Kawano T. Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction // Plant Cell Reports. -2003. -V. 21. P. 829-837.

132. Kawano T., Muto S. Machanism of peroxidase actionc for salicylic acid-indused generation of active oxigen species and an increase in cytosolic calcium in tobacco cell suspension culture // J. Exp. Botany. 2000. - V. 51. - P. 685 - 693.

133. Kim E.H., Kim Y.S., Park S.-H., Koo Y.J., Choi Y.D. et al. Methyl Jasmonate Reduces Grain Yield by Mediating Stress Signals to Alter Spikelet Development in Rice // Plant Physiol. 2009. - V. 149. - P. 1751-1760.

134. Kim J., Han I., Kim Y. et al. C-terminal heparin-binding domain of fibronectin regulates integrin-mediated cell spreading but not the activation of mitogen-activated protein kinase // Biochem. J. 2001. - V. 360. - P.239-245.

135. Klok E.J., Wilson I.W., Wilson D., Chapman S.C., Ewing R.M., Somerville S.C., Peacock W.J., Dolferus R., Dennis E.S. Expression profile analysis of the low-oxygen response in Arabidopsis root cultures // The Plant Cell. 2002. - V.14. - P 2481-2494.

136. Kumari M, Taylor GJ, Deyholos MK. Transcriptomic responses to aluminum stress in roots of Arabidopsis thaliana II Mol. Genetics and Genomes. -2008.-V. 279.-P. 339-357.

137. Lagrimini LM, Gingas V, Finger F, Rothstein S, Liu T. Characterization of antisense transformed plants deficient in the tobacco anionic peroxidase // Plant Physiol. 1997. - V. 114. - P.l 187-1196.

138. Lavania M., Chauhan P.S., Chauhan S.V.S., Singh H.B., Nautiyal C.S. Induction of plant defence enzymes and phenolics by treatment with plant growth-promoting rhizobacteria Serratia marcescens NBRI1213 I I Cur. Microbiol. 2006. - V.52. - P. 363-368.

139. Lee D., Kim S. The regulation of 51 upsteam regions of a Korean radish cationic peroxidase gene by gibberellic acid and abscisic acid // Plant Science. 1998. - V. 139. - P. 105-115.

140. Lehner G., Cardemil L. Differences in wound-induced changes in cell—, wall peroxidase activities and isoform patterns between seedlongs of Prosopsis tamarugo and Prosopsis chelilensis II Physiology. 2003. - V. 23. - P. 443-452.

141. Lehtonen M.T., Akita M., Kalkkinen N., Ahola-Iivarinen E., Ronnholm G., Somervuo P., Thelander M.,Valkonen J.P.T. Quickly-released peroxidase of moss in defense against fungal invaders // New Phytologist. 2009. -V. 183. - P. 432-443.

142. Liechti R., Farmer E.E. The jasmonate pathway // Science. 2002. -V. 296.-P. 1649-1650.

143. Li Y., Kajita S., Kawai S., Katayama Y., Morohoshi N. Down-regulation of an anionic peroxidase in transgenic aspen and its effect on lignin characteristics // J. Plant Res. 2003. - V. 116. - P. 175-182.

144. Liao X.-R., Zhu X.-Ch., He P.-Ch. A cationic peroxidase from leaves of Vitus pseudoreticulata // Phytochemistry. 1999. - V. 51. - P. 143-145.

145. Lige B., Ma S., van Huystee R.B. The effects of the sitedirected removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function // Arch. Biochem. Biophys. 2001. -V. 386. - P. 17-24.

146. Liszkay A., Kenk B., Schopfer P. Evidence for the involvement of cell wall peroxidase in the generation of hydroxyl radicals mediating extension growth // Planta. 2002. - V. 217. - P.658-667.

147. Little D, Gouhier-Darimont C, Bruessow F, Reymond P. Oviposition by pierid butterflies triggers defense responses in Arabidopsis II Plant Physiol. -2007.-V. 143.-P. 784-800.

148. Llorente F., Lopez-Cobollo R.M., Catala R., Martinez-Zapater J.M., Salinas J. A novel cold-inducible gene from Arabidopsis, RCI3, encodes a peroxidase that constitutes a component for stress tolerance // Plant J. 2002. - V. 32. - P. 13-24.

149. Lucena M.A., Romero-Alanda R., Mecardo J.A. et al. Structural and physiological changes in the roots of tomato plants overexpressing a basic peroxidase // Physiol. Plant. 2003. -V.l 18. - P.422-429.

150. Mackintosh C., Garvin D., Radmer L., Helnen S., Muehlbauer. A model wheat cultivar for transformation to improve resistance to Fusarium head blight // Plant. Cell Rep. 2006. - V. 25. - P. 313-319.

151. Mahalingam R., Fedoroff N. Stress response, cell death and signaling: the many faces of reactive oxygen species // Physiol. Plant. 2003. - V.l 19. - P. 56-68.

152. Marguerite J. Varagona,a Robert J. Schmidt,b Raikhelai N. Nuclear Localization Signal(s) Required for Nuclear Targeting of the Maize Regulatory Protein Opaque-2 II The Plant Cell. 1992.-V.4.-P. 1213-1227.

153. Marjamaa K., Kukkola E.M., Fagerstedt K.V. The role of xylem class III peroxidases in lignification II J. of Exp. Botany. 2009. - V. 60. - P. 367-376.

154. Margalit H., Fisher N., Ben-Sasson S.A. Comparative analysis ofstructurally defined heparin binding sequences reveals a distinct spatial distribution of basic residues // J. Biol. Chem. -1993. V.268. - P. 19228-19231.

155. Mayda E., Marques C., Conejero V., Vera P. Expression of pathogen-induced gene can be mimicked by auxin insensitivity // Molecular Plant-Microbe interaction. 2000. - V. 13. - P. 23-31.

156. Medina M.I., Quesada M.A., Pliego F. et al. Expression of the tomato peroxidase gene tpxl in AfaCZ-adapted and unadapted suspension cells // Plant Cell Rep. 1999. - V. 18. - P. 680-683.

157. Minibayeva F., Gorgon L.K., Kolesnikov O.P., Chasov A.V. Role of extracellular peroxidase in the superoxide production by wheat root cells // Protoplasma. 2001. - V. 217. - P.125-128.

158. Minibayeva F., Mika A., Luthje S. Salicylic acid changes the properties of extracellular peroxidase activity secreted from wounded wheat (Tritieum aestivum L.) roots // Protoplasma. 2003. - V. 221. - P. 67-72.

159. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends Plant Sci. 2002. - V.7. - P. 405-410.

160. Mlickovâ K., Luhovâ L., Lebeda A., Mieslerovâ B., Pec P. Reactive oxygen species generation and peroxidase activity during Oidium neolycopersici infection on Lycopersicon species // Plant Physiol. Biochem. 2004. - V.42. -P.753-761.

161. Mohr PG, Cahill DM. Suppression by ABA of salicylic acid and lignin accumulation and the expression of multiple genes, in Arabidopsis infected with Pseudomonas syringae pv. tomato II Functional Integrative Genomics. 2007. -V. 7.-P. 181-191.

162. Moore J.P., Paul N.D., Whittaker J.B., Taylor J.E. Exogenous Jasmonic acid mimics herbivore-induced systemic increase in cell wall boundperoxidase activity and reduction in leaf expansion // Functional Ecology. 2003. -V.17. - P.549-554.

163. Mur et al. The outcomes of concentration-specific interactions between salicylate and jasmonate signaling include synergy, antagonism, and oxidative stress leading to cell death // Plant Physiol. 2006. - V. 140. - P. 249262.

164. Nanda A.K., Andrio E., Marino D., Paulu N., Dunand C. Reactive oxigen species during plant-microbe early interaction // J. Integr. Plant Biology. -2010.-V 52.-P. 195-204.

165. Napier R. Plant Hormone Binding Sites // Ann. of Botany. 2004. -V.93. - P.227-233.

166. Obinger C, Regelsberger G, Furtmuller PG, Jakopitsch C, Ruker F, Pircher A, Peschek GA. Catalase-peroxidases in cyanobacteria—similarities and differences to ascorbate peroxidases // Free Radical Research. 1999. - V.31. - P. 243-249.

167. Oita S, Kameyama M, Nagata T. Binding of barley and wheat alpha-thionins to polysaccharides // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. - V. 64. - P. 958-964.

168. Okazaki Y., Isobe T., Iwata Y., et al. Metabolism of avenanthramide phytoalexins in oats //Plant J. 2004. - V. 39. - P. 560-565.

169. Okuma E., Murakami Y., Shimoishi Y. et al. Effects of exogenousapplication of proline and betaine on the growth of tobacco cultured under saline conditions // Soil Sci. Plant Natur. 2004. - V. 50. - P. 1301-1305.

170. Orozco-Cardenas M.L., Narvaez-Vasquez J., Ryan C.A. Hydrogen Peroxide Acts as a Second Messenger for the Induction of Defense Genes in Tomato Plants in Response to Wounding, Systemin, and Methyl Jasmonate // Plant Cell. 2001. - V. 13. - P. 179-191.

171. Osmond R.I.W., Harmoval M., Fontaine F. et al. Binding interactions between barley thaumatin-like proteins and (l,3)-b-D-glucans. Kinetics, specificity, structural analysis and biological implications // Eur. J. Biochem. -2001.-V.268.-P.4190-4199

172. Ostergaard L., Teilum K., Mirza O. et al. Arabidopsis ATP A2 peroxidase. Expression and high-resolution structure of a plant peroxidase with implications for lignification // Plant Mol. Biology. 2000. - V. 44. - P. 231-243.

173. Otte O., Barz W. Characterization and oxidative in vitro cross-linking of an extensin-like protein and a proline-rich protein purified from chickpea cell walls //Phytochem. 2000. - V. 53. - P. 1-5.

174. Park S.Y., Ryu S.H., Kwon S.Y. et al. Differential expression of six novel peroxidase cDNAs from cell cultures of sweetpotato in response to stress-// Mol. Gen. Genomics. 2003. - V. 269. - P. 542-552.

175. Passardi F., Longet D., Penel C., Dunand C. The class III peroxidase multigenic family in rice and its evolution in land plants. // Phytochemistry. 2004. - V. 65. - P. 1879-1893.

176. Passardi F., Bakalovic N., Teixeira F.K., Pinheiro-Margis M., Penel C., Dunand C. Prokaryotic origins of the peroxidase superfamily and organellarmediated transmission to eukaryotes // Genomics. 2007. - V. 89. - P. 567-579.

177. Passardi F., Penel C., Dunand C. Performing the paradoxial: how plant peroxidases modify the cell wall // Trends Plant Science. 2004. - V.9. - P. 534-540.

178. Passardi F, Bakalovic N, Teixeira FK, Pinheiro-Margis M, Penel C, Dunand C. Prokaryotic origins of the peroxidase superfamily and organellarmediated transmission to eukaryotes I I Genomics. 2007. - V. 89. - P. 567-579.

179. Penel C., Cutsem Van P., Greppin H. Interactions of plant peroxidase with oligogalacturonides in the presence of calcium ions // Phytochemistry. 1999. - V. 51. - P. 193-198.

180. Penel C., Dunand C. Signaling via Plant Peroxidase // Signaling in plants. Signaling and communication in plants / Eds. Baluska F., Mancuso S. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2009. - P. 155-171.

181. Piontek K., Smith A.T., Blodig W. Lignin peroxidase structure and function // Biochem. Soc. Transactions. 2001. - V.29. - P.l 11-116.

182. Quan L.-J., Zhang B., Shi W.-W., Li H.-Y. Hydrogen peroxide in plants: a versatile molecule of the reactive oxygen species network // J. Integ. Plant Biology. 2008. - V.50. - P. 2-18.

183. Quiroga M., Guerrero C., Botella M.A., Barcelo A., Amaya I., Medina M.I., Alonso F.J., Milrad de Forchetti S., Tigier H., Valpuesta V. A Tomato Peroxidase Involved in the Synthesis of Lignin and Suberin // Plant Physiol.2000.-V. 122.-P. 1119-1127.

184. Quiroz-Figueroa F., Mendez-Zeel M., Larque-Saavedra A., Loyola-Vargas V. M. Picomolar concentrations of salicylates induce cellular growth and enhance somatic embryogenesis in Coffea arabica tissue culture // Plant Cell Rep.2001.-V. 20.-P. 679-684.

185. Ralph J., Bunzel M., Marita J.M., Hatfield R.D., Lu F., Kim H., Schatz P.F., Grabber J.H., Steinhart H. Peroxidase-dependent cross-linking reactions of p-hydroxycinnamates in plant cell walls // Phytochem. Reviews. -2004. V. 3.-P. 79-96.

186. Ramonell KM., Zhang B., Ewing R. M., Chen Y., Xu D., Stacey G., Sommervile S. Microarray analysis of chitin elicitation in Arabidopsis thaliana II

187. MoL Plant Pathol. 2002. - V.3. - P. 301-311.

188. Ranieri A., Castangna A., Pacini J. et al. Early production and scavenging of hydrogen peroxide the apoplast of sunflower plants exposed to ozone // J. Exp. Botany. 2003. - V. 54. - P. 2529-2540.

189. Repka V. The glycosylation status and the role of carbohydrate moieties in the heterogeneity of cucumber anionic virus-inducible peroxidase // Acta Virol. 2000. - V. 44. - P. 249-257.

190. Ruebelt M., Tracey L., Jon R., James S., Penna D., Engel K., Jany D. Application of two-dimensional gel electrophoresis to interrogate alterations in the proteome of gentically modified crops // J. Agric. Food Chem.- 2006.-V. 54.-N6.-P. 2169-2177.

191. Ruiz-Duenas F.J., Camarero S., Perez-Boada M., Martinez M.J., Martinez A.T. A new versatile peroxidase from Pleurotus // Biochem. Soc. Trans. -2001.-V. 29.-P. 116-122.

192. Ruley A.T., Sharma N.C., Sahi S.V. Antioxidant defense in a lead accumulating plant Sesbania drummondii // Plant Physiol. Biochem. 2004. -V.42. - P.899-906.

193. Ricoux R., Lukowska E., Pezzotti F., Jean-Pierre M. New activities of a catalytic antibody with a peroxidase activity Formation of Fe(II)-RNO complexes and stereoselective oxidation of sulfides // Eur. J. Biochem. 2004. - V. 271. - P. 1277-1283.

194. Sarkar P., Bosneaga E., Auer M. Plant cell walls throughoutevolution: towards a molecular understanding of their design principles // J. Exp. Botany. 2009. - V. 60. - P. 3615-3635.

195. Sarowar S., Kim E.N., Kim Y.J., Ok S.H., Kim K.D., Hwang B.K., Shin J.S. Overexpression of a pepper ascorbate peroxidase-like 1 gene in tobacco plants enhances tolerance to oxidative stress and pathogens // Plant Science. -2005. V.169.-P. 55-63.

196. Sasaki K., Iwai T., Hiraga S., et al. Ten rice peroxidases redundantly respond to multiple stresses including infection with rice blast fungus // Plant and Cell Physiology. 2004. - V.45. - P. 1442-1452.

197. Sasaki K., Yuichi O., Hiraga S., Goton Y., Seo S., Mitsuhara I., Ito H., Matsu H., Ohashi Y. Characterisation of two rice peroxidase promoters that respond to blast fungus-infection // Mol. Genet. Genomics. 2007. - V. 278. - P. 709-722.

198. Savitsky P.A., Gazaryan I.G., Tishkov V.I. et al. Oxidation of indole-3-acetic acid by dioxygen catalyzed by plant peroxidases: specificity for theenzyme structure // Biochem J. 1999. - V.340. - P. 579-583.

199. Shigeoka S., Ishikawa T, Tamoi M, Miyagawa Y, Takeda T, Yabuta Y, Yoshimura K. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes //J. Exp. Botany. 2002. - V.53. - P. 1305-1319.

200. Siegel S.M. Non enzymic macromolecules as matrices in biological synthesis. The role of polysaccharides in peroxidase catalyzed lignin polymer formation from eugenol // J. Amer. Chem. Soc. - 1957. - V.79. - P. 1628-1632.

201. Sukalovic V., Vuletic M., Vucinic Z. Plasma membrane-bound phenolic peroxidase of maise roots: in vitro regulation of activity with NADH and ascorbate //Plant Sci. 2003. - V. 165. - P. 1429-1435.

202. Takasaki S., Kato Y., Murata M., Homma S., Kawakishi S. Effect of peroxidase and hydrogen peroxide on the dityrozine formation and the mixing characteristics of wheat-fliour drough // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005. - V. 69.-P. 1686-1692.

203. Teixeira FK, Menezes-Benavente L, Margis R, Margis-Piriheiro Mi-Analysis of the molecular evolutionary histoiy of the ascorbate peroxidase gene family: inferences from the rice genome // J. Mol. Evol. 2004. - V.59. - P.761— 770.

204. Tieman D.M., Handa A.K. Reduction in pectin methylesterase activity modifies tissue integrity and caution levels in ripening tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) fruits // Plant Physiol.-1994.-V.106.-P. 429-436:

205. Thipyapong P., Stout M., Attajarusit J. Functional Analysis of Polyphenol Oxidases by Antisense/Sense Technology // Molecules.- 2007. V. 12(8).-P. 1569-1595

206. Thordal-Christensen H., Zang Z., Wei Y., Collinge D. Subsellular localization of H202 in plants. H202 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley powdery mildew interaction // Plant J. - 1997. — V. 11 --P. 1187-1194.

207. Tian M., Gu Q., Zhu M. The involvement of hydrogen peroxide andantioxidant enzymes in the process of shoot organogenesis of strawbery callus // Plant Sci. 2003. - V. 165. - P. 701-707.

208. Tognolli M., Penel C., Greppin H., Simon P. Analysis and expression of the class III peroxidase large gene family in Arabidopsis thaliana II Gene. -2002.-V.28.-P.129-138.

209. Torres M.A., Jones J., Dangl J.L. Reactive Oxygen Species Signaling in Response to Pathogens // Plant Physiology. 2006. - V. 141. - P. 373 - 378.

210. Torres M.A. ROS in biotic interactions II Physiol. Plant. 2010. -V.138. - P.414-429.

211. Travascio P., Bennet A.J, Wang D.Y, Sen D. A ribozyme and a catalytic DNA with peroxidase activity: active sites versus cofactor-binding sites // Chem. Biology. 1999. - V.6. - P. 79-787.

212. Van Loon L.C. Rep M., Pieterse C.M.J. Significance of inducible defence-related proteins in infected Plants II Ann. Rev. Phytopathol. 2006. - V 44. - P. 135-162.

213. Veitch N. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme // Phytochemistry. 2004. - V.65. -P.249-259.

214. Veitch N. Structural determinants of plant peroxidase function II Phytochemistry. -2004. V. 3. - P. 3-18.

215. Ueeda M., Kubota M., Nishi K. Contribution of jasmonic acid to resistance against Phytophthora blight in Capsicum annuum cv. SCM334 // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2006. - V.67. - P.149-154.

216. Wagner V., Matthysse A.G. Involvement of a vitronectin-like protein in attachment of Agrobacterium tumefaciens to carrot suspension culture cells // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 5999-6003.

217. Wallace G., Fry S.C. Action of diverse peroxidases and laccases on six wall-related phenolic compounds // Phytochemistry. 1999. - V. 52. - P. 769773.

218. Wang H., Cai R., Lin Z. Study and application of perturbation of peroxynitrite on peroxidase-oxidase oscillation // Talanta. 2006. - V. 69. - P.509

219. Welinder K.G., Justesen A.F., Kjaersgard I.V., Jensen R.B., Rasmussen S.K., Jespersen H.M., Duroux L. Structural diversity and transcription of class III peroxidases from Arabidopsis thalicina. 11 Eur. J. Biochem. 2002. -V.269. - P. 6063-6081.

220. Wyrwicka A., Sklodowska M. Influence of repeated acid rain treatment on antioxidative enzyme activities and on lipid peroxidation in cucumber leaves // Envir. Exp. Botany. 2006. - V.56. - P. 198-204.

221. Yabuta Y., Motoki T., Yoshimura K. et al. Thylakoid membrane-bound ascorbate peroxidase is a limiting factor of antioxidative systems under photo-oxidative stress // Plant J. 2002. - V. 32. - P. 915-925.

222. Yan Y., Stolz S., Chetelat A., Reymond P., Pagni M., Dubugnon L., Farmer E.E. A Downstream Mediator in the Growth Repression Limb of the Jasmonate Pathway // Plant Cell. 2007. - V. 19. - P. 2470-2483.

223. Yang Y., Anderson E.J. Antimicrobial activity of a porcine myeloperoxidase against plant pathogenic bacteria and fungi // J. Applied Microbiology. 1999. - V. 86. - P. 211-220

224. Yannarelli G.G., Gallego S.M., Tomaro M.L. Effect of UV-B radiationon the activity and isoforms of enzymes with peroxidase activity in sunflower cotyledons. // Environ. Exp. Bot. 2006. V. 56. - P. 174-181.

225. Ye X.Y., Ng T.B. Isolation of novel peroxidase from Franch bean legumes and first demonstration of antifungal activity of non-milk peroxidase // Life Science. 2002. - V. 71. - P. 1667-1680.

226. Yokoyama R, Nishitani K. Identification and characterization of Arabidopsis thaliana genes involved in xylem secondary cell walls. // J. Plant Research. 2006. - V. 119. - P. 189-194.

227. Yoshida K. Kaothien P., Matsui T., Kawaoka. A., Shinmyo A. Molecular biology and application of plant peroxidase genes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V.60. - P. 665-670.

228. Zamocky M. Phylogenetic relationships in class I of the superfamilyof bacterial, fungal and plant peroxidases 11 Eur. J. Biochem. 2004. - V. 271. - P. 3297-3309.

229. Zhao H., Wang B.C., Zhao H.C., Wang J.B. Stress stimulus induced resistance to Cladosporium cucumerinum in cucumber seeding // Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 2005. - V.44. - P.36^10.

Информация о работе

Кузьмина, Ольга Ильинична
кандидата биологических наук
Уфа, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Структурно-функциональный анализ полисахарид-связывающего домена пероксидазы пшеницы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы