Исследование активного центра и механизма действия пероксидазы с помощью функционально активных веществ

Рогожина, Татьяна Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование активного центра и механизма действия пероксидазы с помощью функционально активных веществ
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование активного центра и механизма действия пероксидазы с помощью функционально активных веществ"

На правах рукописи

Рогожина Татьяна Васильевна

Исследование активного центра и механизма действия пероксидазы с помощью функционально активных веществ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов 2005

Работа выполнена в лаборатории исследования биологически активных веществ Якутской государственной сельскохозяйственной академии

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Рогожин Василий Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, с.н.с

Антонюк Людмила Петровна

кандидат химических наук, с.н.с Попов Архип Алексеевич

Ведущая организация: Российский государственный аграрный

университет - МСХА имени К.А. Тимирязева

Защита состоится 15 февраля 2006 г. в 13й® часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу: 410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13, ИБФРМРАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан « Ж » 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н В.Е. Никитина

2IV(Ш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Для активной жизнедеятельности растениям и животным необходим кислород. Основное количество кислорода расходуется на выработку энергии и участие в окислительном метаболизме. Однако, небольшая его часть около 2% может переходить в активные формы кислорода (АФК): 02~, Н202, НО-, НОС1 и др. (Т-Ыш й а!., 1989). Для защиты от их разрушительного действия используются компоненты антиоксидантной системы, среди которых высокомолекулярные (СОД, каталаза, пероксидаза) и низкомолекулярные (аскорбиновая кислота, гидрохинон, стероиды, флавоноиды и др.) антиоксиданты. Интенсивность аэробных процессов может быть оценена по активности пероксидазы, которая катализирует реакции оксидазного и пероксидазного окисления неорганических и органических соединений (Рогожин, Курилюк, 1998). Последними могут быть функционально активные вещества (ИУК, гидрохинон, аскорбиновая кислота, НАДН, фенотиазины), способные участвовать в оксидазных и пероксидазных реакциях, катализируемых пероксидазой. Среди этих веществ следует выделить антиоксиданты, которые способны подавлять образование свободных радикалов, понижая таким образом уровень ПОЛ в клетках живых организмов.

Таким образом, между пероксидазой и антиоксидантами должна наблюдаться взаимная зависимость, которая недостаточно изучена. Механизм действия пероксидазы в реакциях пероксидазного окисления достаточно сложен. Реакция инициируется перекисью водорода, в результате которой образуются окисленные формы фермента (Е1 и Е2).

Е + Н202 -> Е1 Е] + АН2 -» Е2 + АН Е2 + АН2 Е + АН В восстановлении фермента участвуют соединения, являющиеся донорами водорода и донорами электронов.

органических субстратов. Таким образом, при пероксидазном окислении органических субстратов реализуется периферийные механизмы переноса электронов (Лебедева и др., 1996) и активный центр фермента в этом случае включает функциональные группы белка. Причины широкой субстратной специфичности пероксидазы объясняются тем, что на поверхноои белка реализуются несколько различных каналов электронного транспорта с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы на железо гема (Угарова и др., 1984).

В реакциях совместного окисления субстратов наблюдается активация или ингибирование окисления одного субстрата другим, а в реакциях совместного окисления быстро и медленно окисляемых субстратов, наблюдается активация медленно окисляемого субстрата и частичное или полное ингибирование превращения быстро окисляемого субстрата (Угарова и др., 1981).

В литературе приводятся данные об активации оксидазного окисления некоторых субстратов пероксидазы (НАДН и ИУК) в присутствие ряда фенолов (1еп й а1., 1971; БаЛсишаг е1 а!., 1994; Ноп й а1., 1994). Отмечается, что механизмы субстрат-субстратной активации различаются для разных субстратов. Так, для р-крезола и аскорбиновой кислоты и люминола и замещенных фенолов методами спектроскопии ЭПР показано, что активация происходит за счет неферментативных процессов. Тогда как в реакции совместного окисления ферроцианида калия и о-дианизидина предложено, что частицей, эффективно окисляющей ферроцианид, является не свободный радикал о-дианизидина, комплекс пероксидазы с полуокисленным субстратом.

Поэтому механизмы совместного окисления соединений в присутствии пероксидазы во многом зависят от структуры субстратов и способны активно реализовываться в биогенных системах. Знание этих механизмов позволит расширить наши представления о функционировании сложных систем и позволит объяснить многие эффекты действия функционально активных веществ. Поэтому актуальность и значимость изучения строения активного центра пероксидазы и протекание механизмов пероксидазного окисления субстратов, реализуемых в реакциях индивидуального и совместного окисления позволили нам сформулировать цель и задачи данной работы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучить строение активного центра, механизмы действия пероксидазы в реакциях совместного окисления субстратов и предложить возможности использования выявленных механизмов в биогенных системах.

В этой связи необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние индолил-3 - уксусной кислоты на реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и выявить механизмы регуляторного действия.

2. Изучить механизмы действия индолил-3 -уксусной кислоты на пероксидазные реакции быстро окисляемых субстратов (о-дианизидин и гидрохинон) и проявить места связывания этих субстратов в области активного центра пероксидазы.

3. Исследовать реакции пероксидазного окисления фенотиазинов и предложить механизмы их участия в этих реакциях.

4. Изучить реакции совместного окисления фенотиазинов с о-дианизидином и выявить проявления их индивидуальных свойств в этих реакциях.

5. Установить роль строфантина в реакциях пероксидазного окисления фенотиазинов и о-дианизидина.

6 Выявить влияние аскорбиновой кислоты и сердечных гликозидов в дрорастании семян и установить регуляторную роль пероксидазы в этом процессе.

Научная новизна. Исследования влияния ИУК на реакции пероксидазного окисления АК позволили установить, что ауксин ингибирует фермент по конкурентному типу при связывании в активном центре фермента одной молекулы аскорбиновой кислоты. Тогда как в реакциях пероксидазного окисления АК с участием двух и более молекул субстрата ИУК проявляла неконкурентный характер ингибирования. Предложено, что местом связывания АК в активном центре фермента является дистальная область. Изучение реакций совместного пероксидазного окисления о-дианизидина, гидрохинона и ферроцианида калия в присутствии индолил-3-уксусной кислоты позволило высказать предположение, что преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы является гидрофобная область. Тогда как для гидрохинона местом связывания является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков.

Впервые изучены пероксидазные реакции окисления фенотиазинов (хлорпромазина, трифтазина и тиопроперазина). Показано, что они являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы. Предложено, что при совместном окислении о-дианизидина и различных фенотиазинов, фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата, выбор которых определяется доступностью функциональных групп субстрата каналам переноса электронов на поверхности белковой глобулы. Установлено, что в реакциях индивидуального и совместного окисления в действии пероксидазы реализуются сложные регуляторные механизмы, обеспечивающие протекание каталитического процесса. Причем фермент, не проявляющий избирательность по отношению природы окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, приобретает избирательность в реакциях совместного окисления.

Предложено, что выявленные эффекты влияния ИУК на пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты, катализируемое пероксидазой, имеют важное биологическое значение. ИУК может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемого субстрата, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра пероксидазы. По-видимому, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина, служить оксидазным субстратом фермента. При этом ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на

другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы.

Исследования механизмов пероксидазного окисления фенотиазинов позволило высказать предположения о возможных сроках нахождения фенотиазинов в организме человека, а также дать предположительную оценку эффективности их действия. Среди изученных фенотиазинов выраженное седативное действие трифтазина можно объяснить за счет того, что поскольку он в присутствии быстро окисляемого субстрата не окисляется пероксидазой, то он должен дольше сохранять свое функциональное действие. Быстрее всех в организме может окисляться хлорпромазин и его действие должно быть за счет этого непродолжительным. Кроме этого обосновано действие фенотиазинов в присутствии строфантина G при их совместном использовании. Поскольку строфантин G ускоряет окисление тиопроперазина, то при их совместном введении пероксидазное окисление тиопроперазина будет возрастать, что приведет к образованию различных продуктов его окисления и к быстрой потере фармакологического действия. Тогда как пероксидазное окисление трифтазина и хлорпромазина в присутствии строфантина G будет замедляться, обеспечивая, таким образом, пролонгированность действия вводимых препаратов.

Защищаемые положения. 1. В области активного центра фермента имеется обширная субстратсвязывающая площадка, в составе двух специализированных участков связывания субстратов, в действии которых принимают участие две функциональные группы с pKi~5,0 и рК2~6,5. 2. В действии пероксидазы заложены сложные регуляторные механизмы, позволяющие ферменту инициировать процесс пероксидазного окисления широкого спектра субстратов, а в механизмах совместного окисления использовать способы регулирования, ускоряя каталитический процесс за счет улучшения связывания окисляемого субстрата или с участием в окислении комплекса фермента с полуокисленным субтратом. 3. Пероксидаза и антиоксиданты (аскорбиновая кислота и стероидные гликозиды) принимают непосредственное участие в механизмах формирования гипобиотических состояний и ответственны за поддержание высокой жизнеспособности семян.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных, всероссийских конференциях: На научно-практической конференции Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (Москва, 1999), IX Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002" (Москва, 2002), 6-ой, 7-ой, 8-ой и 9-ой Пущинеких школах-конференциях молодых ученых "Биология - Наука 21-го века" (Пущино, 2002, 2003, 2004, 2005), Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии" (Москва, 2002), 1-ой Международной школе-конференции молодых ученых по катализу "Каталитический дизайн - от исследований на молекулярном уровне к практической реализации" (Новосибирск, 2002), 3-ей и 4-ой Международных конференциях "Актуальные проблемы современной науки (Самара, 2002, 2003), VIII Международной научной

экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивое! и живых систем». (Белгород, 2004), III Всероссийской научной молодежной конференции «Под знаком I». (Омск, 2005), Международной научно-практической конференции «Молодежь и медицинская наука в XXI веке». (Киров, 2005), Международной научной конференции студентов, аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005». (Москва, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, в том числе 2 монографии (в соавторстве), 6 статей, 20 тезисов.

Объем и структура работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 174 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц, 30 рисунков, а также список цитируемой лшерачуры из 259 наименований. Диссертация состоит из введения, разделов, заключения, выводов

Список используемых сокращений. АО-антиоксиданты, АК - аскорбиновая кислота, ИУК - индолил-3-уксусная кислота, ОДН - о-дианизидин, ГХ -гидрохинон, ФК - ферроцианид калия, АОС - антиоксидантная система, ПО -пероксидаза, СГ - сердечные (стероидные) гликозиды. СФ - строфантин, ХП -хлорпромазин, ТП - тиопроперазин, ТФ - трифтазин.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами исследований служили различные по происхождению семена пшеницы (ТгШсит аехНуит Ь.) и другие, выращенные в разные годы в условиях Республики Саха (Якутия) (опытные поля ИБПК СО РАН и Якутского НИИСХ).

Влажность, всхожесть, жизнеспособность семян определяли по методам Гостстандартов СССР: всхожесть - ГОСТ 12038 - 66; жизнеспособность - ГОСТ 12039-66; сила роста - ГОСТ 12040-66; влажность - ГОСТ 12041-66. Жизнеспособность семян исследовали тетразольно - топографическим методом.

Семена пшеницы {ТгШсит ае$П\'ат Ь.) и ячменя (Ногс1еит Ь.) предварительно замачивали в растворах БАВ в течение 24 ч, а затем проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри. Число семян в одной чашке - 100, число повторностей в каждом варианте - 4, число опытов - 4.

Концентрацию пероксидазы определяли спектрофотометрически по поглощению при 403 нм (8=102 мМ"1 см'1 (0£е\уа й а1., 1979) или с использованием пиридингемохромогена (Ра1к, 1964).

Активность пероксидазы определяли при 22°С по начальной скорости окисления в их присутствии о-дианизидина перекисью водорода (Лебедева и др., 1977). К 2,1 мл 0,01 М Ыа-фосфатного буфера, содержащего 0,1 М К"Ы03 (рН 7,0), добавляли 0,2 мл 5 нМ раствора пероксидазы и 0,1 мл 0,43 мМ о-дианизидина в 96%-ном этаноле. Реакцию инициировали введением 0,1 мл 16 мМ Н202. Окисление о-дианизидина регистрировали по увеличению поглощения раствора при 460 нм (е=30 мМ"1 см'1). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль о-дианизидина за 1 мин.

Реакцию окисления АК (2,2-352,0 мкМ) и гидрохинона (1,0-1,6 мМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 25°С в среде 0,1 М натрий-ацетатного, рН 4,0-6,0, или натрий-фосфатного, рН 6,0-8,0, буферов, в

присутствии пероксидазы хрена. Окисление АК регистрировали по уменьшению поглощения при 265 нм, е=7,0 мМ"1 см'1 (Досон и др., 1991), а гидрохинона при 290 нм, е=2,2 мМ"1 см"1. За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль субстрата (аскорбиновой кислоты или гидрохинона)за 1 мин.

Спектральные измерения выполняли на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы "Varian" (США). Кажушиеся константы скорости реакций окисления субстратов пероксидазы определяли из данных по стационарной кинетике (Березин, Клесов, 1976). При расчете каталитических констант использовали пакет прикладных программ по анализу и обработке кинетических данных ферментативных реакций. Все полученные количественные результаты подвергнуты статистической обработке с учетом критерия Стьюдента при р<0,05-0,01. Статистическую ошибку средней определяли по методике (Лакин, 1990), используя 111111 Снедекор V2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Регулирование реакций пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты с помощью индолил-3-уксусной кислоты

Известно, что окисление ИУК пероксидазой протекает через образование тройного комплекса фермент-ИУК-кислород. Исследования механизма окисления ИУК пероксидазой показали, что на поверхности белковой глобулы должен располагаться участок связывания ауксина [Metodiewa et al., 1992; Park, Park, 1987; Pieres et al, 1992], который может находиться в составе дистального домена фермента [Савицкий и др., 1998]. При этом считается, что активную роль в катализе пероксидазы принимает участие остаток Тгр-117, удаленный на 8-9 А от атомов азота порфиринового цикла, т.е. находящегося в зоне туннелирования электронов. При этом субдомен, включающий структурно сходные участки в дистальном домене пероксидазы, формируется в направлении от активного центра к поверхности дистального домена, противоположной входу в активный центр.

Исследование влияния ИУК на реакции пероксидазного окисления АК позволило установить, что ауксин ингибирует фермент по конкурентному типу при связывании в активном центре фермента одной молекулы аскорбиновой кислоты (рис. 1 ,а). Тогда как в реакциях пероксидазного окисления АК с участием двух и более молекул субстрата ИУК проявляла неконкурентный характер ингибирования (рис. 1,6). Связывание ИУК с пероксидазой в реакциях конкурентного ингибирования достаточно прочное и составляет 5,4-20,5 мкМ, что соизмеримо с величинами констант связывания аскорбиновой кислоты и о-дианизидина. В реакциях неконкурентного ингибирования ИУК связывается с пероксидазой в 3,2-10,2 раза лучше, чем связывание второй молекулы АК. При этом величины констант ингибирования в реакциях неконкурентного ингибирования при рН 4,5-7,0 для ИУК равны 27,3-34,6 мкМ.

Таким образом, используя ИУК можно предположить место локализации участка связывания молекул аскорбиновой кислоты в активном центре

Mv, мин чкМ1 а 4 1/V, мин мкМ 1 6

Рис 1. Зависимое ш обратных начальных скоростей пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты при рН 5,0 (а) и 7,0 (б) от ее концентрации при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ' 1-0, 2-5, 3-10, 4-15. Концентрации: а)пероксидаза-99 нМ, аскорбиновая кислота - 3,65-9,12 мкМ; б) пероксидаза -142 нМ, аскорбиновая кислота - 22,8-91,2 мкМ

пероксидазы. По-видимому, таким участком является дистальная область активного центра фермента. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, когда в активном центре фермента связывается, по крайней мере, одна молекула субстрата. При связывании двух и более молекул аскорбиновой кислоты с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления аскорбиновой кислоты, что, возможно, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата.

Влияние индолил-3-уксусной кислоты на реакции пероксидазного окисления быстро окисляемых субстратов

Ранее проведенные исследования показали, что центр связывания ИУК может располагаться вдали от активного центра пероксидазы [Савицкий и др., 1998]. Причем оксидазное окисление ИУК может возрастать в присутствии гидрофобных аминокислот, тогда как полярные аминокислоты почти не оказывают влияние на каталитический процесс оксидазного окисления ауксина. Установлена прямая корреляция между гидрофобностью аминокислот и степенью их влияния на скорость окисления ИУК [Park, Parie, 1987].

Проведенное нами изучение реакций совместного пероксидазного окисления о-дианизидина, гидрохинона и ферроцианида калия в присутствии индолил-3-уксусной кислоты позволило установить следующие закономерности. Ауксин ингибирует пероксидазу в реакции окисления о-дианизидина по конкурентному типу (рис. 2), тогда как в реакциях окисления гидрохинона при кислых значениях рН проявлялся неконкурентный характер ингибирования (рис. 3), переходящий при рН>6,5 в смешанный тип. Присутствие ауксина не влияло на пероксидазное окисление ферроцианида калия.

1Л>, мин мкМ'

1/ОДН, мМ'1

Рис. 2. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления о-дианизидина от его концентрации, в двойных обратных координатах, при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-10, 3-20, 4-30; пероксидаза - 0,56 нМ, перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7.

1/ГХ, мМ1

Рис 3. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления гидрохинона от его концентрации, в координатах Лайнуи-вера-Берка, при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-20, 3-40, 4-60; пероксидаза - 4,0 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М иатрий-ацетатный буфер, рН 5.

Конкурентный тип ингибирования реакции пероксидазного окисления о-дианизидина ИУК позволяет предположить, что о-дианизидин и индолил-3 -уксусная кислота связываются в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связываются в различных местах активного центра, однако, если индолил-3-уксусная кислота связывалась на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становится невозможным. Это наблюдается вследствие удаленности мест связывания эффектора и субстрата или в результате конформационных изменений глобулы фермента при связывании ингибитора. Причем при рН 4,5-6,5 тип ингибирования неконкурентный, однако при увеличении рН он меняется и становится смешанным. При этом величина а увеличивалась (а>1), а (3 уменьшалась ((5<1). Изменение этих постоянных характеризует ухудшение связывания субстрата в 2,8-4,2 раза, т.е. при наличии ИУК происходило понижение сродства гидрохинона к активному центру фермента. Однако, если все-таки гидрохинон связался в активном центре, то дальнейшее его превращение ухудшалось в 1,7-5,3 раза. Связывание ИУК с пероксидазой зависело от рН среды. Так в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина величина К, при рН 4,5-7,0 изменялась в диапазоне от 9,6 до 0,72 мкМ, т.е. с возрастанием рН сродство ингибитора к ферменту повышалось в 13,3 раза. Тогда как в реакциях окисления гидрохинона величина К„ в этом же диапазоне рН изменялась от 113 до 17 мкМ, т.е. константа ингибирования понижалась в 6,6 раза. При этом эффективность связывания ИУК с пероксидазой, например, при рН 4,5 и 7,0 лучше связывания о-дианизидина в 4,2

с'

рН

^^„.с'М"

рН

Рис. 4. рН-Зависимости (а) и ^(ксм/К-ш) (б) для реакций пероксидазного окисления

аминазина (1, Г) и ферроцианида калия (2, 2'). Пунктирная кривая рассчитана с использованием значений рКа=6,0, (кЧМ1/Кт)|1т=4,75 1 05 М 'сек"1

и 20,8 раз, а гидрохинона - 5,8 и 8,8 раз соответственно. В реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина связывание ИУК с ферментом при рН 4,5 и 7,0 было в 11,8 и 23,6 раза соответственно эффективнее, чем в реакциях окисления гидрохинона. По-видимому, на сродство ингибитора к ферменту оказывает влияние природа субстрата. Поэтому, преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы, по-видимому, должна быть гидрофобная область. Тогда как для гидрохинона местом связывания является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков [Лебедева, Угарова, 1996]. Подтверждением различных мест связывания о-дианизидина и гидрохинона в активном центре пероксидазы служат данные по совместному пероксидазному окислению этих субстратов. На основании полученных данных можно предположить, что ИУК являясь оксидазным субстратом пероксидазы, способна связываться в составе дистального домена активного центра фермента, ингибируя протекание пероксидазных реакций. При этом пероксидаза будет выполнять роль высокоспецифичной оксигеназы ауксина.

Пероксидазные реакции индивидуального и совместного окисления фенотиазинов

Исследование индивидуальных реакций окисления хлорпромазина позволило отнести его к группе медленно окисляемых субстратов пероксидазы (кса измеренная в диапазоне рН 4,5-7,0 понижалась от 114 до 3,5 с'1). При этом связывание хлорпромазина с псроксидазой зависело от рН и составляло 85-270 мкМ. На кривой рН-зависимости и ^(кса/Кт) определялась ионогенная

группа с рКа 6,0 (рис. 4,а и б, кривые 1, 1'). В щелочной области рН связывание хлорпромазина с ферментом в 2,5-3,0 раза лучше, чем в кислой среде. Предложено, что окисление хлорпромазина протекает по одноэлектронному механизму, характерному для пероксидазного окисления неорганических ионов.

Реакции индивидуального пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина характеризовались низкими значениями каталитических

4-1

ГЦ

■о

* 1-

9* л 0-

эр

-1-

-г-5

—г-7

рН

Рис. 5. рН-Зависимости ^кса1 (1), 1§Кт (2) и ^кси/Кщ (3) для реакций пероксидазного окисления трифтазина. Пунктирные кривые рассчитаны с использованием значений

рКа=4,89,

(кс«/К|п)1т>=51,8 10'

кса(1ш1) 129

,4 -1Л '

рКа=5,64,

с М

<N1 " X

У "ж.

я 1 - ы

рН

Рис 6. рН-ЗаВИСИМОСТИ (1), lgkca,/Km

(2) и \gkat (3) для реакций пероксидазного

окисления тиопроперазина. Пунктирные кривые являются теоретическими для рКа=5,43, ксЯ(1,т)=12,9 с1; рКа=4,71,

(к^я/Кт)!,^ 30,5-Ю4 с'М"1.

констант 0,3-124 и 0,12-9,8 с"1 соответственно, что позволяет отнести их к группе медленно окисляемых субстратов перокси-дазы. Величины Кт для трифтазина и тиопроперазина мало различаются и составляют соответственно 10-330 и 22-196 мкМ в зависимости от рН. Значения Кш трифтазина и тиопроперазина при рН>6,0 примерно такие же, как у о-дианизидина.

На кривых рН-зависимостей 1§кС!Л И 1вкса/Кго реакций пероксидазного окисления

трифтазина (рис. 5) и тиопроперазина (рис. 6), определялись ионогенные группы с рК 4,9, 5,6 и 5,4, 4,7 соответственно, депрото-нирование которых ухудшает каталитический процесс пероксидазного окисления соответственно трифтазина в 413 раз, а тиопроперазина в 82 раза.

При значениях рН>6,0 имело место отклонение опытных кривых рН-зависимостей для lgkcatZK.ro от теоретической для реакций пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина, что, возможно, вызвано проявлением действия еще одной ионо-генной группы свободного фермента, принимающей участие в связывании субстрата.

В отличие от хлорпромазина, у трифтазина и тиопроперазина, с увеличением рН значения Кт понижались. В кислых рН (4,5-5,5) трифтазин окислялся быстрее хлорпромазина в 1,5-3 раза и в 9-12 раз эффективнее тиопроперазина. Константа Михаэлиса трифтазина в 2-2,5 раза больше, чем у хлорпромазина и в 1,5-3,5 раза -тиопроперазина. Однако при рН>6,0 величины Кт трифтазина и тиопроперазина

понижались и становились соизмеримы с Кш для быстро окисляемого субстрата пероксидазы - о-дианизидина.

Низкие значения константы скорости окисления фенотиазинов, возможно, как в случае с НАДН и аскорбиновой кислотой, в первую очередь обусловлены тем, что их окисление пероксидом водорода, протекает по одноэлектронному механизму, аналогично окислению неорганических субстратов пероксидазы. Поэтому при совместном окислении о-дианизидина и различных фенотиазинов, фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата, выбор которых определяется доступностью функциональных групп субстрата л каналам переноса электронов на поверхности белковой глобулы. Среди изученных фенотиазинов расположение функциональных групп хлорпромазина, обеспечивает его преимущественное пероксидазное окисление по сравнению с о-^ дианизидином. При этом вначале полностью окислялся хлорпромазин, а затем наблюдалось окисление о-дианизидина.

При рН 4,0-5,5 тиопроперазин и о-дианизидин могли связываться в активном центре пероксидазы. Причем связывание тиопроперазина улучшало последующее связывание о-дианизидина, но замедляло скорость его пероксидазного окисления, что проявляется в антиконкурентном типе ингибирования. Т.е. тиопроперазин способен связываться только с фермент-субстратным комплексом, и не связывается со свободным ферментом. С возрастанием рН (рН>5,5) происходило депротонирование одной из функциональных групп активного центра фермента и это способствовало переключению механизма переноса электронов с донора водорода о-дианизидина, на преимущественное окисление донора электронов -тиопроперазин. Противоположный эффект наблюдался при совместном окислении о-дианизидина и трифтазина. Последний возможно и связывался в активном центре фермента, однако его окисление не происходило, поскольку реализовывался механизм окисления донора водорода - о-дианизидина.

Влияние строфантина в на кинетику пероксидазного окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Ряд соединений, относящиеся к стероидным гликозидам (дигоксин, строфантин и др.), не являются субстратами пероксидазы, так как не способны реагировать с промежуточными окисленными формами фермента (Ь] и Е2). Однако эти соединения обладают антиоксидантным действием. Участие * строфантина О в реакциях пероксидазного окисления медленно и быстро окисляемых субстратов пероксидазы не изучено. Поэтому мы изучили влияние строфантина в на пероксидазное окисление медленно (хлорпромазин, тиопроперазин, трифтазин) и быстро (о-дианизидин) окисляемых субстратов пероксидазы хрена в широком диапазоне рН; предложив возможные механизмы активирования и ингибирования строфантином О пероксидазы в реакциях пероксидазного окисления медленно окисляемых субстратов.

Показано, что строфантин в может связываться в активном центре фермента, влияя на процесс пероксидазного окисления медленно и быстро окисляемых субстратов пероксидазы. Причем проявлялась двойственность его действия в реакциях пероксидазного окисления медленно окисляемых субстратов

пероксидазы. Например, в реакциях окисления тиопропе-разина строфантин в активировал окисление. При этом тип активирования зависел от рН, проявляясь при рН 5,0-6,0 в бесконкурентном харак-тере (рис. 7,а), тогда как возрастание рН приводило к смене типа активирования с бесконкурентного типа на смешанный (рис. 7,6), что, возможно, связано с участием в этом процессе одной из функциональных групп активного центра фермента или белка с рК~6,0. При рН 5,0-6,0 отмечалось наиболее эффективное связывание строфантина в в активном центре пероксидазы, что приводило к ускорению пероксидазного окисления тиопроперазина, проявляемое в бесконкурентной активации. При рН>6,0 связывание активатора ухудшалось, однако его присутствие в активном центре улучшало последующее связывание тиопроперазина повышая эффективность каталитического превращения.

Несколько иное действие проявлял строфантин в в реакциях пероксидазного окисления хлорпромазина, трифтазина и о-дианизидина.

Строфантин в ингибировал пероксидазное окисление хлорпромазина при рН 5,0-6,0, влияя как на связывание субстрата, так и на его превращение. Тогда как депротонирование функциональной группы активного центра фермента с рК~6,0 приводило к изменению характера ингибирования со смешанного типа на конкурентный (рис. 8,а,б). При этом можно отметить, что связывание строфантина в в активном центре пероксидазы замедляло реакции пероксидазного окисления хлорпромазина, а депротонирование одной из функциональных групп активного центра фермента приводило к тому, что связывание ингибитора затрудняло последующее связывание субстрата.

Таким образом, строфантин в и хлорпромазин при рН>6,0 могут конкурировать за место связывания в активном центре фермента, при этом связывание ингибитора препятствует последующему связыванию субстрата, что и

l/v-10"5. мни М"1 а

1/ТП КГ4, М"'

VvlO \ мин М 1 б

1/ТИ 10-', м'

Рис 7. Зависимости обратных начальных скоростей окисления тиопропера-зина при различных концентрациях строфантина G: 0(]), 8,6(2), 17,2(3), 25,8 мкМ(4); концентрация Н2Ог 0,64' мМ; а - ОД М натрий-ацетатный буфер, рН 5, 19 нМ пероксидаза; б -0,1 М трис-HCl буфер, рН 7, 280 нМ пероксидаза.

1/ХП 10J. VI' 1/xri ю4, м1

Рис. 8. Зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления аминазина при различных концентрациях строфантина G: 0(1), 8,6(2), 17,2(3), 25,8 мкМ(4); концентрация Н202 0,64 мМ; а - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5, 24 нМ пероксидаза; б - 0,1 М Tris-HCl буфер, рН 7, 47 нМ пероксидаза.

приводит к понижению скорости ферментативной реакции. Несколько иной тип ингибирования проявлял строфантин G в реакциях пероксидазного окисления трифтазина. При кислых значениях рН строфантин G связывался вблизи активного центра фермента, не влияя на связывание субстрата, что проявлялось в неконкурентном характере ингибирования (рис. 9,а). Депротонирование одной из функциональных групп активного центра пероксидазы с рК~6,0 резко ухудшало каталитическое превращение трифтазина, понижая kcat в 10-23 раза. Хотя при этом Кт улучшалось в 2,7-6,0 раз. По-видимому, заряд этой ионогенной группы может оказывать влияние на расположение строфантина G в активном центре фермента, что приводит к смене характера ингибирования с неконкурентного на смешанный (рис. 9,6). Показано, что строфантин G ингибирует пероксидазу в реакциях окисления о-дианизидина по антиконкурентному типу (рис. 10). При этом ингибитор связывался с фермент-субстратным комплексом, а не со свободным ферментом. Связывание строфантина G в активном центре фермента в реакциях окисления фенотиазинов и о-дианизидина несколько различалось. При кислых значениях рН строфантин G эффективнее связывался с пероксидазой в реакциях пероксидазного окисления тиопроперазина, тогда как при окислении

1/1Ф 10й, М*1 1/ТФ1Г.М'

Рис 9. Зависимости обратных начальных скоростей окисления трифтазина при различных концентрациях строфантина О: 0(1), 8,6(2), 17,2(3), 25,8 мкМ(4); концентрация Н2О2 0,64 мМ; а - 0,1 М нагрий-ацетачный буфер, рН 6, 40 нМ пероксидаза; 6-0,1 М трис-HCl буфер, рН 7, 95 нМ пероксидаза.

1Л> 10 , мин М'

0 4 8 12

1/о-лианитадии 10"®, И1

Рис. 10. Зависимости обратных начальных скоростей окисления о-дианизидина в присутствии различных концентраций строфантина в: 0(1), 8,6(2), 17,2(3), 25,8 мкМ(4); концентрация пероксидазы 0,14 нМ; Н2О2 - 0,64 мМ; 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,5

трифтазииа, хлорпромазина и о-дианизидина его связывание с ферментом хуже в 2,4, 3,1 и 5,9 раз соответственно. При рН>6,0 резко понижалась скорость каталитического процесса, при этом отмечалось улучшение в связывании эффектора в реакциях окисления хлорпромазина в 3, трифтазина - в 1,4, о-дианизидина - в 1,5 раза с ухудшением связывания строфантина й при окислении тиопроперазина в 2,8 раза. В реакциях ингибирования пероксидазного окисления о-дианизидина строфантином в ни одна из групп активного центра фермента себя не проявила, что, возможно, объясняется различным расположением строфантина в в активном центре фермента при осуществлении реакций

пероксидазного окисления фенотиази-

нов и о-дианизидина.

Роль пероксидазы и антиоксидантов в прорастании семян

Если подойти к вопросам сохранения и повышения жизнеспособности семян растений с позиций биоэнергетики, то можно предположить, что жизнеспособность семян базируется на сохранении на оптимальном уровне активности катаболических ферментов, участвующих в работе аэробных систем. Поэтому мы изучили изменения активность пероксидазы на ранних этапах прорастания семян и при длительном хранении. Показано, что при прорастании семян с появлением корней и 'побегов активность пероксидазы повышается в надземной части в 1,8-2,0, в корнях в 12-14, а в зерне в 4-5 раз (рис. 11).

Результаты исследования активности пероксидазы в покоящихся семенах пшеницы сорта Скороспелка улучшенная урожая разных лет приведены в табл. 1. Как видно из этих данных, что снижение активности пероксидазы коррелирует с понижением всхожести семян. Полученные данные позволили сделать вывод, что при прорастании семян происходит интенсификация аэробных биоэнергетических процессов, активация оксидаз, включая пероксидазу. При этом резкое возрастание активности пероксидазы может свидетельствовать о том, что

30 -

10 ■

—А-2

0 2 4 6 8

Время прорастания, т

Рис. 11 Активность пероксидазы в зерновке (1), побеге (2) и корнях (3) проростков пшеницы сорта Якутянка 224 в зависимости от времени проращивания.

Таблица 1. Активность пероксидазы (мкмоль/мин г сухой массы) в жизнеспособных прорастающих и находящихся в состоянии покоя семенах пшеницы сорта Скороспелка улучшенная.__

Семена Время прорастания семян, сут Пероксидаза

Контроль (сухие) - 3,0±0,3

Проросшие 1 7,2±0,7

3 8,5+0,8

Непроросшие, 1 2,4±0,2

Жизнеспособные 3 3,5±0,2

фермент участвует в активизации пусковых механизмов прорастания семян, инициируя реакции свободнорадикального окисления, которые через активизацию ПОЛ могут способствовать возрастанию дыхательной активности митохондрий.

Для проверки высказанного предположения был проведен следующий эксперимент. Семена пшеницы сорта Скороспелка улучшенная (всхожесть- 44, жизнеспособность - 70%) проращивались в течение трех дней и дифференцировались на проросшие и непроросшие семена. У семян этих двух групп определялась активность пероксидазы. Из таблицы 2 видно, что у непроросших семян активность пероксидазы почти не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается увеличение активности пероксидазы в 2,0 раза. Эти результаты являются доказательством того, что для прорастания семян необходима не просто активация всех биоэнергетических процессов, а переключение дегидрогеназных реакций на аэробные.

Для подтверждения избирательности действия антиоксидантов по отношению пероксидазы зерен пшеницы нами было изучено содержание СГ и АК в зародыше и эндосперме семян ячменя и пшеницы сорта Якутянка 224 (табл. 3). Показано, что в эндосперме семян ячменя со всхожестью 76% СГ и АК содержится больше на 30 и 37% соответственно, чем в зародыше. Тогда как в эндосперме семян пшеницы с лабораторной всхожестью 28%, но высокой жизнеспособностью (86%) стероидов содержится на 20, а АК на 30% меньше, чем в зародыше.

Таблица 2. Активность пероксидазы (мкмоль/мин г сухой массы) семян пшеницы сорта Скороспелка улучшенная в зависимости от сроков сбора урожая._

Срок хранения семян, год Жизнеспособность, % Всхожесть, % Активность пероксидазы, мкмоль/мин г (%)

1 99±1 96+2 3,15 (100)

3 88±2 79+5 1,59 (50,5)

5 56±2 24±2 0,75 (23,8)

Таблица 3. Содержание СГ и АК (мг/100 г) в эндосперме и зародыше семян ячменя и пшеницы. Условия: семена замачивали 17 часов в воде._

Семена растений Всхожесть, % Жизнеспособность, % СГ АК

эндосперм зародыш эндосперм зародыш

Ячмень Пшеница сорт Якутянка 224 76±3 28±1 92±5 86±4 0,93±0,05 0,37X0,02 0,65±0,03 0,46+0,2 12,6±0,9 3,3±0,1 8,0±0,5 5,6+0,2

Эти изменения служат подтверждением того, что содержание и состав функционально активных соединений эндосперма может оказывать влияния на интенсивность метаболических процессов в зародыше. Понижение концентрации СГ и АК в эндосперме приводит к замедлению процессов деления и роста клеток зародыша. Это условие реализуется на начальных этапах развития, когда автономность зародыша, отражающее его независимость развития от окружающих тканей, и проявляющееся в способности нормально развиваться вне материнского организма, еще очень слабо выражена и эндогенные функционально активные вещества эндосперма лимитируют дифференциацию и рост клеток (Батыгина, 1987).

Строфантин и АК по своему действию относятся к группе антиоксидантов. Являясь органическими веществами они участвуют, как было показано выше, в пероксидазных реакциях, поэтому строфантин и АК могут оказывать влияние на активность фермента, что, по-видимому, проявляется при малых концентрациях в виде повышения всхожести семян, тогда как высокое содержание антиоксидантов понижает всхожесть семян, углубляя их покой.

Основные выводы

1. Используя ИУК было показано, что местом локализации участка связывания молекул аскорбиновой кислоты является дистальная область активного центра фермента, при связывании в которой двух и более молекул аскорбиновой кислоты наблюдается ускорение реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, обусловленное кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата.

2. Изучение влияния ИУК на реакции окисления быстро окисляемых субстратов пероксидазы позволило выявить тип ингибирования, при котором связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону ИУК и субстрат связываются в различных местах активного центра, что наблюдается вследствие удаленности мест связывания эффектора и субстрата.

3. Изучение реакций пероксидазного окисления фенотиазинов (хлорпромазина, тиопроперазина и трифтазина) позволило установить, что они являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы и их окисление перекисью, осуществляется по одноэлектронному механизму, аналогично окислению неорганических субстратов пероксидазы.

4. Исследование реакций совместного окисления о-дианизидина с различными фенотиазинами позволило установить, что фермент реализует

различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата, при этом среди изученных фенотиазинов, расположение функциональных групп хлорпромазина, обеспечивают его преимущественное пероксидазное окисление по сравнению с о-дианизидином.

5. В реакциях совместного окисления тиопроперазина и о-дианизидина установлен сложный регуляторный механизм, который обусловлен тем, что при рН 4,5-5,0 проявлялся антиконкурентный тип ингибирования, тогда как с возрастанием рН (рН>5,5), за счет депротонировапия одной из функциональных групп активного центра фермента, происходило переключение механизма переноса электронов с донора водорода о-дианизидина, на преимущественное окисление донора электронов - тиопроперазин.

6. Исследование реакций пероксидазного окисления тиопроперазина, трифтазина, хлорпромазина и о-дианизидина в присутствии строфантина в позволило установить, что при кислых значениях рН строфантин в активирует пероксидазу в реакциях окисления тиопроперазина по бесконкурентному типу, а при окислении трифтазина, хлорпромазина и о-дианизидина проявлялись соответственно неконкурентный, конкурентный и антиконкурентный типы ингибирования.

7. Установлено, что пероксидаза необходима для сохранения жизнеспособности семян и при запуске процессов, связанных с их прорастанием, сопровождаемое интенсификацией аэробных биоэнергетических процессов, активацией оксидаз, включая пероксидазу, активность которой у непроросших семян, остающихся в покое, не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается возрастание активности фермента.

8. Показано, что в непроросших семенах концентрация стероидных гликозидов всегда понижается, возрастая при активации ростовых процессов. Тогда как концентрация АК в покоящихся семенах всегда выше, чем у активно метаболизирующих. Это позволяет предположить о том, что АК необходима семенам для участия в метаболических процессах, а стероидные гликозиды являются их регуляторами.

Список опубликованных работ, отражающих содержание диссертации:

1. Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Возможные механизмы проявления фармакологического действия производных фенотиазинов в живых организмах // Современные вопросы интенсификации кормления, содержания животных и улучшения качества продуктов животноводства: Тез. докл. Междунар. научно-практич. конф. специалистов, 1-2 июля 1999 г. - Москва, 1999. -С. 56. 2 Рогожин В.В , Рогожина Т.В. Возможное влияние строфантина в на реакции пероксидазного окисления фенотиазинов в живых организмах // Там же. - С. 6263.

3. Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Влияние строфантина в на кинетику пероксидазного окисления медленно окисляемых субстратов пероксидазы// Биохимия. -2000. -Т. 65, № 2. -С. 254-262.

4. Рогожина Т.В., Рогожин B.B. Стационарная кинетика индивидуального и совместного окисления фенотиазинов в присутствии пероксидазы хрена // Электронный журнал "Исследовано в России", 70, стр. 768-780, 2002г. http://zhurnal.ape.reIarn.ru/articles/2002/070.pdf

5. Рогожина Т.В. Стационарная кинетика пероксидазного окисления фенотиазинов // Ломоносов-2002: Тезисы докл. IX Междунар. конф. студентов и аспирантов но фундаментальным наукам, 9-12 апреля 2002 г. - Москва, 2002. -С. 105-106.

6. Рогожина Т.В. Особенности протекания реакций пероксидазного окисления фенотиазинов в присутствии строфантина G // Биология - Наука 21-го века: Тезисы докл. 6-ой Пущинской школы-конф. молодых ученых, 20-24 мая 2002 г. -Пущино, 2002. -С. 132.

7. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Фенотиазины являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы // Проблемы медицинской энзимологии: Тезисы докл. Всерос. конф., 5-8 июня 2002 г. - Москва, 2002. -С. 84-85.

8. Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Изучение пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты в присутствии индолил-3-уксусной кислоты // Электронный журнал "Исследовано в России". 111, стр. 1212-1225, 2002 г. http://zhumal.ape.relarn.rU/articles/2002/l 11 .pdf

9. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Стационарная кинетика пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты в присутствии ИУК // Каталитический дизайн -от исследований на молекулярном уровне к практической реализации: Тезисы докл. 1-ой Междунар. школы-конф. молодых ученых по катализу, 2-6 декабря 2002 г. - Новосибирск, 2002. -С.141-142.

10. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Пероксидаза в реакциях окисления быстро и медленно окисляемых субстратов //Там же. -С. 252-253.

11. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Пероксидаза в реакциях индивидуального и совместного окисления субстратов // Актуальные проблемы современной науки: Тезисы докл. 3-ей Междунар. конф., 23-28 сентября 2002 г. - Самара, 2002. -С. 7374.

12. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Модель активного центра пероксидазы // Там же. С. 75-76.

13. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Влияние индолил-3-уксусной кислоты и триптофана на пероксидазное окисление о-дианизидина и гидрохинона // Биология - Наука 21-го века: Тезисы докл. 7-ой Пущинской школы-конф. молодых ученых, 14-18 апреля 2003 г. - Пущино, 2003. -С. 156.

14. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Влияние индолил-3-уксусной кислоты на окисление о-дианизидина и гидрохинона в присутствии пероксидазы // Электронный журнал "Исследовано в России", S1, стр. 919-933, 2003 г. http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081 .pdf

15. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Динамическая модель активного центра пероксидазы // Актуальные проблемы современной науки: Тезисы докл. 4-ой Междунар. конф., 10-12 сентября 2003 г. - Самара, 2003.-С. 54-55.

16. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина ТВ. Пероксидазный катализ многокомпонентных еистем.-Якутск: Сахаполиграфиз чат, 2003. -165 с.

17. Рогожина Т.В., Рогожин B.B. Содержание сердечных гликозидов и аскорбиновой кислоты в семенах растений // Биология - наука XXI века: Тезисы докл. 8-ой Пущинской школы-конф., 17-21 мая 2004 г. - Пущино, 2004. -С. 187188.

18. Рогожин В.В., Pui ожина Т.В. Роль индолил-З-укеуеной кислоты в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, катализируемого пероксидазой хрена // Известия АН. Сер. биол.-2004, № 4. -С.416-420.

19. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Влияние строфантина на прорастание семян // Пищевые ресурсы дикой природы и экологическая безопасность населения: Тезисы докл. Междунар. научно-практич. конф., 17-18 ноября 2004 г. - Киров, 2004. -С. 124-125.

20. Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Влияние УФ-облучения на механизмы устойчивости семян пшеницы // Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем: Тезисы докл. VIII Междунар. науч. экологической конф., 27-29 сентября 2004 г. - Белгород, 2004. -С.87.

21. Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Влияние различных факторов среды на прорастание семян пшеницы // Там же. С. 122.

22. Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Роль индолил-3-уксусной кислоты в реакциях окисления быстро и медленно окисляемых субстратов пероксидазы // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. -2004. -Т.45, №6. -С. 423-428.

23. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина Т.В. Пероксидаза: строение и механизм действия.-Иркутск: Из-во ИГТУ, 2004. -200 с.

24. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Использование пероксидазы в качестве модели исследования реакций пероксидазного окисления функционально активных веществ // Биология - наука XXI века: Тезисы докл. 9-ой Пущинской школы-конф., 18-22 апреля 2005 г. - Пущино, 2005. -С. 234-235.

25.Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Модельные системы пероксидазы и их применение для оценки механизмов пероксидазного окисления лекарственных препаратов // Под знаком I: Тезисы докл. III Всерос. науч. молодежной конф., 4-6 июля 2005 г. - Омск, 2005. -С. 231-232.

26. Рогожина Т.В. Фенотиазины (хлорпромазин, трифтазин и тиопроперазин) являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы // Молодежь и медицинская наука в XXI веке: Тезисы докл. Междунар. научно-практич. конф., 1-2 апреля 2005 г. - Киров, 2005. -С.68-69.

27. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Использование пероксидазы в качестве модели исследования реакций пероксидазного окисления функционально активных веществ // Биология - наука XXI века: Тезисы 9-ой Пущинской школы-конф., 1822 апреля 2005 г. - Пущино, 2005. -С. 124-125.

28. Рогожина Т.В. Пероксидаза как модель исследования реакций окисления фенотиазинов // Ломоносов-2005: Тезисы докл. Междунар. науч. конф. студентов, аспирантов по фундаментальным наукам, 12-16 апреля 2005 г., секция «Химия», Т.2. - Москва, 2005. -С.30.

Подписано в печать 29.12.05. Формат 60x84/16. Бумага тип. №2. Гарнитура «Тайме». Печать офсетная. Печл. 1,5. Уч.-изд.л. 1,87. Тираж 100 экз. Заказ Издательство ЯГУ. 677891, г. Якутск, ул. Белинского, 58.

Отпечатано в типографии издательства ЯГУ

«I

РНБ Русский фонд

2006-4 30775

V«.

.-• ел гг. ^

.. г.;-Г' ■

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рогожина, Татьяна Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава I. Строение пероксидазы.

Глава II. Механизм действия пероксидазы.

2.1. Пероксидаза в реакциях оксидазного окисления субстратов.

2.2. Фермент в реакциях пероксидазного окисления субстратов.

2.2.1. Пероксидаза в реакциях индивидуального окисления субстратов.

2.2.2. Пероксидаза в реакциях совместного окисления субстратов.

Глава III. Функциональная роль пероксидазы.

Глава IV. Использование пероксидазы в аналитических исследованиях.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

§ 1. Исходные вещества.

1.1 Сбор лекарственного сырья.

1.2 Сушка заготовленного сырья.

§ 2. Использованная аппаратура.

§ 3. Приготовление рабочих растворов.

§ 4. Методики проведения экспериментов.

4.1 Методики исследования пероксидазы.

4.2. Методики определения реакции пероксидазного окисления. аскорбиновой кислоты.

4.3. Методики определения ингибирования ИУК пероксидазного окисления, аскорбиновой кислоты, гидрохинона и о-дианизидина.

4.4 Методики определения пероксидазного окисления аминазина.

4.5. Методики определения пероксидазного окисления трифтазина. и тиопроперазина.

4.6. Определение стероидных гликозидов.

4.7. Определения аскорбиновой кислоты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава I. Регулирование реакций пероксидазного окисления антиоксидантов с помощью индолил-3-уксусной кислоты.

1.1. Изучение механизма пероксидазного окисления медленно окисляемого субстрата с помощью индолил-3-уксусной кислоты.

1.2. Влияние индолил-3-уксусной кислоты на пероксидазное окисление быстро окисляемых субстратов.

Глава II. Исследование реакций пероксидазного окисления функционально активных.

2.1. Особенности пероксидазного окисления хлорпромазина.

2.2. Производные фенотиазина являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы.

2.3. Влияние строфантина G на кинетику пероксидазного окисления фенотиазинов.

Глава III. Проявление действия функционально активных веществ в биологических системах.

3.1. Роль пероксидазы и антиоксидантов в прорастании семян.

3.2. Действие строфантина на прорастание семян.

3.3. Участие стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в формировании гипобиотических состояний.

3.4. Роль стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в онтогенезе растений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование активного центра и механизма действия пероксидазы с помощью функционально активных веществ"

Для активной жизнедеятельности растениям и животным необходим кислород. Основное количество кислорода расходуется на выработку энергии и участие в окислительном метаболизме. Однако, небольшая его часть около 2% может переходить в активные формы кислорода (АФК): 02", н202, НО-, НОС1 и др. (Ш>ш & а1., 1989). Для защиты от их разрушительного действия используются компоненты антиоксидантной системы, среди которых высокомолекулярные (СОД, каталаза, пероксидаза) и низкомолекулярные (аскорбиновая кислота, гидрохинон, стероиды, флавоноиды и др.) антиоксиданты.

Интенсивность аэробных процессов может быть оценена по активности пероксидазы, которая катализирует реакции оксидазного и пероксидазного окисления неорганических и органических соединений (Рогожин, Курилюк, 1998). Последними могут быть функционально активные вещества (ИУК, гидрохинон, аскорбиновая кислота, НАДН, фенотиазины), способные участвовать в оксидазных и пероксидазных реакциях, катализируемых пероксидазой. Среди этих веществ следует выделить антиоксиданты, которые способны подавлять образование свободных радикалов, понижая таким образом уровень ПОЛ в клетках живых организмов.

Е + Н202 -> Е, Е! + АН2 Е2 + АН Е2 + АН2 -> Е + АН

В восстановлении фермента участвуют соединения, являющиеся донорами водорода и донорами электронов.

Многообразие субстратов позволяет предположить, что в реакциях пероксидазного окисления могут реализовываться различные механизмы действия фермента. Все субстраты пероксидазы условно можно разделить на быстро и медленно окисляемые. К быстро окисляемым относят о-дианизидин, гидрохинон, фенолы и амины, а к медленно окисляемым ферроцианид калия, аскорбиновая кислота, НАДН и др. Исследование механизмов пероксидазного окисления органических соединений позволили высказать предположение, что перенос электронов, сопровождаемый переносом протонов происходит с участием функциональных групп белковой глобулы фермента. Показано, что в каталитическом процессе участвует один из остатков гистидина (Гис42). Выявлена функциональная группа с рК 6,5, депротонирование которой приводит к понижению скорости окисления одного из органических субстратов - о-дианизидина. Тогда как модификация трех поверхностных СООН-групп белка пероксидазы, не влияет на кинетические параметры окисления ферроцианида калия, но в 10 раз уменьшает константу скорости реакций Е1 с о-дианизидином, что свидетельствует об участии белковой глобулы пероксидазы в окислении органических субстратов. Таким образом, при пероксидазном окислении органических субстратов реализуется периферийные механизмы переноса электронов (Лебедева и др., 1996) и активный центр фермента в этом случае включает функциональные группы белка. Причины широкой субстратной специфичности пероксидазы объясняются тем, что на поверхности белка реализуются несколько различных каналов электронного транспорта с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы на железо гема (Угарова и др., 1984).

В литературе приводятся данные об активации оксидазного окисления некоторых субстратов пероксидазы (НАДН и ИУЬС) в присутствие ряда фенолов (7еп е1 а1., 1971; 8а1китаг е1 а1., 1994; Ноп е1 а1, 1994). Отмечается, что механизмы субстрат-субстратной активации различаются для разных субстратов. Так, для р-крезола и аскорбиновой кислоты и люминола и замещенных фенолов методами спектроскопии ЭПР показано, что активация происходит за счет неферментативных процессов. Тогда как в реакции совместного окисления ферроцианида калия и о-дианизидина предложено, что частицей, эффективно окисляющей ферроцианид, является не свободный радикал о-дианизидина, комплекс пероксидазы с полу окисленным субстратом.

Цель настоящего исследования - изучить строение активного центра, механизмы действия пероксидазы в реакциях совместного окисления субстратов и предложить возможности использования выявленных механизмов в биогенных системах.

В этой связи необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние индолил-3 -уксусной кислоты на реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и выявить механизмы регуляторного действия.

5. Установить роль строфантина в реакциях пероксидазного окисления фенотиазинов и о-дианизидина.

6. Выявить влияние аскорбиновой кислоты и сердечных гликозидов в прорастании семян и установить регуляторную роль пероксидазы в этом процессе.

Впервые изучены пероксидазные реакции окисления фенотиазинов (аминазина, трифтазина и тиопроперазина). Показано, что они являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы. При совместном присутствии аминазина и ферроцианида калия, скорость пероксидазного окисления последнего возрастала за счет того, что аминазин связывался в активном центре пероксидазы вблизи места связывания молекулы ферроцианида, стабилизируя промежуточный комплекс фермента с ферроцианидом. Предложено, что при совместном окислении о-дианизидина и различных фенотиазинов, фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата, выбор которых определяется доступностью функциональных групп субстрата каналам переноса электронов на поверхности белковой глобулы.

Установлено, что в реакциях индивидуального и совместного окисления в действии пероксидазы реализуются сложные регуляторные механизмы, обеспечивающие протекание каталитического процесса. Причем фермент, не проявляющий избирательность по отношению природы окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, приобретает избирательность в реакциях совместного окисления.

Практическая значимость работы. В результате исследований разработана научно-обоснованная программа по изучению механизмов пероксидазного окисления биологически активных веществ. Предложено, что выявленные эффекты влияния ИУК на пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты, катализируемое пероксидазой, имеют важное биологическое значение. ИУК может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемого субстрата, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра пероксидазы. По-видимому, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина, служить оксидазным субстратом фермента. При этом ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. При этом ИУК может выполнять роль "триггера" в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Реализация действия ауксина, возможно, проявляется при выходе семян из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность пероксидазы, которая способна активировать процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к генерированию свободных радикалов, необходимых на конечных этапах эмбриогенеза для активизации механизмов прорастания. Исследования механизмов пероксидазного окисления фенотиазинов позволило высказать предположения о возможных сроках нахождения фенотиазинов в организме человека, а также дать предположительную оценку эффективности их действия. Среди изученных фенотиазинов выраженное седативное действие трифтазина можно объяснить за счет того, что поскольку он в присутствии быстро окисляемого субстрата не окисляется пероксидазой, то он должен дольше сохранять свое функциональное действие. Быстрее всех в организме может окисляться аминазин и его действие должно быть за счет этого не продолжительным. Кроме этого обосновано действие фенотиазинов в присутствии строфантина в при их совместном использовании. Поскольку строфантин в ускоряет окисление тиопроперазина, то при их совместном введении пероксидазное окисление тиопроперазина будет возрастать, что приведет к образованию различных продуктов его окисления и к быстрой потере фармакологического действия. Тогда как пероксидазное окисление трифтазина и аминазина в присутствии строфантина О будет замедляться, обеспечивая, таким образом, пролонгированность действия вводимых препаратов.

2. В действии пероксидазы заложены сложные регуляторные механизмы, позволяющие ферменту инициировать процесс пероксидазного окисления широкого спектра субстратов, а в механизмах совместного окисления использовать способы регулирования, ускоряя каталитический процесс за счет улучшения связывания окисляемого субстрата или с участием в окислении комплекса фермента с полуокисленным субтратом.

3. Пероксидаза и антиоксиданты (аскорбиновая кислота и стероидные гликозиды) принимают непосредственное участие в механизмах формирования гипобиотических состояний и ответственны за поддержание высокой жизнеспособности семян.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Глава I. Строение пероксидазы

Пероксидаза относится к двухкомпонентным ферментам, в составе которого гемин, представленный протопорфирином IX в комплексе с трехвалентным железом, и полипептидная цепь (рис.1). Последняя включает от 203 до 308 аминокислот, и в зависимости от природы изофермента, формирует компактную третичную структуру, представленную двумя доменами (большим и малым). [Welinder et al., 1972]. Фермент имеет размер белковой глобулы равный 50 A [Clementi, Palade, 1969], содержащий около 43% а-спиральных участков [Strickland, 1968]. Гемин нековалентно закреплен в углублении полипептидной цепи между доменами, и удерживается там за счет гидрофобных связей и

Рис. 1. Схема формирования нативной структуры пероксидазы. солевого мостика, образованного между остатком пропионовой кислоты гемина с одной из аминогрупп апобелка [Угарова и др., 1981]. Гемин можно обратимо отделить от белка при кислых рН [Maehly, 1952]. Железо протопорфирина может находиться в высокоспиновом ¿/55/2 или низкоспиновом d5y2 состояниях, образует четыре координационные связи с пиррольными атомами азота порфирина и одну координационную связь с функциональной группой апобелка [Угарова и др., 1981]. По данным ЯМР спектроскопии пятым аксиальным лигандом железа является имидазольная группа гистидинового остатка апобелка [Ishimaru, 1980; Teraoka, Katagauwa, 1981].

Располагаясь в гидрофобной полости апобелка, гемин ориентирован так, что его пропионовокислые остатки направлены к поверхности, а винильные группы протопорфирина обращены во внутреннюю часть белка [Угарова и др., 1981; Савицкий и др., 1977]. Планарная структура гемина предполагает его фиксацию внутри белка за счет я-электронных взаимодействий пиррольных колец протопорфирина с аминокислотными остатками, главным образом с остатком тирозина, фенилаланина, триптофана, гистидина и метионина. Используя замещенные гемины, с этерифицированными карбоксильными группами в 6 и 7 положениях, было показано, что реконструированные ферменты реагируют с перекисью водорода с образованием промежуточного соединения Е1 с теми же скоростями, как и нативная пероксидаза [Araiso et al., 1979; Araiso, Dunford, 1981]. Авторами было высказано предположение, что карбоксильные группы пропионовокислых остатков гемина не играют роли в образовании соединения Е1 пероксидазы. Однако в работе [DiNello, Dolphin, 1981] показано, что даже незначительные изменения структуры заместителей в 6 и 7 положениях резко уменьшает скорость связывания модифицированных геминов с апопероксидазой и активность реконструированных ферментов. По-видимому, пропионовокислые остатки гемина участвуют в его связывании с белком и важны для правильной ориентации тема на белке и поддержании активной нативной структуры фермента.

Комплексообразование апопероксидазы с гемином резко повышает устойчивость фермента к действию УФ-облучения и температуры. Удаление гемина приводит к потере пероксидазной активности, но не сказывается на ее оксидазной функции [Siegel, Galston, 1967].

Нативный фермент имеет в составе нейтральные и аминосахара в количестве до 20% общего веса [Shannon et al., 1966]. Молекулы Сахаров могут присоединяться только к пяти аминокислотным остаткам из тех двадцати, которые входят в состав полипептидной цепи [Sharon, 1974]. Углеводные цепи предохраняют фермент от инактивации радикалами, образующимися в ходе реакций, и увеличивают термическую стабильность пероксидазы. Удаление углеводов хотя и не влияет на каталитическую активность фермента, однако приводит к ускорению его инактивации в ходе реакции [Клячко, 1997].

В составе полипептидных цепей пероксидаз содержится от 6 до 8 SH-групп, которые связаны в 3-4 дисульфидные связи [Shin et al., 1971]. В состав молекулы пероксидазы включены два иона кальция, которые мало влияют на каталитическую активность, однако необходимы для поддержания высокой термической стабильности фермента [Haschke, Friedhoff, 1978;Ogawa et al., 1979].

Известно, что белки являются амфотерными полиэлектролитами, т.е. сочетают в себе кислотные и основные свойства. Кислотные свойства белку придают кислые аминокислоты (аспарагиновая, глутаминовая), а щелочные свойства - основные аминокислоты (лизин, аргинин, гистидин). Чем больше кислых аминокислот содержится в белке, тем ярче выражены его кислотные свойства, и чем больше входит в состав белков основных аминокислот, тем сильнее проявляются его основные свойства. Причем р1 каждого белка определяется соотношением кислых и основных групп боковых радикалов аминокислот: чем выше соотношение кислые/основные аминокислоты в белке, тем ниже его изоэлектрическая точка [Строев, 1986]. Нами проведена оценка содержания заряженных аминокислот в различных изоферментах (Аь В и С) пероксидазы (табл. 1). Видно, что в составе полипептидной цепи фермента содержится всего от 22 до 26% заряженных аминокислот. Таким образом, 3Л части полипептидной цепи пероксидазы представлены гидрофобными и незаряженными аминокислотами. Наличие высокой степени гидрофобности белковой молекулы позволяют предположить, что пероксидаза может являться мембранным ферментом, что и было доказано изучая каталитическую активность пероксидазы в системах обращенных мицелл, в том числе и АОТ [Клячко, 1990; Клячко и др., 1997]. В экспериментах использовались нативная и рекомбинантная пероксидазы. Последняя не содержала углеводных остатков на поверхности белковой молекулы. Показано, что

Таблица 1. Состав аминокислот, входящих в первичную структуру изоферментов пероксидазы, и их некоторые физико-химические свойства [Delincee, Radola, 1970; Phelps et al., 1971; Shin et al., 1971; Welinder, Mazza, 1977; Welinder, 1979].

Изофер- Всего Аминокислоты (%) менты амино- непо- поляр- заряженные Кислые перок- кислот ляр- ные / сидазы (%) ные всего положительно отрицательно Pi основные

HRP-Ai 267 104 104 59 14 45 3,6-4,2 3,2

100) (39) (39) (22) (5) (17)

HRP-B 300 129 92 79 29 50 8,7 1,7

100) (43) (31) (26) (9) (17)

HRP-C 308 130 99 79 30 49 9,0 1,6

100) (42) (32) (25) (Ю) (16) стабильность фермента зависит от степени гидратации ПАВ (w0=[H20]/[A0T]). В экспериментах использовались два подхода нековалентной модификации микросреды внутренней полости мицеллы. Во-первых, в водный буферный раствор, солюбилизируемый добавление 10%-ной глюкозы не приводило к изменению стабильности реконструированной пероксидазы при степени гидратации 10. Отсутствие стабилизирующего эффекта было объяснено тем, что размеры внутренней полости мицеллы и белка при этой степени гидратации совпадают и, по-видимому, вода вместе с растворенными в ней низкомолекулярными компонентами оказывается вытесненной из внутренней полости в район первых СН2-групп углеводородных остатков ПАВ.

Для реализации второго подхода были использованы ПАВ твин и спан, содержащие в своем составе сорбитовое кольцо. Введение 1 мМ (1% относительно концентрации АОТ) спана 80 приводило к достижению стабильности, характерной для нативной пероксидазы хрена в тех же условиях [Клячко и др., 1997].

На основании полученных данных было высказано предположение, что повышение активности и стабилизирующий эффект нативной пероксидазы в растворах ПАВ [Левашов, 1987], по-видимому, обусловлены наличием на поверхности белковой глобулы фермента углеводных фрагментов, ковалентно связанных с белком, содержащих галактозу, глюкозу, арабинозу, фруктозу, глюкозамин, маннозу, ксилозу и фукозу [Klapper, Hackett, 1965; Андреева, 1988]. Эти углеводные фрагменты на поверхности белковой молекулы могут быть использовании при связывании пероксидазы с углеводами клеток. Так, показано сродство одной из пероксидаз - перонектина к фибронектину - одному из углеводсвязывающих белков - лектинов [Johansson, 1997]. При этом растительные пектинсвязывающие белки иммунохимически сходны с витронектином и некоторые из них являются пероксидазами. Кроме этого пероксидаза хрена способна связываться с поперечно сшитой агарозой [Lascu et al., 1986]. Выявлена высокая специфичность в связывании анионных пероксидаз корней пшеницы к хитину, полимеру N-ацетил-О-глюкозамина, входящего в состав клеточной стенки грибов, что может реализоваться в защитной роли этих изоформ пероксидазы в растениях при грибной инфекции [Максимов, 1994; Максимов и др., 1995].

Для полного понимания механизмов функционирования пероксидаз необходимо знание их пространственной структуры [Упоров, Егоров, 1997]. К настоящему времени методом рентгеноструктурного анализа (РСА) разрешены третичные структуры некоторых пероксидаз - цитохром С пероксидазы из дрожжей [Poulos et all., 1987], грибной пероксидазы [Kurishima et all., 1994], марганцевой пероксидазы [Sundaramoorthy et all., 1994], пероксидазы арахиса [Schuller et all., 1996]. Для изофермента С пероксидазы хрена также установлена пространственная третичная структура фермента методом РСА с разрешением около 2 Ä [Gajhede et al., 1996], однако координаты атомов этого белка до сих пор закрыты для пользователей. Поэтому построение модели активного центра пероксидазы хрена основано на гомологии с первичной последовательностью пероксидазы арахиса, имеющей высокую степень сходства в строении третичной структуры и координаты которой открыты для доступа. Причем степень идентичности аминокислотных последовательностей этих ферментов превышает 50%. Используя такую высокую гомологичность, в работе [Упоров, Егоров, 1997] построили модель пространственной структуры пероксидазы хрена, которая предполагает в основном такой же фолдинг, как и пероксидаза арахиса: 10 а-спиралей A-J (рис. 2). В спирализованные участки белковой молекулы входят аминокислотные остатки с номерами полипептидной цепи: А спираль - 14-28, В спираль -31-45, С спираль - 76-90 и D спираль - 92-112. Третичная структура фермента скрепляется четырьмя дисульфидными мостиками между

Рис. 2. Кристаллическая структура пероксидазы арахиса [Schuller et al., 1998]. Показаны дистальные остатки His-42, Arg-38, Phe-41, проксимальный His-169, координирующий гем в активном центре пероксидазы, Phe-142, Phe-143 на входе в активный центр. аминокислотными остатками: 11-91, 44-49, 97-301 и 177-209, которые расположены внутри молекулы. Центры гликозилирования пероксидазы хрена расположены на поверхности белка и доступны для формирования комплекса с углеводами, которые включают аминокислотные последовательности состава Asp-X-Ser/Thr с номерами 13-15, 57-59, 158160, 186-188, 198-200, 214-216, 255-257 и 268-270. Молекула пероксидазы содержит восемь олигосахаридных цепочек. Высказано предположение, 2+ что два иона Са , участвующие в стабилизации трехмерной структуры молекулы пероксидазы хрена, координируют с аминокислотными остатками (43, 46, 48, 50, 64) и (171, 222, 225, 228, 230); в координации железа гемина (Phe-41, Phe-152, His-170, Leu-250) и в связывании ароматических субстратов (Не-180, Phe-221, Ile-244). Активный центр фермента представлен Arg-38, Phe-41, His-42. В дистальной области гемового кармана находятся две молекулы воды [Gajhede et al., 1996].

Одним из новых подходов к изучению линейных антигенных детерминант является антигенное картирование белков методом пептидного сканирования (PEPSCAN). Суть этого метода заключается в синтезе коротких перекрывающихся олигопептидов - фрагментов аминокислотной последовательности изучаемого белка и их тестирование с помощью иммуноферментного анализа на взаимодействие с поликлональными антителами [Аммосова и др., 1997]. Непрерывные или линейные антигенные детерминанты представляют собой непрерывный участок полипептидной цепи, и конформационные антигенные детерминанты состоят из аминокислот, но сближенных в пространстве и не обязательно связанных пептидной связью [Максютов, Загребельный, 1993].

Используя этот метод были определены линейные антигенные детерминанты изофермента С пероксидазы хрена (рис. 3) [Аммосова и др., 1997]. Показано, что линейные антигенные детерминанты фермента,

Рис. 3. Схематический вид эпитопов НЯРС. Участки полипептидной цепи, входящие в эпитопы, представлены в виде затемненных сплошных лент. Также на рисунке изображены гем и аминокислотные остатки, входящие в активный центр; ионы кальция (в виде шариков) и дисульфидные связи (в виде цилиндров) [Аммосова и др., 1997]. некоторые из которых пространственно локализованы в регулярных элементах вторичной структуры a-спиралях, расположены как с наружи, так и внутри белковой глобулы. Часть эпитопов локализована в петлях и изгибах пептидной цепи пероксидазы, обладает «нерегулярной» конформацией. В составе полученных антигенных детерминант наиболее часто встречались десять аминокислот - Arg, Ser, Ala, Thr, Leu, lie, Val, Phe, Pro, Asn. В состав эпитопов входили заряженные аминокислоты Arg и Asp, неполярные аминокислоты Ala, Leu, lie, Val, Phe, Pro и Trp и незаряженные полярные аминокислоты - Asn, Thr, Ser, Gin, Туг, Gly (составляющие 13,4, 51,2 и 35,4% соответственно от общего состава детерминант). Таким образом, на поверхности белковой глобулы фермента, преимущественно располагаются гидрофобные аминокислотные остатки. Три из восьми пептидов, гликозилированные в нативной молекуле пероксидазы хрена (13-15, 198-200, 268-270), входили в состав эпитопов, остальные же гликозилированные аминокислотные остатки были расположены достаточно далеко от антигенных областей. Выявленные эпитопы содержали несколько функционально важных остатков: Arg-38, входящий в активный центр пероксидазы хрена и Phe-142, Phe-143, формирующих канал доступа ароматических субстратов к активному центру фермента. Большая часть аминокислотных остатков, участвующих в связывании кальция, в координации железа гемина и в образовании субстратсвязывающего участка, не входили в состав антигенных детерминант, согласуются с предположениями о том, что эти участки являются консервативными и стабильными структурами [Welinder, 1985], расположенными внутри белковой глобулы.

Используя методику ренатурации рекомбинантной пероксидазы хрена, были получены формы фермента с точечными мутациями F41H и Н143Е [Газарян и др., 1995]. При этом известно, что Phe-41 локализован между остатками дистальных His-40 и His-42. Последний координирует атом железа гемина в активном центре пероксидазы хрена. Тогда как, остаток Phe-143 расположен в проксимальной области гемина вблизи входа в гемсвязывающую полость и совместно с Phe-142, способен формировать субстратсвязывающий участок активного центра пероксидазы. Данные мутации приводили к падению удельной ферментативной активности более чем в 40 раз, с проявлением влияния на различные стадии каталитического механизма. Замена F41H вызывала понижение каталитической константы скорости по перекиси водорода на два порядка и на один порядок по АБТС. При окислении иодида мутация приводила к смене каталитического механизма. Тогда как замена НИЗЕ влияла преимущественно на стадию окисления АБТС и отщепление продукта его окисления. При этом в реакции окисления иодида данный мутант имел на порядок меньшие константы скорости как по перекиси водорода, так и по иодиду. На основании проведенных исследований высказаны предположения, что роль замещенных остатков фенилаланинов (Phe-41 и Phe-143) состоит в формировании гидрофобной полости, обеспечивающей прочное нековалентное связывание порфиринового цикла гемина [Газарян и др., 1995].

Таким образом, активный центр пероксидазы представляет область на поверхности белковой глобулы, расположенной с дистальной стороны гемина, образованной из спиралей А, В, С, D (рис. 4). Активную роль в каталитическом процессе пероксидазного окисления субстратов принимает участие Fe3+, координирующее с четырьмя атомами азотов пирролов протопорфирина, проксимальным лигандом которого является остаток имидазола гистидина белка (His-170). Шестым лигандом является молекула воды. В процессе восстановления перекиси водорода участвуют His-42 и Arg-38, расположенные в спирали В (Schuller et al., 1996; Gajede et all., 1996; Аммосова и др., 1997; Газарян и др., 1998).

Рис. 4. Модельная структура пероксидазы хрена. Показаны участки, структурно-сходные с ауксин-связывающими белками (серым цветом), ос-спирали А, В, С, О, Н и I, гем и остатокТгр-117 [Савицкий и др., 1998].

В координации гемина принимают участие остатки фенилаланинов (РЬе-41 и РЬе-143), роль которых заключается в формировании гидрофобного окружения нековалентносвязанного гемина и обеспечении его прочного встраивания в белковую глобулу [Газарян и др., 1995].

Субстратсвязывающая площадка для соединений органической природы представлена протяженной гидрофобной областью, включающей Аг§-38, РЬе-142, РЬе-143. Местом связывания для оксидазных субстратов пероксидазы, в частности ИУК, может быть дистальный субдомен, включающий спирали А (целиком), В (середина), С (начало), Б (целиком) и переход спирали Э к Б' (Упоров, Егоров, 1997; Савицкий и др., 1998).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рогожина, Татьяна Васильевна

Выводы

4. Исследование реакций совместного окисления о-дианизидина с различными фенотиазинами позволило установить, что фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата, при этом среди изученных фенотиазинов, расположение функциональных групп хлорпромазина, обеспечивают его преимущественное пероксидазное окисление по сравнению с о-дианизидином.

5. В реакциях совместного окисления тиопроперазина и о-дианизидина установлен сложный регуляторный механизм, который обусловлен тем, что при рН 4,5-5,0 проявлялся антиконкурентный тип ингибирования, тогда как с возрастанием рН (рН>5,5), за счет депротонирования одной из функциональных групп активного центра фермента, происходило переключение механизма переноса электронов с донора водорода о-дианизидина, на преимущественное окисление донора электронов - тиопроперазин.

Заключение

Исследование кинетики пероксидазных реакций позволило установить, что неспецифическое связывание субстратов различной природы может происходить в протяженной субстратсвязывающей области активного центра пероксидазы, расположенной на поверхности белковой глобулы фермента, в составе доменов которой присутствуют преимущественно гидрофобные аминокислотные остатки. Непосредственно в активном центре пероксидазы не проявляются аминокислотные остатки, содержащие БН-, ОН-, 1чГН2- и СООН-группы.

Большие размеры субстратсвязывающей области позволяют связываться в активном центре пероксидазы неорганическим и органическим соединениям, что проявляется в неизбирательности действия фермента по отношению к природе окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, на протекание которых могут оказывать влияние, присутствующие в среде активаторы или ингибиторы фермента. Так, например, изучение пероксидазных реакций окисления о-дианизидина и гидрохинона в присутствии индолил-3-уксусной кислоты позволило установить индивидуальные участки связывания этих субстратов и ингибитора в активном центре пероксидазы. Поскольку место связывания ИУК на поверхности белковой глобулы было изучено методом антигенного картирования [Аммосова и др., 1997].

В реакции окисления о-дианизидина в присутствии ИУК, проявляемый конкурентный тип ингибирования свидетельствовал о том, что о-дианизидин и индол ил-3-уксусная кислота связываются в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствовало как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связывались в различных местах активного центра, однако, если индол ил-3-уксусная кислота связывалась на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становилось невозможным. Это может наблюдаться вследствие удаленности мест связывания эффектора и субстрата или в результате конформационных изменений глобулы фермента при связывании ингибитора, или наличием регуляторного участка на поверхности белковой глобулы. Причем при рН 4,5-6,5 тип ингибирования ИУК пероксидазы в реакции окисления гидрохинона неконкурентный, однако при увеличении рН он меняется и становиться смешанным. При этом ухудшалось связывание субстрата, т.е. при наличии ИУК происходит понижение сродства гидрохинона к активному центру фермента. Однако, если все-таки гидрохинон связался в активном центре, то дальнейшее его превращение ухудшалось. Причем связывание ИУК с пероксидазой зависело от рН среды и природы субстрата. Субстраты, имеющие близкую с ИУК полярность, значительно повышали эффективность связывания ингибитора с пероксидазой. Поэтому преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы, по-видимому, должна быть гидрофобная область. Тогда как для гидрохинона местом связывания является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков. Подтверждением различных мест связывания о-дианизидина и гидрохинона в активном центре пероксидазы служат данные по совместному пероксидазному окислению этих субстратов.

Использование ИУК в качестве ингибитора реакций пероксидазного окисления АК, позволило определить место локализации участка связывания молекул аскорбиновой кислоты в активном центре пероксидазы. По-видимому, таким участком является дистальная область активного центра пероксидазы. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления АК, когда в активном центре фермента связывается по крайней мере одна молекула субстрата. При связывании двух и более молекул АК с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления АК, что, возможно, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата. Использование ИУК позволяет высказать предположение, что участки связывания молекул АК пространственно удалены, проявлением этого является неконкурентный характер ингибирования пероксидазы ИУК при окислении АК в присутствии второй молекулы субстрата. При этом связывание ИУК в активном центре пероксидазы создает препятствие для протекания реакции пероксидазного окисления АК. Однако ингибитор проявляет неконкурентный характер ингибирования при окислении двух и более молекул АК.

Сложность механизмов пероксидазного окисления органических субстратов, таких как о-дианизидин, гидрохинон, аскорбиновая кислота, фенотиазины и другие, позволяет предположить, что область активного центра пероксидазы разделена на несколько участков, где могут упорядоченно связываться окисляемые субстраты, и регуляторный участок, связывание в которым субстратов может регулировать протекание каталитического процесса. Последовательное связывание в этих участках субстратов, создает условия для управления ферментативным процессом, основанного на принципе корпоративного взаимодействия субстратов.

Наличие регуляторного участка на поверхности белковой глобулы фермента выявлено в исследованиях реакций совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия, а также аскорбиновой кислоты и гидрохинона. Проведенное картирование активного центра пероксидазы на основании кинетических данных индивидуального и совместного окисления субстратов позволило выделить два разных участка в активном центре пероксидазы, связывание в которых субстратов обусловлено природой и индивидуальностью их строения. Особенно это проявляется в реакциях совместного окисления субстратов, при осуществлении которых утрачивается неизбирательность в действии фермента и приобретается специфичность выбора окисляемого субстрата, а также устанавливается упорядоченное окисление субстратов. Т.е. каждый из участвующих в реакции субстратов приобретает сродство к индивидуальному участку связывания в активном центре фермента, которые условно можно обозначить согласно природе связывающихся субстратов. Один участок связывания о-дианизидина, а другой -гидрохинона. В о-дианизидиновом участке кроме о-дианизидина среди исследуемых нами субстратов могут связываться: хлорпромазин, ИУК, триптофан, строфантин G, аскорбиновая кислота, НАДН, амид III, салицилат натрия, а в гидрохиноновом участке - ферроцианид калия, трифтазин, тиопроперазин, дигоксин. Причем субстраты, связывающиеся в одном участке, могут конкурировать между собой за участок связывания, что проявляется в дифференцированном их окислении. При этом избирательность обусловливается природой субстрата и его сродством к участку связывания, доступностью электроннотранспортных путей к гемину.

Наличие обширной субстратсвязывающей области в активном центре пероксидазы, создает условия для связывания сразу нескольким молекулам субстратов одинаковых или разных по строению. При возможности только одному из них участвовать в каталитическом процессе. Тогда как действие другого субстрата проявляется в регулировании (активировании или ингибировании) ферментативной реакции. При этом реализуется принцип: один окисляется, а другой регулирует каталитический процесс. Причем разные по природе субстраты, связываются в различных участках активного центра фермента или в области расположения регуляторного участка.

Кроме того, нами установлено взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов при прорастании семян пшеницы. Показано, что пероксидаза активно участвует в формировании пусковых механизмов прорастания семян пшеницы. Поскольку в реакциях пероксидазного окисления различных субстратов, в том числе и антиоксидантов, могут образовываться свободные радикалы, способные ускорять процессы свободнорадикального окисления, инициирующие ПОЛ на начальных этапах прорастания семян пшеницы. Таким способом пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, по-видимому, осуществляет контроль за уровнем перекиси водорода и содержанием антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а АО накапливаясь в тканях участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, при этом их избыток может ингибировать фермент. Тогда как в процессе метаболизации антиоксидантов изменяется их концентрация, что может проявляться в регулировании активности пероксидазы и осуществлении общего контроля над деятельностью системы антиоксидантной защиты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рогожина, Татьяна Васильевна, Якутск

1. Аверьянов A.A., Исмаилов А.И. Участие супероксидного радикала в автоокислении госсипола // Биол. науки.-1986, № 5.-С.76-78.

2. Аммосова Т.Н., Упоров И.В., Рубцова М.Ю., Игнатенко О.В., Егоров A.M., Колесанова Е.Ф., Арчаков А.И. Антигенное картирование пероксидазы хрена (изофермент С) // Биохимия.-1997.-Т.62, № 4.-С.516-524.

3. Андреева В.А. Фермент пероксидаза. Участие в защитном механизме растений. М.:Наука, 1988.-129 с.

4. Баландина Г.Н., Лысогорская E.H., Морозова Е.А., Степанов В.М. Окрашенный водорастворимый карбодиимид как реагент для модификации белков // Химия природн. соединен.-1975.-Т.11, № 2.-С.198-201.

5. Барабай В.А. Растительные фенолы и здоровье человека. -М.:Наука, 1984.-160 с.

6. Березин И.В., Клесов A.A. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М:МГУ, 1976.-С.111-114.

7. Березин И.В., Угарова H.H., Дмитриева Гетлинг М.П., Кершенгольц Б.М. Кинетика и механизм действия пероксидазы из хрена в реакции окисления диоксифумаровой кислоты кислородом воздуха // Биохимия.-1975.-Т.40, №3.-С.475-483.

8. Березин И.В., Угарова H.H., Кершенгольц Б.М., Бровко Л.Ю. Влияние простетической группы пероксидазы из хрена на стабильность фермента// Биохимия.-1975.-Т. 40, №2.-С.297-301.

9. Богатский A.B., Назарова Н.Ю., Кинтя П.К. Модификация бислойных липидных мембран среди стероидных гликозидов // Докл. АН СССР.-1960.-Т.252, №1.-С.235-237.

10. Вербов В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа // Твердофазный иммуноферментный анализ / Под ред. Ф.С. Носкова. Тр. ин-та им. Пастера. Л.:Изд-во ин-та им. Пастера, 1986.-С.З-27.

11. Верхотуров В.В. Взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов на прорастание семян пшеницы. Автореф. дис. . канд. биол. наук.-Иркутск, 1999.-23 с.

12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.:Наука, 1972.-252 с.

13. Газарян И.Г., Досеева В.В., Галкин А.Г., Тишков В.И. Получение и каталитические свойства точечных мутантов Phe41-> His и Phel43 Glu пероксидазы хрена, экспрессируемых в Escherichia coli // Биохимия,-1995.-Т.60, № 10.-С.1555-1563.

14. Газарян И.Г., Упоров И.В., Чубарь Т.А., Фечина В.А., Мареева Е.А., Лагримини Л.М. Влияние pH на стабильность анионной пероксидазы табака и ее взаимодействие с перекисью водорода // Биохимия.- 1998.-Т.63, № 5.-С.708-715.

15. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток.-Новосибирск:Наука, 1990.-243 с.

16. Гончар М., Сибирный A.A. Способ определения пероксидазной активности биологических объектов: A.C. 1636773 СССР. Приоритет от 13.01.1988. Зарегистр. 23.03.1991.

17. Гудвин Т, Мерсер Э. Введение в биохимию растений.-М.:Мир, 1986, Т.1.-392 с.

18. Гусель В.А., Маркова И.В. Справочник педиатра по клинической фармакологии.-Л.:Медицина, 1989.-С. 103.

19. Гуськов A.B., Земская В.А., Агаларзаде Г.Б., Калиберная З.В., Черникова Л.М. Изменения ауксиноксидазной активности в укореняющихся черенках фасоли под действием ИУК и 2,4-Д // Физиол. растений.-1985.-Т.32, № 6.-С.1137-1144.

20. Данилова Н.С. Интродукция многолетних травянистых растений флоры Якутии.-Якутск:ЯНЦ СО РАН, 1993.-164 с.

21. Долманова И.Ф., Угарова H.H. Ферментативные методы анализа // Жур. анал. химия.-1980.-Т.35, № 8.-С.1597-1639.

22. Домогло A.C., Чобан И.Н., Берсукер И.В. Структурные признаки антиоксидантной и фунгицидной активности стероидных гликозидов // Биоограническая химия.-1985.-Т.11, №3.-С.408-414.

23. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика.-М.:Мир, 1991.-544 с.

24. Дубинина Е.Е., Шугалей И.В. Окислительная модификация белков // Успехи соврем, биологии,-1993.-Т. 113, № 1.-С.71-81.

25. Журавлев А.И. Биоантиокислители в животном организме/ Биоантиокислители.-М., 1975.-С. 15-20.

26. Жученко A.A., Балашова H.H., Кинтя П.К. Действие стероидных гликозидов на жизнеспособность пыльцы межвидового гибрида томата // Докл. АН СССР.-1984.-Т.274, № 5.-С.1239-1241.

27. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи соврем. биол.-1993.-Т.113, № 3.-С.286-296.

28. Иванова Т.М., Рубин Б.А. О природе фенолоксидазного действия пероксидазы // Биохимия.-1962.-Т.27, № 4.-С.622-630.

29. Иванова Т.М., Рубин Б.А. Об окислении кодегидразы I пероксидазой //ДАН СССР.-1963.-Т. 150, № 2.-С.414-416.

30. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа. -М.:Мир, 1988.-135 с.

31. Канцерогенные вещества. Справочник./В. С. Турусов. М.:Медицина, 1987.-450 с.

32. Карасева Е.И., Чередникова Т.В., Метелица Д.И. Влияние степени гидротации обращенных мицелл аэрозоля от на каталитическую активность пероксидазы, ее конъюгата с кортизолом и их иммунных комплексов // Биохимия,-1996.-Т.62, № 2.-С.322-334.

33. Качурин A.M., Кропачев Е.В., Иоганнсен М.Г., Петров A.C. Особенности пероксидазного окисления амидопирина и его аналогов // Биохимия.-1991.-Т.56, № 10.-С.1768-1778.

34. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи соврем, биологии.-1993. -Т.113, № 4.-С.456-470.

35. Ким Б.Б. Моноклональные антитела в исследовании ферментов. В кн.: Итоги науки и техники. Биотехнология.-М.: ВИНИТИ.-1989.-Т.20.-С.97-132.

36. Кинтя П.К. Природные биорегуляторы стеройдной природы // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева.-1988.-Т.ЗЗ, №5.-С.584-586.

37. Кинтя П.К., Бурцева Е.А., Ковальчук Л.П. Поиск антиоксиданта в ряду стероидных гликозидов // Химико-фарм. журн.-1982, № 1.-С.95-97.

38. Кинтя П.К., Лазуревский Г.В., Балашова H.H. Строение и биологическая активность стероидных гликозидов ряда спиростана и фуростана.-Кишинев: Наука, 1987.-235 с.

39. Клячко Н.Л. Регуляция ферментов структурой и природой матрицы в микрогетерогенных системах на основе агрегатов поверхностно-активных веществ. Дисс. . д-ра хим. наук. М.:МГУ, 1990.-223 с.

40. Клячко H.JT., Дулькис Ю.К., Сухорученко Т.А., Левашов A.B. Стабильность и стабилизация рекомбинантной пероксидазы в системе обращенных мицелл // Биохимия.-1997.-Т.62, № 3.-С.394-399.

41. Крылов С.Н., Крылова С.М., Рубин Л.Б. Механизм ингибирующего действия фенолов на ферментативное окисление индолил-3-уксусной кислоты // Биохимия.-1993.-Т.58, № 6.-С.953-961.

42. Кутузова Г.Д. Влияние химической модификации функциональных групп ферментов на их структуру и стабильность: Дис. .канд. хим. наук.-Москва, 1981.-159 с.

43. Кутузова Г.Д., Угарова H.H. Стабилизация пероксидазы хрена при ацетилировании фермента и в присутствии ионов кальция // Биоорган, химия.-198 l.-T.76,№ 1.-С.75-85.

44. Куч Д. Иммунизация тыквенных против грибных, бактериальных и вирусных болезней // Инфекционные болезни растений: Физиологические и биохимические основы / Ю. Т. Дьяков.-М.:Агропромиздат, 1985.-С.150-168.

45. Лазуревский Г.В., Кинтя П.К., Пухальская Е.С. Стероидные гликозиды, строение и биологическая активность // Химико-фармацевт. журн.-1977, №6.-С. 19-29.

46. Лебедева О.В. Кинетика и механизм взаимодействия гемсодержащей пероксидазы с органическими субстратами и физиологически активными веществами: Автореф. дис. . канд. хим. наук. -М., 1980.-16 с.

47. Лебедева О.В., Угарова H.H. Механизм пероксидазного окисления. Субстрат-субстратная активация в реакциях, катализируемых пероксидазой хрена // Изв. РАН. Серия химич.-1996, №1.-С.25-32.

48. Лебедева О.В., Угарова H.H., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена//Биохимия.- 1977.-Т.42, № 8.-С.1372-1379.

49. Лебедева О.В., Угарова H.H., Березин И.В. Совместное окисление ферроцианида калия и о-дианизидина перекисью водорода, катализируемое пероксидазой хрена // Биохимия.-1981.Т.46, № 7.-С.1202-1209.

50. Лебедева О.В., Угарова H.H. Стационарная кинетика реакции окисления NADH пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена // Биохимия.- 1997.-Т.62, № 2.-С.249-253.

51. Левашов A.B. Катализ ферментами в системах обращенных мицелл: Автореф. дисс. . д-ра хим. наук.-М., 1987.-45 с.

52. Левит М.Н., Шкроб A.M. Лигнин и лигниназа // Биоорган, химия.-1992.-Т.18, № 3.-С.309-344.

53. Лекарственные растения Сибири для лечения сердечно-сосудистых заболеваний / Н.В. Казаренова, М.Н. Ломоносова, В.М. Триль.-Новосибирск:Наука, 1991.-240 с.

54. Макаров A.A. Биологически активные вещества в растениях Якутии. Якутск:Якутский научный центр СО АН СССР, 1989.-156 с.

55. Максимов И.В. Изучение факторов устойчивости пшеницы и эгилопса к септориозу: Дис. . канд. биол. наук. СПб:ВИЗР, 1994. 21 с.

56. Максимов И.В., Хайфуллин P.M., Ямалеев A.M., Ямалеева A.A. Использование биополимера хитина для разделения изоферментов пероксидазы пшеницы / Вопросы биотехнологии / P.P. Ахметова.-Уфа:Изд-во БГУ, 1995.-С.120-127.

57. Максютов А.З., Загребельный С.Н. Антигенные детерминанты белков. Гуморальный иммунный ответ // Мол. биология.-1993.-Т.27, №5.-С. 980-991

58. Матусис И.И. Витамин С (аскорбиновая кислота) // Витамины / М.И. Смирнова.-М.Медицина, 1974.-С.384-414.

59. Матяш Л.Ф., Оглоблина О.Г., Степанов В.М. Изучение реакции пепсина с водорастворимыми карбодиимидами и окрашенным амином // Биохимия.-1972.-Т.37, № 5.-С.1067-1073.

60. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т.1, 2.-М.:Медицина,2002.

61. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи соврем. биол.-1993.-Т.113, № 4.-С.442-455.

62. Михно А.Н., Минакова С.Г., Харченко Л.В. Влияние предпосевной обработки семян биологически активными веществами на полевую всхожесть и развитие проростков сахарной свеклы // Физиология и биохимия культ, растений.-1997.-Т.29, № 2.-С. 107-114.

63. Муравьева Д.А. Фармакогнозия.-М.¡Медицина, 1978.-С.413-417.

64. Нариманов A.A., Корыстов Ю.Н. К механизму повышения всхожести семян ячменя перекисью водорода в условиях переувлажнения //Изв. РАН. Сер. биол.-1998,№ 1.-С. 110-114.

65. Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян.-Л.:Наука, 1985.-347 с.

66. Обручева Н.В., Антипова О.В. Физиология инициации прорастания семян // Физиол. растений.-1997.-Т.44, № 2.-С.287-302.

67. Овчаров К.Е. Роль витаминов в жизни растений. М.:Наука, 1956.345 с.

68. Паду Э.Х. Свойства пероксидазы и фенилаланин-аммиак-лиазы при образовании и лигнификации клеточных стенок стебля пшеницы // Физиология растений.-1995.-Т.42, № 3.-С.408-415.

69. Плетнева Н.Г. Химико-микроскопические методы исследования биологических материалов // Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / В.В. Меньшикова. М.:Медицина, 1987.-С.68.

70. Полак Д., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.:Мир, 1987.-456 с.

71. Полевой В.В. Физиология растений. М.:Высш.шк., 1989.-464 с.

72. Рамазанова J1.X., Мифтахутдинова Ф.Г., Алексеева В.Я. К вопросу об активном центре оксидазной функции пероксидазы // Биохимия.-1971.-Т.36, № 1.-С.67-71.

73. Роговина В.В., Муравьева P.A., Фомина В.А., Муштакова В.М. Пероксидазосомы клеток растений // Изв. РАН. Сер. биол.-1996, № 1.-С.16-22.

74. Рогожин В.В. Роль карбоксильных и гуанидиновых групп в функционировании пероксидазы хрена: Дисс. . канд. хим. наук.-Москва, 1984.-200 с.

75. Рогожин В.В. Возможные механизмы регулирования активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы избытком субстрата и кофермента // Боорган. химия.-1996.-Т.23, № 8.-С.575-579.

76. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Аскорбиновая кислота медленно окисляемый субстрат пероксидазы хрена // Биохимия.-1997.-Т.62, № 12.-С.1686-1690.

77. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние антиоксидантов (дигоксина, кверцетина и аскорбиновой кислоты) на каталитические свойства пероксидазы хрена// Биохимия.-1998.-Т.63, № 6.-С.63-68.

78. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы хрена// Биохимия.-1999.-Т. 64, № 2.-С. 75-80.

79. Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Влияние строфантина G на кинетику пероксидазного окисления медленно окисляемых субстратов пероксидазы // Биохимия.-2000.-Т.65, № 5.-С.657-664.

80. Рогожин В.В., Егорова П.С. Влияние экзогенных этанола и ацетальдегида на жизнеспособность семян пшеницы // Этанол и его метаболизм в высших организмах: Сб. научн. статей.-1991.-С. 90-99.

81. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Курилюк Т.Т., Охлопкова Е.П. Влияние температуры, ультрафиолетового излучения и функционально активных веществ на всхожесть семян пшеницы // Известия ТСХА.-1999.-№ 3.-С.105-124.

82. Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Влияние ультрафиолетового облучения семян на процессы перекисного окисления липидов в проростках пшеницы // Биохимия.-1996.-Т.61, № 8.-С.1432-1439.

83. Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Влияние малых доз ультрафиолетового облучения семян на состояние антиоксидантной системы, прорастающих зерен пшеницы // Известия ТСХА.-1999, № 4.-С.96-105.

84. Рогожин В.В., Курилюк Т.Т., Филиппова Н.П. Антиоксидантная активность проростков после ультрафиолетового облучения семян пшеницы // Наука и образование.-1997, № 4.-С.91-97.

85. Рубин Б.А. О биохимических механизмах антимикробиального иммунитета растений // Биол. науки.-1966, №2.-С.7-12.

86. Ругге Э.К., Блюменфельд JI.A. Свободные радикалы аскорбиновой кислоты, возникающие при взаимодействии с белками // Биофизика.-1965. № 10.-С.689-695.

87. Савицкий А.П., Угарова H.H., Березин И.В. Роль гема в формировании третичной структуры пероксидазы из хрена. Взаимосвязь между флуоресценцией и третичной структурой фермента // Биоорган. химия.-1977.-Т.З, № 9.-С.1242-1249.

88. Саксонов М.Н., Стом Д.И., Акимова Г.П., Нечаева JI.B. Смесь пирокатехин резорцин в качестве донора водорода при определении активности пероксидазы // Физиол. и биохимия культ. раст.-1993.-Т.25, № 5.-С.509-513.

89. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло // Соросовский Образовательный Журнал.-1996. № 3.-С.4-10.

90. Сова В.В., Еляева JT.A. Влияние реагентов, взаимодействующих с карбоксильными группами, на а-1,3-глюканазу из Spisula Sachalinens // Биорган. химия.-1978.-Т.4,№ 11.-С. 1547-1552.

91. Строев Е.А. Биологическая химия. М.:Высш. шк, 1986.-С.44-45.

92. Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Петров В.А. Калориметрическое исследование окисления аскорбиновой кислоты пероксидазой хрена // Биофизика.-1992.-Т.37, № 1.-С.17-22.

93. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии.-М.:Мир, 1981 .-Т. 1 .-С.261 -266.

94. Угарова H.H. Применение ферментов в химическом анализе // Введение в прикладную энзимологию. Учебное пособие / И.В. Березина, К. Мартинека.-М.:Изд-во МГУ, 1982.-С.З06-342,

95. Угарова H.H., Рожкова Г.Д., Васильева Т.Е., Березин И.В. Химическая модификация e-NH2-rpynn остатков лизина в пероксидазе из хрена. Доступность этих групп различным модифицирующим агентам // Биохимия.-1978a.-T.43, № 5.-С.793-797.

96. Угарова H.H., Рожкова Г.Д., Березин И.В. Химическая модификация e-NH2-rpynn лизина в пероксидазе из хрена. Влияние ее на каталитические свойства и пространственную структуру фермента // Биохимия.-19786.-Т.43. № 7.-С. 1242-1250.

97. Угарова H.H., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение. М.:МГУ, 1981.-92 с.

98. Упоров И.В, Егоров A.M. Моделирование пространственной структуры пероксидазы хрена (изофермент С) // Докл. РАН.-1997.-Т.356, № 5.-С.696-699.

99. Хайруллин Р.М, Юсупова З.Р., Максимов И.В. Защитные реакции пшеницы при инфицировании грибными патогенами. 1. Взаимодействие анионных пероксидаз пшеницы с хитином, хитозаном и телиспорами Tilletia caries//Физиол. растений.-2000а.-Т.47, № 1.-С.108-113.

100. Чупахина Г.Н., Залящева М.В., Сивцова A.M. Количественная локализация аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в листьях ячменя в связи с освещением // Фотосинтез и продуктивность растений. Калининград: Калинингр. ун-т, 1987.-96 с.

101. Шемякин М.И., Хохлов A.C., Колосов М.Н., Бергельсон Л.Д., Антонов В.К. Химия антибиотиков. М.:Из-во АН СССР, 1961.-501 с.

102. Шервуд Р.Т., Вэнс К.П. Первичные изменения в клеточных стенках эпидермиса при проникновении паразита/Инфекционные болезни растений: Физиологические и биохимические основы / Ю.Т. Дьяков. -М.:Агропромиздат, 1985.-С.34-54.

103. Шибато К. Доступность для реагентов и окружения аминокислотных остатков в нативных белках.-М.:Мир, 1974.-С.344-386.

104. Якушкин Н.И. Физиология растений. М.¡Просвещение, 1993.-С.275-279.

105. Angelini R, Federico R. Histochemical evidence of polyamino oxidation and generation of hydrogen peroxide in the cell Wall // J. Plant Physiol.-1989.-Vol.135, N 2.-P.212-218.

106. Apostol J., Heinstein P.F., Low P.S. Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells // J. Plant Physiol.- 1989.-Vol.90, N 1.-P.109-114.

107. Araiso T., Dunford H.B. Horseradish peroxidase. XLI. Complex formation with nitrate and its effect upon compound I formation // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1980.-Vol.90, N 4.-P.1177-1182.

108. Araiso T., Dunford H.B. Effect of modification of heme propínate groups on the reactivity of horseradish peroxidase // Arch. Biochem. Biophys.-1981.-Vol.211, N 1.-P.346-351.

109. Araiso T., Dunford H.B., Chang C.K. Horseradish peroxidase. XXXVII. Compound I formation from reconstituted enzyme laching free carboxyl groups as heme side chains // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1979.-Vol.90, N 2.-P.520-524.

110. Bakardjieva N.T. Metal ions control on activity, polyfunctionality and UV-photosensitivity of plant peroxidase // Molecular and Physiological Aspect of Plant Peroxidases/Eds Greppin H., Penel C., Gaspar T. Geneva:Univ. Geneva, 1986.-P.143-194.

111. Balyet H. Les glucosides Digitaligues: Une nouvrlle reaction d'identite I I Schweir. Apotheker. Ztg. -I918.-Bd 56.-S.71-76.

112. Birecka H., Galston A.W. Peroxidase ontogeny in a dwarf pea stem as affected by gibberellin and decipitation // J. Exp. Bot.-1970.-Vol.21, N 4.-P.735-739.

113. Buettner G.R., Moseley P.L. Ascorbate both activates and inactivates bleomycin by free radical generation // Biochemistry.-1992.-Vol.31, N 40.-P.9784-9788.

114. Carraway K. L., Koshland D.E. Reaction of tyrosine residues in proteins with carbodiimide reagents // Biochim. et biophys. acta.-1968.-Vol. 160, N 2-P.272-274.

115. Carraway K.L., Koshland D.E. Reaction of tyrosine reduces in proteins with carbodiimide reagents. In: Methods in Enzymology. N.Y.-London:Acad. Press.-1972.-Vol.25.-part B.-P.616-623.

116. Carraway K.L., Triplett R.B. Reaction of carbodiimides with protein sulfhydryl groups // Biochem. et biophys. acta.-1970.-Vol.200, N 3.-P.564-566.

117. Chance B. The kinetics of the enzyme-substrate compound of peroxidase // J. Biol. Chem.-1943.-Vol.151, N 2.-P.553-577.

118. Chance B. The properties of the enzyme-substrate compound of horseradish peroxidase and peroxide. III. The reaction of complex II with ascorbic acid // Arch. Biochem.-1949.-Vol.24.-P.389-399.

119. Chance B. The kinetics and stoichiometry of the transition from the primary to the secondary peroxidase peroxide complexes // Arch. Biochem. Biophys.-1952.-Vol.41, N 2.-P.416-424.

120. Clementi F., Palade C.E. Intestinal capillaries. I. Permeability to peroxidase and ferritin//J. Cell Biol.-1969.-Vol.41, N 1.-P.33-58.

121. Coldacre P.L., Galston A.W., Weintraub R.L. The effect of substituted phenols on the activity of the indoleacetic acid oxidase of peas // Arch. Biochem. Biophys.-1953.-Vol.43, N 2.-P.358-343.

122. Cottle W, Kolattukudy E.P. Abscisic acid stimulation of suberinization: introduction of enzymes and deposition of polymeric components and associated waxes in tissue cultures of potato tuber // Plant Physiol.- 1982.-Vol.70, N 3,-P.775-780.

123. Critchlow, J.E., Dunford H.B. The kinetics and stoichiometry of the transition from the primary to the secondary peroxidase peroxide complexes // J. Biol. Chem.-1972.-Vol. 247.-P.3714-3715.

124. Critchlow J.E., Dunford H.B. Studies on horseradish peroxidase. IX. Kinetics of the oxidation of p-cresol by compound II // J. Biol. Chem.-1972.-Vol. 248, N 12.-P.3703-3713.

125. Czaninski Y, Catesson A.-M. Localisation ultrastructurale d'activité peroxidasiqnes dans les tissus conducteurs végétaux an cour du cycle annuel // J. Micr.-1969.-Vol.8, N 4.-P.875-881.

126. Davies M.D., Jones P., Mantle D. The kinetics of formation of horseradish peroxidase compound I by reaction with peroxobenzoic acids. pH and peroxo acid substituent effects // Biochem. J.-1976.-Vol.l57, N 1.-P.247-253.

127. DiNello R.K., Dolphin D.H. Substituted hemins as probes for structure-function relationships in horseradish peroxidase // J. Biol. Chem.-1981-Vol.56, N 13.-P.6903-6912.

128. Doke N. NADPH-dependent 02" generation in membrane fractions isolated from wounded potato tubers inoculated with Phytophthora infestans // Physiol. Plant Pathol.-1985.-Vol.27, N 3.-P.311-317.

129. Doke N., Ohashi Y. Involvement of an 02* generating systems in the induction of necrotic lesions on tobacco leaves infected with tobacco mosaic virus // Physiol. Mol. Plant. Pathol.-1988.-Vol.32, N 1.-P. 163-169.

130. Douzov P., Leterrier F. Electron spin resonance of intermediates in the catalytic reaction of peroxidase at low temperature // Biochem. Biophys. Acta.-1970.-Vol.220, N 2.-P.338-340.

131. Dure L., Cormier M.J. The oxidasation of phenol and its reaction product by horseradish peroxidase and hydrogen peroxide /Biochem. Biophys. Res. Commun.-1963 .-Vol. 11 .-P.489-495.

132. Dure L., Cormier M.J. Additional properties of the peroxidase /J.Biol.Chem.-1964.-Vol.239.-P. 2351-2359.

133. Dunford H.B., Hewison W.D. Effect of mixed solvents of the formation of horseradish peroxidase compound I. The importance of diffusion-controlled reactions // Biochemistry.-1977.-Vol. 16, N 13.-P.2949-2957.

134. Dunford H.B., Hewison W.D., Steiner H. Horseradish peroxidase. XXIX. Reactions in water and deuterium oxide; cyanide binding, compound I formation, and reactions of compound I and II with ferrocyanide // Can. J. Chem.-1978.-Vol.56, N 22.-P.2844-2852.

135. Dunford H.B., Stillman J.S. On the function and mechanism of action of peroxidase//Coord. Chem. Rev.-l976.-Vol.l 9, N 3.-P. 187-251.

136. Espellie K.E., Francheschi V.R., Kollattukudy P.E. Immunocytochemical localization and time course of appearance of an anionic peroxidase associated with suberinization in wound-healing potato tuber tissue // Plant Physiol.-1986.-Vol.81, N 2.-P.487-492.

137. Falk J.E. Porphyrins and Metalloporphyrins // Amsterdam.-N.Y.-London etc.: Elsevier, 1964.-236 p.

138. Ferrer M.A., Menoz R., Ros Barcelo A. A biochemical and cytochemical study of the cuticle-associated peroxidases in Lupines // Ann. Bot.-1991.-Vol.67, N 3.-P.561-568.

139. Foyer Ch., Rowell J., Walker D. Measurement of the Ascorbate Content of Spinach Leaf Protoplasts and Chloroplasts during Illumination // Planta.-1983.-Vol.157, N 3.-P.239-245.

140. Fry S.C. Formation of isodityrosine by peroxidase isozymes // J. Exp. Bot.-1987.-Vol.38, N 3.-P.853-859.

141. Gaspar T., Penel C., Castillio I., Greppin H. A two step control of basic and acidic peroxidases and its significance for growth and development // Physiol. Plant.-1985.-Vol.64, N 4.-P.895-934.

142. Gazaryan I.G., Egorov A.M. Advances in Molecular and Cell Biology, 1996. Vol. 15A. Greenwich (Connecticut), JAI Press Inc., P.59-68.

143. George P. The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome C peroxidase and horseradish peroxidase:-.Titration with reducing agents. //Biocem.J.-1953.-Vol.54, N2.-P.267-276.

144. Gibson D.M., Lin E.H. The inhibition of peroxidase and indole-3-acetic acid oxidase activity by British antilewisite // Arch. Biochem. Biophys.-1978.-Vol.186, N 3.-P.-317-324.

145. Graham M.Y., Graham T.Z. Rapid accumulation of anionic peroxidases and phenolic polymers in soybean cotyledon tissues following treatment with Phytophtora megasperma f. sp. glicinea wall glucan // Plant Physiol.-1991,-Vol.97.-P. 1445-1455.

146. Grierson D., Covey S. Plant molecular biology. New York, 1984.-1761. P

147. Gripshöver B., Morre D.J., Boss W.F. Fractionation of suspension cultures of wild carrot and kinetics of membrane labeling // Protoplasma.-1984.-Vol.l23,N 1.-P.213-217.

148. Grob K., Matile Ph. Compartmentation of Ascorbic Acid in Vacuoles of Horseradish Root Cells. Note on Vacuolar Peroxidase // Z. Pflanzenphysiol.-1980.-Bd.98, N 2.-S.235-239.

149. Haschke R.H, Friedhoff J.M. Calcium-related properties of horseradish peroxidase // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1978.-Vol.80, N 4.-P.1039-1042.

150. Hewson W.D., Dunford H.B. Oxidation of p-cresol by horseradish peroxidase compound I //J. Biol. Chem.-1976a.-Vol.251, N 19.-P.6036-6042.

151. Hewson W.D., Dunford H.B. Stoichiometry of the reaction between horseradish peroxidase // J. Biol. Chem.-1976b.-Vol.251, N 19.-P.6043-6052.

152. Hoare D.G., Koshland D.E. A procedure for the selective modification of carboxylic acid groups in proteins // J. Amer. Chem. Soc.-1966.-Vol.88, N 9.-P.2057-2059.

153. Hoare D.G., Koshland D.E. A method for the quantitative modification and estimation of carboxylic groups in proteins // J. Biol. Chem.-1967.-Vol.242, N11.-P.1447-2453.

154. Hubbard C.D., Dunford H.B., Hewson W.D. Horseradish peroxidase. XVII. Reactions of compound I and II with p-aminobenzoic acid in deuterium oxide // Can. J. Chem.-1975.-Vol.53, N 6.-P.1563-1569.

155. Jamada, H., Jamasaki, J. Effect of modification of function groups on the reactivity of horseradish peroxidase // Arch. Biochem.and Biophys.-1974.-Vol.165.-P.728-738.

156. Jamada H., Makino R., Jamasaki J. Effect of 2,4-substituents of deuteroheme upon redox potentials of horseradish peroxidases // Arch. Biochem. and Biophys.-1975.-Vol.l69.-P.344-353.

157. Jensem W.A., Kavaljian L.G. The Cytochemical Localization of Ascorbic Acid in Root Tip Cells // J. Biophys. Biochem. Cytology.-1956.-Vol.2, N 1.-P.87-92.

158. Job D., Jones P. Compound I formation with turnip peroxidases and peroxibenzoic acids // Eur. J. Biochem.-1978.-Vol.86, N 2.-P.565-572.

159. Johansson M.W. Peroxinection, a cell-adhesive peroxidase // Plant Peroxidase Newsletter 1997. N 9.-P.3-5.

160. Jones P., Dunford H.B. On the mechanism of compound I formation from peroxidases and catalases // J. Theor. Biol.-1977.-Vol.69, N 2.-P.457-470.

161. Jones P., Dunford H.B. Horseradish peroxidase. XXVIII. Formation and reactivity of the alkoline from. Evidence an enzyme-substrate complex in compound I formation // Can. J. Biochem.-1978.-Vol.56, N 10.-P.702-707.

162. Jouselle M. Chemical studies on yeast hexokinase specific modification of a single tyrosyl residue with l-ethyl-3(3-dimetylaminapropiil) carbodiimide // Eur. J. Biochem.-1977.-Vol.74, N 3.-P.478-480.

163. Kaneko Y., Tamura M., Yamazaki I. Formation of porphyrin cation radical in Zinc-substituted horseradish peroxidase // Biochemistry.-1980.-Vol.19, N 12.-P.5795-5799.

164. Kay E., Shannon L., Lew J.Y. Peroxidase isozymes from horseradish root. II. Catalytic properties // J. Biol. Chem.-1967.-Vol.242, N 10.-P.2470-2473.

165. Keilin B.D., Hartree E.F. Purification of horseradish peroxidase and comparison of its properties with those of catalase and methaemoglobin // Biochem. J.-1951.-Vol.49, N 1.-P.88-104.

166. Klapper M.H., Hackett D.P. The oxidatic activity of horseradish peroxidase. I. Oxidation of hydro and naphthohydroquinones // J. Biol. Chem.-1963.-Vol.238, N 11.-P.3736-3742.

167. Klapper M.H., Hackett D.P. Investigations on the multiple components of commercial horseradish peroxidase // Biochem. et biophys. acta.-1965.-Vol.96, N 2.-P.271-282.

168. Kosuge T. The role of phenolics in host response to infection // Ann. Rev. Phytopathol.-1969.-Vol.7,N 1.-P. 195-201.

169. MacAdam J.N. Peroxidase activity and termination of cell elongation in tall fescue leat blades//J. Cell. Biochem.-1993.-Suppl. 17A.-P.29.

170. McCapra G., Behesti I. Bioluminescence and chemiluminescence: Insruments and applications./Ed. Van Dyke K. Boca Raton: CRC Press, 1985. Vol.1. P.9-42.

171. Mader M., Amberg-Fischer V. Role of peroxidase in lignification of tobacco cells. I. Oxidation of nicotinamide adenine dinucleotide and formationof hydrogen peroxide by cell wall peroxidases // Plant Physiol.-1982,-Vol.70, N 4.-P.1128-1131.

172. Mader M., Fussl R. Role peroxidase in lignification of tobasso cells. II. Regulation by phenolic compounds // Plant Physiol.-1982.-Vol.70, N 4.-P.1132-1134.

173. Mader M., Ungemach J., Schlos P. The role of peroxidase isoenxyme groups of Nicotiana tabacum in hydrogen peroxide formation // Planta.-1980.-Vol.68, N 5.-P.467-472.

174. Maeda Y., Marita Y. Moessbauer effect in peroxidase-hydrogen peroxide compounds // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1967.-Vol.29, N5.-P.680-685.

175. Maehly A.C. Splitting of horseradish peroxidase into prosthetic group and protein as a maens of studying the linkages between hemin and protein // Biochem. Biophys. Acta.-1952.-Vol.8, N 1.-P.1-8.

176. Mapson L.W.L. Ascorbinsaure biochemical systems. In: The Vitamins. Chemistry, physiology, methods. Ed. W.H.Sebrell, Jr. R.S.Harris. New York -London, 1967, P. 386

177. Melon J.E. Purification and characterization of isoperoxidases elicited by Aspergillus flavus in cotton ovule cultures // Plant Physiol.-1991.-Vol.95, N 1.-P. 14-20.

178. Metodiewa D., Pieres de Melo M., Escobar J.A., Cilento G., Dunford H.B. Horseradish peroxidase-catalyzed aerobic oxidation and peroxidation of indole-3-acetic acid. I. Optical spectra // Arch. Biochem. Biophys.-1992.-Vol.296, N 1.-P.27-33.

179. Moller K.M., Ottolenghi P. The oxidation of o-dianisidine by H202 and peroxidase at neutral pH // Comp. Rend. Trav. Lab. Carlsberg.-1966.-Vol.35, N16.-P.369-389.

180. Morishima J., Ogawa S. Proton nuclear magnetic resonance studies of compounds I and II of horseradish peroxidase // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1978.-Vol.83, N 3.-P.946-953.

181. Moss T.H., Ehrenbery A., Bearden A.J. Moessbauer spectroscopic evidence for the electronic configuration of iron in horseradish peroxidase and its peroxide derivatives // Biochemistry.-1969.-Vol.8, N 10.-P.4159-4162.

182. Ogawa S., Shira Y., Morishima I. Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme environmental structure. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1979.-Vol.90, N2.-P.674-678.

183. Paciolla C., Stefan A., D1 Gara L. Ascorbate system in Dasypyrum villosum from different environments // Bell.Soc.ital.biol.sper.-1991.-Vol.67, N 7.-P.699-706.

184. Pairoba C.F., Colombo S.L., Andreo C.S. Flavonoids as inhibitors of NADP-malic enzyme and PEP carboxylase from C4 plants // Biosci. Biotecnol. and Biochem.-1996.-Vol.60, N 5.-P.779-783.

185. Pang A., Catesson A.-M., Francesch C., Rolando C., Goldberg R. On substrate specificity of peroxidases involved in the lignification process // J. Plant Physiol.-1989.-Vol.135, N 2.-P.325-331.

186. Park R.D., Park C.K. Oxidation of indole-3-acetic acid amino acid conjugates by horseradish peroxidase // Plant Physiol.-1987.-Vol.84, N 3.-P.826-829.

187. Pieres de Melo M., Escobar J.A., Metodiewa D., Dunford H.B., Cilento G. Horseradish peroxidase catalyzed aerobic oxidation of indole-3-acetic acid. II. Oxygen uptake and chemiexcitation // Arch. Biochem. and Biophys.-1992.-Vol.296, N 1.-P.34-39.

188. Poulos T.L., Sheriff S., Howard A.J. Cocrystals of yeast cytochrome c peroxidase and horse heart cytochrome c. // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262.-P.13881-13884

189. Ralston I., Dunford H.B. Horseradish peroxidase. XXII. pH dependence of the oxidation of L-(-)-tyrosine by compound I // Can. J. Biochem.-1978.-Vol.56,N 12.-P.1115-1119.

190. Riehm J.P., Sheraga H.A. Structural studies of ribonuclease.XXI. The reaction between ribonuclease and a water-soluble carbodiimide // Biochemistry.-1966.-Vol.5, N 1.-P.99-102.

191. Roberts D.A. Systemic acquired resistance induced in hypersensitive plants by nonnecrotic localised viral infections // Virology.-1983.-Vol. 122, N 1,-P.207-209.

192. Ros Barcelo A., Menoz R., Sababer F. Lupin peroxidases. I. Isolation and characterization of cell wall-bomd isoperoxidase activity // Physiol. Plantarum.-1991 .-Vol.71, N 4.-P.448-456.

193. Sahulka J. Electrophoretic study on peroxidase, indoleacetic acid oxidase, and o-diphenol oxidase fraction in extractis from différents growth zone of Vicia faba L. Roots // Biol. Plant.-I970.-Vol. 12, N 1.-P. 191-198.

194. Saijo R., Takeo T. Induction of peroxidase activity by ethylene and indole-3-acetic in tea shoots // Agr. Biol. Chem.-1974.-Vol.38, N 11.-P.2283-2284.

195. Santimone M. Titration study of guaiacol oxidation of horseradish peroxidase // Can. J. Biochem.-1975.-Vol.53, N 6.-P.649-657.

196. Saunders B., Holmes-Siedle A., Stark B. Peroxidase: The properties and uses of a versatile enzyme and some related catalysts. London:Butterworths, 1964.-271 p.

197. Scalbert A., Monties B., Lallemand L-Y. Ether linkage between phenolic acid lignin fractions from wheat straw // Phytochemistry.-1985.-Vol.24, N 6.-P.1359-1362.

198. Schloss P., Walter C., Mader M. Basic peroxidases in isolated vacuoles of Nicotiana tabacum L // Planta.-1987.-Vol. 170, N 1 .-C.225-231.

199. Schonbaum G.R., Lo S. Internaction of peroxidases with aromatic1.peroxides and alkyl peroxides // J. Biol. Chem.-1972.-Vol.247, N 10.-P.3353-3360.

200. Schuller, D.J., Ban, N., van Huystee, R.B., McPherson, A., Poulos, T.I. Properties and structure of peroxidase /Structure.-1996.-Vol.4.-P. 311-321.

201. Searle C. Chemical carcinogens as laboratoy hazards. Chemical carcinogens./Ed. Ch. E. Searle. Washington, 1984.-P.303-324.

202. Shannon L.M., Kay E., Lew Y.Y. Peroxidase isoenzymes from horseradish roots. I. Isolation and physical properties // J. Biol. Chem.-1966.-Vol.241, N 9.-P.2166-2172.

203. Sharon N. Lis-H-lectins-cell-agglutinating and sugar-specific proteins // Sci. Amer.-1974.-Vol.230, N 5.-P.78-86.

204. Shin J.H.C., Shannon L.M., Kay E., Lew J.Y. Peroxidase isoenzymes from horseradish roots // J. Biol. Chem.-1971.-Vol.246, N 14.-P.4546-4551.

205. Siegel B.Z., Galston A.W. Indoleacetic acid oxidase activity ofapoperoxidase // Science.- 1967.-Vol. 157, N 3.-P. 1557-1559.

206. Slocum R.D., Furey MJ. Electron-microscopic cytochemical localization of diamine and polyamine oxidases in pea and maize tissues // Planta.-1991 .-Vol. 183, N 3 .-P.443-448.

207. Smith D.W., Williama R.J.P. Binding of ascorbic acid to horseradish peroxidase catalysis. // Structure and Binding.-1970.-Vol.7.-P.l-45.

208. Southerton S.G., Deverall B.J. Changes in phenylalanine ammonia-lyase and peroxidase activities in wheat cultivars expressing resistance to the leaf-rust fungus // Plant Pathol.-1990.-Vol.39, N 2.-P.223-229.

209. Srivastava O.P., Huystee R.B. IAA oxidase and polyphenol oxidase activities of peanut peroxidase isozymes // Phytochemistry.-1977.-Vol. 16, N 10.-P.1527-1530.

210. Stephan D., van Huystee R.B. Some aspects of peroxidase synthesis by cultured peanut // Z. Pflanzenphysiol.-1981 .-B. 101, N 2.-S.313-319.fc

211. Stillman M.J., Kollebone B.R., Stillman J.S. Characterization of the chromophores in horseradish peroxidase compounds I and II using magnetic circular dichroism // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1976.-Vol.72, N 2.-P.554-559.

212. Strickland E.H. Circular dichroism of horseradish peroxidase and its enzyme-substrate compounds // Biochem. Biophys. Acta.-1968.-Vol. 151, N 1.-P.70-75.

213. Schuller, D. J., Ban, N., van Huystee, R. B., McPherson, A., and Poulos, T. L. // Structure.-1996.-Vol.4.-P.311-321.

214. Swedin B., Theorell H. Dioximalec acid oxidase action of peroxidase // Nature.-1940.-Vol.145, N 3663.-P.71-72.

215. Teraoka J., Katagauwa T. Structural implication of the heme linked ionization of HRP-probed by the Fe-hystidine stretching Roman line // J. Biol. Chem.-1981.-Vol.256, N 8.-P.3696-3977.

216. Timkovich R. Detection of the stable addition of carbodiimide to proteins // Anal. Biochem.-1977.-Vol.79, N 1 .-P. 135-143.

217. Vance C.P., Anderson G.O., Sherwood R.T. Soluble and cell wall peroxidases in reed canarygrass in relation to disease and localized lignin formation // Plant Physiol.-1976.-Vol.57, N 6.-P.920-922.

218. Vance C.P., Kirk T.K., Sherwood R.T. Lignification as a mechanism of disease resistance //Annu. Rev. Phytopathol.-1980.-Vol. 18, N 2.-P.259-288.

219. Vance C.P., Sherwood R.T. Regulation of lignin formation in reed canarygrass in relation to disease resistance // Plant Physiol. -1976.-Vol.57, N 6.-P.915-919.

220. Welinder K.G., Smillie L.B., Schonhaum G.R. Amino acid sequence studies of horseradish peroxidase. I. Tryptic peptides // Canad. J. Biochem.-1972.-Vol. 50, N 1.-P.44-62.

221. Welinder K.G., Mazza C. Aminoacid sequence of heme-linked histidin-containing peptides of five peroxidases from horseradish and turnip // Eur. J. Biochem.-1977.-Vol.73, N 2.-P.353-358.

222. Wieringa-Brants D.H., Dekker W.C. Induced resistance in hypersensitive tobacco against tobacco mosaic virus by injection of intercellular fluid from tobacco plants with systemic acquired resistance // Phytopathology.-1987.-Vol.l 18, N 2.-P.165-170.

223. Yamazaki J., Piette L.H. Mechanism of airobic oxidase reaction catalysed by peroxidase // Biochem. Biophis. Acta.-1963.-Vol.77, N 1.-P.47-64.

224. Zimmerlin A., Wajtaszek P., Boiwell G.P. Synthesis of dehydrogenation polymers of ferulic acid with high specificity by a purified cell-wall peroxidase from french bean {Phaseolus vulgaris L.) // Biochem. J.-1994.-Vol.299, N 3.-P.747-753.

Информация о работе

Рогожина, Татьяна Васильевна
кандидата биологических наук
Якутск, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование активного центра и механизма действия пероксидазы с помощью функционально активных веществ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы