Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Продукция индолил-З-уксусной кислоты бактериямиAzospirillum brasilense под действием корневых экзометаболитов пшеницы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Продукция индолил-З-уксусной кислоты бактериямиAzospirillum brasilense под действием корневых экзометаболитов пшеницы"

5Г6 од

На правах рукописи

I 3 [;;!)!{ 1997

СЕРГЕЕВА

Елена Ивановна

Продукция индолил-3-уксусной кислоты бактериями АгоэртПит ЬгавМепБе под действием корневых экзометаболитов пшеницы

03.00.07-микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-1997

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) и на кафедре биохимии и биофизики Саратовского Государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Игнатов В.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Панасенко В.И., доктор медицинских наук Бородулин В.Б.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Защита состоится. __Ю97 г. на заседании диссертационного

совета Д074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г.Саратов, ул.Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб"

Автореферат разослан —1991 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

профессор Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема микробного синтеза биологически активных веществ и, в частности, фита гормонов является одной из актуальных проблем современной биологии.

Значительное распространение в почвах азотфиксирующих бактерий Azos-pirillum, а также их способность колонизировать корни злаков и увеличивать урожайность растений, стимулировало развитие исследований такого явления как ассоциативность.

Исследованиями последних лет четко установлено, что способность ассоциативных бактерий Azospirillum к синтезу фитогормонов, в частности, ин-долил-3-уксусной кислоты (ИУК), является главным их свойством, лежащим в основе позитивного воздействия на рост и развитие растений (Vander-leyden et.al., 1995, Zimmer et.al., 1989, Baibieri et.al., 1986). ИУК влияет на процесс корнеобразования: происходит изгибание, скручивание и ветвление корневых волосков, возрастают их длина и количество (Jain et.al., 1985,1984). Это, в свою очередь, ведет к увеличению активной поглощающей поверхности корней, и как следствие, к усилению роста растений. В литературе отсутствуют сведения о регуляции синтеза ИУК у бактерий под влиянием корневых выделений растения.

К актуальным аспектам практического приложения математической теории планирования эксперимента следует отнести планирование многофакторных экспериментов, разработку статистических моделей и решение на основе их анализа широкого спектра задач управления процессами, например, в системе "растение-микроорганизм". Многофакторный эксперимент, взятый за основу в настоящей работе, позволяет моделировать условия по изменению синтеза ИУК бактериями Azospirillum.

Применительно к бактериям-продуцентам фитогормонов интерес микробиологов связан с выяснением тонких механизмов управления и оптимизации процессов биосинтеза ценных препаратов фитогормональной природы.

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной работы было изучение влияния основных корневых экзометаболитов пшеницы на ИУК-синтезирующую активность бактерий Azospirillum. В связи с этим, необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние аминокислот на синтез ИУК Azospirillum brasilense Sp 245.

2. Определить влияние азотсодержащих веществ, присутствующих в корневой зоне пшеницы, на особенности синтеза ИУК Azospirillum brasilense Sp 245.

3. Определить характер действия углеродсодержащих корневых выделений пшеницы на синтез ИУК бактериями Azospirillum brasilense Sp 245.

4. Выяснить роль лектина пшеницы в продукции ИУК бактериями Azospirillum brasilense Sp 245.

Научная новизна работы.

Полученные данные об особенностях синтеза ИУК бактериями Azospirillum имеют важное значение для разработки теоретических основ ассоциатив-

ных взаимоотношений растений с микроорганизмами.

Впервые в заданных контролируемых и воспроизводимых условиях опыта получена система уравнений, в деталях описывающая процесс биосинтеза ИУК бактериями Azospirillum, в зависимости от концентрации триптофана, углеродсодержащих и азотсодержащих соединений, лектина пшеницы, присутствующих в корневой зоне пшеницы.

Азотсодержащие соединения усиливали ингибирование синтеза ИУК Azospirillum при повышении концентрации триптофана. Показана активизация процесса биосинтеза ИУК Azospirillum углеродсодержащими соединениями. Обнаружено увеличение синтеза ИУК под влиянием лектина пшеницы.

Метод математического описания процессов позволил выявить особенности синтеза ИУК бактериями Azospirillum при одновременном влиянии двух параметров. Построенные математические модели позволяют прогнозировать биосинтетическую активность азоспирилл в отношении синтеза ИУК

Практическая значимость работы.

Постановка многофакторных экспериментов позволила исследовать совокупность действия различных факторов на ИУК-продуцирующую активность микробной клетки.

Ингибирующее влияние азота на продукцию ИУК не позволяет использовать большие количества азотсодержащих препаратов на ранних этапах роста растения.

Полученные в настоящей работе сведения об активации метаболизма азоспирилл в направлении, благоприятном для роста и развития растений, могут быть использованы на практике для разработки экологически чистых агротехнологий, с применением в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе этих бактерий.

Материалы диссертационной работы нашли применение на кафедре биохимии и биофизики СГУ при подготовке спецкурса «Биологически активные вещества», а также при подготовке курсовых и дипломных работ.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Влияние азотсодержащих соединений на продукцию ИУК Azospirillum brasilense имеет двойственный характер (ингибирующий и активирующий) и определяется концентрацией триптофана.

2. Активизация синтеза ИУК Azospirillum brasilense под действием углеродсодержащих соединений.

3. Стимуляция продукции ИУК Azospirillum brasilense в присутствии лектина пшеницы.

Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики СГУ и в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в рамках темы: "Изучение молекулярных механизмов взаимодействия растений и микроорганизмов"(научный руководитель - доктор биологических наук профессор Игнатов В.В., N гос. регистрации 01890057691); частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (проект N 93-04-20680).

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: VIII Восточно-Европейском симпозиуме по азотфиксации «Nit-

rogenfix -92» (Саратов,. Россия, 1992), VI Международном симпозиуме по азотфиксации небобовых (Исмаилия, Египет, 1993), 16-м Международном KOHipecce по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Ивдия, 1994), 1-ой Европейской конференции по фиксации азота (Сегед, Венгрия, 1994), Международном рабочем совещании по азоспириллам и родственным микроорганизмам (Шарвар, Венгрия, 1994), Международном рабочем совещании по ассоциативным взаимодействиям азотфиксирующих бактерий с растениями (Саратов,Россия, 1995), III Международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, Россия, 1995), VIII Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям растение-микроорганизм (Ноксвилл, США, 1996), 2-ой Европейской конференции по азотфиксации (Познань, Польша, 1996), Международном симпозиуме по субповерхностной микробиологии (Давос, Швейцария, 1996), а также на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников, приложения. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, включает 31 таблицу и 13 рисунков. Список литерату-рых источников содержит 145 наименования.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлен литературный обзор, где обсуждены проблемы взаимоотношений почвенных микроорганизмов с растениями и рассмотрены возможные место и роль азоспирилл, как продуцентов фитогормо-нов, в микробных ризоценозах. Обсуждена роль корневых выделений пшеницы в ассоциации "растение-микроорганизм". Обобщены данные о способности Azospirillum к синтезу ИУК, а также сведения о путях синтеза ИУК и ее влияние на развитие растения.

Материалы и методы исследований

В работе использовали штамм Azospirillum brasilense Sp 245 любезно предоставленный Дж. Доберейнер (EMBRAPA, Рио-де-Жанейро, Бразилия). Выбор данного штамма связан в первую очередь с тем, что он является природным ассоциантом пшеницы, колонизирующим межклетники кортекса, сосуды центрального цилиндра и ксилемы как главного, так и боковых корней пшеницы (Dobereiner et.al., 1987; Baldani et.al., 1986). Кроме того, большое число исследований, касающихся молекулярных основ взаимодействия партнеров в системе "растение-микроорганизм", выполнено именно на этом штамме (Fendrik et.al., edit., 1995).

Культивирование бактерий проводили в конических колбах объемом 250 мл, содержащих 100 мл среды при 31°С. Для выращивания бактерий использовали синтетическую среду следующего состава (г/л): К2НР04 - 3,0; КН2Р04

-2,0; яблочная кислота - 1,0; NH4CI - 0,5; MgS04x 7Н20 - 0,2; NaCl -0,1; CaC^- 0,02; FeS04 х 7Н20 - 0,02; MnS04 х Н20 - 0,01; Na2MoO„ х 2Н20 -0,002.

В экспериментах с азотсодержащими соединениями в среду, вместо NH4C1, было добавлено (г/л): KN03 - 0,2; мочевины - 0,2; метионина - 0,2; глутами-новой кислоты - 0,2 и триптофана - 0,2. В экспериментах с углеродсодержа-щими соединениями в среду, вместо яблочной кислоты, было добавлено (г/ л): янтарной кислоты - 0,2; щавелевой кислоты - 0,2; ксилозы - 0,2; фруктозы - 0,2 и триптофана - 0,2. Конечный рН среды - 7,0.

Лектин пшеницы (WGA,"Sigma") и бычий сывороточный альбумин (БСА, "Sigma") добавляли в концентрациях 0,5 и 2,0 мг/л одновременно с посевом культуры. В экспериментах с лекгином пшеницы и БСА культуру выращивали в герметично закрытых флаконах объемом 100 мл. Для создания азот-фиксирующих условий флаконы продували газовой смесью, содержащей 99% Nj и 1% 02. Триптофан был добавлен в культуральную среду в концентрации 0,2 г/л.

Посевным материалом служила трех-суточная культура, выращенная на агаризованной среде при 31°С такого же состава.

Число клеток Azospirillum brasilense Sp 245, их размеры, а также размеры и число клеточных агрегатов во всех экспериментах оценивали методом спек-тротурбидиметрии (Щеголев с соавт.,1984). Измерение оптической плотности суспензии клеток проводили в диапазоне длин волн 400-600 нм, с шагом 50 нм на спектрофотометре СФ-46, оборудованном приставкой. Математическую обработку данных проводили на компьютере IBM РСАТ с использованием предложенной авторами программы (Рамазанов с соавт., 1985).

Чистоту культуры контролировали с помощью световой микроскопии. Использовали фазовоконтрастный микроскоп Jenaval (Германия) при увеличении изображения в 400 раз.

Для выделения ИУК культуральную жидкость центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость подкисляли соляной кислотой до рН 2 и подвергали двукратной экстракции водонасыщенным этилацета-том (1:1) по 30 мл. Экстракт упаривали при 50°С под вакуумом на роторном испарителе досуха (Unipon, Польша).

Разделение веществ этилацетатного экстракта вели в тонком слое силика-геля "Silufol UV-254" (Чехословакия) в восходящем варианте, используя в качестве элюента смесь хлороформ-этанол (16:1 по ч/ч).

Сухие образцы растворяли в 200 мкл этанола и наносили на хроматогра-фическую пластину в виде горизонтальной полосы длиной 4,0 см. В качестве маркера на пластину также наносили синтетическую ИУК фирмы "Sigma".

После хроматографирования пластины высушивали и регистрировали цвет пятен в видимом и ультрафиолетовом свете при 254 и 366 нм, соответствующие по хроматографической подвижности маркеру. ИУК, занимающую площадь такого пятна на хроматограмме, полностью счищали вместе с силика-гелем и элюировали 1 мл этанола трижды по 30 мин. Отмытый от частиц силикагеля спиртовой раствор ИУК упаривали досуха при 50°С под вакуумом. Затем сухие образцы растворяли в 1 мл этанола и добавляли 2 мл реактива Сальковского. Отобранные 2 мл раствора измеряли на Specol-221 с тол-

щиной кюветы 1 см при 530. нм. Количество ИУК определяли по формуле:

ИУК = ехр (4,748 + 1,656 DS30), где D - оптическая плотность раствора при 530 нм.

Использование реактива Эрлиха и реактива Сальковского позволило идентифицировать ИУК в этилацетатном экстракте культуральной жидкости Azospi-rillum brasilense:

1. Реактив Эрлиха. 0,8 г. п-диметиламинобензальдегида растворяли в 30 мл этанола и добавляли 30 мл концентрированной HCl. В присутствии ИУК реактив Эрлиха окрашивается в характерный синий цвет. Спиртовые растворы исследуемого образца и маркера наносили в равных количествах на хроматогра-фическую пластину, прогоняли в системе растворителей, просушивали, опрыскивали реактивом и регистрировали цвет пятен.

2. Реактив Сальковского в модификации Гордона-Вебера. (Tang et.al., 1947) 50 частей 35%-й НСЮ4и 1 часть 0,5%-го FeCl3 . В присутствии ИУК реактив Сальковского окрашивался в малиновый цвет.

Математическую обработку данных, полученных в многофакторном эксперименте, проводили, используя стандартные системы расчета в программе Stat-graphics .

Полученные результаты и их обсуждение

Одним из важных вопросов в диагностике функционального состояния партнеров в системе «растение-микроорганизм» является выяснение особенностей синтеза ИУК бактериями Azospirillum brasilense при одновременном воздействии различных концентраций триптофана и соединений, выступающих в качестве источника азота и углерода для микробной клетки.

Для этого провели анализ совместного действия триптофана и некоторых соединений, содержащихся в корневых выделениях пшеницы, на синтез ИУК Azospirillum brasilense .

Выбранный диапазон концентраций триптофана и других корневых экзо-метаболитов пшеницы от 20 до 180 мг/л приближен к ризосфере растения в естественных условиях (Берестецкий с соавтор., 1979,1986; Берестецкий, 1982).

1. Влияние аминокислот на синтез индолил-З-уксусной кислоты бактериями Az.ospirillum brasilense Sp 245

Известно, что в корневых выделениях пшеницы содержатся различные аминокислоты (Азарова, 1986). Показано, что потребление аминокислот и их влияние на рост и фиксацию азота различается у штаммов Azospirillum ( Hartman et. al., 1988). Данные о действии аминокислот на бактериальный синтез ИУК практически отсутствуют.

Первоначально была проведена с помощью реактива Сальковского качественная реакция на ИУК непосредственно в культуральной жидкости A.brasi-lense Sp 245, выращенной в присутствии одной из аминокислот. Из анализируемых растворов, в которых содержание каждой аминокислоты составляло 100 мг/л среды, наибольшее окрашивание наблюдали в культуральной жидкости с

метионином. Тонкослойная хроматография (ТСХ) этилацетатных экстрактов культуральной жидкости позволила более точно оценить происходящие изменения.

Сравнение образцов на хроматограмме показало, что размер и интенсивность пятна ИУК, соответствующего образцу с метионином были наименьшими. Появлялись пятна индольной природы с другими значениями Rf . Подобный результат наблюдали также в случае роста азоспирилл на среде с добавлением глутаминовой кислоты.

Метионин и глутаминовая кислота являются ключевыми аминокислотами, влияющими на процессы обмена. Глутаминовая кислота играет важную роль в аминокислотном метаболизме растений и микробов. Метионин, предшественник синтеза этилена у микроорганизмов, является сильным ингибитором их роста (Лукнер, 1979).

По данным ТСХ и качественной идентификации реактивом Эрлиха нами показано, что синтез ИУК и сопутствующих индолов азоспириллами, культивируемыми на средах с добавлением различных аминокислот, происходил различно. По характеру продукции ИУК аминокислоты разделены на две группы :

1) Аспарагиновая кислота, аргинин, лизин, фенилаланин, цистеин.

2) Метионин, глутаминовая кислота, гистидин, лейцин, валин, глицин, серин, тирозин, глутамин, аланин, пролин, изолейцин, аспарагин.

В присутствии аминокислот первой группы в среде культивирования клетки азоспирилл синтезировали только ИУК В присутствии аминокислот второй группы азоспириллы синтезировали ИУК и вещество индольной природы, Rf которого меньше Rf маркера.

Реактив Сальковского позволил оценить общий уровень индолов, синтезируемых микробной клеткой. Появление пятен с различными значениями Rf на хроматограмме говорило о том, что этот общий уровень складывался из ИУК и индолсодержащих соединений, возможно, промежуточных продуктов биосинтеза ИУК .

Присутствие глутаминовой кислоты и метионина в культуральной жидкости приводило к тому, что содержание ИУК понижалось и увеличивалось образование интермедиатов индольной природы.

Анализ совместного действия триптофана и глутаминовой кислоты в интервале от 20 до 180 мг/л на синтез ИУК культурой A.brasilense Sp 245 представлен на графике, изображенном на рис.1.

В области содержания глутаминовой кислоты от 20 до 100 мг/л происходило увеличение продукции ИУК на фоне концентраций триптофана от 20 до 60 мг/л, а при содержании глутаминовой кислоты от 100 до 180 мг/л синтез ИУК уменьшался. Повышение уровня триптофана в среде приводило к увеличению ингибирующего эффекта глутаминовой кислоты. Наблюдалось линейное возрастание продукции ИУК с увеличением концентрации триптофана в культуральной среде.

Зависимость продукции ИУК клетками азоспирилл от наличия в среде культивирования триптофана (а) и глутаминовой кислоты (Ь) была нами описана уравнением:

ИУК = 0,31а + 0,42b - 0,002b2 - 0,001ab

Квадратичный эффект фактора (а) - триптофана статистически незначим и определить его оптимальное значение практически невозможно. &го означает, что в интервале концентраций 20180 мг/л содержание триптофана в среде не лимитировало синтез И УК. Это позволило предположить, что зона оп-тиума фактора (а) лежала в области более высоких концентраций. Присутствие в уравнении коэффициента взаимодействия факторов указывает на существование совместного влияния триптофана и глутаминовой кислоты на продукцию ИУК.

Для исследования влияния метио-нина на триптофанзависимый синтез ИУК А.ЪгахИеже Бр 245 была построена трехмерная модель (рис.2).

Метионин, добавленный в культу-ральную среду в тех же концентрациях, вызывал аналогичные изменения в биосинтезе ИУК, что и глутаминовая кислота. Характер влияния был менее выраженным. Это подтверждается и более низким значением коэффициента для метионина (0,26) в уравнении регрессионной зависимости синтеза ИУК, чем для глутаминовой кислоты (0,42).

Зависимость концентрации ИУК в культуральной жидкости азоспирилл от содержания триптофана (а) и метионина (с) приведена в уравнении:

ИУК = 0,31а + 0,26с - 0,001с2 -0,001ас

Таким образом, с одной стороны, триптофан оказывал мощное стимулирующее влияние на синтез ИУК. С другой стороны, активирующее начало глутаминовой кислоты и метионина заметно подавлялось по мере увеличения его концентрации в среде культивирования.

Глутаминовая 149 к-та,мг/л

Рис.1. Влияние глутаминовой кислоты на триптофанзависимый синтез ИУК бактериями А&арМШт Ьгапкте Бр 245.

80

Метионин, I40 мг/л

<4?

2. Влияние источников азота на синтез индолил-З-уксусной кислоты бактериями А.ЬгазИете Бр 245

Рис.2. Влияние метионина на триптофанзависимый синтез ИУК бактериями А~05рт11ит ЬгазИепзе Бр 245.

Для изучения влияния азотсодержащих соединений на синтез ИУК нами были взяты следующие источники азота: нитрат калия, хлорид аммония и мочевина. Вероятность попадания мочевины, нитрата калия и хлорида аммония в корневую зону растения

связана с внесением их как минеральных удобрений. Кроме того, ион аммония является непосредственным участником многих биохимических процессов, протекающих в ризосфере.

Был проведен многофакторный эксперимент для изучения влияния двух параметров: триптофана и источника азота от 20 до180 мг/л на синтез ИУК Abrasillense Sp 245.

Во всех экспериментах наблюдалась четкая закономерность: триптофан в выбранной области концентраций стимулировал синтез ИУК; зависимость прямопропорциональна.

График зависимости синтеза ИУК азоспириллами от концентраций триптофана и нитрата калия представлен на рис.3.

Характер влияния нитрата калия на продукцию ИУК клетками азоспирилл определялся количеством триптофана в среде. Если при концентрации триптофана от 20 до 140 мг/л с увеличением концентрации KN03 происходило увеличение продукции ИУК, то при концентрации триптофана от 140 до 180 мг/л - синтез ИУК снижался. Причем, максимальная продукция ИУК наблюдалась при 20 мг/л KN03 и 180 мг/л триптофана в среде культивирования.

140

20 80 X

Рис.3. Влияние нитрата калия на тригггофанзависимый синтез ИУК бактериями Azospirillum brasilense Sp 245.

KNOj, мг/л

Уравнение, характеризующее ИУК-продуцирующую активность азоспирилл в присутствии триптофана (а) и KN03 (d), имеет вид: ИУК = 0,24а + 0, Id - 0,001ad Поверхность отклика синтеза ИУК в ответ на изменения концентраций триптофана и хлорида аммония в интервале от 20 до 180 мг/л изображена на рис.4.

Зависимость синтеза ИУК от содержания NH4C1 в среде культивирования напоминала куполообразный вид. Ингибирующий эффект NH4C1 на продукцию ИУК клетками азоспирилл становился выраженным только в диапазоне высоких концентраций триптофа-

Рис.4. Влияние хлорида аммония на трипгофанзависимый синтез ИУК бактериями Azospirillum brasilense Sp 245.

на. Полученная зависимость продукции ИУК от наличия в среде культивирования триптофана (а) и хлорида аммония (f) описана нами уравнением: ИУК = 0,48а + 0,38f - 0,002а2 - 0,002?

Оптимум для концентрации NH4C1 составлял 100 мг/л, что соответствовало максимальной продукции ИУК. Отсутствие коэффициента взаимодействия факторов в уравнении означало, что совместного влияния NH4C1 и триптофана на продукцию ИУК не оказывалось.

Анализ совместного действия триптофана и мочевины в концентрации 20 - 180 мг/л на синтез ИУК A.brasilense Sp 245 отражен на графике, представленном на рис.5.

Добавление мочевины в питательную среду приводило к уменьшению продукции ИУК Минимальный синтез ИУК приходился на область от 20 до 120 мг/л содержания мочевины, причем этот интервал растягивался с увеличением концентрации триптофана в среде.

Зависимость концентрации ИУК в культуральной жидкости азоспирилл от содержания триптофана (а) и мочевины (h) приведена в уравнении:

ИУК= 29,82 + 0,28а - 0,42h + 0,002h2 - 0,001 ah

Появление константы в уравнении и величина коэффициентов для мочевины говорит о достаточно сильном воздействии этого фактора на продукцию ИУК клетками азоспирилл.

Таким образом, повышение концентрации триптофана, выступающего в качестве необходимого предшественника биосинтеза ИУК, приводило к увеличению ингибирующего влияния в присутствии азотсодержащих соединений по сравнению с незначительными его концентрациями. Так, мочевина при концентрации триптофана 180 мг/л в среде культивирования A.brasilense оказывала в 3,5 раза более сильный ингибирую-щий эффект, чем при его содержании - 20 мг/л; нитрат калия - в 2 раза; метионин и глутаминовая кислота в 1,8 раза, соответственно. Взятые нами соединения: аминокислоты, NH4C1 и мочевина являются донорами аминогрупп, которые могут оказывать тормозящее влияние на дезаминирование триптофана в процессе его превращения в ИУК. Это подтверждалось и наиболее сильным ингибирующим эффектом мочевины, которая является донором двух аминогрупп (таб.1).

Рис.5. Влияние мочевины на трипто-фанзависимый синтез ИУК бактериями AzospiriUum brasilense .Sj) 245.

Иядол-З-ацетамнд

Антранилов&я кислота

4

Индол 4 Серии Триптофан

Ивдолил-3- Ивдолал-3-пировиноградвая молочная кислота' кислота

/

Индолил-З-ацетальдегмд

Трнптофол

Индолил-3-уксусная кислота

Рис.6. Бактериальные пути синтеза ИУК из триптофана,обнаруженные у МоартИит ЬгазИете; а - индолпируватный путь, катализируемый трансаминазой, б - индол-3-ацетамиднй путь.

Таблица 1.

Количество ИУК, продуцируемое бактериями AzospiriUum brasilense Sp 245, выращенными с различными источниками азота при концентрации триптофана 180 мг/л.

Источник азота Максимальное кол-во ИУК, мг/л Минимальное кол-во ИУК, мг/л

Мочевина 70 36

Глугаминовая кислота 64 40

Мегионин 60 45

Хлорид аммония 58 45

Нитрат катая 45 40

Установлено, что акцепторы аминогрупп очень эффективны при деза-минировании триптофана, но требуется специфическая концентрация каждого из них для получения максимального количества ИУК из определенной концентрации триптофана (Тгиекеп Л. а1., 1972).

Предполагают, что у Ьгай1ете возможны различные пути

превращения триптофана в ИУК (рис.6), в частности, через индол-3-ацета-мид, индолил-3-пировиноградную кислоту и вероятен триптофан-независимый синтез ИУК (Уап(1ег1еу(1еп й. а1., 1995). И, возможно, азот оказывает различное действие на эффективность превращения триптофана в ИУК в зависимости от пути метаболизма и от концентрации триптофана. При рассмотрении графических зависимостей синтеза ИУК от различных источников азота можно отметить, что увеличение концентрации триптофана приводит к усилению ингибирования продукции ИУК. Можно предположить, что при наличии в среде большой концентрации триптофана включается путь индолил-3-пировиноградной кислоты, в которую триптофан превращается при дезаминировании, а присутствие азота в среде в качестве донора аминогрупп ингибирует этот путь, что приводит к снижению синтеза ИУК. С другой стороны, при незначительных концентрациях триптофана в среде менее выражен ингибирующий эффект источников азота, что свидетельствует в пользу индол-3-ацетамидного пути у озртПит ЬгазИеюе. Можно сделать предположение о переключении путей синтеза ИУК у Аго$рт11ит ЬгахИепве. Кроме того, индолил-3-пировиноградная кислота и индолил-3-аце-тальдегид являются нестабильными соединениями и восстанавливаются до триптофола и индолил-3-молочной кислоты. Однако, неоднозначность действия различных источников азота на синтез ИУК не позволяет сделать окончательные выводы о роли и механизме действия соединений азота на синтез ИУК.

3. Влияние Сахаров на синтез индолил-3-уксусной кислоты бактериями АгюртИит ЬгазИете Бр 245

Потребление углеродсодержащих субстратов микробной клеткой и возникающих при этом метаболических откликов на стационарной фазе ее роста - малоизученное явление.

Зависимость синтеза ИУК азоспириллами от присутствия углерода в ка-

чесгве источника энергии и питания в среде культивирования, исследовали, используя сахара - галактозу, сахарозу, мальтозу, глюкозу, фруктозу, ксилозу.

Утилизация Сахаров Azospirillum brasilense Sp 245 имела ряд особенностей: количество ИУК, продуцируемое азоспириллами, выращенными на галактозе, сахарозе, мальтозе и глюкозе, мало отличалось от контроля, а внесение фруктозы и ксилозы - повышало продукцию гормона.

Более глубокое изучение этого влияния показало следующее .

В экспериментах с углеродсодержа-щими веществами подтвердилась закономерность, наблюдаемая ранее: сгимули- иук, рующий эффект триптофана на синтез ИУК усиливался с повышением его концентрации в среде культивирования.

Фруктоза в концентрации от 20 до 180 мг/л в незначительной степени стимулировала ИУК-продуцирующую активность у Azospirillum brasilense Sp 245 (рис.7), что доказывалось относительно малой величиной коэффициента для фруктозы в уравнении регрессионной зависимости: ИУК = 0,23а + 0,0003g -0,001а2 + 0,0004ag, где g - концентрация фруктозы. Максимальный уровень ИУК, равный 60 мг/л, наблюдался при добавлении максимальных количеств триптофана и фруктозы в культуральную среду.

Поверхность отклика триптофанзависимого синтеза ИУК от концентрации ксилозы для Azospirillum brasilense Sp 245, описана уравнением: ИУК

= 0,30а + 0.28k - 0,001k2 - 0,001ka, где k - концентрация ксилозы. Графическое изображение, построенное на основе данного уравнения, представлено на рис.8.

Нужно отметить, что ксилоза в концентрации от 20 до 100 мг/л в среде культивирования стимулировала синтез ИУК, а повышение ее концентрации от 100 до 180 мг/л снижало гормональную продукцию.

Величина коэффициентов в уравнении регрессионной зависимости для триптофана (0,30) и ксилозы (0,28) показывает, что их воздействие на микробную продукцию ИУК практически одинаково. Таким образом, изучение действия Сахаров на триптофанзависимый синтез ИУК Azospirillum brasilense Sp 245 обнаружило, что наиболее оптимальным источником углерода являлась

Влияние фруктозы на триптофанзависимый синтез ИУК бактериями Azospirillum brasilense Sp 245.

а

>i s

20

100

Ксилоза, мг/л

20 О«' V 180 ^

Рис. 8. Влияние ксилозы на триптофанзависимый синтез ИУК бактериями Azospirillum brasilense Sp 245.

фруктоза. В целом, сахара являются мало перспективными субстратами для поддержания биосинтеза ИУК.

4. Влияние органических кислот на синтез индолил-3-уксусной кислоты бактериями Azospirillum brasilense Sp 245

Характер действия органических кислот на триптофанзависимый синтез ИУК бактериями Azospirillum brasilense Sp 245 изучали на примере янтарной и щавелевой кислот. Так как, другие из органических кислот не угилизовывались клетками азоспирилл.

Трехмерные модели,объясняющие особенности синтеза ИУК Azospirillum brasilense Sp 245 под влиянием щавелевой кислоты, янтарной кислоты и триптофана в концентрации от 20 до 180 мг/л в среде культивирования, представлены на рис.9.

Анализ действия органических кислот на фитогормональную продукцию азоспирилл показал их положительное влияние. Увеличение концентрации органических кислот приводило к увеличению количества ИУК

Зависимости продукции ИУК клетками азоспирилл от наличия в среде культивирования янтарной кислоты (т), щавелевой кислоты (п) и триптофана (а) описывались уравнениями: ИУК = 0,085а + 0,038т + 0,OOlarn ИУК = 0,21а + 0,046п + 0,001а2 Отсутствие коэффициента взаимодействия между триптофаном и щавелевой кислотой в уравнении означало, что процессы влияния этих двух факторов на третий идут независимо друг от друга. При этом, следует заметить, что в этом случае максимальная продукция ИУК (60 мг/л) была выше, чем в присутствии янтарной кислоты (50 мг/л), где этот коэффициент имелся. Стимулирующее действие триптофана в присутствии янтарной кислоты менее выражено.

5. Влияние лектина пшеницы на синтез индолил-З-уксусной кислоты бактериями Azospirillum brasilense Sp 245

В литературе имеются сведения о доступности одного из метаболитов пшеницы, лектина (агглютинина зародышей пшеницы) для контакта с бактериями. Показано, что лектин находится в кончиках боковых корней и кор-

60.00 , 50.00 "s 40.00 X 30.00 s 2 ООО

180 но 100 Л*

50

» «

^0.00 >1

Зо.оо

20 „. 60

Щавелевая к-та, мг/л

180

Рис. 9. Влияние щавелевой и янтарной кислот на триптофанзависимый синтез ИУК бактериями МозртПит ЬгазНете Бр 245.

невых чехликах , клетки которых постоянно отделяются, и расслизняются, приводя к его высвобождению из вакуолей (М1зЫапс1 е1 а1.,1982). Кроме того, промывание корней пшеницы водой позволяет обнаружить в смыве лектин (М^Ькт*! е^ а1., 1980). Ранее было показано, что лектин, обнаруживаемый в местах локализации ассоциативных бактерий, будучи добавленным в незначительных концентрациях (Ю-* - 10'9 М) к МояртИит ЬгазИеюе Бр 245, стимулировал такие важные для ассоциации функциональные системы клеточного метаболизма, как азотфиксация и экскреция аммония (увеличение происходило в 5.3 и 12.9 раз соответственно) (Апи>пуик е1. а1., 1993). Поскольку, синтез ИУК бактериями относится к числу значимых для эффективности функционирования ассоциации признаков, важно было выяснить, распространяется ли стимулирующее влияние лектина пшеницы на синтез этого фи-тогормона.

Бычий сывороточный альбумин (БСА) был использован в эксперименте, в качестве контроля,как белок, не обладающий лектиновой активностью.

Зависимость концентрации ИУК в культуральной жидкости азоспирилл

Рис. 10. Влияние лектина пшеницы, БСА и хлорида аммония на синтез ИУК бактериями АговртИит Ьга$Иете 5р245.

от содержания лектина пшеницы (X,) и 1Ш4С1 (У) приведена в уравнении:

ИУК = 78,6 + 151,IX, - 43,ЗУ- 59,9Х,2-40,8Х1У

Графическое изображение зависимости, построенное на основе данного уравнения, представлено на рис.10, а.

Зависимость продукции ИУК А. ЬгазИете 5р 245 от наличия в среде культивирования БСА (X) и ЫН4С1 (У) (рис.10, б) описана уравнением:

ИУК = 59,8 - 4,Щ - 44,0У + 7,4x3т

Из анализа экспериментальных данных следовало, что лектин пшеницы в диапазоне исследованных концентраций существенно стимулировал ИУК -продуцирующую активность А.ЬгахИете Бр 245. Как видно из рис. 10, б замена лектина пшеницы на БСА приводила к исчезновению стимулирующего эффекта: в присутствии БСА азоспириллы синтезировали количества ИУК, достоверно не отличавшиеся от контрольного. Присутствие в среде ИН4С1

снижало продукцию ИУК во всех исследованных случаях. При добавлении к культуре А.Ьга$Иеп$е 5р 245 лектина максимальная концентрация ИУК на безазотистой среде составила 173 мг/л, в то время как присутствие хлорида аммония снижало эту величину до 130 мг/л. В сравнении с контролем превышение концентрации ИУК было двукратным. Обращает на себя внимание тот факт, что максимальная стимуляция синтеза ИУК в присутствии МН4С1 достигалась при несколько меньших концентрациях лектина пшеницы (1,0 мг/л), чем в азотфиксирующих условиях (1,2 мг/л).

По степени влияния на синтез ИУК АгохртИит Ьга$Иете Бр 245 изученные факторы располагались в следующем порядке:

Таблица 2.

Влияние изученных факторов на синтез ИУК бактериями

МозрМПит ЬгазПете Бр 245, полученное с помощью уравнений регрессии.

Факторы Степень влияния фактора на продукцию ИУК, %

Триптофан 93-43

Хлорид аммония 89-26

Лекгин пшеницы 38

Мочевина 17

Фруктоза 14

Ксилоза 12

Щавелевая кислота 9

Янтарная кислота 7

Глутаминовая кислота 3

Метионин 3

Нитрат калия 2

Выводы

1. Установлено, что с повышением содержания триптофана в среде культивирования Azospirillum brasilense Sp 245 от 20 до 180 мг/л наблюдается линейное увеличение количества ИУК.

2. Показано, что ингибирующее влияние на синтез ИУК Azospirillun brasilense Sp 245, вызываемое внесением в среду выращивания KN03, NH4C1, мочевины, метионина и глутаминовой кислоты, носит концентрационный характер и возрастает по мере увеличения количества триптофана.

3. Обнаружено, что лекгин пшеницы в диапазоне концентраций 0,5-2,0

мг/л существенно стимулирует продукцию ИУК Azospirillum brasilense Sp 245.

4. Сравнение влияния изученных факторов на синтез ИУК Azospirillum brasilense Sp 245 позволило выделить три группы соединений, оказывающих: 1) стимулирующий эффект - триптофан, щавелевая кислота, янтарная кислота, фруктоза; 2) ингибирующий эффект - мочевина; 3) стимулирующий эффект от 20 до 100 мг/л переходит в ингибирующий от 100 до 180 мг/л -ксилоза, хлорид аммония, глутаминовая кислота, метионин, нитрат калия.

5. Ингибирующее влияние азота на синтез ИУК Azospirillum brasilense Sp 245 не позволяет использовать большие количества азотсодержащих препаратов на ранних этапах роста растения.

Список публикаций по теме диссертации

1. А.Д. Иосипенко, Е.И. Сергеева, Л.П. Антонюк, В.В. Игнатов. Влияние лектина пшеницы на синтез ИУК у Azospirillum brasilense Sp 245. // Доклады РАН, 1994, Т. 336, С. 559-561.

2. Ignatov V.V., StadnikG.I., Iosipenko О.А., Selivanov N.Yu., Iosipenko A.D., Sergeeva E.I. Interaction between the partners of association "Wheat-Azospirillum brasilense Sp 245". In: Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics,Physiology,Ecology, Edited by Fendrik I., NATO ASI Series V. 37. Springer-Verlag. Berlin. 1995, p. 271-278.

3. Iosipenko A.D., Sergeeva E.I., Ignatov V.V. Influence of methionine on the tryptophan-dependent indole-3-acetic acid production of Azospirillum brasilense. / / Abstr. VIII Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen Fixation "Nitro-genfix-92", Sept.22-26, 1992, Saratov,Russia, p. 60.

4. AntonyukL.P., Fomina O.R., Sergeeva E.I., Iosipenko A.D., Ignatov V.V. Wheat lectin as a signal molecule altering metabolism of Azospirillum brasilense Sp 245, a wheat associate, in a beneficial way to the plant //Abstr. VI International Symposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes., Sept. 6-10, 1993, Ismailia, Egypt, p. 119.

5. AntonyukL.P., Fomina O.R., Sergeeva E.I., Semyonov S.V., Iosipenko A.D., Ignatov V.V. Wheat lectin possibly serves as a signal molecule in Azospiril-/и/м-wheat association. J I Abstr. 16th International Congress on Biochemistry and Molecular Biology, Sept. 19-22, 1994, New Dehli, India, p. 288.

6. Ignatov V.V., AntonyukL.P., Iosipenko A.D., Iosipenko O.A., Selivanov N.Yu., Sergeeva E.I.t Stadnik G.I., Fomina O.R. Interactions between partners in the association "Whcat-Azospirillum brasilense Sp 245". "NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms", Sept. 4-7, 1994, Sarvar, Hungary.

7. Iosipenko A.D., Sergeeva Е.1.д AntonyukL.P., Ignatov V.V. The effect of a wheat lectin on indole-3-acetic acid synthesis in Azospirillum brasilense Sp 245.// Abstr. 1st European Nitrogen Fixation Conference "Safe Application of Genetically Modified Microorganisms in the Environments", August 28-September 3, 1994, Szeged, Hungary, p.89.

8. Sergeeva E.I., Iosipenko A.D., AntonyukL.P.,Ignatov V.V. Effect of wheat

lectin on indole-3-acetic acid synthesis in Azospirillum brasilense Sp 245. // Abstr. 3rd International Symposium on Bioorganic Chemistry, September 17-23, 1995, Dagomys, Russia, p. 112.

9. Sergeeva E.I., Iosipenko A.D., Zakharova EA. Effect of different nitrogen sources on tryptophan-dependent indole-3-acetic acid synthesis by Azospirillum brasilense Sp 245. // Abstr. 8th International Congress Molecular Plant-Microbe Interactions, July 14-19, 1996,Knoxville,USA, Abstr. N. H-116.

10. Zakharova E.A., Sergeeva E.I., Iosipenko A.D. Effect of B-group vitamins on indole-3-acetic acid production by Azospirillum brasilense Sp 245. // Abstr. 8th International Congress Molecular Plant-Microbe Interactions, July 14-19, 1996, Knoxville, USA, Abstr. N. H-148.

11. Sergeeva E.I., Iosipenko A.D. Peculiarities of amino acid consumption by Azospirillum brasilense Sp 245 during indole-3-acetic acid biosynthesis. // Abstr. 2nd European Nitrogen Fixation Conference, September 8-13, 1996, Poznan, Poland, p. 179.

12. Sergeeva E.I., Iosipenko A.D. Regulation of indole-3-acetic acid synthesis in Azospirillum brasilense Sp 245 in response to a molecular signal. // Abstr. The International Symposium on Subsurface Microbiology, 15-21 SmtRmhrr 1QQ6 Davos, Switzerland, p. 194.