Влияние тяжелых металлов и растительных лектинов на некоторые аспекты метаболизма и поведение Azospirillum brasilense

Тугарова, Анна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние тяжелых металлов и растительных лектинов на некоторые аспекты метаболизма и поведение Azospirillum brasilense
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние тяжелых металлов и растительных лектинов на некоторые аспекты метаболизма и поведение Azospirillum brasilense"

На правах рукописи

003167180

ТУГАРОВА Анна Владимировна

ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ЛЕКТИНОВ НА НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА И ПОВЕДЕНИЕ

АгояршиимВЕАБштЁ 4

03 00 04-биохимия 03.00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2008

003167180

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные руководители:

доктор биологических наук Антонюк Людмила Петровна доктор химических наук Камнев Александр Анатольевич

Официальные оппоненты-

доктор биологических наук, профессор Игнатов Олег Владимирович кандидат медицинских наук Киреев Михаил Николаевич

Ведущая организация:

Институт биохимии им А Н Баха, г Москва

Защита состоится « 14 » марта 2008 г в 14 00 на заседании диссертационного совета Д 002 146 01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г Саратов, просп Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН Автореферат диссертации размещен на сайте http //www lbppm Saratov ru/obyav_dis html

Автореферат разослан « 12 » февраля 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бактерии рода Azospirillum способны образовывать ассоциативные и эндофитные симбиозы с растениями, улучшая питание и рост последних Благодаря высокой азотфиксирующей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества, азоспириллы относятся к наиболее исследуемым представителям ростстимулирующих ризобактерий (PGPR - plant-growth-promotmg rhizobacteria) (Bashan etal, 2004)

Считается, что формирование и функционирование всех симбиозов происходит при непосредственном обмене сигналами между макро- и микропартнером симбиоза Для ассоциативного симбиоза азоспирилла - пшеница показано, что одним из таких сигналов может служить агглютинин зародышей пшеницы (АЗП) -белок, экскретируемый в ризосферу корнями пшеницы Данный лектин относится к группе хитин-связывающих лектинов, т е лектинов, которые обладают специфичностью к олигомерам Л-ацетил-р-О-глюкозамина (GlcNAc) Установлено, что АЗП (в концентрациях Ю-8 - 10~9 М) влияет на процессы, важные для формирования и функционирования симбиоза (Антонюк, 2005) В частности, добавление АЗП к культуре A brasilense вызывает усиление азотфиксации, стимулирует продукцию фитогормона ряда ауксинов - индолил-З-уксусной кислоты (ИУК), положительно влияет на размножение бактерий (Антонюк и Игнатов, 2001, Садовникова с соавт, 2003) Предполагается, что не только АЗП, но и другие растительные лектины влияют на жизнедеятельность ризобактерий (Антонюк, 2005), однако экспериментальных данных по этому вопросу на сегодняшний день почти нет

Формирование симбиозов в агробиоценозах зачастую происходит в условиях различных антропогенных загрязнений Среди загрязнителей биосферы, представляющих серьезную угрозу для человека, тяжелые металлы (ТМ) относятся к числу опаснейших (Веницианов с соавт, 2003) Загрязнение почвы соединениями ТМ оказывает неблагоприятное влияние как на эффективность симбиоза в целом, так и на различные аспекты жизнедеятельности макро- и микропартнера в отдельности (Behmov et al, 2004) Накопление ТМ в почве снижает видовое разнообразие почвенной микрофлоры, ингибирует многие микробиологические процессы, приводит к повышению содержания этих токсичных элементов в сельскохозяйственной продукции, снижает урожайность и содержание питательных элементов в растениях В то же время, микроорганизмы могут обладать высокой устойчивостью к ТМ и влиять на мобильность последних в почве путем изменения рН, продуцирования хелатирующих агентов и посредством других механизмов

Необходимо отметить способность ассоциативных бактерий защищать растения от различных неблагоприятных факторов окружающей среды (Abbas & Kamel, 2004, Burd et al, 2000) A brasilense является природным симбионтом для ряда растений, а также входит в состав бактериальных препаратов, используемых в растениеводстве, поэтому знание адаптации азоспирилл к стрессу, вызванному ТМ, важно не только для понимания стратегии выживания бактерий в природных условиях, но имеет и важное прикладное значение

Все вышесказанное предопределило наш интерес к изучению влияния ТМ и растительных лектинов на различные аспекты жизнедеятельности азоспирилл, важные для эффективности растительно-бактериального симбиоза

Целью данной работы являлось изучение влияния ионов тяжелых металлов и растительных лектинов на различные аспекты жизнедеятельности азоспириллы В связи с этим были поставлены следующие задачи

1 Изучение чувствительности А brasilen.se к ряду ионов тяжелых металлов кадмия(Н), меди(П), кобальта(Н) и цинка(11)

2 Анализ изменений, возникающих в клетках А Ьгаяйете под воздействием тяжелых металлов, с применением методов колебательной спектроскопии

3 Изучение взаимодействия ионов кобальта(11) с клетками А Ьгшкте методом эмиссионной спектроскопии ЯГР

4 Исследование влияния кадмия(П) и меди(И) на продукцию фитогормона ИУК клетками А Ъгазйете в различных условиях культивирования

5 Исследование влияния растительных лектинов на скорость плавания А Ьгамкте в жидких средах

6 Изучение влияния растительных лектинов на подвижность Л Ьгсяйете в полужидких средах

Научная новизна работы Впервые для бактерий показано, что в условиях стресса, обусловленного присутствием ТМ (при отсутствии других видов стресса), происходит накопление поли-3-гидроксобутирата (ПГБ) клетками эпифитного штамма А Ьгазйете Бр7 Установлено, что штаммы одного вида, А Ъгаяйете, различающиеся по своей локализации в ризосфере, по-разному реагируют на стресс, вызываемый ионами ТМ Впервые методом эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса (ЯГР, с использованием радиоактивного изотопа 57Со) показаны изменения химического состояния кобальта(Н), происходящие в живых клетках А Ьгшкте Бр245 Обнаружено, что первичная быстрая сорбция кобальта(П) живыми клетками по своему механизму аналогична химическому взаимодействию катиона с поверхностью мертвых клеток Впервые продемонстрировано влияние хитин-связывающих растительных лектинов на скорость плавания (в жидких средах) и тип социальной подвижности (в полужидких средах) А Ьгшкте

Научно-практическая значимость Установлено, что А Ьгазгкте Бр7 и Бр245 обладают относительно высокой устойчивостью к ряду ТМ, чго позволяет рекомендовать данные штаммы к использованию для фитостимуляции и совместной с растениями фиторемедиации при загрязнениях почв данными поллютантами Полученные результаты по влиянию ТМ на продукцию ИУК штаммами 4 Ьгшкте могут способствовать выработке стратегии их практического использования в агробиотехнологии Обнаруженный эффект индукции биосинтеза ПГБ штаммом А Ьгшкте Бр7 в присутствии ряда ТМ может быть полезен для разработки биотехнологических приемов производства данного промышленно ценного биополимера

основе возникновения и успешного существования ассоциативных симбиозов, что является практически важным для увеличения эффективности последних

Апробация работы Материалы диссертации представлялись на следующих научных совещаниях 7th International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine (St-Petersburg, Russia, 2002), 1-й региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2002), 10th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (Szeged, Hungary, 2003), International Symposium on Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants (Saratov, Russia, 2003), 8th International Symposium on Metal Ions m Biology and Medicine (Budapest, Hungary, 2004), FESTEM (Federation of European Societies on Trace Elements and Minerals) Second International Symposium on Trace Elements and Minerals m Medicine and Biology (Neuherberg-Munich, Germany, 2004), Всероссийской научной конференции "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений фундаментальные и прикладные аспекты" (Саратов, 2005), 9-й школе-конференции молодых ученых "Биология - наука 21го века" (Пущино, 2005), международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005), 30th FEBS Congress and 9* IUBMB Conference "The Protein World" (Budapest, Hungary, 2005), 9th International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine (Lisboa, Portugal, 2006), International Conference "Rhizosphere II" Satellite Workshop "Azospirillum VII and Related PGPR Genomics, Molecular Ecology, Plant Responses and Agronomic Significance" (Montpelher, France, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 работы в зарубежных и отечественных научных изданиях, из них 8 - статьи в сборниках и рецензируемых журналах, включая две статьи в журналах, входящих в рекомендованные ВАК списки периодических изданий для публикаций основных научных результатов Основные положения, выносимые на защиту

1 Клетки штаммов Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 обладают высокой устойчивостью к Cd2+ (по сравнению с некоторыми ранее изученными эубактериями), достаточно устойчивы к повреждающему действию Zn2+ и менее устойчивы к Со2+ и Си2+

2 Культивирование A brasilense в присутствии Cd2+ и Си2+ (0 2 мМ) приводит к снижению содержания фитогормона ИУК в культуральной жидкости В аэробных условиях культивирования снижение концентрации данного фитогормона происходит лишь за счет уменьшения числа жизнеспособных клеток, тогда как в микроаэробных - за счет снижения удельной продукции ИУК клетками

3 При росте эпифитного штамма A brasilense Sp7 на М^-содержащей питательной среде в присутствии тяжелых металлов происходит накопление ПГБ клетками Для эндофитного штамма A brasilense Sp245 в аналогичных условиях индукции синтеза и накопления ПГБ не наблюдается

4 Хитин-связывающие растительные лектины вызывают снижение скорости плавания A brasilense в жидкой культуре и изменение типа подвижности А biasilense от роения к распространению с образованием микроколоний в полужидких средах

Личный вклад соискателя Личный вклад соискателя состоит в участии в постановке всех исследовательских задач, подготовке и проведении большинства экспериментальных работ активном участии в обработке, интерпретации и обсуждении всех полученных результатов, атакже в подготовке статей к публикации

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения и обсуждения полученных резузыатов, заключения, выводов списка публикаций автора по теме диссертации списка цитируемой литературы содержащего 297 источников, в том числе - 251 зарубежных Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков и 10 таблиц

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в рамках тем "Особенности биохимии эндофитных и ассоциативных симбионтов рода izospii ilium" (руководитель - д б н Антонюк Л П , № гос регистрации 01200012855) и "Исследование молекулярных механизмов растительно-микробных взаимодействий с использованием спектроскопических подходов" (руководитель - д х н Камнев А А , № гос регистрации 01200712166)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Обзор литературы включает следующие подразделы 1 1 Современные представления о физиологии и экологии азоспирилл 1 2 Механизмы устойчивости микроорганизмов к тяжелым металлам I 3 Использование колебательной спектроскопии для решения микробиологических задач

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

В работе были использованы бактерии AzosptuUum bi asílense, штаммы Sp7 Spl07 и Sp245 (коллекция ИБФРМ РАН), а также его Омегон-Кт-мутанты - SK048, SK05 Î и SK454, полученные в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН (Katzy et а! 1998) В разделе даны состав питательных сред условия выращивания бактерий и пробоподготовка для используемых в работе методов В главе описаны следующие методы высокоэффективная жидкостная хроматография - для определения концентрации ИЖ продуцируемой бактериальными клетками, масс-спектрометрия - для определения содержания ТМ в бактериальных клетках, ИК-спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) - для определения макроизменений в бактериальных клетках вызываемых ТМ, эмиссионная спектроскопия ЯГР - для изучения химического состояния кобальта в живых клетках методы определения скорости плавания в жидких средах и подвижности бактерий в полужидких средах Минимальную летальную и минимальную ингибирующую рост концентрации ТМ определяли, оценивая численность жизнеспособных клеток по количеству КОЕ

Все эксперименты были проведены не менее чем в 3-х повторностях в 3-х независимых экспериментах Статистическую обработку данных проводили с испо 1ьзованием пакета анализа чанных программы Excel Microsoft Office 97 или ХР

Результаты исследований и их обсуждение

Определение минимальной летальной (МЛК) и минимальной ингибирующей рост концентрации (МИК) тяжелых металлов для А Ьгазйете.

Исследование токсического действия ТМ на азоспириллы было начато с определения МИК (минимальная концентрация, при которой происходит статистически достоверное уменьшение числа жизнеспособных клеток) и МЛК (наименьшая концентрация, при которой наблюдается отсутствие роста бактерий) Для анализа числа жизнеспособных клеток (КОЕ) был использован стандартный чашечный метод Полученные данные приведены в табл 1 Сравнение с литературными данными по влиянию ТМ на другие РвРЯ и почвенные бактерии (Белимов с соавт, 2004, ВеЬгпоу ег а1, 2004) показало, что штаммы А Ьгазгкте Бр245 и Бр7 обладают сравнительно высокой устойчивостью к меди, а по отношению к кадмию и цинку - максимальной по сравнению с ранее изученными ризобактериями При этом азоспириллы обладают устойчивостью к ТМ, сравнимой с устойчивостью для микробиологических объектов, выделенных из загрязненных тяжелыми металлами областей (УПтаг, 2003, Ме^еау е/ а1,1985)

Таблица 1

Штамм Значения МИК / МЛК, мМ / мМ

Cir+ Со Zn С<Г

A brasilense Sp7 0 1/05 0 1/05 -/5 -15

A brasilense Sp245 0 1/05 0 1/05 -/5 -/5

Примечание данные представлены как МИК / МЛК солей CuS04 5Н20, СоСЬ 6Н20, ZnS04 7Н20, CdCb в среде культивирования данные не определены

Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют о достаточно высокой устойчивости штаммов -1 btasilense Sp245 и Sp7 к действию ряда ТМ по сравнению с другими изученными бактериями Данный вывод в сочетании с хорошо известной способностью азоспириллы стимулировать рост растений за счет способности продуцировать фитогормоны и высокой азотфиксирующей активности (Окоп & Vanderleyden, 1997) делают перспективным ее использование в биоремедиации почв, загрязненных соединениями ТМ Следует отметить, что азоспирилла обладает высокой устойчивостью к кадмию, который относится к наиболее токсичным поллютантам для человека и животных (Будников, 1998).

Изучение влияния ионов тяжелых металлов на A. brasilense методами колебательной спектроскопии. Для оценки общего влияния ТМ на азоспириллу были использованы такие методы исследования, как ИК-епектроскопия и спектроскопия KP Данные методы в последние десятилетия все чаще используются для решения различных микробиологических задач во всем мире (Naumann, 2000, 2001, Jiang et al, 2004), однако в нашей стране они используются в гораздо меньшей степени, чем могли бы Это связано, в частности, с недостатком информации о возможностях и особенностях использования методов колебательной спектроскопии в микробиологических исследованиях В настоящей работе эти методы были использованы для детектирования изменений, возникающих в клетках азоспириллы под воздействием 0 2 мМ Со2", Си2' и Zn2+

Проведенное исследование с использованием спектроскопии КР показало, что, на присутствие кобальта(П), меди(П) или цинка(П) в среде в концентрации 0.2 мМ (каждого в отдельности), клетки штамма А Ъгаяйете 8р7 отвечают определенными метаболическими изменениями (рис 1) Во всех случаях для штамма А Ьгавйете Бр7 отмечались спектроскопические признаки накопления полиэфиров (в частности, появление заметной полосы около 945 см-1, отвечающей скелетным колебаниям связей С-С-О) Насколько нам известно, индукция синтеза полиэфиров бактериальными клетками в присутствии ТМ (в отсутствие стресса, связанного с недостатком питательных веществ) в литературе ранее описана не была. В связи с этим в данной работе были предприняты сравнительные исследования клеток штаммов А Ъгаяйете 8р7 и 8р245 с помощью метода ИК фурье-спектроскопии, более чувствительного к присутствию полиэфирных соедикенийвш

рт в «74 {♦С* 9 и® «9 | Г

¡Центром) а ,«, f1 Л, i*m г 1 т А*.

ж»

W»

СмшчияогшКР ш1

Рис. 1. Спектры КР (в области 2000-400 см"1) целых клеток культуры А Ьгаикте вр7, выращенной (а) на сред; с добавлением 3 г/л Ш4С1 (контроль), а также в аналогичных условиях в присутствии 0 2 мМ (б) кобальта(Н), (в) меди(П) и (г) цинка(П)

Проведенное исследование подтвердило, что даже в богатой питательной среде (с оптимальным соотношением CN) ТМ индуцируют накопление ill Ь клетками штамма A brasilense Sp7 (рис 2А) На спектрах клеток данного штамма, выращенных в присутствии ТМ (рис 2А, варианты Ь, с, d), появляется характерная для сложных эфиров интенсивная полоса поглощения при 1727 см-1, отвечающая валентным колебаниям карбонильной группы, которая в спектре контрольных клеток проявляется лишь в виде слабого плеча. Данные изменения, наряду с увеличением поглощения в области деформационных колебаний связей С-Н групп -СНг- и -СН3 (1440-1460 см-1) и некоторых других областях спектра, свидетельствуют о накоплении полиэфиров клетками штамма Sp7 в ответ на стресс, вызванный ТМ

Определение содержания ТМ в образцах, для которых были получены ИК-спектры, методом масс-спекггрометрии, показало, что штамм A brasileme Sp7 накапливает их в количествах 001-04 % сухой биомассы (табл 2) (при концентрации металла 0 2 мМ в среде культивирования) Такие количества комплексов с ТМ, присутствующие в биомассе, сами по себе не могут давать заметного вклада в ИК-спектры Таким образом, появление новых полос поглощения в спектрах отражает перестройку метаболизма бактерий под воздействием ТМ, приводящую к биосинтезу и накоплению 111 Ь

Рис. 2. ИК фурье-спектры целых клеток А Ьгаяйете (А) Бр7 и (Б) 8р245, выращенных на среде с 3 г/л ИН4С1 в отсутствие ТМ (я, контроль) и в присутствии каждого из ТМ (Ь) кобальта(П), (с) меди(И) и цинка(11) в концентрации 0 2 мМ

Таблица 2

Накопление тяжелых металлов клетками штамма Azospirillum brasilense Sp7

Среда культивирования Содержание металлов, мкг/г сухой биомассы

Со Си Zn

CMC (контроль) 05 47 25

CMC + 0 2 мМ Со2+ 118 2 27

CMC + 02 мМ Си2+ 0.7 477 35

CMC + 02 мМ Zn2+ 06 7 4240

Примечание ТМ были добавлены в виде солей CuS04 5Н20, СоС12 6Н20, ZnS04 7Н20, Жирным шрифтом вьщелены значения содержания в биомассе металлов, добавленных в среду культивирования в концентрации 0 2 мМ CMC - синтетическая малатная среда

Таблица 3

Накопление тяжелых металлов клетками штамма Azospirillum brasilense Sp245*

Среда культивирования Содержание металлов, мкг/г сухой биомассы

Со Си Zn

CMC (контроль) 3 1 213 41

CMC + 0 2 мМ Со2+ 134.2 33 2 57 5

CMC + 0 2 мМ Си2+ 08 438.4 52.8

CMC + 0 2 мМ Zn2+ 1 6 33 2136.4

* См примечание к табл 2

Результаты, полученные в аналогичных условиях культивирования для штамма Sp245, показывают, что присутствие ТМ не вызывает заметных изменений в ИК-спектрах клеток по сравнению с контролем (рис 2Б), несмотря на сопоставимый со штаммом Sp7 уровень накопления ТМ (0 01-0 2 % сухой биомассы, табл 3)

Эти различия в отклике эндофитного (Sp245) и эпифитного штамма (Sp7) на стресс, вызванный ТМ, связаны, наиболее вероятно, с их различными адаптационными способностями, что, в свою очередь, может быть напрямую связано с занимаемыми данными штаммами различными экологическими нишами Штамм Sp7 локализован на поверхности корня, те всегда находится в прямом контакте с компонентами почвы в ризосфере, в отличие от штамма А brasilense Sp245 - факультативного эндофита, способного колонизировать корень пшеницы как снаружи, так и изнутри (Kirchhof et al, 1997) Адаптационная стратегия к воздействию ТМ в случае штамма Sp7 включает накопление ПГБ, чего не наблюдается у штамма Sp245 Известно, что синтез ПГБ индуцируется в определенных стрессовых условиях и увеличивает способность азоспириллы к выживанию (Bashan & Holguin, 1997, Kadoun et al, 2005)

Изучение взаимодействия ионов кобальта(П) с клетками А. brasilense методом эмиссионной спектроскопии ЯГР. Методом ИК-спекгроскопии, как отмечено выше, не были зафиксированы какие-либо изменения в спектрах клеток А brasilense Sp245 при их росте на средах с кобальтом(П), цинком(П) или медью(П) Это оставляло открытым вопрос участвуют ли катионы этих ТМ как-либо в метаболизме данного штамма (те происходит ли их ассимиляция клетками), или же происходит лишь их абиотическое (химическое) взаимодействие с компонентами клеточной поверхности?

Плодотворным для решения данного вопроса оказалось использование такого исключительно редко применяемого в биологии ядерно-химического метода, как эмиссионная спектроскопия ЯГР (Perfihev & Kamnev, 2007) Как известно, радиоактивный изотоп одного из изучаемых нами металлов, 57Со, является одним из наиболее удобных радионуклидов для этого высокочувствительного и информативного метода (Мессбауэровская спектроскопия замороженных растворов, 1998), что позволило нам использовать его для изучения химического состояния кобальта в бактериальных клетках В экспериментах были использованы как живые, так и мертвые (термически обработанные) клетки А brasilense Sp245 Целесообразность использования последних диктовалась тем, что в данном случае возможно лишь абиотическое (химическое) взаимодействие катионов с компонентами клеточной поверхности, исключены элементы адаптационной стратегии бактерии к поллютанту, в частности невозможен активный, энергетически зависимый вывод катионов кобальта из клетки, а также синтез de novo биополимеров (белков, полисахаридов и др), связывающих ТМ

Полученные эмиссионные спектры ЯГР представлены на рис ЗА Анализ спектральных компонентов при разложении спектров однозначно показывает наличие двух форм исходного кобальта(Н) в каждом из образцов, которые представлены дублетами со значительными величинами квадрупольного расщепления (третий компонент с меньшими величинами соответствует

нуклеогенному "Те"1, образующемуся в результате пост-эффектов (РегйНеу-е/ а!.. 2005)). Надо отметить, что параметры эмиссионных спектров ЯГР для мертвых клеток со временем не изменялись и совпадали для различных периодов контакта с "Со"" (2 и 60 мин).

На рис. ЗБ представлено сравнение полученных параметров для двух вышеупомянутых форм кобапьта(П) в каждом из образцов для различных периодов контакта (2 и 60 мин) живых бактерий, мертвой биомассы, а также супернатанта без клеток с "Со-". При этом на данном рисунке каждой экспериментальной "точке" (в виде прямоугольника - с учетом статистической погрешности определения изомерного сдвига 5 (по горизонтали) и квадруполъного расщепления J (по вертикали)) соответствует определенная форма исходного >7Со"~.

\ •

V , I

1 V

\ Л 7 17 V- i

:' f%

i У

a; 4

2 <-> J 3

S J , — 1

о ■ ■Ш11

1 :3 fci-*ai

о 2 7 2

О.

ф 2 5 СЮ

а • ■Ш1 3

1 21 Е»3

ш аз 4

( ,

> 0 , , Л0 45 . 0

Изомерный сдвиг, см"1

Рис. 3. Эмиссионные спектры ЯГР (А ) и сравнение параметров (Б) для живых клеток A. brasilense Sp245. быстро замороженных в жидком азоте после контакта с катионами 57Co2i в течение (1)2 мин и (2) 60 мин, а также дня (3) мертвой биомассы и (4) супернатанта (после 60 мин контакта с катионами i7Co2+). Положение различных квадрупольных дублетов на рис. ( А), соответствующих различным спектральным компонентам, показано в виде скобок над спектрами.

Параметры обеих форм кобальта(П) для живых бактерий статистически достоверно различаются для 2 и 60 мин (см. 1 и 2 на рис. ЗБ). что указывает на трансформацию кобальта(П) живыми клетками в течение часа. При этом параметры обеих форм для 2 мин контакта с металлом живых клеток (см. 1 на рис. ЗБ) очень близки (перекрываются) с соответствующими параметрами мертвых клеток (см. 3 на рис. ЗБ). На основании этого наблюдения можно полагать, что механизм быстрого связывания кобальта) 11) на поверхности живых клеток подобен механизму чисто химического взаимодействия данного элемента с мертвой биомассой клеток и. наиболее вероятно, объясняется связыванием кобальта!¡1) с функциональными группами биомакромолекул клеточной поверхности различной природы (Jiang et at., 2004). Можно также отметить, что параметры обеих форм для супернатанта заметно отличаются от параметров форм всех остальных образцов клеток (см. рис. ЗБ).

Прямая идентификация вида комплексов в столь сложной системе, как-бактериальная клетка, с помощью метода эмиссионной спектроскопии ЯГР. к сожалению, в настоящее время не представляется возможной по ряду причин, и в

первую очередь - из-за недостатка экспериментальных данных по эмиссионной спектроскопии ЯГР комплексов кобальта с биолигандами Кроме этого, важно отметить, что различные комплексы 37Со с близким по составу (природа донорных атомов) и структуре (их расположение) координационным микроокружением могут давать близкие параметры спектров и быть, таким образом, практически неразличимыми в спектрах ЯГР (не давать разрешающихся полос)

Отметим, что наличие двух форм кобальта(П), различимых по спектральным параметрам, в образцах клеток связано с существованием различных функциональных групп поверхностных биомакромолекул, участвующих в координации катиона с образованием различного микроокружения (Jiang et al, 2004) Аналогично объясняется и наличие двух (отличающихся по координации) форм кобальта(П), присутствующих в супернатанте, освобожденном от клеток

Можно полагать, что при связывании :'7Со2+ с поверхностными структурами живых и термически обработанных бактериальных клеток основными координирующими атомами являются атомы кислорода и азота функциональных групп биополимеров поверхности клеток и липополисахарид-белковых комплексов, выделяемых азоспириллой во внешнюю среду Важно отметить, что ни одна из форм кобальта(И) в супернатанте по параметрам (см рис ЗБ) не соответствует гексааквакомплексу (последний дает параметры <5=13—14и А = 3 3 - 34 мм/с в замороженном растворе при Т ~ 80 К (Vértes et al, 1979)) Это означает, что наличие в изученных растворах и клеточных суспензиях свободного гидратированного иона [Со(Н20)6]2+ в сколько-нибудь заметных количествах в данных условиях маловероятно для всех образцов (те весь кобальт(Н) находится в виде комплексов с биолигандами)

Таким образом, сравнительный анализ взаимодействия живых и термически обработанных клеток азоспириллы с катионами кобальта(П) с использованием эмиссионной спектроскопии ЯГР позволяет получить достаточно важную информацию о молекулярных взаимодействиях в изучаемой системе В частности, полученные нами данные свидетельствуют о том, что культура А brasilense способна связать весь поступивший в систему кобальт(Н) при его достаточно низкой концентрации (~2 Ю-45 М з7Со2+ при плотности клеток 2 4 108 кл /мл, что по порядку величины приблизительно соответствует уровню накопления Со2+ клетками A bi asílense, см табл 3)

Кроме того, представленные в данном разделе данные убедительно свидетельствуют о том, что живая культура -/ biasílense Sp245 не только связывает Со2+, но и ассимилирует его, что следует из сравнения данных, полученных на живых и мертвых клетках, а также сравнения результатов по 2 и 60 мин экспозиции живых клеток с з7Со2+ Наш вывод о том, что при добавлении к бактериальной культуре кобальт(Н) ассимилируется клетками азоспириллы и включается в метаболизм, не противоречит данным об отсутствии изменений в ИК фурье-спектрах клеток данного штамма Хорошо известно, что только количественно выраженные изменения состава клеточных компонентов могут приводить к изменениям, находящих отражение в колебательных спектрах

Проведенные эксперименты показали. что метод эмиссионной спектроскопии ЯГР может дать информацию о динамике превращений следов

кобальта в клетках микроорганизмов, включая его взаимодействие с поверхностными биополимерами клетки и дальнейшую трансформацию При этом было показано, что первичная быстрая сорбция кобальта(П) живыми клетками по своему механизму аналогична химическому взаимодействию катиона с поверхностью мертвых клеток Данный вывод вполне логично объясняет первую (быструю) стадию взаимодействия катиона металла с различными функциональными группами биополимеров клеточной поверхности бактерий (Jiang et al, 2004) - как живых клеток, так и мертвой биомассы

Для сравнения отметим, что в недавней работе (Ranquet et al, 2007) по механизму токсичности субмиллимолярных концентраций кобальта(П) для Е coh с помощью биохимических и генетических экспериментов обнаружена инактивация ряда [Fe-Sj-ферментов бактерии в присутствии Со2+ в среде В опытах т vitro было показано, что кобальт(П) реагирует с лабильными [Fe-SJ-кластерами в белках, участвующих в их биосинтезе Таким образом, токсичность кобальта связана с его влиянием на внутриклеточный метаболизм железа и, в частности, на процесс "сборки" [Fe-S]-кластеров при их синтезе de novo или восстановлении

Изучение продукции ИУК бактериями A brastlense Sp245 и Sp7 в присутствии тяжелых металлов. Способность к синтезу ИУК азоспириллами и другими ризобактериями считается свойством, важным для проявления их ростстимулирующего действия (Spaepen et al, 2007) ТМ в определенных концентрациях способны угнетать рост как микроорганизмов, так и растений, а также влиять на различные аспекты их метаболизма и взаимодействия друг с другом В этих условиях возрастает значимость такой особенности ризобактерий, как способность синтезировать и выделять в окружающую среду фитогормоны

Нами было исследовано влияние кадмия(П) и меди(П) (в концентрации 0 2 мМ в среде) на продукцию ИУК A brastlense Sp245 в аэробных и микроаэробных условиях культивирования, A brastlense Sp7 - в микроаэробных условиях ТМ в этой концентрации не оказывали значительного влияния на рост азоспириллы, при этом вызывали четко выявляемые изменения в метаболизме A brastlense Sp7 и не влияли на ИК-спектроскопические характеристики клеток штамма Sp245

Продукция ИУК бактерия \т A brastlense Sp245 в присутствии Cd ~ и Си в аэробных условиях Содержание ИУК в культурапьной жидкости штамма А brastlense Sp245 снижалось в 1 6 раза для культуры, выращенной в присутствии Cd(Il), и в 1 8 раза - в присутствии Cu(II), по сравнению с контролем в аэробных условиях культивирования (табл 4) При этом наблюдалось снижение числа жизнеспособных клеток под воздействием ионов ТМ в 3 6 раза и в 2 раза соответственно для меди(Н) и кадмия(Н) (табл 4)

Дополнительные эксперименты показали, что кадмий и медь в данных условиях не образуют устойчивых комплексов с ИУК и не разрушают продуцируемый азоспириллой фитогормон На основании полученных результатов можно сделать вывод, что снижение количества ИУК в среде культивирования происходит лишь за счет процессов, связанных с ростом и развитием бактериальной культуры, а не за счет физико-химических процессов, в результате которых могло бы происходить уменьшение содержания количества ИУК

Гаки.м образом концентрация ИУК в к\льтуральной жидкости снижалась, хотя удельное количество ИУК (отнесенное на 106 клеток культуры) в случае кадмия не изменялось а в присутствии меди в среде даже возрастало (см табл 4)

Таблица 4

Жизнеспособность и продукция ИУК штаммом -í bi asílense Sp245 при аэробном _____ росте в присутствии тяжепых металлов____________

Металл в ¡ КОЕ концентрации 0 2 ] 10" кл /мл мМ ! ИУК в культуральной жидкости, 10"" м г/мл Удельная продукция ИУК мкг/10" клеток

Контроль ' 147 ±12 8 9 ± 0 9 06 + 0 1

Cd(II) i 75 ±15 5 5 + 06 0 7 ± 0 2

Cu(ll) ] 40 а- 12 48105 1 2 ±0 4

Примечание данные представляют среднее 3-х или более повторностей Доверительные ишервалы указаны для надежности 95% ТМ добавляли в виде солей Си&04 5Н:0 и СёС1;

Воздействие кадмия(П) в исследуемой концентрации было менее выражено, чем влияние меди(Н) и проявлялось лишь в небольшом ингибировании роста клеток без изменения в синтезе ИУК в расчете на клетку, что вполне логично так как ранее нами была показана большая устойчивостью азоспириллы к кадмию, чем к меди

Надо отметить, что, несмотря на достаточно высокую устойчивость к кадмию (МЛК = 5 мМ) штамма 1 btasílense Sp245, в данных условиях культивирования мы наблюдали небольшое ингибирование роста уже при концентрации данного поллютанта 0 2 мМ Влияние кадмия в такой низкой концентрации на жизнеспособность клеток связано, скорее всего, с тем, что в аэробных условиях выращивания негативное влияние ТМ усиливается довольно высокой концентрацией кислорода, что, как описано в литературе, может приводить к сильному окислительному стрессу (Nies, 1999, Schutzendubel & Polle, 2002)

Продукция I'ft'K в микроаэробных усювиях штаммами A biasilense Ьр245 и Sp7 При выращивании в микроаэробных условиях культура штамма Л bi asílense Sp245 продуцировала на порядок (8 7 мг/л) меньшее количество ИУК и показывала большую устойчивость к воздействию ТМ по сравнению с аэробными условиями роста (рис 4А) Важно отметить, что в случае Cd""" в данных условиях не происходило ингибирования роста бактерий по сравнению с контролем (рис 4Б)

При росте в микроаэробных условиях в присутствии меди(П) число жизнеспособных клеток I lv asílense Sp245 уменьшалось в 1 8 раза (рис 4Б), в то время как при выращивании в аэробных условиях происходило ингибирование роста азоспириллы более чем в 3 5 раза (см табл 4) В цепом, в микроаэробных условиях добавление ТМ приводило к снижению общего количества ИУК, регистрируемого в среде культивирования, как и в аэробных условиях роста (рис 4А, см также табл 4)

Необходимо отметить что вызванное ионами меди ингибирование продукции ИУК было намного более выражено, чем ингибирование бактериального роста (ср рис 4А и 4Б соответственно), а в присутствии кадмия(П) снижаюсь лишь количество ИУК, но не количество жизнеспособных клеток Проведенный статистический анализ данных показал, что различия в уменьшении КОЕ и количества ИУК в случае чеди(Н) достоверны Эго в свою очередь позволяет

сделать вывод, что уменьшение концентрации ИУК в среде культивирования А. ЬгаяНепзе, вызванное присутствием ТМ, обусловлено прежде всего снижением продукции ИУК самими бактериальными клетками, а не уменьшением их числа.

Рис. 4. Продукция ИУК (А) и жизнеспособность (КОЕ) (Б) для штамма А. ЬгазИете Бр245 в присутствии 0.2 мМ Си804 или СУС12 в микроаэробных условиях культивирования. Указано стандартное отклонение. Различия по сравнению с контролем статистически достоверны при р < 0.05 для обоих вариантов (А) и для Си304 (Б).

Таким образом, в аэробных условиях общее количество ИУК в среде культивирования А. ЬгсиИепзе Бр245 снижалось, но синтез ее в расчете на клетку не изменялся в случае кадмия(П), а в случае меди(П) даже возрастал. При росте в микроаэробных условиях также регистрировалось уменьшение общего количества ИУК в среде культивирования. Однако, в отличие от аэробных условий, как в присутствии меди, так и в присутствии кадмия снижалась также и продукция ИУК в расчете на клетку.

Штамм А. Ьгаь'йете Бр7 в микроаэробных условиях выращивания продуцировал меньшее количество ИУК, и катионы ТМ оказывали меньшее влияние на продукцию ИУК, чем в случае штамма Эр245 (рис. 5А и 4А, соответственно). Так, при росте без дополнительной аэрации в контрольной культуре концентрация ИУК, определенная для штамма Л. ЬгазИете Бр7, составляла 3.1 мг/л; присутствие С<12+ и Си2+ уменьшало продукцию этого фитогормона в 2.6 и 1.9 раза, соответственно (рис. 5А), фактически без изменения в росте бактерий (рис. 5Б).

При использовании ИК-спектроскопии было показано, что стресс, обусловленный ТМ, индуцировал синтез ПГБ штаммом А. ЪгазИете 8р7, но не штаммом Бр245. Синтез больших количеств данного полиэфира азоспириллой, как было показано другими авторами, позволяет бактериям быть более устойчивыми к стрессам, вызванными различными факторами (Та1 е/ а/., 1990; Каёоип е1 а!., 2003а; 20036). Возможно, накопление данного полиэфира является одной из причин большей стабильности и меньшего влияния ТМ на метаболизм

(как показано в этом разделе на примере биосинтеза ИУК и анализа количества жизнеспособных клеток) штамма Бр7 к стрессу, вызываемому ТМ.

4 ]

3.5] 3 \ 2,5 2 1,5 1

0,5 О

Контроль + CüS04 + CáOj

контроль + Cuso,+cao,

Рис. 5. Продукция ИУК (А) и жизнеспособность (КОЕ) (Б) для штамма A. brasilense Sp7 в присутствии 0.2 мМ CuS04 или CdCl2 в микроаэробных условиях культивирования. Указано стандартное отклонение. Различия в (А) по сравнению с контролем статистически достоверны при р< 0.05 для обоих вариантов.

Важно отметить, что в аэробных условиях азоспирилла более чувствительна к негативному влиянию ТМ по сравнению с микроаэробными условиями, что может объясняться несколькими возможными причинами. Во-первых, может происходить синергическое воздействие ТМ и кислорода на азоспириллу, приводящее, как упоминалось выше, к сильному окислительному стрессу. Во-вторых, в микроаэробных условиях, являющихся природными условиями для азоспирилл, бактерии имеют больше возможности для межклеточного взаимодействия, которое, как известно, важно для адаптации бактерии к стрессу. Напротив, механическое перемешивание, которое часто используется при создании аэробных условий выращивания периодических культур, препятствует физическому контакту клеток, который важен для межклеточной кооперации и адаптации бактерий к стрессу (Волошин, Капрельянц, 2004). В-третьих, можно также предположить, что в микроаэробных условиях A. brasilense способна образовывать биопленки, что, как известно, обеспечивает большую устойчивость бактерий к различным негативным факторам (Merino et al., 2006).

Информация о влиянии ТМ на продукцию ИУК важна для лучшего понимания функционирования ассоциативных симбиозов в условиях загрязнения данными поллютантами. Надо отметить, что ранее в литералуре упоминалось об увеличении синтеза ИУК клетками при неблагоприятных условиях вообще (Spaepen et al., 2007) и в присутствии ТМ в частности (Пищик с соавт., 2005). Наши исследования показали, что это не всегда справедливо, и синтез ИУК зависит не только от присутствия ТМ, но и от условий, при которых ТМ воздействуют на клетки. Было показано, что культивирование A. brasilense в присутствии Cd2+ и Си2+ (0.2 мМ) приводит к снижению содержания фитогормона ИУК в культуральной жидкости. Однако в аэробных условиях культивирования уменьшение количества ИУК происходило лишь за счет уменьшения числа жизнеспособных клеток, при одновременном увеличении

ими синтеза ИУК в случае меди и без изменения в синтезе - в случае кадмия, тогда как в микроаэробных условиях - за счет реального снижения синтеза ИУК культурой.

Изучение влияния растительных лектинов на подвижность азоспириллы в жидких и полужидких средах. Было показано, что в присутствии растительных лектинов, специфичных к СИсЫАс и его олигомерам, происходит как изменение скорости движения азоспириллы в жидких средах, так и изменение типа коллективной подвижности на полужидких средах.

Изучение влияния лектинов на скорость плавания А. ЬгаяПете в жидких средах. Средняя скорость движения клеток А. brasilen.se Бр245 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) без добавления какого-либо лектина составляла 26.5 ± 1.3 мкм/с (рис. 6А). В присутствии АЗП, лектина картофеля (ЛК) или лектина II утесника обыкновенного (ЛУ II), обладающих сродством к С1с1МАс или его олигомерам, скорость плавания азоспирилл заметно снижалась. Как можно видеть из представленных данных, снижение скорости начиналось с концентрации лектинов в жидкой среде 5-1 (И мкг/мл, достигало максимума при 0.05-0.5 мкг/мл и далее не менялось. По-видимому, в диапазоне концентраций 0.05-0.5 -кг/мл происходило насыщение сайтов связывания АЗП, ЛК или ЛУ II у бактерий, ч дальнейшее возрастание концентрации лектина не приводило к дальнейшему снижению скорости плавания азоспирилл (рис. 6А). Конканавалин А (Кон А) или фитогемагглютинин П (ФГА П)- фитолектины, обладающие иной углеводной специфичностью, — не вызывали статистически достоверного уменьшения скорости плавания (рис. 6А).

А Б

□ контроль

5-Ю"4 5-10-' 510'3 5-Ю'1 510" 510' Концентрация белка, мкг/мл

0 0.05 0.5

Концентрация АЗП, мкг/мл

Рис. 6. Скорость плавания клеток штамма А. ЬгаэИете вр245 (А) в присутствии различных лектинов и (Б) в присутствии АЗП, при ингибировании последнего различными веществами.

Дальнейшее изучение вляния лектинов на снижение скорости плавания бактерий было проведено на примере связывания АЗП, являющегося лектином, выделенным из пшеницы, с клетками А. ЬгаяНете 8р245, т.к. данный штамм А. ЬгазПете Бр245 является природным симбионтом пшеницы. При блокировании специфичных центров связывания АЗП предварительной (1 ч) обработкой лектина 0.05 мг/мл ИсЫАс или его олигомером, /У,Лг,А''"-триацетилхитотриозой ((GlcNAc)з) в такой же концентрации происходило элиминирование влияния АЗП

на скорость движения клеток (рис 6Б) В этом случае при 0 05 мкг/мл АЗП скорость плавания клеток фактически восстанавливалась до контрольного значения в отсутствие АЗП, а при 0 5 мкг/мл АЗП - восстановление скорости было неполным, что может свидетельствовать о возможном неполном ингибировании сайтов связывания лектина (рис 6Б) Данный лектин мог также связываться с поверхностными полимерами бактерий не только за счет данных специфических сайтов связывания, ингибированных i аптенами

Аналогичный эффект наблюдался при обработке АЗП липополисачарид-белковым комплексом (ЛПБК), выделенным из капсулы азоспириллы и содержащим остатки GIcNAc (Коннова с соавт, 1992) добавление его к АЗП приводило к практически полному восстановлению скорости плавания, характерной в отсутствие АЗП (рис 6Б) Сахара, не являющиеся гаптенами для данного лектина - рамноза или глюкоза, но входящие в состав полисахаридов клеточной поверхности штамма Sp245 (Коннова с соавт, 1992, Yegorenkova et al, 2001), не влияли на способность АЗП снижать скорость плавания азоспирилл (рис 6Б) Контрольные эксперименты показали, что ни одно из используемых для блокирования возможных сайтов связывания лектина веществ (GIcNAc, (GIcNAc )3, рамноза и глюкоза) само по себе не вызывало снижения скорости плавания бактерий (рис 6Б)

Добавление АЗП к клеткам штамма^ brasilense Spl07, для которого определен более низкий процент содержания GIcNAc в составе полимеров клеточной поверхности по сравнению с Sp245 (Коннова с соавт, 1992), снижало скорость плавания в жидкой среде в меньшей степени Очевидно, снижение скорости плавания азоспирилл в присутствии АЗП, а также лектинов с аналогичной специфичностью, происходит вследствие специфического связывания этих лектинов с полимерами поверхности бактерий, содержащими остатки GIcNAc

Изучение влияния чектинов на поведение I b¡asílense в полужидких средах Нами также было исследовано влияние растительных лектинов на изменение типа подвижности азоспириллы в полужидких средах Все попытки зафиксировать влияние лектинов на подвижность Azospirilhim на полужидкой среде с бактоагаром не увенчались успехом Вероятно, наличие различных остатков полисахаридов, в том числе и GIcNAc, в бактоагаре препятствует успешному взаимодействию бактерий с лектином В качестве гелеобразующего агента для создания полужидкой среды нами был использован Phytagel (Sigma), имеющий в своем составе глюкуроновую кислоту, рамнозу и глюкозу и не содержащий остатков GIcNAc, только в этом случае нам удалось зафиксировать влияние хитин-связывающих лектинов на подвижность A brasilense

На среде без добавления каких-либо веществ или среде, содержащей бычий сывороточный альбумин (БСА), культуры A brasilense Sp245 формировали обычные концентрические макроколонии (рис 7А, Б), характерные для азоспириллы В присутствии Кон А на вторые сутки инкубирования бактерии начинали перемещаться от края концентрической макроколонии с формированием выбросов, или протуберанцев (рис 7В) Однако влияние этого лектина на распространение A bi asílense было относительно слабым

А - контроль Б - +50 мкг/мл БСА В - +0.5 мкг/мл Кон А Г - +0.5 мкг/мл АЗП Д - +АЗП, 5 мкг/мл Е - +0.5 мкг/мл ЛК Ж - -50 мкг/мл (01сЫАс), 3 - 0.5 мкг/мл АЗП+ 50 мкг/мл (С1сЫАс)3 И - +0.5 мкг/мл АЗП

Рис. 7. Подвижность штаммов А. ЬгавПете Яр245 (А-3) и 5р107 (И) на полужидких средах в присутствии различных веществ. Колонии фотографировались через 48 ч инкубации при 32 °С. Масштабная линейка 1 см.

На средах, содержащих АЗП или Л К, у А. ЬгазИепзе 5р245 наблюдалось появление колоний смешанного мутно-зернистого фенотипа (рис 7, Г-Е), что свидетельствует о переходе части популяции от роения к распространению с образованием микроколоний.

При ингибировании специфических сайтов связывания АЗП с помощью (01сЫАсЬ зоны распространения стали менее гранулированными на периферии, но все еще состояли из микроколоний около точки внесения культуры (рис. 7, 3). Эксперимент с добавлением (С1сЫАс).! в полужидкую среду показал появление протуберанцев во внешнем краю роящихся колец (рис. 7, Ж), что свидетельствует о влиянии данного специфичного для АЗП гаптена на характер распространения .4. ЬгазИете.

Характер распространения штамма А. brasilen.se Бр 107 в присутствии АЗП и ЛК также изменялся, хотя характер изменения был отличен от Бр245: наблюдались протуберанцы зернистого типа из колец роения (рис. 7, И).

Таким образом, было показано, что лектины со специфичностью к остаткам в^Ас влияют на коллективную подвижность .4. ЬгаьНеюе Бр245. Изменение поведения 5р245 в полужидких средах в присутствии АЗП или Л К может быть следствием снижения скорости движения клеток и модификации структуры клеточной поверхности, влияющей на межклеточное взаимодействие, необходимое для роения бактерий (НагэЬеу, 2003).

Вызываемое растительными лектинами снижение в скорости плавания в жидкой среде снималось добавлением в^Ас. (С1сК!Ас)3, а также ЛПБК. выделенным из капсулы .4. ЬганИепяе 5р245. Мы не смогли полностью элиминировать вызываемый АЗП эффект, наблюдаемый на полужидких средах, ингибируя специфические сайты связывания с помощью (С1сЫАс);. Это может свидетельствовать как о том, что в данном случае не все сайты связывания были заблокированы (01сТ^Ас)> так и с тем, что данные лектины могли связываться с поверхностными полимерами бактерий не только за счет данных специфических сайтов связывания. Следует учесть, что время инкубации на полужидких средах было больше 36 ч (что необходимо для

формирования зон распространении), и поэтому нельзя исключить возможность метаболических изменений как АЗП, так и его гаптенов Возможные продукты таких преобразований не учитывались в данном исследовании

Известно, что состав поверхности ых полимеров и процент бактериальных клеток, способных к связыванию растительных лектинов, различны и зависят от множества факторов (Уа§ос!а-51та§агл е/ а1, 1988, Коннова с ооавт, 2003) Показано, что на социальное движение бактерий могут влиять различные факторы (НакИсу, 2003) Ранее было показано, что АЗП взаимодействует с капсулой А Ъгс&йете (Уаяойа-8Ьа§ат е\ а\, 1988) Также было показано, что флагеллин полярного жгушка гликозилирован (Моет е/ а/, 1995), и сам жгутик окружен полисахаридной оболочкой (Бурыгин, 2003) Это свидетельствует о том, что связывание АЗП может происходить не только на поверхности бактериальной клетки, но и на полисахаридной капсуле жгутика Можно предположить, что изменения в типе подвижности на полужидких средах с АЗП и Ж являются следствием в изменении поверхностных компонентов клетки, необходимых, скорее всего, для бактериального контакта при распространении, и/или вследствие снижения скорости вращения жгутика (НагеЬеу, 2003)

Структура полярного и/или латеральных жгутиков могла быть изменена таким способом, что приводила к изменению их вращения или связывания при движении бактерий в полужидких средах, что могло вызвать изменения в наблюдаемой нами картине распространения в полужидкой среде

Таким образом, при анализе изменений подвижности азоспириллы в полужидких средах довольно трудно судить, какая система жгутикования была прежде всего ответственна за изменение поведения А Ьгаягкпзе в присутствии растительных лектинов Связывание АЗП на поверхности клеток может так или иначе влиять на межклеточное взаимодействие, вращение полярного и связывание или вращение латеральных жгутиков Каждое из этих событий могло затронуть скоординированное движение бактериальных клеток по поверхностям и облегчить переход, по крайней мере, части популяции от роения к распространению с образованием микроколоний

Мы сравнили влияние АЗП на подвижность штаммов А Ьгавйете Бр245 и 8р107 (Бе-РоШ ег а/, 1980, ВаИаш е? а!, 1983) Оба штамма выделены из корней пшеницы и, таким образом, могут в природных условиях взаимодействовать с АЗП в ризосфере и ризоплане (Яа1кЬе1 е/ а/, 1984) Для данных штаммов были показаны фактически одинаковые скорости плавания в жидких средах и тип распространения в полужидких средах в присутствии АЗП Влияние АЗП на поведение 8р107 было менее выражено, чем это было в случае 8р245 Эти результаты согласуются с литературными данными (Коннова с соавт, 1992), в которых сообщалось, что аффинность АЗП для поверхностных полисахаридов 8р107 ниже, чем для 8р245

С одной стороны, А Ъгазйете Йр245 является природным симбионтом пшеницы (ВаМат е! а1, 1983) С другой стороны, АЗП экскретируется в окружающую среду и, как было показано ранее, оказывает влияние на аспекты жизнедеятельности азоспириллы, важные для функционирования симбиоза пшеница-азоспирилла (Антонюк, 2005) Полученные результаты показали, что АЗП и другие растительные лектины, относящиеся к группе хитин-связывающих

лектинов (Peumans & Van Damme, 1995), могут влиять на подвижность A brasilense как в жидких, так и в полужидких средах

В настоящей работе впервые обнаружено снижение скорости плавания А brasilense в жидкой культуре в присутствии трех хитин-связывающих растительных лектинов - агглютинина зародышей пшеницы, лектина картофеля и лектина II утесника обыкновенного Также впервые показано изменение типа подвижности А brasilense от роения к распространению с образованием микроколоний в полужидких средах в присутствии агглютинина зародышей пшеницы и лектина из клубней картофеля

При блокировании специфических сайтов связывания АЗП соответствующими GlcNAc-еодержащими гаптенами эффект, вызываемый АЗП, либо значительно снижался, либо полностью ингибировался Таким образом, было показано, что данное изменение в скорости плавания и типе подвижности связано со специфическим взаимодействием АЗП с GlcNAc-еодержащими биополимерами клеточной поверхности азоспирилл

ВЫВОДЫ

1 Изучена чувствительность Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 к Cd2+, Со2+, Cu2+ и Zn2+ Установлено, что оба штамма обладают высокой устойчивостью к Cd2+ (по сравнению с некоторыми ранее изученными эубактериями), достаточно устойчивы к повреждающему действию Zn2+ и менее устойчивы к Со2+ и Си2+

2 Показано, что культивирование A brasilense в присутствии Cd2+ и Си2+ (О 2 мМ) приводит к снижению содержания фитогормона индолил-3-уксусной кислоты в культуральной жидкости В аэробных условиях культивирования снижение концентрации фитогормона происходило лишь за счет уменьшения числа жизнеспособных клеток, тогда как в микроаэробных - за счет снижения удельной продукции индолил-3-уксусной кислоты азоспириллой

3 С использованием спектроскопических подходов изучена реакция А brasilense Sp7 и Sp245 на стресс, индуцированный 0 2 мМ Со2+, Си2+ и Zn2+ в среде роста Впервые для бактерий показано, что при росте эпифитного штамма Sp7 на NHV-содержащей среде с тяжелыми металлами происходит накопление поли-3-гидроксобутирата клетками бактерий Для эндофитного штамма A brasilense Sp245 в аналогичных условиях индукции синтеза поли-3-гидроксобутирата не зарегистрировано

4 Впервые методом эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса (на ядрах 57Со) показаны изменения химического состояния кобальта(Н), происходящие в живых клетках A brasilense Sp245 Обнаружено, что первичная быстрая сорбция кобальта(П) живыми клетками по механизму аналогична химическому взаимодействию катиона с поверхностью мертвых клеток

5 Впервые обнаружено снижение скорости плавания A brasilense в жидкой культуре в присутствии трех хитин-связывающих растительных лектинов - агглютинина зародышей пшеницы, лектина картофеля и лектина II утесника Показано, что в основе данного явления лежит специфическое взаимодействие между данными лектинами и GkNAc-содержащими биополимерами азоспириллы

6 Впервые показано изменение типа подвижности A brasilense от роения к распространению с образованием микроколоний в полужидких средах в присутствии агглютинина зародышей пшеницы и лектина картофеля

Список публикаций автора по теме диссертации

1 Kamnev А А, Antonyuk L Р, Tugarova А V, Tarantihs Р A, Polissiou М G, Gardiner РНЕ Fourier transform infrared spectroscopic charactensation of heavy metal-induced metabolic changes in the plant-associated soiJ ЪяЯептп. Azospmllum brasilense Sp7 //J Mol Struct -2002 - Vol 610, No 13 -P 127-131

2 Tugarova A V, Kamnev A A, Antonyuk LP, Tarantihs P A, Polissiou M G Effects of heavy metals on the plant-associated bactenum Azospmllum brasilense endophytic and non-endophytic strains I! Metal Ions in Biology and Medicine - Vol 7 / L Khassanova, Ph Collery, I Maymard, Z Khassanova, J -C Etienne(Eds) -Pans JohnLibbey Eurotext,2002 -P 237-241

3 Tugarova AV, Kamnev A A, Antonyuk LP, Gardiner PHE, Tarantihs PA, Polissiou MG Accumulation of heavy metals by the soil bactenum Azospmllum brasilense Sp245 and some of its mutant strains // Metal Ions in Biology and Medicine - Vol 8 / M A Cser, I Sziklai Laszlo, i -C Etienne, Y Maymard, J Centeno, L Khassanova, Ph Collery (Eds) - Pans John Libbey Eurotext, 2004 -P 30-33

4 Kamnev A A, Tugarova A V, Antonyuk L P, Tarantilis P A, Polissiou M G, Gardiner PHE Effects of heavy metals on plant-associated rhizobactena companson of endophytic and non-endophytic strains of Azospmllum brasilense IIJ Trace Elem Med Biol -2005 - Vol 19, No 1 -P 91-95

5 Tugarova A V, Kamnev A A, Antonyuk L P Gardiner PHE Azospirillum brasilense resistance to some heavy metals // Metal Ions m Biology and Medicine - Vol 9 / M С Alpoim, P V Morais, M A Santos, A J Cnstovao, J A Centeno, Ph Collery (Eds) - Pans John Libbey Eurotext, 2006 - P 242245

6 Kamnev A A, Tugarova A V, Antonyuk L P, Tarantihs P A, Kulikov L A Perfiliev Yu D, Polissiou M G, Gardiner PHE Instrumental analysis of bactenal cells usmg vibrational and emission Mossbauer spectroscopic techniques//Anal Clum Acta.-2006 - Vol 573-574 -P 445452

7 Schelud'ko A V, Makrushm К V, Tugarova A V Krestmenko VA, Panasenko VI Antonyuk LP, Katsy EI Changes m motility of the rhizobactenum A-ospv ilium brasilense in the presence of plant lectms // Microbiol Res - DOI 10 1016/j nncres 2006 11 008 (Available online 21 February 2007)

8 Камнев A A, Тутарова А В, Антонюк Л П Эндофигный и эпифишый штаммы Azospirillum Ь asilense по-разному отвечают на стресс, вызываемый тяжелыми металлами // Микробиология -2007 -Т 76 №6 - С 908-911

9 Tugarova А V Kamnev А А, Antonyuk L Р, Tarantihs Р А, Polissiou М G Effects of heavy metals on the plant-associated bactenum Azospmllum bi asilense endophytic and non-endophytic strains // Abstr 7"1 Internat Symp 011 Metal ions m Biology and Medicine St -Petersburg, Russia 5-9 May 2002 /Trace Elemaits 111 Medicine (Moscow) -2002 - Vol 3 No 2 -P 65-66

10 Тутарова А В Вчияние ряда тяжелых металлов на метаболизм Azospmllum brasilense спектроскопическое исследование целых клеток // Стратегия взаимодействия микроорганизмов

с окружающей средой Материалы 1-й регион конф мол уч 26-27 марта 2002 г, Саратов Россия - Саратов,2002 -С 54

i 1 Tugarova А V, Sadovmkova Y N, Kamnev А А, Antonyuk L Р, 1 aranülis P A, Polissiou M G Responses of the rhizobactenum Azospmllum bi asílense to nitrogen starvation and to wheat lectin a DRIF Г spectroscopic study //10lh Europ Conf on the Spectroscopy of Biological Molecules, Szeged. Hungary 30 Aug -4Sept 2003/B Szalontai Z Kota(Eds) -Book of Abstracts -P 91

12 Tugarova A V Makarov О E, Antonyuk L P Production of the phytohomione indole-3-acetic acid by izospu ilium brasilense strains Sp7 and Sp245 in the presence of cadmium and copper // Abstr Internat Symp Biochem Interactions of Microorganisms and Plants with Technogemc Environmental Pollutants, July 28-30,2003, Saratov, Russia - Saratov 2003 - P 43

13 Шелудько А В, Тугарова А В, Бурыгин Г Л Крисгиненко В А Панасенко В И, Кацы Е И Моделирование условий, влияющих на способы распространения Azospmllum brasilense по агаризованным средам И Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой Материалы 2-й регион конф мол уч Саратов, 26-28 октября 2004 - Саратов Научная книга, 2004 -С 27

14 Antonyuk LP, Tugarova AV Kamnev A A, Bebmov AA, Bezverkhova NV, Safronova VI Interactions in plant-bacterial symbioses under cadmium stress // Abstr of 8Л Internat Symp on Metal Ions in Biology and Medicine, May 18-22,2004 -Budapest, Hungary, 2004 -P 58

15 Tugarova AV Kamnev A A, Antonyuk LP, Gardiner PHE, Tarantihs PA, Polissiou MG Accumulation of heavy metals by the soil bactenum Azospmllum brasilense Sp245 and some of its mutant strains // Ibid - P 181

16 Tugarova A V, Kamnev A A, Antonyuk L P, Makarov О E, Gardiner PHE The effect of some heavy metals on ÍAA production by Azospmllum brasilense and their accumulation by the bactenum // Abstr Internat Conf "Rhizosphere2004",Sept 12-17,2004,Munich,German} -Munich,2004 -P 124

17 Tugarova A V, Kamnev A A, Antonyuk L P, Gardiner PHE, Tarantihs P A , Polissiou M G Effects of heavy metals on plant-associated rluzobactena // Abstr 2nd Internat Symp on Trace Elements and Minerals in Medicme and Biology Federation of Europ Soc on Trace Elements and Mmerals (FESTEM) May 13-15,2004,Neuhertoerg-Mumch,Germany -Abstr No 85 -P 118-119

18 Тугарова А В , Антонюк JI П, Камнев А А Влияние тяжелых металлов на Azospmllum brasilense накопление металлов в клетках и продукция фитогормона ИУК // Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений фундаментальные и прикладные аспекты Материалы Всерос науч конф, Саратов, 15-17 июня 2005 г - Саратов Научная книга, 2005 - С 28-30

19 Тугарова А В . Антонюк Л П Влияние кадмия и меди на продукцию индолил-3-уксусной кислоты бактериями Azospmllum brasilense // "Биология - наука 21го века Материлы 9-й школы-конф мол уч, 18-22 апреля2005 г , Пущино,Россия -Пущино 2005 -С 215

20 Шелудько А В. Тугарова А В , Кацы Е И , Панасенко В И, Крестиненко В А, Антонюк Л П Участие фитолектинов в регуляции подвижности ризобактерии Azospmllum brasilense //Там же -С 219

21 Т\ гарова А В , Сядовникова Ю Н Шелудько А В , Антонюк Л П Агглютинин зародышей пшеницы как возможный молекулярный сигнал для бактериальных клеток // Рецепция и внутриклеточная сигнализация Материалы конф, 6-9 июля 2005 г - Пушино, 2005 - С 394-396

22 Tugarova А V Sheludko А V, Katsy Е i Panasenko VI, Antonyuk L P Phvtolectms as biologically active substances for rhizobactena of genus Azospn úlum // FEBS J -2005 - Vol 272(Suppl 1) -P 77

23 1 ugarova A V Kamnev A A, Antonyuk L P Azospmllum brasilense resistance to some heavy metals // 9th Internat Symp on Metal Ions m Biology and Medicine, 21-24 May 2006 Lisbon, Portugal -Book of Abstracts - Lisbon 2006 - Abstr No 0-73 -P 113

24 Tugarova A V Smirnova V E, Sadovmkova Yu N, Scheludlco A V Ilchukova A V, El-Registan GI, Antonvuk L P Growth in Azospmllum bi asílense is regulated with high- and iow-molecular-weight signals // Internat Conf Rtosphere 11 Satellite Workshop 'Azospmllum VII and Related PGPR Genomics Molecular Ecology, Plant Responses and Agronomic Significance Aug 30-Sept 01 2007 Montpellier France - Abstr Book.-P 14

Подписано в печать 06 02 2008 Формат 60x84 L/16 Бумага офсетная Гарнитура Times New Roman Печать RISO Объем 1,0 печ л Тираж 100 экз Заказ Jfe 07 Отпечатано с готового оригинал-макета ООО «Интехника» 410028, Саратов, ул Чернышевского, 153, офис 1, тел 22-77-22

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тугарова, Анна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Современные представления о физиологии и экологии азоспирилл.

1.1.1 Продукция индолил-3-уксусной кислоты азоспириллами.

1.1.2 Агглютинин зародышей пшеницы как фактор регуляции метаболизма азоспириллы.

1.1.3 Подвижность Azospirillum и ее роль во взаимодействии с растениями.

1.1.4 Существование и выживание азоспириллы в неблагоприятных условиях.

1.2 Механизмы устойчивости микроорганизмов к тяжелым металлам.

1.3 Использование колебательной спектроскопии для решения микробиологических задач.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объекты исследования и условия культивирования бактерий.6Ь

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.2.2 Масс-спектрометрия.

2.2.3 Колебательная спектроскопия.

2.2.4 Эмиссионная спектроскопия ЯГР.

2.2.5 Определение подвижности азоспириллы на жидких и полужидких средах.

2.2.6 Определение устойчивости азоспирилл к тяжелым металлам.

2.3 Статистическая обработка результатов.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Определение минимальной летальной и минимальной ингибирующей рост концентраций тяжелых металлов для A. brasilense.

3.2 Изучение влияния ионов тяжелых металлов на A. brasilense методами колебательной спектроскопии.

3.3 Изучение взаимодействия ионов кобальта(П) с клетками А. brasilense методом эмиссионной спектроскопии ЯГР.

3.4 Изучение продукции ИУК бактериями A. brasilense Sp245 и Sp7 в присутствии тяжелых металлов.

3.5 Изучение влияния растительных лектинов на подвижность азоспириллы в жидких и полужидких средах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние тяжелых металлов и растительных лектинов на некоторые аспекты метаболизма и поведение Azospirillum brasilense"

Бактерии рода Azospirillum способны образовывать ассоциативные и эндофитные симбиозы с растениями, улучшая питание и рост последних. Благодаря высокой азотфиксирующей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества (Окоп & Vanderleyden, 1997), азоспириллы наряду с псевдомонадами и бациллами, относятся к наиболее исследуемым представителям ростстимулирующих ризобактерий (PGPR — plant-growth-promoting rhizobacteria) (Bashan et al., 2004; Somers et al., 2004).

Считается, что формирование и существование всех симбиозов происходит при непосредственном обмене сигналами между макро- и микропартнером симбиоза. Для ассоциативного симбиоза азоспирилла-пшеница показано, что одним из таких сигналов может служить агглютинин зародышей пшеницы (АЗП), белок экскретируемый в ризосферу корнями пшеницы. Данный лектин относится к группе хитин-связывающих лектинов, т.е. лектинов, которые обладают специфичностью к олигомерам А^-ацетил-p-D-глюкозамина (GlcNAc). К настоящему времени описано более 10 клеточных ответов азоспириллы на АЗП, которые способствуют формированию и функционированию ассоциативного симбиоза (Антонюк, 2005). Установлено, что данный лектин (в концентрациях 10 -10 М) влияет на процессы, важные для формирования и функционирования симбиоза (Антонюк, 2005). В частности, добавление АЗП к культуре Azospirillum brasilense вызывает усиление азотфиксации, стимулирует продукцию фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), положительно влияет на размножение бактерий (Антонюк, Игнатов, 2001; Садовникова с соавт., 2003). Предполагается, что не только АЗП, но и другие растительные лектины влияют на жизнедеятельность ризобактерий (Антонюк, 2005), однако экспериментальных данных по этому вопросу на сегодняшний день почти нет.

Формирование симбиозов в агробиоценозах зачастую происходит в условиях различных антропогенных загрязнений. Среди загрязнителей биосферы, представляющих серьезную угрозу для человека, тяжелые металлы (ТМ) относятся к числу опаснейших (Веницианов с соавт., 2003). Загрязнение почвы соединениями ТМ оказывает неблагоприятное влияние как на эффективность симбиоза в целом, так и на различные аспекты жизнедеятельности макро- и микропартнера в отдельности (Bezverkhova et al., 2002; Belimov et al., 2004). Накопление ТМ в почве снижает видовое разнообразие почвенной микрофлоры, ингибирует многие микробиологические процессы, приводит к повышению содержания этих токсичных элементов в сельскохозяйственной продукции, снижает урожайность и содержание питательных элементов в растениях. В то же время, микроорганизмы могут обладать высокой устойчивостью к ТМ и влиять на мобильность последних в почве посредством изменения рН, продуцирования хелатирующих агентов, биовыщелачивания, биосорбции и биоаккумуляции.

Необходимо отметить способность ассоциативных бактерий защищать растения от различных неблагоприятных факторов окружающей среды (Schutzendubel & Polle, 2002; Abbas & Kamel, 2004; Burd et al., 2000). A. brasilense является природным симбионтом для ряда растений, а также входит в состав бактериальных препаратов, используемых в растениеводстве, поэтому знание механизмов адаптации азоспирилл к стрессу, вызванному ТМ, важно не только для понимания стратегии выживания бактерий в природных условиях, но имеет и важное прикладное значение.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение влияния ионов тяжелых металлов и растительных лектинов на различные аспекты жизнедеятельности азоспириллы. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучение чувствительности A. brasilense к ряду ионов тяжелых металлов: кадмия(П), меди(П), кобальта(П) и цинка(П).

2. Анализ изменений, возникающих в клетках A. brasilense под воздействием тяжелых металлов, с применением методов колебательной спектроскопии.

3. Изучение взаимодействия ионов кобальта(Н) с клетками A. brasilense методом эмиссионной спектроскопии ЯГР.

4. Исследование влияния кадмия(П) и меди(П) на продукцию фитогормона ИУК клетками A. brasilense в различных условиях культивирования.

5. Исследование влияния растительных лектинов на скорость плавания А. brasilense в жидких средах.

6. Изучение влияния растительных лектинов на подвижность A. brasilense в полужидких средах.

Научная новизна работы. Впервые для бактерий показано, что в условиях стресса, обусловленного присутствием ТМ (при отсутствии других видов стресса), происходит накопление поли-3-гидроксобутирата (ПГБ) клетками эпифитного штамма A. brasilense Sp7. Установлено, что штаммы одного вида, A. brasilense, различающиеся по своей локализации в ризосфере, по-разному реагируют на стресс, вызываемый ионами ТМ. Впервые методом эмиссионной спектроскопии ЯГР (с использованием радиоактивного изотопа

Со) показаны изменения химического состояния кобальта(Н), происходящие в живых клетках A. brasilense Sp245. Обнаружено, что первичная быстрая сорбция кобальта(П) живыми клетками по своему механизму аналогична химическому взаимодействию катиона с поверхностью мертвых клеток. Впервые продемонстрировано влияние хитин-связывающих растительных пектинов на скорость плавания (в жидких средах) и тип социальной подвижности (в полужидких средах) A. brasilense.

Научно-практическая значимость. Установлено, что A. brasilense Sp7 и Sp245 обладают относительно высокой устойчивостью к ряду ТМ, что позволяет рекомендовать данные штаммы к использованию для фитостимуляции и совместной с растениями фиторемедиации при загрязнениях почв данными поллютантами. Полученные результаты по влиянию ТМ на продукцию ИУК клетками изученных штаммов A. brasilense могут способствовать выработке стратегии их практического использования в агробиотехнологии. Обнаруженный эффект индукции биосинтеза поли-3-гидроксобутирата штаммом A. brasilense Sp7 в присутствии ряда ТМ может быть полезен для разработки биотехнологических приемов производства данного промышленно ценного биополимера.

Полученные результаты по влиянию хитин-связывающих лектинов на скорость плавания и тип подвижности азоспирилл, в основе которого лежит специфическое взаимодействие между данными лектинами и GlcNAc-содержащими биополимерами азоспириллы, позволяет лучше понять механизмы, лежащие в~ основе возникновения и успешного существования ассоциативных симбиозов, что является практически важным для увеличения эффективности последних.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в рамках тем "Особенности биохимии эндофитных и ассоциативных симбионтов рода Azospirillum" (руководитель - д.б.н. Антонюк Л.П., № гос. регистрации 01200012855) и "Исследование молекулярных механизмов растительно-микробных взаимодействий с использованием спектроскопических подходов" (руководитель - д.х.н. Камнев А.А., № гос. регистрации 01200712166).

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 01-04-48755), ИНТАС (проект № 96-1015), Комиссии РАН по работе с молодежью" (6-й Конкурс-экспертиза проектов, проект № 205),

НАТО (проекты № LST.CLG.977664 и LST.NR.CLG.981092), Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-1529.2003.4 и НШ-6177.2006.4). Часть исследований выполнялась в рамках Соглашений между Российской и Венгерской академиями наук на 2002-2004 гг. и 2005-2007 гг. (Протокол, Тематический план, п. 27; Распоряжение Президиума РАН № 10107-173 от 05.03.2002 г. и Протокол, Тематический план, п. 37, 38; Распоряжение Президиума РАН № 10107-120 от 18.02.2005 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Клетки штаммов Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 обладают

94исключительно высокой устойчивостью к Cd (по сравнению с некоторыми ранее изученными эубактериями), достаточно устойчивы к повреждающему действию Zn2+ и менее устойчивы к Со2+ и Си2+.

2. Культивирование A. brasilense в присутствии Cd" и

Си (0.2 мМ) приводит к снижению содержания фитогормона ИУК в культуральной жидкости. В аэробных условиях культивирования снижение концентрации данного фитогормона происходит лишь за счет уменьшения числа жизнеспособных клеток, тогда как в микроаэробных - за счет снижения удельной продукции индолил-3-уксусной кислоты клетками.

3. При росте эпифитного штамма A. brasilense Sp7 на NH4+-содержащей питательной среде в присутствии тяжелых металлов происходит накопление поли-3-гидроксобутирата клетками. Для эндофитного штамма А. brasilense Sp245 в аналогичных условиях индукции синтеза и накопления поли-3-гидроксобутирата не наблюдается.

4. Хитин-связывающие растительные лектипы вызывают снижение скорости плавания A. brasilense в жидкой культуре и изменение типа подвижности A. brasilense от роения к распространению с образованием микроколоний в полужидких средах.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка публикаций автора

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тугарова, Анна Владимировна

выводы

1. Изучена чувствительность Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 к Cd" , Со2+, Cu2+ и Zn2+. Установлено, что оба штамма обладают высокой устойчивостью к Cd (по сравнению с некоторыми ранее изученными эубактериями), достаточно устойчивы к повреждающему действию Zn2+ и менее устойчивы к Со2+ и Си2+.

2. Показано, что культивирование A. brasilense в присутствии Cd и Си (0.2 мМ) приводит к снижению содержания фитогормона индолил-3-уксусной кислоты в культуральной жидкости. В аэробных условиях культивирования снижение концентрации фитогормона происходило лишь за счет уменьшения числа жизнеспособных клеток, тогда как в микроаэробных - за счет снижения удельной продукции индолил-3-уксусной кислоты азоспириллой.

3. С использованием спектроскопических подходов изучена реакция А.

У 4- ■!brasilense Sp7 и Sp245 на стресс, индуцированный 0.2 мМ Со , Си и

Zn в среде роста. Впервые для бактерий показано, что при росте эпифитного штамма Sp7 на NH^-содержащей среде с тяжелыми металлами происходит накопление поли-3-гидроксобутирата клетками бактерий. Для эндофитного штамма A. brasilense Sp245 в аналогичных условиях индукции синтеза поли-3-гидроксобутирата не зарегистрировано.

4. Впервые методом эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса (на ядрах 57Со) показаны изменения химического состояния кобальта(П), происходящие в живых клетках A. brasilense Sp245. Обнаружено, что первичная быстрая сорбция кобальта(Н) живыми клетками по механизму аналогична химическому взаимодействию катиона с поверхностью мертвых клеток.

5. Впервые обнаружено снижение скорости плавания A. brasilense в жидкой культуре в присутствии трех хитин-связывающих растительных лектинов - агглютинина зародышей пшеницы, лектина картофеля и лектина II утесника. Показано, что в основе данного явления лежит специфическое взаимодействие между данными лектинами и GlcNAc-содержащими биополимерами азоспириллы.

6. Впервые показано изменение типа подвижности A. brasilense от роения к распространению с образованием микроколопий в полужидких средах в присутствии агглютинина зародышей пшеницы и лектина картофеля.

Список публикаций автора по теме диссертации

1. Kamnev А.А., Antonyuk L.P., Tugarova A.V., Tarantilis P.A., Polissiou M.G., Gardiner P.H.E. Fourier transform infrared spectroscopic characterisation of heavy metal-induced metabolic changes in the plant-associated soil bacterium Azospirillum brasilense Sp7 // J. Mol. Struct. -2002.-Vol. 610, No. 1-3.-P. 127-131.

2. Tugarova A.V., Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Effects of heavy metals on the plant-associated bacterium Azospirillum brasilense: endophytic and non-endophytic strains // Metal Ions in Biology and Medicine. - Vol. 7 / L. Khassanova, Ph. Collery, I. Maymard, Z. Khassanova, J.-C. Etienne (Eds.). - Paris: John Libbey Eurotext, 2002. - P. 237-241.

3. Tugarova A.V., Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Gardiner P.H.E., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Accumulation of heavy metals by the soil bacterium Azospirillum brasilense Sp245 and some of its mutant strains // Metal Ions in Biology and Medicine / M.A. Cser, I. Sziklai Laszlo, J.-C. Etienne, Y. Maymard, J. Centeno, L. Khassanova, Ph. Collery (Eds.). — Paris: John Libbey Eurotext, 2004. - Vol. 8. - P. 30-33.

4. Kamnev A.A., Tugarova A.V., Antonyuk L.P., Tarantilis P.A., Polissiou M.G., Gardiner P.H.E. Effects of heavy metals on plant-associated rhizobacteria: comparison of endophytic and non-endophytic strains of Azospirillum brasilense //J. Trace Elem. Med. Biol.-2005.-Vol. 19, No. 1.-P. 91-95.

5. Tugarova A.V., Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Gardiner P.H.E. Azospirillum brasilense resistance to some heavy metals // Metal Ions in Biology and Medicine. - Vol. 9 / M.C. Alpoim, P.V. Morais, M.A. Santos, A.J. Cristovao, J.A. Centeno, Ph. Colleiy (Eds.). - Paris: John Libbey Eurotext, 2006. - P. 242-245.

6. Kamnev A.A., Tugarova A.V., Antonyuk L.P., Tarantilis P.A., Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D., Polissiou M.G., Gardiner P.H.E. Instrumental analysis of bacterial cells using vibrational and emission Mossbauer spectroscopic techniques // Anal. Chim. Acta. - 2006. - Vol. 573-574. - P. 445-452.

7. Schelud'ko A.V., Makrushin K.V., Tugarova A.V., Krestinenko V.A., Panasenko V.I., Antonyuk L.P., Katsy E.I. Changes in motility of the rhizobacterium Azospirillum brasilense in the presence of plant lectins // Microbiol. Res. - DOI: 10.1016/j.micres.2006.11.008 (Available online 21 February 2007).

8. Камнев A.A., Тугарова A.B., Антонкж Л.П. Эндофитный и эпифитный штаммы Azospirillum brasilense по-разному отвечают на стресс, вызываемый тяжелыми металлами // Микробиология. - 2007. - Т. 76, № 6. - С. 908-911.

9. Tugarova A.V., Kamnev А.А., Antonyuk L.P., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Effects of heavy metals on the plant-associated bacterium Azospirillum brasilense: endophytic and non-endophytic strains // Abstr. 7th Intern. Symp. on Metal Ions in Biology and Medicine. St.-Petersburg, Russia, 5-9 May 2002. — Moscow: Trace Elements in Medicine, 2002. - Vol. 3, No 2. - P. 65-66.

10.Тугарова А.В. Влияние ряда тяжелых металлов на метаболизм Azospirillum brasilense: спектроскопическое исследование целых клеток // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой:: Материалы 1-й регион, конф. хмол. уч., 26-27 марта 2002 г., Саратов, Россия. - Саратов, 2002. - С. 54.

11.Tugarova A.V., Sadovnikova Y.N., Kamnev А.А., Antonyuk L.P., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Responses of the rhizobacterium Azospirillum brasilense to nitrogen starvation and to wheat lectin : a DRIFT spectroscopic study // Abstr. 10th Europ. Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules / B. Szalontai, Z. Kota (Eds.) - Szeged, Hungary, 30 Aug. - 4 Sept. 2003. - P. 91.

12.Tugarova A.V., Makarov O.E., Antonyuk L.P. Production of the phytohormone indole-3-acetic acid by Azospirillum brasilense strains Sp7 and Sp245 in the presence of cadmium and copper // Abstr. Intern. Symp. Biochem. Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants, July 28-30, 2003, Saratov, Russia. - Saratov, 2003. -P.43.

13.Шелудько A.B., Тугарова A.B., Бурыгин Г.Л., Кристиненко В.А., Панасенко В.И., Кацы Е.И. Моделирование условий, влияющих на способы распространения Azospirillum brasilense по агаризованным средам // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Материалы 2-й регион, конф. мол. уч., Саратов, 26-28 октября 2004. - Саратов: Научная книга, 2004. - С. 27.

14.Antonyuk L.P., Tugarova A.V., Kamnev А.А., Belimov A.A., Bezverkhova N.V., Safronova. V.I. Interactions in plant-bacterial symbioses under cadmium stress // Abstr. of 8th Internat. Symp. on Metal Ions in Biology and Medicine, May 18-22,2004. - Budapest, Hungary, 2004. - № 0-49. - P. 58.

15.Tugarova A.V., Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Makarov O.E., Gardiner P.H.E. The effect of some heavy metals on IAA production by Azospirillum brasilense and their accumulation by the bacterium // Abstr. Intern. Conf. "Rhizosphere 2004", Sept. 12-17, 2004, Munich, Germany. - Munich, 2004. - P. 124.

16. Tugarova A.V., Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Gardiner P.H.E., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Effects of heavy metals on plant-associated rhizobacteria // Abstr. 2nd Intern. Symp. on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology. Federation of Europ. Soc. on Trace Elements and Minerals (FESTEM), May 1315, 2004, Neuherberg-Munich, Germany. - No. 85. - P. 118-119.

17.Tugarova A.V., Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Gardiner P.H.E., Tarantilis-P.A., Polissiou M.G. Accumulation of heavy metals by the soil bacterium Azospirillum brasilense Sp245 and some of its mutant strains // Abstr. 8th Intern. Symp. on Metal Ions in Biology and Medicine, May 18-22 2004. -Budapest, Hungary, 2004. - P. 181.

18.Тугарова A.B., Антонюк Л.П., Камнев A.A. Влияние тяжелых металлов на Azospirillum brasilense: накопление металлов в клетках и продукция фитогормона ИУК // Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Материалы Всерос. науч. конф., Саратов, 15-17 июня 2005 г. — Саратов: Научная книга, 2005. - С. 28-30.

19.Тугарова А.В., Антонюк Л.П. Влияние кадмия и меди на продукцию инд олил-3-уксусной кислоты бактериями Azospirillum brasilense И

Биология - наука 21го века: Материлы 9-й школы-конф. мол. уч., 18-22 апреля 2005 г., Пущино, Россия. - Пущино, 2005. — С. 215.

20.Шелудько А.В., Тугарова А.В., Кацы Е.И., Панасенко В.И., Крестиненко В.А., Антонюк Л.П. Участие фитолектинов в регуляции подвижности ризобактерии Azospirillum brasilense П Там же. — С. 219.

21.Тугарова А.В., Садовникова Ю.Н., Шелудько А.В., Антонюк Л.П. Агглютинин зародышей пшеницы как возможный молекулярный сигнал для бактериальных клеток // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: Материалы конф., 6-9 июля 2005 г. - Пущино, 2005. - С. 394-396.

22.Tugarova A.V., Sheludko A.V., Katsy E.I., Panasenko V.I., Antonyuk L.P. Phytolectins as biologically active substances for rhizobacteria of genus Azospirillum IIFEBS J. - 2005. - Vol. 272 (Suppl. 1). - P. 77.

23.Tugarova A.V., Kamnev A.A., Antonyuk L.P. Azospirillum brasilense resistance to some heavy metals // 9th Intemat. Symp. on Metal Ions in Biology and Medicine: Book of Abstracts, 21-24 May 2006, Lisbon, Portugal. -Lisbon, 2006. - Abstr. № 0-73. - P. 113.

24.Tugarova A.V., Smirnova V.E., Sadovnikova Yu.N., Schelud'ko A.V., Ilchukova A.V., El-Registan G.I., Antonyuk L.P. Growth in Azospirillum brasilense is regulated with high- and low-molecular-weight signals // Internat. Conf. "Rhizosphere II" Satellite Workshop "Azospirillum VII and Related PGPR: Genomics, Molecular Ecology, Plant Responses and Agronomic Significance", Aug. 30 - Sept. 01, 2007, Montpellier, France. - Abstr. Book. - P. 14.

Благодарности

Автор приносит глубокую благодарность своим научным руководителям — д.б.н. Л.П. Антонюк и д.х.н. А.А. Камневу за постоянную поддержку, внимание, ценные советы, консультации и помощь в проведении экспериментальных измерений, обсуждении полученных результатов и оформлении результатов работы. Отдельную признательность хочется выразить с.н.с. лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН к.б.н. А.В. Шелудько за плодотворное сотрудничество и помощь при проведении экспериментов по изучению подвижности азоспириллы, а также при подготовке данной работы. Автор признателен с.н.с. лаборатории структурных методов исследования к.х.н. О.Е. Макарову за помощь при проведении экспериментов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Автор также благодарит сотрудников лаборатории биохимии ИБФРМ РАН за помощь в проведении экспериментов, доброжелательность и поддержку.

Чувство особой признательности за помощь хочется выразить коллегам из других городов, при непосредственном участии которых выполнялись спектроскопические исследования и обсуждение полученных результатов: проф. д.х.н. Ю.Д. Перфильеву и доценту к.х.н. Л.А. Куликову (лаборатория ядерно-химических методов МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва); проф. М.Г. Полиссиу (M.G. Polissiou) и проф. П.А. Тарантилису (Р.А. Tarantilis) из Аграрного университета г. Афины, Греция (Agricultural University of Athens, Greece); д-ру Ф. Гардинеру из Университета Шеффилд Хэллам, г. Шеффилд, Великобритания (Р.Н.Е. Gardiner, Sheffield Hallam University, U.K.). Также хочется выразить благодарность за советы и помощь при выполнении данной работы к.б.н. А.А. Белимову (лаборатория микробиологического мониторинга и биоремедиации почв ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, Пушкин, Санкт-Петербург). Автор признателен за ценные обсуждения, поддержку и гостеприимство академику Венгерской АН, проф. А. Вертешу (A. Vertes) и проф. Э. Кузманну (Е. Kuzmann) из лаборатории ядерной химии университета им. Л. Этвеша, Будапешт, Венгрия (Laboratory of Nuclear Chemistry, Eotvos University, Budapest), а также проф. Б. Биро из лаборатории ризобиологии Института почвоведения и агрохимии Венгерской АН, Будапешт, Венгрия, (В. Biro, Laboratory of Rhizobiology, Research Institute for Soil Science and Agricultural Chemistry, Hungarian Academy of Sciences, Budapest).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему времени загрязнения почв различными поллютантами, в том числе и соединениями ТМ, широко распространены. Это способно снижать как эффективность симбиоза в целом, так и влиять на жизнедеятельность макро- и микропартнера в отдельности. В то же время, микроорганизмы могут обладать высокой устойчивостью к ТМ и, как известно, способны защищать растения от различных неблагоприятных факторов окружающей среды (Schutzendubel & Polle, 2002; Abbas & Kamel, 2004; Burd et al, 2000).

A. brasilense является природным симбионтом для ряда растений, а также входит в состав бактериальных препаратов, используемых в растениеводстве. В связи с этим знание адаптации азоспирилл к стрессу, вызванному соединениями ТМ, важно не только для понимания стратегии выживания бактерий в природных условиях, но имеет и прикладное значение. Эффективное' функционирование растительно-бактериальных симбиозов в загрязненных почвах (в частности, в присутствии ТМ) важно не только с точки зрения сельскохозяйственной биотехнологии (улучшение роста культурных растений и снижение переноса ТМ в надземную часть растений), но и для более эффективной фиторемедиации, в которой, как показано в последние годы (см., например, обзоры Kamnev, 2003; Khan, 2005), почвенные микроорганизмы играют важную роль.

В ходе исследований нами было обнаружено, что азоспириллы обладают достаточно высокой устойчивостью к ТМ по сравнению с другими эубактериями. Так, было показано, что устойчивость азоспириллы к кадмию(Н) сравнима с устойчивостью бактерий, выделенных из загрязненных тяжелыми металлами областей - R. metallidurans и Bacillus sp. (Yilmaz, 2003; Diels & Mergeay, 1990). При анализе имеющейся в литературе информации для различных PRPR (Белимов с соавт., 2004; Belimov et al., 2004) было выяснено, что штаммы A. brasilense Sp245 и Sp7 обладают сравнительно высокой устойчивостью к меди(П), а по отношению к кадмию и цинку - максимальной, насколько нам известно, устойчивостью по сравнению с ранее изученными ризобактериями.

Вывод о высокой устойчивости азоспириллы к действию ТМ в сочетании с ее хорошо известной способностью стимулировать рост растений за счет способности продуцировать фитогормоны и высокой азотфиксирующей активности (Окоп & Vanderleyden, 1997) делают перспективным ее использование в биоремедиации и фиторемедиации почв, загрязненных ТМ.

Дальнейшее исследование было посвящено более детальному изучению воздействия ТМ на азоспириллу. Для оценки общего влияния ТМ на азоспириллу были использованы такие методы исследования, как ИК-спектроскопия и спектроскопия КР. Данные методы, приборная база которых интенсивно развивалась за последние десятилетия, все чаще используются для решения различных задач в микробиологии во всем мире (Naumann, 2000; 2001; Jiang et al., 2004), однако в нашей стране они используются в гораздо меньшей степени, чем могли бы. Это связано как с отсутствием необходимой материальной базы, так и с недостаточной информацией о возможностях и особенностях использования, методов колебательной спектроскопии в микробиологии. В настоящей работе данные методы были использованы для детектирования изменений, возникающих в клетках азоспириллы под воздействием 0.2 мМ Со2+, Си2+ и Zn2+.

Было показано, что при росте эпифитного штамма Sp7 на среде с тяжелыми металлами (в отсутствие иных видов стресса, в том числе питательного) происходит накопление ПГБ клетками бактерий. Хорошо известно, что при неблагоприятных условиях окружающей среды синтез ПГА является защитной реакцией микроорганизмов и повышает их выживаемость (Olcon & Itzigsohn, 1992). Важно отметить, что синтез и накопление ПГБ при стрессе, вызванном лишь присутствием ТМ, показан для бактерий впервые. Одновременно было обнаружено, что штамм, отличающийся от Sp7 по занимаемой им экологической нише и способный к внутрикорневой колонизации, A. brasilense Sp245, не обнаруживает накопления ПГБ в данных условиях. Эти различия двух штаммов одного вида, очевидно, отражают их различные адаптационные возможности.

Плодотворным оказалось использование в данной работе для решения чисто микробиологических задач такого исключительно редко применяемого в биологии радиохимического метода, как эмиссионная спектроскопия ЯГР (Kamnev, 2005; Perfiliev & Kamnev, 2007). На примере катиона кобальта(И), с использованием радионуклида э7Со, применение этого метода позволило сделать вывод об изменении химического состояния данного катиона в живых клетках в течение часа. При этом было показано, что первичная быстрая сорбция кобальта(И) живыми клетками по своему механизму аналогична химическому взаимодействию катиона с поверхностью мертвых клеток. .Данный вывод вполне логично объясняет первую (быструю) стадию взаимодействия катиона металла с различными функциональными группами биополимеров клеточной поверхности бактерий (Jiang et al., 2004) - как живых клеток, так и мертвой биомассы.

Информация о влиянии ТМ на продукцию ИУК важна для лучшего понимания функционирования ассоциативных симбиозов в условиях загрязнения данными поллютантами. При этом необходимо отметить, что ранее в литературе упоминалось об увеличении синтеза ИУК клетками при неблагоприятных условиях вообще (Spaepen et al, 2007) и в присутствии ТМ, в частности (Пищик с соавт., 2005). Наши исследования показали, что это не всегда справедливо, и синтез ИУК зависит не только от присутствия ТМ, но и от условий, при которых ТМ воздействуют на клетки. Было найдено, что культивирование A. brasilense в присутствии Cd" и Си" (0.2 мМ) приводит к снижению содержания фитогормона ИУК в культуральной жидкости. Однако в аэробных условиях культивирования уменьшение количества ИУК происходило за счет уменьшения числа жизнеспособных клеток, при одновременном увеличении ими синтеза ИУК в случае меди и без изменения в синтезе — в случае кадмия, тогда как в микроаэробных условиях — за счет реального снижения синтеза ИУК культурой.

Вторая часть работы была посвящена изучению влияния АЗП и других растительных лектинов на подвижность азоспириллы. С одной стороны, А. brasilense Sp245 является природным симбионтом пшеницы (Baldani et al., 1983), с другой стороны, АЗП экскретируется в окружающую среду и, как было показано ранее, оказывает влияние на различные аспекты жизнедеятельности азоспириллы, важные для функционирования симбиоза пшеница-азоспирилла (Антонюк, 2005). В настоящей работе впервые обнаружено снижение скорости плавания A. brasilense в жидкой культуре в присутствии трех хитин-связывающих растительных лектинов - агглютинина зародышей пшеницы, лектина картофеля и лектина из Ulex europaeus (II). Также впервые показано изменение типа подвижности A. brasilense от роения к распространению с образованием микроколоний в полужидких средах в присутствии агглютинина зародышей пшеницы и лектина картофеля.

При блокировании специфических сайтов связывания АЗП соответствующими GlcNAc-содержащими гаптенами эффект, вызываемый АЗП, либо значительно снижался, либо полностью ингибировался. Таким образом^, было показано, что данное изменение в скорости плавания и типе подвижности связано со специфическим взаимодействием АЗП с GlcNAc-еодержащими, биополимерами клеточной поверхности азоспирилл. Проведенное нами исследование свидетельствует о том, что растение может влиять на поведение своего микросимбионта, изменяя подвижность бактерии в жидких и полужидких средах. Это влияние осуществляется через лектины — белки, входящие в состав корневых выделений, и в условиях симбиоза вступающие в непосредственный контакт с бактериями, колонизирующими поверхность корня.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тугарова, Анна Владимировна, Саратов

1. Антонюк Л.П. Растительные лектины как факторы коммуникации в симбиозах // Молекулярные основы взаимодействия ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред. В.В. Игнатова — М.: Наука, 2005. С. 118-159.

2. Антонюк Л.П. Регуляция метаболизма Azospirillum brasilense Sp245: особенности азотного обмена и влияние лектина пшеницы (агглютинина зародышей пшеницы): дис. . д-ра биол. наук. Москва, 2002. - 374 с.

3. Антонюк Л.П., Евсеева Н.В. Лектин пшеницы как фактор растительно-микробной коммуникации и белок стрессового ответа // Микробиология. 2006. - Т. 75, № 4. - С. 544-549.

4. Антонюк Л.П., Игнатов В.В. О роли агглютинина зародышей пшеницы в растительно-бактериальном взаимодействии: гипотеза и экспериментальные данные в ее поддержку // Физиол. раст. 2001. - Т. 48, № 3. -С. 427-433.

5. Баканчикова Т.И., Мякиньков Ф.Г., Павлова-Иванова Л.К., Майсурян А.П. Участие генов хемотаксиса в установлении ассоциативных взаимоотношений между Azospirillum brasilense и пшеницей // Мол. ген. микробиол. вирусол. 1989. - № 4. - С. 24-32.

6. Белимов А.А. Эффективность инокуляции ячменя смешанными культурами диазотрофов: дис. кан. биол. наук. Л.: ВНИИСХМ, 1990. - 190 с.

7. Белимов А.А., Кунакова A.M., Груздева Е.В. Влияние рН почвы на взаимодействие ассоциативных бактерий с ячменем // Микробиология. -1998. Т. 67, № 4. - С. 561-568.

8. Белимов А.А., Кунакова A.M., Сафронова В.И., Степанок В.В., Юдкин Л.Ю., Алексеев Ю.В., Кожемяков А.П. Использование ассоциативных бактерий для инокуляции ячменя в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием//Там же. 2004. - Т. 73, № 1.-С. 118-125.

9. Белимов А.А., Поставская С.М., Хамова О.Ф., Кожемяков А.П., Кунакова A.M., Груздева Е.В. Приживаемость и эффективность корневых диазотрофов при инокуляции ячменя в зависимости от температуры и влажности почвы //Там же. 1994. - Т. 63, № 5. - С. 900-908.

10. Болдырев А.А. Ыа/К-АТФаза — свойства и биологическая роль // Сорос. Образоват. Журн. 1998. - № 4. - С. 2-9.

11. Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем // Там же. 1998. - № 5. - С. 23-29.

12. Бурыгин Г.Л. Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum: автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2003. —22 с.

13. Веницианов Е.В., Виниченко В.Н., Гусева Т.В., Дайман С.Д., Заика Е.А., Молчанова Я. П., Сурнин В.А., Хотулева М.В. Экологический мониторинг: шаг за шагом / Под ред. Е.А. Заика. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2003. - 252 с.

14. Волошин С. А., Капрельянц А.С. Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях // Биохим. 2004. - Т. 69. - С. 1555-1564.

15. Гармаш Н.У., Булавко Г.И., Наплекова Н.Н., Гармаш Г.А. Роль микроорганизмов и растений в детоксикации свинца // Агрохимические исследования в Сибири. — Красноярск: Изд-во Сиб. отд. леса и древесины, 1984.-С. 126-130.

16. Головачева Р.С., Жилина Н.В. Жгутиковый аппарат археобактерий рода Sulfurococcus II Микробиология. 1988. - Т. 57. - С. 516-518.

17. Дорошенко Е.В., Булыгина Е.С., Спиридонова Е.М., Турова Т.П., Кравченко И.К. Выделение и характеристика азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum из почвы сфагнового болота // Микробиология. 2007. - Т. 76, № 1.-С. 107-115.

18. Завальский A.M. Влияние вязкости на движение и хемотаксис бактерий // Биофиз. 1986. - Т. 31. - С. 83-85.

19. Зеленин К.Н. Что такое химическая экотоксикология // Сорос. Образоват. Журн. 2000. - № 6. - С. 32-36.

20. Иванов В.Т., Готтих Б.П. Нерасторжимое единство биологии, химии и физики // Вест. РАН. 1999.-Т. 69, № 5. - С. 410-417.

21. Иванова Е.П., Горшкова Н.М., Куриленко В.В. Толерантность к солям тяжелых металлов морских протеобактерий родов Pseudoalteromonas и Alteromonas II Микробиология. 2001. - Т. 70, № 2. - С. 283-285.

22. Иосипенко О.А., Стадник Г.И., Игнатов В.В. Лектины корней проростков пшеницы в процессе взаимодействия растения с ассоциативными микроорганизмами рода Azospirillum II Там же. 1996. - Т. 32, № 4. - С. 458-461.

23. Кацы Е.И. Генетико-биохимические и экологические аспекты подвижности и хемотаксиса у фитопатогенных, симбиотических и ассоциированных с растениями бактерий // Успехи сов. биол. 1996. - Т. 116. - С. 579-593.

24. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями / Под ред. В.В. Игнатова. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. - 172 с.

25. Кацы Е.И. Участие ауксинов в регуляции экспрессии генов бактерий и растений // Генетика. 1997. - Т. 33, № 5. - С. 565-576.

26. Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько А.В. Влияние интеграции вектора pJFF350 в 85-МДа плазмиду Azospirillum brasilense Sp245 на жгутикование и подвижность бактерий // Генетика. 2002. - Т. 37, № 2. - С. 183-189.

27. Коннова С.А. Изучение продуцируемых бактериями Azospirillum brasilense внеклеточных углеводсодержащих комплексов и полисахаридов, входящих в их состав: дис. . кан. биол. наук. Саратов, 1993. — 191 с.

28. Коннова С.А., Макаров О.Е., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Экзополисахариды бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Spl07 // Микробиол. журн. -1992. Т. 54.-С. 31-42.

29. Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Макаров О.Е., Игнатов В.В. Исследование влияния условий выращивания бактерий Azospirillum brasilense на состав их внеклеточных полисахаридсодержащих материалов // Изв. РАН Сер. Биол. 2003. - № 4. - С. 430-437.

30. Лебедев B.C., Володина Л.А., Дейнега Е.Ю., Федоров Ю.И. Структурные изменения поверхности бактерий Escherichia coli и медь индуцированная проницаемость плазматической мембраны // Биофиз. -2005.-Т. 50, №1. С. 107-113.

31. Мёссбауэровская спектроскопия замороженных растворов / Под ред. А. Вертеша, Д. Надя. Пер. с англ. под ред. Ю.Д. Перфильева. - М.: Мир, 1998.-С. 271-293.

32. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов / Под ред. Зигель X., Зигель А.-М.: Мир, 1993.-368 с.

33. Никитина В.Е., Аленысина С.А., Итальянская Ю.В., Пономарева Е.Г. Очистка и сравнение лектинов с клеточной поверхности активных и неактивных по гемагглютинации азоспирилл // Биохим. 1994. - Т. 59., № 5. - С. 656-662.

34. Никитина В.Е., Галкин М.А., Котусов В.В., Крапивина Л.И., Игнатов В.В. Влияние лектина пшеницы на азотфиксирующую активность Azospirillum brasilense // Прикл. биохим. микробиол. 1987. - Т. 23, № 3. - С. 389-392.

35. Пищик В.Н., Воробьев Н.И., Проворов Н.А. Экспериментальное и математическое моделирование популяционной динамики ризосферных бактерий в условиях кадмиевого стресса // Микробиология. -2005. Т. 74., № 6. - С. 845-851.

36. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. -М.: Изд-во Моск. ун-та, 1983.-С. 115-116.

37. Садовникова Ю.Н., Беспалова JI.A., Антонюк Л.П. Агглютинин зародышей пшеницы является фактором роста для бактерии Azospirillum brasilense II Докл. АН СССР. 2003. - Т. 389, № 4. - С. 544-546.

38. Сенцова О.Ю., Максимов В.Н. Действие тяжелых металлов на микроорганизмы // Успехи микробиол. 1985. - Т. 20. - С. 227-252.

39. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986. — 136 с.

40. Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Чердынцева Т.А., Нетрусов А.И. Гормоны и гормоноподобные соединения микроорганизмов // Прикл. биохим. микробиол. 2006. - Т. 42., № 3. - С. 261-268.

41. Шелудько А.В., Борисов И.В., Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Кацы Е.И. Влияние конго красного на подвижность бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 2006. - Т. 75, № 1. - С. 62-69.

42. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на клетке полярного пучка пилей и поведение бактерий Azospirillum brasilense в полужидком агаре // Там же.-2001.-Т. 70, № 5.-С. 662-667.

43. Экологический энциклопедический словарь / Под ред. А.С. Монина. М.: Ноосфера, 2002. - С. 683-684.

44. Abbas S.M., Kamel Е.А. Rhizobium as a biological agent for preventing heavy metal stress // Asian J. Plant Sci. 2004. - Vol. 3, No. 4. - P. 416-424.

45. Adler J. Chemotaxis in bacteria // Annu. Rev. Biochem. 1975. - Vol. 44. - P. 341-356.

46. Agarwala-Dutt R., Tilak K.V.B.R., Rana J.P.S. Isolation of Azospirillum from interior of various parts of some graminaceous plants // Z. Microbiol. 1991. -Vol. 146.-P. 217-219.

47. Aiking H., Кок К., Heerikhuizen H.V., Van't RJ. Adaptation to cadmium by Klebsiella aerogenes growing in continous culture proceeds mainly via formation of cadmium sulfide // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - Vol. 44. - P. 938-944.

48. Anderson A.J., Dawes E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates // Microbiol. Rev. 1990. - Vol. 54.-P. 450-472.

49. Baca B.E., Soto-Urzua L., Xochihua-Corona Y.G., Cuervo-Garcia A. Characterization of two aromatic amino acid aminotransferases and production of indoleacetic acid in Azospirillum strains // Soil. Biol. Biochem. 1994. - Vol. 26. - P. 57-63.

50. Baena J.R., Lendl B. Raman spectroscopy in chemical bioanalysis // Curr. Opin. Chem. Biol. 2004. - Vol. 8. - P. 534-539.

51. Bai W., Zhao K., Asami K. Effects of copper on dielectric properties of E. coli cells // Coll. Surf. B: Biointerfaces. 2007. -Vol. 58, No. 2. - P. 105-115.

52. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effect of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. -Vol. 29. - P. 924-929.

53. Barbieri P., Zanelli Т., Galli E., Zanetti G. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1986. - Vol. 36. - P. 87-90.

54. Barkay Т., Miller S.M., Summers A.O. Bacterial mercury resistance from atoms to ecosystems // FEMS Microbiol. Rev. 2003. - Vol. 27, No. 2-3. - P. 355-384.

55. Bashan Y. Interactions of Azospirillum spp. in soil: a review // Biol. Fertil. Soils. — 1999.-Vol. 29.-P. 246-256.

56. Bashan Y. Migration of the rhizosphere bacteria Azospirillum brasilense and Pseudomonas fluorescence towards wheat roots in the soil // J. Gen. Microbiol. 1986.-Vol. 132.-P. 3407-3414.

57. Bashan Y., Hogluin G., De-Bashan L.E. Azospirillum plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997— 2003)//Can. J. Microbiol.-2004.-Vol. 50, No. 8.-P. 521-577.

58. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum — plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. 1997. - Vol. 43. - P. 103-121.

59. Bashan Y., Levanony H. Current status of Azospirillum inoculation "technology: *a Azospirillum as a challenge for agriculture // Can. J. Microbiol. 1990. - Vol. 36.-P. 591-608.

60. Bashan Y., Levanony H. Horizontal and vertical movement of Azospirillum brasilense Cd in the soil and along the rhizosphere of wheat and weeds in controlled and field environments // J. Gen. Microbiol. 1987. - Vol. 133. - P. 3473-3480.

61. Bastarrachea F., Zamudio M., Rivas R. Non-encapsulated mutants of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum // Can. J. Microbiol. 1988. - Vol. 34-P. 24-29.

62. Beveridge T.J., Murray G.E. Uptake and retention of metals by cell walls of Bacillus subtilis II J. Bacteriol. 1976. - Vol. 127.-P. 1502-1518.

63. Bianco C., Imperlini E., Calogero R., Senatore В., Amoresano A., Carpentieri A., Pucci P., Defez R. Indole-3-acetic acid improves Escherichia coifs defences to stress 11 Arch. Microbiol. 2006a. - Vol. 185. - P. 373-382.

64. Bianco C., Imperlini E., Calogero R., Senatore В., Pucci P., Defez R. Indole-3-acetic acid regulates the central metabolic pathways in Escherichia coli И Microbiol. -20066.-Vol. 152.-P. 2421-2431.

65. Bloss Т., Clemens S., Nies D.H. Characterisation of the ZATlp zinc transporter from Arabidopsis thaliana in microbial model organisms and reconstituted proteoliposomes // Planta. 2002. - Vol. 214. - P. 783-791.

66. Broer S., Ji G., Broer A., Silver S. Arsenic efflux governed by the arsenic resistance determinant of Staphylococcus aureus plasmid pi 258 // J. Bacteriol. 1993. -Vol. 175, No. 11. - P. 3480-3485.

67. Bruins M.R., Kapil S., Oehme F.W. Microbial resistance to metals in the environment // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2000. - Vol. 45. - P. 198-207.

68. Burd G.I., Dixon D.G., Glick B.R. Plant growth-promoting bacteria that decrease heavy metal toxicity in plants // Can. J. Microbiol. 2000. - Vol. 46. - P. 237-245.

69. Canovas D., Cases I., de Lorenzo V. Heavy metal tolerance and metal homeostasis in Pseudomonas putida as revealed by complete genome analysis // Environ. Microbiol.-2003.-Vol. 5, No. 12.-P. 1242-1256.

70. Carey P.R. Raman spectroscopy, the sleeping giant in structural biology, awakes // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, No. 38. - P. 26625-26628.

71. Carreno-Lopez R., Campos-Reales N., Elmerich C., Baca B.E. Physiological evidence for differently regulated tryptophan-dependent pathways for indole-3-acetic acid synthesis in Azospirillum brasilense II Mol. Gen. Genet. — 2000. -Vol. 264.-P. 521-30.

72. Cavet J.S., Borrelly G.P.M., Robinson N.J. Zn, Cu and Co in cyanobacteria: selective control of metal availability // FEMS Microbiol. Rev. 2003. -Vol. 27.-P. 165-181.

73. Christofi N., Ivshina I.B. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation // J. Appl. Microbiol. -2002. Vol. 93, No. 6. - P. 915-929.

74. Cooke T.J., Poli D.B., Sztein A.E., Cohen J.D. Evolutionary patterns in auxin action // Plant Mol. Biol. 2002. - Vol. 49, No. 3-4. - P. 319-338.

75. Costacurta A., Keijers V., Vanderleyden J. Molecular cloning and sequence analysis of an Azospirillum brasilense indole-3-pyruvate decarboxylase gene // Mol. Gen. Genet. 1994. - Vol. 243. - P. 463-472.

76. Costacurta A., Vanderleyden J. Synthesis of phytohormones by plant-associated bacteria // Crit. Rev. Microbiol. 1995. - Vol. 21. - P. 1-18.

77. Croes C., Moens S., Van Basterlaere E., Vanderleyden J., Michiels K. The polar flagellum mediates Azospirillum brasilense adsorption to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1993.-Vol. 139.-P. 960-967.

78. Dawes E.A., Senior P.J. The role and regulation of energy reserve polymers in microorganisms // Adv. Microb. Physiol. 1973. - Vol. 10. - P. 135-266.

79. Del Gallo M., Negi M., Neyra C.A. Calcofluor- and lectin-binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum И J. Bacterid. 1989. -Vol. 171, No. 6.-P. 3504-3510.

80. De-Polli H., Bohlool B.B., Dobereiner J. Serological differentiation of Azospirillum species belonging to different host-plant specificity groups // Arch. Microbiol. 1980.-Vol. 126.-P. 217-222.

81. Dobereiner J., Pedrosa F.O. Nitrogen-fixing bacteria in non leguminous crop plants.

82. Berlin; Heidelberg; N.Y.: Springer Verlag, 1987. 155 pp. Duffus J.H. "Heavy metals" - a meaningless term? // Pure Appl. Chem. - 2002.

83. Fan В., Rosen B.P. Biochemical characterization of CopA, the Escherichia coli Cu(I)-translocating P-type ATPase // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. -P. 46987-46992.

84. Faure D., Desair J., Keijers V., Bekri M.A., Proost P., Henrissat В., Vanderleyden J. Growth of Azospirillum irakense KBC1 on the aryl P-glucoside salicin requires either salA orsalBHi. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, No. 10.-P. 3003-3009.

85. Filip Z., Herrmann S., Kubat J. FT-IR spectroscopic characteristics of differently cultivated Bacillus subtilis II Microbiol. Res. 2004. - Vol. 159. - P. 257-262.

86. Frankenberger W.T. Arshad M. Phytohormones in soils. Microbial production and function. -N.Y.: Marcel Dekker, 1995. 520 pp.

87. Glick B.R. Phytoremediation: synergistic use of plants and bacteria to clean up the environment // Biotechnol. Adv. 2003. - Vol. 21. -P. 383-393.

88. Glick B.R. The enhancement of plant growth by free-living bacteria // Can. J. Microbiol. 1995.-Vol. 41.-P. 109-117.

89. Griffiths P.R., de Haseth J.A. Fourier Transform Infrared Spectrometry. N.Y.: Wiley-Interscience, 1986. -672 pp.

90. Grube M., Gapes J.R., Schuster K.C. Application of quantitative IR spectral analysis of bacterial cells to acetone-butanol-ethanol fermentation monitoring // Anal. Chim. Acta. -2002. Vol. 471. - P. 127-133.

91. Guffanti A.A., Wei Y., Rood S.V., Krulwich T.A. An antiport mechanism for a member of the cation diffusion facilitator family: divalent cations efflux in exchange for K+andH+//Microbiol. Mol. -2002. Vol. 45.-P. 145-153.

92. Gutnick D.L., Bach H. Engineering bacterial biopolymers for the biosorption of heavy metals; new products and novel formulation // Appl. Microbiol. Biotechnol.-2000.-Vol. 54.-P. 451-460.

93. Hammar M., Arnqvist A., Bian Z., Olsen A., Normark S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12 // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 18, No. 4. P. 661-670.

94. Harshey R.M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal // Annu. Rev. Microbiol. 2003. - Vol. 57. - P. 249-273.

95. Hartmann A., Singh M., Klingmuller W. Isolation and characterization of Azospirillum mutants excreting high amounts of indole acetic acid // Can. J. Microbiol. 1983.-Vol. 29.-P. 916-923.

96. Helm D., Labischinski H., Schallehn G., Naumann D. Classification and identification of bacteria by Fourier-transform infrared spectroscopy // J. Gen. Microbiol. 1991.-Vol. 137.-P. 69-79.

97. Helm D., Naumann D. Identification of some bacterial cell components by FT-IR spectroscopy // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - Vol. 126. - P. 75-80.

98. Hong K., Sun S., Tian W., Chen G.Q., Huang W. A rapid method for detecting bacterial polyhydroxyalkanoates in intact cells by Fourier transform infrared spectroscopy // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 51, No. 4. - P. 523-526.

99. James E.K. Nitrogen fixation in endophytic and associative symbioses // Field Crops Res. 2000. - Vol. 65. - P. 197-209.

100. Ji G., Silver S. Bacterial resistance mechanism for heavy metals of environmental concern//J. Ind. Microbiol. 1995. - Vol. 14.-P. 61-75.

101. Jiang W., Saxena A., Song В., Ward B.B., Beveridge T.J., Myneni S.C.B. Elucidation of functional groups on Gram-positive and Gram-negative bacterial surfaces using infrared spectroscopy // Langmuir. 2004. - Vol. 20, No. 26. - P. 11433-11442.

102. Jiang Z.-Y., Rushing B.G., Bai Y., Gest H., Bauer C.E. Isolation of Rhodospirillum centenum mutants defective in phototactic colony motility by transposon mutagenesis//J. Bacteriol. 1998,-Vol. 180-P. 1248-1255.

103. Kachur A.V., Koch C.J., Biaglow J.E. Mechanism of copper-catalyzed oxidation of glutathione // Free Radical. Res. 1998. - Vol. 28. - P. 259-269.

104. Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y. Involvement of the reserve material poly-(3-hydroxybutyrate in Azospirillum brasilense stress endurance and root colonization // Appl. Environ. Microbiol. 2003a. - Vol. 69, No. 6. - P. 3244-3250.

105. Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y. Poly beta-hydroxybutyrate depolymerase (PhaZ) in Azospirillum brasilense and characterization of a phaZ mutant // Arch. Microbiol. 20036. - Vol. 180. - P. 309-318.

106. Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y., Castro-Sowinski S. Ecological and agricultural significance of bacterial polyhydroxyalkanoates // Crit. Rev. Microbiol. -2005.-Vol. 31.-P. 55-67.• • • • «7

107. Kamnev A.A. Application of emission ( Co) Mossbauer spectroscopy in bioscience //J. Mol. Struct.-2005.-Vol. 744-747.-P. 161-167.

108. Kamnev A.A. Phytoremediation of heavy metals: an overview // Recent Advances in Marine Biotechnology / M. Fingerman, R. Nagabhushanam (Eds.). Enfield (NH), USA: Science Publishers, 2003.-Vol. 8.-P. 269-317.

109. Kamnev A.A., Ristic M., Antonyuk L.P., Chernyshev A.V., Ignatov V.V. Fourier transform infrared spectroscopic study of intact cells of the nitrogen-fixing bacterium Azospirillum brasilense II J. Mol. Struct. 19976. - Vol. 408-409.-P. 201-205.

110. Kapulnik Y., Olcon Y., Henis Y. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation // Can. J. Microbiol. 1985. - Vol. 31. - P. 881-887.

111. Karpati E., Kiss P., Ponyi Т., Fendrik I., de Zamaroczy M., Orosz L. Interaction of Azospirillum lipoferum with wheat germ agglutinin stimulates nitrogen fixation // J. Bacterid.- 1999.-Vol. 181,No. 13. P. 3949-3955.

112. Kenner B.A., Riddle J.W., Rockwood S.W., Bordner R.H. Bacterial identification by infrared spectrophotometry // J. Bacteriol. 1958. - Vol. 75. - P. 16-20.

113. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A.D., Keiser P. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rise roots and rhizosphere soil // Res. Microbiol. 1989. - Vol. 140, No. 9. - P. 679-693.

114. Khan A.G. Role of soil microbes in the rhizospheres of plants growing on trace metal contaminated soils in phytoremediation // J. Trace Elem. Med. Biol. 2005. -Vol. 18, No. 4.-P. 355-364.

115. Kim Y.B., Lenz R.W. Polyesters from microorganisms // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. -2001. -Vol. 71.-P. 51-79.

116. Kirchhof G., Schloter M., Assmus В., Hartmann A. Molecular microbial ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes // Soil Biol. Biochem. 1997. - Vol. 29. - P. 853-862.

117. Kominek L.A., Halvorson H.O. Metabolism of poly-betahydroxybutyrate and acetoin in Bacillus cereus II J. Bacteriol. 1965. - Vol. 90. - P. 1251-1259.

118. Kuiper I., Lagendijk E.L., Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J. Rhizoremediation: a beneficial plant-microbe interaction // Mol. Plant-Microbe Interact. 2004. -Vol. 17, No. l.-P. 6-15.

119. Kundu B.S., Sangwan P., Sharma P.K., Nandwal A.S. Response of pearl millet to phytohormones produced by Azospirillum brasilense II Indian J. Plant Physiol. 1997. - Vol. 2. - P. 101-104.

120. Magalhaes F.M., Baldani J.I., Souto S.M., Kuykendall J.R., Dobereiner J. A new acid-tolerant Azospirillum species // An. Acad. Bras. Cienc. 1983. -Vol. 55.-P. 417-430.

121. Mandimba G., Heulin Т., Bally R., Guckert A., Balandreau J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage // Plant Soil. — 1986. -Vol. 90. P.129-139.

122. Manna A., Pal S., Paul A.K. Occurrence of poly-3-hydroxybutyrate in Azospirillum sp. // Folia Microbiol. 1997. - Vol. 42. - P. 629-634.

123. Mariey L., Signolle J.P., Amiel C., Travert J. Discrimination, classification, identification of microorganisms using FTIR spectroscopy and chemometrics // Vibr. Spectrosc. 2001. - Vol. 26, No. 2. - P. 151-159.

124. Matin A., Veldhuis C., Stegeman V., Veenhuis M. Selective advantage of a Spirillum sp. in a carbon-limited environment. Accumulation of poly-beta-hydroxybutyric acid and its role in starvation // J. Gen. Microbiol. — 1979. -Vol. 112.-P. 349-355.

125. McCarter L., Hilmen M., Silverman M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus II Cell. 1988. - Vol. 54. - P. 345-351.

126. McEntee J.D., Woodrow J.R., Quirk A.V. Investigation of cadmium resistance in Alcaligenes sp. //Appl. Environ. Microbiol. 1986. - Vol. 51. - P. 512-520.

127. Mehnaz S., Weselowski В., Lazarovits G. Azospirillum canadense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. - Vol. 57. - P. 620-624.

128. Mergeay M. Towards an understanding of the genetics of bacterial metal resistance // Trends Biotechnol. 1991.-Vol. 9.-P. 17-24.

129. Mergeay M., Nies D., Schlegel H.G., Gerits J., Charles P., Van Gijsegem F. Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemolithotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals // J. Bacteriol. 1985. - Vol. 162. - P. 328-334.

130. Merino S., Shaw J.G., Tom J.M. Bacterial lateral flagella: an inducible flagella system // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - Vol. 263. - P. 127-135.

131. Mishkind M.L., Raikhel N.V., Palevitz B.A., Keegstra K. The cell biology of wheat germ agglutinin and related lectins // Chemical taxonomy, molecular biology and function of plant lectins / Ed. R. Alan. -N.Y.: Liss Inc., 1983. P. 163-176.

132. Misra A.K., Thakur M.S., Srinivas P., Karanth N.G. Screening of poly-/?-hydroxybutyrate-producing microorganisms using Fourier transform infrared spectroscopy//Biotechnol. Lett. 2000. - Vol. 22. - P. 1217-1219.

133. Misra Т.К. Bacterial resistance to inorganic mercury salts and organomercurials // Plasmid. 1992. - Vol. 27. - P. 4-16.

134. Moens S., Michiels K., Keijers V., Van Leuven F., Vanderleyden J. Cloning, sequencing, and phenotypic analysis of laf 1, encoding the flagellin of lateral flagella of Azospirillum brasilense Sp7 // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177.-P. 5419-5426.

135. Moila A.H., Shamsuddin Z.H., Saud H.M. Mechanism of root growth and promotion of nodulation in vegetable soybean by Azospirillum brasilense II Commun. Soil Sci. Plant Anal. 2001. - Vol. 32. - P. 2177-2187.

136. Mordukhova E.A., Sokolov S.L., Kochetkov V.V., Kosheleva I.A., Zelenlcova N.F., Boronin A.M. Involvement of naphthalene dioxygenase in indole-3-acetic acid biosynthesis by Pseudomonas putida II FEMS Microbiol. Lett. 2000. -Vol. 190.-P. 279-285.

137. Motta E.D.S., De Barros L.H.G.P. Motion of magnetotactic microorganisms // J. Exp. Biol. 1986.-Vol. 121.-P. 153-163.

138. Murphy R.J., Levy J. F. Production of copper oxalate by some copper tolerant fungi // Trans. Br. Mycol. Soc. 1983.-Vol. 81.-P. 165-168.

139. Naumann D. Infrared spectroscopy in microbiology // Encyclopedia of analytical chemistry / Ed. R.A. Meyers. Chichester: Wiley & Sons Ltd, 2000.-P. 102-131.

140. Naumann D. FT-infrared and FT-raman spectroscopy in biomedical research // Appl. Spectrosc. Rev.-2001.-Vol. 36, No. 2-3.-P. 239-298.

141. Naumann D., Helm D., Labischinski H. Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy//Nature. 1991. -Vol. 351, No. 6321.-P. 81-82.

142. Naumann D., Keller S., Helm D., Schultz Ch., Schrader B. FT-IR spectroscopy and FT-Raman spectroscopy are powerful analytical tools for the noninvasive characterization of intact microbial cells // J. Mol. Struct. 1995. -Vol. 347.-P. 399-405.

143. Naz N., Young H.K., Ahmed N., Gadd G.M. Cadmium accumulation and DNA homology with metal resistance genes in sulfate-reducing bacteria // Appl. Environ. Microbiol.-2005.-Vol. 71, No. 8.-P. 4610-4618.

144. Nies D.H. Efflux-mediated heavy metal resistance in prolcaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2003. - Vol. 27. - P. 313-339.

145. Nies D.H. Microbial heavy-metal resistance // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. -Vol. 51.-P. 730-750.

146. Nies D.H., Silver S. Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances // J. Indust. Microbiol. Biotech. 1995.-Vol. 14.-P. 186-199.

147. Norris K.P. Infrared spectroscopy and its application to microbiology // J. Hyg. -1959.-Vol. 57.-P. 326-345.

148. Nosco P., Bliss L.C., Cook F.D. The association of free-living nitrogen-fixing bacteria with the roots of High Arctic graminoids // Arc. Alp. Res. 1994. -Vol. 26.-P. 180-186.

149. Nucifora G., Chu L., Misra Т.К., Silver S. Cadmium resistance from Staphylococcus aureus plasmid pI258 cadA gene results from a cadmium-efflux ATPase // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. - Vol. 86. - P. 3544-3548.

150. Nur I., Steinitz Y.L., Okon Y., Henis Y. Carotenoid composition and function in nitrogen-fixing bacteria of the genus Azospirillum II J. Gen. Microbiol. -1981.-Vol. 123.-P. 27-32.

151. Ohtake H., Cervantes C., Silver S. Decreased chromate uptake in Pseudomonas juorescens carrying a chromate resistance plasmid // J. Bacteriol. 1987. -Vol. 169.-P. 3853-3856.

152. Okon Y., Itzigsohn R. Poly-/?-hydroxybutyrate metabolism in Azospirillum brasilense and the ecological role of PHB in the rhizosphere FEMS // Microbiol. Rev. -1992.-Vol. 103.-P. 131-140.

153. Okon Y., Itzigsohn R. The development of Azospirillum as commercial inoculant for improving crop yealds // Biotechnol. Adv. 1995. - Vol. 13. - P. 415-424.

154. Okon Y., Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum-'moculated roots // Plant Soil. 1986.-Vol. 90, No. l.-P. 3-16.

155. Okon Y., Labandera-Gonzales C.A. Agronomic applications of Azospirillum. An evaluation of 20 years worldwide field inoculation // Soil Biol. Biochem. -1994.-Vol. 26.-P. 1591-1601.

156. Okon Y., Vanderleyden J. Root-associated Azospirillum species can stimulate plants // ASM News. 1997. - Vol. 63. - P. 366-370.

157. Olubayi O., Caudales R., Atkinson A., Neyra C.A. Differences in chemical composition between nonflocculated and flocculated Azospirillum brasilense Cd 11 Can. J. Microbiol. 1998. - Vol. 44. - P. 386-390.

158. Ona O., Smets I., Gysegom P., Bernaerts K., Impe J.V., Prinsen E., Vanderleyden J. The effect of pH on indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis of Azospirillum brasilense Sp7 // Symbiosis. 2003. - Vol. 35. - P. 199-208.

159. Ona O., Van Impe J., Prinsen E., Vanderleyden J. Growth and indole-3-acetic acid biosynthesis of Azospirillum brasilense Sp245 is environmentally controlled // FEMS Microbiol. Lett. 2005. - Vol. 246. - P. 125-132.

160. Oust A., Moretro Т., Naterstad K., Adt I., Manfait M., ICohler A. Fourier transform infrared and Raman spectroscopy for characterization of Listeria monocytogenes strains // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - Vol. 72, No. 1. - P. 228-232.

161. Patriquin D.G., Dobereiner J., Jain D.K. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses // Can. J. Microbiol. 1983. Vol. 29. - P. 900-915.

162. Patten C.L., Glick B.R. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid // Can. J. Microbiol. 1996. - Vol. 42, No. 3. - P. 207-220.

163. Pazirandeh M., Wells B.M., Ryan R.L. Development of bacterium-based heavy metal biosorbents: enhanced uptake of cadmium and mercury by Escherichia coli expressing a metal binding motif // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, No. 10.-P. 4068-4072.

164. Pedraza R.O., Ramirez-Mata A., Xiqui M.L., Baca B.E. Aromatic amino acid aminotransferase activity and indole-3-acetic acid production by associative nitrogen-fixing bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2004. - Vol. 3. - P. 15-21.

165. Peng G., Wang H., Zhang G., Hou W., Liu Y., Wang E. Т., Tan Z. Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass //Int. J. Syst. Evol. Microbiol.-2006.-Vol. 56.-P. 1263-1271.

166. Perfiliev Yu.D., Kamnev A.A. Emission Mossbauer spectroscopy // Mossbauer Effect Ref. & Data J. 2007. - Vol. 30, No. 5.-P. 121-122.

167. Perfiliev Yu.D., Rusakov V.S., Kulikov L.A., Kamnev A.A., Alkhatib K. Reason for line broadening in emission Mossbauer spectra // J. Radioanal. Nucl. Chem. -2005. Vol. 266, No. 3. - P. 557-560.

168. Perfiliev Yu.D., Rusakov V.S., Kulikov L.A., Kamnev A.A., Alkhatib K. Effects of trapped electrons on the line shape in emission Mossbauer spectra // Hyperfme Interactions. 2006. - Vol. 167, No. 1-3. - P. 881-885.

169. Peumans W.G., Van Damme E.G.M. Lectins as plant defense proteins // Plant

170. Raikhel N.V., Mishkind M.L., Palevitz B.A. Characterization of a wheat germ agglutinin-like lectin from adult wheat plants // Planta. 1984. - Vol. 162. -P. 55-61.

171. Production, composition and Pb~ adsorption characteristics of capsularpolysaccharides extracted from a cyanobacterium Gloeocapsa gelatinosa II Water Res. 2006. - Vol. 40. - P. 3759-3766.

172. Reinhold В., Hurek Т., Fendrik I. Strain-specific chemotaxis of Azospirillum spp. // J. Bacterid.- 1985.-Vol. 162.-P. 190-195.

173. Riddle J.W., Kabler P.W., Kenner B.A., Bordner R.H., Rockwood S.W., Stevenson H.J.R. Bacterial identification by infrared spectrophotometry // J. Bacteriol. -1956.-Vol. 72-P. 593-603.

174. Rouch D.A., Lee, B.T.D., Morby A.P. Understanding cellular responses to toxic agents: A model for mechanism choice in bacterial metal resistance // J. Ind. Microbiol.- 1995.-Vol. 14.-P. 132-141.

175. Rudiger H., Gabius H.J. Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions and applications // Glycoconj. J. 2001. - Vol. 18, No. 8. - P. 589-613.

176. Saier M.H. Jr. A fimctional-phylogenetic classication system for transmembrane solute transporters // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - Vol. 64. - P. 354-411.

177. Saier M.H. Jr. Computer-aided analyses of transport protein sequences: gleaning evidence concerning function, structure, biogenesis, and evolution // Microbiol. Rev. 1994.-Vol. 58.-P. 71-93.

178. Saier M.H. Jr., Tam R., Reizer A., Reizer J. Two novel families of bacterial membrane proteins concerned with nodulation, cell division and transport // Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 11. - P. 841 -847.

179. Sardesai N., Babu C.R. Poly-beta-hydroxybutyrate metabolism is affected by changes in respiratory enzymatic activities due to cold stress in two psychrotrophic strains of Rhizobium II Curr. Microbiol.-2001.-Vol. 42.-P. 53-58.

180. Scheludko A.V., Katsy E.I., Ostudin N.A., Gringauz O.K., Panasenko V.I. Novel classes of Azospirillum brasilense mutants with defects in the assembly and functioning of polar and lateral flagella // Мол. ген. микробиол. вирусол. -1998.-№4.-С. 33-37.

181. Schloter М., Hartmann A Endophytic and surface colonization of wheat roots (Triticum aestivum) by different Azospirillum brasilense strains studied with strain specific monoclonal antibodies // Symbyosis. 1998. - Vol. 25, No. 1. - P. 159-179.

182. Schrader В., Dippel В., Erb I., Keller S., Lochte Т., Schulz H., Tatsch E., Wessel S. NIR Raman spectroscopy in medicine and biology: results and aspects // J. Mol. Struct. 1999. - Vol. 480-481. - P. 21 -32.

183. Schultz C., Naumann D. In vivo study of the state of order of the membranes of gram-negative bacteria by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) // FEBS Lett. 1991. - Vol. 294, No. 1 -2. - P. 43-46.

184. Schultz H., Baranska M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy // Vibr. Spectrosc. 2007. -Vol. 43, No. l.-P. 13-25.

185. Schuster K.C. Monitoring the physiological status in bioprocesses on the cellular level // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1999. - Vol. 66. - P. 185-208.

186. Schiitzendiibel A., Polle A. Plant responses to abiotic stresses: heavy metal-induced oxidative stress and protection by mycorrhization // J. Exp. Bot. — 2002. -Vol. 53.-P. 1351-1365.

187. Schwarz R.E., Wojciechowicz D.C., Picon A.I., Schwarz M.A., Paty P.B. Wheat germ agglutinin-mediated toxicity in pancreatic cancer cells // Br. J. Cancer. -1999.-Vol. 80, No. 11.-P. 1754-1762.

188. Scott J.A., Palmer S.J. Cadmium bio-sorption by bacterial exopolysaccharide // Biotechnol. Lett. 1988. - Vol. 10. - P. 21-24.

189. Scott J.A., Palmer S.J. Sites of cadmium uptake in bacteria used for biosorption // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - Vol. 33. - P. 221-225.

190. Sekar C., Prasad N.N., Sundaram M.D. Enhancement of polygalacturonase activity during auxin induced para nodulation and endorhizosphere colonization of Azospirillum in rice roots // Indian J. Exp. Biol. 1999. - Vol. 38. - P. 80-83.

191. Shi W., Li C., Louise C.J., Adler J. Mechanism of conditions causing lack of flagella in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 2236-2240.

192. Silver S. Plasmid-determined metal resistance mechanisms: range and overview // Plasmid. 1992. - Vol. 27. - P. 1-3.

193. Silver S., Misra Т.К., Laddaga R.A. DNA sequence analysis of bacterial toxic heavy metal resistances // Biol. Trace Elem. Res. 1989. - Vol. 21. - P. 145-163.

194. Silver S., Phung L.T. Bacterial heavy metal resistance: new surprises // Annu. Rev. Microbiol. 1996. - Vol. 50. - P. 735-789.

195. Skerman V.B.D., Sly L.I., Williamson M. Conglomeromonas largomobilis gen. nov., sp. nov., a sodium-sensitive, mixed-flagellated organism from freshwater // Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. - Vol. 33. - P. 300-308.

196. Skvortsov I.M., Ignatov V.V. Extracellular polysaccharides and polysaccharide-containing biopolymers from Azospirillum species: properties and the possible role in interaction with plant roots // FEMS Microbiol. Lett. 1998. -Vol. 165.-P. 223-229.

197. Snavely M.D., Florer J.B., Miller C.G., Maguire M.E. Magnesium transport in Salmonella typhimurhmr. ~ Mg~ transport by CorA, MgtA, and MgtB systems//J. Bacteriol. 1989.-Vol. 171.-P. 4761-4766.

198. Socrates G. Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies. Chichester: Wiley, 2001.-P. 1-49.

199. Somers E., Vanderleyden J., Srinivasan M. Rhizosphere bacterial signalling: a love parade beneath our feet // Crit. Rev. Microbiol. 2004. - Vol. 30, No. 4. - P. 205-240.

200. Spaepen S., Vanderleyden J., Remans R. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling // FEMS Microbiol. Rev. 2007. - Vol. 31.-P. 425-448.

201. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - Vol. 24, No. 4. - P. 487-506.

202. Summers A.O., Silver S. Mercury resistance in a plasmidbearing strain of . Escherichia coli II J. Bacteriol. 1972. - Vol. 112 - P. 1228-1236.

203. Sun J., Dommelen A.V., Impe J.V., Vaderleyden J. Involvement of glnB, glnZ and glnD genes in the regulation of poly-3-hydroxybutyrate biosynthesis by ammonia in Azospirillum brasilense II Appl. Environ. Microbiol. 2002. -Vol. 68.-P. 985-988.

204. Sun J., Peng X., van Impe J., Vanderleyden J. The ntrB and ntrC genes are involved in the regulation of poly-3-hydroxybutyrate biosynthesis by ammonia in Azospirillum brasilense Sp7 // Appl. Environ. Microbiol. -2000.-Vol. 66.-P. 113-117.

205. Tal S., Olcon Y. Production of the reserve material poly-/?-hydroxybutyrate and its function in Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Microbiol. — 1985. — Vol. 31.-P. 608-613.

206. Tal S., Smirnoff P., Olcon Y. The regulation of poly-P-hydroxybutyrate metabolism in Azospirillum brasilense during balanced growth and starvation // J. Gen. Microbiol.- 1990.-Vol. 136-P. 1191-1196.

207. The principles of the uptake and chemical speciation of the elements in biology // Frausto da Silva J.J.R., Willams R.J.P. Biological Chemistry of the.Elements -The Inorganic Chemistry of Life. Oxford University Press, 2001. - P. 29-82.

208. Thuler D.S., Floh E.I.S., Handro W., Barbosa H.R. Plant growth regulators and amino acids released by Azospirillum sp. in chemically defined media // Lett. Appl. Microbiol. -2003.-Vol. 37. P. 174-178.

209. Tien T.M., Gaslcins M.H., Hubell D.H. Plant growth substances produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennicetum americanum L.)//Appl. Environ. Microbiol. 1979.-Vol. 37.-P. 1016-1024.

210. Trevors J.T., Stratton G.W., Gadd G.M. Cadmium transport, resistance, and toxicity in bacteria, algae, and fungi // Can. J. Microbiol. 1986. - Vol. 32. - P. 447-464.

211. Umali-Garcia M., Hubbel D.H., Gaskins M.H., Dazzo F.B. Association of Azospirillum with grass roots // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - Vol. 39. - P. 219-226.

212. V6rtes A., Korecz L., Burger K. Mossbauer Spectroscopy. Studies in physical and theoretical chemistry, Vol. 5. Amsterdam: Elsevier, 1979. - 432 pp.

213. Valappil S.P., Boccaccini A.R., Виске C., Roy I. Polyhydroxyalkanoates in Gram-positive bacteria: insights from the genera Bacillus and Streptomyces H Antonie van Leeuwenhoelc. 2007. - Vol. 91, No. l.-P. 1-17.

214. Van Elsas J.D., van Overbeek L.S. Bacterial responses to soil stimuli // Starvation in Bacteria/Ed. S. Kjelleberg. -N.Y.: Plenum Press, 1992. P. 55-77.

215. Vande Broek A., Vanderleyden J. Genetics of the Azospirilium-plant root association. -Review // Crit. Rev. Plant Sci. 1995. - Vol. 14, No. 5. - P. 445-466.

216. Vecchio A., Finoli C.,-Di Simine D., Andreon V. Heavy metal biosorption by bacterial cells // Fresenius J. Anal. Chem. 1998. - Vol. 361. - P. 338-342.

217. Vieira R.H.S.F., Volesky B. Biosorption: a solution to pollution? // Internatl. Microbiol. 2000. - Vol. 3. - P. 17-24.

218. Vogler H., Kuhlemeier C. Simple hormones but complex signalling // Curr. Opin. Plant Biol.-2003.-Vol. 6.-P. 51-56.

219. Wang J.G., Bakken L.R. Screening of soil bacteria for poly-betahydroxybutyric acid production and its role in the survival of starvation // Microb. Ecol. 1998. -Vol. 35.-P. 94-101.

220. Xie C.H., Yokota A. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from the roots of the rice plant Oiyza sativa II Int. Syst. Evol. Microbiol.-2005.-Vol. 55.-P. 1435-1438.

221. Yilmaz E.I. Metal tolerance and biosorption capacity of Bacillus circulans strain ЕВ 1 //Res. Microbiol.-2003.-Vol. 154.-P. 409-415.

222. Yu C., Irudayaraj J. Identification of pathogenic bacteria in mixed cultures by FTIR spectroscopy // Transactions of the ASABE. 2006. - Vol. 49. - P. 1623-1632.

223. Zakharova E.A., losipenko A.D., Ignatov V.V. Effect of water-soluble vitamins on the production of indole-3-acetic acid by Azospirillum brasilense II Microbiol. Res.-2000.-Vol. 155.-P. 209-214.

224. Zakharova E.A., Shcherbakov A.A., Brudnik V.V., Skripko N.G., Bulkhin N. S., Ignatov V.V. Biosynthesis of indole-3-acetic acid in Azospirillum brasilense: insights from quantum chemistry // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 259. - P. 572-576.

Информация о работе

Тугарова, Анна Владимировна
кандидата биологических наук
Саратов, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние тяжелых металлов и растительных лектинов на некоторые аспекты метаболизма и поведение Azospirillum brasilense - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы