Особенности клеточных ответов Azospirillum brasilense на воздействие стрессовых факторов и лектина пшеницы

Садовникова, Юлия Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности клеточных ответов Azospirillum brasilense на воздействие стрессовых факторов и лектина пшеницы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности клеточных ответов Azospirillum brasilense на воздействие стрессовых факторов и лектина пшеницы"

На правах рукописи

003467039

САДОВНИКОВА Юлия Николаевна

ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ОТВЕТОВ АгОБРШШиМВКАБПЕЖЕ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ И ЛЕКТИНА

ПШЕНИЦЫ

03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2009

003467039

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН).

Научные руководители: доктор химических наук

Камнев Александр Анатольевич доктор биологических наук Антонюк Людмила Петровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Игнатов Олег Владимирович доктор химических наук, профессор Панкратов Алексей Николаевич

Ведущая организация: Биологический факультет

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита состоится «29» апреля 2009 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте: http://www.ibppm.saratov.ru/obyav_dis.htinl

Автореферат разослан «¿3» марта 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета , у

доктор биологических наук ВЕ. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Почвенные бактерии рода АгояртИит уже в течение трех десятилетий находятся под пристальным вниманием исследователей в лабораториях многих стран. Это связано с многообразием свойств данного рода бактерий, важнейшим из которых является их способность образовывать ассоциативные и эндофитные симбиозы со многими высшими растениями и стимулировать их рост и развитие, фиксируя азот атмосферы, продуцируя и выделяя в почву фитогормоны и ряд других физиологически активных соединений (ВаБЬап с1 а1. 2004).

Азоспириллы обладают значительным адаптивным потенциалом, что позволяет им занимать различные экологические ниши и предопределяет их встречаемость практически во всех климатических поясах. Из 12 описанных к настоящему моменту видов азоспирилл пока лишь два вида - А. brasiloi.se и А. Иро/епип - используются в качестве компонентов бактериальных препаратов и биоудобрений в агробиотехнологии; им же посвящена основная масса исследований. Тем не менее, если, к примеру, в Южной Америке Вгас1уг1и:о-Ыит уаротсит используется для инокуляции около 25 млн. гектаров сои, то площади пшеницы и кукурузы, занятые с использованием коммерческих препаратов на основе А:о.чр1гШит, занимают пока лишь 0.5 млн. гектаров (Са51го-8о\ут51а с Г а/., 2007)..

Одним из факторов, способствующих формированию эффективных ассоциаций почвенных бактерий с растениями, выживаемости микросимбионта в почве и стабильности его фитосгамулирующего действия, является его устойчивость к стрессам. Это тем более важно ввиду того, что формирование растительно-микробных ассоциаций, в том числе и при использовании биопрепаратов для инокуляции культурных растений, происходит в постоянно меняющихся условиях обитания. Последние включают в себя различные неблагоприятные факторы окружающей среды, многообразие которых с учетом обширной "географии" распространения азоспирилл очень велико. В связи с этим исследование механизмов адаптации азоспирилл к стрессовым условиям, в том числе при их длительном воздействии, является актуальной задачей и представляет интерес не только для выявления фундаментальных закономерностей, способствующих пониманию стратегии выживания бактерий в неблагоприятных условиях, но имеет и важное прикладное значение.

Экспериментально доказано, что в преодолении стрессовых условий многими бактериями, включая азоспирилл, важную роль играет их способность синтезировать внутриклеточный резервный "запас" биополимеров, представляющих собой продукт поликонденсации (эстерификации) гидроксоалкановых кислот (Каскшп с1 а1., 2005). У А. brasilen.se они представлены гомополимером Р-гидроксомасляной кислоты - поли-3-гидроксобутира-том (ПГБ), что, по данным (Кас1о1Ш е( а1., 2003), имеет значение также для колонизации бактерией корней растений. Данная способность к синтезу и накоплению резервного биополимера, в частности, имеет принципиальное значение для увеличения сохранности, эффективности и надежности коммерческих бактериальных препаратов (Ка(1о1т е1 а!., 2003, 2005). Это обусловли-

вает важность и актуальность исследований, связанных с биосинтезом и накоплением этого биополимера, имеющего также потенциальное промышленное значение в связи с его способностью к биодеградации и наличию ряда других полезных свойств (Khanna and Srivastava, 2005; Rehm, 2007).

Существенным фактором, который в настоящее время признан как необходимое звено в формировании устойчивой и эффективной растительно-бактериальной ассоциации, является обмен молекулярными сигналами между макропартнером (растение-хозяин) и микросимбионтом. Как показано в исследованиях последних лет (Антонюк, 2005; Антонюк и Евсеева, 2006), для ассоциативного симбиоза A. brasilense с пшеницей в качестве одного из таких сигналов, вызывающих целый ряд клеточных ответов бактерии, может выступать агглютинин зародышей пшеницы (АЗП), который не только экспонирован на поверхности корня, в местах прикрепления бактерий, но и в небольших количествах может попадать в окружающую среду. Данный лектин, обладающий специфичностью к остаткам А'-ацетил-В-глюкозамина (и его олигомерам), содержащимся в биополимерах клеточной поверхности азоспирилл, вызывает в клетках бактерий ряд метаболических изменений, существенных для формирования симбиоза и его функционирования.

Необходимо подчеркнуть, что все описанные для A. brasilense эффекты, вызванные лектином пшеницы, наблюдались в условиях азотфиксации - при росте бактерий в микроаэробных условиях в отсутствие источников связанного азота. В связи с этим представляло интерес выяснить наличие какого-либо клеточного ответа бактерии на лектин пшеницы в аэробных условиях, в том числе в условиях ассимиляции аммония, подавляющих азотфиксацию.

Как известно, успешность колонизации растения бактериями зависит, в том числе, и от плотности популяции. Поскольку, с одной стороны, способность белков стимулировать размножение бактерий уже описана (Bermudez el al., 1996; Мукамолова и соавт., 1999; Томова и соавт., 2005), а с другой -воздействие АЗП на метаболизм азоспириллы плейотропно (стимулируется ряд процессов, важных для формирования растительно-бактериального симбиоза), представляло также интерес исследование возможности лектина пшеницы стимулировать размножение азоспирилл.

Все вышесказанное предопределило интерес к изучению особенностей клеточных ответов A. brasilense при воздействии некоторых стрессовых факторов и лектина пшеницы.

Целью данной работы являлось изучение реакции A. brasilense на некоторые виды стресса и лектин пшеницы, в том числе при длительном культивировании.

Для реализации поставленной цели в ходе исследования решали следующие задачи:

1. Исследование влияния лектина пшеницы на рост/1, brasilense на жидкой и полужидкой средах.

2. Выявление клеточных ответов/1 brasilense на дефицит азота в аэробных условиях в присутствии и в отсутствие лектина пшеницы методом ИК-фурье-спектроскопии.

3. Изучение состояния культуры А. ЬгахИеп.чс при длительном культивировании в различных стрессовых условиях.

4. Исследование динамики накопления и свойств внутриклеточного поли-3-гидроксобутирата в различных стрессовых условиях при длительном культивировании А brasilen.se методом ИК-фурье-спектроскопии.

Научная новизна. Впервые показано, что лектин пшеницы может служить фактором роста для азоспирилл, увеличивая число жизнеспособных клеток в стационарной фазе роста как на жидкой, так и на полужидкой средах.

С помощью ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения для штамма А. brasilense Бр245 впервые обнаружено, что в аэробных условиях при дефиците азота в среде (трофический стресс), а также в присутствии лектина пшеницы происходит перераспределение компонентов вторичной структуры клеточных белков с увеличением доли р-структурных фрагментов.

Охарактеризовано состояние культуры А. Ьпт1ете Бр245 при длительном культивировании (до 30 сут) в условиях дефицита азота как в микроаэробных, так и в аэробных условиях. Обнаружено, что аэрация вызывает большее снижение жизнеспособности культуры азоспирилл на поздних стадиях при незначительном снижении общего числа клеток в культуре в обоих случаях.

Охарактеризовано влияние температурных условий и состава среды на состояние культуры при длительном культивировании азоспирилл (до 30 сут) в азотфиксирующих условиях и динамика накопления поли-3-гидроксобутирата (ПГБ) клетками. С помощью ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения впервые для бактерий обнаружено, что при длительном микроаэробном культивировании в условиях дефицита связанного азота в среде А. ЬгахИете накапливает ПГБ меньшей степени кристалличности, чем до достижения стационарной фазы; при этом на более поздних сроках культивирования культура в первую очередь расходует именно эту более аморфную фракцию ПГБ, характеризующуюся, по литературным данным, большей скоростью ферментативного гидролиза (т.е. более легкой "усваиваемостью").

Научно-практическая значимость. Полученные в работе результаты по влиянию лектина пшеницы на рост азоспирилл позволяют лучше понять механизмы формирования и успешного функционирования растительно-бактериальных симбиозов, что важно для повышения их эффективности.

Данные об адаптации азоспирилл к различным стрессовым условиям, в том числе при длительном культивировании, также существенны для выработки стратегии их практического применения в агробиотехнологии.

Полученные сведения о динамике накопления клетками азоспирилл и свойствах резервного вещества (поли-3-шдроксобутирата, играющего важную роль в преодолении бактериями стрессовых условий) могут быть использованы для улучшения свойств коммерческих бактериальных препаратов, а также для разработки биотехнологических приемов производства данного промышленно ценного биополимера.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на следующих научных мероприятиях: 1-я Регион, конф. мол.

ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 26-27 марта 2002 г.; 10th Eur. Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules, Szeged, Hungary, 30 Aug. - 4 Sept. 2003; f1 FEMS Congr. of European Microbiologists, June 29 - July 3, 2003, Ljubljana, Slovenia; 14th Internal Congr. of the Hungarian Society for Microbiology, 9-11 Oct. 2003, Balatonfiired, Hungary; 2-я Регион, конф. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 26-28 октября 2004 г.; Всеросс. научно-практ. конф., посвященная 117-летию Н.И. Вавилова, Саратов, 2004 г.; 9-я Междунар. пущинская школа-конференция мол. ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 18-22 апреля 2005 г.; Всеросс. конф. "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты", Саратов, 15-17 июня 2005 г.; 5th Int. Symp. "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems", 20-24 June 2005, St.-Petersburg, Russia; Междунар. конф. "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 6-9 июля 2005 г.; 30lh FEBS Congress, 2-7 July, 2005, Budapest, Hungary; Науч. конф. "Коммуникация у микроорганизмов", Москва, 11 ноября 2005 г.; Междунар. конф. "Современная физиология растений: от молекул до экосистем", Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г.; 10th Analytical Russian-German-Ukrainian Symp. (ARGUS'2007 -Nanoanalytics), 26-30 Aug. 2007, Saratov, Russia; Internat. Conf. "Rhizosphere II" Satellite Workshop "Azospirillum VII and Related PGPR: Genomics, Molecular Ecology, Plant Responses and Agronomic Significance", Aug. 30 - Sept. 01, 2007, Montpellier, France; Всеросс. конф. с междунар. участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем", Саратов, 10-12 сентября 2007 г.; 5th Internat. Conf. on Instrumental Methods of Analysis, 30 Sept. -4 Oct. 2007, Patras, Greece; Междунар. науч. конф. "Микроорганизмы и биосфера", Москва, 19-20 ноября 2007 г.; 4-я Межрегион, конф. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой", Саратов, 14-16 октября 2008 г.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН 10 ноября 2008 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ в зарубежных и отечественных научных изданиях, из которых 3 статьи в журналах, включенных ВАК в "Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук", 2 статьи в сборниках научных работ и 21 тезисы докладов в материалах научных конференций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Лектин пшеницы может быть фактором роста для A. brasilense: он увеличивает число жизнеспособных клеток в стационарной фазе на жидкой и полужидкой средах.

2. В аэробных условиях при дефиците азота в среде у A. brasilense Sp245 происходит возрастание доли белков, содержащих Р-структурные фрагменты полипептидной цепи, в белковой составляющей клетки. Лектин пшеницы индуцирует такие же изменения в культуре даже в оптимальных по азоту условиях роста бактерии.

3. A. brasilense Sp245 сохраняет высокую жизнеспособность при длительном культивировании в условиях дефицита азота. Сочетание трофического и окислительного стрессов приводит к значительному сокращению числа жизнеспособных клеток в культуре.

4. При длительном культивировании в условиях азотфиксаили A. brasilense накапливает поли-3-гидроксобутират меньшей степени кристалличности, чем в ранней стационарной фазе. При этом на более поздних сроках культивирования, при переходе на внутренний питательный резерв - ПГБ, культура преимущественно расходует именно эту более аморфную фракцию биополимера.

Личный вклад соискателя. Личный вклад соискателя состоит в участии в постановке всех исследовательских задач, подготовке и проведении экспериментальных работ, активном участии в обработке, обсуждении и интерпретации всех полученных результатов, а также в подготовке публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка публикаций автора по теме диссертации, благодарностей, списка цитируемой литературы, содержащего 295 источников, в том числе - 225 зарубежных. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков и 10 таблиц.

Проведение исследований. Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в рамках тем "Особенности биохимии эндофитных и ассоциативных симбионтов рода Azospirillum" (руководитель - д.б.н. Л.П. Антонюк, № гос. регистрации 01200012855) и "Исследование молекулярных механизмов растительно-микробных взаимодействий с использованием спектроскопических подходов" (руководитель -д.х.н. А.А. Камнев, № гос. регистрации 01200712166).

Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнялись при поддержке грантами Российского фонда фундаментальных исследований №№ 01-04-48755-а (2001-2003 гг.) и 03-04-06400-мас (2003 г.); грантом № 205 Комиссии РАН по работе с молодежью (6-й Конкурс-экспертиза проектов; 2002-2004 гг.); грантом Министерства науки и образования РФ, лот № 2005-РИ-112/001, проект № РИ-112/001/423 (2005 г.); фантами Президента РФ на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ №№ НШ-1529.2003.4 (2003-2005 гг.) и НШ-6177.2006.4 (2006-2008 гг.); составляли часть совместных международных проектов в рамках Соглашений между РАН и Венгерской АН на 2002-2004 гг. (Постановление Президиума РАН № 10107173 от 05.03.2002 г., проект № 27) и на 2005-2007 гг. (Постановление Президиума РАН № 10107-120 от 18.02.2005 г., проект № 38), а также в рамках научных программ НАТО при поддержке грантами на развитие связей сотрудничества (Collaborative Linkage Grants) №№ LST.CLG.977664 (в течение 2002-2003 гг.), LST.NR.CLG.981092 (2004-2006 гг.), ESP.NR.NRCLG 982857 (в течение 2007-2008 гг.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

Обзор литературы включает следующие разделы:

1.1. Бактерии рода Azospirillum: современные представления о систематике, физиологии и экологии. 1.2. Стресс у бактерий. 1.3. Регуляция роста у бактерий. 1.4. Инфракрасная спектроскопия как исследовательский инструмент в современной микробиологии.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

В работе были использованы бактерии Azospirillum brasilense, штаммы Sp245 и Sp7 (коллекция ИБФРМ РАН). В главе даны состав питательных сред, условия выращивания бактерий и пробоподготовка для используемых в работе методов. Описаны методики определения числа жизнеспособных клеток, общего числа клеток, биомассы; постановка экспериментов по длительному культивированию; метод двойной радиальной иммунодиффузии; приготовление образцов клеток для спектроскопических исследований; методология ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения (без применения КВг). Все эксперименты были проведены не менее чем в 3-х повторностях в независимых экспериментах. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета анализа данных программы Excel Microsoft Office 97 или ХР.

Результаты исследований и их обсуждение

Влияние агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) на рост A. brasilense. Данный лектин является димером типа а2 (36 кДа), со специфичностью к остаткам Л'-ацетил-В-глюкозамина (GlcNAc), его олигомерам и полимеру (хитин). Молекула АЗП содержит четыре углеводсвязывающих участка, каждый из которых может взаимодействовать с GlcNAc. Кроме того, два из четырех активных центров белковой молекулы связывают А'-ацетил-D-нейраминовую кислоту (NeuNAc). АЗП способен специфически связывается с отдельными поверхностными полимерами A. brasilense (Никитина и соавт., 1996; Коннова и соавт., 2005), что считается важным для успешной колонизации растений пшеницы этими бактериями.

Проводившиеся с 80-х годов XX века исследования показали, что клетки азоспириллы отвечают на АЗП изменением метаболизма. Поскольку для успешной колонизации растений бактерии должны достичь в ризосфере определенной плотности, представлялась актуальной проверка АЗП на его способность стимулировать рост азоспирилл.

Ввиду того, что в природных условиях ризобактерии редко размножаются в планктонных (плавающих в жидкой среде) культурах, представлялось целесообразным выяснить, имеет ли место стимуляция роста азоспириллы под влиянием АЗП при росте в полужидких средах, позволяющих моделировать условия существования азоспирилл, близкие к природным. Для приготовления полужидкой среды использовали малатно-солевую среду с добавлением 0.5 г/л

NH4C1 и 0.095% Phytagel ("Sigma-AIdrich"). По результатам 3-х экспериментов, проведенных не менее чем в 5-ти повторностях, показано, что АЗП (0.5 мкг/мл) увеличивает количество жизнеспособных клеток A. brasilense Sp245; среднее значение КОЕ в опыте составило 213% от контроля. Замена АЗП на БСА (белок, не являющийся лектином) или конканавалин А (КонА - лектин из Canavalia ensiformis, специфичный к a-D-маннозе и a-D-глюкозе) не приводила к ростстимулирующему эффекту; однако неактивным оказался и лектин из клубней картофеля (STA), также специфичный к олигомерам и полимерам GIcNAc, что оставляет открытым вопрос о специфичности активирующего действия АЗП на рост азоспириллы. Было также показано, что в полужидких средах АЗП влияет и на размер колоний азоспириллы, уменьшая долю мелких (< 2 мм) и увеличивая долю крупных колоний (, 4 мм), что, вероятно, связано со стимуляцией не только роста, но и коллективной подвижности.

Описанная для лектинов бобовых способность к стимуляции роста ризобий (Косенко и Мандровская, 1998) была установлена при изучении роста R legumi-nosarum как на твердых агаризованных, так и в жидких средах. В связи с этим была предпринята проверка влияния лектана пшеницы на жизнеспособность A. brasilense Sp245 при росте бактерии в жидкой культуре.

С учетом отсутствия стимулирующего эффекта АЗП при малых сроках его воздействия на A. brasilense, а также известных данных о том, что пролиферативное (ростстимулирующее) действие растительных лектинов на эукариотические клетки проявляется спустя 3-5 сут с момента начала действия стимула (Brown and Hunt, 1978; Kilpatrick and McCurrach, 1987), была выбрана длительность воздействия АЗП на A. brasilense в течение 66 часов.

Культуру выращивали в микроаэробных условиях, поскольку все ранее обнаруженные клеточные ответы бактерии на АЗП проявлялись именно в этих условиях (Антонюк, 2005). Культивирование A. brasilense Sp245 с АЗП (0.2 мкг/мл; 5.6х] О"9 М) в течение 66 ч приводило к увеличению числа жизнеспособных клеток бактерии в среднем на 60% по данным 3-х независимых экспериментов, проведенных не менее чем в 3-х повторностях. Аналогичные данные были получены и для штамма A. brasilense Sp7, где прирост составил 58%. Как и в случае полужидких сред для A. brasilense Sp245, КонА и БСА были неактивны. При этом не было обнаружено прироста биомассы, а также общего числа клеток в культуре A. brasilense Sp245, определяемого общим счетом.

Таким образом, по результатам экспериментов, присутствие АЗП в среде культивирования, не вызывая "количественных" изменений в культуре (не происходило увеличения общего числа клеток и биомассы по сравнению с контролем), "качественно" меняло культуру - происходило увеличение числа жизнеспособных клеток. При этом более выражено данный эффект проявлялся при культивировании A. brasilense Sp245 на полужидкой среде. Способность АЗП быть фактором роста для A. brasilense является пролонгированным эффектом: она не выявляется у активно растущих культур, а проявляется только в стационарной фазе роста бактерии при достаточно длительном времени воздействия данного лектина.

Важно отметить, что на разных стадиях развития пшеницы АЗП расположен в основном в тех структурах, которые входят в контакт с почвой во время прорастания и развития растения, и может быть доступен для бактерий. В связи с этим способность АЗП стимулировать рост Л. bra.silen.se может реализоваться и в естественных условиях, что, в свою очередь, может способствовать формированию эффективного ассоциативного симбиоза пшеницы и А. ЪгаьИете.

Исследование клеточных ответов А. ЬгаяИеже на стресс и влияние лектина пшеницы с использованием ИК-фурье-спектроскопии. Целью данной части работы явился мониторинг изменений в составе и (или) структуре клеточных макромолекул А. ЬгазИете Бр245 в ответ на комплексный стресс (дефицит связанного азота, соответствующий высокому соотношению С:Ы в среде роста, в сочетании с повышенным уровнем кислорода, созданным за счет аэрации) с применением метода ИК-фурье-спектроскопии целых клеток в режиме диффузного отражения (ДО). Другой целью было выявление возможных изменений в составе и (или) структуре макрокомпонентов клеток А. brasilen.se Бр245, выращенных в аэробных условиях в присутствии АЗП. Интерес к этому вопросу был вызван, в частности, тем, что в аэробных условиях роста бактерии А. Ьгаз11ете Бр245 ранее не удавалось выявить клеточный ответ на АЗП как молекулярный сигнал растения, в отличие от многочисленных эффектов АЗП, проявляющихся в микроаэробных условиях (Антонюк и Евсеева, 2006).

На рис. 1а представлен ИК-фурье-спектр клеток А. brasilen.se 8р245, выращенных с перемешиванием на полной среде, содержащей источник связанного азота (ЫН4"). Хотя для роста азоспириллы предпочтительными считаются условия с невысоким уровнем кислорода, в условиях описываемого эксперимента бактерии нарастали до несколько больших значений оптической плотности (при X = 595 нм; А595) по сравнению с культурой, растущей на той же среде, но без перемешивания (Аул = 0.92 ± 0.01 и 0.81 ± 0.11 соответственно, для 70-часовых культур) и, вероятно, не испытывали окислительного стресса. Таким образом, спектр на рис. 1 а условно можно считать контрольным (для данной серии экспериментов), то есть спектром клеток, практически не испытывающих стресса. Общая форма ИК-спектра клеток азоспириллы, выращенных вне стресса (см., например, рис. 1а), близка к виду спектров других бактериальных клеток. В частности, в представленной области имеются характерные полосы клеточных белков - амид-1 (около 1660 см4) и амид-П (~1540 см4), помимо ряда других полос.

Спектр клеток А. brasilen.se Бр245, выращенных аэробно в условиях питательного стресса (дефицит азота), представлен на рис. 16. Данные условия были неблагоприятными для азоспириллы, прежде всего за счет высокого соотношения С:1\Г. Дополнительное стрессовое воздействие культура испытывала за счет сочетания двух факторов культивирования: аэрация и исключение аммония из питательной среды. ИК-спектр клеток, подверженных описанному выше комплексному стрессу (см. рис. 16), значительно отличается от контрольного спектра (см. рис. 1а), отражая значительную перестройку метаболизма А. ЬгаъИете при переходе от оптимальных условий к высокому

соотношению С:Ы в среде. Одной из доминирующих черт спектра на рис. 1 б является появление ряда полос, характерных для поли-3-гидроксобутирата (ПГБ): в области 1730 см-1 (колебания у(С=0) сложноэфирного фрагмента); 1450-1452 и 1379 см-1 (антисимметричные и симметричные деформационные колебания метильных и метиленовых групп); а также около 1285, 1135 и 1055 см"' (колебания сложноэфирного фрагмента С-О-С / С-С-О) и др.

Волновое число / см'1

Рис. 1. ИК-фурье-спектры (в режиме диффузного отражения) сухой биомассы клеток А. Ъгаь'йете Бр245, выращенных в малатно-солевой среде в присутствии 3 г/л Т\ГН4С1 (а, в) и в той же среде без добавления №14С1 (б, г), в том числе в присутствии 0.2 мкг/мл агглютинина зародышей пшеницы (в, г).

Накопление этого резервного биополимера в стрессовых условиях, отмечавшееся как для азоспирилл, так и для ряда других бактерий, играет роль в преодолении неблагоприятных экологических условий (Кас1оип е1 а!., 2005).

Второе существенное изменение в ИК-слектре испытывавших трофический стресс клеток было связано с изменениями в области полосы амид-1. Как известно, полоса амид-1 характеризуется наличием различных составляю-

щих в области 1620-1690 см-1 для различных конформаций полипептидной цепи, что позволяет использовать ИК-спектроскопию для характеристики содержания различных компонентов вторичной структуры белков.

В спектре на рис. 1 а данная область представлена одним широким пиком с максимумом 1656 см-1, в то время как в случае трофического стресса наблюдалось расщепление полосы амид-I с появлением, кроме максимума около 1660 см"', также пиков при 1632 и 1686 см"1 (см. рис. 16). Как известно, вторичной структуре типа ос-спирали соответствует полоса с максимумом при 1656-1658 см"1. Различным (по силе взаимодействия между слоями) видам р-слоев (р-sheets) отвечает полоса с максимумом в области от 1637 до 1623 см"1, при этом ей обычно сопутствует полоса (или плечо) в области 1680-1690 см"1 (р-антипараллельные складки; [3-antiparallel pleated sheets). Для Р-изгибов (p-turns) характерна полоса в области 1670-1660 см"1. Уширенная полоса около 1645— 1648 см"1 соответствует неупорядоченной (random coil) вторичной структуре.

Таким образом, сравнение спектров клеток A. brasilense Sp245, подвергавшихся воздействию комплексного стресса (см. рис. 16), и клеток, растущих в оптимальных условиях (см. рис. 1а), свидетельствует о возрастании доли Р-структурных фрагментов в общем пуле белков клетки в первом случае.

Для получения ИК-спектров на рис. \в,г среда культивирования, в отличие от вышеописанных двух вариантов, содержала лектин пшеницы (0.2 мкг/мл). На спектре АЗП-содержагцей культуры (рис. 1е) в присутствии аммония наблюдалось аналогичное расщепление полосы амид-I (появление дополнительного максимума при 1635 см"'). В присутствии АЗП в среде без аммония (рис. \г) расщепление полосы амид-] сохранялось (наряду с полосами ПГБ).

Таким образом, как присутствие лектина пшеницы, так и трофический стресс в данных условиях индуцировали увеличение доли р-структурных фрагментов в общем пуле белков клетки. Отметим, что в литературе, насколько нам известно, нет сведений о конформационных изменениях клеточных белков бактерий, происходящих под воздействием внешних факторов.

Для некоторых уже охарактеризованных ранее белков клеточной поверхности A. brasilense, включающих лектин (гемагглютинин) и мажорный белок внешней мембраны - адгезин, гомологичный бактериальным поринам (Burdman et al., 2000; Bashan et al., 2004), доказано также их участие в стрессоустойчивости и (или) колонизации корней растений (последнее также способствует преодолению стресса бактериями) (Никитина и соавт., 1996, 2001; Burdman et al., 2001; Mora et al., 2008). Поскольку как бактериальные гемагглютинины (Morita, 1998; Sharma et al., 1999), так и порины (Vogel and Jahnig, 1986; Achouak et al., 2001) богаты p-структурами, можно предположить, что обнаруженное в настоящей работе увеличение доли Р-структурных фрагментов клеточных белков A. brasilense Sp245, происходящее в стрессовых условиях, а также в присутствии АЗП, связано с индукцией биосинтеза одного или более (глико)протеинов клеточной поверхности - гемагглютинина и (или) порина. В частности, в случае АЗП азоспирилла может отвечать на этот сигнал "присутствия растения" готовностью к колонизации, синтезируя участвующие в ней биополимеры.

Адаптация А. ЬгазИеме к стрессам при длительном культивировании.

Следующей задачей было исследование поведения А. Ьга$Иепзе Бр245 в глубокой стационарной фазе роста; в частности, изучение торможения роста бактерий под влиянием окислительного стресса, азотного голодания и исчерпания других питательных субстратов. В работе были использовали два типа условий. В первом случае бактерии росли в условиях азотфиксации - на среде, не содержащей источников связанного азота, и без дополнительной аэрации. Во втором типе условий бактериям создавали более жесткий стресс - они выращивались на той же среде, но дополнительно аэрировались.

Как видно из сравнения данных, представленных на рис. 2 и 3, общее число клеток на протяжении эксперимента в обоих случаях колебалось незначительно и оставалось в пределах одного порядка. В условиях азотфиксации (см. рис. 2) происходило более плавное снижение числа КОЕ по сравнению с условиями жесткого стресса (рис. 3). Наиболее резкое падение числа жизнеспособных клеток происходило после 10-го дня культивирования (рис. 3); к 24-му дню культивирования общее число клеток в аэробной культуре А. Ьга$Нете превышало КОЕ на 2 порядка. К концу эксперимента количество жизнеспособных клеток в микроаэробных условиях снизилось примерно на 1 порядок от стартовой плотности, в случае аэробных условий культивирования - на -2.5 порядка. Таким образом, наличие двойного стресса вызывает более глубокое торможение роста по сравнению с одинарным стрессом на поздних стадиях.

Представленные на рис. 2 и 3 данные хорошо согласуются с оценкой оптической плотности культуры А. ЪгахИете Бр245 как в условиях азотфиксации, так и в условиях двойного стресса, которая также указывала на незначительное снижения общего числа клеток в культуре.

сутки

Рис. 2. Динамика числа колониеобразующих единиц (КОЕ) и общего числа клеток А. ЬгаБИете Бр245 при культивировании в условиях азотфиксации (на среде без аммония и без дополнительной аэрации).

сутки

Рис. 3. Динамика числа колониеобразующих единиц A. brasilense Sp245 и общего числа клеток в культуре при культивировании в аэробных условиях на среде без аммония.

Известно, что для вегетативных клеток A. brasilense Sp245 характерно наличие двух мажорных полос преципитации в и мму но диффузии с антителами, полученными на клетки Sp245, обработанные глутаровым альдегидом (Матора и соавт., 2008). Известно также, что каждая из полос визуализирует один из

двух типов липополисахаридов (ЛПС1 или ЛПС2) (Katzy el al., 1998). Для оценки возможных изменений поверхности клеток стареющей культуры мы сравнили результаты иммунодиффузионного анализа экстрактов внешних мембран 18-часовой культуры (вегетативные клетки) и 36-дневной культуры Sp245, используя вышеупомянутые антитела. Было показано, что интенсивность одной из полос у 36-дневной культуры значительно

уменьшалась по сравнению с 18-часовой (рис. 4).

Рис. 4. Результаты иммунодиффузионного анализа липополисахарид-содержащего экстракта клеток A. brasilense Sp245 после микроаэробной инкубации в течение 36 сут с антителами к клеткам Sp245, обработанным глутаровым альдегидом (1-5 - повторности 36-дневной культуры).

A. brasilense Sp245

Оценка ЛПС-содержащего экстракта 36-дневной микроаэробной культуры А. ЬгахИете 8р245 в тесте иммунодиффузии (см. рис. 4) позволяет предположить, что клетки этой бактерии на поздних стадиях культивирования имеют отличия в мажорных поверхностных антигенах по сравнению с активно растущими клетками.

Влияние стрессовых температурных условий и питательных сред (трофический фактор) на состояние культуры при длительном культивировании. Целью следующей серии экспериментов было сравнение жизнеспособности культур и изменений в мажорных компонентах химического состава клеток А. ЬгазИете $р245 при их культивировании в стрессовых температурных условиях и на различных питательных средах. В экспериментах исследовали следующие варианты культур:

1. Контрольный вариант («К»): культуру выращивали на синтетической малатно-солевой среде без аммония в термостате (микроаэробно) при температуре 31°С.

2. Вариант с охлаждением («X»): опытную культуру выращивали так же на той же среде, но при температуре 14°С.

3. Вариант с предварительным замораживанием («М»): инокулят перед внесением в среду выдерживали 30 мин при минус 12°С, после чего культура росла так же, как в контрольном варианте.

4. Вариант "глюкоза + триптофан" («Г»): культура росла микроаэробно на минерально-солевой среде, в которой благоприятные источники азота и углерода были заменены на неблагоприятные (глюкоза и триптофан), при 38°С.

Для каждого варианта определяли следующие параметры роста культуры: 1) количество КОЕ; 2) общее количество клеток (микроскопически, в камере Горяева). На протяжении 30 сут были выбраны 3 точки (2, 9 и 30 сут), когда производили отбор клеточной суспензии и определяли параметры роста культуры. Каждую точку кривых рассчитывали по данным не менее чем 3-х параллельно культивируемых культур. Кроме того, с применением метода ИК-фурье-спектроскопии в режиме ДО следили за изменением общего химического состава клеток.

К 9-му дню в контрольной культуре произошло 2-кратное снижение числа жизнеспособных клеток по сравнению с данными для 2 сут (рис. 5). В отличие от контроля, в остальных условиях культивирования наблюдалось более резкое падение числа КОЕ к 9-му дню. Наиболее выраженным оно было у культур «X», культивируемых при пониженной температуре, и предобработанной замораживанием «М» - в пять раз до плотности 107 кл./мл и 108 кл./мл соответственно. На среде с глюкозой »гасло КОЕ снизилось в итоге примерно в 2 раза, как и в контроле.

С 10-го по 30-й день в опытных образцах «Г» и «X» не произошло дальнейшего снижения КОЕ по сравнению с данными на 9-й день, а в вариантах «К» и «М» КОЕ уменьшилось почти на порядок. На 30-й день культивирования число КОЕ для контрольной культуры, «X» и культуры «М», охлажденной перед инокуляцией, составило приблизительно 107 кл./мл, а у культуры, культивируемой на среде с глюкозой (вариант «Г») - около ЗхЮ8

кл./мл. В итоге у варианта «Г» КОЕ уменьшилось менее чем на 1 порядок от максимального значения, а у всех остальных культур на порядок. Быстрее всего - к 9 дню - это произошло у культур «X» и «М».

На среде с глюкозой и триптофаном (вариант «Г») азоспирилла достигала наибольшей плотности по сравнению с другими культурами и сохраняла наибольшее количество жизнеспособных клеток по истечении месяца. Интересные факты были выявлены при сравнении культуры «М» и контроля. На 2-е сутки число КОЕ этой культуры достигало больших значений, чем у контроля, а затем этот показатель резко снижался. Вероятно, сильное охлаждение вызывало начальную стимуляцию роста популяции.

Рис. 5. Число жизнеспособных клеток (КОЕ) А. ЬгсяИете Бр245 при длительном культивировании для различных условий выращивания (см. выше, стр. 15).

Исследование накопления внутриклеточного поли-3-гидроксобутира-та (ПГБ) А. ЬгавИепье в различных стрессовых условиях при длительном культивировании методом ИК-фурье-спектроскопии. В настоящем разделе представлены результаты исследования образцов биомассы клеток штамма А. ЬгазПете 8р245 для описанных выше вариантов «К», «X», «М» и «Г». Методом ИК-фурье-спектроскопии в режиме ДО оценивали накопление ПГБ и особенности его структуры.

На рис. 6 показан общий вид ИК-спектров (в режиме ДО) в наиболее информативной области (ниже 2000 см-1) для контрольной культуры клеток А.ЬгазИете Бр245 на 2-е, 9-е и 30-е сутки роста. На спектрах заметно выделяется вышеупомянутая полоса \>(С=0), по интенсивности вполне соизмеримая с интенсивностью основной белковой полосы амид-1 (соседняя более широкая полоса с максимумом около 1660 см"1).

Была также предпринята сравнительная оценка уровня накопления (относительного количества) ПГБ в клетках А. ЬгахИегяе по методике,

описанной в обзорной специализированной главе, посвященной применению ИК-спектроскопии в микробиологии (Naumann, 2000). Метод основан на анализе отношения интенсивностей (а = Л(с=о> / Лмид-н) полосы валентных колебаний v(C=0) с максимумом около 1730 см"1, характерной для ПГБ, и полосы амид-Ii около 1550 см"1, характерной для клеточных белков (используемой в данном случае в качестве "внутреннего стандарта" по белку).

Рис. 6. ИК-фурье-спектры диффузного отражения (в области ниже 2000 см"1) сухой биомассы клеток А. ЬгавМете Бр245, выращенных в условиях азотфикса-ции (без добавления КН4С1, микроаэробно) при 31°С (контрольный вариант «К») в течение 2,9 и 30 сут.

Результаты расчета величин а по ИК-фурье-спектрам для различных вариантов культур приведены на рис. 7.

Уже по достижении стационарной фазы роста (2 сут) происходит заметное приблизительно одинаковое накопление ПГБ клетками бактерий во всех вариантах (а = 2.3 -г- 2.5). К 9-м суткам роста содержание ПГБ заметно увеличивается в трех вариантах - «К», «X» и «Г» (до а = 3.1 3.4) и значительно менее заметно - в варианте «М» (до а = 2.6; увеличение не является статистически значимым). Однако по прошествии 30 сут относительное содержание ПГБ снижается: наиболее сильно в контрольном варианте (до а = 1.9) и в варианте «М» (до а = 1.8), т.е. ниже уровня а для 2 сут; заметно, но гораздо менее выражено - в варианте «X» (до а = 2.6) и еще меньше - в варианте «Г» (до а= 3.1).

Очевидно, что в условиях трофического стресса (при высоком соотношении С:№) до 9-х суток происходит накопление ПГБ клетками всех вариантов, однако исчерпание питательных веществ при более длительных сроках роста культуры приводит к переходу клеток на использование "внутреннего резерва" (внутриклеточного запаса ПГБ). Для вариантов «X» и особенно «Г» гораздо меньшее снижение значений а (т.е. относительного содержания ПГБ) к 30-м

Волновое число / см

суткам соответствует отсутствию снижения общего числа клеток на поздних стадиях роста, а в случае варианта «Г» - также максимальным значениям КОЕ (числа жизнеспособных клеток) на всех этапах роста культуры.

Рис. 7. Относительные количества ПГБ в биомассе клеток А. ЬгахИете 8р245 для разных вариантов культур на различных стадиях роста (по оси ординат - значения отношения (а) интенсивностей полосы \>(С=0) около 1740 см-1, характерной для ПГБ, и полосы амид-П около 1550 см ' клеточных белков в ИК-фурье-спектрах ДО; а = Л<с=о) / Лмид-п)- Условия культивирования для культур «X», «М» и «Г» даны на стр. 15.

Таблица 1. Значения положения максимумов основных полос ПГБ в ИК-спектрах ДО для целых клеток А. ЪгаьПете Бр245 для разных вариантов на различных стадиях роста культуры

Варианты Средние значения положения максимумов двух основных полос ПГБ в ИК-спектрах (около 1740а и 13006 см1)

2 сут 9 сут 30 сут

К 1734(1)в 1290(1) 1748(3) 1305(6) 1732(2) 1286(1)

X 1734(2) 1288(1) 1747(2) 1304(3) 1744(1) 1300(2)

м 1736(4) 1292(2) 1740(4) 1295(3) 1733(3) 1287(3)

г 1739г 1304г 1748(1) 1308(1) 1748(2) 1309(2)

Примечания:а) Валентные колебания у(С=0). Валентные колебания фрагментов С-С-О/С—О—С.в) В скобках даны значения ±х (стандартное отклонение). г Единичное измерение без КВг (малое количество образца).

Анализ полученных ИК-слектров ДО для различных вариантов в точках роста 2, 9 и 30 сут показал, что положения максимумов двух основных полос ПГБ, соответствующих валентным колебаниям полиэфирной группы - v(C-O) около 1740 см"1 и фрагментов С-С-О/С-О-С около 1300 см"1 - в ряде случаев существенно отличаются. В табл. 1 приведены усредненные значения положения максимумов вышеуказанных двух основных полос в ИК-фурье-спектрах ДО (около 1740 и 1300 см ') для накапливающегося внутриклеточного ПГБ.

Из данных табл. 1 следует, что по достижении 2 сут роста культуры величины частот максимумов полосы v(C=0) на ИК-спектрах клеток близки для всех вариантов и укладываются в узкий диапазон -1736 ± 3 см"1, характерный для полос V(C=0) ПГБ. Однако для тех вариантов, которые характеризуются дальнейшим накоплением ПГБ к 9-м суткам (варианты «К», «X», «Г»; см. рис. 7), максимум поглощения полос v(C=0) обнаруживался при существенно больших частотах - около 1748 см"1 (на -10-И 4 см"1 выше). При этом для варианта «М», для которого практически не наблюдалось роста содержания ПГБ от 2-х к 9-м суткам роста (см. рис. 7), значение максимума полосы v(C=0) также менялось мало (от 1736 ± 4 до 1740 ± 4 см"1 соответственно). Далее, к 30-м суткам роста культуры, для вариантов, характеризующихся наиболее выраженным снижением содержания ПГБ (варианты «К» и «М»), наблюдалось снижение частот максимумов для полос v(C=0) до значений около 1733 см"1, близким к исходным (для 2 сут роста). Для варианта «X», характеризующегося менее выраженным снижением содержания ПГБ от 9-х к 30-м суткам роста (см. рис. 7), снижение частоты максимума полосы v(C=0) значительно меньше - с 1747 ± 2 до 1744 ± 1 см"1, а для варианта Г, характеризующегося еще меньшим снижением содержания ПГБ от 9-х к 30-м суткам (см. рис. 7), частота v(C=0) от 9-х к 30-м суткам не снижалась.

Аналогичную тенденцию к изменению частот для всех вышеописанных вариантов при переходе от 2-х к 9-м сут и далее к 30-м сут роста проявляла также полоса V(C-C-0/C-0-C) для ПГБ около 1300 см"1 (см. табл. 1).

Выявленное изменение частоты (положения максимумов) полос вышеуказанных колебаний для внутриклеточного ПГБ на разных стадиях роста бактериальной культуры в литературе не описано. Интерпретация обнаруженного эффекта отражает изменение степени кристалличности этого внутриклеточного биополимера при его накоплении и последующем расходовании культурой.

Таким образом, полученные результаты позволяют полагать, что после 2 сут до 9 сут в микроаэробной культуре A. brasilense Sp245 в условиях трофического стресса (при высоком соотношении C:N) в клетках тех вариантов, которые продолжали интенсивно накапливать ПГБ (варианты «К», «X», «Г»; см. табл. 1), накапливался продукт более высокой степени аморфности, который, как известно, легче подвергается ферментативному гидролизу (Khanпа and Srivastava, 2005). Иными словами, при длительном культивировании в условиях стресса (от 2 до 9 сут) клетки накапливают более "легкоусваиваемый" продукт (ПГБ большей степени аморфности). Более того, очевидно, что именно эта фракция ПГБ в первую очередь расходуется "голодающими" клетками при

более длительных сроках (до 30 сут). Это особенно четко проявляется для вариантов «К» и «М», характеризующихся наиболее выраженным снижением содержания ПГБ к 30-м суткам (см. выше) - для этих вариантов "остаточный" ПГБ характеризуется пониженными значениями частот максимумов полос v(C=0) и v(C-O-C) (см. табл. 1).

Исследование клеток другого штамма, А. brasilense Sp7, выращенных в условиях, соответствующих варианту «К», показал, что от 2-х к 9-м сут при практически двукратном увеличении интенсивности полосы v(C=0) ПГБ ее максимум сдвигался с 1732 ± 2 до 1744 ± 1 см Л Следовательно, выявленный для штамма А. brasilense Sp245 эффект снижения степени кристалличности ПГБ, накапливающегося в клетках при продолжительном трофическом стрессе (от 2 до 9 сут), характерен и для штамма Sp7.

Для перевода значений отношения интенсивностей полос а- Лгс-О)/Лмвд-п в величины процентного содержания ПГБ в сухой биомассе клеток (Р, мас.%) была построена калибровочная зависимость по данным работы (Kansiz et al, 2000) о газохроматографическом определении содержания ПГБ в различных образцах клеток Е. coli (Р = 0%; 19.7%; 27.3%; 40.3%) и по приведенным авторами ИК-фурье-спектрам для тех же образцов клеток с расчетом значений отношения £*=/\(с=0) /Лмид-п (сс= 0.12; 1.29; 1.49; 2.29 соответственно) по вышеописанной методике (Naumann, 2000). Полученная калибровочная зависимость линейна, в аналитическом виде соответствует уравнению Р = 18.71 а - 2.45 (коэффициент линейной корреляции г = 0.995) и позволяет оценить содержание ПГБ (в % от массы сухих клеток) по данным рис. 7. Так, на 2-е сутки содержание ПГБ в клетках штамма Sp245 всех вариантов (а = 2.3^2.5) составляло 40+44%; максимальному значению (er = 3.4) соответствует Р = 61% (вариант «Г», 9 сут); минимальному (а= 1.8) - значение Р = 31% (вариант «М», 30 сут).

Выводы

1. Впервые показано, что агглютинин зародышей пшеницы (АЗП) может служить фактором роста для Azospirillum brasilense. Установлено, что присутствие данного лектина в полужидкой среде роста бактерии увеличивает не только число жизнеспособных клеток, но и размер колоний.

2. С помощью ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения впервые показано, что в аэробных условиях при азотном голодании у А. brasilense Sp245 индуцируется возрастание доли белков, содержащих ß-структурные фрагменты полипептидной цепи, в белковой составляющей клетки. В присутствии АЗП такие же изменения в клетках индуцируются не только в стрессовых, но и в оптимальных по азоту условиях культивирования.

3. Установлено, что А. brasilense Sp245 сохраняет высокую жизнеспособность при длительных (месяц и более) сроках выращивания в периодической культуре; аэрация вызывает большее, по сравнению с микроаэробными условиями культивирования, снижение числа жизнеспособных клеток на поздних сроках культивирования.

4. Охарактеризовано влияние температурного стресса, некоторых источников азота и углерода на параметры роста A. brasilense и динамику накопления клетками поли-3-гидроксобутирата при длительном (до 30 суток) культивировании бактерии.

5. С помощью ИК-фурьс-спектроскопии в режиме диффузного отражения впервые продемонстрирована способность бактерий накапливать в клетках на разных стадиях гипобиоза культуры поли-3-гидроксобутират (ПГБ) различной степени кристалличности. Показано, что на более поздних стадиях культивирования бактерии преимущественно расходуют более аморфную фракцию ПГБ, характеризующуюся, по литературным данным, большей скоростью ферментативного гидролиза.

Список публикации автора по теме диссертации Статьи

1. Садовникова Ю.Н., Беспалова J1.A., Антонюк Л.П. Агглютинин зародышей пшеницы является фактором роста для бактерии Azospirillum brasilense // Докл. Акад. наук. 2003. Т. 389, № 4. С. 544-546.

2. Антонюк Л.П., Садовникова Ю.Н., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л. Повторное выделение бактерии Azospirillum brasilense Sp245 из нестерильных растений пшеницы // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Сб. научных статей / Под ред. О.В. Турковской. Саратов: Изд-во "Научная книга", 2005. С. 49-59.

3. Kamnev А.А., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Sadovnikova J.N., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Infrared spectroscopic detection of biospecific interactions using gold nanoparticles functionalised by biomacromolecules // Proc. 10th Analytical Russian-German-Ukrainian Symposium (ARGUS'2007 - Nanoanalytics) / Ed. by S.N. Shtykov. Saratov: Nauchnaya Kniga, 2007. P. 10-13.

4. Камнев А.А., Садовникова Ю.Н., Антонюк Л.П. Влияние дефицита азота и лектина пшеницы на состав и структуру некоторых биополимеров Azospirillum brasilense Sp245 11 Микробиология. 2008. Т. 77, № 2. С. 278-281.

5. Kamnev А.А., Sadovnikova J.N., Tarantilis P.A., Polissiou M.G., Antonyuk L.P. Responses of Azospirillum brasilense to nitrogen deficiency and to wheat lectin: a diffuse reflectance infrared Fourier transform (DRIFT) spectroscopic study // Microb. Ecol. 2008. V. 56, N 4. P. 615-624.

Тезисы докладов

6. Садовникова Ю.Н., Беспалова Л.А., Антонюк Л.П. Агглютинин зародышей пшеницы как фактор роста для бактерии Azospirillum brasilense Sp245 // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы 1-й Межрегион, конф. мол. ученых, 26-27 марта 2002 г., Саратов. - С. 22-23.

7. Ostakhina N.V., Bespalova L.A., Sadovnikova Y.N., Antonyuk L.P. Novel effects of wheat germ agglutinin as a molecular signal for Azospirillum brasilense Sp245 // Abstr. 5 European Nitrogen Fixation Conference: Book of Abstracts, 6-10 Sept. 2002, Norwich, U.K. - P. 41.

8. Sadovnikova Yu.N., Bespalova L.A., Antonyuk L.P. The lectin wheat germ agglutinin as a growth factor for Azospirillum brasilense // Abstr. 1st FEMS Congr. of European Microbiologists, June 29 - July 3, 2003, Ljubljana, Slovenia. - Book of Abstracts. - P. 416.

9. Antonyuk L.P., Bespalova L.A., Sadovnikova Yu.N., Smirnova V.E., Tugarova A.V. The lectin wheat germ agglutinin as a molecular signal for Azospirilltim brasilense: new data // 11!h Int. Congr. on Molecular Plant-Microbe Interactions, 18-26 July, 2003, St. Petersburg. Book of Abstracts. - P. 306.

10. Tugarova A.V., Sadovnikova Yu.N., Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Responses of the rhizobacterium Azospirillum brasilense to nitrogen starvation and to wheat lectin: a DRIFT spectroscopic study // 10th Eur. Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules, 30 Aug. - 4 Sept. 2003, Szeged, Hungary. - Book of Abstracts / Ed. by Szalontai В., Kota Z. - P. 91.

11. Sadovnikova Yu.N., Bespalova L.A., Ostakliina N.V., Antonyuk L.P. Communication in the Azospirillum brasilense - wheat symbiosis // 14th Internal Congr. of the Hungarian Society for Microbiology, Balatonfured, Hungary, 9-11 Oct. 2003. Book of Abstracts. - P. 177.

12. Sadovnikova Yu.N., Berezhnov A.V., Bespalova L.A., Antonyuk L.P. Plant lectin, wheat germ agglutinin, can probably increase the density of Azospirillum brasilense in the wheat rhizosphere // Rhizosphere-2004, 12-17 September, 2004, Munich, Germany. Book of Abstracts. - P. 117.

13. Садовникова Ю.Н., Беспалова Л.А., Антонюк Л.П. Растения пшеницы могут стимулировать рост ризобактерий Azospirillum brasilense II Вавиловские чтения - 2004. Материалы Всеросс. научно-практ. конф., посвящ. 117-летию Н.И. Вавилова: Сб. науч. статей. Саратов, 2004. С. 57-59.

14. Садовникова Ю.Н., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Антонюк Л.П. Получение реизолятов A. brasilense Sp245 из нестерильных растений // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Матер. 2-й Регион, конф. мол. ученых, Саратов, 26-28 октября 2004. - Саратов: Изд-во "Научная книга", 2004. - С. 23.

15. Садовникова Ю.Н., Кучинский С.В., Антонюк Л.П. Активация и торможение роста эндофитной ризобактерии Azospirillum brasilense II "Биология - наука XXI века": Материалы 9-й Междунар. пущинской школы-конф. мол. ученых, Пущино, 18-22 апреля 2005. - С. 215.

16. Садовникова Ю.Н., Камнев А.А., Кучинский С.В., Валиев Р.Ш., Антонюк Л.П. Спектроскопические подходы к изучении реакции на стресс у бактерии Azospirillum brasilense II Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Материалы Всеросс. конф., Саратов, 15-17 июня 2005. - Саратов: Изд-во "Научная книга", 2005.-С. 79-81.

17. Kamnev А.А., Dykman L.A., Antonyuk L.P., Sadovnikova Yu.N., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Biopolymers conjugated with gold nanoparticles: FTIR spectroscopic study and detection of biospecific interactions // 5* Int. Symp. "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems", 20-24 June 2005, St.-Petersburg, Russia. Book of Abstracts, Abstr. No. 0-019.

18. Sadovnikova Yu.N., Antonuyk L.P. Phytolectin wheat germ agglutinin can serve as a cytokine for phytosymbiont Azospirillum brasilense II 30th FEBS Congr., 2-7 July 2005, Budapest, Hungary. Book of Abstracts. - P. 76.

19. Тугарова A.B., Садовникова Ю.Н., Шелудько A.B., Антонюк Л.П. Агглютинин зародышей пшеницы как возможный молекулярный сигнал для бактериальных клеток // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: Материалы Междунар. конф., Пущино, 6-9 июля 2005. - Пущино, 2005. С. 394-396.

20. Антонюк Л.П., Садовникова Ю.Н., Смирнова В.Е., Соболева Е.Ф., Шелудько А.В. Лектины пшеницы и сои: возможная роль в формировании растительно-бактериальных симбиозов // Современная физиология растений: от молекул до экосистем: Материалы докл. междунар. конф., 18-24 июня 2007 г. -Ч. 3. - Сыктывкар, 2007. - С. 6-7.

21. Tugarova A.V., Smirnova V.E., Sadovnikova Yu.N., Schelud'ko A.V., Ilchukova A. V., El-Registan G.I., Antonyuk L.P. Growth in Azospirillum brasilense is regulated with high- and low-molecular-weight signals // Intemat. Conf. "Rhizosphere II" Satellite Workshop "Azospirillum VII and Related PGPR: Genomics, Molecular Ecology, Plant Responses and Agronomic Significance", Aug. 30 - Sept. 01, 2007, Montpellier, France. - Abstr. Book. - P. 14.

22. Смирнова B.E., Садовникова Ю.Н., Шелудько A.B., Антонюк Л.П. Агглютинин зародышей пшеницы стимулирует рост природного симбионта пшеницы Azospirillum brasilense Sp245 на полужидкой среде // Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем: Материалы Всеросс. конф. с междунар. участием, 10-12 сентября 2007 г. - Саратов, 2007. - С. 100.

23. Kamnev A.A., Tarantilis P.A., Sadovnikova J.N., Antonyuk L.P., Polissiou M.G. Instrumental analysis of bacterial cells grown under different stress conditions using diffuse reflectance infrared Fourier transform (DRIFT) spectroscopy // 5th Internat. Conf. on Instrumental Methods of Analysis, 30 Sept. - 4 Oct. 2007, Patras, Greece. Abstract Book, Abstr. No. P141.

24. Антонюк Л.П., Смирнова B.E., Соболева Е.Ф., Садовникова Ю.Н., Шелудько А.В. Растительные лектины могут использоваться ризобактериями как факторы роста // Микроорганизмы и биосфера: Сб. материалов междунар. науч. конф., 19-20 ноября 2007 г. - Москва, 2007. - С. 7-8.

25. Смирнова В.Е., Садовникова Ю.Н., Шелудько А.В., Антонюк Л.П. Лектин пшеницы как возможный фактор роста для Azospirillum brasilense Sp245, растущей на полужидкой среде // Вавиловские чтения: Материалы междунар. научно-практ. конф., посвящ. 120-летию Н.И. Вавилова, 26-30 ноября2007 г.-Ч. 1,-Саратов, 2007.-С. 191-192.

26. Тугарова А.В., Садовникова Ю.Н., Камнев А.А. Исследование накопления поли-3-гидроксобугарата Azospirillum brasilense Sp7 в стрессовых условиях // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. 4-й межрег. конф. мол. ученых, Саратов, 14-16 окт. 2008 г. С. 40.

Подписано в печать 17.03.2009. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объём 12,0 печ. л. Тираж 100 экз. Отпечатано с готового оригинал-макета в Центре оперативной полиграфии «Интехника», Корпорация «Софит». 410028, Саратов, ул. Чернышевского, 153

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Садовникова, Юлия Николаевна

Список сокращений и условных обозначений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Бактерии рода Azospirillum-, современные представления о систематике, физиологии и экологии.

1.1.1. Систематика рода Azospirillum и наиболее изученные представители.:.

1.1.2. Азоспириллы - природные симбионты высших растений

1.1.3. Строение клеточной поверхности A. brasilense.

1.1.4. Агглютинин зародышей пшеницы и его влияние на метаболизм азоспирилл.

1.2. Стресс у бактерий.

1.2.1. Стрессовые факторы и стрессовые ответы бактерий

1.2.2. Реакция азоспирилл на некоторые виды стресса.

1.3. Регуляция роста у бактерий

1.3.1. Важность биокоммуникативных процессов в развитии бактериальных популяций.

1.3.2. Регуляция роста бактерий молекулярными сигналами полипептидной природы.

1.3.3. Регуляция роста бактерий низкомолекулярными метаболитами.

1.4. Инфракрасная спектроскопия как исследовательский инструмент в современной микробиологии.

2. Материалы и методы исследования.

2.1. Выращивание бактериальных культур.

2.2. Оценка ростовых параметров культуры.

2.2.1. Оценка общего числа клеток в культуре.

2.2.2. Определение числа жизнеспособных клеток.

2.2.3. Оценка биомассы после завершения культивирования

2.2.4. Кривые роста культур А. ЬгаБИете.

2.3. Постановка экспериментов по длительному культивированию А. ЬгаяНете.

2.4. Двойная радиальная иммунодиффузия.

2.5. Приготовление образцов клеток для ИК-спектроскопии

2.6. ИК-фурье-спектроскопия в режиме диффузного отражения

2.7. Статистическая обработка полученных результатов.

3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1. Влияние агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) на рост

А. ЬгаБИете.

3.1.1. АЗП как возможный фактор роста для А. ЪгаБИете на полужидкой среде.

3.1.2. АЗП как возможный фактор роста для А. ЪгаБйете на жидкой среде.

3.2. Исследование клеточных ответов Л. ЬгаБИепле на стресс и влияние лектина пшеницы с использованием ИК-фурье-спектроскопии.

3.2.1. Изменения в составе клеток Л. ЪгаБИепБе Бр245 в ответ на комплексный стресс.

3.2.2. Изменения в составе клеток Л. ЬгаБИепБе вр245, выращенных в аэробных условиях в присутствии АЗП

3.3. Адаптация А. ЬгаяИете к стрессам при длительном культивировании.

3.3.1. Торможение роста Л. ЪгаБИете Бр245 при различных видах стресса.

3.3.2. Влияние стрессовых температурных условий и питательных сред (трофический фактор) на состояние культуры при длительном культивировании.

3.4. Исследование накопления внутриклеточного поли-3-гидроксобутирата (ПГБ) А. ЬгаяПете в различных стрессовых условиях при длительном культивировании методом ИК-фурье-спектроскопии.

3.4.1. Динамика накопления ПГБ клетками на различных стадиях развития культуры в различных стрессовых условиях.

3.4.2. Сравнительный анализ внутриклеточного ПГБ на различных стадиях развития культуры.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности клеточных ответов Azospirillum brasilense на воздействие стрессовых факторов и лектина пшеницы"

Актуальность темы. Почвенные бактерии рода АгоьртИит уже в течение трех десятилетий находятся под пристальным вниманием исследователей в лабораториях многих стран. Это связано с многообразием свойств данного рода бактерий, важнейшим из которых является их способность образовывать ассоциативные и эндофитные симбиозы со многими высшими растениями и стимулировать их рост и развитие, фиксируя азот атмосферы, продуцируя и выделяя в почву фитогормоны и ряд других физиологически активных соединений (ВайЬап е1 а1. 2004).

Азоспириллы обладают значительным адаптивным потенциалом, что позволяет им занимать различные экологические ниши и предопределяет их встречаемость практически во всех климатических поясах. Из 12 описанных к настоящему моменту видов азоспирилл пока лишь два вида - А. ЬгазИете и А. Нро/егит - используются в качестве компонентов бактериальных препаратов и биоудобрений в агробиотехнологии; им же посвящена основная масса исследований. Тем не менее, если, к примеру, в Южной Америке ВгайугЫго-Ыит ]аротсит используется для инокуляции около 25 млн. гектаров сои, то площади пшеницы и маиса, занятые с использованием коммерческих препаратов на основе АгозршИит, занимают пока лишь 0.5 млн. гектаров (Сазй-о-Золутзк! ег а1.у 2007).

Одним из факторов, способствующих формированию устойчивых ассоциаций почвенных бактерий с растениями, выживаемости микросимбионта в почве и стабильности его фитостимулирующего действия, является его устойчивость к стрессам. Это тем более важно ввиду того, что формирование растительно-микробных ассоциаций, в том числе и при использовании биопрепаратов для инокуляции культурных растений, происходит в постоянно меняющихся условиях обитания. Последние включают в себя различные неблагоприятные факторы окружающей среды, многообразие которых с учетом обширной "географии" азоспирилл очень велико. В связи с этим исследование механизмов адаптации азоспирилл к стрессовым условиям, в том числе при их длительном воздействии, является актуальной задачей и представляет интерес не только для выявления фундаментальных закономерностей, способствующих пониманию стратегии выживания бактерий в неблагоприятных условиях, но имеет и важное прикладное значение.

Экспериментально доказано, что в преодолении многими бактериями, включая азоспирилл, неблагоприятных и стрессовых условий важную роль играет способность синтезировать внутриклеточный резервный "запас" биополимеров, представляющих собой продукт поликонденсации (эстерифика-ции) гидроксоалкановых кислот (Kadouri et aL, 2005). У A. brasilense они представлены гомополимером ß-гидроксомасляной кислоты - поли-3-гидрок-собутиратом (ПГБ), что, по данным (Kadouri et aL, 2003), имеет значение также для колонизации бактерией корней растений. Данная способность к синтезу и накоплению* резервного биополимера, в частности, имеет принципиальное значение для увеличения сохранности, эффективности и надежности коммерческих бактериальных препаратов (Kadouri et al., 2003, 2005). Это обусловливает важность и актуальность исследований, связанных с биосинтезом и накоплением этого биополимера, имеющего также потенциальное промышленное значение в связи с его способностью к биодеградации и наличию ряда других полезных свойств (Kim and Lenz, 2001; Khanna and Srivastava, 2005; Rehm, 2007).

Существенным фактором, который, в настоящее время признан как необходимое звено в формировании устойчивой и эффективной растительно-бактериальной ассоциации, является обмен молекулярными сигналами между макропартнером (растение-хозяин) и микросимбионтом. Как показано в исследованиях последних лет (Антонюк, 2005; Антонюк и Евсеева, 2006), для ассоциативного симбиоза А brasilense с пшеницей в качестве одного из таких сигналов, вызывающих целый ряд клеточных ответов бактерии, может выступать агглютинин зародышей пшеницы (АЗП), который не только экспонирован на поверхности корня, в местах прикрепления бактерий, но и в небольших количествах может попадать в окружающую среду. Данный лектин, обладающий специфичностью к остаткам М-ацетил-О-глюкозамина (и его олигомерам), содержащимся в биополимерах клеточной поверхности азоспирилл, вызывает в клетках бактерий ряд метаболических изменений, существенных для формирования симбиоза и его функционирования.

Необходимо подчеркнуть, что все описанные для А. ЬгаБИепзе эффекты, вызванные лектином пшеницы, наблюдались в условиях азотфиксации — при росте бактерии в микроаэробных условиях в отсутствие источников связанного азота. В связи с этим представляло интерес выяснить наличие какого-либо клеточного ответа бактерии на лектин пшеницы в аэробных условиях, в том числе в условиях ассимиляции аммония, подавляющих азотфиксацию.

Как известно, успешность колонизации растения бактериями зависит в том числе и, от плотности популяции. Поскольку, с одной стороны, способность белков стимулировать размножение бактерий уже описана (Вептшёег ег а1, 1996; Мукамолова и соавт., 1999; Томова и соавт., 2005), а с другой -воздействие АЗП на метаболизм азоспириллы плейотропно (стимулируется ряд процессов, важных для- формирования растительно-бактериального симбиоза), представляло также интерес исследование возможности лектина пшеницы стимулировать размножение азоспирилл.

Все вышесказанное предопределило наш интерес к изучению особенностей клеточных ответов А. ЬгазИете при воздействии некоторых стрессовых факторов и лектина пшеницы.

Целью данной работы являлось изучение реакции А. ЬгазйепБе на некоторые виды стресса и лектин пшеницы, в том числе при длительном культивировании.

Для реализации поставленной цели в ходе исследования решали следующие задачи:

1. Исследование влияния лектина пшеницы на рост А. ЬгаяИете на жидкой и полужидкой средах.

2. Выявление клеточных ответов А. ЬгахИеше на дефицит азота в аэробных условиях в присутствии и в отсутствие лектина пшеницы методом ИК-фурье-спектроскопии.

3. Изучение состояния культуры А. ЬгаБйете при длительном культивировании в различных стрессовых условиях.

4. Исследование динамики накопления и свойств внутриклеточного поли-3-гидроксобутирата в различных стрессовых условиях при длительном культивировании А. ЬгазИете методом ИК-фурье-спектроскопии.

Научная новизна. Впервые показано, что лектин пшеницы может служить фактором роста для азоспирилл, увеличивая число жизнеспособных клеток в стационарной фазе роста при длительном воздействии как на жидкой, так и на полужидкой средах.

С помощью ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения (ДО) для штамма А. ЬгаБИете 8р245 впервые обнаружено, что в аэробных условиях при дефиците азота в среде (трофический стресс), а также в присутствии лектина пшеницы происходит перераспределение компонентов вторичной структуры клеточных белков с увеличением доли Р-структурных фрагментов.

Охарактеризовано состояние культуры А. ЬгаБИепБе (штамм Бр245) при длительном культивировании (до 30 сут) в условиях дефицита азота как в микроаэробных, так и в аэробных условиях. Обнаружено, что аэрация вызывает более резкое снижение жизнеспособности культуры азоспирилл на поздних стадиях при незначительном снижении общего числа клеток в культуре в обоих случаях.

Охарактеризовано также влияние температурных условий и состава среды на состояние культуры при длительном культивировании азоспирилл (до 30 сут) в азотфиксирующих условиях и динамика накопления поли-3-гидроксобутирата (ПГБ) клетками. С помощью ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения впервые для бактерий обнаружено, что при длительном микроаэробном культивировании в условиях дефицита азота в и среде A. brasilense накапливает ПГБ меньшей степени кристалличности, чем до достижения стационарной фазы; при этом на более поздних сроках культивирования культура в первую очередь расходует именно эту более аморфную фракцию ПГБ, характеризующуюся, по литературным данным, большей скоростью ферментативного гидролиза (более легкой "усваиваемостью").

Полученные сведения о динамике накопления клетками азоспирилл и свойствах резервного вещества (поли-3-гидроксобутирата, играющего важную роль в преодолении бактериями неблагоприятных и стрессовых условий) могут быть использованы для улучшения свойств коммерческих бактериальных препаратов, а также для разработки биотехнологических приемов производства данного промышленно ценного биополимера.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на следующих научных мероприятиях: 1-я Регион, конф. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 26-27 марта 2002 г.; 10th Eur. Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules, Szeged, Hungary, 30 Aug. - 4 Sept. 2003; 1st FEMS Congr. of European Microbiologists, June 29 - July 3, 2003, Ljubljana, Slovenia; 14th Internat. Congress of the Hungarian Society for Microbiology, 9-11 Oct. 2003, Balatonfiired, Hungary; 2-я Регион. конф. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 26-28 октября 2004 г.; Всеросс. научно-практ. конф., посвященная 117-летию Н.И. Вавилова, Саратов, 2004 г.; 9-я Междунар. пущинская школа-конференция мол. ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 18-22 апреля 2005 г.; Всеросс. конф. 12 "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты", Саратов,. 15-17 июня 2005 г.; 511' Int. Symp. "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems", 20-24 June 2005, St.rPetersburg, Russia; Междунар: конф. "Рецепция? и внутриклеточная? сигна-, лизация", Пущино, 6-9 июля 2005 г.; 30th FEBS Congress, 2-7 July, 2005,, Budapest, Hungary; Науч. конф. "Коммуникация у микроорганизмов", Москва,, 11 ноября 2005 г.; Междунар: конф; "Современная физиология растений: от молекул до экосистем", Сыктывкар; 18-24 июня 2007 г.; 10? Analytical Russian-German-Ukrainian Symp. (ARCUS'2007 - Nanoanalytics), 26-30 Aug. 2007, Saratov, Russia; Internat. Conf. "Rhizospherell" Satellite Workshop "Azospirillum VII and?. Related PGPR: Genomics, Molecular Ecology,: Plant Responses and Agronomic Significance", Aug-.30 - Sept. 01, 2007, Montpellier, France; Bcepocc: конф; с междунар: участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических, систем", Саратову 10-12 сентября! 2007 г.; 5 Internat. Conf: on Instrumental Methods of Analysis, 30 Sept. - 4 Oct. 2007, Patras, Greece; Междунар. науч. конф. "Микроорганизмы. и биосфера",

Москва; 19-20 ноября 2007 г.; 4-я Межрегион, конф. мол: уч. "Стратегия взаимодействия микроорганизмов; и растений с окружающей средой", Саратов, 14-16 октября 2008 г.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании: лаборатории биохимии ИБФРМ РАН 10 ноября 2008 г.

Публикации. По теме диссертации, опубликовано 26 работ в зарубежных и отечественных научных изданиях,, из которых 3, статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, 2 статьи в сборниках научных работ и 21 тезисы докладов в материалах научных конференций.

Основные положения; выносимые на защиту: ' • 1. Лектин пшеницы может быть фактором роста для A. brasilense: он ; увеличивает число жизнеспособных клеток в стационарной фазе на жидкойш полужидкой средах.

2. В аэробных условиях при дефиците азота в среде у А.ЬгаяИете 8р245 происходит возрастание доли белков, содержащих (3-структурные фрагменты полипептидной цепи в белковой составляющей клетки. Лектин пшеницы индуцирует такие же изменения в культуре даже в оптимальных по азоту условиях роста бактерии.

3. Л. ЬгахИете 8р245 сохраняет высокую жизнеспособность при длительном культивировании в условиях дефицита азота. Сочетание трофического и окислительного стрессов приводит к значительному сокращению числа жизнеспособных клеток в культуре.

4. При, длительном культивировании в условиях азотфиксации Л. brasilen.se накапливает поли-3-гидроксобутират меньшей степени кристалличности, чем в ранней стационарной фазе. При этом на более поздних сроках культивирования, при переходе на внутренний питательный, резерв— ПГБ, культура преимущественно расходует именно эту более аморфную фракцию биополимера.

Личный вклад соискателя. Личный вклад соискателя состоит в участии в постановке всех исследовательских задач, подготовке и проведении основной части экспериментальных работ, активном участии'в обработке, обсуждении и интерпретации всех полученных результатов, а также в подготовке публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка публикаций автора по теме диссертации, списка цитируемой литературы, содержащего 295 источника, в том числе -225 зарубежных. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков и 10 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Садовникова, Юлия Николаевна

126 Выводы

1. Впервые показано, что агглютинин зародышей пшеницы (АЗП) может служить фактором роста для АгоБртИит ЬгазИете. Установлено, что присутствие данного лектина в полужидкой среде роста бактерии увеличивает не только число жизнеспособных клеток, но и размер колоний.

2. С помощью ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения впервые показано, что в аэробных условиях при азотном голодании у А. ЬгаБйепБе Бр245 индуцируется возрастание доли белков, содержащих Р-стру-ктурные фрагменты полипептидной цепи, в белковой составляющей клетки. В присутствии АЗП такие же изменения в клетках индуцируются не только в стрессовых, но и в оптимальных по азоту условиях культивирования.

3. Установлено, что А. ЬгазИепБе 8р245 сохраняет высокую жизнеспособность при длительных (месяц и более) сроках выращивания в периодической культуре; аэрация вызывает большее, по сравнению с микроаэробными условиями культивирования, снижение числа жизнеспособных клеток на поздних сроках культивирования.

4. Охарактеризовано влияние температурного стресса, некоторых источников азота и углерода на параметры роста А. ЬгаяИете и динамику накопления клетками поли-3-гидроксобутирата при длительном (до 30 суток) культивировании бактерии.

5. С помощью ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения впервые продемонстрирована способность бактерий накапливать в клетках на разных стадиях гипобиоза культуры поли-3-гидроксобутират (ПГБ) различной степени кристалличности. Показано, что на более поздних стадиях культивирования бактерии преимущественно расходуют более аморфную фракцию ПГБ, характеризующуюся, по литературным данным, большей скоростью ферментативного гидролиза.

Список публикаций автора по теме диссертации

Статьи

1. Садовникова Ю.Н., Беспалова Л.А., Антонюк Л.П. Агглютинин зародышей пшеницы является фактором роста для бактерии Azospirillutn brasilense // Докл. Акад. наук. 2003. Т. 389, № 4. С. 544-546.

3. Kamnev А.А., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Sadovnikova J.N., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Infrared spectroscopic detection of biospecific interactions using gold nanoparticles functionalised by biomacromolecules // Proc. 10th Analytical Russian-German-Ukrainian Symposium (ARGUS'2007 - Nanoana-lytics) / Ed. by S.N. Shtykov. Saratov: Nauchnaya Kniga, 2007. P. 10-13.

4. Камнев A.A., Садовникова Ю.Н., Антонюк Л.П. Влияние дефицита азота и лектина пшеницы на состав и структуру некоторых биополимеров Azospirillum brasilense Sp245 // Микробиология. 2008. Т. 77, № 2. С. 278-281.

5. Kamnev А.А., Sadovnikova J.N., Tarantilis Р.А., Polissiou M.G., Anto-nyuk L.P. Responses of Azospirillum brasilense to nitrogen deficiency and to wheat lectin: a diffuse reflectance infrared Fourier transform (DRIFT) spectroscopic study // Microb. Ecol. 2008. V. 56, N 4. P. 615-624.

Тезисы докладов

6. Садовникова Ю.Н., Беспалова Л.А., Антонюк Л.П. Агглютини н зародышей пшеницы как фактор роста для бактерии Azospirillum brasilense Sp245 // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы 1-й Межрегион, конф. мол. ученых, Саратов, 26-27 марта 2002 г., Саратов. С. 22-23.

7. Ostakhina N.V., Bespalova L.A., Sadovnikova Y.N., Antonyuk L.P. Novel effects of wheat germ agglutinin as a molecular signal for Azospirillum brasilense

Sp245 // Abstr. 5th European Nitrogen Fixation Conference: Book of Abstracts, 610 Sept. 2002, Norwich, U.K. P. 41.

8. Sadovnikova Yu.N., Bespalova L.A., Antonyuk L.P. The lectin wheat germ agglutinin as a growth factor for Azospirillum brasilense И Abstr. 1st FEMS Congr. of European Microbiologists, June 29 — July 3, 2003, Ljubljana, Slovenia. — Book of Abstracts. - P. 416.

9. Antonyuk L.P., Bespalova L.A., Sadovnikova Yu.N., Smirnova V.E., Tugarova A.V. The lectin wheat germ agglutinin as a molecular signal for Azospirillum brasilense: new data// 11th Int. Congr. on Molecular Plant-Microbe Interactions, 18-26 July, 2003, St. Petersburg. Book of Abstracts. P. 306.

10. Tugarova A.V., Sadovnikova Yu.N., Kamnev A.A., Antonyuk L.P.', Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Responses of the rhizobacterium Azospirillum brasilense to nitrogen starvation and to wheat lectin: a DRIFT spectroscopic study // 10th Eur. Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules. Book of Abstracts / Ed. by Szalontai В., Kota Z. - Szeged, Hungary, 30 Aug. - 4 Sept. 2003. - P. 91.

11. Sadovnikova Yu.N., Bespalova L.A., Ostakhina N.V., Antonyuk L.P. Communication in the Azospirillum brasilense — wheat symbiosis // 14th Internat. Congr. of the Hungarian Society for Microbiology, Balatonfiired, Hungary, 9-11 Oct. 2003. Book of Abstracts. - P. 177.

12. Sadovnikova Yu.N., Berezhnov A.V., Bespalova L.A., Antonyuk. L.P. Plant lectin, wheat germ agglutinin, can probably increase the density of Azospirillum brasilense in the wheat rhizosphere 11 Rhizosphere-2004, 12-17 September, 2004, Munich, Germany. Book of Abstracts. - P. 117.

13. Садовникова Ю.Н., Беспалова. JI.А., Антонюк JI.П. Растения пшеницы могут стимулировать рост ризобактерий Azospirillum brasilense П Вавиловские чтения - 2004. Материалы Всеросс. научно-практ. конф., посвящ. 117-летию Н.И. Вавилова: Сб. науч. статей. Саратов, 2004. С. 57-59:

2-й Регион, конф. мол. ученых, Саратов, 26-28 октября 2004. - Саратов: Изд-во "Научная книга", 2004. - С. 23.

15. Садовникова Ю.Н., Кучинский С.В., Антонюк Л.П. Активация и торможение роста эндофитной ризобактерии Azospirillum brasilense 7/ "Биология - наука XXI века": Материалы 9-й Междунар. пущинской школы-конф. мол. ученых, Пущино, 18-22 апреля 2005. - С. 215.

16. Садовникова Ю.Н., Камнев А.А., Кучинский С.В., Валиев Р.Ш.,

Антонюк Л.П. Спектроскопические подходы к изучении реакции на стресс у бактерии Azospirillum brasilense II Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Материалы Всеросс. конф., Саратов, 15-17 июня 2005. — Саратов: Изд-во "Научная книга", 2005. - С. 79-81.

17. Kamnev А.А., Dykman L.A., Antonyuk L.P., Sadovnikova Yu.N., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Biopolymers conjugated with gold nanoparticles: FTIR spectroscopic study and detection of biospecific interactions // 5th Int. Symp. "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems", 20-24 June 2005, St.-Petersburg, Russia. Book of Abstracts, Abstr. No. 0-019.

21. Tugarova A.V., Smirnova V.E., Sadovnikova Yu.N., Schelud'ko A.V., Ilchukova A.V., El-Registan G.I., Antonyuk L.P. Growth in Azospirillum brasilense is regulated with high- and low-molecular-weight signals // Internat. Conf. "Rhizosphere П" Satellite Workshop "Azospirillum VII and Related PGPR: Genomics, Molecular Ecology, Plant Responses and Agronomic Significance", Aug. 30 - Sept. 01,2007, Montpellier, France. - Abstr. Book. - P. 14.

23. Kamnev А.А., Tarantilis Р.А., Sadovnikova J.N., Antonyuk L.P., Polissiou M.G. Instrumental analysis of bacterial cells grown under different stress conditions using diffuse reflectance infrared Fourier transform (DRIFT) spectroscopy // 5th Internat. Conf. on Instrumental Methods of Analysis, 30 Sept. — 4 Oct. 2007, Patras, Greece. Abstract Book, Abstr. No. P141.

26. Тугарова А.В., Садовникова Ю.Н., Камнев А.А. Исследование накопления поли-3-гидроксобутирата Azospirillum brasilense Sp7 в стрессовых условиях // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. 4-й межрег. конф. мол. уч., Саратов, 14-16 окт. 2008 г. С. 40.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям -доктору химических наук A.A. Камневу и доктору биологических наук Л.П. Антонюк за чуткое руководство и огромную помощь в работе.

Автор также признателен д.б.н. Л.А. Дыкману за критическое прочтение работы и ценные замечания, д.б.н. Л.Ю. Матора за консультативную помощь, к.б.н. Г.Л. Бурыгину за постановку экспериментов иммунодиффузии. Также хочется выразить благодарность к.б.н. A.B. Шелудько за советы в экспериментах по выращиванию азоспириллы на полужидкой среде; к.б.н. Л.И. Поздняковой за консультативную помощь.

Автор выражает особую признательность настоящим и бывшим сотрудникам лаборатории к.б.н. Л.А. Беспаловой, к.б.н. В.Е. Смирновой, к.б.н. Е.Ф. Соболевой за помощь в проведении экспериментов, ценные методические советы и внимание в ходе выполнения работы. Отдельную признательность хочется выразить к.б.н. A.B. Тугаровой за помощь, постоянное внимание и огромную поддержку в ходе выполнения работы и подготовки диссертации.

Неоценимая помощь в проведении спектроскопических измерений была оказана в ходе данного исследования коллегами из Лаборатории химии Аграрного университета г. Афины, Греция - проф. П.А. Тарантилисом и проф. М.Г. Полиссиу, за что автор приносит им глубокую благодарность.

Искренне благодарю также всех моих друзей и коллег за поддержку и внимание к данной работе.

132

Заключение

В результате проведенных исследований сделан еще один шаг на пути к пониманию механизмов формирования и функционирования растительно-бактериальных симбиозов с участием азоспирилл — повсеместно распространенных ризобактерий. В дополнение к ряду описанных эффектов лектина пшеницы (АЗП) - белка стрессового ответа и сигнальной молекулы растения-хозяина по отношению к его микросимбионту, А. ЬгаБИепхе (Антонюк, 2005; Антонюк и Евсеева, 2006) — получены новые данные о пролонгированном пролиферативном влиянии АЗП на бактерии в различного типа средах. При этом на полужидких средах, моделирующих условия существования азоспирилл, более близкие к природным, АЗП влияет также и на размер колоний, что, вероятно, связано со стимуляцией не только роста, но и коллективной подвижности. Таким образом, показано, что фитостимулирующие ризобакте-рии (РОРИ) способны использовать белки растения-хозяина для повышения плотности клеток в популяции, что, в свою очередь, может способствовать формированию эффективного ассоциативного симбиоза.

Как уже упоминалось в обзоре литературе, способность бактерий в ответ на молекулярные сигналы белковой природы активнее размножаться описана в 90-х годах прошлого столетия и в настоящее время изучается на ряде моделей. Ни для одной из них еще не предложен механизм действия белка-сигнала; остаются пока неизвестными и молекулярные механизмы, обеспечивающие увеличение числа жизнеспособных клеток в культурах азоспирил-лы под влиянием АЗП.

Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что азоспириллы достаточно эффективно адаптируются к длительным стрессам. В частности, при дефиците азота, соответствующем высокому соотношению в среде, они накапливают поли-3-гидроксобутират (ПГБ). Применение в данной работе современного высокоинформативного инструментального метода -ИК-фурье-спектроскопии в режиме диффузного отражения - для изучения особенностей клеточных ответов азоспирилл на АЗП и стрессовые условия позволило выявить новые эффекты, которые трудно зафиксировать иными методами: изменения во вторичной структуре клеточных белков; накопление ПГБ меньшей степени кристалличности (легче "усваивающегося") в процессе преодоления длительного стресса; преимущественное расходование этой более легко усваивающейся фракции ПГБ при переходе бактерий на "внутренние резервы", что иллюстрирует высокий адаптивный потенциал культуры.

Как показали проведенные нами эксперименты, азоспириллы сохраняют высокую жизнеспособность (не менее

105 10б кл./мл) в ходе периодического культивирования в течение месяца. Эти данные хорошо согласуются с проведенным недавно исследованием (см. Мулюкин и соавт., Микробиология, 2009, т. 78, № 1), в котором охарактеризованы цистоподобные покоящиеся формы двух штаммов, А. ЬгаяИете 5р7 и 8р245. Авторы вышеупомянутой работы провели электронно-микроскопическое изучение 4-месячных клеток обоих штаммов и показали, что покоящиеся формы азоспирилл имеют ряд структурных особенностей и существенно отличаются от вегетативных (активно размножающихся) клеток бактерии.

Это, в свою очередь, дает возможность предположить, что частичное расходование клетками А. ЪгаБИеше ПГБ, зарегистрированное нами методом ИК-фурье-спектроскопии, связано со структурными преобразованиями, которые бактерии претерпевают в процессе образования цистоподобных покоящихся форм. Структурная перестройка клеток азоспириллы, вероятно, затрагивает и мажорные антигены поверхности азоспириллы — ЛПС1 и ЛПСИ, выявляемые с помощью иммунодиффузии со штаммоспецифически-ми антителами. В случае вегетативной культуры выявляются оба эти антигена, в то время как в случае 36-часовой культуры один из них выявляется плохо. Очевидно, что для детального выяснения того, как меняется поверхность азоспириллы при переходе от деления к покою, потребуются дальнейшие исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Садовникова, Юлия Николаевна, Саратов

1. Аитонюк Л.П. Растительные лектины как факторы коммуникации всимбиозах // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под. Ред. В.В. Игнатова. — М.: Наука,2005.-С. 118-159.

2. Антонюк Л.П. Регуляция метаболизма бактерии Azospirillum brasilense Sp245: особенности азотного обмена и влияние лектина пшеницы (агглютинина зародышей пшеницы): Дис. . докт. биол. наук. М., 2002. -384 с.

3. Антонюк Л.П., Игнатов В.В. О роли агглютнина зародышей пшеницы в растительно-бактериальном взаимодействии: гипотеза и экспериментальные данные в ее поддержку // Физиол. растений. 2001. Т. 48, № 3. С. 427-433.

4. Бабоша A.B. Изменение содержания агглютинина зародышей пшеницы врастениях, обработанных перекисью водорода // Прикл. биохим. микробиол. 2006. Т. 42, № 2. - С. 247- 251.

5. Бухарин О.В., Гинцбург A.JL, Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005. - 366 с.

6. Вахитов Т.Я. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях: Автореферат дис. докт. биол. наук, С.-Петербург, 2007. 40 с.

7. Вахитов Т.Я., Петров J1.H. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий // Микробиология. 2006. Т. 75, № 4. - С. 483-488.

8. Волкогон В.В., Мамчур А.Е., Лемешко C.B., Миняйло В.Г. Азоспириллы -эндофиты семян злаковых растений // Микробиол. журн. 1995. Т. 57, № 1.-С. 14-19.

9. Волошин С.А., Капрельянц A.C. Межклеточные взаимодействия вбактериальных популяциях // Биохимия. 2004. - Т. 69. - С. 1555-1564.

10. Воробьева Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость бактерий // Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т. 40, № 3. - С. 261-269.

11. Дорофеев В.Ф., Удачин P.A., Семенова JI.B., Новикова М.В., Градчанинова О.Д., Шитова И.П., Мережко А.Ф., Филатенко A.A. Пшеницы мира. -Ленинград: ВО "Агропромиздат", 1987. С. 560.

12. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus, штамм 504 // Микробиология. 2001. Т. 70, № 6. С. 811-819.

13. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Дыкман Л.А., Игнатов В.В. Роль полисахаридсодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерий на корнях проростков пшеницы // Микробиология. 2001. Т. 70, № 1. - С. 45-50.

14. Иосипенко O.A. Лектины в процессе взаимодействия пшеницы с ассоциативными микроорганизмами рода Azospirillum: Автореф. дис. канд. биол. наук, М., 1996.-23 с.

15. Иосипенко А.Д., Сергеева Е.И., Антонюк Л.П., Игнатов В.В. Влияниелектина пшеницы на синтез индолил-3-уксусной кислоты у Azospirillum brasilense Sp245 // Докл. Акад. наук. 1994. Т. 336, № 4. С. 559-561.

16. Итальянская Ю.В., Никитина В.Е., Пономарева Е.Г., Аленькина С.А.

17. Лектины бактерий рода Azospirillum // Изучение и применение лектинов. Тарту: Изд-во Тарт. ун-та, 1989. Т. 1. - С. 179-184.

18. Камнев A.A., Тугарова A.B., Антонюк Л.П. Эндофитный и эпифитный штаммы Azospirillum brasilense по-разному отвечают на стресс, вызываемый тяжелыми металлами // Микробиология. 2007. Т. 76, № 6. - С. 908-911.

19. Карпунина Л.В., Вишневецкая O.A., Богатырев В.А., Никитина В.Е., Итальянская Ю.В. Определение локализации лектинов, агглютининов почвенных азотфиксирующих бактерий // Микробиология. 1995. Т. 64, № 4. - С. 453-457.

20. Коннова С.А., Брыкова О.С., Сачкова O.A., Егоренкова О.В., Игнатов В.В. Исследование защитной роли полисахаридсодержащих компонентов капсулы бактерий Azospirilum brasilense II Микробиология. 2001. - Т. 70, №4.-С. 503-508.

21. Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Исследованиеиммунохимической гетерогенности липополисахаридов Azospirillum brasilense II Микробиология. 2008. Т. 77, № 2. С. 196-200.

22. Мукамолова Г.В., Янг М., Келл Д.Б., Капрельянц A.C. Бактериальные феромоны и клеточное деление // Успехи биол. химии. 1999. Т. 39. С. 225-254.

23. Мунблит В Я., Тальрозе ВН., Трофимов В.И. Термоинактивация микроорганизмов. М.: Наука, 1985. - С. 248.

24. Никитина В.Е. Лектины азоспирилл: свойства, биологическая активность и перспективы их практического использования. Дис. . д-ра биол. наук. -Саратов, 2001.-310 с.

25. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Пономарева Е.Г., Савенкова H.H. Изучение роли лектинов клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы // Микробиология. 1996. Т. 65, № 2. - С. 165-170.

26. Никитина В.Е., Галкин М.А., Котусов В.В., Крапивина Л.И., Игнатов В.В. Влияние лектина пшеницы на азотфиксирующую активность Azospirillum brasilense II Прикл. биохим. микробиол. 1987. Т. 23, № 3. С. 389-392.

27. Никитина В.Е., Пономарева Е.Г., Аленькина С.А., Коннова С.А. Участие бактериальных лектинов клеточной поверхности в агрегации азоспирилл // Микробиология. 2001. Т. 70, № 4. с. 471-476.

28. Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л., Степаненко И.Ю., Эль-Регистан Г.И.

29. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75, № 4. - С. 489-496.

30. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69, № 3. С. 309-327.

31. Олескин A.B., Кировская Т.А. Популяционно-коммуникативпое направление в микробиологии // Микробиология. 2006. Т. 75, № 4. С. 440-445.

32. Ревина A.A., Ларионов О.Г, Кочетова М.В., Луцик Т.К., Эль-Регистан Г.И. Спектрофотометрические и хроматографические исследования продуктов радиолиза аэрированных водных растворов алкилрезорцинов // Изв. АН. Сер. хим. 2003. № 11. С. 2257-2263.

33. Редькина Т.В. Механизм положительного влияния бактерий рода Azospirillum на высшие растения // Биологический азот в сельском хозяйстве СССР / Под ред. E.H. Мишустина. М: Наука, 1989. - С. 132-141.

34. Сумарока М.В., Антонюк Л.П., Игнатов В.В. Характеристика фосфолипид-ного состава мембран бактерий Azospirillum brasilense И Микробиология. 1998. Т. 67, № 1.С. 61-64.

35. Томова А.С., Щегловитова О.Н., Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Размножение Salmonella typhimurium и продукция ФНОа в организме мышей после острого у-облучения // Иммунология. 2004. № 2. С. 93.

36. Томова А.С., Терехов А.А., Тихонова О.В., Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Стимуляция бактериального роста цитокином ФНОа в системе in vitro // Мол. генетика, микробиол. вирусол. 2005. № 2. С. 37-38.

37. Троценко Ю.А. Иванова Е.Г. Доронина Н.В. Аэробные метилотрофные бактерии как фитосимбионты // Микробиология. 2001. Т. 70, № 6. С. 725-736.

38. Файн А.В., Березовский И.Н., Чехов В.О., Украинский Д.Л., Есипова Н.Г. Двойные и вилочковые водородные связи в а-спиралях глобулярных белков // Биофизика. 2001. Т. 46, № 6. С. 969-977.

39. Хайруллин P.M. Роль анионных пероксидаз и агглютинина зародыша в реакциях пшеницы на грибную инфекцию: Дис. . докт. биол. наук, Казань, 2001.-292 с.

40. Хмель И.А. Quorum-sensing регуляция экспрессии генов: фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий // Микробиология. 2006. Т. 75, № 4.- С. 457-464.

41. Шакирова Ф.М., Безрукова M.B. Изменение содержания АБК и лектина в корнях проростков пшеницы под влиянием 24-эпибрассинолида и засоления // Физиол. растений. 1998. Т.45, № 3. С. 451-455.

42. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В. Современные представления опредполагаемых функциях лектинов растений // Журн. общ. биол. 2007. -Т. 68, №2.-С. 98-114.

43. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Хайруллин P.M. Увеличение уровня лектина в проростках пшеницы под влиянием солевого стресса // Изв. РАН. Сер. биол. 1993. № 1. С. 142-145.

44. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Шаяхметов И.Ф. Влияние теплового стресса на динамику накопления АБК и лектина в клетках каллуса пшеницы // Физиол. растений. 1995. Т. 42. С. 700-702.

45. Шелудько A.B., Кацы Е.И. Образование на клетке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. Т. 70, № 5. - С. 662-667.

46. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин A.JL, Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. - Т. 75, № 4. - С. 446-456.

47. Эшмен Р.Ф. Активация лимфоцитов // Иммунология / Под ред. У. Пола. М: Мир, 1987. - Т. 1. - С. 414-466.

48. Achouak W., Heulin T., Pages J.-M. Multiple facets of bacterial porins // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199, N 1. P. 1-7.

49. Aertsen A., Michiels C.W. Stress and how bacteria cope with death and survival // Crit. Rev. Microbiol. 2004. V. 30, N 4. P. 263-273.

50. Agarwala-Dutt R., Tilak K.V.B.R., Rana J.P.S. Isolation of Azospirillum from the interior of various parts of some graminaceous plants // Zentralbl. Mikrobiol. 1991.-V. 146, N3.-P. 217-219.

51. Antonyuk L.P., Fomina O.R., Galkin M.A., Ignatov V.V. The effect of wheat germ agglutinin on dinitrogen fixation, glutamine synthetase activity and ammonia excretion in Azospirillum brasilense Sp245 // FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 110, N3. P. 285-290.

52. Bacilio-Jimenez M., Aguilar-Flores S., del Valle M.V. Endophytic bacteria in rice seeds inhibit early colonization of roots by Azospirillum brasilense II Soil Biol. Biochem. 2001. -V. 33. P. 167-172.

53. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. V. 29, No. 8. P. 924-929.

54. Bashan Y. Azospirillum plant growth-promoting strains are nonpathogenic on tomato, pepper, cotton, and wheat // Can. J. Microbiol. 1998a. V. 44. - P. 168-174.

55. Bashan Y. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture // Biotechnol. Adv. 1998b. V. 16, N 4. - P. 729-770.

56. Bashan Y., Holguin G. A proposal for the division of "plant growth-promoting rhizobacteria" into two classifications: biocontrol-plant growth-promoting bacteria and plant growth-promoting bacteria // Soil Biol. Biochem. 1998. V. 30. P. 1225-1228.

57. Beney L., Gervais P. Influence of the fluidity of the membrane on the response of microorganisms to environmental stresses // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57. P. 34-42.

58. Berg R.H., Tyler M.E., Novick N J. Biology of Azospirillum sugarcaneassociation. I. Enhancement of nitrogenase activity // Appl. Environ. Microbiol. 1980.-V. 39.-P. 642-649.

59. Bermudez L.E., Petrofsky M., Shelton K. Epidermal growth factor binding protein in M. avium and M. tuberculosis: a possible role in the mechanism of infection // Infect. Immun. 1996. V. 64, N 8. P. 2917-2922.

60. Bhavanandan V.P., Katlic A.W. The interaction of wheat germ agglutinin with sialoglycoproteins. The.role of sialic acid // J. Biol. Chem. 1979. V. 254, N 10.-P. 4000-4008.

61. Bloembergen S., Holden D.A., Hamer G.K., Bluhm T.L., Marchessault R.H. Studies of composition and crystallinity of bacterial poly(/?-hydroxybutyrate-co-/?-hydroxyvalerate) // Macromolecules. 1986. V. 19. P. 2865-2871.

62. Bonnin S., Besson F., Gelhausen M., Chierici S., Roux B. A FTIR spectroscopy evidence of the interactions between wheat germ agglutinin and N-acetylglu-cosamirie residues // FEBS Lett. 1999. V. 456. P. 361-364. *

63. Bottini R., Cassan F., Piccoli P. Gibberellin production by bacteria and itsinvolvement in plant growth promotion and yield increase // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. V. 65. P. 497-503.

64. Brady P.G., Vannier A.M., Banwell J.G. Identification of the dietary lectin, wheat germ agglutinin in human intestinal contents // Gastroenterology. 1978. — V. 75.-P. 236-239.

65. Bredenbruch F., Geffers R., Nimtz M., Buer J., Haussler S. The Pseudomonas aeruginosa quinolone signal (PQS) has an iron-chelating activity // Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 1318-1329.

66. Brencic A., Winans S.C. Detection of and response to signals involved in host-microbe interactions by plant-associated bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005. V. 69, N1. P. 155-194.

67. Brown J.C., Hunt R.C. Lectins // Int. Rev. Cytol. 1978. V. 52. P. 277-349.

68. Burdman S., De Mot R., Vanderleyden J., Okon Y., Jurkevitch E. Identification and characterization of the omaA gene encoding the major outer membrane protein of Azospirillum brasilense IIDNA Sequence. 2000. V. 11. P. 225-257.

69. Byler D.M., Susi H. Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra // Biopolymers. 1986. V. 25, N 3. P. 469-487.

70. Cammue B.P.A., Broekaert W.F., Kellens J.T.C., Raikhel N.V., Peumans W.J. Stress-induced accumulation of wheat germ agglutinin and abscisic acid in roots of wheat seedlings // Plant Physiol. 1989. V. 91. - P. 1432-1435.

71. Cassan F.D., Lucangeli C.D., Bottini R., Piccoli P.N. Azospirillum spp. metabolize 17, 17-2H2. gibberellin A20 to [17, 17-2H2] gibberellin A! in vivo by rice mutant seedlings // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. - P. 763-767.

72. Castellanos T., Ascencio F., Bashan Y. Starvation-induced changes in the cell surface of Azospirillum lipoferum IIFEMS Microbiol. Ecol. 2000. V. 33, N 1. P. 1-9.

73. Castro-Sowinski S., Herschkovitz Y., Okon Y., Jurkevitch E. Effects ofinoculation with plant growth-promoting rhizobacteria on resident rhizosphere microorganisms // FEMS Microbiol. Lett. 2007. V. 276, N 1. P. 1-11.

74. Choma A., Lorkiewicz Z., Russa R. Analysis of Azospirillum lipopolysaccharides // Abstr. 9th Int. Congr. on Nitrogen Fixation. Cancuh, Mexico, 1992. - P. 125.

75. Choma A., Russa R., Mayer H., Lorkiewicz Z. Chemical analysis of Azospirillum lipopolysaccharides // Arch. Microbiol. 1987. V. 146, N 4. - P. 341-345.

76. Choo-Smith L.-P., Maquelin K., van Vreeswijk T., Bruining H.A., Puppels G.J., Ngo Thi N.A., Kirschner C., Naumann D., Ami D., Villa A.M., Orsini F.,

77. Doglia S.M., Lamfarraj H., Sockalingum G.D., Manfait M., Allouch P., Endtz H.P. Investigating microbial (micro)colony heterogeneity by vibrational spectroscopy // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67, N 4. - P. 461-469.

78. Christiansen-Weniger C., van Veen J.A. NH4+-excreting Azospirillum brasilense mutants enhance the nitrogen supply of a wheat host // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. - P. 3006-3012.

79. Christiansen-Weniger C., Vanderleyden'J. Ammonium excreting Azospirillum sp. become intracellularly established in maize {Zea mays) para-nodules // Biol. Fértil. Soils. 1994. -V. 17. P. 1-8.

80. Cohen A.C., Bottini R., Piccoli P.N. Azospirillum brasilense Sp 245 produces ABA in chemically-defined culture medium and increases ABA content in arabidopsis plants // Plant Growth Regul. 2008. V. 54, N 2. P. 97-103.

81. Cohen-Gonsaud M., Keep N.H., Davies A.P., Ward J., Henderson B., Labesse G. Resuscitation-promoting factors possess a lysozyme-like domain // Trends Biochem Sci. 2004. V. 29. - P. 7-10.

82. Del Gallo M., Negi M., Neyra C.A. Calcofluor- and lectin-binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lip ofe rum // J. Bacterid. 1989. V. 171, N 6. P. 3504-3510.

83. Denis M., Campbell D., Gregg E.O. Interleukin-2 and granulocyte macrophage colony stimulating factor stimulate growth of a virulent strain of Escherichia coli II Infect. Immun." 1991. — V. 59.-P. 1853-1856.

84. Díaz-Zorita M., Fernández-Canigia M.V. Field performance of a liquid formulation of Azospirillum brasilense on dryland wheat productivity 11 Eur. J. Soil Biol. 2008. DOI: 10.1016/j.ejsobi.2008.07.001 (Available online 26.07.2008).

85. Diggle S.P., Gardner A., West S.A., Griffin A.S. Evolutionary theory of bacterial quorum sensing: when is a signal not a signal? // Phil. Trans. Royal Soc. B: Biol. Sci. 2007a. -V. 362, No. 1483. P. 1241-1249.

86. Plants. Berlin; Heidelberg; N.Y.: Springer, 1987. P. 155. Dubern J.-F., Diggle S.P. Quorum sensing by 2-alkyl-4-quinolones in Pseudomonas aeruginosa and other bacterial species 11 Mol. BioSystems. 2008. V. 4, N 9. P. 882-888.

87. Goldstein I.J., Poretz R.D: Isolation, physicochemical characterization and'charbohydrate-binding specificity of lectins // The Lectins: Properties,

88. Functions and Applications in Biology and Medicine / Liener I.E., Sharon N., Goldstein IJ (Eds.). Academic Press, 1986. - P. 34-247. проверить стр.!

89. Gray E.J., Smith D.L. Intracellular and extracellular PGPR: commonalities and distinctions in the plant-bacterium signaling processes // Soil Biol. Biochem. 2005. V. 37. P. 395-412.

90. Griffiths P.R., de Haseth J.A. Fourier Transform Infrared Spectrometry. New York: Wiley-Interscience, 1986.

91. Grivet J.Ph., Midoux P., Gatellier P., Delmotte F., Monsigny M. Wheat germ agglutinin: a review of recent results // Structure, Dynamics, Interaction and Evolution of Biological Macromolecules / C. Helene (Ed.). D. Redel Publ. Co., 1983.-P. 329-349.

92. Grube M., Gapes J.R., Schuster K.C. Application of quantitative IR spectralanalysis of bacterial cells to acetone-butanol-ethanol fermentation monitoring // Anal. Chim. Acta. 2002. - Vol. 471. - P. 127-133.

93. Helm D., Naumann D. Identification of some bacterial cell components by FT-IR spectroscopy // FEMS Microbiol Lett. 1995. - V. 126, N 1. - P. 75-80.

94. Hense B.A., Kuttler C., Müller J., Rothballer M., Hartmann A., Kreft J.-U. Does efficiency sensing unify diffusion and quorum sensing? // Nature Rev. Microbiol. 2007. V. 5. P. 230-239.

95. Jain D.K., Patriquin D.G. Root hair deformation, bacterial attachment, and plant growth in wheat-Azospirillum associations // Appl. Environ. Microbiol. 1984. — V.48.-P. 1208-1213.

96. James E.K. Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis // Field Crops Res. 2000. V. 65. - P. 196-209.

97. Jiang W., Saxena A., Song B., Ward B.B., Beveridge T.J., Myneni S.C.B.

98. Elucidation of functional groups on Gram-positive and Gram-negative bacterial surfaces using infrared spectroscopy // Langmuir. 2004. V. 20, N 26. P. 11433-11442.

99. Jofre K., Rivarola V., Balegno H., Mori G. Differential gene expression in

100. Azospirillum brasilense Cd under saline stress // Can. J. Microbiol. 1998. V. 44, № 10. - P. 929-936.

101. Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y. Involvement of the reserve material poly-ß-hydroxybutyrate in Azospirillum brasilense stress endurance and root colonization // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69, N 6. - P. 3244-3250.

102. Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y., Castro-Sowinski S. Ecological and agricultural significance of bacterial polyhydroxyalkanoates // Crit. Rev. Microbiol. 2005. V. 31, N 2. P. 55-67.

103. Kamnev A.A. FTIR spectroscopic studies of bacterial cellular responses to environmental factors, plant-bacterial interactions and signalling // Spectroscopy. 2008a. V. 22, N 2-3. P. 83-95.

104. Kamnev A.A. Metals in soil versus plant-microbe interactions: biotic and chemicalinterferences // Plant-Microbe Interactions / Barka E.A., Clément C. (Eds.).

105. Research Signpost: Trivandrum (Kerala, India), 2008b. Chapter 13. P. 291-318.

106. Kamnev A.A. Physicochemical approaches to studying plant growth promotingrhizobacteria // Plant-Bacteria Interactions. Strategies and Techniques to

107. Promote Plant Growth / Ahmad I., Pichtel J., Hayat S. (Eds.). Wiley-VCH:

108. Weinheim, 2008c. Chapter 2. P. 19-40.

109. Kamnev A.A., Renou-Gonnord M.-F., Antonyuk L.P., Colina M., Chernyshev

110. Kapulnik Y., Okon Y., Henis Y. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation // Can. J. Microbiol. 1985a. V. 31. - P. 881-887.

111. Kapulnik Y., Gafni R., Okon Y. Effect of Azospirillum spp. inoculation on root development and NO3" uptake in wheat (Triticum aestivum cv. Miriam) in hydroponic systems // Can. J. Bot. 1985b. V. 63. - P. 627-631.

112. Kapulnik Y., Sarig S., Nur I., Okon Y., Kigel J., Henis Y. Yield increases in summer cereal crops in Israeli fields inoculated with Azospirillum II Exp. Agric. 1981. V. 17. P. 179-187.1

113. Karpati E., Kiss P., Ponyi T., Fendrik I., de Zamaroczy M., Orosz L. Interaction of Azospirillum lipoferum with wheat germ agglutinin stimulates nitrogen fixation 11. Bacterid. 1999. V. 181, N 13. P. 3949-3955.

114. Kennedy I.R., Pereg-Gerk L.L., Wood C., Deaker R., Gilchrist K., Katupitiya S. Biological nitrogen fixation in nonleguminous field crops: facilitating the evolution between Azospirillum and wheat // Plant Soil. 1997. V. 194. - P. 65-79.

115. Kenner B.A., Riddle J.W., Rockwood S.W., Bordner R.H. Bacterial identification by infrared spectrophotometry. II.: Effect of instrumental and environmental variables // J. Bacteriol. 1958. - V. 75, N 1. - P. 16-20.

116. Khammas K.M., Agtron E., Grimont P.A.D., Kaiser P. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil // Res. Microbiol. 1989. V. 140. - P. 679-673.

117. Khanna S., Srivastava A.K. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates // Process Biochem. 2005. V. 40. P. 607-619.

118. Kilpatrick D.C., McCurrach P.M. Wheat germ agglutinin is mitogenic, non-mitogenic and anti-mitogenic for human lymphocytes // Scand. J. Immunol. 1987. V. 25, N 4. - P. 343-348.

119. Kim Y.B., Lenz R.W. Polyesters from microorganisms // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2001. V. 71. P. 51-79.

120. Kirchhof G., Hartmann A. Development of gene-probes of Azospirillum based on 23S-rRNA sequences // Symbiosis. 1992. V. 13. - P. 23-35.

121. Kirchhof G., Schloter M., Aßmus B., Hartmann A. Molecular microbial ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes // Soil Biol. Biochem. 1997. V. 29. P. 853-862.

122. Magalhaes F.M.M., Baldani J.I., Souto S.M. A new acid tolerant Azospirillum species // Ann. Acad. Bras. Sci. 1983. V. 55. - P. 417-430.

123. MalhotraM., Srivastava S. An ipdC gene knock-out of Azospirillum brasilense strain SM and its implications on indole-3-acetic acid biosynthesis and plant growth promotion // Ant. van Leeuwenhoek. 2008. V. 93, N 4. P. 425-433.

124. Mariey L., Signolle J.P., Amiel C., Travert J. Discrimination, classification,identification of microorganisms using FTIR spectroscopy and chemometrics 11 Vibr. Spectrosc. 2001. - V. 26, No 2. - P. 151-159.

125. Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Shchyogolev S.Yu. Structural effects of Azospirillum lipopolysaccharides in cell suspensions // Biomacromolecules. 200L V. 2, No. 2. P. 402-406.

126. Mehnaz S., Weselowski B., Lazarovits G. Azospirillum canadense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007a. V. 57. - P. 620-627.

127. Mehnaz S., Weselowski B., Lazarovits G. Azospirillum zeae sp. nov., adiazotrophic bacterium isolated from rhizosphere soil of Zea mays II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007b. V. 57. - P. 2805-2809.

128. Mishkind M., Keegstra K., Palevitz B.A. Distribution of wheat germ agglutinin in young wheat plants // Plant Physiol. 1980. V. 66. P. 950-955.

129. Mishkind M., Raikhel N., Palevitz B.A., Keegstra K. Immunocytochemical localization of wheat germ agglutinin in wheat // J. Cell Biol. 1982. V. 92. P. 753-764.

130. Mishkind M., Palevitz B.A., Raikhel N.V., Keegstra K. Localization of wheat germ agglutinin-like lectins in various species of the Gramineae II Science. 1983a. V. 220. P. 1290-1292.

131. Mishkind M.L., Raikhel N.V., Palevitz B.A., Keegstra K. The cell biology of wheat germ agglutinin and related lectins // Chemical Taxonomy, Molecular Biology and Function of Plant Lectins / R. Alan (ed.). N.Y.: Liss Inc., 1983b. P. 163-176.

132. Misra A.K., Thakur M.S., Srinivas P., Karanth N.G. Screening of poly-(3hydroxybutyrate-producing microorganisms using Fourier transform infrared spectroscopy // Biotechnol. Lett. 2000. - Vol. 22. - P. 1217-1219.

133. Mody B., Modi V. Peanut agglutinin induced alterations in capsular andextracellular polysaccharide synthesis and ex-planta nitrogenase activity of cowpea rhizobia // J. Biosci. 1987. V. 12, N 3. P. 289-296.

134. Morita M. Molecular analysis of Physarum haemagglutinin I: lack of a signal sequence, sulphur amino acids and post-translational modifications 11 Microbiology (U.K.). 1998. V. 144, N4. P. 1077-1084.

135. Movasaghi Z., Rehman S., ur Rehman I. (2008) Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy of biological tissues I I Appl. Spectrosc. Rev. 2008. — V. 43, N 2. P. 134-179.

136. Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S., Young D.I., Young M., Kell D.B. A bacterial cytokine // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 85, No. 15. P. 8916-8921.

137. Mukamolova G.V., Turapov O.A., Young D., Kaprelyants A.S., Kell D.B., Young M. A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis // Mol. Microbiol. 2002. - N 46. - P. 623-635.

138. Naumann D. Infrared spectroscopy in microbiology // Encyclopedia of Analytical Chemistry / Meyers R.A. (Ed.). Chichester: Wiley, 2000. P. 102-131.

139. Naumann D. FT-infrared and FT-Raman spectroscopy in biomedical research // Appl*. Spectrosc. Rev. 2001. - V. 36, N 2-3. - P. 239-298.

140. Naumann-D., HelmD., Labischinski H. Microbiological characterizations by FTIR spectroscopy//Nature (U.K.). 1991. V. 351. P. 81-82.

141. Naumann D., Schultz Gh., Görne-Tschelnokow U., Hucho F. Secondary structure and temperature behavior of the acetylcholine receptor by Fourier transform infrared spectroscopy // Biochemistry (USA). 1993. V. 32. P. 3162-3168.

142. Naumann D., Keller S., Helm D., Schultz Ch., Schräder B. FT-IR spectroscopy and FT-Raman spectroscopy are powerful analytical tools for the non-invasive characterization5of intact microbial cells // J. Mol. Struct. 1995. V. 347. - P. 399-405.

143. Neyra C.A., Atkinson A., Olubayi O. Coaggregation of Azospirillum with other bacteria: basis for functional diversity I I Azospirillum VI and Related Microorganisms / Fendrik I. et al. (Eds.). Berlin: Springer, 1995. V. G37. P. 429-439.

144. Nichols P.D., Henson J.M., Guckert J.B., Nivens D.E., White D.C. Fourier transform-infrared spectroscopic methods for microbial ecology: analysis of bacteria, bacteria-polymer mixtures and biofilms // J. Microbiol. Meth. 1985. V.4.N l.P. 79-94.

145. Nosco P., Bliss L.C., Cook F.D. The association of free-living nitrogen-fixing bacteria with the roots of High Arctic graminoids // Arc. Alp. Res. 1994. V. 26.-P. 180-186.

146. Okon Y., Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum-inoculated roots // Plant Soil. 1986. V. 90, №. 1 - P. 3-16.

147. Olubayi O., Caudales R., Atkinson A., Neyra C.A. Differences in chemicalcomposition between nonflocculated and flocculated Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Microbiol. 1998. V. 44, N 4. P. 386-390.

148. Ouchterlony O., Nilsson L.A. Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis // Handbook of Experimental Immunology. Vol. 1 / Weir D.M. (Ed.). Oxford: Blackwell, 1978. Chapter 19.-P. 19.1-19.44.

149. Oust A., Moretro T., Naterstad K., Adt I., Manfait M., Kohler A. Fourier transform infrared and Raman spectroscopy for characterization of Listeria monocytogenes strains // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72, N 1. - P. 228-232.

150. Padermshoke A., Katsumoto Y., Sato H., Ekgasit S., Noda I., Ozaki Y. Melting behavior of poly(3-hydroxybutyrate) investigated by two-dimensional infrared correlation spectroscopy // Spectrochim. Acta Part A. 2005. V. A61, No. 4. P. 541-550.

151. Peng G., Wang H., Zhang G., Hou W., Liu Y., Wang E.T., Tan Z. Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56, N 6. - P. 1263-1271.

152. Pestova E.V., Havarstein L.S., Morrison D.A. Regulation of competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae by an auto-induced peptide pheromone and a two-component regulatory system// Mol. Microbiol. 1996.-V. 21.-C. 853-862.

153. Peumans W.J., Stinissen H.M., Carlier A.R. A genetic basis for the origin of six different isolectins in hexaploid wheat // Planta. 1982. V. 154. - P. 562-567.

154. Peumans W.J., Van Damme E.J., Barre A., Rouge P. Classification of plant lectins in families of structurally and evolutionarily related proteins // Adv. Exp. Med. Biol. 2001. V. 491, N 1. P. 27-54.

155. Porat R., Clark B.D., Wolff S.M., Dinarello C.A. Enhancement of growth of virulent strains of Escherichia coli by interleukin-1 // Science. 1991. V. 254. - P. 430-432.

156. Pracht J., Boenigk J., Isenbeck-Schröter M., Keppler F., Schüler H.F. Abiotic Fe(III) induced mineralization of phenolic substances // Chemosphere. 2001. -V. 44, N4. P. 613-619.

157. Raaijmakers J.M., de Bruijn I., de Kock M.J. Cyclic lipopeptide production by plant-associated Pseudomonas spp.: diversity, activity, biosynthesis, and regulation // Mol. Plant-Microbe Interact. 2006. V. 19, N 7. P. 699-710.

158. Rai S.N., Gaur A.C. Nitrogen fixation by Azospirillum spp. and effect of

159. Azospirillum lipoferum on the yield and N-uptake of wheat crop // Plant Soil. 1982. V. 69, N2. P. 233-238.

160. Redfield RJ. Is quorum sensing a side effect of diffusion sensing? // Trends Microbiol. 2002. V. 10. P. 365-370.

161. Redkina T.V., Mishustin E.N. Nitrogen-fixing microorganisms of the genus

162. Azospirillum and their relations with higher plants 11 Interrelationships between Microorganisms and Plants in Soil / Vancura V., Kung F. (Eds.). Praha: Academia, 1989. P. 263-267.

163. Rehm B.H.A. Biogenesis of microbial polyhydroxyalkanoate granules: a platform technology for the production of tailor-made bioparticles // Curr. Issues Mol. Biol. 2007. V. 9. P. 41-62.

164. Riddle J.W., Kabler P.W., Kenner B.A., Bordner R.H., Rockwood S.W.,

165. Stevenson H.J.R. Bacterial identification by infrared spectrophotometry // J. Bacteriol. 1956. - V. 72, N 5. - P. 593-603.

166. Rivarola V., Castro S., Mori G. Response of Azospirillum brasilense Cd to sodium chloride stress // Ant. van Leeuwenhoek. 1998. V. 73, N 3. - P. 255-261.

167. Rodríguez-Navarro D.N., Dardanelli M.S., Ruíz-Saínz J.E. Attachment of bacteria to the roots of higher plants // FEMS Microbiol. Lett. 2007. V. 272, N 2. P. 127-136.

168. Ruppel S., Merbach W. Effect of ammonium and nitrate on 15N2-fixation of

169. Azospirillum spp., and Pantoea agglomerans in association with wheat plant // Microbiol. Res. 1997. V. 152. - P. 377-383.

170. Schloter M., Hartmann A. Endophytic and surface colonization of wheat roots {Triticum aestivum) by different Azospirillum brasilense strains studied with strain specific monoclonal antibodies // Symbiosis. 1998. V. 25. P. 159-179.

171. Schmitt J., Hemming H.-C. FTIR-spectroscopy in microbial and material analysis // Int. Biodeterior. Biodegrad. 1998. - V. 41, N 1. - P. 1-11.

172. Schultz C., Naumann D. In vivo study of the state of order of the membranes of gram-negative bacteria by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) // FEBS Lett. 1991. - V. 294, N 1-2. - P. 43-46.

173. Schulz H., Baranska M. Identification and quantification of valuable plantsubstances by IR and Raman spectroscopy // Vibr. Spectrosc. 2007. V. 43, N l.-P. 13-25.

174. Schuster K.C. Monitoring the physiological status in bioprocesses on the cellular level // Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology / Th. Scheper, Managing Ed. Berlin; Heidelberg: Springer. - 1999. - V. 66. - P. 185-208.

175. Segura D., Cruz T., Espin G. Encystment and alkylresorcinol production by

176. Azotobacter vinelandii strains impaired in poly-(3-hydroxybutyrate synthesis // Arch. Microbiol. 2003. V. 179, N 6. P. 437-443.

177. Shakirova F.M., Bezrukova M.V., Shayakhmetov I.F. Effect of temperature shock on the dynamics of abscisic acid and wheat germ agglutinin accumulation in wheat cell culture // Plant Growth Regul. 1996. V. 19. P. 85-87.

178. Sharma S.K., Fu F.N., Singh B.R. Molecular properties of a hemagglutininpurified from type A Clostridium botulinum II J. Protein Chem. 1999. V. 18, N l.P. 29-38.

179. Shchyogolev S.Yu., Zhulin I.B. Effective method of cell agglutination analysis by lectins I I Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry. V. 7 / Kocourek J., Freed D.L.J. (Eds.). — St. Louis: Sigma Chem. Comp., 1990. P. 405-409.

180. Shiner E.K., Rumbaugh K.P., Williams S.C. Interkingdom signaling: deciphering the language of acyl homoserine lactones // FEMS Microbiol. Rev. 2005. V. 29. P. 935-947.

181. Singh U.S., Scannell R.T., An H., Carter B.J., Hecht S.M. DNA cleavage by di-and trihydroxyalkylbenzenes. Characterization of products and the roles of 02, Cu(II), and alkali // J. Amer. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 12691-12699.

182. Skerman V.B.D., Sly L.I., Williamson M., Conglomeromonas largomobilis gen. nov., sp. nov., a sodium-sensitive, mixed-flagelated organism from freshwater // Int. J. Syst. Bacterid. 1983. V. 33. - P. 300-308.

183. Somers E., Vanderleyden J., Srinivasan M. Rhizosphere bacterial signalling: a love parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 2004. V. 30. P. 205-240.

184. Spaepen S., Vanderleyden J., Remans R. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling // FEMS Microbiol. Rev. 2007. V. 31: 425-448.

185. Sreerama N., Woody R.W. Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: Comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methodswith an expanded reference set // Anal. Biochem. 2000. V. 287. P. 252-260.i

186. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixingbacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. V. 24, N 4. - P. 487-506.

187. Stephan M.P., Pedrosa F.O., Dobereiner J. Physiological studies with Azospirillum spp. // Associative N2-fixation. CRC Press: Boca Raton, Flo., 1981. P. 8-12.

188. Stinissen H.M., Peumans W.J. Recent advances in biochemistry, cell biology, physiology, biosynthesis and genetics of Gramineae lectins 11 Biochem. Pflanzen. 1985.- V. 180.-P. 85-106.

189. Sudesh K, Abe H, Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalka-noates: biological polyesters // Prog. Polym. Sci. 2000. V. 25. P. 1503-1555.

190. Tabary F., Balandreau J., Bourrillon R. Purification of the rice embryo lectin and its binding to nitrogen-fixing bacteria from the rhizosphere of rice // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. V. 119, N. 2. P. 549-555.

191. Tripathi A.K., Nagarajan T., Verma S.C., Rudulier D.L. Inhibition of biosynthesis and activity of nitrogenase in Azospirillum brasilense Sp7 under salinity stress // Curr. Microbiol. 2002. V. 44, N 5. - P. 363-367.

192. Tufariello J., Jacobs W., Chan J. Individual Mycobacterium tuberculosisresuscitation-promoting factor homologues are dispensable for growth in vitro and in vivo II Infect. Immun. 2004. V. 72. - P. 515-526.

193. Uchimiya M., Stone A.T. Redox reactions between iron and quinones: Thermodynamic constraints // Geochim. Cosmochim. Acta. 2006. V. 70, N 6. 1388-1401.

194. Vogel H., Jahnig F. Models for the structure of outer-membrane proteins of

195. Escherichia coli derived from Raman spectroscopy and prediction methods // J. Mol. Biol. 1986. V. 190, N 2. P. 191-199.

196. Votyakova T.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B. Influence of viable cells on the resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in extended stationary phase. The population effect // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 3284-3291.

197. Wang L.-H., Weng L.-X., Dong Y.-H., Zhang L.-H. Specificity and enzymekinetics of the quorum-quenching iV-acyl homoserine lactone lactonase (AHL-lactonase) // J. Biol. Chem. 2004. V. 279, N 14. P. 13645-13651.

198. Wang Y.-J., Leadbetter J.R. Rapid acyl-homoserine lactone quorum signalbiodégradation in diverse soils // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71, N 3. P. 1291-1299.

199. Westby C.A., Cutshall D.S., Vigil G.V. Metabolism of various carbon sources by Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 1983. V. 156, N 3. P. 1369-1372.

200. Whitehead N.A., Barnard A.M.L., Slater H., Simpson N.J.L., Salmond G.P.C. Quorum-sensing in Gram-negative bacteria// FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25, N 4. P. 365-404.

201. Williams P., Winzer K., Chan W.C., Cámara M. Look who's talking: communication and quorum sensing in the bacterial world // Phil. Trans. Royal Soc. B: Biol. Sci. 2007. V. 362, No. 1483. P. 1119-1134.

202. Wright C.S. Crystallographic elucidation of the saccharide binding mode in wheat germ agglutinin and its biological significance // J. Mol. Biol. 1980. V. 141. - №3.- P. 267-291.

203. Wu A.M., Wu J.H., Song S.C., Tsai M.S., Herp A. Studies on the binding of wheat germ agglutinin (Triticum vulgaris) to O-glycans 11FEBS Lett. 1998. V. 440, N 3. P. 315-319.

204. Zhulin I.B., Johnson M.S., Taylor B.L. How do bacteria avoid high oxygen concentrations? // Biosci. Rep. 1997. V. 17, N 3. P. 335-342.

Информация о работе

Садовникова, Юлия Николаевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Особенности клеточных ответов Azospirillum brasilense на воздействие стрессовых факторов и лектина пшеницы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы