Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние лектина пшеницы на метаболизм Azospirillum brasilense

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние лектина пшеницы на метаболизм Azospirillum brasilense"

•' 0 (к

На правах рукописи

ФОМИНА Оксана Романовна

Влияние лекшина пшеницы на метаболизм АгоэрМИит brasilen.se

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов, 1996

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) и на кафедре биохимии и биофизики Саратовского Государственного Университета им, Н.Г. Чернышевского.

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Игнатов В.В., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Антонюк JI. П.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН Шуб Г.М., доктор биологических наук, старший научный сотрудник Щербаков А.А.

Ведущая организация: Институт биохимии им А.Н. Баха РАН

Защита состоится ■17июня а !3С гна заседании Диссертационного совета Д074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, г. Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке РНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан _ _1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ассоциации или, другими словами, ассоциативные симбиозы - колонизация бактериями корней и других органов высших растений без образования выраженных морфологических структур, но с позитивным воздействием бактерий на рост и развитие растений, - широко распространенное явление (Умаров, 1986; Okon (ed.), 1994). Большое число почвенных микроорганизмов способно образовывать ассоциации с высшими растениями, однако наиболее интенсивно исследуемыми являются бактерии рода Azospirillum (Dobereiner, Pedroza, 1987).

Взаимодействие азосиирилл с растениями хорошо описано на уровне физиологических эффектов. Это: (а) усиление корнеобразования с соответствующим увеличением поглотительной способности корней как результат продукции фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) бактериями (Zimmer et al., 1980); (б) азотфиксация микропартнера и передача ее продукта, аммония, макропартнеру (Умаров, 1986); (в) повышение нитратредуктазной активности корней после колонизации растения. Предполагают также, что такие свойства азоспирилл как способность ингибировать рост патогенных грибов (Редькина, 1989), синтезировать сидерофоры (Bachhawat et al., 1987) и бакгериоцины (Del Gallo et al., 1994) также вносят свой вклад в усиление роста и развития растения. Однако, остается неясным, какие молекулярные сигналы лежат в основе установления и эффективного функционирования растительно-бактериальных ассоциаций, как макропаргнер влияет на метаболизм микропартнера, и наоборот.

В этой связи большой интерес вызывают лектины, так как известно, что они выполняют информационные функции в различных биологических системах ( De Pater et al., 1995, Lyubimova et al., 1990).

В частности, в ассоциации пшеница-азоспирилла интересен в этом отношении агглютинин зародышей пшеницы (лекгин пшеницы, агглютинин зародышей пшеницы, АЗП, wheat germ agglutinin, WGA ). В литературе имеются сведения о том, что лектин пшеницы присутствует не только в зародыше, но и в корнях и доступен для контакта с бактериями (Mishkind et

al., 1980). Крометого, показан факт связывания лектина пшеницы с клетками азоспириллы (Yagoda-Shagam et al., 1988, Del Gallo et al., 1990, Del Gallo et al., 1989). К началу наших исследований было также известно, что лекгин пшеницы стимулирует азотфиксирующую активность у Azospirillum brasilense (Никитина с соавт., 1987).

Совокупность имеющихся в литературе сведений определила выбор целей и задач настоящей работы.

Цель работы. Основной целью данной работы явилось получение экспериментальных данных о влиянии лектина пшеницы как одного из метаболитов макропаргнера ассоциации пшеница-азоспирилла на метаболизм Azospiriüum brasilense Sp 245, природного accomiama пшеницы, В работе решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать влияние лектина пшеницы на азотный метаболизм азоспириллы;

2. Выяснить, вызывает ли лекгин пшеницы активацию нитрогеназы или индуцирует биосинтез фермента;

3. Оценить влияние лектина пшеницы на биосинтетические процессы азоспириллы и параметры роста культуры.

Научная новизна работы.

1. Впервые показано, что в ассоциации пшеница-азоспирилла один из метаболитов макропартнера, лектин пшеницы, рецептируясь на поверхности азоспириллы оказывает существенное влияние на ее азотный метаболизм.

2. Впервые описана способность растительного лектина вызывать усиление биосинтетических процессов у ассоциативной бактерии, азоспириллы. Показана способность лектина пшеницы вызывать индукцию биосинтеза нитрогеназы и глугаминсиететазы у Azospirillum brasilense.

3. На основе полученных экспериментальных данных предложена гипотеза о сигнальной роли лектина пшеницы в ассоциации пшеница-азоспирилла.

Практическая значимость работы. В настоящее время на основе азоспирилл и других ассоциативных бактерий созданы и применяются биоудобрения. Отсутствие четких и глубоких представлений о молекулярных основах взаимодействия партнеров в ассоциативных симбиозах обуславливает

как недостаточно высокую эффективность, так и недостаточную широту использования бактериальных удобрений в земледелии. Использование больших доз азотных удобрений в интенсивных технологиях, таким образом, является реальностью и влечет за собой целый комплекс экологических проблем: загрязнение пиши, воды и кормов нитратами, сдвиг экологических цепей в водоемах (как следствие цветение воды и ее техническая непригодность), загрязнение атмосферы закисью азота.

Учитывая огромную опасность нитратного загрязнения для здоровья людей, низкий процент усвоения и дороговизну азотных удобрений - крайне важна в настоящее время разработка экологически чистых агротехнологий для растениеводства.

Получение в настоящей работе сведения об активации метаболизма азоспириллы в направлении, благоприятном для роста и развития растений, могут быть использованы на практике для разработки экологически чистых агротехнологий, в том числе для создания сортов растенийс высокой способностью к обеспечению себя биологическим азотом, а также для повышения эффективности применения в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе этих бактерий.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Влияние лекгина пшеницы на азотный метаболизм Azospirillum brasilense

2. Активация биосинтетических процессов у Azospirillum brasilense под влиянием лектина пшеницы.

Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики СГУ и в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в рамках темы: "Изучение молекулярно-генетических механизмов узнавания, контакта к обмена метаболитами азоспирилл и культурных паков" (научный руководитель профессор Игнатов В.В., Nroc. регистрации 01860024516); частично данная работа получила финансовую поддержку от Российского фонда фундаментальных исследований (проект N 95-04-11473).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на IV Всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, Россия, 1992), VIII Восточно-Европейском симпозиуме по азотфиксации "Nitrogenfíx - 92" (Саратов, Россия, 1992), Российско - немецком рабочем совещании по

молекулярной биологии и биотехнологии растений (Москва, Россия, 1992), VI Международном симпозиуме по азотфиксации небобовых (Исмаилия, Египет, 1993), Всесоюзной конференции "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации" (Москва, Россия, 1993), 16-м Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индия, 1994), 7-м Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Прага, ЧСФР, 1994), Международном рабочем совещании по азоспириллам и родственным микроорганизмам (Шарвар, Венгрия, 1994), 9-м Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, Россия, 1995), 3-й Международной конференции по молекулярному узнаванию (Сингапур, 1995), 10-м Международном конгрессе по азлтфиксашш (Санкт-Петербург. Россия, 1995). Международном рабочем совещании по ассоциативному взаимодействию азотфиксируюших бактерий с растениями (Саратов, Россия, 1995). 23-й конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (Базель, Швейцария, 1995), 6-й международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии (Москва, Россия, 1995 ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 135 страницах .машинописного текста, включает 3 таблицы и 11 рисунхсз. Список лшературных источников содержит 210 наименований, в том числе 180 зарубежных.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор представлен в первой главе, где дана характеристика рода Mospirillum, охарактеризован азотный обмен бактерий этого рода, рассмотрены основные типы поверхностных структур клеток и обсуждена их роль в связывании лектина пшеницы, а также в бактериально-растительных взаимодействиях. Также приведены сведения о локализации лектина пшеницы в растении. Один из разделов обзора литературы посвящен

колонизации корней пшеницы азоспириллами и их влиянию на рост и развитие растения.

Сведения об использованных материалах и методах исследования представлены отдельно во второй главе.

В работе использовали штамм Azospirillum brasilense Sp 245 любезно предоставленный Ж. Доберейнер (EMBRAPA, Рио-де-Жанейро, Бразилия).

Выбор данного штамма обусловлен тем, что он выделен из корней пшенины и является ее природным ассоциангом. Бактерии выращивали при 32°С в периодической культуре с перемешиванием на синтетической среде следующего состава, г/л: КЛР04 - 3,0; КН,РО,- 2,0; NaCl - 0,1, MgS04 х 7Н,0-0,2; СаС12- 0,02; FeS04x 7Н,0 - 0,02; MnS04xH20 - ОД; Na,Mo04 х 2Н,0 - 0,002; яблочная кислота - 5,0. Посевной материал выращивали в периодической культуре при 32°С в аэробных условиях в колбах Эрленмейера в течении 24 часов на той же среде с добавлением NH.C1 (0,5 г/л). Во всех экспериментах, за исключением тех, в которых определялась азотфиксирующая активность культуры, ее выращивали в герметично укупоренных флаконах объемом 450 мл, содержащих 250 мл среды. Газовая фаза содержала 99% N2 и 1% Ог

Лектин пшеницы выделяли из коммерческого препарата зародышей пшеницы по методу, предложенному Семеновым C.B. и Карагановой O.A. (Семенов, Карагодова, 1989). Метод включат, измельчение и обезжиривание зародышей пшеницы, экстракцию лектина слабым раствором соляной кислоты, высаливание сульфатом аммония, аффинную хроматографию на хитине, гель-фильтрацию на колонке сефадекса G-25 и лиофильное высушивание. Препарат агглютинина зародышей пшенины (Мг=3б кД) был электрофоретически гомогенным, контроль за чистотой препарата проводили перед высушиванием.

Активность глутаминсинтетазы (ГС) определяли трансферазным методом (Stadtman et al., 1970) в пермеабилизированных клетках азоспириллы. Клетки выращивали как описано выше, в течении 12 часов, затем осаждали их центрифугированием и ресуспендировали в 0,9% NaCl таким образом, чтобы плотность суспензии была равна 4 х 10' клеток/мл. Затем добавляли лектин пшеницы или другой контрольный белок. Через 10

минут к 0,25 мл термостатируемой при 37°С суспензии добавляли 0,025 мл смеси толуол + этанол (1:4) для того, чтобы сделать клетки проницаемыми для компонентов реакционной смеси. Все дальнейшие процедуры были выполнены в соответствии с методом определения активности ГС, предложенным Стэдманом (Stadtman et ai., 1970).

Степень аденилирования фермента определяли по ингибированию активности аденилированной формы ГС в трансферазной реакции в присутствии катионов Mg2+. Активность измеряли как описано выше без добавления 75 мМ MgCl2 и с добавлением. Степень аденилирования расчитывалась по предложенной авторами метода формуле (Stadtman et al., 1970).

Для определения нитрогеназной активности во флаконы объемом 10 мл, содержащие 2 мл среды, вносили 0,2 мл культуры и растили аэробно в течении 8 часов. Затем стерильно добавляли лектин пшеницы или другой контрольный белок, флаконы укупоривали герметично, воздух откачивали и добавляли газовую смесь следующего состава 02: С2Н2: N,(1:9:90) и растили далее 24 часа с перемешиванием при 32°С. Для оценки нитрогеназной активности анализировали газовую смесь на содержание этилена на газовом хроматографе (Chrom 5, ЧСФР).

Для оценки концентрации аммония в кульхуральной жидкости азоспириллы бактерии выращивати как описано выше в течение 8 часов затем добавляли лектин пшеницы или другой контрольный белок, герметически укупоривали, продували газовой смесью следующего состава: N2:02 (99:1) и растили еще 4 часадо середины логарифмической фазы роста. Затем клетки осаждали центрифугированием. Концентрацию аммония в супернатанте определяли с помошью ион-селективного электрода OP-NH3 0-7113 в комплекте с цифровым рН-метром ОР-21 (Radelkis, Венгрия).

Грубые экстракты клеток Azospirillum brasilense готовили по следующей схеме. Культуру азоспириллы выращивали как описано выше. Далее суспензию делили на 2 равные по объему и количеству клеток части, в одну из которых добавляли раствор лектина пшеницы до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. После часовой инкубации обе культуры тщательно промывали, осаждая клетки центрифугированием и ресуспендируя в 0,9% NaCl. Культуру, к которой ранее был добавлен лектин, контролировали на его отсутствие в

среде по реакции гемагглютинации (Никитин, 1982). Отмытые, осажденные центрифугированием клетки азоспириллы ресуспендировали буфером, содержащим 10 мМ Трис НС1,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 2 мМ Мд504,0,4 мМ дитиотреигола, 25 мкг/мл фенатметатсульфонилфторида (рН 7,0) и озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе 1Ш - 20 (Польша), Полученные грубые экстракты осветляли центрифугированием и анализировшш в иммуноэлекгрофорезе и электрофорезе в полиакриламидном (ПААГ) геле с додецилсульфатом Ка (БОБ).

Электрофорез проводили на пластинках размером 17 х 14 см в ПААГ в присутствии БОБ по методу Лэммли (ЬаеттН, 1970) в градиенте полиакриламида от 6 до 25%. Верхний концентрирующий гель был 4%. Препараты перед нанесением на гель смешивати с буфером для образцов, содержащим БОБ и кипятили 5 минут. Для окрашивания белка применяли 0,04% раствор Кумасси 11-250.

Иммунодиффузию проводили по методу Ухтерлони (ОисЫейопу, N1155011, 1978) в 1% агарозном геле, приготовленном на трис-глицин-барбитуратном буфере (рН 8,6-8,8). В центральную лунку вносили 10 мкл антител к гомогенному препарату ГС АючртИит Ьга5Иете Бр 245, любезно предоставленных Л.Ю. Матора, в остальные лунки вносили по 10 мкл грубого экстракта клеток Л^озртНит ЬгазИете Бр 245 в последовательных двукратных разведениях. Полосы преципитации появлялись после 24-30 часов инкубации дтастин в эксикаторе во атажной атмосфере. Отмытый от непреципитирующих белков и высушенный агарозный гель окрашивали тем же раствором Кумасси 11-250, который использовали для окраски преципитатов в ракетном иммуноэлекгрофорезе.

Ракетный иммуноэлектрофорез грубых экстрактов клеток азоспириллы проводили по методу, описанному в Руководстве по количественному иммуноэлектрофорезу (Вееке, 1977). Использовали трис-глицин-барбитуратный буфер ионной силы 0,02 М, рН 8,7. Пластины размером 8,8 х 8,4 см заливали 1% раствором агарозы, приготовленным на вышеупомянутом буфере с добавлением 170 мкл антител, титр 1:16. Все образцы были нанесены в объеме 5 мкл. Иммуноэлектрофорез проходил при напряжении 2 В/см в течении 10 часов. Удаление непреципитирующих белков проводили двукратным промыванием 1М №С1. Гель высушивали феном. Для

окраски преципитатов использовали 0,5% раствор кумасси R-250, содержащий 10% уксусной кислоты и 45% этанола. Отмывочный раствор содержал те же концентрации этанола и уксусной кислоты.

Концентрацию бежа определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). К 0,5 мл образца добавляли 0,5 мл раствора красителя следующего состава: кумасси R-250 - 100 мг, этанол -50 мл, 0, 3% НС104 -100 мл, вода до 1 л. Оптическая плотность измерялась при 600 нм на фотоэлектрокалориметре (Specol, Германия). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (БСА). Концентрация белка расчитывалась из следующей градуировочной зависимости:

С. = 69.08 Е, г -9.64: г =0.995

Для расчета концентрации белка использовали значения оптической плотности (л= 600 нм), которые входили в диапазон 0,05 - 0,88.

Число клеток Azospirillum brasilense Sp 245, их размеры, а также размеры и число клеточных агрегатов во всех экспериментах оценивали методом спектротурбодиметрии (Щеголев с соавт., 1984). Измерение оптической плотности суспензии клеток проводили в диапазоне длин волн 400 - 600 нм, с шагом 50 нм на спектрофотометре СФ-26, оборудованном приставкой. Математическую обработку данных проводили на компьютере IBM PC AT с использованием предложенной авторами программы (Рамазанов с соавт., 1985).

Чистоту культуры контролировали с помощью световой микроскопии. Использовали фазовоконтрастный микроскоп Jenaval (Германия) при увеличении изображения з 400 раз.

Полученные результаты и их обсуждение.

1. Увеличение активности глутаминсинтетазы и индукция ее биосинтеза в клетках азоспириллы под влиянием лектина пшеницы.

Добавление лектина пшеницы к культуре Azospirillum brasilense Sp 245 приводило к возрастанию активности глутаминсинтетазы (Рис.1, кривая 1). Максимальное возрастание активности наблюдали, когда на каждые 8х10б клеток приходилось 0,5 мкг (1,39х10'8М) лектина. Получасовая преинкубадия лектина пшеницы с 10% раствором К-ацетил-О-глюкозамина приводила к исчезновению стимулирующего эффекта (активности ГС в контроле и опыте достоверно друг от друга не отличались). Когда лекгин пшеницы заменяли на

лектин Ulex europaeus UEA II (лектин, специфичный к полимерам N-auerai-D-глюкозамина) эффект усиления активности ГС сохранялся, но был менее выраженным (максимумы ^ 500 стимуляции 162% и 152% соответственно). Необходимо отметить, что ни БСА, ни конканавалин А (Con А), добавленные в тех

30)

100 о о

2 3 WGA, ng/ml

же концентрациях, что и „ , „

Рис. 1. Зависимость активности глутаминсинтетазы лектин пшеницы, (1; д). нитрогеназы (2, А) А. ЬгмИете 5р 245 и

содержания аммония всоеде(3, Й») от концентрации стимуляции глутамин- Лекшна пшеницы.

синтетазной активности не

вызывали. Обнаруженный эффект был зависим от фазы роста культуры и максимально выражен в середине экспоненциальной фазы (Рис.2).

Для ответа на вопрос, происходит ли усиление биосинтеза ГС под влиянием лектина пшеницы, был проведен иммуноэлектрофорез грубых экстрактов клеток азоспириллы, инкубированных с пектином и не подвергавшихся воздействию лектина, против антител, полученных к

гомогенному препарату ГС МоьртЦит ЬгазИепзе

245' Время, ч

Результаты ИМ- Рис. 2. Зависимость активности глутаминсинтетазы А. ЬгазНеюе Бр 245 (1, Щ) от фазы роста культуры му ноэлектрофореза (2, 0) в присутствии лектина пшеницы.

•>- Т

9

представлены на Рис. 3. Первые

три дорожки представляют

^ результаты анализа экстрактов

;! , | клеток, подвергавшихся воздей-

;; ! ствию лектина пшеницы, неразбав-

V Ф О ф ' I лснный' разбавленный в 2 и 4 раза

-9 } соотвеХственно. Следующие три Рис. 3. Иммуноэлекгрофорез по Лореллу 1 г

грубых экстрактов клеток А. Ьгапкше 5р дорожки - грубые экстракты

245, обработанных и необработанных

лектином пшенииы. 1,2,3 - грубый клеток, не подвергавшихся

экстракт клеток обработанных лектином воздействию лектина: нераз-пшеншы, неразбаатенный, разоа&тенный г

в 2 и 4 раза соответственно. 4.5,6 - грубый баглгннь'й экстракт, разбаБлешшй экстракт необработанных клеток, „

неразбавленный, разбавленный в 2 и 4 раза в / и 4 раза соответственно. Из соответственно. сравнения первых трех ракет с

соответствующими им контрольными ракетами видно, что экстракты клеток, подвергавшихся воздействию лектина, давати большую высоту ракет, а значит содержали большее чисто молекул антигена, то есть ГС. Что касается количественной оценки, то определенную информацию можно извлечь из сравнения 2-й и 4-й ракет. Обе ракеты имеют одинаковую высоту (27,5 мм), а значит оба анатизируемых раствора (разбавленный в 2 раза экстракт клеток, обработанных лектином и неразбавленный экстракт необработанных клеток) содержали примерно равное количество молекул фермента. Это, в свою очередь, свидетельствовало о том, что часовая инкубация А10$р1гШит Ъгаьйете Бр 245 с лектином пшеницы прнзолпда к примерно двукратному увеличению концентрации ГС в бактериальных клетках, то есть добавление лектина стимулирует биосинтез ГС.

Сравнение данных по определению активности ГС в инкубировавшихся с лектином пшеницы клетках (Рис.1) с данными иммуноэлекгрофореза позволяет предположить, что активации пресинтезированного фермента под влиянием лектина не происходит. Причиной наблюдаемого увеличения активности фермента является, по всей видимости, индукция его биосинтеза 2. Влияние лектина пшеницы на азотфиксацию АюзрШИит Ьга.чНете 5р245.

Подученные данные по влиянию лектина пшеницы на ГС азоспирилды

сравнивали с данными по индукции нитрогеназной активности при связывании лектина на поверхности ЛгозрИНит ЬгсиНете Бр 245 (рис 1, кривая 2) (АпЮпуик гt а1, 1993). Как видно из сравнения кривых 1и 2, в случае нитрогеназной активности эффект был более выраженным. Обращает на себя внимание сходный характер зависимости обоих ферментов, глугаминсингетазы и нитро-геназы, от концентрации лектина. Максимальное усиление (в 5,3 раза) наблюдалось при той же концентрации лектина, что и в случае ГС - 0,5 мкг/мл. Как и в случае с ГС, получасовая инкубация лектина с К-ацетил-Б-глюкозамином приводила к исчезновению стимулирующего эффекта. Кроме того, мы не наблюдали стимуляции, когда заменяли лектин пшеницы на Соп А (специфичный к а-Б-маннозеик а-О-г.тгокозе) и Б С А, При замене лектина пшеницы на лектин такой же углеводсвязывающей

специфичностью, иЕА II, эффект сохранялся, но был менее выраженным (312% стимуляции против 533%). Повышение азотфик-сирующей активности хорошо коррелировало с повышением активности ГС (г=+0.98). Как и в случае с ГС, стимулирующий

эффект зависел от фазы роста культуры и был наиболее выражен в середине экспоненциальной фазы роста (рис. 4, кривая 1).

Известно, что процесс азотфиксашш у бактерий имеет крайне сложную регуляцию, причем как на уровне биосинтеза нитрогеназного комплекса, так и на уровне регуляции активности пресинтезированного фермента. В этой связи важно было выяснить, происходит ли усиление биосинтеза нитрогеназы

Время, ч

Рис. 4, Зависимость активности нитрогеназы А. ЪгаъИете 5р 245 в присутствии (1, А) и в отсутствии (2, лектина пшеницы от фазы роста культуры (3,0).

в ответ на связывание лектина с поверхностью бактерии. Для решения поставленной задачи мы проводили денситометрию белковых профилей клеток, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию лектина, и сравнивали площади пиков для Мо-Рс белка нитрогеназы. Идентификацию последнего проводили, используя препарат Мо-Ре белка нитрогеназы Аюю-ЬааегутектсШ,

Денситометрия

белковых профилей

азоспириллы

представлена на рис.5.

Количественный анализ

полученных данных

показал, что для клеток

А.ЬгазИеше, которые не

инкубировали с

лектином, суммарная

площадь для а и (3

Рис. 5. Денситометрия белковых профилей А. ЬгазИете субъединиц Мо-Бе Эр 245. А-клетки, неинкубированные с лектином

пшеницы; В-инкубированные с АЗП клетки; С-Мо- белка нитрогеназы

Бе белок нитрогеназы АгоюЬаагг \inelandii равна 45 квадратных

миллиметров. Для клеток азоспириллы, подвергавшихся воздействию лектина, площадь пиков для обеих субъединиц составила 102 квадратных миллиметра. Более чем двукратное превышение площади пиков Мо-Ре бежа нитрогеназы азоспириллы в опыте по сравнению с контролем свидетельствует об индукции биосинтеза этого фермента у А.ЬгаяИепзг под влиянием лектина пшеницы.

Сравнение количественных данных по усилению активности нитрогеназы (при концентрации лектина пшеницы 0,5 мкг/мл - в 5,3 раза, рис. 1, кривая 2) с данными по индукции биосинтеза нитрогеназы (в 2,2 раза при той же концентрации лектина) убедительно свидетельствует в пользу того, что индукция биосинтеза нитрогеназы не является единственной причиной тестируемого увеличения активности фермента. Вероятно, в активации азотфиксации под влиянием лектина задействованы как минимум два молекулярных механизма регуляции этого процесса.

3. Усиление экскреции аммония клетками азоспириллы под влиянием лектина пшеницы.

В процессе усиления азотфиксации, происходящего при взаимодействии бактериальных клеток с лекхином, синтезируется повышенное количество аммония, конечного продукта этого процесса. Так как ион аммония является токсичным веществом, бактерия должна либо утилизировать это соединение, либо удалять его из клетки. В литературе имеются сведения о способности азоспириллы экскретировать в среду обитания небольшие количества аммония, которые на последующих этапах роста культуры поглощаются бактерией.

В этой связи нами были проведены эксперименты по определению содержания аммония в среде культивирования азоспириллы, растущей в присутствии и отсутствии лектина пшеницы. Полученные экспериментальные данные (рисЛ, кривая 3) показывают, что лектин вызывает существенное усиление экскреции аммония. Зависимость имеет такой же характер, как и в случае ГС и азотфиксации, но более выражена количественно: максимальное превышение концентрации в опыте по сравнению с контролем -12.9 раза. Эффект усиления экскреции аммония хорошо коррелировал с двумя вышеописанными: коэффициент корреляции был равен +0.83 для кривых 1 и 3 на рисунке 1 и -¡-0.92 для кривых для кривых 2 и 3, приведенных на этом же рисунке. Повышение концентрации иона аммония в культуральной жидкости азоспириллы наблюдалось и при замене лектина пшеницы на ПЕЛ И, однако оно было менее выражено. Не удалось зарегистрировать усиления экскреции аммония при замене лектина пшеницы на Соп А и БСА. Как и в двух вышеописанных случаях эффект усиления экскреции аммония зависел от фазы роста культуры и был максимальным в середине логарифмической фазы (рис. 6).

Эксперименты, описанные в этом и двух предыдущих разделах, свидетельствуют в пользу того, что поверхностные структуры бактерии, отвечающие за связывание лектина пшеницы и последующую трансмембранную передачу сигнала, содержат 1^-ацетил-0-глюкозамин.

Так, оба лектина, специфичные к этому гаптену, лектин пшеницы и 11ЕА И, вызывали индукцию нитрогеназы, глутаминсинтетазы и экскреции

аммония, в то время как Соп А, лекгин с другой специфичностью, не изменял ни один из контролируемых параметров. Кроме того, преинкубация лектина пшеницы с К-ацетил-Б-глюкозамином приводила к исчезновению всех трех

12 14 Время, ч

Рис. 6. Зависимость концентрации аммония в среде А. ЬгазИегие 5р 245 в присутствии лектина пшеницы (1, ив отсутствии лектина пшеницы (2, ф) от фазы роста культуры

(3,0)-

эффектов. Лекгин пшеницы вызывал более сальные изменения активности г.тутамннсинтетазы, азотфиксашш и экскреции аммония по сравнению с ЦЕА II, и это, в свою очередь свидетельствует о его более сильном сродстве к рецепторам клеточной поверхности азоспириллы.

4. Усиление синтеза белка в клетках АкквШИит ЬшИете Бр 245 под влиянием лектина пшеницы

Как следует из описанных выше экспериментов, лекгин пшеницы вызывает индукцию биосинтеза глутаминсинтетазы и белков нитрогеназы. Важно было выяснить, происходит ли индукция биосинтеза других белков под влиянием лектина. С этой целью были получены экстракты клеток

азоспириллы, подвергавшихся воздействию лектина пшеницы (часовая инкубация культуры с 0,5 мкг/мл лектина), и проведено их сравнение с экстрактами необработанных клеток. Первые свидетельства в пользу того, что усиление биосинтеза у A.brasilense Sp 245 касается не только нитрогеназы и глутаминсинтетазы, а носит более общий характер, были патучены при сравнениии содержания бежа в грубом экстракте клеток, подвергавшихся воздействию этого лектина, с соответствующим контрольным экстрактом. Различие в содержании белка было довольно значительным. В случае клеток, инкубировавшихся с лектином, концентрация белка в грубом экстракте была равна 380 мкг/мл, в то время как контрольный экстракт содержал 120 мкг/мл ( средние значения из б экспериментов). Крайне маловероятно, что добавляемый в среду культивирования лектин пшеницы вноаи свой вклад в наблюдаемое трехкратное превышение по содержанию белка: экстракты тщательно отмывались от лектина и его SmÁ 8®wss» Ъ-Л отсутствие контролировалось по реакции ~ ¿

гемагглютинации. . ,

Для более полной характеристики i-^í-; стимуляции биосинтеза белков под влиянием ШЩ

лектина пшеницы был проведен '¿¿Ж' ¿üií*

электрофоретический анализ полученных SS аЩа " * _ч _ -

экстрактов (рис.7). С целью лучшего

разрешения мажорных белков анализировали "t^T%

также двукратно разведенный экстракт ¿¿S- -f3^? ;

клеток, инкубировавшихся с АЗП. ítí'.

На первых двух дорожках (рис. 7 А,В),

представляющих соответственно двукратно

разведенный и исходный экстракты клеток _

. ABC

после их инкубации с АЗП, визуально

Рис. 7. SDS-электрофорез регистрируется 64 полосы, в то время как гру6ых экстракт0в клеток

белковый профиль контрольного экстракта л- brasilense Sp 245, г г с инкубированных с лектином

обнаруживает 26 полос (рис 7, С).Попарное пшеницы,двукратно разведенный^), неразбавлен-сравнение белковых полос, совпадающих по НЬ1Й(В), контрольный грубый

электрофоретической подвижности в экстракт (С), контрольном и опытном вариантах, позволило

выявить 2 важных момента. Во-первых, все полосы, обнаруживаемые в контрольном белковом профиле, видимы и в опытном. Этот факт, вероятно, свидетельствует в пользу отсутствия ингибирования синтеза отдельных белков в ответ на добавление АЗП. Во-вторых, интенсивность практически всех совпадающих по подвижности полос в опытном экстракте выше, чем в контрольном. Это, в свою очередь, говорит об усилении синтеза тех белков, которые присутствуют в клет ках A.brasilense, не подвергавшихся воздействию лектина пшеницы.

Таким образом, белковый профиль клетки, активированной АЗП, состоит из 26 белков, идентичных по электрофоретической подвижности белкам контрольного профиля, и 38 новых белков. Мы предполагаем, что часть белков, выявляемых только в опытном варианте, присутсвует и в клетках, не подвергавшихся воздействию лекгина, но в количествах, недостаточных для того, чтобы они проявились при избранном нами варианте элекгрофоретического анализа. Очевидно, что есть и такие белки, которые отсутствуют в клетке азоспириллы и синтезируются лишь при ее активации лекганом пшеницы. Важно отметить, что замена лектина пшеницы на Con А или БСАне вызывала изменений в белковом профиле A.brasilense Sp 245, т.е. профили инкубировавшихся с каждым из этих белков клеток были идентичны контрольному. Не было также обнаружено различий при сравнении содержания белка в соответствующих экстрактах.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что лектин пшеницы оказывает стимулирующее влияние на биосингетические процессы в клетке: втрое возрастает общее содержание белка; белковый профиль клеток, подвергавшихся воздействию лектина, обогащается 38 новыми белками; усиливается биосинтез присутствующих в клетке белков, в том числе нитрогеназы и глутаминсинтетазы.

5. Влияние лектина пшеницы на рост Azosvirillum brasilense

В связи с тем, что результаты экспериментов показали усиление биосинтетических процессов у A.brasilense Sp 245 в ответ на добавление лекгина пшеницы, важно было выяснить, происходит ли при этом усиление роста бактерии.

Для ответа на этот вопрос проводили сравнительную оценку параметров роста культуры, растущей в присутствии и отсутствии АЗП, с

помощью спектротурбидиметрии . Проведенный анализ показал, что увеличения числа клеток не происходит, т.е. АЗП не вызывает усиления роста бактерий. Однако, лекгин оказывал существенное влияние на другой параметр: возрастал радиус клеток (в среднем на 12,5 %), что позволяет говорить о том, что под влиянием АЗП клетки А. brasilen.se становятся крупнее. Увеличение размеров бактерий, по-видимому, являются прямым следствием усиления биосинтетических процессов в клетке.

6, Сигнальная роль лектина пшеницы в ассоциации пшеница -азоспирилла: гипотеза и экспериментальные данные, ее поддерживающие.

Подводя итог изложенным экспериментальным данным, можно отметить, что обнаружено явление активации метаболизма у А. Ьга$Иеп$е под влиянием лектина пшеницы, (а) увеличение активности ГС; (б) стимуляция азотфиксации и последующая экскреция ее продукта аммония в среду обитания; (в) усиление биосинтеза белков, в том числе нитрогеназы и ГС; (г) увеличение радиуса клеток азосшгриллы.

Кроме того, работами других сотрудников группы биохимии микроорганизмов было установлено, что лектин пшеницы вызывает стимуляцию продукции ИУК (Иосипенко с соавт., 1994) и изменение соотношения кислых фосфолипидов, кардиолипина (КЛ) и фосфотидилглицерина (ФГ) (Апюпуик ее а!., 1995). Оба эффекта были довольно ярко выражены: усиление синтеза ИУК было двукратным, а изменение соотношения ФГ/КЛ - трехкратным. Также ранее (Галкин с соазт., 1989) было показано защитное действие лектина пшеницы от ингабирующего действия кислорода на нитрогеназную активность А. ЬгазИепзе.

Анализ собственных экспериментальных данных и сравнение их с имеющимися в литературе сведениями, позволяет предположить, что явление стимуляции метаболизма азоспириллы, обнаруженное в лабораторных экспериментах имеет место и в природных условиях, в ассоциации пшеница -азоспирилла. Мы предполагаем, что лекгин пшеницы является сигнальной молекулой, изменяющей метаболизм азоспириллы в направлении, благоприятном для роста и развития растения. Гипотеза базируется на следующих экспериментальных данных:

1, Лекгин пшеницы доступен для контакта с бактериями, в том числе и

с азоспириллами. Этот вывод вытекает из сравнения литературных данных по локализации лектина пшеницы с аналогичными данными по локализации азоспирилл. Исследования Леванони с соавторами (Ьеуапопу е1 а1., 1989), показывают, что азоспириллы колонизируют следующие зоны корня: кончик корня, зону элонгации и зону корневых волосков. В свою очередь Мишкайндом и его коллегами (^ШЫипс! е! а1., 1980) показано, что АЗП локализован в корневом чехлике и кончике корня. Следует ометить, что в исследованиях Леванони с соавторами корни пшеницы были свободны от корневых чехликов, потому что растения выращивались в условиях гидропоники. А в исследованиях Мишкайнда и его коллег кончик корня включал зону элонгации. Таким образом, для корневого чехлика, кончика корня и зоны элонгации места локализации лектина и бактерий, по-видимому, совпадают. Что касается зоны корневых волосков, то лекгин пшеницы, по всей видимости, доступен и бактериям этой зоны. С одной стороны клетки корневого чехлика слушиваются, разрушаются и освобождают лектин., с друтой стороны - корень растет и зона корневых волосков смещается в то место, где до того был корневой чехлик. Важно отметить, что лектин расположен в поверхностных слоях зерновки и корня и легко смывается при промывании интактных корней буфером (М^бШтк! йа!, 1980). Добавление 1\т-ацетил-В-глюкозамина к буферу существенно увеличивало элюцию лектина.

2. Лектин пшеницы связывается с поверхностью азоспириллы и усиливает два наиболее важных для роста и развития растения процесса: азотфиксацию с последующей экскрецией аммония, а также продукцию фитогормона ИУК (Иосипенко с соавт., 1994). Важно отметить количественный аспект: стимуляция экскреции аммония была в максимуме 13 - кратной.

3. Все описанные эффекты наблюдались при низких концентрациях лектина пшеницы, 10'8 -10"9 М, а именно такие концентрации типичны для гормонов и других сигнальных молекул. Кроме того, известно, что АУвА действует как; гормон на другие клетки. В частности, в литературе описано инсулиноподобное действие этого лектина (ОШгеса^а* е! а1., 1973).

4. Помимо действия в малых дозах вещество, играющее роль сигнальной молекулы, должно удовлетворять и еще одному критерию, а именно, вызывать

перестройку метаболических процессов в клетке. Нами показано, что связывание лектина пшеницы с поверхностью азоспириялы вызывает усиление биосинтеза как уже имеющихся в клетке, таки новых белков, то есть в основе формирования клеточного ответа азоспириялы лежит экспрессия целого ряда генов.

Предполагается, что при колонизации корней пшеницы азоспириллами имеет место следующая последовательность событий: лекгин связывается с поверхностью азоспириялы, сигнал трансмембранно передается внутрь клетки и вызывает формирование клеточного ответа, в том числе усиление азотфиксации, экскреции аммония и продукции ИУК. Ион аммония и ИУК экскретируются азоспприллой наружу, оба названные метаболита поглощаются растением, включаются в его метаболизм, что приводит к усилению его роста и развития. Очевидно, необходимы дополнительные эксперименты, чтобы подтвердить или опровергнуть гипотезу о сигнальной роли лекпша пшеницы в ассоциации пшеншха-азоспирилла.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что добавление лектина пшеницы в концентрациях 10"' -10"9 М к культуре АгоьртИит ЬгслИете вызывает усиление активности глутаминсинтетазы, ключевого фермента азотного обмена азоспириллы.

2. Методом ракетного иммуноэлектрофореза с антителами против гомогенного препарата глутаминсинтетазы АхрщгШит ЬгтИете показано, что лекгин пшеницы вызывает индукцию биосинтеза глутаминсинтетазы, а не ее активацию.

3. Установлено, что лектин лшенииы стимулирует экскрецию продукта азотфиксации, аммония, более чем в 12 раз.

4. Зависимости индукции глутаминсинтетазы, нитрогеназы и экскреции аммония азоспириллой от концентрации лектина пшеницы имеют сходный характер и хорошо коррелируют друг с другом. Все три эффекта зависят от возраста культуры и максимальны в середине логарифмической фазы роста.

5. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что поверхностные структуры АгсиртИит ЬгазНеюе, ответственные за связывание лектина пшеницы содержат М-ацетил-О-глюкозамин.

6. Связывание лектина пшеницы с поверхностными структурами Azospirillum brasilense приводит также к трехкратному усилению биосинтеза белка в бактериальной клетке. Сравнение белкового профиля лектин-акгивированных клеток с контрольным профилем выявило усиление синтеза как уже существующих в клетке белков, так и индукцию новых. Лектин пшеницы индуцирует биосинтез нитрогеназы у Azospirillum brasilense.

7. Изменение метаболизма у Azospirillum brasilense в ответ на воздействие лектина пшеницы сопровождается увеличением размеров клеток, но лектин не влияет на их число.

8. На основе полученных экспериментальных данных предложена гипотеза о том, что лектин пшеницы играет роль сигнальной молекулы в ассоциации пшеница-азоспирилла.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Antonyuk L.P., Fomina O.R., Galkin М.А., Ignatov V.V. The effect of wheat germ agglutinin on dinitrogen fixation, glutamine synthetase activity and ammonia excretion in Azospirillum brasilense Sp 245. //FEMS Microbiol. Lett., 1993, V. 110, P. 285-290.

2. Antonyuk L.P., Fomina O.R., KalininaA.V., SemyonovS.V., Nesmeyanova M.

A., Ignatov V.V. Wheat lectin possibly serves as a signal molecule in Azospirillum - wheat association. //Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics, Physiology, Ecology/ Ed. I. Fendrik, M. Del Gallo, J. Vanderleyden, M. de Zamaroczy. NATO ASI Series. Vol. G. Berlin: Springer-Verlag, 1995. P. 319324.

3. Антонкж Л.П., Фомина O.P., Игнатов B.B. Влияние лектина пшеницы на

метаболизм Azospirillum brasilense: индукция биосинтеза белков.// Микробиология, 1995 (в печати).

4. Antonyuk L.P., Фомина О.Р., Ignatov V.V. Wheat lectin regulates nitrogen metabolism in Azospirillum brasilense. //Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Eds. Tichonovich I. et al., Kluwer Academic Publishers, 1995. P. 341.

5. Антонюк Л.П., Фомина O.P., Галкин M.A., Игнатов B.B. Индукция юпрогеназной активности бактерий в присутствии растений и возможный механизм этого процесса. //IV Всес.науч. конф."Микроорганизмы в сельском хозяйстве" Пущино, 20-24 янв., 1992. С.9.

6. Antonyuk L.P., Фомина О.Р., Galkin М.А. Ignatov V.V. Lectin of Triticum

vulgaris as a stimulator of nitrogen fixation and ammonia excretion in

Azospirillum brasilense Sp 245, a native wheat associate. //Abstr. VIHth East. Eur. Symp. N2 -fixation "Nitrogenfix-92", 22-26 September, 1992. Saratov, Russia, P. 34.

7. Антонюк Л.П., Фомина O.P., Галкин M.A. Игнатов В.В. Регуляция клеточного метаболизма Azospirillum brasilense Sp 245 под влиянием лекпша пшеницы. //Конф."Клинические и эксперимент, аспекты клет. сигнализации": Тез. 27-29 сент. 1993, Москва, С. 3-4.

8. Antonyuk L.P., Fomina O.R., SergeevaE.I. Iosipenko A.D. Ignatov V.V. Wheat

lectin as a signal molecule altering metabolism of Azospirillum brasilense Sp 245, a wheat associate, in a beneficial way to the plant. //Abstr. Vl-th Intern.Symp. N, - fixation with Non-Legumes, 6-10 September, 1993, Ismailia, Egypt. P. 119.

9. Antonyuk L., Fomina 0., Iosipenko A., Sergeeva E. Semyonov S. Ignatov V.

Wheat lectin possibly serves as a signal molecule in Azospirillum - wheat association. //Abstr. 16 Intern Congr. of Biochemistry and Molec. Biol. Sept, 19-22,1994, New Delhi, India,.

10. Ignatov V, Antonyuk L., Fomina 0., Semyonov S. Regulation of nitrogen metabolism in Azospirillum brasilense by a wheat lectin. //Abstr. 7 Intern Congr. of Bacteriology and Appl. Microb. Division, July 3-8, 1994, Praque, Czech Rep.

11. Antonyuk L.P., Fomina O.R., Kalinina A.V., Semyonov S.V., Nesmeyanova M.A., Ignatov V.V. Wheat lectin possibly serves as a signal molecule in Azospirillum - wheat association. //Abstr. NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorg. Sept. 4-7, Sarvar, Hungary.

12. Антонюк Л.П., Фомина O.P., Семенов C.B., Игнатов В.В. Усиление азотфиксации у Azospirillum brasilense под влиянием лектина пшеницы: возможный механизм процесса. //9 Баховский коллоквиум по азотфиксации: Тез. докл. Москва, Россия, 24-26 января 1995, С. 54.

13. Antonyuk L.P., Fomina O.R., Ignatov V.V. Molecular recognition in the wheat- Azospirillum association. //Abstr. 3rd IUBMB conf. "Molecular Recognition", April 23-27,1995, Singapore, P. 35.

14. Antonyuk L.P., Fomina O.R., Ignatov V.V. Wheat lectin regulates nitrogen metabolism in Azpspirillum brasilense . //10 Int.Congr. onNitr. Fix. May 28-June 3,1995. S.-Petersburg, Russia: Abstr.N. 120.

15. Antonyuk L.P., Fomina O.R., KalininaA,V., Ignatov V.V. Towards the lectin-carbohydrate recognition in the Azospirillum brasilense - wheat association // Int. Workshop on Associative interactions of nitrogen-fixing bacteria with plants, Saratov, Russia,5-8 June 1995: Book of Abstracts. P. 66.

16. Fomina O.R., Antonyuk L.P., Ignatov V.V. Cellular interaction in the plant - bacterial association: the role of wheat lectin. // Abstr. 23rd FEBS Meeting. Aug. 13-18,1995, Basel, Switzerland.

17. Ignatov V.V. Antonyuk L.P., Iosipenko A. D., Iosipenko OA, Fomina O.R.,

SelivanovN.Yu., SergeevaE.I., Stadnik G.I. Interaction between the partners of association, wheat - Azospirillum brasilense Sp 245 //Abstr. NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorg. Sept. 4-7, Sarvar, Hungary.

18. Fomina O.R., Antonyuk L.P., Ignatov V.V. Effect of wheat lectin on the metabolism of the plant - growth promoting rhizobacterium Azospirillum: induction of protein biosynthesis. //6-я Межд. конф. "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии", 18-23 дек. 1995, Москва

Подписано к печати 12.0У.96 Объем 1 п. л. Тираж 100. Заказ N° 4.

Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.