Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез индолил-3-уксусной кислоты и его регуляция у бактерий Azospirillum brasilense

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарова, Елена Андреевна, Саратов

61: М- '¿¡ЬШ- Ь

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ

на правах рукописи УДК 579.222

Захарова Елена Андреевна

СИНТЕЗ-ИНД0ЛИЛ-3-УКСУСН0Й КИСЛОТЫ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ У БАКТЕРИЙ

АгоБРтшим ВВАБИЕШЕ

03.00.07 - микробиологйя 03.00.04 - биохимия -

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д. б. н., проф. Игнатов В. В.,

Научный консультант д. х. н., проф. Щербаков А. А.

Саратов - 1998

Содержание " ^ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........:........................ ,.. .4

ВВЕДЕНИЕ................................................5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ...............................11

1.1. Роль вторичных метаболитов бактерий - фитогормонов в развитии ассоциативных взаимоотношений "растение-микроорганизм". . ......................................,................И

1.2. Пути биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты у бактерий ......;....................................................18

1.3. Регуляция синтеза индолил-3-уксусной кислоты у бактерий. ...................................................34

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. ..... .w. ................ . 40

2.1. Бактериальные штаммы................................40

2.2. Культивирование бактерий...........................41

2.3. Определение йндольных производных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.........................44

2.4. Квантовохимические методы..........................44

2.5. Выделение, очистка и идентификация индолил-3-уксус-ной кислоты...........................:.................45

2.5.1. Экстракция.......................................45

2.5. 2.. Тонкослойная хроматография.........................46

2.5.3. Качественная идентификация индолил-3-уксусной кислоты................................•.........................46

2.6. Статистическая, обработка данных.................... 48

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И 'ОБСУЖДЕНИЕ.________ 49

3.1. Исследование синтеза индолил-3-уксусной кислоты бактериями Azospirillum brasitense.............................. 49

3.1.1. Исследование продукции индолил-3-уксусной кислоты из триптофана бактериями Azospirillum brasi tense..............49

3.1.2. Исследование продукции индолил-3-уксусной .кислоты бактериями Azospirillum brasilense при использовании антрани-ловой кислоты в качестве предшественника фитогормона.........53

3.1.3. Особенности продукции индолил-3-уксусной кислоты бактериями Azospirillum brasitense при использовании индола в качестве предшественника фитогормона........................58

3.1. 4. ■ Расчеты термодинамических параметров путей синтеза индолил-3-уксусной кислоты..................................63

3.2. Регуляция биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты у

Azospirillum brasilense водорастворимыми витаминами..........77

. \

3.2.1. Построение регрессионных моделей.............-. . .,77

3.2.2. Влияние витаминов группы В на триптофан-зависимый синтез индолил-3-уксусной кислоты у бактерий Azospirillum brasilense.......................................................83

3.3. Регуляция продукции индолил-3-уксусной кислоты у . бактерий Azospirillum brasilense фенольными соединениями...)....;....................................................97

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................108

ВЫВОДЫ. . . ...............................................ИЗ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................115

ПРИЛОЖЕНИЕ. ...........................................134

, СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАВ - биологически активные вещества "ИУК - индолил-3-уксусная кислота Трп - триптофан

ИПВК - индолил-3-пировиноградная кислота ИАМ - индолил-3-ацетамид ИАН - индолил-3-ацетонитрил • ИААльд - индолил-3-ацетальдегид ТАМ - триптамин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота НАДН - никотинамиддезоксирибонуклеотид MND0 - modifed neglect of differential overlap (модифицированное пренебрежение дифференциальным перекрыванием) МО J1KA0 - молекулярная орбиталь - линейная комбинация атомных орбиталей

AMI - Austin Model 1 (Остин модель)

РМЗ - Parametric Method Number 3 (параметризованный метод N3)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Изучение вторичного метаболизма микроорганизмов является одной из актуальных проблем современной микробиологии и биохимии.

Исследование вторичного метаболизма, специфичного для тех или иных микроорганизмов представляется необходимым по ряду причин. Во-первых, исследование метаболизма микробной клетки на этапах прекращения роста, а именно когда идут интенсивные процессы синтеза целого ряда биологически активных веществ (БАВ), мало исследованная область биохимии микроорганизмов. Во-вторых, интерес связан с поиском эффективных продуцентов фитогор-монов, выявлению особенностей метаболизма и оптимизации ферментационного процесса метаболитов гормональной и регуляторной природы. • В-третьих, необходимо акцентировать внимание на исследовании БАВ, продуцируемых ризосферными микроорганизмами, поскольку было установлено, что микроорганизмы являются активными продуцентами БАВ, которые, попадая в растение через корневую систему, активируют процессы роста и оказывают существенное влияние на обмен веществ во всем растительном организме [1].

Среди БАВ, продуцируемых микроорганизмами, важная роль принадлежит веществам типа ауксинов, гибберелинов, абсцизинов и этилена.

Поэтому важнейшим направлением в области изучения вторичного; метаболизма является исследование синтеза фитогормонов бактериями, находящимися в ассоциации с растениями. В последние годы четко установлено, что именно способность ассоциатив-

ных бактерий к синтезу фитогормонов, является одним из главных свойств, лежащих в основе позитивного воздействия на рост и развитие растений [2, 3].

Модельными системами изучения ассоциации между бактериями и злаками являются бактерии рода АгоэртИит, продуцирующие фитогормоны в количествах, которые в ризосфере обладают физиологической активностью. Среди фитогормонов индо-лил-3-укс'усная кислота (ИУК) обнаруживает наибольшую активность' в стимулировании процесса роста растения [4, 5]. Стимулирующие или ингибирующие эффекты роста растения, вызываемые микроорганизмами, могут быть выяснены только тогда, когда станут ясными гормональные характеристики бактерий: биосинтетические пути ИУК и их регуляция. В настоящее время предполагается множественность путей синтеза ИУК, дискутируется вопрос о предшественнике биосинтетического пути ИУК [4]. Все это подразумевает высокую степень регуляции этого биохимического процесса, что особенно актуально для микроорганизмов ризосферы, у которых процесс биосинтеза ИУК происходит под влиянием химических соединений и условий, существующих в ризосфере.

Таким образом, представляется важным охарактеризовать пути синтеза ИУК бактериями и исследовать действие химических соединений - аналогов веществ ризосферы, на синтез этого фито-гормона.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование особенностей биосинтеза ИУК и влияния биологически активных веществ корневых выделений растений на'этот процесс у ассоциативных бактерий АговрггИЬиш ЬгазИепБе. Поставленная цель может быть достигнута решением следующих задач:

1. Исследование продукции ИУК у бактерий при содержании в среде культивирования различных предполагаемых предшественников ИУК;

2. Оценка вклада различных,триптофан-зависимых путей синтеза ИУК в продукцию фитогормона, на основе расчета значений изменений свободных энергий и констант равновесия этого процесса;

3. Изучение влияния водорастворимых витаминов на триптофан-зависимый синтез ИУК бактериями Azospirittum brasitense.

4. Выяснение характера влияния фенольных соединений на продукцию ИУК бактериями A. brasitense.

Научная новизна работы. Полученные данные об особенностях синтеза ИУК бактериями Azospirittum brasitense имеют важное значение для разработки теоретических основ ассоциативных взаимодействий растений с микроорганизмами.

Предложен подход изучения синтеза ИУК, основанный на квантовохимических расчетах термодинамических параметров (свободной энергии и энтропии). Показано, что вклады триптофан-зависимых путей синтеза в продукцию ИУК велики.

■ Сравнение различных индольных соединений в качестве предшественников синтеза ИУК показало, что триптофан-независимый синтез маловероятен, когда бактерии используют индол и антра-ниловую 'кислоту как предшественники этого фитогормона.

Выяснены некоторые аспекты регуляции процесса синтеза ИУК у бактерий Azospirittum brasitense. Были использованы химические аналоги БАВ корневых выделений растений, а именно водорастворимые витамины и фенольные соединения. Показаны закономерности влияния этих соединений на биосинтез ИУК. Выявлен

стимулирующий эффект водорастворимых витаминов и ингибирующее действие фенольных соединений на бактериальную продукцию ИУК. Построены модели триптофан-зависимого синтеза ИУК, учитывающие влияние витаминов группы В и фенольных соединений. Модели позволяют оптимизировать процесс бактериального синтеза ИУК и обладают прогностическим характером.

Практическая значимость. Полученные в работе данные о вторичном метаболизме бактерий рода Azospirг Пит и о факторах, регулирующих этот процесс в направлении благоприятном для развития растений, могут быть использованы на практике для разработки экологически чистых агротехнологий, с применением в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе ,этих бактерий, а также для улучшения экологической обстановки в районах хранения и будущего уничтожения запасов химического оружия в Российской Федерации.

Постановка многофакторных экспериментов позволила исследовать совокупность действия различных факторов на ИУК-проду-цирующую активность бактерий и построить прогностические модели бактериального синтеза ИУК.

Материалы диссертационой работы нашли применение.на кафедре биохимии и биофизики СГУ При подготовке спецкурса "Био-логичёски активные вещества", а также в научно-исследовательской работе СВВИУХЗ.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Особенности продукции ИУК Azospirillum brasitense при содержании в среде культивирования бактерий различных индоль-ных соединений в качестве предшественников индолил-3-уксусной кислоты.

*

2. Оценка вкладов различных.путей синтеза в продукцию ИУК, заключающаяся в том, что вклады триптофан-зависимых путей синтеза в продукцию ИУК через индолилацетамид и индолилацето-нитрил соизмеримы и велики, тогда как путь через индолилпиро-виноградную кислоту менее значим.

3. Закономерности влияния водорастворимых витаминов, их стимулирующее действие на триптофан-зависимый синтез ИУК бактериями Azospirillum brasitense и моделирование этого процесса.

•А. Закономерности регуляции триптофан-зависимой продукции ИУК бактериями Azospirillum brasilense фенольными соединениями и моделирование этого процесса.

. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: VIII Международном Конгрессе по Молекулярным Взаимодействиям между Растениями и Микроорганизмами (Ноксвилл, США, 1996), III Международном Симпозиуме1 по Субповерхностой Микробиологии (Давос, Швейцария, 1996), Всероссийском Симпозиуме по Теории и Практике Хроматографии и Электрофореза (Москва, Россия, 1998), I Всероссийской Конференции "Молекулярное Моделирование" (Москва, Россия, 1998),' VIII Международном симпозиуме по экологии микроорганизмов (Галифакс, Канада, 1998), а также на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсужде-

ния, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложения. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, включает 25 рисунков и 5 таблиц. Библиография содержит 141 наименование.

- и -

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.-1. Роль вторичных метаболитов - фитогормонов в развитии ассоциативных взаимоотношений растение-микроорганизм

Проблема микробного синтеза биологически активных веществ относится к категории важнейших фундаментальных и прикладных проблем микробиологии и биохимии. Особенно важно акцентировать

внимание на продукцию БАВ ризосферными микроорганизмами, по-

\

скольку, как известно, между микроорганизмами ризосферы и растениями устанавливаются ассоциативные взаимоотношения, при которых синтезируемые бактериями вещества влияют на рост и развитие растений [5-10]. Естественно, в ассоциациях существует и обратная связь, когда корневые выделения растений оказывают влияние на метаболизм микроорганизмов [11-1.4]. Чтобы понять, что такое ассоциация и какую роль в ней- играет метаболизм бактерий, дадим определение термину "ризосфера". В это' понятие вкладывается разный смысл, но оно всегда содержит идею о влиянии различных химических соединений корневых выделений на количественный состав и метаболизм микроорганизмов, обитающих в ризосфере.

Подобное взаимодействие не предполагает тесных взаимосвязей между партнерами по типу бобово-ризобиального симбиоза. В литературе такое сообщество определяется как ассоциативная система (или ассоциация). Ассоциативное взаимодействие между микроорганизмами и растениями обычно не приводит к образованию клубеньков или каких-либо иных четко различимых морфологических структур. Поэтому вопрос о критериях ассоциативности

представляется весьма важным.

Комплекс факторов, обуславливающих развитие ассоциативных отношений в системе "растение - микроорганизм", включает : выживаемость микроорганизмов в почве, подвижность и хемотакси-ческую активность, адсорбцию на корневой системе. Их действие направлено на реализацию процессов обмена метаболитами, а именно, на активизацию азотфиксирующей активности и синтеза микроорганизмами биологически активных веществ, регулирующих рост и развитие растений [5-10]. .

Сущность процесса обмена метаболитами состоит в том, что растворенные органические вещества корневых выделений потребляются микроорганизмами. В составе корневых выделений растений встречаются вещества различной прйроды: углеводы, органические кислоты, аминокислоты, спирты, витамины, липиды, нуклеотиды, пептиды, белки,' антибиотики, фенольные соединения. Корневые выделения поддерживают высокую активность микрофлоры [11-14]. Часть их перерабатывается в биомассу, а часть идет на азотфик-сацию и синтез биологически активных веществ [15].

• С другой стороны, фитогормоны, витамины и другие биологически активные вещества микробного происхождения, которым до настоящего времени уделяется незаслуженно мало внимания, способствуют быстрейшему формированию функциональных систем растений, ведут к их сбалансированному питанию, что в конечном счете сказывается на эффективности использования растениями минеральных удобрений и азота, поставляемого ризосферными азотфиксаторами [15]. Поэтому изучение различных аспектов биосинтеза БАВ именно ассоциативными микроорганизмами представляется важным.

Чтобы охарактеризовать бактерий как ассоциативные используется несколько признаков: способность бактерий выделяться из тканей поверхностно - стерилизованных корней растений; способность бактерий фиксировать атмосферный азот за счет корневых выделений растения хозяина и передавать связанный азот растению; способность бактерий размножаться в ризосфере растения-хозяина [16].

Что касается бактерий рода AzospгrгЫum, то они являются хорошими модельными системами изучения ассоциаций, поскольку

г

продуцируют БАВ, в частности фитогормоны, в количествах, которые в ризосфере обладают физиологической активностью [4].

Фитогормоны, продуцируемые микроорганизмами рассматривают как вторичные метаболиты. Под термином вторичный метаболизм подразумевают огромное число метаболических путей, приводящих к образованию соединений, свойственных лишь немногим видам. Булок [17] сформулировал основные критерии вторичного метаболизма. Им было показано, что синтез вторичных метаболитов интенсивно протекает в культурах микроорганизмов, достигших стационарной фазы роста. Вторичными метаболитами называют различные по химической природе вещества, образуемые клеткой, имеющие ограниченное таксономическое распространение, не имеющие явной функции во время роста организма-продуцента и синтезируемые в тот момент, когда резко затормаживаются процессы клеточного деления.

Согласно современным представлениям, образование вторичных соединений может быть нужным продуцирующему организму в трех случаях:

.1) при детоксикации избыточных или ненужных соединений;

2) при образовании соединений, имеющих значение в установлении экологических взаимосвязей между организмами;

3) при биосинтезе веществ, используемых в качестве метаболических эффекторов.

Изучая вторичный метаболизм ассоциативных бактерий, необходимо выделить именно второй аспект проблемы, так как известно, что многие вторичные-соединения принимают участие в установлении экологических взаимосвязей между микроорганизмами и растениями. Другими словами, вторичные соединения могут использоваться в качестве аллелохимических агентов - веществ, способствующих взаимодействию между видами