Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внеклеточные пектолитические и протеолитические ферменты бактерий рода Azospirillum

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чернышова, Марина Павловна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Современные аспекты проблемы биологической фиксации азота

1.1 История открытия процесса азотфиксации

1.2 Основные группы диазотрофных бактерий

1.3 Биохимия и генетика азотфиксации

1.4 Благоприятное влияние инокуляции азотфиксирующих бактерий рода 12 Azospirillum на рост и развитие растений.

1.5 Возможные механизмы улучшения роста растений при инокуляции 15 азотфиксирующими бактериями

Глава 2. Взаимодействие почвенных ассоциативных бактерий с корнями растений

2.1 Колонизация азотфиксирующими микроорганизмами внутренних 19 тканей растений

2.2 Ферменты микроорганизмов, расщепляющие клеточные стенки 21 растений

2.2.1 Внеклеточные пектолитические и целлюлозолитические ферменты 25 диазотрофных бактерий

2.2.2 Протеолитические ферменты диазотрофных бактерий 29 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы

3.1 Штаммы бактерий и условия их культивирования

3.2 Растительные объекты

3.3 Стерилизация зерновок пшеницы

3.4 Выращивание растений пшеницы в галечной культуре

3.5 Выращивание растений пшеницы в водной культуре

3.6 Инокуляция бактериями проростков пшеницы

3.7 Выделение бактерий из корней растений, предварительно 34 инокулированных штаммами азоспирилл.

3.8 Изучение адсорбции бактериальных клеток на корни трехсуточных 34 проростков пшеницы

3.9 Концентрирование культуральной жидкости

3.10 Тестирование пектолитической активности бактерий рода Azospirillum

3.11 Тестирование протеолитической активности бактерий рода 38 Azospirillum

3.12 Статистическая обработка данных

Глава 4. Способность штаммов бактерий рода Azospirillum продуцировать внеклеточные пектолитические и протеолитические ферменты

4.1 Пектолитическая активность бактерий рода Azospirillum

4.1.1 Оптимизация состава среды для определения пектолитической способности штаммов Azospirillum

4.2 Протеолитическая активность бактерий рода Azospirillum

Глава 5. Исследование пектиназ и протеаз бактерий рода Azospirillum как факторов, обуславливающих колонизацию бактериями внутренних тканей пшеницы

5.1 Разработка методики глубокой стерилизации зерновок пшеницы

5.2 Изучение пектолитической и протеолитической активности штаммов азоспирилл, выделенных из поверхностно - стерилизованных корней растений

5.3 Сравнительное изучение колонизации корней растений штаммами азоспирилл, обладающими различной выраженностью признаков пектолитической и протеолитической активности

Глава 6. Влияние корневых эксудатов пшеницы на пектолитическую и протео-литическую активность азоспирилл

6.1 Разработка способа получения стерильных корневых эксудатов пшеницы

6.2 Изменение параметров роста культур азоспирилл в ответ на введение в среду культивирования корневых эксудатов пшеницы

6.3 Влияние корневых эксудатов пшеницы на протеолитическую и пектолитическую активность бактерий рода Azospirillum

Глава 7. Исследование свойств внеклеточных протеолитических и пектолитиче-ских ферментов бактерий рода Azospirillum.

7.1 Пектолитические ферменты

7.1.1 Продукция разными видами азоспирилл пектатлиаз

7.1.2 Полигалактуроназная активность азоспирилл

7.1.3 Зимография пектолитических ферментов A. irakense КВС

7.2 Протеолитические ферменты ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Да - молекулярная масса в дальтонах; БСА - бычий сывороточный альбумин; ДСН - додецилсульфат натрия; ДТТ - дитиотреитол; кДа - молекулярная масса в килодальтонах;

ИУК - индолил-3-уксусная кислота;

КОЕ - колониеобразующая единица;

ОКС - однослойная казеиновая среда

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПГ - полигалактуроназы;

ПЛ - пектатлиазы;

ПМЭ - пектинметилэстеразы;

CMC - синтетическое моющее средство; тпн - размер в тысячах пар нуклеотидов;

ТХУ - трихлоруксусная кислота;

ФБС - фосфатно-буферная смесь;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

СВВ - кумасси бриллиантовый синий;

RE - корневые эксудаты;

RR - рутениевый красный.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеклеточные пектолитические и протеолитические ферменты бактерий рода Azospirillum"

Актуальность проблемы

Проблема ассоциативного взаимодействия растений с почвенными азотфиксирующими микроорганизмами привлекает к себе внимание исследователей уже несколько десятков лет в связи с возможностью использования биологической фиксации азота в сельском хозяйстве. На основе различных диазотрофных микроорганизмов, относящихся к группе бактерий, улучшающих рост растений (в том числе и азоспирилл) были созданы и активно применяются различные биологические добавки, позволяющие избежать использования азотных удобрений. Однако, применение подобных биоудобрений в полевых условиях не всегда приводило к положительному результату, более того, в ряде случаев происходило снижение урожая (Bashan Y., Holguin G., 1997). Нестабильность результатов полевых экспериментов - прямое следствие недостаточной изученности механизмов, обеспечивающих формирование эффективной ассоциации микроорганизмов с растениями, среди которых немаловажное значение может иметь способность азотфиксирующих бактерий колонизировать внутренние ткани растений. Очевидно, что для этого бактериям необходимо преодолеть растительную клеточную стенку, состоящую из сложного комплекса полисахаридов. Особенно важными для процесса проникновения бактерий внутрь растительной ткани являются пектолитические ферменты, так как срединная пластинка и, возможно, первичная клеточная стенка, в основном состоят из пектиновых полисахаридов (Родионова Н.А., 1989). Не исключена роль бактериальных протеаз в деградации белкового компонента клеточной стенки - экстенсина (Позднякова Л.И., 1981; Жаме Э. с соавт., 2000). Участие внеклеточных пектолитических и протеолитических ферментов многих фитопатогенных бактерий и грибов, а также азотфиксирующих симбиотических и ассоциативных микроорганизмов в процессах проникновения в ткани растений-хозяев доказано экспериментально (Васильева К.В., Гладких Т.А., 1984; Barbar С.Е. et al., 1997; Srivastava А.К. et al., 1989; Mateos P.F. et al., 1992; Kovtunovych G. et al., 2000).

По литературным данным бактерии рода Azospirillum колонизируют как поверхность, так и внутренние ткани корней различных растений (Dobereiner J. et al., 6

1979; Umali-Garsia M., et al 1979; Schloter M.G. et al., 1994; Assmus В., 1995). Между тем, механизм, обусловливающий способность азоспирилл проникать внутрь растительных тканей, неясен. Данные о пекголитических и протеолитических ферментах бактерий рода Azospirillum как о факторах, опосредующих проникновение азоспирилл во внутренние ткани растений, остаются до сих пор спорными и требуют дальнейших исследований в этой области.

Цель работы: изучение внеклеточных пекголитических и протеолитических ферментов бактерий рода Azospirillum и их возможного участия в процессе ассоциативного взаимодействия азоспирилл с растениями пшеницы.

Задачи исследования:

1. Исследовать способность бактерий рода Azospirillum продуцировать внеклеточные пектолитические и протеолитические ферменты;

2. Изучить влияние пассажей штаммов азоспирилл через стерилизованные растения пшеницы на активность внеклеточных пекголитических и протеолитических ферментов бактерий;

3. Провести сравнительное изучение колонизации корней пшеницы штаммами азоспирилл с различной активностью внеклеточных пектолитических и протеолитических ферментов;

4. Оценить влияние корневых эксудатов пшеницы на уровень пектолитической и протеолитической активностей штаммов азоспирилл;

5. Исследовать свойства внеклеточных пектолитических и протеолитических ферментов штаммов азоспирилл.

Научная новизна работы

Установлено, что бактерии, выделенные из поверхностно-стерилизованных корней растений, инокулированных штаммами азоспирилл, обладают более высоким уровнем активности пектолитических (в 10,5 раз) и протеолитических (в 7,5 раз) ферментов в сравнении с исходными штаммами.

Выявлено, что штаммы азоспирилл, обладающие в результате пассажа через растения увеличенной пектолитической и протеолитической активностью, 7 колонизируют внутренние ткани корней пшеницы в большем количестве, чем исходные.

Впервые показано, что при выращивании штаммов азоспирилл в присутствии корневых эксудатов пшеницы происходит увеличение пектолитической (на 7,8 %) и протеолитической (на 37,5 %) активностей культуральной жидкости бактерий.

Впервые охарактеризованы свойства внеклеточных протеолитических ферментов штаммов азоспирилл. Методом зимографии показано, что исследованные штаммы характеризуются наличием не менее шести форм внеклеточных протеолитических ферментов с молекулярными массами в пределах от 32 до 172 кДа

Практическая значимость работы

Разработаны методические рекомендации «Методика глубокой стерилизации зерновок пшеницы». Методические рекомендации одобрены Ученым Советом ИБФРМ РАН (протокол № 4 от 4 апреля 2001).

Оптимизирован состав среды, позволяющей детектировать пектолитическую активность штаммов бактерий, обладающих низкой выраженностью этого признака и проводить массовый скрининг культур на способность к деградации пектина.

Разработан способ получения стерильных корневых выделений растений пшеницы.

Апробация работы

Материалы диссертации представлялись на 3-ей Европейской конференции по азотфиксации (Нидерланды, 1998), IV съезде физиологов растений России «Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва, 1999), Первом рабочем совещании микробиологов Поволжья «Фундаментальные аспекты микробиологии» (Саратов, 2000), XII юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001)

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной конференции лаборатории биохимии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН «30» марта 2001 г. g

Публикации

Основное содержание работы отражено в 5 опубликованных работах. Структура диссертации

Работа состоит из 7 глав, включающих обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результатов собственных исследований и завершается заключением, выводами и библиографическим указателем, включающим 38 отечественных и 173 зарубежных источника. Общий объем диссертации составляет 112 страниц. Текст иллюстрирован 11 таблицами и 20 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бактерии рода Azospirillum обладают внеклеточной пектолитической и протеолитической активностями.

2. При пассаже бактерий через стерилизованные растения пшеницы происходит увеличение уровня внеклеточных протеолитической и пектолитической активностей азоспирилл.

3. Способность азоспирилл колонизировать внутренние ткани корней пшеницы зависит от уровня пектолитической и протеолитической активности бактерий.

Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Изучение молекулярных механизмов взаимодействия растений и микроорганизмов» (№ гос. per. 01890057691, научный руководитель засл. деятель науки РФ д.б. н., проф. Игнатов В.В.) 9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Чернышова, Марина Павловна

выводы

1. Выявлена способность десяти штаммов бактерий рода Azospirillum, принадлежащих к пяти видам, продуцировать внеклеточные пектолитические и протеолитиче-ские ферменты. Оптимизирован состав среды для определения пектолитической активности азоспирилл.

2. Установлено, что у штаммов азоспирилл, прошедших пассаж через растения пшеницы, наблюдается увеличение пектолитической и протеолитической активностей по сравнению с исходными культурами. Пектолитическая активность A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7 увеличилась в среднем, в 10,5 раз, протеолитическая активность в 7,5 раз. У A. irakense КВС1 изменений в активности ферментов не выявлено.

3. Показано, что штаммы A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7 с увеличенными активностями ферментов в результате пассажа через растения колонизируют внутренние ткани корней пшеницы в большем количестве, чем исходные. Исключение составил штамм A. irakense КВС1, у которого степень колонизации внутренних тканей корней пшеницы не изменилась.

4. Установлено, что добавление в среду культивирования бактерий корневых эксудатов пшеницы вызывает увеличение протеолитической активности A. brasilense Sp7 на 37,5 % и увеличение пектатлиазной активности A. irakense КВС1 на 7,8 %.

5. В культуральной жидкости штаммов A. brasilense Sp245, A. brasilense Sp7 и A. irakense КВС1 обнаружена пектатлиазная активность, характеризующаяся зависимостью от ионов Са2+ и имеющая рН - оптимум в интервале значений 7,5-9,5. Методом зимографии показано, что штамм A. irakense КВС1 продуцирует внеклеточную пектатлиазу, представляющую собой полипептид с молекулярной массой около 45 кДа.

6. Выявлено, что протеолитическая активность культуральной жидкости штаммов A. brasilense Sp245, A. brasilense Sp7 и A. irakense КВС1 характеризуется зависимоу I стью от ионов Са и субстратной специфичностью в отношении желатина. Оптимум активности штаммов A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7 находится при значениях рН 5,5 и 8,8, штамма A. irakense КВС1 при значении рН 5,5. Методом зимографии показано, что данные штаммы характеризуются наличием не менее шести форм внеклеточных протеолитических ферментов с молекулярными массами в пределах от 32 до 172 кДа.

93

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактерии рода Azospirillum относят к классу факультативных эндофитов вследствие их способности колонизировать как поверхность корней растений, так и внутренние ткани растения. Получено достаточно много экспериментальных доказательств внутритканевой локализации азоспирилл. Одним из факторов, опосредующих проникновение бактериальной клетки в ткань корня и ее активную жизнедеятельность в этих условиях, является наличие у микроорганизмов экстраклеточных пекти-наз и протеаз. Однако оставалось не ясным, каким образом бактериальные клетки проникают внутрь ткани корня, так как вопрос наличия у бактерий этого рода пекто-литических и протеолитических ферментов оставался открытым. В последнее время считалось, что пектолитической способностью обладает только один из пяти имеющихся в роде Azospirillum видов, A. irakense. Но выполненные ранее работы свидетельствовали о наличии пектолитической активности у других видов Azospirillum, что, однако, до настоящего времени подтвердить не удавалось. Относительно наличия протеолитической активности у штаммов рода Azospirillum в литературе имеется крайне мало сведений.

Нами был проведен скрининг штаммов пяти известных видов рода Azospirillum по наличию этих признаков и оптимизирован состав среды A (Umali-Garsia М. et al., 1978) для определения пектолитической активности азоспирилл. Необходимость подобных разработок была вызвана, в частности, тем что на существующих средах для определения пектолитической активности азоспирилл нам не удалось зарегистрировать этот признак на достаточном для количественного измерения уровне > десяти тестированных штаммов видов A. brasilense, A. lipoferum, A. halopraeferans, А. amasonense. В состав среды А был дополнительно введен СаОг, увеличены концентрации дрожжевого экстракта и агара и снижена концентрация пектина. Основное преимущество среды D заключается в более высокой чувствительности по сравнению с описанными в литературе средами (в среднем, в 3,5 раза), что позволило регистрировать низкую пектолитическую активность у штаммов A. brasilense, A. lipoferum, А. halopraeferans, A. amasonense. Выявлено, что наиболее предпочтительным субстратом для "чашечного" теста пектолитической активности азоспирилл является свекловичный пектин.

87

Полученные нами значения величин зон лизиса пектина для штаммов A. brasilense несравненно меньше таковых, описанных ранее для этих штаммов в литературе paHee(Umali-Garsia М. et al., 1978; Plasinski J et al., 1985). Возможно, что у указанных протестированных штаммов произошло снижение экстраклеточной пекти-нолитической активности. Вероятной причиной данного эффекта может служить длительное хранение и культивирование на комплексных средах, а также на средах с органическими кислотами (малат и сукцинат), являющимися наиболее предпочтительным источником углерода для азоспирилл, усвоение которого не требует синтеза экстраклеточных пектиназ.

На среде для определения протеолитической активности (Шевченко О.В., 1999) был проведен скрининг штаммов A. brasilense Sp245, Sp7, CD, 107; A. lipoferum SR43, 59B, A. irakense KBC1, KA3; A. amazonenze Am 14, A. halopraeferans Au4. Результаты скрининга показали, что все протестированные штаммы при росте на плотных средах с казеином обладают способностью продуцировать экстраклеточные протеолитические ферменты. Эта способность у разных штаммов выражена в разной степени, но в целом характеризуется очень невысоким уровнем. Предпочтительным субстратом для определения протеолитической активности штаммов азоспирилл «чашечным» методом явился казеин.

Показано, что при длительном культивировании коллекционных штаммов азоспирилл на средах с пектином и казеином происходит увеличение пектолитической и протеолитической активностей, что находит выражение в увеличении диаметра зон лизиса субстратов вокруг колоний штаммов.

Вторая часть работы была посвящена изучению влияния пассажа через растения на выраженность признаков пектолитической и протеолитической активностей. В связи с этим нами были проведены эксперименты по инокуляции стерилизованных проростков пшеницы чистыми культурами штаммов A. irakense КВС1, A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7, выделению этих штаммов из поверхностно-стерилизованных корней и сравнительному определению пектолитической и протеолитической активности исходных и выделенных таким образом штаммов. Однако использование описанных в литературе методик стерилизации семян не позволило нам проводить длительное культивирование растений, так как более 80 % процентов проростков оказывалось зараженными плесневыми грибами. В связи с эти нами разрабо

88 тана методика глубокой стерилизации зерновок пшеницы, позволяющая получать растения пшеницы, свободные от посторонней микрофлоры как бактериальной, так и грибной этиологии (степень инфицирования растений к концу срока культивирования составила не более 10 %) и проводить длительное культивирование растений в стерильных условиях.

Выделение бактериальных клеток, проникших внутрь ткани корня пшеницы, проводили после 4 недельной инокуляции, бактерии штаммов A. brasilense Sp245 и A. irakense КВС1 начинали выделяться из поверхностно-стерилизованных корней уже через одну неделю после инокуляции. К концу четвертой недели количество выделяемых клеток увеличивалось и составило для этих штаммов, соответственно, (0,36 ± 0,05) х 103 и (0,86 ± 0,07) х 104 кл/г сырого веса корней. В результате первого пассажа на растениях нам не удалось выделить какого-либо количества клеток штамма А. brasilense Sp7 из поверхностно-стерилизованных корней. Однако после повторной инокуляции корней пшеницы клетками A. brasilense Sp7 первого пассажа, выделенных из корней, не прошедших поверхностную стерилизацию, через четыре недели удалось выделить небольшое количество клеток ((0,7 ± 0,05) х 102 кл/г сырого веса корней) из поверхностно-стерилизованных корней. Таким образом, количественные показатели инвазивности тестированных штаммов, полученные в результате эксперимента, находятся в некотором соответствии с данными о выраженности у этих штаммов признака пектолитической активности.

Чашечный» анализ пектолитической и протеолитической активностей штаммов A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245, выделенных из поверхностно - стерилизованных корней растений показал наличие у этих штаммов более высоких показателей в сравнении с исходными штаммами (рис. 7), что является косвенным доказательством участия этих активностей в процессах проникновения бактерий в ткани корней растения. Увеличение активности для этих штаммов в среднем составило: пектолити-ческая активность - в 10,5 раз, протеолитическая активность - в 7,5 раз. Данное изменение признаков стабильно сохранялось в течение 10-ти пересевов на соответствующих средах. Достоверной разницы между величинами зон лизиса у A. irakense КВС1 данным методом нам выявить не удалось, что, возможно, говорит о максимальной степени выраженности признака пектолитической активности у этого штамма.

89

При выделении бактерий из поверхностно-стерилизованных корней пшеницы, из популяции микробных клеток, находящейся в ассоциативных взаимоотношениях с растением, происходит отбор бактерий, способных колонизировать внутренние ткани корней пшеницы. И тот факт, что бактерии, способные к проникновению, обладают повышенной пектолитической и протеолитической активностью, косвенно доказывает роль этих ферментов как факторов, опосредующих проникновение бактерий внутрь ткани корня растения. Согласованное изменение этих признаков может свидетельствовать о совместном участии протеаз и пектиназ в процессах проникновения и жизнедеятельности микроорганизмов внутри корня растения.

Анализ количественных показателей, характеризующих взаимодействие штаммов A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7 с растением (прикрепление к поверхности корня, проникновение внутрь ткани корня и динамика численности бактерий на поверхности и во внутренности корня в процессе культивирования) показал, что в составе бактериальной популяции, прошедшей пассаж через растения, количество клеток, способных к проникновению внутрь ткани корня растения, выше в сравнении с исходными штаммами. Так, численность внутренней популяции A. brasilense Sp245 в 5,4 раза превысила исходный штамм, a A. brasilense Sp7, прошедший два пассажа через растения, выделялся из поверхностно-стерилизованных корней растений в количестве (2,0 ± 0,35)х103 кл/г сырого веса корней, тогда как исходный штамм колонизировал только поверхность корня пшеницы. Численность внутренней популяции у штамма Л. irakense КВС1, активность пектолитических и протеолитических ферментов которого при пассаже через растения пшеницы не изменилась, достоверно не отличалась от численности исходного штамма.

Полученные результаты свидетельствуют об активной роли пектолитических и протеолитических ферментов азоспирилл в проникновении бактериальных клеток во внутренние ткани корней пшеницы и обеспечении их жизнедеятельности в этих условиях.

Добавление в среду культивирования бактерий корневых эксудатов вызывало увеличение урожая клеток у всех исследованных штаммов, на 15,55 % (A. brasilense Sp7), 20,13 % (A. brasilense Sp245) и 16,7 % (A. irakense КВС1). Анализ кривых роста A. brasilense Sp7* A. brasilense Sp245* и A. irakense КВС1* на среде с добавлением корневых эксудатов показал, что происходит сокращении продолжительности лаг

90 фазы по сравнению с коллекционными штаммами. Это может свидетельствовать о том, что штаммы бактерий, выделенные из корней растений пшеницы, более адаптированы к росту на среде с эксудатами. Анализ удельной пектолитической и протеоли-тической активностей в культуральной жидкости штаммов A. brasilense Sp7* и А. irakense КВС1*, выращенных на жидкой среде LB с добавлением корневых эксудатов показал достоверное увеличение этих активностей в среднем на 37,5 % (протеазы А. brasilense Sp7*) и 7,3 % (пектатлиазы A. irakense КВС1*) в сравнении со средой без добавления корневых эксудатов. Этот факт позволяет предположить, что корневые эксудаты, помимо общего положительного влияния на рост бактериальной популяции, возможно, содержат компоненты, индуцирующие синтез бактериями экстраклеточных пектиназ и протеаз. Причем индуцирующее влияние в большей степени выражено в отношении экстраклеточных протеолитических ферментов, чем пектиноли-тических ферментов.

Нами предложен способ получения стерильных эксудатов корней пшеницы без примесей эксудатов семян, так как разработанная конструкция позволяет изолировать верхнюю часть проростка вместе с зерновкой от контакта с культуральной средой.

Изучение свойств экстраклеточных протеолитических и пектолитических ферментов показало, что пектатлиазы культуральной жидкости штаммов A. brasilense Sp7*, A. brasilense Sp245* и A. irakense КВС1 характеризуются оптимумом активности в щелочной области рН, нуждаются в присутствии ионов кальция и проявляют большую субстратную специфичность в отношении пектата натрия и свекловичного пектина. Методом зимографии показано, что культуральный фильтрат штамма А. irakense КВС1 характеризуется наличием одной зоны лизиса пектина на уровне 45 кДа, причем пассаж через растения не оказывал влияние на состав пектолитических ферментов. Методом радиальной диффузии показано наличие в культуральной жидкости Л. irakense КВС1 полигалактуроназной активности.

Внеклеточные протеолитические ферменты A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245* характеризуются оптимумом активности в широком интервале рН со слабо-выраженными пиками в кислой и щелочной областях (A. irakense КВС1* - только в области кислых значений), нуждаются в присутствии ионов кальция и проявляют большую субстратную специфичность в отношении желатина в сравнении с казеином и альбумином. Так как протеолитическая активность азоспирилл ингибируется до

91 бавлением ингибитора металлопротеаз - ЭДТА, вероятно, большая часть внеклеточных протеолитических ферментов азоспирилл относится к классу кальций-зависимых металлопротеаз. Зимография протеаз показала наличие в культуральной жидкости азоспирилл не менее шести форм протеолитических ферментов, активных в отношении желатина. Несмотря на то, что всем трем тестированным штаммам свойственно наличие сходных форм протеаз, набор и количество этих ферментов несколько различается.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об активной роли пектолитических и протеолитических ферментов азоспирилл в проникновении бактериальных клеток во внутренние ткани корней пшеницы и обеспечении их активной жизнедеятельности в этих условиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чернышова, Марина Павловна, Саратов

1. Антонюк Л.П., Сумарока М.В., Игнатов В.В. Влияние лектина пшеницы на фосфолипидный состав мембран бактерии Azospirillum brasilense //Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т 35. - С. 60-62.

2. Большой практикум по физиологии растений /Под ред. Б.А. Рубина. М.: "Высшая школа", 1978. - 347 с.

3. Бурцева Т.И., Лоенко Ю.Н. Трипсиноподобная протеиназа и ее эндогенный ингибитор из Yersinia pseudotuberculosis. Биологическая активность //Биохимия. -1999.-Т 64, Вып. 9.-С. 1175-1179.

4. Васильева К.В., Гладких Т.А. Методика изучения роли пектолитических ферментов Verticillium dahliae Kleb в развитии инфекционного увядания (вилта) хлопчатника /В кн.: "Методы исследования патологических изменений растений". М.: "Колос", 1976. - С. 39-45.

5. Васильева К.В., Гладких Т.А. Множественность форм пектолитических ферментов /В кн.: "Биохимия иммунитета, покоя и старения". М.: "Наука", 1984. - С. 12-32.

6. Волкогон В.В., Миняйло В.Г., Лемешко С.В., Онищенко Л.И. Специфичность взаимодействия бактерий рода Azospirillum со злаковыми травами //Микробиологический журнал. 1995. - Т 57, № 3. - С. 9-15.

7. Волкогон В.В., Хальчицкий А.Е., Миняйло В.Г. Азотфиксирующие микроорганизмы корневой зоны райграса и костреца /Микробиологический журнал. 1991. - Т 53, № 6. - С. 3-10.

8. Гладких Т.А., Васильева К.В., Метлицкий Л.В. Множественность форм пектин-транс-элиминазы Verticillium dahliae Kleb. возбудителя вилта хлопчатника //Прикладная биохимия и микробиология. - 1978. - Т 14. - С. 833.

9. Глинка Е.М., Гладких Т.А., Проценко М.А. Выделение белкового ингибитора полигалактуроназы из клубней картофеля //Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т 33, № 5. - С. 503-507.94

10. Глинка Е.М., Проценко М.А. Белковый ингибитор полигалактуроназы из клеточной стенки растения //Биохимия. 1998. - Т 63, Вып. 9. - С. 1189-1195.

11. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Исследование начальных этапов взаимодействия бактерий Azospirillum brasilense с корнями проростков пшеницы: адсорбции, деформации корневых волосков //Микробиология. 2000. - Т 69. - С. 120-126.

12. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Дыкман JI.A., Игнатов В.В. Роль полисахаридосодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерий на корнях проростков пшеницы //Микробиология. 2001. - Т 70.-С. 45-60.

13. Емцев В.Т., Чумаков М.И. Критерии ассоциативности для бактерий, находящихся в диазотрофном биоценозе с небобовыми растениями //Микробиологический журнал. 1998. - Т 50. - С. 93-102.

14. Захарова Е.А. Синтез индолил-3-уксусной кислоты и его регуляция у бактерий Azospirillum brasilense: Дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1998. - 132 с.

15. Иванов В.П. Растительные выделения и их значение в жизни фитоценозов. М.: "Наука", 1973. - 149 с.

16. Карпунина Л.В., Никитина В.Е. Азотфиксирующая способность имммобилизованных клеток Azospirillum brasilense // Прикладная биохимия и микробиология. 1987. - Т XXIII. - Вып. 4. - с. 558-560.

17. Карпунина JI.B., Никитина В.Е., Воротилова Н.А., Коновалова Н.Г., Шатаева J1.K. Изучение азотфиксирующей способности клеток Azospirillum brasilense Sp. 7, иммобилизованных на мелкопористых сорбентах // Биотехнология. 1989. - Т 5. -№2.-с. 208-211.

18. Карпунина JI.B., Савенкова Н.Н., Вишневецкая О.А., Никитина В.Е., Мордкович С.С. Изучение нитрогеназной активности бактерий рода Azospirillum на корнях пшеницы // Известия академии наук СССР. Сер. Бйологическая. 1989. - № 2 - с. 304-308.95

19. Клечковская Е.А., Адамовскач В.Г., Вольф Г.А., Вовчук С.В. Роль гидролаз и ингибиторов трипсина в формировании устойчивости озимой пшеницы к поражению фузариозными грибами //Физиология растений. 1998. - Т 45, № 6. - С. 841-849.

20. Майорова Т.Н. Популяционная экология Azospirillum brasilense: Автореферат дис. . канд. биол. наук. Москва, 1996. - 20 с.

21. Методы химии углеводов /Пер. с англ. Под ред. Н.К. Кочеткова. М.: "Мир", 1967. -376 с.

22. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. -М.: "Наука", 1968. 532 с.

23. Молекулярная генетика взаимодействия бактерий с растениями. М.: "Агропромиздат", 1988. - 416 с.

24. Нгуен Т.Х., Тон Т.Н.Б., Тарасенко В.А., Козыровская Н.А. Азотфиксирующие бактерии колонизирую корни риса // В кн.: Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями. Пущино, 1989. - С. 146-171.

25. Остерман J1.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование М.: "Наука", 1981. - 286 с.

26. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология М.: "Колос", год. - С. 6566.

27. Позднякова Л.И. Методические рекомендации по выделению и изучению бактериальных ферментов пектолитического и протеолитического комплексов -Саратов, 1981.-С. 3-11.

28. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.Ф., Барышева Н.Н., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области //Микробиология. 1988. - Т 57. - С. 275-278.

29. Румянцева Г.Н., Родионова Н.А., Мартинович Л.И. Очистка и характеристика двух типов Р-глюкозидаз: цедллобиазы и арил-р-глюкозидазы //Целлюлазы микроорганизмов. 1981. - С. 83-93.

30. Скворцов И.М. Муцигель и слизь с поверхности корней растений //Успехи современной биологии. 1994. - Т 114, Вып. 3. - С. 372-384.

31. Фурина Е.К., Бонарцева Г.А., Львов Н.П. Влияние различных концентраций кислорода, . нитрата и молибдена на азотфиксацию и денитрификацию у Azospirillum lipoferum //Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т 35. - С. 50-54.

32. Хасирджева А.К. Хроматографическая очистка микробных пектиназ и целлюлаз и использование их при изолировании протопластов высших растений. Дис. . канд. биол. наук. Москва, 1984. - 158 с.

33. Жаме Э., Гуззарди П., Салва И. Что говорят нам трансгенные растения о регуляции и функции экстенсинов структурных белков клеточной стенки? // Физиология растений. - 2000. - Т 47. - №3. - с. 360-369.

34. Шевченко О.В. Протеолитическая активность возбудителя сибирской язвы: Дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1999. - 99 с.

35. Aggarwall P., Chaundhary К. Bilogical nitrogen fixation at elevated temperature in different Azospirillum species and strains // Biol. Fertil. Soils. 1995. Vol. 20. - P. 260262.

36. Alvarez R. Isolation of atmospheric-nitrogen-fixing spirilla from the waters of the Parana delta and other rivers IIRev. Argent. Microbiol. 1984. - Vol. 16, N 2. - P. 93-6.

37. Andreeva I.N., Redkina T.V., Ismailov S.F. The involvement of indoleacetic acid in the stimulation of Rhisobium- legum simbiosis by Azospirillum brasilense //Russ. J. Plant. Physiol. 1993. - Vol. 40. - P. 901- 906.97

38. Antonyuk L.P., Formina. O.R., Kalinina A., Semenov S., Nesmeyanova M., Ignatov V. The effect wheat lectin possibly serves as a signal molecule in the Azospirillum wheat assotiation //NATO ASI Ser. G. - 1995. - Vol. 37. - P. 319-324.

39. Bacic A., Moody S.F., Clarke A.E. Structural analysis of secreted root slime from maize (Zea mays L.) //Plant. Physiol. 1986. - Vol. 80, N 3. - P. 771-777.

40. Baldani V.L.D., Dobereiner J. Host plant specificity in the infection of maize, wheat and rice with Azospirillum spp. //Int. Workshop Assoc. N2-Fixation (Piracicaba, 1979) Abstr.-Piracicaba: West Palm Beach. Fla. s. a. 1979. - P. 15.

41. Baldani V.L.D., Baldani J. I., Dobereiner J. Inoculation of field-grown wheat (Triticum aestivum) -with. Azospirillum spp. //Brasil. Biol. Fertil. Soils. 1987. - Vol. 4. - P. 37-40.

42. Baldani V.L.D., Dobereiner J. Host plant specificity in the infection of cereals with Azospirillum spp. //Soil. Biol. Biochem. 1980. - № 12. - P. 433-439.

43. Barbar C.E., Tang J.L., Feng J.X. A novel regulatory system required for pathogenicity of Xanthomonas campeslris is mediated by a small diffusible signal molecule //Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24, № 3. - P. 535-566.

44. Barbieri P., Galli E. Effect on wheat root development of inoculation with an Azospirillum brasilense mutant with altered indole-3-acetic acid production //Res. Microbiol. 1993. - Vol. 144, N 1. - P. 69-75.

45. Bashan Y., Holguin G. Inter-root movement of Azospirillum brasilense and subsequent root colonisation of crop and weed seedlings growing in soil //Microbial Ecology. -1995.-Vol. 29.-P. 269-281.

46. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) //Can. J. Bacteriol. - 1997. - Vol. 43. - P. 103-121.98

47. Bashan Y., Levanony H. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture //Can. J. Microbiol. 1990. - Vol. 36. - P. 591-608.

48. Bashan Y., Levanony H. Factors affecting adsorption of Azospirillum brasilense Cd to root hairs as compared with root surface of wheat //Can. J. Microbiol. 1989. - Vol. 35. -P. 936-944.

49. Bashan Y., Levanony H. Migration, colonisation and adsorption of Azospirillum brasilense to wheat roots //Lectins biology, biochemistry, clinical biochemistry. Eds.: T.C. Bog-hansen, C.H. Brognen and J.L. Ochox. Vol. 6, Walter de Gnuyter, Berlin, 1987.

50. Bashan Y., Levanony H., Whitmoyer R. Root surface colonization of non-cereal crop plants by pleomorphic Azospirillum brasilense Cd //Journal of General Microbiology. -1991.-Vol. 137.-P. 187-196.

51. Bashan Y., Ream Y., Levanony H., Sade A. Nonspecific responses in plant growth, yield and root colonization of noncereal group plants to inoculation with Azospirillum brasilense Cd //Can. J. Bot. 1989. - Vol. 67. - P. 1317-1324.

52. Bashan Y., Singh M., Levanony H. Contribution of Azospirillum brasilense Cd to growth of tomato seedlings is not trough nitrogen fixation //Can. J. Bot. 1989. - Vol. 67. - P. 2429-2434.

53. Becking J.H., Boer W.E., Howink A.L. Electron microscopy of the endophyte of Alnus glutinosa. //Ant. van Leenwenhoek J. Microbiol. Serol. 1964. - Vol. 30. - P. 343.

54. Beijerinck M.W. Under ein Spirillum, welches freien stickstoff binden kaan //Zentralbaltt fur Bacteriologie, parasitenkunde und Infektionskrankheiten. 1925. -Vol. 63.-P. 353-359.

55. Bekri M.A., Desair J., Keijers V., Proost P., Searle-van Leeuwen M., Vanderleyden J., Vande Broek A. Azospirillum irakense produces a novel type of pectate lyase //J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 2440-2447.

56. Bhagvwat A.T., Thomas J. Legume-Rhizobium interactions: cowpea root exudate elicits faster nodulation response by Rhizobium species //Appl. Environ. Microbiol. 1982. -Vol.43.-P. 800-805.

57. Bhuneswari T.V., Bauer W.D. Role of lectin in plant-microbe interaction //Plant Physiol.- 1979.-Vol. 62.-P. 71-74.

58. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. The serotyping of Azospirillum spp. by cell-gold immunoblotting //FEMS Microbiol. Lett. 1992. - P. 115-118.

59. Bothe H., Korsgen H., Lehmacher T. and Hundeshagen B. Differential effects of Azospillum, auxin and combined nitrogen on the growth of roots of wheat // Symbiosis.- 1992. -Vol. 13. -P. 167-179.

60. Burris R.H., Roberts G.P. Biological nitrogen fixation //Annu. Rev. Nutr. 1993. - Vol. 13.-P. 317-335.

61. Callaham D., Torrey J. The structural basis for infection of root hairs ofTrifolium repens by Rhizobium //Can. J. Microbiol. 1981. - Vol. 59. - P. 1647-1664.

62. Carnahan J.E., Mortenson L.E., Mower H.F., Castle J.E. Nitrogen fixation in cell-free extracts of Clostridim pasteurianum //Biochim. Biophys. Acta. 1960. - Vol. 38. - P. 188-189.

63. Castellanos Т., Ascencio F., Bashan Y. Cell-surface lectins of Azospirillum spp. // Y. Curr. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 241-244.

64. Chaboud A. Isolation, purification and chemical composition of maize root cap slime // Plant. Soil. 1983. - Vol. 73. - P. 395-402.

65. Christiansen-Weniger C. An influence of plant growth substances on growth and nitrogenase activity from Azospirillum brasilense 11 Azospirillum IV, Kligmuller W., ed. Springer-Verlag, New-York, 1988. P. 141-149.

66. Currier W.W., Strobel G.A. Chemotaxis of Rhizobium spp. to plant root exudates //Plant Physiol. 1976. - Vol. 57. - P. 820-823.

67. Currier W.W., Strobel G.A. Chemotaxis of Rhizobium spp. to a glycoprotein prodused by biedsfoot trefoil roots //Science. 1976. - Vol. 196. - P. 434-436.100

68. Currier W.W., Strobel G.A. Characterization and biological activity of trefoil chemotactin //Plant. Sci. Lett. 1981. - Vol. 21. - P. 159-165.

69. Dahm H., Rozycki H., Strzelczyk E., Li C.Y. Production of B-group vitamins by Azospirillum spp. grown in media of different pH at different temperatures //Zentralbl Mikrobiol. 1993. - Vol. 148. - P. 195-203.

70. Dazzo F.B. Bacterial adhesion to plant root surfaces //Microbial adhesion and aggregation. Ed.: Marshall K.C. Dahlem Konferenzen. Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo: Springer-Verlag, 1984. P. 85-93.

71. Dazzo F.B., Hrabak M.R. Regulation of recognition in the Rhizobium clover symbiosis // In: Current Perspectives in nitrogen fixation. Gibson A.H. and Newton W.E., eds. Australian Academy of Science, Canberra, 1981. - P. 292-195.

72. De Troch P., Vanderleyden J.F. Surface Properties and Motility of Rhizobium and Azospirillum in Relation to Plant Root Attachment //Microb. Ecol. 1996. - Vol. 32. -P. 149-169.

73. Debette L. Isolation and characterization of an extracellular proteinase produced by a soil strain of Xanthomonas maltophila //Curr. Microbiol. 1991. - V. 22, № 2. - P. 8590.

74. Delgado L., Trejo B.A., Huitron C., Aguilar G. Pectin lyase from Aspergillus spp. CH-Y-1043 //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. - Vol. 39. - P. 515-519.

75. Dobereiner J. History and new perspectives of diazotrophic association with non -leguminous plants //Symbiosis. 1992. - Vol. 13. - P. 1-13.

76. Dobereiner J., Baldani V.L. Selective infection of maize roots by streptomycin-resistant Azospirillum lipoferum and other bacteria //Can. J. Microbiol. 1979. - Vol. 25, N 11.-P. 1264-1269.101

77. Dobereiner J., Baldani V.L.D., Olivares F., Reis V.M. Endophytic diazotrophs: the key to BNF in gramineous plants //Hegazi N.A., Fayez M., Monib M. (ed.). Nitrogen fixation with non legumes. American Universisty of Cairo Press, Cairo, Egypt, 1993.

78. Dow J. M., Clarke B.R., Milligan D.E., Tang J.-L., Daniels M.I. Extracellular proteases from Xanthomonas campestris pv. campestris, the black rot pathogen //Appl. Environ. Microbiol. 1990. - Vol. 56, № 10. - P. 2994-2998.

79. Eady R.R., Smith B.E., Lowe D.J., Torneley R.N., Hawkes Т., Dixon R.A., McLean P., Postgate J.R. The structure and function of nitrogenase //Biochem. Sci. Trans. 1981. -Vol. 9, N 2. - P. 75.

80. Eady R.R., Kahn D., Buchanan-Wollaston V. Molecular enzymology of nitrogen fixation //Isr. J. Bot. 1982. - Vol. 31. - P. 45-60.

81. Eckert В., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffels M., Hartmann A. Azospirillum doebereinerae sp. nov. a diazotrophic bacterium associated with Miscanhus sinesis 'Giganteus //Int. J. System. Evolut. Microbiol. 2000. (In press)

82. Eskew D.L., Focht D.D., Ting I.P. Nitrogen fixation, denitrification, and pleomorphic growth in a higli pigmented Spirillum lipoferum //Appl. Environ. Microbiol. 1977. -Vol. 34.-P. 582-585.

83. Elshanshoury A.R. Interactions of Azotobacter chroococcum, Azospirillum brasilense and Streptomyces mutabilis, in relation to their effect on wheat development //J. Agron. Crop. Sci.-1995.-Vol. 175.-P. 119- 127.

84. Fages J., Arsac J.F. Sunflower inoculation with Azospirillum and other plant growth promoting rhisobacteria //Plant. Soil. 1991. - Vol. 137. - P. 87- 90.

85. Falk E.C., Doeberener J., Jonson J.L., Krieg N.R. Deoxyribonucleic acid homology of Azospirillum amazonense and emendation of the description of the genus Azospirillum //Inter. J, Syst. Bacteriol. 1985. - Vol. 35. - P. 117-118.

86. Falk E.C., Jonson J.L., Baldani V.L., Doeberener J., Krieg N.R. Deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid homology studies of the genera Azospirillum and Conglomeromonas //Inter. J. Syst. Bacteriol. 1986. - Vol. 36. - P. 80-95.102

87. Fani R., Bandi C., Bazzicalupo M., Ceccherini M.T., Fancelli S., Gallori E., Gerace L., Grifoni A., Miclaus N., Damiani G. Phylogeny of the genus Azospirillum based on 16S rDNA sequence //FEMS Microbiol. Lett. 1995. - Vol. 15;129 (2-3). - P. 195-200.

88. Favey S., Bourson C., Bertheau Y., Kotoujansky A., Boccara M. Purification of the acidic pectate lyase and nucleotide sequense of the correspondind gene (pelA) of Ervinia chrysanthemi strain 3937 //J. Gen. Microbiol. 1992. - Vol. 138. - P. 499-508.

89. Favilli F., Pastorelli R., Gori A. Response of sugar beet to Azospirillum bacterization in field experiments //Agric. Mediter. 1993. - Vol. 123. - P. 281- 285.

90. Ferreira M.C.B., Fernandes M.S., Dobereiner J. Role of Azospirillum brasilense nitrate reductase in nitrate assimilation by wheat plants //Biol. Fert. Soils. 1987. - Vol. 4. - P. 47-53.

91. Franke I.H., Fegan M., Hayward A.C., Sly L.I. Nucleotide sequence of the nifR gene coding for nitrogen reductase in the acetic acid bacterium Acetobacter diazotrophicus /ILett. Appl. Microbiol. 1998. - Vol. 26. - P. 12-16.

92. Gallori E., Bazzicalupo M. Effect of nitrogen compounds on nitrogenase activity in Azospirillum brasilense //FEMS Microbiol. Lett. 1985. - Vol. 28. - P. 35-38.

93. Govedarica M., Milosevic N., Jarak M., Vojvodic V.M. Effectiveness of Azospirillum lipoferum strain in carrot //Zemljiste Biljka 1993. - Vol. 42. - P. 121-125.

94. Halsall D.M., Gibson A.D. Cellulose decomposition and associated nitrogen fixation by mixed cultures of Cellulomonas gelida and Azospirillum species or Bacillus macerans //Appl. Environmen. Microbiol. 1985. - Vol. 49. - P. 1021-1026.

95. Halsall D.M., Turner G.L., Gibson A.D. Utilization straw and xilan by pure cultures nitrogen- fixating Azospirillum spp. //Appl. Environmental. Microbiol. 1985. - Vol. 49. -P. 423-428.103

96. Halverson L.J., Stacey G. Host recognition in the Rhizobium soybean symbiosis. Detection of a protein factor in soybean root exudate which is involved in the nodulation process //Plant. Physiol. - 1984. - Vol. 74. - P. 84-89.

97. Harris P.J., Northcote D.H. Patterns of polysoccaride biosynthesis in differentiating cells of maize root-tips //Biochem. J. 1970. - Vol. 120. - P. 479-491.

98. Holguin G., Bachan Y. Nitrogen-fixing by Azospirillum brasilense Cd is promouted when co-cultured with a mangrove rhizosphere bacterium (Staphylococcus spp.) //Soil. Biol. Biochem. 1996. (In press).

99. Hurek Т., Reinhold-Hurek B. identification of grass-associated and toluene-degrading diazotrophs, Azoarcus spp., by analysis of partial 16S ribosomal DNA sequences //Appl. Environ. Microbiol. 1995. - Vol. 61. - P. 2257-2261.

100. Irving H.R., Grant B.R. The effect of pectin and plant root surface carbogidrates on encystment and development of Phytophtora cinnamoni zoospores //J. Gen. Microbiol. -1984.-Vol. 130.-P. 1015-1018.

101. Jagnow, G. Nitrogen-fixing bacteria associated with graminaceous roots with special reference to Spirillum lipoferum Beijerinck IIZ. Pflenzenernahr. Bodenkd. 1979. - Vol. 142.-P. 399-410.104

102. Jagnow G. Nitrogen-fixing bacteria associated with graminaceous roots with special reference to Spirillum lipoferum Beijerinck //Z. Pflenzenernahr. Bodenkd. 1979. -Vol. 142.-P. 399-410.

103. Jain D., Patriquin D. Root hair deformation. Bacterial attachment, and plant growth in weat-Azospirillum interaction //Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 48. - P. 1208-1213.

104. James E.K., Reis V.M., Olivares F.L., Baldani J.I., Dobereiner J. Infection of sugarcane by the nitrogen-fixing bacterium Acetobacter diazotrophicus //J. Exp. Bot. -1994.-Vol. 45.-P. 757-766.

105. Jones B.L., Fontanini D., Jarvinen M., Pekkarinen A. Simplified endoproteinase assays using gelatin and azogelatin //Anal. Chem. 1998. - Vol. 263. - P. 214-220.

106. Kaiser P. Diazotrophic mixed cultures of Azospirillum brasilense and Enterobacter cloaceaf!NATO ASI Ser. Ser. G. 1995. - Vol. 37. - P. 207- 212.

107. Karpati E., Kiss P., Ponyi Т., Fendrik I., de Zamaroczy M., Orosz L. Interaction of Azospirillum lipoferum with wheat germ agglutinin stimulates nitrogen fixation //J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 3949-3955.

108. Katupitiya S., New P.B., Elmerich C., Kennedy J.R. Improved nitrogen fixation in 2,4- D-treated wheat roots associated with Azospirillum lipoferum studies of colonization using reporting genes //Soil. Biol. Biochem. 1995. - Vol. 27. - P. 447452.

109. Kavimandan S.K., Subba Rao N.S., Mohrin A.V. Isolation of Spirillum lipoferum from the stems of wheat and nitrogen fixation in enriched cultures //Curr. Sci. 1978. -Vol. 47.-P. 96.

110. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P. A., Kaiser P. Azospirillum irakense spp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil //Res. Microbiol. 1989. - Vol. 140. - P. 679 - 693.

111. Khammas K.M., Kaiser P. Pectin decomposition and associated nitrogen fixation by mixed cultures of Azospirillum and Bacillus species //Can. J. Microbiol. 1992. - Vol. 38.-P. 794-797.105

112. Kirchhof G., Hartmann A. Development of gene-probes for Azospirillum based on 23S-rDNA sequences //Symbiosis. 1992. - Vol. 13. - P. 27-35.

113. Kirchhof G., Schloter M., ABmus В., Hartmann A. Molecular microbial ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes //Soil. Biol. Biochem. -1997.-Vol. 29.-P. 853-862.

114. Kijne J.W., Van der Shaal I.A.M., De Vries G.E. Pea lectins and the rekoghition of the Rhizobium leguminosarum //Plant. Sci. Lett. 1980. - Vol. 18. - P. 65-67.

115. Kopp S., Abril A. Effect of inoculation with Azospirillum spp. on forage grasses in highland pastures of the Sierras de Cordoba, Argentian //Rev. Argent. Microbiol. -1997.-Vol. 29.-P. 103-107.

116. Krol M.J., Perzyuishi A. Cellulose and xilan utilization by pure cultures of nitrogen-fixing Azospirillum spp. //Abstracts IV European Nitrogen fixation conference. Sevilla.Spain, 2000.-P. 143.

117. Kulinska D. Occurrence of Azospirillum in Polish soils //Acta. Microbiol. Pol. -1983.-Vol. 32.-P. 265-826.

118. Lakshmi V., Satyanarayana Rao A. Establishment and survival of Spirillum lipoferum //Indian. Acad. Sci. 1977. - Vol. 86. - P. 397.

119. Leschine S.B., Holwell K., Canale-Parola E. Nitrogen fixation by anaerobic cellulolytic bacteria //Science. 1988. - Vol. 242. - P. 1157-1159.

120. Levanony H., Bashan Y., Romano В., Klein E. Ultrustructural localization and identification of Azospirillum brasilense Cd on and within wheat root by immuno-gold labeling //Plant. Soil. 1989. - Vol. 117. - P. 207-218.

121. Liao C.-H. Cloning of pectate lyase gene pel from Pseudomonas fluorescens and detection of sequences homologous to pel in Pseudomonas viridiflava and Pseudomonas putida //J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 4386-4393.106

122. Lynch J.M., Horper S.H.T. Straw as a substrate for cooperative nitrogen fixation //J. Gen. Microbiol. 1983. - Vol. 129. - P. 251- 253.

123. Magro P., DiLenna P., Marciano P., Pallavicini C. Variability of polygalacturonase and protein isoelectric focusing patterns in Botrytis cinerea isolates //J. Gen. Microbiol. 1980. - Vol. 120. - P. 105-109.

124. Matthews S.W., Schank S.C., Aldrich H.C., Smith R.L. Peroxidase-antiperoxidase labeling of Azospirillum brasilense in field-grown pearl-millet //Soil. Biochem. 1983. -Vol. 15.-P. 699-703.

125. Mitchell J.E. The effect of roots on the activity of soil-borne plant pathogens //R. Heitefiiss and P.H. Williams, eds. Physiology and Plant Pathology. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg & New York, 1976. P. 104-125.

126. Moody S.F., Clarke A.E., Basic A. Structural analysis of secreted slime from wheat and cowpea roots //Phytochemistry. 1988. - Vol. 27. - P. 2857-2861.

127. Morales V.E., Martinez-Molina E., Hubbell D. Cellulase production by Rhizobium //Plant. Soil. 1984. - Vol. 80. - P. 407-415.

128. Mori E., Fulchieri M., Indorato C., Fani R., Bazzicalupo M.J. Cloning, nucleotide sequencing, and expression of the Azospirillum brasilense long gene: involvement in iron uptake //Bacterid. 1996. - Vol. 178. - P. 3440-3446.107

129. Nur I., Окоп Y., Henis Y. Comparative studies of nitrogen-fixing bacteria associated with grasses in Israel with Azospirillum brasilense //Can. J. Microbiol. 1980. - Vol. 26.-P. 714-718.

130. Odunfa S.A., Werner D. Root exudates in relation to growth and nitrogenase activity of Rhizobium japonicum //Z. Allg. Microbial. 1981. - Vol. 21. - P. 601-606.

131. Oh K.H., Seong C.S., Lee S.W., Kwon O.S., Park Y.S. Isolation of a psychrotrophic Azospirillum spp. and characterization of its extracellular protease //FEMS Microbiol. Lett.-1999.-Vol. 174.-P. 173-178.

132. Окоп Y., Kapulnic Y. Development and function of Azospirillum-inoculated roots //Plant. Soil. 1986. - Vol. 90. - P. 3-16.

133. Окоп Y., Labandera-Gonzalez C.A. Agronomic applications of Azospirillum: an evaluation of 20 years worldwide field inoculation // Soil. Biol. Biochem. 1994. - Vol. 26.-P. 1591-1601.

134. Olivares F.L., Baldani V.L.D., Reis V.M., Baldani J.I., Dobereiner J. Occurrence of the endophytic diazotrophs Herbaspirillum spp. in roots, stems, and leaves predominanly of gramineae //Biol. Fertil. Soils. 1996. - Vol. 21. - P. 197-200.

135. Patriquin D.G. New developments in grass-bacteria associations //Advanches in Agricultural Microbiology. Ed. N.S. Subba Rao, 1981. P. 139-190. Oxford and IBH Publishing Co., New Delhi.

136. Patriquin D.G., Dobereiner J., Jain D.K. Sites and processes of associations between diazothrophs and grasses //Can. J. Microbiol. 1983. - Vol. 29. - P. 900-915.

137. Patriquin D.G., Dobereiner J. Light microscopy observations of tetrazolium-reducing bacteria in the endorhizosphere of maize and other grasses in Brazil //Can. J. Microbiol. 1978. - Vol. 24. - P. 734-742.

138. Paul R.E., Jonson C.M., Jones R.L. Studies of the secretion of maize cap slime. Some properties of the secreted polymer //Plant. Physiol. 1975. - Vol. 56. - P. 300306.

139. Perotti E., Chapo G., Menendez L., Pidello A. Survival of Azospirillum in the rhizosphere of Festuca arundinacea //Rev. Argent. Microbiol. 1985. - Vol. 17. - P. 103-108.

140. Perroud В., Bandhari C.K., Elmerih C. The nifHDK operon of Azospirillum brasilense Sp 7 //Azospirillum III: genetics, Physiology, Ecology (Klingmuller W., Ed.), Springer, Berlin. 1985. - P. 10-19.108

141. Picoli P., Bottini R. Effects of C/N ratio, N content, pH, and incubation time on growth and gibberellin production by Azospirillum lipoferum //Simbiosis. 1994. - Vol. 17.-P. 229- 239.

142. Plasinsky J., Rolfe B. G. Analysis of pectolytic activity of Rhisobium and Azospirillum strains isolated from Trifolium repens //J. Plant. Physiol. 1985. - Vol. 120.-P. 181-187.

143. Proteolytic enzymes: a practical approach /Edited by R.J. Beynon, J.S. Bond IRL Press at Oxford University Press 1990. P. 259.

144. Quiviger В., France C., Lutfalla G., Rice D., Haselcorn R., Elmerih C. Cloning of a nitrogen fixation (nif) gene cluster of Azospirillum brasilense //Biochemic. 1982. -Vol. 64. - P. 495-502.

145. Reinhold В., Hurek Т., Niemann E.G., Fendrik I. Close association of Azospirillum and diazotrophic rods with different root zones of Kallar grass //Appl. Environ. Microbiol. &&. - Vol. 16. - P. 520-526.

146. Reinhold В., Hurek Т., Fendrik I. Cross reaction of predominant nitrogen - fixing bacteria with envelop, round bodies in the root interior of Kallar grass //Appl. Environ. Microbiol. - 1987. - Vol. 53. - P. 889-891.

147. Rennie R.J. A single medium for the isolation of acetylene-reducing (dinitrogen-fixing) bacteria from soils //Can. J. Microbiol. 1981. - Vol. 27. - P. 8-14.

148. Rennie R.E., Larson R.I. Dinitrogen fixation associated with disomic chromosome substitution lines of spring wheat //Can. J. Bot. 1979. - Vol. 57. - P. 2771-2775.

149. Rougier M., Chaboud A. Mucilage secreted by roots and their biological function /Лет. J. Bot. 1985. - Vol. 34. - P. 129-146.109

150. Safo-Sampah S., Torrey J.G. Polysaccharide-hydrolyzing enzymes of Franckia (Actinomycetales) //Plant. Soil. 1988. - Vol. 112. - P. 89-97.

151. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989. - Vol. I. - P. 132144.

152. Schloter M.G., Hartmann A. Endophytic and surface colonization of wheat roots (Triticum aestivum) by different Azospirillum brasilense strains studied with strain-specific monoclonal antibodies //Symbiosis. 1998. - Vol. 25. - P. 159-179.

153. Shimshick E.J., Herbert R.R. Biding characteristics of N2-fixing bacteria to cereal roots //Appl. Environ. Microbiol. 1981. - Vol. 38. - P. 447-453.

154. Sigma Cell Culture Cataloque & Price List. 1994. - P. 169-171.

155. Skvortsov I.M., Ignatov V.V. Extracellular polysaccharides and polysaccharide-containing biopolymers from Azospirillum species: properties and the possible role in interaction with plant roots //FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 15. - P. 223-229.

156. Smith R.L., Schank S.C., Milam I.R., Baltensperger A.A. Responses of Sorghum and Pennisetum species to the N2-fixing bacterium Azospirillum brasilense //Appl. Environ. Microbiol. 1984. - Vol. 47. - P. 1331-1336.

157. Souza E.M., Pedrosa F.O., Drummond M., Rigo L.U., Yates M.G. Control of Herbaspirillum seropedicae NifA activity by ammonium ions and oxygen /J. Bacteriol. 1999.-Vol. 181.-P. 681-684.110

158. Sriskandarajah S., Kennedy I.R., Yu D., Chan Y.T. Effect of plant growth regulators on acetylene-reducing associations between Azospirillum brasilense and wheat //Plant. Soil. 1993. - Vol. 153. - P. 165-177.

159. Srivastava A.K., Prasad M. The production of protease in cultures of Xanthomonas canpestris pv phaseoli and its activities in pea leaf tissues of varied responses //Zentral. Microbiol. 1989. - Vol. 144. - P. 23-27.

160. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects //FEMS Microbiol. Rev. 2000. - Vol. 24. - P. 487-506.

161. Stewart W.D.P. Nitrogen fixation its current relevance and future potential //Int. J. Bot.- 1983.-Vol. 32.-P. 5-44.

162. Strelczyk E., Kampert M., Li C.Y. Cytokininlike substances and ethylene production by Azospirillum in media with different carbon sources //Microbiol. Res. 1994. - Vol. 149.-P. 55-60.

163. Sutherland I.W. Polysaccaride lyases //FEMS Microbiol. Rev. 1995. - Vol. 16. - P. 323-347.

164. Tang I. L., Gough G. L., Barber C.E., Daniels M.J. Xanthomonas campestris pv campestris protein similar to actability activation factor is involved in regulation of phytopathogenicity //Mol. J. Genetic. 1987. - Vol. 210. - P. 443-440.

165. Tien T.M., Diem H.G., Gaskins M.H., Hubbell D.H. Polygalacturonic acid transeliminase production by Azospirillum species //Canad. J. Microbiol. 1981. - Vol. 27.-P. 429-431.

166. Tomarelli R.M., Charney J., Harding M.L. The use of albumin as a substrate in the colorimetric determination of peptic and tryptic activity //J. Lab. Clin. Med. 1949. -Vol. 34.-P. 428-433.

167. Trinick M.J. Structure of nitrogen-fixing nodules formed by Rhisobium on roots of Parasponia andereonii Planch //Can. J. Microbiol. 1979. - Vol. 25. - P. 565-578.1.l

168. Tyler M.E., Milam J.R., Smith R.L., Schank S.C., Zuberer D.A. Isolation of Azospirullum from diverse geographic regions //Can. J. Microbiol. 1979. - Vol. 25. -P. 693-697.

169. Umali-Garsia M., Hubbel D.H., Gaskins M.H. Process of infection of Panicum maximum by Spirillum lipoferum //Environmental role of nitrogen-fixing blue-green algae and asymbiotic bacteria. Ecol. Bull. (Stockholm), 1978. Vol. 26. - P. 373-379.

170. Umali-Garsia M., Hubbel D.H. Adsorption and mode of entry of A. brasilense to grass roots. Associative N2 fixation //Ed. P.V. Vose, A.P. Rusche. - 1979. - Vol. 1. -P. 49-62.

171. Umali-Garsia M., Hubbel D.H., Gaskins M.H., Dazzo F.B. Association of Azospirillum with grass roots //Appl. Environ. Microbiol. 1980. - Vol. 39. - P. 212226.

172. Vancura V. Root exudates of plants. 1. Analysis of root exudates of barley and wheat in their initial phases of growth //Plant. Soil. 1964. - Vol. 21. - P. 231-248.

173. Vande Broek A., Lambrecht M., Vanderleyden J.F. Bacterial chemotactic motility is important for the initiation of wheat root colonization by Azospirillum brasilense //Microbiology. 1998. - Vol. 144. - P. 2599-2606.

174. Warembourg F.R., Billes G. Estimating carbon transfer in the plant rhisosphere //J.L. Harley and R. Skott-Russel, eds. The soil-root interface. Acad. Press, London, New York, 1979.-P. 183-197.

175. Waterbury J.B., Calloway C.B., Turner R.D. A cellulolytic nitrogen-fixing bacterium cultured from the gland of deshayes in shipworms (Bivalvia: Teredinidae) //Science. -1983. Vol. 221. - P. 1401-1403.

176. Westby C.A., Enderlin C.S., Steinberg N.A., Josef C.M., Meeks J.C. Assimilation of 13 NH4+ by Azospirillum brasilense grown under nitroge limitation and excess //J. Bacterid. 1987. - Vol. 169. - P. 4211-4214.

177. Yahalom E., Okon Y., Dovrat A. Possible mode of action of Azospirillum brasilense strain Cd on the root morphology and nodule formation in burr medic //Can. J. Microbiol. 1990. - Vol. 46. - P. 10-14.112

178. You С., Zhou F. Non nodular endorhizospheric nitrogen fixation in wetland rice //Can. J. Microbial. - 1989. - Vol. 35. - P. 403-408.

179. Zaady E., Perevolotsky A., Okon Y. Promotion of plant growth by inoculum with aggregated and single cell suspensions of Azospirillum brasilense Cd //Soil. Biol. Biochem. 1993. - Vol. 25. - P. 819-823.

180. Zhang Y., Burris R.H., Ludden P.W., Roberts G.P. Presence of a second mechanism for the posttranslational regulation of nitrogenase activity in Azospirillum brasilense in response to ammonium //J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 2948-2953.

181. Zhang Y., Burris R.H., Ludden P.W., Roberts G.P. Regulation of nitrogen fixation in Azospirillum brasilense //FEMS Microbiol. Lett. 1997. - Vol. 152. - P. 195-204.