Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Mn-пероксидазы эндофитного и эпифитного штаммов бактерии Azospirillum brasilense

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Mn-пероксидазы эндофитного и эпифитного штаммов бактерии Azospirillum brasilense"

На правах рукописи

Купряшина Марин Александровна

Мп-ПЕРОКСИДЛЗЫ ЭНДОФИТНОГО II ЭПНФИТНОГО ШТАММОВ БАКТЕРИИ A7.OSPIRIl.LUM ВЯЛЯИ-ЕЖЕ

03.02.03 — микробиология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Саратов - 2014

005550256

005550256

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель: Никитина Валентина Евгеньевна

доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений н микроорганизмов Российской академии наук, лаборатория микробиологии, заведующая лабораторией

Официальные оппоненты: Гоголев Юрий Викторович

доктор биологических наук

Федеральное государственное бюджетное учреждение пауки Казанский иституг биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, лаборатория молекулярной биологии, заведующий лабораторией Плешакова Екатерина Владимировна доктор биологических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Саратовский государственный университет имени

Н.Г. Чернышевского», кафедра биохимии и биофизики, профессор кафедры

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Воронежский государственный университет», г. Воронеж

Защита состоится «4» июня 2014 г. в 11:00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук по адресу: 410049, Саратов, проспект Энтузиастов. 13. Тел./факс (8452) 970383.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ.

Диссертация и автореферат диссертации размещены на сайте ИБФРМ РАН:

ЬИрУАЬррт rll/disscгtacioпllvv-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан «/^¿¿'¿/-ЛАсЬя.014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.Н. Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. На сегодняшний день проблема молекулярных механизмов взаимодействия микроорганизмов с растениями в зоне ризосферы, по-прежнему, остается особенно дискуссионной (Dutta and Podile, 2010; Fibach-Paldi et al„ 2011). Одними из наиболее исследуемых модельных объектов ассоциативного симбиоза являются бактерии рода Azospirillum (Hartman et al., 2000). Некоторые штаммы азоспирилл способны к исключительно тесному взаимодействию с растением, в том числе к проникновению во внутренние ткани корня (Bashan et al., 2004; Saikia et al., 2012). Благодаря наличию большого генома азоспириллы обладают достаточно пластичным метаболизмом, позволяющим им адаптироваться к динамичным условиям ризосферы (Кацы, 2007).

Известно, что в прикорневом слое почвы аккумулируются многие физиологически активные вещества, и в частности фенольные соединения, способные даже в связанном состоянии сохранять свою биологическую активпость (Bugg et al., 2011). Вещества именно этой группы, являются наиболее распространенными токсинами, а также выступают активаторами или ингиботорами многих обмешплх процессов (Rudrappa et al., 2008). В частности, защитные реакции растительных тканей в ответ на механическое повреждение и на атаку микроорганизмов связаны с участием фенольных соединений (Запрометов, 1992). Кроме того, вещества ароматической природы служат специфическими сигналами вызывающими хемотаксис у рнзобактерий (Somers et al., 2004; Dutta and Podile, 2010). Такпм образом, очевидно, что азоспириллам необходимы мехашпмы, позволяющие преодолеть фепольный барьер, возникающий при становлении взаимодействий с расгашем-хозяином, при этом не исключено, что у эндофитных и эпифнтных штаммов данных бактерий они могут различаться.

Относительно недавно появились сведения о наличии у азоспирилл фенолоксидазной активности (Givaudan et al., 1993; Faure et al., 1994; Diamantidis et al., 2000; Никитина и др., 2010). Большинство работ касались обнаружения и изучения оксидаз, в частности лакказ. К началу наших исследований, полностью отсутствовали данные о пероксидазах бактерий, аналогичных ферментам лпгшшолитического комплекса грибов. Основываясь на способности далных фермептов окислять многие ароматические, гетероциклические, хлороргашгческие вещества (Дзедзюля н Беккер, 2000; Hofrichter, 2002; Лисов п др., 2007; Айзениггадт п Боголицын, 2009), мы предположили, что продукция азоспириллами внеклеточной неспецифическон пероксидазы, в частности Мп-пероксидазы, может быть связана с механизмами адаптации, повышающими выживаемость, конкурентоспособность бактерий благодаря возможности окислять п нейтрализовать токсичные фенольные соешшепия. Вероятнее всего, что наличие метаболических путей, ответственных за окисление ароматических веществ, предопределяет способность бактерии и к деградации более сложных липппгаподобных соединений.

Показано, что почвешхые бактерии A. brasilense, могут поддерживать жизнеспособность при высоких концентрациях ионов метаплов (Beveridge et al., 1997; Камнев и др., 2007).

Интересными представляются исследования о возможном участии фенолоксидаз некоторых грибов в снижении токсического действия соединений золота, за счет образования Ли0 (Категаш е1 а1., 2010; БапзЫ е1 а1., 2011; Ветчинкина и др., 2013а). Не исключено, что фенолоксидазы азоспирилл также могут умствовать в восстановлении золота из золотосодержащих соединений до элементного состояния с образованием золотых наночаспщ. Кроме того поиск и развитие нетоксичных, экологически чистых, так называемых «зелёных» методов синтеза наноматериалов, на сегодняшний день стоит особенно остро. В связи с этим, актуальным является исследование способности бактерий рода АюзргШит к биосинтезу золотых наночастиц и роли собственных Мп-пероксидаз в данном процессе.

Таким образом, исследование Мп-пероксидазы азоспирилл представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения роли фермента в жизнедеятельности бактерий и взаимоотношениях с растением, так и с позиции применения данного микроорганизма для получения препаратов, которые могут использоваться в различных областях биотехнологии.

Целью работы явилось сравнительное исследование свойств и функциональной значимости внеклеточных Мп-пероксидаз бактерий А. ЬгазНеше Бр245 и А. ЪгазЛепзе 5р7.

Задачи исследования:

1. Выявить способность А. ЬгазИеизе к продукции внеклеточной Мп-пероксидазы.

2. Определить оптимальные условия культивирования А. ЬгазИете Бр245 и 8р7 с целью получения максимальной активности исследуемого фермента.

3. Изучить влияние ряда фенольных соединений на продукцию Мп-пероксидазы, и способность изучаемых штаммов к окислению данных веществ.

4. Оценить Мп-пероксндазную активность А. ЫазМете Яр245 и 8р7 при ннокуляшш бактериями корней проростков пшеницы сорта Саратовская 29.

5. Выделить гомогенные препараты Мп-пероксидазы А. Ьгаз^кпзе 8р245 и Яр7, дать сравнительную характеристику выделенных ферментов.

6. Исследовать лнгнинолитическую активность азоспирилл и способность Мп-пероксидаз к окислению модельных соединений лигнпна.

7. Изучить способность А. ЪгшНетг к восстановлению золота из золотохлористоводородной кислоты до элементного состояния с образованием наночастиц и определить роль Мп-пероксидаз в этом процессе.

Научная новизпа работы. Впервые в культуральиой жидкости азоспирилл обнаружена внеклеточная Мп-пероксидаза. Впервые выделепы н частично охарактеризованы гомогенные препараты Мп-пероксидаз эндофитного и эпифитного штаммов азоспирилл. Впервые обнаружена лигнинолитическая активность у бактерий рода Агозр&Шит и показана способность собственных Мп-пероксидаз деградировать модельные соединения лигнина. Получены приоритетные данные о формировании культурами А. ЬгаьНепяе золотых наночастиц при восстановлении хлораурата. Впервые показано, что в восстановлении золота участвуют внеклеточные Мп-пероксидазы, представлены гипотетические схемы данного процесса.

Теоретическая п практическая значимость. Полученные в рачках настоящей работы результаты исследований расширяют и утлубляют представления об адаптивных возможностях азоспирилл и вносят дополтггелыгые коррективы в понимание механизмов взаимодействия микропартнера с растением-хозяином при становлешш растительно-бактериальной ассоциации.

Получетпле гомогашые препараты бактерпальпых Мп-перокспдаз могут быть использованы при проведении различного рода биологических исследований. Предложенная схема выделения и очистки внеклеточной Мп-пероксидазы азоспирилл может бьпъ использована в различных областях биотехнологии, связанных с разрушением полициклическпх ароматических соединений, биоконверсией лпгнипоподобных веществ и детоксикашш ксенобиотиков. Потетцилыго значимыми для разработки экологически чистых методов синтеза золотьк наночаспщ являются сведения о биовосстаповлешга золота с использованием азоспирилл и их ферментов. Материалы диссертации использованы при выполнении дипломной и курсовых работ студентами биологического факультета Саратовского государствегаюго уштверслггета имени Н.Г. Чернышевского.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обнаружена продукция внеклеточной Мп-пероксидазы в культуральнои жидкости азоспирилл.

2. Индукция внеклеточной активности Мп-пероксидазы А. Ьпт/еп.че вторичными метаболитами растений, а также детекция фермента в области бактериальных скоплении, на поверхности корня тюкулировашгаго растения, косвенно подтверждают протекторную функцию Мп-пероксидазы, при становлении растительио-бактериалыюй ассоциации.

3. Выделетше из культур ал ытои жидкости А. Ьга$Пензе Яр245 и А. brasilen.se 8р7 электрофоретически гомогенные препараты Мп-перокспдазы представляют собой односубъединичные белки с молекулярной массой 42-44 кДа, способные к окислению ароматических субстратов только в присутствии 1ЬСЬ и являющиеся Мп-зависимымн.

4. Способность Мп-пероксидазы азоспирилл окислять модельные соединения липпта свидетельствует об участии фермента в липпшолитической активности бактерий А. ЬгазИете Яр245 и ?р7. которая в напбольшей етепепи вьфажепа у эндофитного штамма.

5. Внеклеточная Мп-пероксидаза бактерий А. ЪгаМкте Бр245 и Эр7 опосредует способность бактерий к восстановлению золота из золотохлористоводородной кислоты с образованием золотых наночаспщ.

Работа выполпена в лабораторщ1 микробиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растении и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Изучение гликопротеинов и биогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200904389, научный руководитель темы: дб.н., профессор В.Е. Никитина) и

«Физполого-биохимические признаки адаптационных процессов у бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01201359054, научный руководитель темы: д.б.н., профессор В.Е. Никитина).

Апробация работы. Материалы диссертации, представлены на Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2009» (Саратов, 25 - 26 ноября 2009); 14-и Путинской Международной школе-конференции молодых ученых «Бпология - наука XXI века» (Пущино, 19 - 23 апреля 2010); VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Мшкк, 31 мая - 4 июня 2010); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 28 сентября - 1 октября 2010); VI молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиолопш» (Москва, 25 - 27 октября 2010); Conference «Ecology of Soil Microorganisms. Microbes as Important Drivers of Soil Processes» (Чехия, Прага, 27 апреля - 1 мая 2011); IV Всероссийском с международным участием Конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2011» (Воронеж, 23 - 27 мая 2011); XXIV зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-хнмнческой бнолопш и биотехнологии» (Москва, 7-9 февраля 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 24 - 28 сентября 2012); международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (28 - 29 января 2013). VI Всероссийского с международным участием Конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 19 - 23 августа 2013), международной научно-практической конференции «Вавиловские чтегата-2013» (Саратов, 25 -27 ноября 2013 г). Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории микробиолопш ИБФРМ РАН протокол № 34 от 12.03.2014 г.

Личный вклад соискателя. Автором осуществлен аналитический обзор литературы и обобщение теоретических данных по теме диссертации. Экспериментальные исследования выполнялись автором лично и в составе научных групп. Соискателю принадлежит решающ;« роль в обработке, и интерпретащт всех полученных результатов, а также в подготовке публикаций.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследований, изложения и обсуждепия результатов работы, заключешм, выводов и списка используемой литературы, включающего 290 источников, в том числе 248 зарубежных, и 206 опубликованных в последние 15 лет. Работа изложена на 127 страницах, содержит 28 рисунков и 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы дана краткая характеристика растительно-микробного взаимодействия и современные представления о систематике и физиологии ассоциативных бактерии рода Azospirillum; описаны основные фенолоксидазы и более подробно Мп-пероксщаза; а также представлена информация о биологическом синтезе золотых наночаспщ микроорганизмами.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования в работе были использованы два штамма A. brasilense Sp7 (эппфитный) и Sp245 (эндофитный) из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН.

Активность Мн-пероксидазы (МпП) определяли спектрофотометрически: по скорости окисления 2,6-диметоксифепола при 30°С (Paszczynski et al., 1988); по скорости окисления АБТС (Niku-Paavola et al., 1988); по скорости образования хелатного комплекса Мп-тартрат (Никитина и др., 2005). За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ су бстрата за 1 мип. Удельную активность выражали в единицах на 1 мг белка.

Для изучения Mn-пероксидазной активности А. brasilense при инокуляции корней растений, была выбрана мягкая яровая пшеница сорта Саратовская 29, семена которой были предоставлены НИИ сельского хозяйства Юго-Востока РАСХН (г. Саратов). Для выявления Mn-пероксидазной активности проводили окраску препаратов корней в течение 30 мин 0,2% 2,6-диметоксифенолом и 0,2% о-дианизпдином с добавлением 0,1 мМ Н2О2 и 0,2 мМ Мп2+ (Никитина II др., 2010). Распределение бактериальных клеток на корнях п специфическое окрашивание хромогенных субстратов определяли при помощи светового микроскопа Jenaval (Carl Zeiss, Германия).

Для выявления способности азоспирилл к деградации лигнина, исследуемые штаммы выращивали па агаризовшпюй малатпо-солевой среде с добавлением 0,1% тапгаш (Мокрушина и др., 2010). Для подтверждения способности азоспирилл к росту на лигтшсодержащих субстратах, оценивался бактериальный рост на плотной агаризованной среде содержащей 0,5% лигнина (Bholay et al., 2012). В работе использованы два вида модельного препарата лигнина Классона: 1. из нативных опилок, 2. из метанолизных опилок, предоставленного лабораторией биохимии ФГОУ ВПО «Пензенская ГСХА», г. Пенза (Ильина. 2011).

Для выделения внеклеточной МпП использовали 36-тп часовую культуру бактерий, выращенных на жидкой малатпо-солевой среде. Клетки осаждали центрифугировшшем 15 мин при 7000 g. Супернатант использовали для дальнейшей очистки, которая состояла из ряда стадий: дробное осаждение белков культуральнон жидкости сульфатом аммония; селективная сорбция примесей на геле CaFj (за основу взят метод, предложенный Новаковскнм с соавт., 2006); гель-фильтрация на колонке с Sephadex G-75 (Sigma-Aldrich, Швеция); ионообменная хроматография па носителе Toyopearl DEAE-650M (Tosoh, Япония). Фракции, обладающие Мп-пероксидазной активностью, диализовали против воды и использовали для дальнейшего

анализа. Степень очистки фермента определяли по изменению его удельной активности, а также с помощью электрофореза в денатурирующих условиях (ДДС-Ыа-электрофорез).

Липшндеградирующую функцию полученных чистых препаратов МпП определяли спектрофотомегрически па иммуноферментном анализаторе Multiskan Ascent (Thermo Electron, China) с помощью метода Ahmad (Ahmad et al„ 2010).

С целью обнаружения восстановленных частиц элементного золота, образцы целых бактериальных клеток Л. brasilense Sp245 и Sp7 и культуральной жидкости исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии на электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss. Германия) и метода негативного контрастирования. Для подтверждения предположения об участии МпП в восстановлении золота с образованием наночастиц, водные растворы полученных ранее гомогенных препаратов ферментов инкубировали с 30 мкМ НАиСЦ при комнатной температуре. Размер, форму и относительное количество синтезированных нанообразованин оценивали с помощью трансмиссионных электронно-микроскопических изображений, полученных па микроскопе Libra 120. Для подтверждения того, что суспензия наночастиц содержит именно золото, проводили рентгенофлуоресцентное исследование отфильтрованных частиц с помощью энергодисперсионного спектрометра модели ED 2000 (Oxford Instruments, Великобритания). Для измерения среднего размера и распределения синтезированных частиц Au" по размеру, а также дзета-потенциала, использовали лазерный анализатор Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания). При оценке полученных результатов пользовались методом расчета стандартного отклонения среднего арифметического с использованием программы Microsoft Office Excel 2007; данные, имеют соответствующие доверительные интервалы при уровне доверительной вероятности 0,95.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Обнаружение активности внеклеточной Мп-пероксидазы. Первым этапом нашей работы явилось обнаружение внеклеточной активности МпП А. brasilense Sp245 и Sp7 при культивировании бактерий на жидкой малатно-солевой среде в течение 24 часов (Таблица 1).

Таблица I — Обнаружение внеклеточной Mn-пероксидазной активности A. brasilense

Методы измерения активности Активность, ед/мг

A. brasilense Sp245 A. brasilense Sp7

по образованию комплекса Мп3+-тартрат 5,34±0.05 6,41±0,04

по окислетпо 2,6-диметоксифенола 2,28±0,12 2,73±0,08

по окислению АБТС 0.77±0,06 1,21±0,07

Для более объективной оценки, измерение ферментативной активности проводами с использованием нескольких специфических методов (Lobos et al., 1994; Никитина и др.. 2005; Jiang et al., 2008). Первый - связан с измерением скорости образования малостабильного хелатного комплекса Мп3+-тартрат, имеющего характерные пики поглощения при 238 нм (Никитина п др., 2005). Два других метода основаны на окислении хромогешшх субстратов, а

именно 2.6-диметоксифепола и АБТС, до соответствующих окрашенных продуктов (N¡101-Раа\о1а е! а1., 1988; РазгсгуизК.! е1 а1.. 1988). Как видно из таблицы 1, активность МпП в культуральной жидкости выявлена у обоих исследуемых штаммов. Активность фермента у А. ЬгаяНеме Яр7 была выше, по сравнению с эндофитным штаммом, что справедливо при разных, используемых в дапном эксперименте, методах измерения ферментативной активности.

Зависимость продукции Мп-пероксидспы А. ЬгахИеп^е Яр245 и $р7 от условий культивирования. Известно, что условия культивирования микроорганизмов оказывают большое влияние на их метаболизм и соответственно на активность ферментов. Нами было оценено влияние на продукцию Мп-перокспдазы азосинрилл таких параметров, как возраст культуры, температурный фактор, соотношешге утлерода и азота в среде культивирования.

В результате проведенных исследований обнаружено, что активность МпП как эпифитного, так и эндофитиого штаммов зависела от времени культивирования бактерий. Мп-пероксидазная активность А. ЬгаяНеюе увеличивалась пропорционально накоплению бактериальной

биомассы, и максимальные значения активности фермента регистрировались во временном диапазоне от 12 ч до 24 ч выращивания. Ферментативная активность А. ЬгсяНеюе 5р245, аналогично эпифитному штамму возрастала от начала инокуляции до 18 ч культивирования, однако незначительно снижалась к 24 ч, и была максимальна через 36 ч выращивания. Интересным представляется тот факт, что Мп-пероксидазпая активность А. ЬгаьИеюе 5р7 была выше в период логарифмической стадии роста тогда как активность МпП А. ЬгазИепзе $р245 увеличивалась значительно позднее, в ответ па недостаток в среде питательных веществ и накопление продуктов обмена. Данный ферментативный отклик, по-видимому, свидетельствует о важности фермента в адаптивном потенциале бактерии. Кепи»ас1е\т с соавторами (2011) показано, что для В. тЬиНз также характерен максимум ферментативной активности через 36 ч культивирования, при переходе бактерий к стационарной фазе роста. Однако, по мнешпо авторов, МпП накапливается в среде в течение логарифмической стадш1, характеризующейся активным синтезом белков, и поэтому, при переходе бацилл на стационарную фазу роста, содержание фермента в среде и его активность максимальны, а в дальнейшем начинают снижаться. Стоит отметить, что для некоторых грибных пероксидаз фенолоксидазного комплекса, также характерно повышение активности при переходе культуры к лдиофазному росту (Ахмедова 1996).

При изучении влияния температурного фактора на активность фермента был выбран диапазон от 22°С до 37°С с шагом в 5°. Ферментативная активность штамма 5р245 незначительно возрастала прямо пропорционально увеличению температуры культивирования и была максимальна при 37°С, однако Яр7 проявлял повышенную активность при 27°С.

Изменение соотношения С/И в среде культивирования влияло на Мп-пероксидазную активность А. ЬгахМепзе 5р245, при снижении содержания источника утлерода или азота, активность фермента увеличивалась более чем в 2 раза, по сравнению с контролем. Максимальная ферментативная активность эндофитного штамма, а именно 6.2±0,2 ед/мг, отмечалась в условиях дефицита азота. Для А. ЬгазИепэе Яр7 также отмечалось увеличение

активности в случае снижения содержания яблочной кислоты (источник углерода) в среде культивирования до 2 г/л и при недостатке азота. Полученные данные согласуются, с исследованиями фенолоксидаз грибов, так как известно, что для них характерно увеличение активности при культивировании на бедной по азоту и углероду среде (Ахмедова, 1996; Ahammed and Prema, 2002). Присутствие в среде культивирования сложного органического соединения (дрожжевого экстракта), несмотря на увеличение роста бактерий, существенно снижало продукцию МпП как A. brasilense Sp245, так и A. brasilense Sp7.

Таким образом, выявленные различия в активности МпП эндофитного и эпифитного штаммов азоспирилл, обусловлены, вероятнее всего, адаптивными возможностями культур к условиям существования в различных экологических нишах. Интересным представляется тот факт, что большую зависимость активности Мп-перокспдазы от условий культивирования проявлял эндофитный штамм азоспирилл.

Влияние фенольиых соединений на Мп-пероксидатую активность. На следующем этапе работы проводилось изучение зависимости продукции Мп-пероксидазы пггаммов A. brasilense Sp245 и Sp7 от присутствия фенольиых соединений в среде культивирования, а также способности азоспирилл к окпсленгао ароматических субстратов при росте на жидкой питательной среде. Для эксперимента были выбраны фенольмые соединения, являющиеся наиболее распространенными вторичными метаболитами растений: феруловая кислота, кверцетин, 2,6-дпметоксифенол (сирингол) и пирокатехин. Также было изучено влияние на Mn-пероксидазную активность АБТС и сирингалдазина - специфических субстратов фенолоксидаз. В ходе исследования в среду выращивания (жидкая малатно-солевая среда) при засеве культуры вносили ароматические соединения в концентрациях 0,1 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ. При выборе концентрации исследуемых веществ, мы учитывали средние концентрации фепольных соединений в ризосфере, а также осповмвались на подобных экспериментах, описанных в литературе для других микроорганизмов (Dakora and Phillips, 2002; Arora and Gill, 2005; Oliveira et al., 2009b; Hoang et al., 2010). Оба штамма оказались способны окислять соединения ароматической природы. О процессе биодеградацни веществ судили по изменению окраски культуралмгой жидкости, вследствие накопления продуктов реакции окисления, что подтверждали спектрофотометрпчески.

Установлено, что присутствие фенольиых соединений в среде культивирования способно стимулировать активность МпП A. brasilense. Так максимальная Мп-пероксидазная активность A. brasilense Sp245 (в 3,3 раза превышающая контрольные зпачепия) регистрировалась при содержании в среде культивирования 1 мМ 2,6-диметокеифенола, 0,5 мМ пирокатехина и 0,1 мМ сирингалдазина (18 ч культивирования). Для A. brasilense Sp7 максимальная активность фермента, превышающая контроль в 3 раза, наблюдалась через 18 ч выращивапия при содержашш 0,1 мМ феруловой кислоты, 0,5 мМ и 1 мМ сирингалдазина, 0,5 мМ АБТС и 0,1 мМ кверцетина через 36 ч. По дшпшм литературы, Мп-пероксидазная активность, как грибов, так и некоторых бактерий, аналогично ферментативной активности

азоспирилл, повышается при внесении в среду культивирования ароматических субстратов, выступающих в роли индукторов (Johannes and Majcherczyk, 2000).

Установлено, что 2,6-диметоксифенол и пирокатехин - вещества, активно участвующие в ингибировании микроорганизмов при атаке растения-хозяина (Makoi and Ndakidemi, 2007) - в большей степени стимулировали Mn-пероксидазную активность штамма A, brasilense Sp245. Присутствие в среде культивирования кверцетина и феруловой кислоты, наиболее распространенных ароматических соединений экссудатов корней злаков (Dakora and Phillips. 2002; Walker et al., 2003), стимулировало активность МиГ! A. brasilense Sp7. Специфические субстраты фенолоксидаз практически при всех концентрациях стимулировали активность МпП азоспирилл

Основываясь на полученных данных по влиянию фенолъных соединений на Mn-пероксвдазную активность азоспирилл, а также учитывая способность бактерий окислять ароматические вещества, мы предположили, что одной из главных функций МпП в жизнедеятельности бактерий рода Azospirillum является участие данных ферментов в механизме адаптации бактерий к токсическому действию фенольных соединений, активно синтезируемых растением при становлении растительно-микробной ■ ассоциации. В связи с этим, представляется важным исследование активности данного фермента при взаимодействии A. brasilense Sp245 и Sp7 с растением-хозяином.

Активность Мп-пероксидаш A. brasilense при инокуляции корней пшеницы. Для исследования зависимости активности Mn-пероксидазы от присутствия растения хозяина, проводили инокуляцию трехсуточных стерильных проростков пшеницы сорта Саратовская 29 штаммами A. brasilense Sp245 и Sp7. Обнаружено, что при инокуляции бактериями пшеницы происходит увеличение Mn-пероксидазной активности в среде выращивания по сравнению с контрольными образцами. Стоит отметить, что в большей степени увеличивалась активность МпП в среде выращивания растений, инокулированных штаммом A. brasilense Sp7. С применением просвечивающей световой микроскопии были получены микрофотографии скопления бактериальных клеток на поверхности корня пшеницы (Рисунок 1).

Область бактериальных скоплений окрашивалась в желто-коричневый цвет, при использовании 2,6-диметоксифенола и темно-коричневый - о-дианизидина, в качестве специфических красителей, что свидетельствует о накоплении фенолоксидаз. а именно МпП в этой зоне. При этом штаммовых различий нами отмечено не было. В контрольных образцах, не содержащих ионы марганца и перекиси, а также в образцах без бактерий, подобной окраски не наблюдалось.

Примечание: А. контроль: Б. образцы, окрашенные: о-дианизидином. Масштабная линейка равна 100 мкм.

Рисунок 1 - Просвечивающая световая микроскопия поверхности корня, колонизированной А. Ьга5Иете Бр245

А

Б

Общеизвестно, одним из основных способов выживания бактерий во внешней окружающей среде является образование скоплений и биопленок, внутри которых накапливаются биологически активные вещества и ферменты (Oh et aJ., 2007: Burdman et al., 2000). Полученные данные указывают на то, что МпП аккумулируется в матриксе бактериальных скоплений, на поверхности корня инокулированного растения, что свидетельствует о возможном участии МпП азоспирилл в адаптации бактерии к условиям ризосферы.

Выделение и очистка Мп-пероксидазы A. brasilense. Для дальнейшего изучения свойств МнП азоспирилл, необходимо было выделение чистого ферментного препарата. Были выбраны оптимальные условия культивирования бактерий, исходя из ранее полученных результатов. Оба штамма выращивали на малатно-солевой среде с 0,1 мМ пирокатехином и 1 мМ MnS04x5Hi0 при температуре 30°С. В качестве первой стадии очистки использовали осаждение белков из культуральной жидкости дробным фракционированием сульфатом аммония. Как видно из представленных электрофореграмм ДДС-№-электрофореза в ПААГ МпП двух штаммов (Рисунок 2), в ходе второго этапа, основанного на селективной сорбции белков на геле CaF2, и дальнейшем осаждением препарата ледяным ацетоном, удавалось избавиться от высокомолекулярных белков. В полученных препаратах преобладали белки с массой от 70 до 20 кДа. Далее ферментную вытяжку освобождали от низкомолекулярных примесей с помощью гель-фильтрации на колонке с Sepliadex G-25. уравновешенной 0,025 М Na-ацетатным буфером, рН 5,0. Стоит отметить, что подбор специфических условий для очистки бактериальной МпП представлял большую сложность. Фермент имел свойство сильно сорбироваться с целым рядом носителей. В процессе выделения, при использовании элюирующих буферов с рН 6,8-7,5, у фермента пропадала активность. Предварительно проведетгаое исследование показало, что для очистки бактериальной МпП неэффективно применение тонких методов разделения, таких, как высокоэффективная хроматография на Mono Р и Mono Q, что справедливо и для некоторых грибных МпП (Беккер и др., 1992).

Примечание: t - маркеры; препарат после:

2 - дробного фракционирования (NH;bS();,

3 - сорбции белков на геле CaF^, осаждения препарата ледяным ацетоном; 4 хроматографии на колонке с Sephadex G-75; 5 - хроматографии па колонке с Toyopearl DEAE-650M. Слева от рисунков линейка с молекулярным весом, кДа.

Рисунок- 2 - ДДС-Ыа-электрофорез ; препарата МпП A. brasilense Sp245 (А) и A. brasilense Sp7 (Б)

А Б

На следующем этапе препарат подвергали гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-75, уравновешенной 0,025 М Ыа-ацетатным буфером, рН 5,0. содержащим 0,1 М NaCl. Фракции,

обладающие Mn-пероксидазной активностью, объединяли и днализовали против буфера. Проведение хроматографии при низких значениях pH позволило отделить основную часть балластных белков. В результате данного этапа ферментный препарат МпП А. brasilense Sp245 и А. brasilense Sp7 удалось очистить в 1,7 и 5,2 раза соответственно (Таблица 2). Полученный, после гель-фильтрации, препарат наносили на колонку с гелем Toyopearl DEAE-650M, уравновешенную 0,025 М Na-ацетатным буфером, pH 5,0, промывали стартовым буфером, элюцию проводили в ступенчатом градиенте соли от 0,1 мМ до 1 мМ NaCl. Белки, обладающие Mn-пероксидазной активностью, сильно связывались с носителем и выходили в зоне высоких концентраций NaCl, данные фракции объединяли, диализовали против воды. Анализ гомогенности полученных препаратов ферментов проводили методом электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии Na-ДДС в 12,5%-ном ПААГ (Рисунок 2). Сопоставление данных нативного и денатурирующего электрофорезов показало, что внеклеточные МпП А. brasilense Sp245 и А. brasilense Sp7 (MnnSp24j и MnnSp7) -одноеубъединичпые ферменты, обладающие примерно одинаковой молекулярной массой, лежащей в диапазоне 42-44 кДа. Удельная активность выделенной бактериальной Mnrisp:245 составляла 106,4 ед/мг, MnnsP7-93,7 ед/мг.

Таблица 2 - Результаты очистки внеклеточных МпП А. brasilense Sp245 / А. brasilense Sp7

Стадия очистки Удельная активность, ед/мг Содержание белка мг Степень очистки Выход, %

Sp245 Sp7 Sp245 Sp7 Sp245 Sp7 Sp245 Sp7

Осаждение (Концентрирование) 5,2 3,5 3,13 1,9 1 1 100 100

Гель-фильтрация на Sephadex G-75 8,7 18,2 0,39 0,2 1,7 5,2 41,2 66,7

Ашгонообмишая хроматография на Toyopearl DEAE-650M 106,4 93,7 0,04 0,025 20,6 26,8 27,6 35,0

Сравнение полученных результатов с данными литературы позволяет констатировать, что относительная активность грибных МпП в десятки-сотни раз превышает активность МпП азоспирилл, однако удельная активность выделенных нами ферментов оказалась одного порядка с грибными ферментами (Леонгьевский и др., 1990; Беккер, 1992; Дзедзюля и Беккер, 2000).

Таким образом, нами впервые из культуральпой жидкости А. Ъга5йете Эр245 и Бр7 выделены ферменты МпП со степенью очистки 20,6 (МпП^р^) и 26,8 (МпП$Р7) раз соответственно, и показателем чистоты более 1,2. При этом разработанная схема очистки белка до электрофоретическп гомогенного состояния обеспечивала выход фермента не менее 27,6%.

Характеристика полученных препаратов МпПцрш и ЛТпПцР7. При исследовании свойств гомогенных препаратов МпПзргдз и МпП$Р7 установлено, что выделенные ферменты теряли окислительную активность в присутствии ЭДТА, следовательно, являлись

металле содержащими. Температурный оптимум выделенных ферментов примерно одинаков и лежит в области от 25 до 30°С. Время полуинактивации при 40°С составило: Mnrisp24S -5 ч, Mnn.sp7 -4 ч. Для MnrisP245 и MnnSp7 pH-оптимум реакции окисления 2,6-дпметоксифенола равеп 4,5. При сравнении перокепдаз азоспирилл с ферментами, выделенными в работе Oliveira с соавторами (2009b) из В. pumilus и Paenibacillus sp„ необходимо отметить одно существенное отличие. Ферменты бацнлл проявляли большую активность в щелочной среде, тогда как выделенные нами МпП были активны при низких значениях pH, также как известные грибные МпП (Леонтьевский и др., 1991; Arara and Gill, 2005). Окисление ароматических соединений Mnrisp245 и MnnSp7 было возможно только в присутствии Н2О2, что подгверждает пероксидазную природу ферментов. Способность окислять ряд характерных субстратов в присутствии Мп2+, особенно M11SO4 с образованием комплекса Мп3+-тартрат, является обычным свойством типичных МпП лигшшолитическнх грибов (Лисов и др. 2007). Однако добавление Mir* в реакционную смесь по-разному влияло на активность MnnsP245 и Mnílsp? при окислении разных ароматических соединений. Наибольшую окислительную способность при данных условиях оба фермента проявляли к M11SO4 и 2,6-днмегокспфенолу. Также общим свойством для МпП эндофитного и эпифитного пггаммов явилась способность к окислению АБТС и о-дианизидина в отсутствие Мп2+, т.е. независимо от образования комплекса Мп'+-тартрат. Однако активность возрастала при добавлении MnS04 Пирокатехин и гваякол не окислялись выделенными ферментами в отсутствие Мп2 \ Оба фермента не окисляли вератриловыП спирт - специфический субстрат лигшга-пероксидазы (Ахмедова, 1996; Дзедзюля и Беккер, 2000; Rahman et al., 2013), независимо от наличия ионов марганца.

Таким образом, в ходе исследования, при характеристике свойств гомогенных препаратов МпП, существенных отличий между ферментами эндофштгого и эпифитного штаммов не выявлено. Однако для фермента, выделенного га культуральной жидкости A. brasilense Sp245, свойственны большая удельная активпоегь и стабильность, по сравнению с Mnn.sP7.

Лигнинолитическая активность ,4. brasilense Sp245 и Sp7 и участие Мп-пероксидазы в процессах окисления модельных соединений лигнина. Основываясь на данных, полученных на первых этапах исследования, нами было выдвинуто предположение о возможном участии МпП азоспирилл в процессах разрушения сложных полифенольных соединений, в том числе и лигнина. Для обнаружения лигнинолитической активности штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7, бактерии культивировали на малапю-солевой агаризованной среде с 0,5% танином, в соответствии с методикой, предложенной в работе Мокрушшюй с соавторами (2010), однако из-за подавления бактериального роста, концентрация дашгого вещества была снижена до 0,1 %. На первые сутки роста ни одна из исследуемых культур не давала коричневого окрашивания, что свидетельствовало об отсутствии процесса окисления танина. Спустя двое суток культивирования отмечалось появление коричневой окраски субстрата вблизи растущего края колоний только у A. brasilense Sp245 (Рисунок 3). Данная цветная реакция имеет название реакции Бавендамма и обнаруживает ферменты, выделяемые деструкторами лигнина и

окисляющие танин (Мокрушина и др., 2010). Способность к разложению лигнина А. brasilense Sp7 наблюдалась лишь на 5-е сутки роста.

Далее исследовали способность азоспирилл к росту на лигнинсодержащих средах, отмечали интенсивность роста (отсутствие роста, слабый, умеренный или значительный рост), по сравнению с контролем (культура на малатно-солевой среде). При оценке способности азоспирилл к росту на плотной агаризованной среде, содержащей 0,5% лигнина, установлено, что А. brasilense Sp7 проявлял умеренный рост на среде с добавлением лигнина Классона, полученного из метанолизных опилок, тогда как на среде с модельным соединением - из нативных опилок, для данного штамма характерен слабый рост.

Примечание слева направо: опытный образец, контроль.

Рисунок Э - Качественная цветная реакция с танином на наличие лигнинолитической активности у А. brasilense Sp245 при твердофазном культивировании

По данным литературы, использование метанолизных лигнинсодержащих субстратов стимулируют развитие и накопление биомассы ксилотрофных базидиомицетов в большей степени, по сравнению с нативным лигнином (Ильина, 2011), что согласуется с полученными нами данными для штамма А. brasilense Sp7. Напротив, рост колоний А. brasilense Sp245 был активнее на среде с лигнином, выделенным из нативных опилок. Следует отметить, что эндофитный штамм был способен расти на лигнинсодержащих средах без добавления, в качестве затравки, малата натрия, тогда как эпифитный штамм даже с внесением дополнительного источника углерода в среду культивирования проявлял рост лишь в начале штриха.

В ходе исследования установлено, что оба штамма в зоне роста обесцвечивают агаризованную среду, содержащую 0,5% лигнин Классона (независимо от метода получения модельного соединения). В среднем, зоны лизиса проявляются как у А brasilense Sp245, так и у Sp7 на 4-5 сутки вырапшвания. Полученные данные согласуются с работами по разложению модельньтх соединений лигнина Р. aeruginosa, S. marcescens, Pandoraea norimbergensis LD001, Pseudomonas sp. LD002 и Bacillus sp. LD003; при культивировании данных микроорганизмов деградация лигнинсодержащих субстратов, аналогично азоспириллам, приходится на 4-6 сутки (Bandounas et al„ 2011: Bholay et al, 2012).

Этимология бактериальной деполимеризации лигнина недостаточно изученный процесс. Не так давно возникла гипотеза об использовании бактериями аналогичной грибам лигниндеграднрующей ферментной системы, при этом предполагается, что в разрушении лигнина участвуют те же ферменты, что и при окислении простых ароматических соединений (Bugg et aL, 2011). Функцию разрушения лигнина в полифенолъном комплексе грибов приписывают лигнин-пероксидазе, тогда как Mnll отводится ведущая роль в детоксикации образовавшихся продуктов распада (Wariishi et al., 1991; Banci et al., 2003). Однако существуют данные о

деградации нефенольных компонентов лигнина МпП (Gutierraz et al., 2002). Обнаруженная ранее способность азоспирилл окислять фенольные соединения, в частности сирингалдазин и 2,6-диметоксифенол, являющиеся компонентами деполимеризации лигнина, а также выявленные лигнинолитаческая активность и способность бактерии к росту на лигшшсодержащих средах, подтверждают наличие у азоспирилл ферментных систем, участвующих в разрушении лигнииоподобных веществ.

В связи с вышеизложенным, следующим этапом исследования явилось изучение способности гомогенных препаратов Mnrisp245 и Mnllsp? окислять модельные соединения лигнина. Лигниндеградирующую функцию полученных препаратов МпП определяли с |

помощью метода Ahmad (Ahmad et al., 2010), с использованием двух модельных препаратов лигнина Классона (из нативных и метанолизных опилок).

Оба выделенных фермента оказались способны окислять модельные соединения лигнина как полученные из метанолизных. так и из нативных опилок (Рисунок 4). О процессе окисления свидетельствует изменение оптической плотности раствора в течение 20 мин. Как было показано Ahmad (Ahmad et а).,

2010), увеличение оптической плотности при проведении данного теста связано с выделением фенольных продуктов,

образующихся при деградации нитрированного лигнина. Огмечено, что при повышении концентрации фермента в инкубационной смеси возрастала огггичеекая плотность раствора, следовательно, увеличивалось количество продуктов разложения лигнина. Исследование окисления препаратов нитрированного лигнина в динамике, также показало, что в большей степени ферменты разрушали модельные соединения, полученные из нативных опилок, при этом лигниндеградпрующая способность Mnllspiis оказалась выше, по сравнению с Mnllsp?. Ранее нами показано, что для А. brasilense Sp7 характерен умеренный рост на среде с метанолизиым препаратом лигнина, тогда как при использовании нативного лигнина в среде культивирования для штамма характерен рост только в начале штриха. Данный факт, по-видимому, можно объяснить способностью бактерии к синтезу наряду с МпП и других феиолоксидаз. разрушающих метанолизные соединения лигнина. Таким образом, нами впервые обнаружена лигнинолвтическая активность азоспирилл, при этом потенциал штамма А. brasilense Sp245 оказался выше, по сравнению А. brasilense Sp7. Впервые показана способность к деградации модельных соединений лигнина МпП А. brasilense. Фермент, выделенный го культуральной жидкости эндофитного штамма, активнее разрушал лигнин Классона, чем MnnSp7.

■ 5р 245. И31И0НЫЙ /I:

■ Sp7. Н ¿ПИОНЫ" ЛИ1Н

Sp245.w ■ Sp7.MciaiionHзный <м

Рисунок 4 - Деградация модельных соединений лигнина Mnnsn245 и Mnnso?

Восстановление золота из хлораурата бактериями AzospirUlum brasilense и возможная роль Мп-пероксидазы в данном процессе. Предположительно, функциональную роль МпП в жизнедеятельности азоспирилл можно связывать не только со снижением токсического действия фенольных соединений, но и некоторых металлов. В связи с этим, представляются особенно интересными результаты исследований о возможном участии фенолоксидаз в биоредукции золотохлористоводородной кислоты с образованием Аи° некоторыми грибами (Ramezani et al„ 2010; Sanghi et al., 2011: Ветчинкина и др.. 2013а). необходимой для снижения токсического действия высоких концентраций данного вещества. Вполне вероятно, что фенолоксидазы азоспирилл также опосредуют способность к восстановлению золота из токсичных золотосодержащих соединений. В связи с вышеизложенным, представляло несомненный интерес исследование способности бактерий рода AzospirUlum к биосинтезу золотых наночастиц и роли фенолоксидаз. в частности МпП, в данном процессе.

Влияние золотосодержащего соединения HAuCU на рост азоспирилл. Первоначально нами была протестирована чувствительность А. brasilense Sp245 и Sp7 к присутствию НЛиС14 в среде культивирования. Минимальная ингибирующая рост концентрация составляла 40 мкМ, что справедливо как для эндофитного так и для эпифитного штамма.

Биосинтез золотых наночастиц бактериями А. brasilense. В ходе исследования установлено, что в присутствии НАиСЦ в диапазоне концентраций 5-30 мкМ при культивировании А. brasilense Sp245 и Sp7 на вторые сутки среда начинала приобретать слабое сиреневое окрашивание. Такое окрашивание указывает на накопление в культуральной жидкости наночастиц золота (Philip, 2009). В синтетической среде того же состава с внесенной HAuCU без инокуляции бактерий изменения цвета и выпадения осадка не происходило. Это свидетельствовало о том, что процесс образования золотых наночастиц, в данном случае, не связан с химическим восстановлением золота под действием компонентов среды культивирования.

Как видно на рисунке 5, в культуральной жидкости и около бактериальных клеток, наблюдались электронно-плотные образования различной формы, при этом размер частиц сильно варьировал. С увеличением времени культивирования количество наночастиц возрастало.

Примечание: масштабная линейка равна 1 мкм.

Рисунок 5 - Негативное контрастирование А. brasilense Sp245(A) и Sp7 (Б) через 48 ч культивирования в жидкой синтетической среде в присутствии 30 мкМ НАиСЦ

Диаметр наносфер колебался от 5 до 50 нм, с преимущественным содержанием частиц около 30 нм. Плоские и объемные треугольники, пятиугольники, тетраэдры имели размеры от 5до 300 нм.

.0

Образование золотых наночастиц в присутствии препаратов Мп-пероксидаз A. brasilense Sp245 и Sp7. Для подтверждения предположения о том, что МпП участвуют в механизме биоредукции золотосодержащих соединений, водные растворы полученных ранее гомогенных препаратов ферментов инкубировали с 30 мкМ HAuClj при комнатной температуре (Рисунок 6). Через 24 ч наблюдалось окрашивание смеси, что, как упоминалось ранее, является признаком образования и накопления наночастиц золота.

Примечание: масштабная линейка равна 500 нм, 600 нм.

• • • Рисунок 6 - Просвечивающая

.' • • '' . электронная микроскопия золотых

.'. ' ' ■ 'мою. наночастиц, полученных из 30 мкМ

раствора НАиСЦ с помощью МпП * :. ■ A. brasilense Sp245: А - 24 ч, Б -48 ч

к «о»» инкубирования А Б

Стоит отметить, что белки азоспирилл, не обладающие фенолоксидазной активностью, например лектины, выделенные с поверхности клеток азоспирилл (Никитина и др., 1994), а также бычий сывороточный альбумин, взятый в качестве контроля, не восстанавливали золото до элементного состояния. Наночастицы, образовавшиеся с участием бактериальной МпП (различий между штаммами не выявлено) за 24 ч, представлены по большей части ионосферами размером от 5 до 15 нм с небольшим содержанием нанопризм. Частицы, образовавшиеся через 48 ч инкубирования, представляли собой электронно-плотные образования сферической, треугольной формы и тетраэдры размерами от 5 до 300 нм. Размеры частиц восстановленного золота были также оценены методом динамического светорассеяния (Рисунок 7). Для подтверждения того, что суспензия наночастиц, синтезированных в присутствии очищенных препаратов MnrisP245 и MnnSp7, содержит именно золото, отфильтрованные и лиофилизованные частицы исследовали с помощью реитгенофлуоресцензного анализа (Рисунок 8).

Ь

Sp"

Диаметр, ни Диаметр, ям

Рисунок 7 - Функции распределения по размерам (А) и распределения интенсивности по размеру золотых наночастиц, образовавшихся при инкубации МпП A. brasilense с 30 мкМ

НАиСЦ

Дзета-потенциал коллоидного золота, биологически восстановленного при инкубировании с MnnSp245 составлял - 5,08±0,2 мВ, a MnnSp7 - 6,2±0,1 мВ.

Несмотря на низкие значения дзета-потенциала, полученные коллоиды, были устойчивы, и во временном промежугке более 10 дней не происходило агрегации или флокуляции частиц, и выпадения осадка. Вероятнее всего, определенную роль в Рисунок 8 - Рентгеновский стабилизации сыграло присутствие фермента, флуоресцентный анализ частиц, Предполагаемый механизм

образовавшихся при инкубировании восстановления золота Мп-пероксидазами MnTIsp245 с 30 мкМ НАиСЦ А brasUense. Мы предполагаем, что

внеклеточное восстановление AuCLf, осуществляемое простетической группой фермента идет в обход основного каталитического цикла В результате окислительно-восстановительной реакции происходит образование элементного золота, при этом фермент переходит в «покоящуюся», полностью окисленную форму. Как упоминалось ранее МпП как классическая пероксидаза способна приводить к образованию перекиси водорода (Gomez-Toribio et al„ 2001; Лисов, 2005). Восстановление золота ферментом, также может идти и опосредованно через образование экзогенной перекиси При проверке данной гипотезы, был поставлен опыт с внесением 0,1 мМ Н2О2В водный раствор 30 мкМ НАиСЦ Уже через 10 мин инкубационная смесь приобретала розовое окрашивание. Коллоид был нестабилен, и в течение нескольких минут восстановленные частицы выпадали в осадок.

Логично было бы предположить, что подобное свойство МпП не универсально, и белки обладающие пероксидазной активностью, способны восстанавливать золото до элементного состояния с образованием наночастиц. Однако, при инкубировании препарата пероксидазы хрена с золотохлорисговодородной кислотой, в аналогичных нашему эксперименту условиях, восстановление золота не происходило. Таким образом, в нашей работе получены данные о формировании в культурах A. brasilense золотых наночастиц. Установлено, что образование коллоидного золота протекает внеклеточно. Впервые показано, что в восстановлении золота участвуют внеклеточные МпП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной го интенсивно исследуемых моделей растительно-микробного взаимодействия являются ассоциативные бактерии рода Azospirillum (Lugtenberg and Kamilova, 2009; Saikia et al„ 2012). Немаловажную роль в становлении ассоциации играют фенольные соединения, активно синтезируемые растением (Запрометов. 1992). Они способны выступать в роли ингибиторов наиболее важных процессов в жизнедеятельности бактериальной клетки. Для поддержания физиологически активного состояния в зоне ризосферы азоспириллам необходима система адаптации к агрессивному воздействию многих токсичных соединений. Нами было выдвинуто предположение, что такой протекторной функцией может обладать МпП.

О возможном участии МпП азоспирилл в адаптации бактерии к условиям ризосферы свидетельствуют полученные данные о повышении ферментативной активности при инокуляции растений бактериями, а также качественное обнаружение МпП в зоне бактериальных скоплений, на поверхности корня инокулировшшого растения. В ходе исследования установлено, что штаммы А. Ьгалйепхс Яр245 и Бр7 способны окислять ряд фенольных соединений, присутствующих в среде культивирования, при этом данный процесс сопровождался стимуляцией Мп-пероксидазной активности. Пирокатехин и 2,6-диметоксифенол в большей степени влияли на ферментативную активность А. ЬгазПете Бр245, а кверцетин и феруловая кислота на активность МпП А. ЬгазНеюе 8р7. Вероятнее всего, субстратная специфичность ферментов эндофитного и эпифитного штаммов обусловлена адаптационными возможностям!, связанными с различиями в условиях существования бактерий (внутри корня или в ризосфере).

Для изучения свойств МпП А. Ыш Пепле, была разработана схема выделения и очистки фермента. Сопоставление данных пативного и денатурирующего электрофорезов показало, что внеклеточные МпП А. ЬгаяИете 5р245 и ,-1. ЬгшПепзе Бр7 (МпПзр245 и МпП$р7) — односубъедшшчпые ферменты, обладающие примерно одппаковой молекулярной массой, лежащей в диапазоне 42-44 кДа. Относительная активность выделенных ферментов была в десятки-сотни раз ниже грибных МпП (Леонтьевский, 1990; Беккер, 1992; Дзедзюля и Беккер, 2000), но одного порядка с ранее изученными бактериальными (ОИуена й а!., 2009Ь). В отличие от МпП В. ритНиз и РаетЬасШиз $р. (ОНуена е[ а1., 2009Ь), обладающих максимальной активностью в щелочных условиях, рН-оптимум получегапдх в ходе нашей работы ферментов был равен 4,5, что согласуется с известными МпП грибного происхождения. Фермент как А. Ьгалйете 8р245, так и А. ЬгшИете Бр7 проявлял Мп-зависимую активность к ряду ароматических веществ. Существенных отличий по физико-химическим свойствам между ферментами эндофитного и эпифитного штаммов не выявлено, однако следует отметить большую удельную активность у фермента А Ьгачйсте Бр245.

Нами установлено, что представители рода Л:о<;р1п11ит способны расти на лигнинсодержащих субстратах, при этом липшнолитический потенциал штамма А. ЬгазПете Эр245 оказался выше, по сравнению с Яр7. Учитывая этот факт, а также опираясь на гипотезу, предложенную Ви^ с соавторами (Bugg е1 а!, 2011) об использовании бактериями аналогичной грибам лигшшдеградирующей ферментной системы, мы предположили, что МпП азоспирши может участвовать в процессах разрушения лигнина. Проведённые эксперименты показали способность очищенных препаратов МпП окислять лигнин Классона, что косвенно подтверждает возможность участия МпП в проникновении эпдофипюй бактерии внутрь корня, и нахождении там в метаболически активном состоянии.

В ходе данной работы впервые получены результаты о способности бактерий А. ЬгаяПепхе к образованию га хлораурата золотых наночаслщ. В литературе фрагментарно представлены сведения об участии оксидоредуктаз в восстановлении золота до элементного состояния и образовании наночастиц. Нами обнаружено, что биосинтез коллоидного золота протекает

внеклеточно. Впервые показало, что в редукшш НАиСЦ принимают участие внеклеточные МпП, относя1Щ1еся к фенолокисляюшпм ферментам. Мы предположили, что восстановление ионов Аи3+ до Аи" идет в обход основного каталитического цикла фермента, либо за счет образования МпП пероксида водорода, способного к биоредукцни золотосодержащего соедипения, либо за счет окислительно-восстановительной реакщга с Ре;> простетической группы активного центра ферме1гга. Известно, что многие микроорганизмы, как и почвенные бактерии А. Ьгш1кте, могут поддерживать жизнеспособность при высоких концентрациях ионов металлов в среде обитания (Ве\епс1де е1 а!., 1997). Вероятнее всего, именно благодаря наличию защитных механизмов, азоспирнллы оказались способны к биосинтезу золотых наночастиц из золотохлорнстоБодородной кислоты. Можно предположить, что биоредукцня золотой кислоты с образованием Аи° необходима для снижения токсического действия высоких концентраций данного вещества. Необходимо отметить, что доступность, простота и безопасность биосшггеза наночастиц золота при помощи ассоциативной почвенной бактерии А. brasilcn.se делают этот метод перспективным для экологически чистого получения наночастиц.

Таким образом, экспериментальные данные, полученные в ходе наших исследований, подтверждают предположения о полифункционатыюй протекторной роли МпП в жизнедеятельности азоспирилл.

Кроме того, принимая во внимание высокую окислительную способность фермента, простоту в использовашш, не исключена возможность применения бактериальной МпП в современных тонких биотехнологических методах.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в культуралыюй жидкости бактерий А. ЬгазНеюе, эндофитного штамма 5р245 и эпифитного - 8р7, обнаружена активность Мп-пероксидазы.

2. Установлено, что Мп-пероксидаза А. ЬгазИете является ицдуцибельным ферментом; изучена зависимость активности ферме!гтов штаммов 5р245 и 8р7 от условш"! культивирования. Выявлены иггаммовые различия в зависимости продукции фермента от возраста культуры, температуры, и соотношения количества у глерода и азота в среде выращивания.

3. На примере ряда ароматических соединений показано, что исследуемые штаммы способны окислять сирингатдазнн, 2,6-диметоксифенол. АБТС. пирокатехин, кверцетпн и феруловую кислоту. При этом обнаружена специфичность индукции Мп-пероксидазпой активности А. ЬгахНеюе 5р245 и Эр7 фенольными соединениями. Пирокатехин и 2,6-диметоксифенол в большей степени стимулировали ферментативную активность эндофитного штамма, тогда как кверцетин п феруловая кислота индуцировали активность Мп-пероксидазы А. ЬгаяНепзе Бр7.

4. Установлено, что шюкуляция азоспирпллами корней проростков пшеницы сорта Саратовская 29 стимулирует внеклеточную Мп-пероксидазную активность культур обоих штаммов. Акшвность фермера качественно детектировалась в области бактериальных скоплений на поверхности корня инокулированного растения.

5. Впервые из культуральной жидкости А. Ьгаикте 5р245 и А. ЬгазНеюе 5р7 выделены электрофоретпчеекп гомогенные препараты Мп-перокспдаз. Разработанная схема очистки позволяет получить фермент с выходом не менее 27%.

6. Частично охарактеризованы Мп-пероксидазы А. Ьпт1ете 5р245 и А. Ьгаи1ете Яр7. Установлено, что оба ферме1ггл представляют собой односубъедшшчные белки с молекулярной массой 42-44 кДа и удельной активностью ~ 100 ед'мг. Показано, что ферменты являются Мп-зависимымп и окисляют ароматические субстраты только в присутствии 1ЬО:,

7. Впервые обнаружена лигшшолитнческая активность А. ЬгазИепяе Яр245 и 5р7, в наибольшей степеш1 выраженная у эидофптного штамма. Доказано участие Мп-пероксидаз азо спирилл в деградации модельных соедшгений лигнина

8. Установлена способность бактерий А. ЬгсяИаж к восстановлению золота из золотохлористоводороднон кислоты до элементного состояния и формированию золотых наночастиц. Впервые показано участие бактериальных внеклеточных Мп-пероксидаз в восстаповлепии Аи3+ до Аи нз НАиСЬ, предложеп пшотетический мехашим протекания данпой реакции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Купряшина, М.Л. Выделение и очистка Мп-пероксидазы Л:о.<;р1п11ит ЬгаяНегие 8р245 / М.А. Купряшина, Н.Ю. Селиванов, В.Е. Никитина // Прикладная биохимия и микробиология. -2012. - Т. 48. ~№ 1.-С. 23-26.

2. Купряшина, МЛ. Индукторы активности Мп-пероксидазы и лакказы А:<прт11ит ЬгшИепзе Бр245 / МЛ. Купряшина, Е.П. Ветчинкина, Е.Г. Пономарева, В.Е. Никипша// Известия Самарского научного центра РАН. - 2013. - Т. 15. - № 3(1). - С. 23-26.

3. Купряшина, М.А. Биосинтез золотых наночастиц бактериями у\:о.чриШшп ЬгсчИепзг / М.А. Купряшина, Е.П. Ветчинкина, А.М. Буров, Е.Г. Пономарева, В.Е. Никипша // Микробиология. — 2014 - Т. 83.-№1.-С. 41-48.

Публикации в материалах конференций

4. Никитина, В.Е. Активность Мп-пероксидазы у бактерий рода /\zospinlhim, стимулирующих рост и развитие сельскохозяйственных растений / В.Е. Никитина, Е.П. Ветчинкина, Е.Г. Пономарёва, МЛ. Купряшина // Материалы международной научно-практической конференции «Вавштовскпе чтения-2009». Саратов: ИЦНаука, 2009.-Т. 1.-С. 157-158.

5. Купряшина, МЛ. Влияние фенольиых соединении на активность марганец-пероксидазы у Агохр/пИит Ьга5:1си<:е Бр245 / М.Л. Купряшина. В.Е. Никитина// Сборник тезисов «Биология наука XXI века»: 14 Международная Путинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 2010. -Том 2.-С. 239.

6. Купряшина, М.А. Влияние индукторов на активность Мп-пероксидазы эндофитной бактерии А:охрИ11ит Ьгаикпзе Яр245 / МЛ. Купряшина, Е.Г. Пономарева В.Е. Ниюптша // Материалы VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Беларусь, Минск: Беларуская навука, 2010. -С. 119-121.

7. Купряшнна, М.А. Mn-перокспдаза Azospirillum brasilense: выделение и очистка / VI.Л. Купряшнна, Н.Ю. Селиванов, В.Е. Никитина// Материалы V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов: Издательский центр «Наука», 2010. - С. 116.

8. Купряшнна, МЛ. Активность Mn-пероксидазы Azospirillum brasilense в зависимости от фенольных соединений в среде культивирования / М.А. Купряшнна, Н.Ю. Селиванов, В.Е. Ниипина // «Актуатьные аспекты современной микробиологии»: VI молодежная школа-конференция с международным участием. Инсппут микробиологии им. С.Н. Вшюградского РАН. Тезисы. -М.: МАКС Пресс, 2010 -С. 36-38.

9. Купряшнна, МА. Зависимость активности липши- и Мп-пероксидазы Azospirillum brasilense от условий культивирования / М.А. Купряшнна, С В. Петров, В.Е. Никитина // Материны IV Всероссийского с международным участием Конгресса студентов н аспирантов-биологов «Симбиоз -Россия 2011». Воронеж: Полиграф, центр Воронеж, госуд Ун-та, 2011. - Т. 1.-С. 24-26.

10. Kupryasliina, М.А. Purification of the Mn-peroxidase in the rhizospheric bacterium Azospirillum brasilense / M.A. Kupryashina, V.E. Nikitina // Abstract book "Ecology of soil microorganisms", Prague. Czech Republic, 2011. - P. 226.

11. Купряшнна, MA. Выделение и очистка внеклеточной Mn-пероксидазы Azospirillum Brasilense Sp7 и Sp245 / MA. Купряшнна, B E. Никитина // Тезисы докладов и стендовых сообщешш XXIV зимней молодежной научной школы «Перспективные направлешш физпко-химпческойбиолопшибиотехнолопш». Москва2012.-С. 74.

12. Пономарева Е.Г. Выделение п очистка лакказы Azospirillum Brasilense Sp245 / Е.Г. Пономарева Е.П. Ветчшгаша, МА Купряшнна, В.Е. Нтагпша // Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых. «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов: Издательский центр «Наука», 2012. -С. 157.

13. Купряшнна, МА. Стимуляция гашиш- и Mn-перокспдазной активности азосгатршш соединениями ароматической природы / МА. Купряшнна, С.В. Петров, В.Е. Нигашша // Материаты международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве», Саратов: «Саратовский ГАУ», 2013. - С. 257-259.

14. Купряшнна, МА. Биовосстановление коллоидного золота фенолоксидазами азоспирилл / МА. Купряшнна, Е.П. Ветчннкина Е.Г. Пономарева, В.Е. Никитина // Сборник тезисов VI Всероссийского с международным участием Конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013». Иркутск: «Аспртгг», 2013. С. 88-90.

15. Встчшпаша. Е.П. Биостгтез золотых наночаепщ фенолокисляющими ферментами бактершЧ и грибов / Е.П. Ветчинкина Е.А. Лощинина МА. Купршшша, A.M. Буров, В.Е. Ниишша // Сборник статей Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтешгя - 2013». Саратов: «Буква», 2013. -С. 107-110.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Купряшина, Мария Александровна, Саратов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИБФРМ РАН)

04201457511 На правах рукописи

Купряшина Мария Александровна

Мп-ПЕРОКСИДАЗЫ ЭНДОФИТНОГО И ЭПИФИТНОГО ШТАММОВ БАКТЕРИИ АгОБРШЬЬ им ВМБИЕШЕ

03.02.03 - микробиология 03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Никитина В.Е.

Саратов - 2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................................5

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................12

1.1 Растительно-микробные взаимоотношения в ризосфере и современные представления о систематике и физиологии ассоциативных бактерий

рода АгозрМИит............................................................................................................................................12

1.2 Общая характеристика фенолоксидаз..........................................................................................21

1.3 Фенолоксидазная активность бактерии рода АгоэртИит................................................29

1.4 Биологический синтез золотых наночастиц микроорганизмами........................32

Глава 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................35

2.1 Микроорганизмы и условия их культивирования............................................................35

2.2 Материалы и методы исследования................................................................................................35

2.2.1 Определение активности внеклеточной Мп-пероксидазы..................35

2.2.2 Оценка активности Мп-пероксидазы при выращивании бактерий на среде содержащей соединения ароматической природы..........................................................................................................................................................................................36

2.2.3 Определение концентрации белка..............................................................................36

2.2.4 Определение активности Мп-пероксидазы при инокуляции корней проростков пшеницы азоспириллами..................................................37

2.2.4.1 Инокуляция проростков пшеницы бактериями..........................37

2.2.4.2 Качественное обнаружение Мп-пероксидазной активности на корнях........................................................................................37

2.2.5 Выделение и очистка фермента....................................................................................38

2.2.6 Электрофоретический анализ ферментов............................................................39

2.2.7 Степень чистоты полученных препаратов..........................................................39

2.2.8 Определение рН-оптимумов выделенных ферментов............................39

2.2.9 Установление температурного оптимума............................................................40

2.2.10 Определение времени полуинактивации ферментов................................40

2.2.11 Ингибирование этилендиаминтетраацетатом..................................................40

2.2.12 Субстратная специфичность..........................................................................................40

2.2.13 Определение лигнинолитической активности азоспирилл..................41

2.2.14 Определение лигниндеградирующей функции Мп-пероксидазы 41

2.2.15 Установление чувствительности азоспирилл к присутствию в среде золотохлористоводородной кислоты......................................................42

2.2.16 Методы обнаружения и изучения частиц восстановленного золота....................................................................................................................................................43

2.2.16.1 Просвечивающая электронная микроскопия............................43

2.2.16.2 Ультрафиолетовая спектроскопия......................................................43

2.2.16.3 Рентгеновская флуоресценция..............................................................44

2.2.16.4 Динамическое светорассеяние (фотонная корреляционная спектроскопия)..........................................................44

2.2.17 Статистическая обработка результатов..................................................................44

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................45

3.1 Обнаружение активности внеклеточной Мп-пероксидазы....................................45

3.2 Зависимость продукции Мп-пероксидазы А. Ьгазйете 8р245 и 8р7 от условий культивирования......................................................................................................................46

3.3 Влияние фенольных соединений на Мп-пероксидазную активность............49

3.4 Активность Мп-пероксидазы А. Ъгазйете при инокуляции корней пшеницы..................................................................................................................................................................53

3.5 Выделение и очистка Мп-пероксидазы А. Ъгазйете....................................................55

3.6 Характеристика полученных препаратов МпП8р245 и МпП8р7................................65

3.7 Лигнинолитическая активность А. ЬгаБйете 8р245 и Бр7 и участие Мп-пероксидазы в процессах окисления модельных соединений лигнина......................................................................................................................................................................68

3.8 Восстановление золота из хлораурата бактериями АгозртИит Ъгазйете и

возможная роль Мп-пероксидазы в данном процессе.......................... 77

3.8.1 Влияние золотосодержащего соединения НАиСЦ на рост

азоспирилл........................................................................................................................................77

3.8.2 Биосинтез золотых наночастиц бактериями А. ЬгаяИете......................78

3.8.3 Образование золотых наночастиц в присутствии препаратов Мп-пероксидаз А. ЪгазИете 8р245 и 8р7............................................................83

3.8.4 Предполагаемый механизм биовосстановления золота Мп-пероксидазами А. ЬгазИете....................................................................................86

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................................................................................91

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................................................................94

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ......................................................96

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................97

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. На сегодняшний день проблема молекулярных механизмов взаимодействия микроорганизмов с растениями в зоне ризосферы, по-прежнему, остается особенно дискуссионной (Dutta and Podile, 2010; Fibach-Paldi et al., 2011). Одними из наиболее исследуемых модельных объектов ассоциативного симбиоза являются бактерии рода Azospirillum (Hartman et al., 2000). Некоторые штаммы азоспирилл способны к исключительно тесному взаимодействию с растением, в том числе к проникновению во внутренние ткани корня (Bashan et al., 2004; Saikia et al., 2012). Благодаря наличию большого генома азоспириллы обладают достаточно пластичным метаболизмом, позволяющим им адаптироваться к динамичным условиям ризосферы (Кацы, 2007).

Известно, что в прикорневом слое почвы аккумулируются многие физиологически активные вещества, и в частности фенольные соединения, способные даже в связанном состоянии сохранять свою биологическую активность (Bugg et al., 2011). Вещества именно этой группы, являются наиболее распространенными токсинами, а также выступают активаторами или ингибиторами многих обменных процессов (Rudrappa et al., 2008). В частности, защитные реакции растительных тканей в ответ на механическое повреждение и на атаку микроорганизмов связаны с участием фенольных соединений (Запрометов, 1992). Кроме того, вещества ароматической природы служат специфическими сигналами вызывающими хемотаксис у ризобактерий (Somers et al., 2004; Dutta and Podile, 2010). Таким образом, очевидно, что азоспириллам необходимы механизмы, позволяющие преодолеть фенольный барьер, возникающий при становлении взаимодействий с растением-хозяином, при этом не исключено, что у эндофитных и эпифитных штаммов данных бактерий они могут различаться.

Относительно недавно появились сведения о наличии у азоспирилл фенолоксидазной активности (Givaudan et al., 1993; Faure et al., 1994; Diamantidis

е1 а1., 2000; Никитина и др., 2010). Большинство работ касались обнаружения и изучения оксидаз, в частности лакказ. К началу наших исследований, полностью отсутствовали данные о пероксидазах бактерий, аналогичных ферментам лигнинолитического комплекса грибов. Основываясь на способности данных ферментов окислять многие ароматические, гетероциклические, хлорорганические вещества (Дзедзюля и Беккер, 2000; НоШсМег, 2002; Лисов и др., 2007; Айзенштадт и Боголицын, 2009), мы предположили, что продукция азоспириллами внеклеточной неспецифической пероксидазы, в частности Мп-пероксидазы, может быть связана с механизмами адаптации, повышающими выживаемость, конкурентоспособность бактерий благодаря возможности окислять и нейтрализовать токсичные фенольные соединения. Вероятнее всего, что наличие метаболических путей, ответственных за окисление ароматических веществ предопределяет способность бактерии и к деградации более сложных лигниноподобных соединений.

Показано, что почвенные бактерии А. ЬгаяНете, могут поддерживать жизнеспособность при высоких концентрациях ионов металлов (Веуепс^е е1 а1., 1997; Камнев и др., 2007). Интересными представляются исследования о возможном участии фенолоксидаз некоторых грибов в снижении токсического действия соединений золота, за счет образования Аи° (Натегаш е1 а1., 2010; Эаг^Ы е1 а1., 2011; Ветчинкина и др., 2013а). Не исключено, что фенолоксидазы азоспирилл также могут участвовать в восстановлении золота из золотосодержащих соединений до элементного состояния с образованием золотых наночастиц. Кроме того поиск и развитие нетоксичных, экологически чистых, так называемых «зелёных» методов синтеза наноматериалов, на сегодняшний день стоит особенно остро. В связи с этим, актуальным является исследование способности бактерий рода АгозртИит к биосинтезу золотых наночастиц и роли собственных Мп-пероксидаз в данном процессе.

Таким образом, исследование Мп-пероксидазы азоспирилл представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения роли фермента в жизнедеятельности бактерий и взаимоотношениях с растением, так и с позиции применения данного микроорганизма для получения препаратов, которые могут использоваться в различных областях биотехнологии.

Целью работы явилось сравнительное исследование свойств и функциональной значимости внеклеточных Мп-пероксидаз бактерий А. ЪгаБйете 8р245 и А. ЪгазИете 8р7.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выявить способность А. ЬгаяИете к продукции внеклеточной Мп-пероксидазы.

2. Определить оптимальные условия культивирования А. Ь гая Пете 8р245 и Эр7 с целью получения максимальной активности исследуемого фермента.

3. Изучить влияние ряда фенольных соединений на продукцию Мп-пероксидазы, и способность изучаемых штаммов к окислению данных веществ.

4. Оценить Мп-пероксидазную активность А. ЪгаяИете 8р245 и 8р7 при инокуляции бактериями корней проростков пшеницы сорта Саратовская 29.

5. Выделить гомогенные препараты Мп-пероксидазы А. Ь гая Пете 8р245 и 8р7, дать сравнительную характеристику выделенных ферментов.

6. Исследовать лигнинолитическую активность азоспирилл и способность Мп-пероксидаз к окислению модельных соединений лигнина.

7. Изучить способность А. ЪгаБИете к восстановлению золота из золотохлористоводородной кислоты до элементного состояния с образованием наночастиц и определить роль Мп-пероксидаз в этом процессе.

Научная новизна. Впервые в культуральной жидкости азоспирилл обнаружена внеклеточная Мп-пероксидаза.

Впервые выделены и частично охарактеризованы гомогенные препараты Mn-пероксидаз эндофитного и эпифитного штаммов азоспирилл.

Впервые обнаружена лигнинолитическая активность у бактерий рода Azospirillum и показана способность собственных Mn-пероксидаз деградировать модельные соединения лигнина.

Получены приоритетные данные о формировании культурами A. brasílense золотых наночастиц при восстановлении хлораурата. Впервые показано, что в восстановлении золота участвуют внеклеточные Mn-пероксидазы, представлены гипотетические схемы данного процесса.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в рамках настоящей работы результаты исследований расширяют и углубляют представления об адаптивных возможностях азоспирилл и вносят дополнительные коррективы в понимание механизмов взаимодействия микропартнера с растением-хозяином при становлении растительно-бактериальной ассоциации.

Полученные гомогенные препараты бактериальных Mn-пероксидаз могут быть использованы при проведении различного рода биологических исследований. Предложенная схема выделения и очистки внеклеточной Mn-пероксидазы азоспирилл может быть использована в различных областях биотехнологии, связанных с разрушением полициклических ароматических соединений, биоконверсией лигниноподобных веществ и детоксикации ксенобиотиков. Потенциально значимыми для разработки экологически чистых методов синтеза золотых наночастиц являются сведения о биовосстановлении золота с использованием азоспирилл и их ферментов.

Материалы диссертации использованы при выполнении дипломной и курсовых работ студентами биологического факультета Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского.

Положения, выносимые на защиту:

1. Обнаружена продукция внеклеточной Мп-пероксидазы в культуральной жидкости азоспирилл.

2. Индукция внеклеточной активности Мп-пероксидазы А. Ьгаяйете вторичными метаболитами растений, а также детекция фермента в области бактериальных скоплений, на поверхности корня инокулированного растения, косвенно подтверждают протекторную функцию Мп-пероксидазы, при становлении растительно-бактериальной ассоциации.

3. Выделенные из культуральной жидкости А. ЬгаяПете 8р245 и А. Ьг аз Пете 8р7 электрофоретически гомогенные препараты Мп-пероксидазы представляют собой односубъединичные белки с молекулярной массой 42-44 кДа, способные к окислению ароматических субстратов только в присутствии Н2О2 и являющиеся Мп-зависимыми.

4. Способность Мп-пероксидазы азоспирилл окислять модельные соединения лигнина свидетельствует об участии фермента в лигнинолитической активности бактерий А. ЪгаяИете 8р245 и 8р7, которая в наибольшей степени выражена у эндофитного штамма.

5. Внеклеточная Мп-пероксидаза бактерий А. ЬгазПете 8р245 и 8р7 опосредует способность бактерий к восстановлению золота из золотохлористоводородной кислоты с образованием золотых наночастиц.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Изучение гликопротеинов и биогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200904389, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина) и «Физиолого-биохимические признаки адаптационных процессов у бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01201359054, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина).

Апробация работы. Материалы диссертации, представлены на Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения -2009» (Саратов, 25 - 26 ноября 2009); 14-й Пущинской Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010); VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск, 31 мая - 4 июня 2010); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 28 сентября - 1 октября 2010); VI молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 25 - 27 октября 2010); Conférence «Ecology of Soil Microorganisms. Microbes as Important Drivers of Soil Processes» (Чехия, Прага, 27 апреля - 1 мая

2011); IV Всероссийском с международным участием Конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2011» (Воронеж, 23 - 27 мая 2011); XXIV зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 7-9 февраля 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 24 - 28 сентября

2012); международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (28 - 29 января 2013), VI Всероссийского с международным участием Конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 19 - 23 августа 2013), международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2013» (Саратов, 25-27 ноября 2013 г). Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН протокол № 34 от 12.03.2014 г.

Личный вклад соискателя. Автором осуществлен аналитический обзор литературы и обобщение теоретических данных по теме диссертации. Экспериментальные исследования выполнялись автором лично и в составе

научных групп в период с 2009 по 2013 г. Соискателю принадлежит решающая роль в обработке, и интерпретации всех полученных результатов, а также в подготовке публикаций.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Структура и объем диссертации. Д