Плазмидные перестройки и изменения в подвижности, метаболизме азота и устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий Azospirillum brasilense

Варшаломидзе, Ольга Эдуардовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Плазмидные перестройки и изменения в подвижности, метаболизме азота и устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий Azospirillum brasilense
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Плазмидные перестройки и изменения в подвижности, метаболизме азота и устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий Azospirillum brasilense"

005008301

Варшаломидзе Ольга Эдуардовна

плазмидные перестройки и изменения в подвижности, метаболизме азо га и устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий АгояртыимВМЯПЕШЕ

03.02.03 - микробиология 03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 ЯНВШ

Саратов - 2011

005008301

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Кацы Елена Ильинична

доктор биологических наук Шелудько Андрей Вячеславович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Попов Юрий Алексеевич

доктор биологических наук Плешакова Екатерина Владимировна

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики

Казанского научного центра Российской академии наук

Защита диссертации состоится «25» января 2012 г. в 14:00 ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13). Тел. / факс (8452) 970383.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ и на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnyy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан декабря 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Являющиеся ассоциативными партнерами растений, бактерии рода Azospirillum из семейства Rhodospirillaceae способны к существованию в разнообразных климатических поясах и экологических нишах (Levanony et al., 1989; Bashan, Holguin, 1997, 1998; Katupitiya et al., 1995). Изучению особенностей метаболизма и многокомпонентных геномов азоспирилл посвящены многочисленные работы широкого круга исследователей. Повышенный интерес к биохимии и генетике этих бактерий объясняется их способностью стимулировать рост широкого круга растений (это plant-growth-promoting rhizobacteria, или PGPR).

У многих ассоциированных с растениями бактерий сформировались сложные мозаичные геномы - главным образом, за счет дупликаций генов и масштабного горизонтального генетического переноса (MacLean et al., 2007). Присутствие многочисленных мобильных генетических элементов в геномах азоспирилл также предполагает потенциальную возможность разнообразных генетических перестроек (Pothier et al., 2008; Katsy, Prilipov, 2009; Katsy, 2011). Пока известно очень немного оригинальных работ, посвященных изучению у азоспирилл динамики геномов и ее физиологических последствий. Между тем пластичность одной из плазмид (85-МДа плазмида, или р85) модельного штамма A. brasilense Sp245, исследуемого и в настоящей работе, привела к различиям в плазмидном составе культур Sp245, поддерживаемых в разных лабораториях мира, и к утрате р85 тем вариантом Sp245, геном которого был секвенирован недавно в США (Pothier et al., 2008; Khalsa-Moyers, 2010).

Среда обитания почвенных бактерий разнообразна по химическому составу, и существование в такой среде требует от организмов устойчивости и гибкости. В связи с этим пластичность генома является важной характеристикой бактерий, так как способствует возникновению неоднородных по своим адаптивным свойствам популяций. Получены первые данные о том, что образование фенотипических вариантов некоторых ризобактерий способствует их лучшему взаимодействию с растениями (Achouak et al., 2004).

Одним из факторов, жизненно важных для бактерий, является наличие в среде источника азота. Для азоспирилл характерна способность к азотфиксации в микроаэрофильных условиях и к использованию азотсодержащих солей (соли аммония, нитраты и нитриты) в условиях аэрации (Tal, Окоп, 1985). Процесс диссимиляторной денитрификации (как правило, при недостатке кислорода) у бактерий может катализироваться респираторной мембранносвязанной или периплазматической нитратредуктазой; цитохром cd^ или медьсодержащей нитритредуктазой; гетеродимерной, получающей электроны от цитохрома с или однокомпонентной, получающей электроны от хинола NO-редуктазой и N20-редуктазой (Zumft, 1997). Денитрификация может служить для нейтрализации редуцирующего потенциала в клетке, а также для дальнейшего превращения нитрита, в определенной концентрации способного ингибировать рост азоспирилл (Lee et al., 2002). Продукты нитрат- и нитритредукции могут влиять на поведение бактерий и их взаимодействие с растениями (Van Alst et al., 2007; Molina-Favero et al., 2008). У модельного штамма A. brasilense Sp245 охарактеризована периплазматическая нитратредуктаза и кодирующие ее гены парАВС (Steenhoudt et al., 2001), две копии гена нитритредуктазы nirK, локализованные в разных плазмидах (Pothier et al., 2008), гены norB (Braker, Tiedjc, 2003) и nosZ (Rich et al., 2003) с неопределенной локализацией в геноме. Других сведений об идентификации у азоспирилл генов денитрификации к началу наших работ в литературе не было.

Известны исследования, показавшие, что устойчивость азоспирилл к ряду тяжелых металлов выше по сравнению с другими ризобактериями (например, Tugarova et al., 2006). Несколько работ посвящены механизмам поступления металлов в клетку и их последующим превращениям (Ignatov et al., 2001; Kamnev et al., 1997, 2004). Для поддержания баланса ионов металлов в клетке бактериями используются несколько описанных в литературе систем (Bruins et al., 2000; Choudhury, Srivastava, 2001). Одним из способов выведения ионов из клетки является антипорт ионов и протонов, осуществляемый системой из трех-четырех белков. Мембранные белковые компоненты этой системы, или протон-субстрат антипортеры, из суперсемейства RND (restriction, nodulation, division - резистентность, образование клубеньков, деление клеток) подразделяются на основе экспортируемого субстрата. Разные экспортеры тяжелых металлов RND (НМЕ) осуществляют выброс одновалентных и двухвалентных катионов (Nies, 1999). Устойчивость бактерий к тяжелым металлам часто обеспечивается продуктами экспрессии плазмидных генов (Mergeay et al., 2003; Nies, 2003; и др.). Однако данных о генетических аспектах устойчивости азоспирилл к тяжелым металлам (кобальт, медь, цинк и др.) в литературе обнаружено не было.

Важным свойством, способствующим лучшему приспособлению бактерий к окружающей среде, является их подвижность. Наличие у азоспирилл специализированных двигательных органелл - жгутиков (Tarand et al., 1978; Hall, Krieg, 1984; Khammas et al., 1989) позволяет им перемещаться по направлению к наиболее благоприятным условиям, закрепляться на поверхности корней растений.

Исследования влияния плазмидных перестроек на такие важные механизмы приспособления бактерий к обитанию в гетерогенных экологических нишах, как подвижность, системы адаптации к разным источникам азота и устойчивость к солям тяжелых металлов, по-видимому, позволят расширить представления об адаптационном потенциале азоспирилл, обусловливаемым пластичностью генома.

Целью диссертационной работы явилось получение новых данных о функциях плазмид Azospirillum brasilense и о влиянии динамики геномов на физиолого-биохимические характеристики этих бактерий.

В соответствии с поставленной целью в ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Характеристика нуклеотидной последовательности клонированного ранее 18.3-т.п.н. Д7ю1-фрагмента 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245, утрата которой дериватом Sp245.5 сопровождалась блокированием диссимиляторной нитритредукции.

2. Сравнительный анализ геномов A. brasilense Sp245, Sp7 и Cd и вариантов штамма Sp245 с новым плазмидным профилем с использованием в полимеразных цепных реакциях праймеров к ДНК р85.

3. Исследование поведения A. brasilense Sp245 и его суперроящихся вариантов со спонтанными геномными перестройками в средах, содержащих в качестве источника азота хлорид аммония, нитрат или нитрит.

4. Анализ гемагглютинирующей активности и подвижности клеток штамма A.brasilense Sp245 и его деривата Sp245.5 (с крупной плазмидной перестройкой и новым липополисахаридом) в присутствии разных источников азота.

5. Сравнение устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий A. brasilense Sp245 и Sp7 и их производных со спонтанными плазмидными перестройками.

Научная новизна работы. Показано, что у модельного штамма A. brasilense Sp245 спонтанные геномные перестройки, затрагивающие плазмиду р85, могут

сопровождаться утратой протяженных сегментов р85 или их сохранением в геноме азоспирилл.

Кроме генов медьсодержащей нитритредуктазы {тгК) и гетеродимерной N0-редуктазы (погСВ), в плазмидной ДНК азоспирилл (р85 из штамма А. braailen.se Эр245) впервые выявлены гены активатора ИО-редуктазы NoгD; АТФ-азы NorQ; предполагаемого сенсора N0; цистатион-(3-лиазы, катализирующей образование возможного антагониста N0 - гомоцистеина; одного из регуляторов транскрипции ЬувЯ типа и каталитической субъединицы I цитохром с оксидазы (ссоЩ\ а также последовательности, кодирующие компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, осуществляющей выброс катионов из клеток. В ДНК типового штамма А. ЪгахИете 5р7 и его производного С<1 обнаружен локус, высоко гомологичный тгК и ог/208 (кодирующей предсказанный белок с консервативным доменом "субъединица Е формилметанофурандегидрогеназы") изр85 штамма Л. brasilense 5р245.

Впервые показано, что спонтанные плазмидные перестройки могут приводить к появлению субпопуляций (вариантов) штамма А. ЬгазИепзе 8р245 с различиями в росте и подвижности в средах с К03" и (или) N0?" и в эффективности восстановления нитрата и нитрита.

Установлено, что на подвижность бактерий А. Ъгая1ете Бр245 оказывают влияние межклеточные контакты, опосредуемые взаимодействиями поверхностного белка-гемагглютинина с О-специфическим полисахаридом (ОПС) этого штамма. Отсутствие таких белок-углеводных взаимодействий вследствие появления нового ОПС у деривата А. ЬгазИете 8р245.5 (в клетках которого вместо двух резидентных плазмид образовалась новая мегаплазмида), по-видимому, является одной из причин заметных изменений в коллективной подвижности этих бактерий.

На примере А. ЬгаШете впервые выявлено влияние динамики генома на устойчивость бактерий к ионам тяжелых металлов: описано необычное явление существенного спонтанного повышения толерантности бактерий к солям кобальта (И), цинка (II), меди (II) и серебра (I).

Научно-практическая значимость работы. Новые знания о влиянии динамики геномов РОРЫ А. Ышйете на экологически значимые свойства этих бактерий (осуществление денитрификации; заселение новых территорий благодаря индивидуальной и социальной подвижности; устойчивость к солям тяжелых металлов и др.) будут полезны при разработке аграрных биотехнологий. Выявленные в плазмиде р85 из А. hrasileti.se вр245 последовательности, кодирующие ферменты денитрификации и компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, могут быть клонированы в других бактериях с целью расширения адаптационного потенциала новых хозяев. Дериват 8р245.5 РОРЯ А. ЬгазИете Бр245, обладающий, как оказалось, относительно высоким уровнем устойчивости к ряду тяжелых металлов, может быть использован в работах по биоремедиации загрязненных почв. Бактерии штамма 8р245.5, подробно охарактеризованные в данной работе, уже нашли применение в исследованиях пяти лабораторий ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, микробиологии, биохимии, иммунохимии, экологической биотехнологии).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В плазмиде р85 из штамма А. brasilen.se вр245 находится комплекс генов, потенциально важных для обеспечения диссимиляторной редукции >Ю2~ и N0 и для защиты этих бактерий от токсического действия N0 и ионов тяжелых металлов.

2. Спонтанные генетические перестройки могут приводить к утрате из генома А. brasilen.se Яр245 протяженных сегментов 85-МДа плазмиды или к их сохранению в составе новых молекул ДНК.

3. Плазмидные перестройки в ряде случаев сопровождаются появлением вариантов штамма A. brasilense Sp245 с индивидуальными различиями в скорости движения и роста в присутствии разных источников азота, нитрат- и нитритредукции, гемагглютинирующей активности и устойчивости к солям тяжелых металлов.

4. Существенное повышение толерантности деривата Л. brasilense Sp245.5 к солям серебра, кобальта, меди и цинка определяется несколькими факторами, в том числе, усилением протонзависимого эффлюкса ионов Ag+, Cu2+ и Zn2+.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в рамках двух плановых тем НИР (науч. рук. -д.б.н. проф. Е.И. Кацы): "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense" (№ госрегистрации 01200606181) и "Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями" (№ госрегистрации 01200904390). Исследования были частично поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований (06-04-48204-а; рук. - д.б.н. Е.И. Кацы) и Президента РФ (НШ-3171.2008.4; рук. - заслуженный деятель науки РФ, д.б.н. проф. В.В. Игнатов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Соискатель принимала непосредственное участие в постановке задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.

Автор выражает благодарность зав. лаб. генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН д.б.н. проф. Е.И. Кацы, сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН в.н.с. д.б.н. А.В. Шелудько и с.н.с. к.б.н. Л.П. Петровой, сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН (зав. лаб. - д.б.н. проф. В.Е. Никитина) с.н.с. к.б.н. Е.Г. Пономаревой и с.н.с. к.б.н. Е.П. Ветчинкиной и зав. лаб. молекулярной генетики ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ к.б.н. А.Г. Прилипову за помощь при выполнении работ и сотрудничество.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IV Межрегиональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008), 5-м Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009) и V Всероссийской конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2010). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании ЛГМ ИБФРМ РАН 22.11.2011, протокол № 185.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе, три статьи в рецензируемых журналах и две статьи в сборниках.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 9 подразделов), а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 305 источников, из них 52 на русском и 253 на английском языке. В Приложении приведены обсуждаемые в работе кодирующие последовательности из двух сегментов р85, депонированные в базу данных GenBank (NCBI, США) под номерами EU194339, EU595700-EU595706, EU784144, GU904166, GU904167 и GQ168585).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы дана характеристика бактерий рода Azospirillum как одного из основных модельных объектов в исследованиях ассоциативного микробно-растительного взаимодействия. Проанализированы современные данные о динамике геномов как одном из факторов формирования внутрипопуляционного разнообразия бактерий; свойствах и функциях плазмид азоспирилл; генетико-биохимических аспектах диссимиляторпой денитрификации и влиянии этого процесса на взаимодействие микроорганизмов с растениями; механизмах устойчивости бактерий к ионам тяжелых металлов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы бактерии A. brasilense дикого типа: Sp245 (Baldani et al, 1983), Sp7 (Tarrand et al, 1978) и Cd (Eskew et al, 1977); a также производные штаммов Sp245, Sp7 и Sp7-S (лишенного 115-МДа плазмиды, или pli5) (Матвеев с соавт., 1987). Дериват Sp245.5 утратил 85-МДа и 120-МДа (р120) плазмиды с образованием нового -ЗОО-МДа репликона после длительного хранения бактерий в богатой среде (Петрова, 1998; Кацы с соавт., 2002). Обездвиженные мутанты Sp245 -SK051 и SK248 - содержат коинтеграты р85 с вектором для омсгонового мутагенеза pJFF350 (Кацы с соавт., 2001). Плазмидный состав у пяти независимых спонтанных суперроящихся (Swa4') вариантов Sp245.Pl-Sp245.P5 ранее не анализировался (Борисов, 2004; Шелудько с соавт., 2006). Производные штамма Sp7-S (Sp7.l-Sp7.10) содержат дериваты 90-МДа плазмиды, или pRhico, с различиями в молекулярной массе и структуре (Петрова с соавт., 2005а, 2010). Вариант Sp7.K2 - производный штамма Sp7, спонтанно утратившего р115 (Петрова с соавт., 2005а; Матора с соавт., 2008). Для поддержания рекомбинантной плазмиды рЕК248Х использован штамм Escherichia coli DH1 (Sambrook et al., 1989). Плазмида pEK248X - это лигированный сам па себя KmR АТпЛ-фрагмент коинтеграта p85::pJFF350 из мутанта SK248, содержащий 18.3 тысяч пар нуклеотидов (т.п.п.) из ДНК р85 (Кацы с соавт., 2001).

Культуры А. brasilense выращивали при 28-30°С на малатно-солевой среде (Döbcreiner, Day, 1976) с NH4C1 (1 г/л) (MSM) или на среде с пептоном, сукцинатом и солями (MPSS) (Методы общей бактериологии, 1984); Е. coli - на среде LB (Sambrook étal, 1989) при 37°С.

Плазмидный состав бактерий изучали с помощью метода Eckhardt (1978).

Рекомбинантнуго плазмиду рЕК248Х выделяли из клеток Е. coli DH1 методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). ДНК р85, представленную в рЕК248Х, секвенировали посредством праймерной "прогулки" (Sambrook et al., 1989) в прямом и обратном направлениях в лаборатории молекулярной генетики ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (Москва).

Для постановки полимеразных цепных реакций (ПЦР) на ДНК азоспирилл праймеры, специфичные к двум сегментам р85 штамма A. brasilense Sp245 (таблица 1), и условия ДНК-амплификации подбирали с помощью программы Primer Select из пакета программ Lasergene (DNA Star, США). Условия амплификации при постановке BOX-, ERIC-, RAPD- и REP-ПЦР соответствовали описанным ранее (Rademaker et al., 1998; de Bruijn, 1992; Fancelli et al, 1998). Амплификацию ДНК проводили в автоматическом термоциклере Терцик (ДНК технология, Москва, Россия). Для электрофореза продуктов ПЦР использовали 2%-ные агарозные гели.

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием алгоритмов BLAST и Fasta. Положение инициирующих кодонов в открытых рамках считывания (orj) определяли в соответствии с расстоянием от

предсказанных последовательностей Шайн-Дальгарно и по результатам выравнивания соответствующих аминокислотных последовательностей со сходными белками из баз данных (когда это было возможно). Предсказание сайтов связывания регуляторов транскрипции делали с использованием базы данных и сервера PRODOMC. Свойства белковых продуктов orf изучали с помощью инструментов, представленных на серверах Pfam, PSORTb, SCOP, ProDom, PredictProtein, SMART, SignalP и SUPERFAMILY.

Таблица 1. Праймеры для постановки ПНР на ДНК A. brasilense

Праймеры 1 Нуклеотидная последовательность ¡ Положение* | Ссылка

Р1 Праймеры к 18.9-т.п.нЛю1-фраг! 5'-CGGCGCCGTGGGTGGTCT-3' 5 ' -CGGTGGCAAGCGGGñAATG-3' leirry p85 4938-4955 5403-5385 Данная работа

Р2 51-CGTCGGCGCCTTGTTGAGAAT-3' S 1 -CGGTGCGCCTGCTGCTGGAAGA-31 7042-7062 7452-7431 Данная работа

РЗ 51-CCGGATGCGCGTGCTGAC-3' 5 ' -CGGCCCCGGGTATGGAT-3' 7805-7822 8226-8210 Данная работа

Р4 5 ' -TGTGGGTGTCGGGCATCAT-3 1 5' -GAATCGGCGGCGTCACC-3' 9439-9457 9847-9831 Данная работа

Р5 5 ' -TCGTGGAGGCGGTGAAAGTGT-3' 5'-GCGCGGGTGGGCAACGAT-3' 10703-10723 11627-11610 Данная работа

Рб 5 ' -CGGCACGGTGATGGAAGACG-3 ' 5'-CGACGGGGAGGCGCTGGTGGACT-3' 15337-15356 15772-15750 Кацы с соавт., 2010

Р7 5' -ACCCCGCTGCCCGCTTGTGTTC-3■ 5'-CCGCCGCTTCCCCGTGACCTT-31 17280-17301 18019-17999 Данная работа

Р8 Праймеры к 9.1-т.п.н. Лйо1-фраг 5' -CAGCGACCGGCACATCAAGGAAGT-3' 5'-GGCGACGCGGCGGAACAGC-3' •менту p85 4377-4400 4785-4767 Данная работа

Р9 5 ' -GCGGCAGCGTGGCAGTTTGAC-3 ' 5'-CGGCGTCGGCGTGGCGTTCG-3' 6600-6620 7180-7161 Данная работа

Р10 5 ' -CGGGTCGCGGTGGATGTGGAT-3 ' 5'-CTGACTTCCGGCGCCGCG-3' 7793-7813 8322-8305 Данная работа

BOX Праймеры для REP-Щ S'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3' P Множественные повторы нуклеотидных последовательностей (Яа(1етакег е( а1„ 1998)

ERIC 5 ' -ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3' 5' -AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3' (беВшчп, 1992)

REP 5'-IIIIICGICGICATCIGGC-3' 5' -ICGICTTATCIGGCCTAC-3' (с!г Вгицп, 1992)

RAPD 5'-GTTTCCGCCC-3' (РапсеШ е/ а/., 1998)

* Координаты приведены в соответствии с нуклеотидными последовательностями 18.3-т.п.н. и ЭЛ-т.п.н.ЛйоГ-фрагментов р85 из A. brasilense Sp245.

Определение гемагглютинирующей активности бактерий. В ячейки иммуноферментных планшетов с 96 лунками вносили по 50 мкл: 18-ч бактериальных культур (Л;90 = 0.5); суспензий бактерий, отмытых от среды в 0.05 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (рН 7.0) (Л590 = 0.5; Ат = 1.0); суспензий бактерий (А590 = 0.5) в ФСБ после 8 ч инкубации при 37°С в присутствии 2 мг/мл трипсина; культуральной жидкости, освобожденной от бактерий центрифугированием (использовали культуры с Ат = 0.5). Готовили серию двукратных разведений в ФСБ каждого из вариантов. К полученным разведениям добавляли по 50 мкл 2%-ной суспензии в ФСБ трипсинизированных или нативных кроличьих эритроцитов; через 18 ч инкубации при 4°С определяли титр гемагглютинации.

Изучение скорости роста бактерий в присутствии разных источников азота. Бактерии выращивали 18 ч на плотной MSM, а затем ииокулировали в конические 250-мл колбы со 100 мл среды MPSS, содержащей KN03 или KN02 (1 г/л). Так как

работа ферментов, принимающих участие в метаболизме азота, зависит от условий аэрации, то в первой серии экспериментов колбы помещали в качалку для интенсивной аэрации и инкубировали при 200 об/мин. Во второй серии опытов для выращивания бактерий в стационарных условиях брали колбы на 100 мл, содержащие 40 мл среды. Измеряли оптическую плотность культуральной жидкости на фотоколориметре КФК-3 каждые 2 ч при Х=590 нм (Ат) в кювете толщиной 1 см. Результаты представляли в виде графической зависимости Л590 от времени. Во всех случаях проводили не менее пяти независимых экспериментов в трех повторностях.

Нитрит в культуральной жидкости определяли по (Nicolas, Nason, 1957).

Изучение подвижности бактерий. Бактерии выращивали в жидкой MSM 18 ч при 30°С. По окончании инкубации из культуры клеток готовили препарат "раздавленная" или "висячая" капля. Для наблюдения за бактериями (в жидкой или полужидкой среде) использовали фазово-контрастный микроскоп Jenaval, соединенный с цифровой видеокамерой Sony DCR-TRV900E. При микроскопии каждого препарата проводили видеозапись движения бактерий. Скорость записи - 25 видеокадров/с, видеофайлы сохраняли на компьютере в формате AVI. Используя объект-микрометр, записывали видеофайл с масштабной линейкой. Видеоизображение подвергали компьютерному анализу, позволяющему отображать траекторию движения отдельных клеток. У 50-150 единичных клеток определяли среднюю скорость движения по траектории. Оценивали подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа. Для определения среднего показателя процента подвижных клеток обрабатывали не менее пяти файлов.

Для оценки подвижности бактерий в жидкой среде в присутствии препаратов полимеров клеточной поверхности A. brasilense Sp245 суспензии бактериальных клеток в ФСБ смешивали на покровном стекле с растворами гемагглютинина (ГА), липополисахарида (ЛПС), О-специфического полисахарида (ОПС) ОПС1 или ОПСП, ЛПС-белкового комплекса (ЛПБК) или полисахарид-липидного комплекса (ПСЛК) в ФСБ (конечные концентрации полимеров приведены в Главе 3) и инкубировали 1 мин и 30 мин. Определяли процент подвижных клеток и скорость их движения.

ГА был охарактеризован в лаборатории микробиологии (JIM) ИБФРМ РАН под руководством д.б.н. проф. В.Е. Никитиной. Препараты ЛПС, ОПС1, ОПСП, ЛПБК или ПСЛК любезно предоставлены д.б.н. проф. С.А. Конновой с коллегами (лаборатория биохимии ИБФРМ РАН).

Для выявления возможного ингибирования связывания ГА с бактериальными клетками в раствор ГА (10 мкг/мл) добавляли до 0.1 мг/мл ЛПС, ОПС1, ОПСП, ЛПБК или ПСЛК. Через 1 ч инкубации при 28°С растворы смешивали с суспензией клеток и определяли скорость движения бактерий. В контрольных опытах использовали ФСБ без добавления полимеров.

Изучение устойчивости бактерий к солям тяжелых металлов. Определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) соли, т.е. ее концентрацию, предотвращающую видимый рост бактерий в течение 18-24 ч инкубации. Бактерии выращивали в жидкой среде, культуры доводили до одинаковой оптической плотности и рассевали из серийных разведений на плотную среду с различной концентрацией сульфата меди, нитрата серебра, хлорида кобальта и сульфата цинка.

Для изучения влияния солей тяжелых металлов на рост клеток A. brasilense Sp245 и Sp245.5 в жидкой среде и в жидкой среде, содержащей ингибитор эффлюкс-помп карбонилцианид-м-хлорофенилгидразон (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone, или СССР), использовали эти соли в варьирующих концентрациях. Инокулировали по 100 мкл 24-ч культур бактерий, выращенных в 20 мл жидкой MSM с 0.01% дрожжевого экстракта, в колбы с 15 мл среды, содержащей соль тяжелого металла.

Колбы инкубировали на качалке при 140 об/мин и 30°С. Через 24 ч инкубации измеряли оптическую плотность культур при 590 им (AS90). СССР добавляли в среды из 1-мМ раствора до требуемой конечной концентрации.

Все количественные результаты подвергали статистической обработке с использованием пакета Microsoft Office Excel 2003 (11.6355 6360) SP1. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости. Для оценки достоверности различий между средними значениями использовали /-критерий Стьюдента.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Идентификация в плазмиде р85 из бактерий A. brasilense Sp245 комплекса генов денитрификации. В результате анализа нуклеотидной последовательности 18.3-т.п.н. А7го1-фрагмента р85, представленного в рекомбинантной плазмиде рЕК248Х, был идентифицирован комплекс генов, важных для осуществления денитрификации (рис. 1).

t*l II fi f*| Щ Щ

Рис. 1. Генетическая карта 18.3-тпн А7го1-фрагмента 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245. Горизонтальными стрелками изображены orf со свойствами кодирующих последовательностей азоспирилл и направление их транскрипции. Двунаправленными стрелками обозначены целевые участки ПЦР-амплификации с использованием пар праймеров Р1-Р7. X — Xho\-cam рестрикции. Масштабная линейка соответствует 1 т.п.н. IS-элементы \SAzbal и ISAzba2, а также orf414 и ог/418, кодирующие предсказанные гликозилтрансферазы, охарактеризованы ранее (Katsy, Prilipov, 2009; Кацы с соавт., 2010). Возможная функция гипотетического продую-а трансляции orfl 71 не предсказана.

В р85 выявлены структурные гены медьсодержащей нитритредуктазы (nirK) и гетеродимерной NO-редуктазы (погСВ), а также ранее не описанные у азоспирилл гены norQD. Продукт ог/208 сходен с консервативными белками из ряда бактерий и содержит домен "субъединица Е формилметанофурандегидрогеназы". Роль субъединицы Е в работе вышеназванного фермента, обнаруженного у метаногенных и сульфатредуцирующих микроорганизмов, не определена. В белке ORF181 обнаружены два гемэритриновых домена. Полагают, что гемэритрин является регулятором ответа на NO (Strübe et al., 2007), играет значимую роль при попадании организмов в условия лимитации по кислороду, будучи его накопителем, и опосредует аэротаксис бактерий в качестве кислородного сенсора (Isaza et al., 2006). В секвенированном фрагменте р85 таюке обнаружена orf293, кодирующая регулятор транскрипции LysR-типа. Регуляторы LysR участвуют в контроле транскрипции разнообразных генов, в том числе, в условиях кислородного стресса. ORF293 обладает значимым сходством с белком HdfR, являющимся негативным регулятором транскрипции мастер-оперона flhDC, продукты которого необходимы для экспрессии остальных флагеллярных генов у Е. coli и ряда других гамма-протеобактерий (Ко, Park, 2000).

Многие бактерии адаптируются к микроаэробным условиям, благодаря работе цитохром с оксидазы с6Л3-типа, кодируемой опероном ccoNOQP. Нуклеотидные последовательности гена ccoN, впервые выявленного нами в плазмидной ДНК азоспирилл, и ccoN из оперона ccoNOQP (cyíNOQP), ранее охарактеризованного у типового штамма A. brasilense Sp7 (Marchal et al., 1998), идентичны на 85%. Кодируемая р85 каталитическая субъединица I (CcoN) цитохром с оксидазы обладает свойствами, достаточными для работы фермента в качестве протонной помпы.

Интересно, что перед генами р85 nirK, погС и ccoN есть потенциальные сайты связывания регулятора транскрипции RegA одного из белков двухкомпонентной сенсорно-рсгуляторной системы РгтВА (RegBA), модулирующей экспрессию ряда генов у альфапротеобактерии Rhodobacter sphaeroides в зависимости от редокс-статуса клетки (Laratta et al., 2002; Laguri et al., 2003). Наличие потенциальных сайтов связывания белков-регуляторов транскрипции FNR (regulator of fumarate and nitrite reduction), ANR (arginine nitraíe regulator) и DNR (dissimilatory nitrate respiration regulator) перед генами nirK и погС, выявленными нами в плазмиде р85, свидетельствует о возможной активации экспрессии этих генов в ответ на снижение концентрации О? и присутствие оксидов азота. Перед nirK, погС, ог/293 и ccoN в р85 есть и потенциальные сайты связывания регулятора NarL, находящегося под контролем сенсора нитрата/нитрита NarX (Zumft, 1997). Гены norCBQD и nirK, orf208 и orfl81, по-видимому, образуют опероны. Поэтому белки-регуляторы транскрипции, потенциальные сайты связывания которых находятся перед погС и nirK, могут оказывать влияние на экспрессию всех генов предполагаемых оперонов norCBQD и nirKorf208orfl81.

В секвенированном сегменте р85 обнаружен и ген metC (рис. 1). В случае Е. cotí metC-мутаиты, дефектные по синтезу гомоцистеина, имели более высокий уровень экспрессии гена флавогемоглобина (hmp), индуцируемой N0. При повышении концентрации гомоцистеина в клетках Е. coli уровень экпрессии hmp падал. В связи с этими и другими данными возникло предположение о том, что гомоцистеин является антагонистом NO (Membrillo-Hernández et al., 1998). Продукт orfl64, также локализованной в р85 (рис. 1), по-видимому, не связан с процессами денитрификации или регуляции метаболизма в ответ на оксиды азота и редокс-статус клетки.

У производного A. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой исчезновение р85 и одного из двух фрагментов тотальной ДНК, гомологичных 2.4-т.п.н. £coRI фрагменту р85, содержащему, как сейчас выяснилось, часть гена nirK, а также orf208 и ог/181, сопровождалось утратой способности бактерий к нитритредукции (Кацы, 2002а). Ранее в реакциях гибридизации с вышеназванным A'coRl-фрагментом р85 позитивные сигналы были обнаружены в р85 и плазмиде с молекулярной массой более 300 МДа. С 2.4-т.п.н. fícoRI фрагментом р85 гибридизовались 2.7-т.п.н. и 2.4-т.п.н. £coRI фрагменты тотальной ДНК штамма Sp245 (Кацы с соавт., 2002). Коллеги из Франции также обнаружили у A. brasilense Sp245 два гомологичных гена nirK, локализованных в разных плазмидах (Pothier et al., 2008). Плазмида р85 может претерпевать спонтанные генетические перестройки, и в штамме, поддерживаемом в одной из французских лабораторий, появилась ее 150-МДа производная (Pothier et al., 2008). Pothier с соавт. (2008) локализовали гены nirK и погСВ в 150-МДа плазмиде (р150) "своего" штамма Sp245. Нами установлено, что белки NorC и NirK, кодируемые соответственно pl 50 и р85 из двух вариантов Sp245, идентичны на 100%. Белок NorB, кодируемый 150-МДа дериватом р85, короче идентифицированного нами NorB на 87 аминокислотных остатков. Уровень идентичности аминокислотных последовательностей двух NorB составляет 92%. Есть

ли в 150-МДа плазмиде из "французского" штамма Бр245 другие гены, обнаруженные нами в р85, не известно.

3.2 Выявление в плазмиде р85 из А. ЬгаяНепйе вр245 последовательностей, кодирующих предсказанные белки-экспортеры ионов тяжелых металлов. В настоящей работе в результате анализа нуклеотидной последовательности плазмиды р85 у азоспирилл впервые идентифицированы ог/" (оф22х, оф15 и оф 76) (рис.1), предсказанные продукты которых, по-видимому, образуют помпу, осуществляющую выброс катионов из клетки (таблица 2).

Таблица 2. Характеристика предсказанных продуктов трансляции открытых рамок считывания, выявленных в плазмиде р85 из Л. brasilen.sc Бр245_

Условное обозначение, величина и предсказанная локализация продукта orf Координаты домена в аминокислотной последовательности и его название; Е-\га1ие ОепЬапк номер доступа, название наиболее сходного белка: % идентичности/% сходства (координаты выровненных последовательностей) ОН-и сходного белка; Е-уа1ие

Orfl22x >122 а.о.*/>13.3 кДа Цпм** (38-57), (67-89) Трансмембранные участки гр_00056507, СШ3696, Возможная помпа для выброса серебра из а-протеобактерии Magnctospirillum magneШacticum: 81/91 (1-90:942-1031); е-34

(1—98) С003696, Возможная помпа для выброса серебра; 2е27

(20-103) 2А0601, Помпа для выброса тяжелых металлов (кобальт-цинк-кадмий); Зе"04

Orfll5 115 а.о./11.9кДа Вне цп*** (1-25) Сигнальный пептид АСН82433, Консервативный гипотетический белок из у-протеобактерии АасШЫоЪасШив (епооуЛсктг. 44/67 (46-115:50119); 9е"12

(56-106) Иат11604, Сиз^Ес, МедьсБязывагощий першшазматический белок СшЕ; бе"15

(58-97) Р1Ш)9838, Першшазматический медьсвязывающий белок; 5е 08

(58-96) С0С5569, ^охарактеризованный консервативный белок; 5е~06

Orf 176 176 а.о./18.7 кДа Вне цп*** (52-169) С003019, Предсказанный мсталлсвязывающий белок; бе"33 ЕАБ40039, Возможный консервативный периплазматаческий белок из у-протеобактерииРвусЬготопаъ эр.: 49/65 (47-170:15-140); Зе~30

(84-153) р£аш04214, ОиР411, Белок с неизвестной функцией; 5е~17. Некоторые из членов семейства определяют устойчивость бактерий к катионам металлов

Примечание: * Аминокислотный остаток. * *Цитоплазматическая мембрана, **Вне цитоплазмы.

Подобные белковые помпы, состоящие из расположенного в цитоплазматической мембране антипортера протонов, периплазматического белка и белка, локализованного в наружной мембране (Nikaido, 1996), охарактеризованы у Ralstonia metallidurans (Mergeay et al., 2003) и включают Cnr систему (устойчивость к никелю и кобальту) (Liesegang et al., 1993), Ncc систему (устойчивость к никелю, кобальту и кадмию) (Schmidt, Schlegel, 1994) и Czc систему (устойчивость к кобальту, цинку и кадмию) (Mergeay et al., 1985). У Pseudomonas aeruginosa помпа CzrCBA вносит вклад в устойчивость бактерий к цинку и кадмию (Hassan et al, 1999). У Е. coli

четырехкомпонентная помпа CusCFBA определяет устойчивость к одновалентным катионам серебра и меди (Franke et ah, 2003) и, по-видимому, участвует в поддержании гомеостаза меди (Grass, Rensrng, 2001). Об идентификации у каких-либо штаммов Azospirillum генов, определяющих устойчивость к тяжелым металлам, ранее не сообщалось.

Локализация комплекса генов денитрификации и orf, кодирующих предсказанную эффлюкс-помпу, в плазмидной ДНК A. brasilense Sp245, к тому лее недалеко от IS-элементов ISAzbal и lSAzba2 (Katsy, Prilipov, 2009) (см. рис. 1), свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов и высокой вероятности их горизонтального переноса в популяциях ризосферных бактерий.

3.3 Сравнительный анализ ДНК бактерий штаммов A. brasilense Sp245, Sp7 и Cd в полимеразных цепных реакциях с праймерами к ДНК плазмиды р85 из штамма Sp245. Осуществлен сравнительный анализ геномных ДНК бактерий штаммов A. brasilense Sp245, Sp7 и Cd в ПЦР с парами праймеров Р1 и Р7 к локусам р85 (рис. 1), кодирующим экологически значимые белки. Эти исследования выполнены совместно с с.н.с. ЛГМ ИБФРМ РАН к.б.н. Л.П. Петровой.

В ПЦР на ДНК A. brasilense Sp7 и Cd с праймерами Р7 к последовательностям р85, кодирующим предсказанные компоненты эффлюкс-помпы, осуществляющей выброс тяжелых металлов из клеток, были получены негативные результаты. По-видимому, в геномах штаммов Sp7 и Cd нет локусов, идентичных orfI22x и orfl 76 из плазмиды р85 A. brasilense Sp245.

Однако в ПЦР на ДНК A. brasilense Sp245 и Sp7 с праймерами к nirK-orf208 (PI) образовались ампликоны с ожидаемой длиной 466 п.н., что свидетельствует о существовании высоко гомологичных локусов у двух штаммов азоспирилл. В случае ПЦР с Р1 на ДНК A. brasilense Cd был получен слабый позитивный результат, что, по-видимому, объясняется сохранением в геноме этого штамма одного из двух участков гомологии 2.4-т.п.н .EcoRI-фрагменту с генами nirK-orf208-orfl81, локализованного вне pi 15 (Кацы с соавт., 2002).

Утрата р 115 штаммом A. brasilense Cd сопровождается потерей способности бактерий к восстановлению нитрита, что также свидетельствует о вкладе генов рН5 в процесс денитрификации. Полученные нами косвенные данные о сходной роли р 115 и р85 в процессе диссимиляторной нитритредукции согласуются с предположением о

возможном родстве этих плазмид, основанном на явлении невозможности их совместного поддержания в одной клетке (несовместимости) (Кацы, 1992).

3.4 Анализ изменений в структуре ДНК, произошедших у спонтанных суперроящихся производных А. brasilense Sp245. Данный подраздел работы Рис. 2. Плазмидный профиль выполнялся совместно с с.н.с. к.б.н. Л.П. штамма A. brasilense Sp245 (1) и его Петровой. Нами установлено, что у четырех Спонтанных Swa^ вариантов Sp245.Pl спонтанных производных A.brasilense Sp245 с (2), Sp245,P2 (3), Sp245.P3 (4), ускоренным роением (Sp245.Pl-Sp245.P4) Sp245.P4 (5) и Sp245.P5 (6). вместо 85-МДа репликона появилась примерно Молекулярная маиса плазмид в МДа в два раза более крупная плазмида (рис. 2), по-указана слева. Различия в плазмидных видимому; являющаяся продуктом

профилях обозначены стрелками. меЖмолекулярной генетической рекомбинации.

iiïhrtfi-»

В то же время плазмидные профили бактерий штаммов Sp245 и Sp245.P5 идентичны.

Ранее было показано, что геномы азоспирилл обладают пластичностью, и ДНК некоторых плазмид вовлечена в спонтанные геномные перестройки (Кацы с соавт., 2002; Петрова с соавт., 2005, 2005а; Vial et al, 2006). Так, Pothier et al. (2008) отметили различия в плазмидном составе культур A. brasilense Sp245, поддерживаемых в разных лабораториях. Эти авторы предположили, что самая маленькая плазмида, обнаруженная в клетках штаммов Sp245 из Реховота (Израиль) и Лувена (Бельгия), образовала коинтеграт с другой плазмидой в клетках штамма Sp245 из Лиона (Франция) (Pothier et al., 2008). Интересно, что плазмидные профили наших штаммов A. brasilense Sp245 и Sp245.P5 аналогичны таковым у образцов Sp245 из Реховота и Лувена, а размер новой плазмиды вариантов Sp245.Pl-Sp245.P4 близок к размеру вероятного коинтеграта из французского штамма Sp245.

С использованием ПДР с 10 парами праймеров к двум ЛйоГфрагментам р85 (рис. 1; рис. 3) мы проверили, сохранились ли соответствующие локусы р85 в клетках

спонтанных суперроящихся вариантов Sp245.Pl-P5. Все ПЦР на ДНК Sp245 и пяти его Swa^ вариантов дали идентичные позитивные результаты. По-видимому, новая плазмида, обнаруженная в клетках штаммов Sp245.Pl-Sp245.P4 (рис. 2), является дериватом р85.

С целью более тонкого анализа изменений в структуре ДНК, происходящих при спонтанном появлении

суперроящихся производных Sp245, были поставлены ПЦР (ERIC-, RAPD-, REP-, ВОХ-Г1ЦР) с праймерами, к консервативным мотивам в повторяющихся последовательностях нуклеотидов бактерий. С помощью данного подхода оказалось возможным выявление тонких различий в архитектуре геномов штамма Sp245 и некоторых из его суперроящихся производных (рис.

4).

В REP- и ВОХ-ПЦР различия между ДНК Sp245 и его SwaT+ вариантами уловить не удалось, возможно, в связи с отсутствием в р85 нуклеотидных повторов,

соответствующих праймерам,

использованным в данных

разновидностях ПЦР.

3.5 Сравнительное

исследование ДНК бактерий

Рис. 3. Генетическая карта 9.1-тпн Ji/jol-фрагмента р85 (по Katsy, Prilipov, 2009; Ковтунов с соавт. 2012). Горизонтальными стрелками изображены orf и направление их транскрипции; двунаправленными стрелками - целевые участки 1ИДР-амплификации с использованием праймеров Р8-Р10. int - ген фаговой интегразы; tnpA - ген транепозазы IS-элемента ISAzba3; оф19 кодирует 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат-сульфотрансферазу, а orf 119 - мембранный белок толерантности к толуолу Ttg2. X -Xhol-саш рестрикции. Масштабная линейка соответствует 1 т.п.н.

Рис. 4. Результаты ERIC-ПЦР (а) и RAPD-ПЦР (б) на ДНК А. brasilense Sp245 (1), Sp245.Pl (2) и Sp245.P2 (3). (Различия в составе продуктов ПЦР на ДНК Sp245, Sp245.P3, Sp245.P4 и Sp245.P5 не выявлены.) М - маркерная ДНК, 100 bp+ DNA ladder (Fermentas. Латвия). Длина ряда маркерных фрагментов ДНК в п.н. указана слева. Стрелками обозначены межштаммовые различия.

штамма A. brasilense Sp245 и его спонтанного деривата Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой. Как показано ранее, SDS-PAGE профили белков внешней мембраны у штаммов Sp245 и Sp245.5 почти идентичны (Кацы с соавт., 1994), но структура ОПС у них абсолютно разная. Повторяющееся звено ОПС у штамма Sp245 является пентасахаридом, состоящим из остатков £>-рамнозы (Fedonenko et al., 2002), а у Sp245.5 - дисахаридом, образованным остатками /У-ацетил-Д-галактозамина и 7У-ацетил-1)-маннозаминуроновой кислоты (Федоненко с соавт., 2010). Sp245 продуцирует полисахариды, связывающие флуоресцентный краситель калькофлуор (ПССК) (Cal* фенотип) (Katzy et al, 1998), a Sp245.5 имеет ¡n (>2 r> м i?, i>6 l>? СаГ фенотип (Кацы с соавт., 2002). В

отличие от штамма A. brasilense Sp245 бактерии Sp245.5 не способны к восстановлению нитрита (Кацы, 2002, 2002а).

С целью анализа изменений в структуре ДНК Sp245.5 были поставлены ПЦР с праймерами к ДНК р85 из Sp245. Эта работа выполнялась совместно с с.н.с. к.б.н. Л.П. Петровой. Во всех ПЦР на Рис. 5. Результаты ПЦР с праймерами к клеточной ДНК Sp245 были получены плазмиде р8э из A. brasilense Sp245 на ДНК ампликоны ожидаемого размера. ПЦР на бактерий штаммов Sp245 (l) и Sp245.5 (2). М- тотальной ДНК деривата Sp245.5 с

маркерная ДНК, 100 bp+ DNA ladder (Fermentas, Латвия). На панелях Р1-Р7 показаны результаты ПЦР е праймерами PI, Р2, РЗ, Р4, Р5, Р6 и Р7. Длина рада маркерных фрагментов (в п.н.) приведена слева.

праймерами Р1-РЗ и Р5-Р7 не дала никаких продуктов, а в ПЦР с Р4 образовались два ампликона размером -1.35 и 1.9 т.п.н (вместо 409 п.н.) (рис. 5). Таким образом, 18.3-т.п.н. ХИо1-фрагмент р85, в котором мы выявили гены денитрификации и три о^ кодирующие , предсказанные компоненты

эффлюкс-помпы, очевидно, был утрачен или очень сильно поврежден в процессе спонтанной плазмидной

перестройки, произошедшей у 8р245.5.

хWfOQ tW-íBító. '.5.

ЯЬ

20-j 11) i

......

ШИш Í

га.\ & -

ал ~

MI,С; iflMIÄ»

В*>.! ¡мш --

КЖ):

í'2 е.4 !>.<) (i SO >8 .» 40

Рис, б. Характеристика колоний, формируемых A.hrasilense Sp245 после точечной инокуляции суспензии клеток в полужидкие среды, содержащие разные источники азота (1 г/л), а - на средах с концентрацией агара 0.2, 0.4 или 0.6%. (I - без связанного азота; (2-4) в присутствии: 2 - NH4CI, 3 -KNO3, 4 - KNOi). Время инкубации - 36 ч. б - на средах, содержащих 0.4% агара (1 - диаметр колоний на поверхности агара; 2 - диаметр колоний в толще агара). Время инкубации - 36 ч и 72 ч.

3.6 Различия в

подвижности и

гем агглютинирующей активности клеток

штаммов А. brasilense Бр245 и 8р245.5. В аэробных условиях на полужидких средах без источника связанного азота клетки штамма Бр245 формируют колонии,

превышающие диаметр колоний, образованных в присутствии аммония, нитрата или нитрита (рис. 6). Край колоний образован

бактериями, мигрирующими в толще среды (2-3 мм от поверхности). На поверхности агара клетки формируют в пределах колонии диски меньшего диаметра. Вероятно, азоспириллы, будучи микроаэрофилами (ТапашЗ е? а!., 1978), в отсутствие азота преимущественно формируют колонию в микронише, благоприятной для работы ннтрогеназы.

На средах с 0.2-0.4% агара в ряду "аммоний-нитрат-нитрит" наблюдается уменьшение размера колоний (рис. 6). Максимальный диаметр колоний на полужидкой МБМ (концентрация агара 0.4%), содержащей хлорид аммония или нитрат калия, не зависит от концентрации соли (1-3 г/л).

Изменение концентрации аммония или нитрата в среде не влияет на скорость движения клеток штамма 8р245. Так, при концентрации солей 1 или 3 г/л скорость, соответственно, составляет 28.6 ± 1.5 и 28.6 ± 1.4 мкм/с в присутствии аммония и 29.9 ± 1.5 и 29.8 ±1.4 мкм/с в присутствии нитрата. Скорость движения клеток, выросших на среде с нитритом, несколько уменьшается с увеличением его концентрации. Клетки, выросшие с 1 г/л или 3 г/л нитрита калия, двигаются, соответственно, со скоростью 24,4 ±1.2 или 22.4 ± 1.4 мкм/с. Однако диаметр колоний в сходных условиях не изменяется.

Возможно, присутствующий в среде источник азота влияет не только на скорость движения клеток, но и на взаимодействия, определяющие контакты между перемещающимися бактериями, что сказывается на диаметре колоний. На средах с 0.6% агара различия в размере колоний нивелируются (рис. 6а), очевидно, в результате того, что клетки на более плотных средах между собой находятся в более тесном контакте, чем бактерии в присутствии 0.2-0.4% агара, и роль взаимодействий, модулируемых источником азота, становится не столь существенной.

Средняя скорость движения клеток А. Ьга.1,ilen.se 8р245.5, выросших в жидкой среде, существенно снижена по сравнению с таковой у штамма дикого типа. Клетки вр245 движутся со скоростью 29.3 ± 0.9 мкм/с, а у вр245.5 этот показатель составляет 17.1 ± 0.8 мкм/с. На полужидких средах поведение деривата Бр245.5 заметно отличается от поведения Бр245. Клетки вр245.5 формируют "диффузную" колонию, тогда как бактерии Бр245 образуют четко очерченный диск (рис. 7). В случае вр245.5 фронт движущихся бактерий, в отличие от дикого типа, характеризуется несколько

меньшей плотностью клеток. Размер колоний у вр245.5 превышает таковой у 8р245, хотя у деривата скорость движения клеток ниже.

Скорее всего, фенотип колоний 8р245.5, образуемых в полужидкой среде, обусловлен кардинальными имениями свойств поверхностных полисахаридов и, как следствие, нарушением углевод-углеводных или белок-углеводных взаимодействий.

Межклеточные контакты обеспечиваются компонентами бактериальной поверхности, в частности, полисахаридными и белковыми структурами. Уровень продукции и свойства поверхностных полимеров у азоспирилл могут меняться в зависимости от источника азота в среде инкубации, что, в свою очередь, сказывается и на способности клеток вызывать гемагглютинацию (Никитина с соавт., 1994; Yagoda-Shagam с/ а!., 1988).

Рис. 7. Различия в характере распространения в полужидкой среде бактерий штаммов А. brasilense Sp245 (а) и Sp245.5 (б) через 36 ч после точечной инокуляции их культур в MSM, содержащую 0.4% агара. Масштабная линейка соответствует 1 см.

Совместно с сотрудниками ЛМ ИБФРМ РАН (зав. лаб. - д.б.н. проф. В.Е. Никитина) к.б.н. Е.Г. Пономаревой и к.б.н. Е.П. Ветчинкиной было проведено сравнение гемагглютинирующей активности клеток Л. brasilense Sp245 и Sp245.5 и изучено влияние различных источников азота на способность азоспирилл к гемаглютинации.

Агглютинацию трипсицизированных эритроцитов вызывают жидкие культуры Sp245 (/¡590=0.5), выросшие в стационарных условиях на среде с 1 г/л хлорида аммония; суспензии отмытых клеток из этих культур в ФСБ и культуральная жидкость. Во всех случаях титр реакции агглютинации составил 1:4, что может быть обусловлено различной степенью связывания гемагглютининов с поверхностью бактериальной клетки и особенностями комплексов, образуемых гемагглютининами с другими молекулами, влияющими на активность агглютининов. Обработанные трипсином клетки штамма Sp245 (А ¡до = 0.5) утрачивали способность агглютинировать трипсинизированные эритроциты. В суспензиях клеток (А590 = 1.0) у деривата Sp245.5 титр реакции гемагглютинации составил 1:32, а у родительского штамма Sp245 -1:16.

На способность культур штамма Sp245 вызывать агглютинацию эритроцитов влияет источник азота в среде выращивания бактерий. Титр агглютинации трипсинизированных эритроцитов жидкими культурами Sp245 (А590 = 0.5), выросшими на среде с 1 г/л нитрита или нитрата калия, составил 1:16, а в случае 1 г/л хлорида аммония - 1:4. Изменение содержания хлорида аммония (1, 3 или 0.05 г/л) не влияло на агглютинирующие свойства культур Sp245. Ранее сообщалось (Антонюк, 2005), что исключение аммония из состава среды культивирования в случае штамма Sp245 приводит к снижению гемагглютинирующей активности бактерий. Напротив, у штамма A. brasilense Sp7 способностью к гемагглютинации обладали только клетки, выросшие на средах с низким содержанием азота (например, 0.05 г/л KN03) (Никитина с соавт., 1994). Можно предположить, что у штаммов Sp245 и Sp7 различаются механизмы регуляции синтеза или активности агглютининов.

3.7 Подвижность бактерий штаммов A. brasilense Sp245 и Sp245.5 в присутствии полимеров, выделенных с поверхности клеток Sp245. Сотрудниками ЛМ ИБФРМ РАН с поверхности клеток штамма Sp245 выделен препарат гемагглютинина, после очистки гель-фильтрацией представляющий собой белок с молекулярной массой около 67 кДа.

При определениии специфичности агглютинина Sp245 (в ЛМ ИБФРМ РАН) ингибированием углеводами и углевод содержащими полимерами реакции гемагглютинации выделенные с поверхности штамма Sp245 ЛПБК и ЛПС в концентрации 50.5 мкг/мл подавляли активность 1.0 мкг/мл ГА в отношении трипсинизированных эритроцитов. При этом ни один из 35 использованных моно- и дисахаридов и аминосахаров не блокировал гемагглютинирующей активности данного белка. Из обнаруженных у Sp245 двух ОПС с тонкими различиями в антигенной структуре и заряде (Katzy et al., 1998; Федоненко с соавт. 2004) только кислый препарат ОПС1 в концентрации 25 мкг/мл ингибировал активность ГА (1.0 мкг/мл). Следует заметить, что ЛПБК, ЛПС, ОПС1 и ОПСП в диапазоне концентраций 500-25 мкг/мл не вызывают агглютинацию трипсинизированных эритроцитов. Только ПСЛК в концентрации 500 мкг/мл вызывает агглютинацию. При снижении его концентрации до 250-25 мкг/мл агглютинации эритроцитов не происходит. Однако в концентрациях 250-25 мкг/мл ПСЛК не блокирует активность ГА.

Нами установлено, что добавление к суспензии клеток Sp245 ГА приводит к заметному снижению скорости движения бактерий в жидких средах (рис. 8). ГА не

1.1^44 Гс .«ЙЙДЛННЙ

Ш Ш

оказывает влияния на подвижность клеток мутанта 8р245.5 с кардинальной перестройкой в структуре ОПС ЛЛС и утратой ПССК (рис. В).

Предварительная инкубация ГА с ЛПС, ЛПБК и ОПС1 приводит к ингибированию его воздействия на скорость движения клеток. В присутствии ПСЛК или ОПСП

действие ГА на скорость движения бактерий на 9.3 или 12,6% менее эффективно в сравнении с незаблокированным белком (рис. 86). У штамма Эр245 в состав ЛПС, ЛПБК и ИСЛК входят сходные

моносахариды и антигены, идентичные таковым у ОПС1 (Коннова с соавт., 1992; Федоненко с соавт., 2001; 2004).

Полярный жгутик штамма вр245 покрыт чехлом, антигенные

детерминанты которого идентичны детерминантам ЛПС (Бурыгин, 2003). По-видимому, снижение скорости клеток в присутствии ГА является следствием его взаимодействия не только с клеткой, но и с полярным жгутиком, обеспечивающим движение. В пользу этого предположения говорит отсутствие изменений в подвижности при добавлении этого ГА к клеткам штамма А. ЬгавПепяе Бр7 (рис. 8а). ЛПС и чехол полярного жгутика 8р7 и 8р245 имеют разную антигенную структуру (Бурыгин, 2003).

Результаты измерения скорости движения мутантов и данные ингибиторного анализа позволяют говорить о значительном сродстве ГА к ЛПС Бр245. Моносахариды рамноза, глюкоза, галактоза и глюкозамин, входящие в состав ЛПС, ЛПБК или ПСЛК (Коннова с соавт., 1992, Бкуогеоу, 1япа1оу, 1998; Федоненко с соавт., 2001; 2004), не блокируют действие ГА на подвижность.

Таким образом, у А. ЬгаяПете вр245 гемагглютинирующая активность бульонных культур и скорость роения в полужидких средах варьируют при использовании разных источников азота. Клетки 8р245.5, обладающие гемагглютинирующей активностью, вдвое превышающей активность 8р245, на полужидкой среде формируют "диффузные" колонии, а не четкие кольца роения, как 8р245. Полученные данные свидетельствуют о влиянии на социальную подвижность бактерий межклеточных контактов, опосредуемых взаимодействием поверхностного гемагглютинина с ОПС1, модулируемым в зависимости от окружающих условий. Природа источника азота в окружающей среде и степень доступности кислорода влияют на скорость движения клеток, и, вероятно, на межклеточные контакты А. ЬгаяНете вр245, обусловленные взаимодействиями ГА и ОПС1.

3.8 Рост и подвижность бактерий штамма А. ЬгаэИепяе вр245 и его

Рис. 8. Влияние полимеров, выделенных с поверхности клеток штамма 5р245, на подвижность Л.бгая'/еияе в жидких средах.

(а) скорость движения клеток разных штаммов азоспирилл в: 1 -ФСБ, 2-ФСБ + ГА. Концентрация ГА -мкг/мл. Время инкубации - 1 мин.

(б) скорость движения клеток штамма Бр245 в:

1 - ФСБ; 2 - ФСБ + ЛПС, 3 - ФСБ + ЛПБК, 4-ФСБ + ПСЛК, 5-ФСБ + ОПС1, (5-ФСБ +

ОПСП.

спонтанных суперроящихся производных в присутствии разных источников азота. При выращивании на жидкой MPSS с нитратом калия в условиях интенсивной аэрации у A. brasilense Sp245 дикого типа и его суперроящихся вариантов (Sp245.Pl-Sp245.P5) в течение первых 4-х ч наблюдался одинаковый рост с незначительными различиями. Лаг-фаза длилась 6-8 ч, после чего наиболее интенсивно рос штамм Sp245.P5, а наименьший прирост наблюдался у Sp245.P3. Через 16-18 ч при значении оптической плотности культуры А59ц = 1.5-2 скорость роста перестала изменяться. Более подробно на средах с нитратом или нитритом наблюдали за ростом родительского штамма Sp245 и его вариантов Sp245.P3 и Sp245.P5.

При выращивании бактерий на среде с нитритом на качалке лаг-фаза длилась 1018 ч. Максимальная плотность культуральной жидкости составляла 1.2-1.3 и достигнута она была через 36-48 ч. Штамм Sp245.P5 в этих условиях также опережал рост штамма Sp245, a Sp245.P3 отставал от них. В отсутствие аэрации на среде с KN03 или с KN02 зависимость концентрации клеток от времени стала линейной. Скорость роста штамма Sp245.PS на среде с KNO3 осталась столь же высокой, как в предыдущих экспериментах. При этом Sp245.P3 и дикий тип росли одинаково. На среде с KNO2 оптическая плотность клеточных суспензий у всех трех штаммов изменялась практически одинаково. Стационарные условия более близки к природным, уровень содержания кислорода в этом случае способствует работе ферментов ассимиляционной и диссимиляционной нитритредукции, наблюдается умеренный рост бактерий. При этом использование KN02 как источника азота,

видимо, является энергетически не столь выгодным, как использование нитрата (Van Alst et al., 2007), чем можно объяснить меньшую скорость роста. Одинаковый для дикого штамма и его вариантов рост в этих условиях может быть обусловлен отсутствием различий в работе фермента, восстанавливающего нитрит.

Изучено накопление нитрита бактериями, выращенными на MPSS с KN03 в условиях интенсивной аэрации. Измерения проводили спустя 16 ч после начала культивирования, так как именно с этого времени хорошо видны различия в скорости роста штаммов. Результаты представлены на рис. 9. Следует отметить, что мы наблюдали образование клеточных агрегатов при выращивании азоспирилл на среде MPSS с KNO3. Внутри агрегатов кислородные условия могут быть более выгодными для активности нитрат-и нитритредуктазы. В условиях интенсивной аэрации из-за перемешивания культуры содержание кислорода в среде нестабильно, и можно предположить, что у штамма Sp245.P3 эти ферменты более устойчивы к колебаниям концентрации кислорода, чем у других исследованных штаммов. Хотя нельзя исключить, что полученные результаты являются следствием формирования вариантом Sp245.P3 наиболее устойчивых агрегатов клеток.

Способность перемещаться в направлении корней растения, наряду с аэро- и хемотаксисом помогает азоспириллам колонизировать корневую систему растений (Кацы, 1996). Подвижность важна как показатель энергетической активности клетки.

КЖз. мг/а

«Ч

SOi Д,

•К!

30-

м-

4 ■

16 20 24 7» 33 ' Ж 4« Вреш йнкгбзит "ч

Рис. 9. Накопление нитрита при культивировании А. ЬгаяНепзе Бр245

(1), его в«'а^'"'производных 8р245.РЗ

(2) и Sp245.PS (3) в жидкой МРБЯ с КЫОз (1 г/л) в условиях интенсивной аэрации.

В жидкой МРБ5 с нитратом калия клетки Sp245.Pl, 5р245.РЗ и Sp245.PS, выросшие в условиях интенсивной аэрации, плавали значительно быстрее - со скоростью 33.8 ± 1.0, 34.2 ± 1.4, 34.9 ±1.5 мкм/с, соответственно, чем клетки штамма 8р245 (29.0 ±1.5 мкм/с). При замене нитрата на нитрит у Эр245 и 8р245.РЗ подвижность подавлялась до 24.5 ± 2.0 и 26.8 ± 2.3 мкм/с, соответственно, а у Sp245.Pl и Sp245.PS скорость движения практически не снижалась (31.4 ± 1.5 и 32.7 ± 3.0 мкм/с, соответственно). Снижение подвижности клеток азоспирилл происходит также и в случае изменения источника азота в бедной по составу среде МвМ. Стоит отметить, что при культивировании бактерий с нитратом накопленный бактериями нитрит (рис. 9) не влияет на их подвижность.

На полужидких средах с концентрацией агара 0.4% и выше азоспириллы синтезируют латеральные жгутики. Оказалось, что на полужидкой МР88 с нитратом клетки Sp245.Pl, 5р245.РЗ и Sp245.PS двигаются быстрее родительского штамма. На МРББ с нитритом скорость движения клеток падает у Sp245.Pl, 8р245.РЗ и 8р245, и межштаммовые различия нивелируются. В случае штамма Sp245.PS замена нитрата на нитрит не влияет на подвижность клеток (таблица 3).

Показано, что диаметр колоний, формируемых в полужидкой МЭМ всеми исследованными штаммами, максимален в отсутствие солей азота в среде и снижается при их добавлении (до 1 г/л) в ряду 5ЧН4С1 > КК03 > КТ\02. При этом на МЯМ с нитритом калия все исследованные варианты 8р245.Р утрачивают способность к ускоренному по сравнению с диким типом роению. Аналогичные результаты получены и на МРБв (таблица 3).

Таблица 3. Зависимость от источника азота скорости движения клеток и диаметра колоний в полужидкой среде М1'53 у А ЬгаШете 5р245 и его производных_

Скорость движения клеток, мкм/с Диаметр колоний, мм

Штамм Источник азота

NH4CI KN03 kno2 Ntt,Cl KN03 kno2

Sp245 15.8 ±0.9 15.5 ± 1.0 13.5 ±0.8 17.4 ±2.8 12.3 ± 1.0 7.7 ± 1.0

Sp245.PI 19.1 ±0.9 18.2 ± 1.2 14.5 ±1.3 35.8 ± 2.0 17.2 ±2.4 8.6 ±1.4

Sp245.P3 19.2 ± 1.0 18.7 ± 1.5 14.0 ±1.2 36.2 ±1.7 15.0 ±0.8 6.1 ±0.5

Sp245.P5 19.9 ±1.0 19.1 ± 1.2 18.4 ± 1.2 37.9 ±1.4 24.7 ± 1.9 17.1 ±2.7

Примечания: Время инкубации 36 ч. Концентрация агара 0.4%; хлорида аммония, нитрата или нитрита калия - 1 г/л.

Варианты Sp245.Pl и Sp245.P5 быстрее восстанавливают нитрат и нитрит в условиях денитрификации, чем штамм Sp245.

Таким образом, выявлены различия в поведении спонтанных вариантов Sp245.P с изменениями в структуре р85, имеющих одинаковый суперроящийся фенотип в присутствии молекулярного азота или хлорида аммония, при замене источников азота в среде на нитрат или нитрит.

По-видимому, в исследованиях механизмов ассоциативного взаимодействия азоспирилл с растениями следует учитывать возможные последствия спонтанных вариаций в структуре геномов азоспирилл, которые, как показано нами, могут приводить к формированию субпопуляций A. brasilense с различиями в метаболизме нитратов/нитритов.

3.9 Сравнение устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий A.brasilense Sp245 и Sp7 дикого типа и их производных с плазмидными перестройками. Механизмы, обеспечивающие устойчивость микробов к ионам тяжелых металлов и поддержание гомеостаза тех из них, которые существенны для жизнедеятельности, тесно переплетаются (Silver, 1992; Choudhury,

Srivastava, 2001; Canovas el ah, 2003; Franke ei al., 2003). В ЛГМ ИБФРМ РАН была выявлена выраженная динамика геномов A. brasilense, проявляющаяся, в частности, в появлении вариантов с измененным плазмидным составом. Спонтанные плазмидные перестройки сопровождались изменением ряда культурально-физиологических характеристик бактерий (Кацы с соавт., 2002; Петрова с соавт, 2005, 2005а, 2010).

Локализация генов предсказанной эффлюкс-помпы в плазмиде р85 из штамма А. brasilense Sp245 позволила предположить, что плазмидные перестройки могли повлиять на устойчивость бактерий к тяжелым металлам. В предварительных экспериментах определили МИК солей серебра, меди, кобальта и цинка (AgN03, CuS04 х 5Н20, СоС12 х 6Н20, ZnS04 х 7Н20), предотвращающие видимый рост бактерий на плотной среде в течение 48-72 ч инкубации. МИК определяли для А. brasilense Cd и Sp7, производных Sp7.l-Sp7.10 и Sp7.K2; Sp245, его мутантов SK051, SK248 и спонтанных дериватов Sp245.5 и Sp245.Pl-Sp245.P5.

Оказалось, что на плотной MSM только бактерии Sp245.5 выдерживают значительно более высокие концентрации ионов Ag+, Cu"+, Со2+ и Zn2+, чем Sp245 и другие штаммы азоспирилл. Сравнительная токсичность использованных металлов для штамма Sp245 и его деривата Sp245.5 имела одинаковый характер: Ag+>Co2+>Cu2+>Zn2+.

МИК AgN03 на жидкой среде для обоих штаммов оказалась на порядок ниже, чем на плотной (таблица 3). Возможно, аэрация и перемешивание усиливают влияние иона серебра. Значимых различий в МИК солей кобальта, меди и цинка при выращивании бактерий на плотных или жидких средах не наблюдалось. Вероятно, это объясняется более выраженной способностью двухвалентных ионов к образованию комплексов с молекулами на поверхности бактерий (Левина, 1972).

Мы задались вопросом о возможных причинах резкого повышения уровня устойчивости деривата A. brasilense Sp245.5 к одновалентным и двухвалентным катионам. На других объектах было показано, что ключевым механизмом устойчивости к ионам тяжелых металлов является активный эффлюкс, обеспечиваемый работой RND-транспортеров, белков CDF (cation diffusion facilitators - ускорители диффузии катионов) и АТФ-аз Р-типа. Для работы RND-транспортеров и CDF необходим градиент протонов (Nies, 2003).

В следующей серии экспериментов сравнили влияние солей серебра, кобальта, меди и цинка на рост клеток Sp245 и Sp245.5 в жидкой среде и в жидкой среде с добавлением ингибитора эффлюкс-помп СССР, нарушающего трансмембранный градиент протонов (Досон с соавт., 1991). Протонофор использовали в концентрации 0.625 мкМ, не влияющей на рост бактерий, но немного подавляющей скорость их плавания в жидких средах (что служит показателем изменений в клеточной энергетике).

В случае штамма A. brasilense Sp245 МИК кобальта, меди и цинка в присутствии СССР снижались, но низкий уровень устойчивости к серебру оставался прежним. Добавление СССР не влияло на толерантность деривата A. brasilense Sp245.5 к кобальту, подавляло его устойчивость к меди и серебру до уровней дикого типа и вызывало снижение устойчивости к цинку (таблица 4).

По-видимому, значительное повышение устойчивости клеток штамма A. brasilense Sp245.5 к солям меди и серебра и, в меньшей степени, к солям цинка связано с активизацией процесса эффлюкса этих металлов.

У Sp245.5 изменен состав поверхностных полисахаридов, которые в первую очередь взаимодействуют с ионами, чем, возможно, объясняется отличная от штамма дикого типа устойчивость к солям кобальта и цинка. Не исключено, что

определенный вклад привносят какие-то изменения в процессе внутриклеточного преобразования кобальта, который не зависит от работы помпы (Катпеу е< а/., 2004).

Таблица 4. МИК ионов тяжелых металлов для штаммов А. ЬгазНепзе, инкубируемых в жидкой М5М в отсутствие или в присутствии 0.625 мкМ СССР_

А. ЬгаяНете МИК

мкМ мМ

А6+ Аё+ + СССР Со2+ Со2+ + СССР Си2+ Си2' + СССР 2п2+ гп2++ СССР

Бр245 0.5 ± 0.05 0.5 ±0.1 3.4 ±0.03 3.3 ±0.04 0.9 ±0.1 0.6 ±0.1 3.1 ±0.4 2.1 ±0.2

8р245.5 0.9 ±0.1 0.6 ±0.1 0.7 ± 0.03 3.7 ± 0.04 4.7 ±0.8 0.8±0.1 11.5 ±0.7 8.1 ±0.4

Крупная геномная перестройка, произошедшая в клетках А. ЬгаяНете 8р245.5, могла оказать влияние на экспрессию многих плазмидных и (или) хромосомных генов, ответственных за толерантность бактерий к тяжелым металлам. Возможная избыточность и взаимозаменяемость генов, ответственных за устойчивость А.ЪгазИепзе вр245 к тяжелым металлам, могла замаскировать негативные последствия утраты локализованных в р85 последовательностей, кодирующих компоненты одной из эффлюкс-помп. Для уточнения функции продуктов трансляции оф22х, ог/115 и оф76, выявленных в р85, необходимы дополнительные молекулярно-генетические и биохимические исследования.

Интересно, что более устойчивый к солям тяжелых металлов дериват А. ЪгазИете 8р245.5 обладает также повышенной способностью к колонизации корней пшеницы по сравнению со штаммом дикого типа (неопубликованные данные сотрудников ЛГМ ИБФРМ РАН). По-видимому, штамм Бр245.5 может найти применение в работах по инокуляции растений в условиях загрязнения почв тяжелыми металлами - при разработке технологий биоремедиации.

ВЫВОДЫ

1. В 85-МДа плазмиде (р85) бактерий АгохртНит Ьгаи1еп$е вр245 выявлены гены медьсодержащей нитритредуктазы №гК; гетеродимерной ЫО-редуктазы №гСВ; активатора КО-редуктазы ¡ЧоФ; АТФ-азы №>г<3; предполагаемого сенсора N0 (ОгП 81); цистатион-р-лиазы МеК?, катализирующей синтез возможного антагониста N0 - гомоцистеина; регулятора транскрипции ЬуэК типа; каталитической субъединицы I цитохром с оксидазы CcoN и консервативного белка (0г1208). В ДНК бактерий А. ЪгаэПете и Сс1 обнаружен локус, высоко гомологичный тгК -о$208 из р85.

2. В плазмиде р85 из А. bra.sUеже Эр245 идентифицированы три открытые рамки считывания, кодирующие компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, осуществляющей выброс катионов тяжелых металлов из клеток.

3. С помощью полимеразных цепных реакций с 10 парами праймеров к 18.3-т.п.н. и 9.1-т.п.н ХЛо1-фрагментам р85 показано, что спонтанные плазмидные перестройки могут сопровождаться утратой из клеток А. brasilen.se этих сегментов р85 (у деривата Эр245.5) или их сохранением в составе новой плазмиды (у вариантов Sp245.Pl, 8р245.Р2, 8р245.РЗ и 8р245.Р4).

4. У производного А. brasilen.se 8р245.5 исчезновение 85- и 120-МДа репликонов при образовании новой мегаплазмиды сопровождается снижением скорости плавания бактерий, двукратным повышением их гемагглютинирующей активности и изменением морфологии макроколоний, формируемых в полужидких средах, по сравнению с таковыми у Бр245. В присутствии препарата поверхностного белка-

гемагтлютинина штамма Sp245, обладающего сродством к его О-спецйфическому полисахариду (ОПС1), снижается скорость плавания клеток этого штамма, но не деривата Sp245.5 с иной структурой ОПС.

5. У спонтанных суперроящихся вариантов A. brasilense Sp245.Pl, Sp245.P2, Sp245.P3, Sp245.P4 и Sp245.PS, более подвижных в присутствии N2 и NH<C1, чем Sp245, выявлены межштаммовые различия в росте и подвижности в средах с М)з~ и (или) NO2" и в эффективности восстановления нитрата и нитрита.

6. Дериват A. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой и новым липополисахаридом устойчив к значительно более высоким концентрациям солей серебра, кобальта, меди и цинка, чем родительский штамм Sp245. Характер влияния карбоншщианид-.м-хлорофенилгидразона на минимальные концентрации ионов тяжелых металлов, ингибирующие рост культур Sp245.5, свидетельствует об активизации у деривата протонзависимого эффлюкса ионов Ag+, Cu2+ и Zn

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах

1 Шелудько A.B., Пономарева Е.Г., Варшаломидзе О.Э., Ветчинкина Е.П., Кацы Е.И., Никитина В.Е. Гемагглютинирующая активность и подвижность бактерий Azospirittum brasilense в присутствии разных источников азота // Микробиология. - 2009. - Т. 78, № 6. -С. 749-756.

2 Петрова Л.П., Варшаломидзе О.Э., Шелудько A.B., Кацы ЕЙ. Локализация генов денитрификации в плазмидной ДНК бактерии Azospirillum brasilense II Генетика. - 2010. - T. 46,№7.-С. 904-910.

3 Shelud'ko А. V., Varshalomidze O.E., Petrova L.P., Katsy E.I. Effect of genomic rearrangement on heavy metal tolerance in the plant-growth-promoting rhizobacterium Azospirillum brasilense Sp245 II Folia Microbiol. - 2011. - http.V/dx.doi.org/10.1007/s 12223-011 -0074-5.

Статьи в сборниках

4 Варшаломидзе О.Э., Шелудько A.B., Пономарева Е.Г., Никитина В.Е., Кацы Е.И. Влияние источников азота га подвижность и свойства клеточной поверхности Azospirillum brasilense II Биология: традиции и инновации в XXI веке / Ред. Т.В. Балтии. - Казань: Изд-во КГУ, 2008. -С. 29-31.

5 Кацы Е.И., Шелудько A.B., Петрова Л.П., Варшаломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Шульгин C.B. Спонтанные и индуцированные изменения в социальной подвижности ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense // Бюлл. МОИП. Отдел биол. - 2009. - Т. 114, № 2, прил. 1. -С. 132-133.

Тезисы докладов

6 Варшаломидзе О.Э., Шелудько A.B., Кацы Е.И. Подвижность Azospirillum brasilense в присутствии разных источников азота // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. IV Межрегион, конф. мат. уч. - Саратов: Научная книга, 2008. - С. 19.

7 Кацы Е.И., Петрова Л.П., Шелудько A.B., Варшаломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Прилипов А.Г. Изменения в структуре плазмид и вариации в проявлении признаков, значимых для взаимодействия ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense с растениями // Матер. 5-го Московского междунар. конгр. "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - М.: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. - Ч. 1. - С. 283.

Katsy El, Petrova LP., Shelud'ko A.V., Varshalomidze O.E., Kulibyakina O.V., PrilipovA.G. Changes in plasmid structures and variations in the traits important for the interactions of the associative bacterium Azospirillum brasilense with plants // Proceed. 5th Moscow Intern. Congr. "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development". - Moscow: JSC "Expo-biochem-technologies", D.I. Mendeleyev University of Chemistry and Technology of Russia. - 2009. - Part l.-P. 284.

8 Варшаломидзе О.Э., Петрова Л.П., Шелудько A.B., Кацы Е.И. Анализ подвижности ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense в присутствии нитратов и нитритов //

Симбиоз Россия 2010: Сб. тез. III Всеросс. с междунар. уч. контр, студ и аспир.-биол. -Нижний Новгород, 2010 г. - С. 89-90.

9 Варшаломидзе О.Э., Шелудько А.В., Петрова Л.П., Кацы Е.И. Влияние плазмндных перестроек на уровень устойчивости ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense к солям тяжелых металлов // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. V Всеросс. конф. мол. уч. - Саратов: Научная книга, 2010. - С. 40.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 19.12.2011. Гарнитура Times. Печать Riso. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 0681

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачёвская, 161, офис 320 Я 27-26-93

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Варшаломидзе, Ольга Эдуардовна

Условные обозначения и сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.:.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Бактерии рода АгояртЫит как один из основных модельных объектов в исследованиях ассоциативного микробно-растительного взаимодействия.

1.2 Динамика геномов как один из факторов формирования внутрипопуляционного разнообразия бактерий.

Свойства и функции плазмид азоспирилл.

1.3 Генетико-биохимические аспекты диссимиляторной денитрификации и влияние этого процесса на взаимодействие микроорганизмов с растениями.

1.4 Механизмы устойчивости микроорганизмов к ионам тяжелых металлов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2 Питательные среды и условия выращивания бактерий.

2.3 Анализ плазмидного состава бактерий. Выделение, очистка и секвенирование ДНК.

2.4 Постановка полимеразных цепных реакций.

2.5 Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей с использованием биоинформационных ресурсов.

2.6 Определение гемагглютинирующей активности бактерий.

2.7 Изучение скорости роста бактерий в присутствии разных источников азота.

2.8 Определение нитрита в культуральной жидкости.

2.9 Исследование подвижности бактерий.

2.10 Определение уровня устойчивости бактерий к солям тяжелых металлов.

2.11 Статистическая обработка результатов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Идентификация в плазмиде р85 из бактерий А. ЪгахИсте Бр245 комплекса генов денитрификации.

3.2 Выявление в плазмиде р85 из А. ЬгаяИеже Бр245 последовательностей, кодирующих предсказанные белки-экспортеры ионов тяжелых металлов.

3.3 Сравнительный анализ ДНК бактерий штаммов А. ЬгаяПете 8р245, Бр7 и Сс в ПЦР с праймерами к ДНК р85 из штамма 8р245.

3.4 Анализ изменений в структуре ДНК, произошедших у спонтанных суперроящихся производных A. brasílense Sp245.

3.5 Сравнительное исследование ДНК бактерий штамма A br asílense Sp245 и его спонтанного деривата Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой.

3.6 Различия в подвижности и гемагглютинирующей активности клеток штаммов

A. brasilense Sp245 и Sp245.5.

3.7 Подвижность бактерий штаммов A. brasilense Sp245 и Sp245.5 в присутствии полимеров, выделенных с поверхности клеток Sp245.

3.8 Рост и подвижность бактерий штамма Л. brasilense Sp245 и его спонтанных суперроящихся производных в присутствии разных источников азота.

3.9 Сравнение устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий A.brasilense

Sp245 и Sp7 дикого типа и их производных с плазмидными перестройками.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Плазмидные перестройки и изменения в подвижности, метаболизме азота и устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий Azospirillum brasilense"

Актуальность проблемы. Являющиеся ассоциативными партнерами растений, бактерии рода АгохрМИит из семейства Ккос1о8рт11асеае способны к существованию в разнообразных климатических поясах и экологических нишах (Ьеуапопу е1 а1., 1989; ВаБИап, Но1^п, 1997, 1998; КаШрМуа ег а1., 1995). Изучению особенностей метаболизма и многокомпонентных геномов азоспирилл посвящены многочисленные работы широкого круга исследователей. Повышенный интерес к биохимии и генетике этих бактерий объясняется их способностью стимулировать рост широкого круга растений (это р1ап1-§гоАЛ^Ь-рготойп§ гЫгоЬа^епа, или РОРЫ).

Среда обитания почвенных бактерий разнообразна по химическому составу, и существование в такой среде требует от организмов устойчивости и гибкости. В связи с этим пластичность генома является важной характеристикой бактерий, так как способствует возникновению неоднородных по своим адаптивным свойствам популяций. Получены первые данные о том, что образование фенотипических вариантов ризобактерий способствует их лучшему взаимодействию с растениями (АсЬоиак е/ а1, 2004).

Клубеньковые бактерии обладают высоко динамичным геномом, что частично определяется наличием большого числа ^-элементов и генов транспозаз, в том числе, в областях, кодирующих симбиотические функции.

У свободноживущих ассоциативных бактерии также сформировались сложные мозаичные геномы - главным образом, за счет дупликаций генов и масштабного горизонтального генетического переноса (МасЬеап а1, 2007). Присутствие многочисленных мобильных генетических элементов в геномах азоспирилл предполагает потенциальную возможность разнообразных генетических перестроек (РоАиег е/ а1, 2008; Ка1Бу, РгШроу, 2009; Ка1Бу, 2011).

Одним из факторов, жизненно важных для бактерий, является наличие в среде источника азота. Для азоспирилл характерна способность к фиксации атмосферного азота за счет работы нитрогеназы в микроаэрофильных условиях и к использованию азотсодержащих солей (соль аммония, нитраты и нитриты) в условиях аэрации (Tal, Окоп, 1985). Процесс диссимиляторной денитрификации (как правило, при недостатке кислорода) у бактерий может катализироваться респираторной мембраносвязанной или периплазматической нитратредуктазой; цитохром cd\ или медьсодержащей нитритредуктазой; гетеродимерной, получающей электроны от цитохрома с или однокомпонентной, получающей электроны от хинола NO-редуктазой и ^О-редуктазой (Zumft, 1997). Денитрификация может служить для нейтрализации редуцирующего потенциала в клетке, а также для дальнейшего превращения нитрита, в определенной концентрации способного ингибировать рост азоспирилл (Lee et al., 2002). Продукты нитрат- и нитритредукции могут влиять на поведение бактерий и их взаимодействие с растениями (Van Alst et al., 2007; Molina-Favero et al., 2008). У модельного штамма ассоциативных бактерий A. brasilense Sp245 охарактеризована периплазматическая нитратредуктаза и кодирующие ее гены парАВС (Steenhoudt et al., 2001), две копии гена нитритредуктазы nirK, локализованные в разных плазмидах (Pothier et al., 2008), гены norB (Braker, Tiedje, 2003) и nosZ (Rich et al., 2003) с неопределенной локализацией в геноме. Других сведений об идентификации у азоспирилл генов денитрификации к началу наших работ в литературе не было.

Известны исследования, показавшие, что устойчивость азоспирилл к ряду тяжелых металлов выше по сравнению с другими ризобактериями (Tugarova et al., 2006). Несколько работ посвящены механизмам поступления металлов в клетку и их последующим превращениям (Ignatov et al., 2001; Kamnev et al., 1997; Kamnev et al, 2004). Для поддержания баланса ионов металлов в клетке бактериями используются несколько описанных в литературе систем (Bruins et al., 2000; Choudhury, Srivastava, 2001). Одним из способов выведения ионов из клетки является антипорт ионов и протонов, осуществляемый системой из трех белков. Мембранные компоненты этой системы, или протон-субстрат антипортеры, являются белками суперсемейства RND, они подразделяются на основе экспортируемого субстрата. Экспортеры тяжелых металлов RND (НМЕ) являются высоко субстратспецифичными, дифференцируют одновалентные и двухвалентные ионы (Nies, 1999). Согласно некоторым исследованиям, устойчивость бактерий к тяжелым металлам обеспечивается продуктами экспрессии плазмидных генов (Mergeay et al., 2003; Nies, 2003). Однако данных о генетических аспектах устойчивости азоспирилл к тяжелым металлам (кобальт, медь, цинк и др.) в литературе обнаружено не было.

Важным свойством, определяющим адаптационный потенциал бактерий, является их подвижность. Наличие у азоспирилл специализированных двигательных органелл - жгутиков (Tarand et al., 1978; Hall, Krieg, 1984; Khammas et al., 1989) позволяет им перемещаться по направлению к наиболее благоприятным условиям, закрепляться на поверхности корней растений.

В соответствии с поставленной целью в ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Характеристика нуклеотидной последовательности клонированного ранее 18.3-т.п.н. Л7го1-фрагмента 85-МДа плазмиды (р85) A. brasilense Sp245, утрата которой дериватом Sp245.5 сопровождалась блокированием диссимиляторной нитритредукции.

4. Анализ гемагглютинирующей активности и подвижности клеток штамма A. brasilense Sp245 и его деривата Sp245.5 (с крупной плазмидной перестройкой и новым липополисахаридом) в присутствии разных источников азота.

5. Сравнение устойчивости к солям тяжелых металлов бактерий A. brasilense Sp245 и Sp7 и их производных со спонтанными плазмидными перестройками.

Научная новизна работы. Показано, что у модельного штамма A. brasilense Sp245 спонтанные геномные перестройки, затрагивающие 85-МДа плазмиду (р85), могут сопровождаться утратой протяженных сегментов р85 или их сохранением в геноме азоспирилл.

Кроме генов медьсодержащей нитритредуктазы (nirK) и гетеродимерной NO-редуктазы (погСВ), в плазмидной ДНК азоспирилл (р85 из штамма А. brasilense Sp245) впервые выявлены гены активатора NO-редуктазы NorD; АТФ-азы NorQ; предполагаемого сенсора N0; цистатион-[3-лиазы, катализирующей образование возможного антагониста NO - гомоцистеина; одного из регуляторов транскрипции LysR типа и каталитической субъединицы I цитохром с оксидазы (ccoN); а также последовательности, кодирующие компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, осуществляющей выброс катионов из клеток. В ДНК типового штамма A. brasilense Sp7 и его производного Cd обнаружен локус, высоко гомологичный nirK и ог/208 (кодирующей предсказанный белок с консервативным доменом "субъединица Е формилметанофурандегидрогеназы") из р85 штамма A. brasilense Sp245.

Впервые показано, что спонтанные плазмидные перестройки могут приводить к появлению субпопуляций (вариантов) штамма A. brasilense Sp245 с различиями в росте и подвижности в средах с N03~ и (или) NÜ2- и в эффективности восстановления нитрата и нитрита.

Установлено, что на подвижность бактерий A. brasilense Sp245 оказывают влияние межклеточные контакты, опосредуемые взаимодействиями поверхностного белка-гемагглютинина с О-специфическим полисахаридом (ОПС) этого штамма. Отсутствие таких белок-углеводных взаимодействий вследствие появления нового ОПС у деривата А. ЬгазИете 8р245.5 (в клетках которого вместо двух резидентных плазмид образовалась новая мегаплазмида), по-видимому, является одной из причин заметных изменений в коллективной подвижности этих бактерий.

На примере А. ЬгаяПете впервые выявлено влияние динамики генома на устойчивость бактерий к ионам тяжелых металлов: описано необычное явление существенного спонтанного повышения толерантности бактерий к солям кобальта (II), цинка (И), меди (II) и серебра (I).

Научно-практическая значимость работы. Новые знания о влиянии динамики геномов РОРЫ А. ЬгаэИете на экологически значимые свойства этих бактерий (осуществление денитрификации; заселение новых территорий благодаря индивидуальной и социальной подвижности; устойчивость к солям тяжелых металлов и др.) будут полезны при разработке аграрных биотехнологий. Выявленные в плазмиде р85 из А. ЪгазИете Бр245 последовательности, кодирующие ферменты денитрификации и компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, могут быть клонированы в других бактериях с целью расширения адаптационного потенциала новых хозяев. Дериват 8р245.5 РвРК А. ЬгазИете 8р245, обладающий, как оказалось, относительно высоким уровнем устойчивости к ряду тяжелых металлов, может быть использован в работах по биоремедиации загрязненных почв. Бактерии штамма А. brasilen.se 8р245.5, подробно охарактеризованные в данной работе, нашли применение в исследованиях пяти лабораторий ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, микробиологии, биохимии, иммунохимии, экологической биотехнологии).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В плазмиде р85 из штамма А ЪгаяИете Эр245 находится комплекс генов, потенциально важных для обеспечения диссимиляторной редукции N02" и N0 и для защиты этих бактерий от токсического действия N0 и ионов тяжелых металлов.

2. Спонтанные генетические перестройки могут приводить к утрате из генома А. ЬгаБНеже Бр245 протяженных сегментов 85-МДа плазмиды или к их сохранению в составе новых молекул ДНК.

3. Плазмидные перестройки в ряде случаев сопровождаются появлением вариантов штамма А. ЪгазИеже 8р245 с индивидуальными различиями в скорости движения и роста в присутствии разных источников азота, нитрат- и нитритредукции, гемагглютинирующей активности и устойчивости к солям тяжелых металлов.

4. Существенное повышение толерантности деривата А. ЬгаяИете 8р245.5 к солям серебра, кобальта, меди и цинка определяется несколькими факторами, в том числе, усилением протонзависимого эффлюкса ионов А§+, Си2+ и

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в рамках двух плановых тем НИР (науч. рук. -д.б.н. проф. Е.И. Кацы): "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий АгоэртИит ЬгааИете" (№ госрегистрации 01200606181) и "Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями" (№ госрегистрации 01200904390). Исследования были частично поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований (06-04-48204-а; рук. - д.б.н. Е.И. Кацы) и Президента РФ (НШ-3171.2008.4; рук. - засл. деят. науки РФ, д.б.н. проф. В.В. Игнатов).

Автор выражает благодарность зав. лаб. генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН д.б.н. проф. Е.И. Кацы, сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН в.н.с. д.б.н. A.B. Шелудько и с.н.с. к.б.н. Л.П. Петровой, сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН (зав. лаб. - д.б.н. проф. В.Е. Никитина) с.н.с. к.б.н. Е.Г. Пономаревой и с.н.с. к.б.н. Е.П. Ветчинкиной и зав. лаб. молекулярной генетики ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ к.б.н. А.Г. Прилипову за помощь при выполнении работ и сотрудничество.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IV Межрегиональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008), 5-м Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009) и V Всероссийской конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2010). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 22.11.2011, протокол № 185.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 9 подразделов), а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 305 источников, из них 52 на русском и 253 на английском языке. В Приложении приведены обсуждаемые в работе кодирующие последовательности из двух сегментов 85-МДа плазмиды бактерий A. brasilense Sp245, депонированные в международную базу данных GenBank (NCBI, США) (GenBank accession numbers EU194339, EU595700-EU595706, EU784144, GU904166, GU904167 и GQ168585).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Варшаломидзе, Ольга Эдуардовна

ВЫВОДЫ

1. В 85-МДа плазмиде (р85) бактерий АгохртИит ЪгаьИеже Бр245 выявлены гены медьсодержащей нитритредуктазы №гК; гетеродимерной ЫО-редуктазы МогСВ; активатора ЫО-редуктазы ЫогБ; АТФ-азы N0^; предполагаемого сенсора N0 (ОгП81); цистатион-р-лиазы МеК?, катализирующей синтез возможного антагониста N0 - гомоцистеина; регулятора транскрипции ЬуБЯ типа; каталитической субъединицы I цитохром с оксидазы СсоЫ и консервативного белка (0г£208). В ДНК бактерий А. ЬгаяНете 8р7 и Сё обнаружен локус, высоко гомологичный тгК-ог/208 из р85.

2. В плазмиде р85 из А. ЬгаяИете Бр245 идентифицированы три открытые рамки считывания, кодирующие компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, осуществляющей выброс катионов тяжелых металлов из клеток.

3. С помощью полимеразных цепных реакций с 10 парами праймеров к 18.3-т.п.н. и 9.1-т.п.н ^¥7го1-фрагментам р85 показано, что спонтанные плазмидные перестройки могут сопровождаться утратой из клеток А. Ь г об Не те этих сегментов р85 (у деривата 8р245.5) или их сохранением в составе новой плазмиды (у вариантов Sp245.Pl, 8р245.Р2, 8р245.РЗ и 8р245.Р4).

4. У производного А. Ъга^йете 8р245.5 исчезновение 85- и 120-МДа репликонов при образовании новой мегаплазмиды сопровождается снижением скорости плавания бактерий, двукратным повышением их гемагглютинирующей активности и изменением морфологии макроколоний, формируемых в полужидких средах, по сравнению с таковыми у 8р245. В присутствии препарата поверхностного белка-гемагглютинина штамма 8р245, обладающего сродством к его О-специфическому полисахариду (0ПС1), снижается скорость плавания клеток этого штамма, но не деривата 8р245.5 с иной структурой ОПС.

5. У спонтанных суперроящихся вариантов^. Ьгазйете Sp245.Pl, 8р245.Р2, 8р245.РЗ, 8р245.Р4 и Sp245.PS, более подвижных в присутствии N2 и ЖЦСЛ, чем 8р245, выявлены межштаммовые различия в росте и подвижности в средах с >Юз~ и (или) N02" и в эффективности восстановления нитрата и нитрита.

6. Дериват А. ЪгазИете Бр245.5 с крупной плазмидной перестройкой и новым липополисахаридом устойчив к значительно более высоким концентрациям солей серебра, кобальта, меди и цинка, чем родительский штамм 8р245. Характер влияния карбонилцианид-л«-хлорофенилгидразона на минимальные концентрации ионов тяжелых металлов, ингибирующие рост культур 8р245.5, свидетельствует об активизации у деривата протонзависимого эффлюкса ионов , Си и

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из интересных и перспективных моделей для изучения ассоциативного растительно-микробного взаимодействия являются бактерии рода Azospirillum (Bashan, Holguin, 1997; Katupitiya et al., 1995; Levanony et al., 1989), обладающие крупным геномом, в том числе многочисленными плазмидами. Содержащаяся в плазмидах азоспирилл генетическая информация, по-видимому, важна для стимуляции роста растений и выживания этих бактерий в почве и ризосфере (Katsy, 2011).

Основным объектом данного исследования являлись бактерии штамма Azospirillum brasilense Sp245, обладающие всеми характеристиками, которые могут влиять на их ассоциативное взаимодействие с растениями (диазотрофность, хемотаксис, подвижность, образование фитогормонов, разнообразных углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности и др.). Кроме того, бактерии данного штамма способны не только колонизировать ризосферу, но и проникать внутрь корней и существовать в них в метаболически активном состоянии (Döbereiner, De-Polli, 1981; Jain, Patriquin, 1984).

С помощью in situ лизиса клеток бактерий и анализа плазмидного состава методом (Eckhardt, 1978) у А. brasilense Sp245 были выявлены плазмиды р85, р120 и три плазмиды с молекулярной массой >300 МДа (Кацы, 1992). Для получения новых данных о первичной структуре и функциях плазмид А. brasilense нами были использованы базы биоинформационных данных и методы in silico анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Полученные результаты были сопоставлены со сведениями о тех изменениях в фенотипе бактерий, к которым привели определенные изменения в структуре плазмид А brasilense Sp245.

В своих исследованиях мы использовали созданную в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН коллекцию производных штамма А. brasilense Sp245, отличающихся от него по признакам, связанным с продукцией поверхностных структур и функционированием систем, обеспечивающих диссимиляторную нитритредукцию и бактериальную подвижность. Кроме того, были разработаны специфичные к плазмиде р85 олигонуклеотидные праймеры, использование которых позволило провести сравнительный анализ ДНК нескольких штаммов A. brasilense дикого типа и спонтанных вариантов штамма Sp245.

Секвенирование 18.3-т.п.н. А7ю1-фрагмента р85 из A. brasilense Sp245 (представленного в рекомбинантной плазмиде рЕК248Х) выявило наличие в р85 генов, кодирующих медьсодержащую нитритредуктазу (nirK); гетеродимерную NO-редуктазу (погСВ); белки NorQ и NorD, влияющие на синтез и/или активацию NirK и/или NO-редуктазы (norQD); каталитическую субъединицу I цитохром с оксидазы (ccoN); предполагаемый сенсор N0 с двумя гемэритриновыми доменами (orfl81) и фермент, необходимый для синтеза возможного антагониста NO - гомоцистеина (metC). В этом же районе р85 обнаружена orf293, кодирующая регулятор транскрипции LysR типа; ог/208, в продукте которой выявлен домен "субъединица Е формилметанофурандегидро-геназы", и orfl64, кодирующая консервативный секретируемый белок с неясной функцией.

Интересно, что перед генами р85 nirK, norC и ccoN есть потенциальные сайты связывания регулятора транскрипции RegA. RegA - один из белков двухкомпонентной сенсорно-регуляторной системы PrrBA (RegBA), модулирующей экспрессию ряда генов альфапротеобактерии Rb. sphaeroides в зависимости от редокс-статуса клетки (baratta et al., 2002; Laguri et al., 2003). Возможно, аналогичная система регуляции экспрессии генов в ответ на изменения внутриклеточного редокс-статуса, предполагающая, участие CcoN (baratta et al., 2002; Swem, Bauer, 2002; Laguri et al., 2003), существует и у альфапротеобактерии A. brasilense, и не случайно ccoN оказался рядом с кластером генов денитрификации.

Транскрипция бактериальных генов денитрификации активируется в ответ на низкое содержание 02 и присутствие N03~ в среде. Известны такие глобальные регуляторы транскрипции генов в условиях дефицита кислорода, как белок FNR; гомологичный ему белок ANR, контролирующий денитрификацию, дезаминирование аргинина и продукцию цианида у Р. aeruginosa; а также белок DNR, экспрессия гена которого находится под контролем ANR. DNR, по-видимому, отвечает на оксиды азота (Zumft, 1997). Наличие потенциальных сайтов связывания FNR/ANR/DNR перед генами nirK и погС, выявленными нами в плазмиде р85 из A. brasilense Sp245, свидетельствует о возможной активации экспрессии этих генов в ответ на снижение концентрации 02 и присутствие оксидов азота.

Перед nirK, погС, or/293 и ccoN в р85 выявлены и потенциальные сайты связывания регулятора NarL, находящегося под контролем сенсора нитрата/нитрита NarX (Zumft, 1997). Возможно, биосинтез не только двух ферментов денитрификации, но и кодируемого р85 регулятора транскрипции Orf293 и каталитической субъединицы I цитохромоксидазы CcoN модулируется в ответ на N03~ и N02~.

Гены norCBOD и nirK, or/208 и or/181, по-видимому, образуют опероны. Поэтому белки-регуляторы транскрипции, потенциальные сайты связывания которых находятся перед погС и nirK, могут оказывать влияние на экспрессию всех генов предполагаемых оперонов norCBQD и nirKor/208or/l81.

Локализация комплекса генов денитрификации в плазмидной ДНК А. brasilense Sp245, к тому же недалеко от IS-элементов ISAzbal и !SAzba2 (Katsy, Prilipov, 2009), свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов и высокой вероятности их горизонтального распространения в популяциях ризосферных бактерий, приводящего к расширению адаптационного потенциала микробов.

ПНР с праймерами к nirK-or/208 из плазмиды р85 на ДНК бактерий А. brasilense Sp245, Sp7 и Cd, привели к получению во всех трех случаях ампликона с ожидаемой длиной 466 п.н., что свидетельствует о существовании высоко гомологичных локусов у этих штаммов азоспирилл. Типовой штамм А. brasilense Sp7, содержит плазмиды pRhico, р 115 и несколько плазмид с молекулярной массой более 300 МДа (Кацы, 1992). Ранее при гибридизации с 2.4-т.п.н. £соЮ-фрагментом р85, содержащим, как стало сейчас ясно, nirK-orf208-orfl81, был зарегистрирован сильный позитивный сигнал в плазмиде р115 из A. brasilense Sp7 и более слабый - в плазмиде Sp7 с молекулярной массой более 300 МДа (Кацы с соавт., 2002). Штамм A. brasilense Cd, утративший р115, изолирован из корней растения, инокулированного культурой Sp7 (Eskew et al., 1977) и, по-видимому, является производным штамма Sp7 (см., например работу Петровой с соавт., (2005)). В случае ПЦР на ДНК А. brasilense Cd с праймерами к nirK-orf208 был получен слабый позитивный результат, что, по-видимому, объясняется сохранением в геноме этого штамма одного из двух участков гомологии 2.4-т.п.н oRI-фрагменту с генами nirK-orf208-orfl81, локализованного вне pi 15 (Кацы с соавт., 2002; Петрова с соавт., 2005). Утрата р115 штаммом A. brasilense Cd сопровождается потерей способности бактерий к восстановлению нитрита, что также свидетельствует о вкладе генов pi 15 в процесс денитрификации.

В настоящей работе в результате анализа нуклеотидной последовательности 18.3-т.п.н. .YTzoI-фрагмента плазмиды р85 из A. brasilense Sp245 были идентифицированы orf, предсказанные продукты которых, по-видимому, образуют эффлюкс-помпу, осуществляющую выброс катионов тяжелых металлов из клетки. Подобные белковые помпы состоят из расположенного в цитоплазматической мембране антипортера протонов, периплазматического белка и белка, локализованного в наружной мембране (Nikaido, 1996). У R. metallidurans (Mergeay et al., 2003) сходные системы обеспечивают устойчивость к никелю, кобальту, кадмию, цинку (Mergeay et al., 1985; Liesegang et al., 1993; Schmidt, Schlegel, 1994). У P. aeruginosa помпа CzrCBA вносит вклад в устойчивость бактерий к цинку и кадмию (Hassan et al., 1999). У Е. coli четырехкомпонентная помпа CusCFBA определяет устойчивость к одновалентным катионам серебра и меди (Franke et al., 2003) и, по-видимому, участвует в поддержании гомеостаза меди (Grass, Rensing, 2001). Об идентификации у каких-либо штаммов Azospirillum генов, определяющих устойчивость к тяжелым металлам, ранее не сообщалось.

В ПНР на ДНК A. brasilense Sp7 и Cd с праймерами к последовательностям р85, кодирующим предсказанные компоненты эффлюкс-помпы, осуществляющей выброс тяжелых металлов из клеток, были получены негативные результаты. По-видимому, в геномах бактерий штаммов Sp7 и Cd нет локусов, идентичных orfl22x и orfl76 из плазмиды р85 A. brasilense Sp245.

Геномы азоспирилл обладают пластичностью, и ДНК некоторых плазмид вовлечена в спонтанные геномные перестройки (Кацы с соавт., 2002; Петрова с соавт., 2005, 2005а; Vial et al., 2006; Katsy, 2011). Нами установлено, что у ряда полученных ранее (Борисов, 2004) спонтанных производных A. brasilense Sp245 с ускоренным роением (Sp245.Pl-Sp245.P4) вместо 85-МДа репликона появилась примерно в два раза более крупная плазмида, по-видимому, являющаяся продуктом межмолекулярной генетической рекомбинации. Интересно, что плазмидные профили нашего штамма A. brasilense Sp245 и его Swa^-производного Sp245.P5 аналогичны таковым у образцов Sp245 из Реховота (Израиль) и Лувена (Бельгия), а размер новой плазмиды из клеток суперроящихся вариантов Sp245.Pl-Sp245.P4 близок к размеру вероятного коинтеграта (р85 с другой плазмидой) из французского штамма Sp245 (Лион) (Pothier et al, 2008).

Предсказанные продукты нескольких orf, выявленных в р85 из A. brasilense Sp245, предположительно, могут влиять на сборку или вращение покрытого полисахаридным чехлом (Бурыгин с соавт., 2007) полярного жгутика, субъединицы флагеллина которого гликозилированы (Moens et al., 1995). Так, ген р85 ccoN кодирует каталитическую субъединицу I цитохромоксидазы, являющуюся интегральным белком цитоплазматической мембраны. Эта 56-кДа субъединица цитохромоксидазы содержит 12 трансмембранных спиральных участков и металлосодержащие каталитические центры, достаточные для работы фермента в качестве протонной помпы. Трансмембранный протонный потенциал, в частности, используется как источник энергии для вращения бактериальных жгутиков. В других работах сотрудников ЛГМ ИБФРМ РАН в р85 были выявлены последовательности, кодирующие гликозилтрансферазы (<ог/414 и ог/418) (Кацы с соавт., 2010), 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат-сульфотрансферазу (orJ319) и мембранный белок толерантности к толуолу Ttg2 (orfll9) (Ковтунов с соавт., 2012). В нашей работе описаны несколько orf р85, которые, по-видимому, важны для восстановления нитрита и NO (nirK и norCBQD), детекции NO и его детоксификации (orfl81 и metC, соответственно) в клетках A. brasílense Sp245.

Для того чтобы выяснить, сохранились ли соответствующие локусы р85 у независимых спонтанных суперроящихся вариантов A. brasilense Sp245.Pl-Sp245.P5, на их ДНК были поставлены ПЦР с 10 парами праймеров к двум Xhol-фрагментам р85, содержащим перечисленные выше кодирующие последовательности. Все ПЦР на ДНК штамма Sp245 и пяти его Swa++-вариантов дали идентичные позитивные результаты. По-видимому, новая плазмида, обнаруженная в клетках штаммов Sp245.Pl-Sp245.P4 вместо р85, является дериватом р85.

С целью более тонкого анализа изменений в структуре ДНК, происходящих при спонтанном появлении суперроящихся производных A. brasilense Sp245, были также поставлены ПЦР с праймерами, соответствующими известным консервативным мотивам в повторяющихся последовательностях нуклеотидов бактерий. С помощью данного подхода оказалось возможным выявление тонких различий в архитектуре геномов A. brasilense Sp245 и некоторых из его спонтанных суперроящихся вариантов.

Сравнение ряда физиолого-биохимических характеристик штаммов A.brasilense Sp245, Sp245.Pl, Sp245.P2, Sp245.P3, Sp245.P4 и Sp245.P5 позволило выявить различия в поведении вариантов, имеющих одинаковый суперроящийся фенотип в присутствии N2 или хлорида аммония, при замене NH4CI в среде на нитрат или нитрит. Обнаружены межштаммовые различия в скорости роста и подвижности бактерий в жидких и полужидких средах с N03~ или N02"", нитрат- и нитритредукции:

В случае идентифицированного ранее сотрудниками ЛГМ ИБФРМ РАН деривата А. ЬгазИете 8р245, названного 8р245.5, спонтанно утратившего р85 и р120 при образовании новой мегаплазмиды (Кацы с соавт., 1994; Петрова, 1998; Кацы с соавт., 2002) результаты ПЦР-анализа свидетельствуют о том, что 18.3-т.п.н. Л7ю1-фрагмент р85, в котором мы выявили гены денитрификации и гены, кодирующие возможную эффлюкс-помпу, был утрачен или очень сильно изменен в процессе спонтанной плазмидной перестройки.

8Б8-РАОЕ профили белков внешней мембраны штаммов А. ЪгаяИете 8р245 и 8р245.5 почти идентичны (Кацы с соавт., 1994), но структура ОПС у них абсолютно разная (Федоненко с соавт., 2010). Тогда как бактерии штамма 8р245 продуцируют поверхностные полисахариды, связывающие флуоресцентный краситель калькофлуор (Са1+ фенотип) (КаХгу е1 а1., 1998), дериват 8р245.5 имеет СаГ фенотип (Кацы с соавт., 2002). В отличие от штамма А. ЬгазИете 8р245 бактерии 8р245.5 не способны к диссимиляторному восстановлению нитрита (Кацы, 2002, 2002а).

В настоящей работе мы установили, что скорость движения клеток А.ЬгазИете 8р245.5, выросших в жидкой среде, существенно снижена по сравнению с таковой у штамма дикого типа. Анализ подвижности азоспирилл в полужидких средах показал, что поведение деривата А. ЬгаяИете 8р245.5 заметно отличается от поведения родительского штамма. В полужидкой среде клетки А. ЬгазИете 8р245.5 формируют "диффузную" колонию, тогда как бактерии А. Ьгазйете 8р245 образуют четко очерченный диск. Размер колоний у 8р245.5 незначительно превышает таковой у 8р245, хотя у деривата скорость движения клеток ниже, чем у дикого типа.

Скорее всего, фенотип колоний деривата 8р245.5, образуемых в полужидкой среде, обусловлен кардинальными изменениями свойств поверхностных полисахаридов и, как следствие, нарушением углевод-углеводных или белок-углеводных взаимодействий. Стоит отметить, что кардинальные перестройки в структуре ЛПС у 8р245.5 приводят к повышению гемагглютинирующей активности клеток этого штамма.

Наличие нитратов или нитритов в среде индуцирует процесс денйтрификации (Zumft, 1997). Присутствие в среде связанного азота и его химическая природа оказывают влияние на свойства бактериальной поверхности (например, на уровень продукции полисахаридов и активность гемагглютининов азоспирилл) (Никитина с соавт., 1994, 2001; Yagoda-Shagam et al., 1988). Сравнение поведения штаммов A. brasilense Sp245 и Sp245.5 в полужидких средах с разными источниками азота (NH4C1, KN03 или KN02) и данные о гемагглютинирующей активности клеток A. brasilense при использовании разных источников азота позволяют сделать вывод о влиянии на коллективную подвижность Sp245 межклеточных контактов, опосредуемых взаимодействием поверхностного гемагглютинина с ОПС1. Эти взаимодействия зависят от таких внешних факторов, как источник азота и концентрация кислорода. Данные факторы влияют и на скорость движения клеток, являющуюся важным энергетическим показателем.

Завершая обсуждение результатов поведения азоспирилл в присутствии нитрата и нитрита, необходимо еще раз отметить, что восстановление N03~ и N02", осуществляемое этими бактериями, может влиять на их ассоциативные взаимодействия с растениями (Van Alst et al., 2007; Molina-Favero et al, 2008). Так, например, стимулирование образования придаточных корней у растений томата зависело от продукции NO инокулятом A. brasilense Sp245 (Creus et al., 2005), а у мутанта Sp245c/z/i, дефектного по нитратредукции, была снижена способность к колонизации корней растений (Steenhoudt et al, 2001а). По-видимому, в исследованиях механизмов ассоциативного взаимодействия азоспирилл с растениями следует учитывать возможные последствия спонтанных вариаций в структуре геномов азоспирилл, которые, как показано нами, могут приводить к формированию субпопуляций с различиями в метаболизме нитратов/нитритов.

Азоспириллы существуют в разнообразных почвенных и водных экосистемах, часто загрязненных тяжелыми металлами. Исследования, выполненные на других бактериях, свидетельствуют о том, что механизмы, обеспечивающие устойчивость микробов к ионам тяжелых металлов и поддержание гомеостаза тех из металлов, которые существенны для жизнедеятельности, тесно переплетаются (Silver, 1992; Choudhury, Srivastava, 2001; Cánovas et al, 2003; Franke et al, 2003).

У А. brasílense спонтанные плазмидные перестройки могут сопровождаться изменениями разнообразных культурально-физиологических характеристик: увеличением скорости роения; вариациями в морфологии колоний и антигенной структуре клеточной поверхности; устойчивости к антибиотикам и поверхностно-активным веществам; эффективности формирования биопленок и др. (Кацы с соавт., 2002; Петрова с соавт, 2005, 2005а, 2010). Локализация генов предсказанной эффлюкс-помпы в плазмиде р85 из штамма A. brasilense Sp245 позволила предположить, что плазмидные перестройки могли оказывать влияние и на устойчивость бактерий к тяжелым металлам.

В случае штамма A. brasilense Sp7 и его вариантов с измененным плазмидным составом значимых различий в уровнях устойчивости к солям Ag (I), Cu (II), Со (II) и Zn (II) выявить не удалось. Суперроящиеся варианты A.brasilense Sp245.Pl-Sp245.P5 также практически не отличались по этим показателям от родительского штамма Sp245. Опосредованная ISAzbal интеграция вектора рЛ^Т^О в 18.3-т.п.н. ^Tíol-фрагмент р85, несущий orfl22x, or/115 и orfl76, у мутантов A. brasilense SK051 и SK248 (Katsy, Prilipov, 2009), не оказала влияния на уровень устойчивости этих бактерий к вышеперечисленным солям тяжелых металлов.

Однако, оказалось, что бактерии A. brasilense Sp245.5 выдерживают

I л i 2+ о i значительно более высокие концентрации ионов Ag , Cu , Со и Zn , чем родительский штамм Sp245 и другие штаммы азоспирилл. Сравнительная токсичность использованных металлов для штамма Sp245 и его деривата Sp245.5 имела одинаковый характер: Ag+>Co2+>Cu2+>Zn2+.

Возникает вопрос, каковы возможные причины резкого повышения уровня устойчивости деривата у! brasilense Sp245.5 к одновалентным и двухвалентным катионам. Ключевым механизмом устойчивости к ионам тяжелых металлов является активный эффлюкс, обеспечиваемый работой RND-транспортеров, белков CDF и АТФ-аз Р-типа. Для работы RND-транспортеров и CDF необходим градиент протонов (Nies, 2003). Сравнение влияния солей серебра, кобальта, меди и цинка на рост клеток A. brasilense Sp245 и Sp245.5 в жидкой среде и в жидкой среде с добавлением ингибитора эффлюкс-помп СССР показало, что в случае штамма Sp245 МИК кобальта, меди и цинка в присутствии СССР снижались.

У A. brasilense Sp245.5 значительное повышение устойчивости клеток к солям меди и, в меньшей степени, к солям серебра и цинка связано с активизацией эффлюкса этих металлов. Новая клеточная поверхность и другие неизученные факторы также могут быть важны для повышения резистентности клеток Sp245.5 к металлам. У этого деривата A. brasilense изменена структура поверхностных гликополимеров, которые в первую очередь взаимодействуют с ионами, чем, возможно, отчасти и объясняется повышение устойчивости Sp245.5 к солям кобальта и цинка.

Крупная геномная перестройка, произошедшая в клетках A. brasilense Sp245.5, могла оказать влияние на экспрессию многих плазмидных и (или) хромосомных генов, ответственных за толерантность бактерий к тяжелым металлам. Возможная избыточность и взаимозаменяемость генов, ответственных за устойчивость A. brasilense Sp245 к тяжелым металлам, могла замаскировать негативные последствия утраты локализованных в р85 последовательностей, кодирующих компоненты одной из эффлюкс-помп. Для уточнения функции продуктов трансляции orf!22x, orfllS и orfl76, выявленных в р85, необходимы дополнительные молекулярно-генетические и биохимические исследования.

Новые знания о влиянии динамики геномов азоспирилл на процессы преобразования клеткой источников азота и формирования защитных систем и их регуляцию, возможно, будут полезны при отборе или конструировании PGPR, перспективных для использования в агробиотехнологии. Так, локализация предсказанных генов эффлюкс-помпы в р85 из A. brasilense Sp245 свидетельствует о возможности использования этой плазмиды для создания новых штаммов с расширенным адаптационным потенциалом. Интересен дериват А. ЬгаяИете 8р245.5, обладающий повышенной способностью к колонизации корней пшеницы по сравнению со штаммом дикого типа (неопубликованные данные сотрудников ЛГМ). Этот штамм может быть применен для инокуляции растений в условиях загрязнения почв тяжелыми металлами - при разработке технологий биоремедиации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Варшаломидзе, Ольга Эдуардовна, Саратов

1. Андреева И.Н., Редькина Т.В., Исмаилов С.Ф. Роль индолилуксусной кислоты в стимулирующем действии Azospirillum brasilense на бобово-ризобиальный симбиоз // Физиология растений. 1993. - Т. 40, № 6. - С. 901-906.

2. Антонюк Л.П. Растительные лектины как факторы коммуникации в симбиозах // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Ред. Игнатов B.B. М.: Наука, 2005. - С. 118-159.

3. Антонюк Л.П., Игнатов В.В. О роли агглютинина зародышей пшеницы в растительно-бактериальном взаимодействии: гипотеза и экспериментальные данные в ее поддержку // Физиология растений. 2001. - Т. 48, № 3. - С. 427-433.

4. Белимов A.A., Кунакова A.M., Груздева Е.В. Влияние pH почвы на взаимодействие ассоциированных бактерий с ячменем // Микробиология.-1998.-Т. 67, № 4.-С. 561-568.

5. Борисов И.В. Генетический анализ вариаций в подвижности и поверхностных структурах ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов: ИБФРМ РАН, 2004. - 23 с.

6. Буракаева А.Д., Русанов A.M., Лантух В.П. Роль микроорганизмов в очистке сточных вод от тяжёлых металлов: Методическое пособие. Оренбург: ОГУ, 1999. - С. 8-22.

7. Бурыгин Г.Л. Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum: Автореф. дис. канд. биол. наук. — Саратов, 2003. — 22 с.

8. Бурыгин Г.Л., Широков A.A., Шелудько A.B., Кацы Е.И., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. Выявление чехла на поверхности полярного жгутика Azospirillum brasilense // Микробиология. 2007. - Т. 76, № 6. - С. 822-829.

9. Васюк Л.Ф., Боровков A.B., Хальчицкий А.Е., Ионкова C.B., Чмелева З.В. Бактерии рода Azospirillum и их влияние на продуктивность небобовых растений // Микробиология. 1989. - Т. 58, № 4. - С. 642-652.

10. Дебабов В.Г. Жизнь бактерий за стенами лабораторий // Молекулярная биология. -1999. Т. 33, № 6. - С. 1074-1084.

11. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс K.M. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. - 544 с.

12. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Дыкман JI.A., Игнатов В.В. Роль полисахаридсодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерий на корнях проростков пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 1. - С. 45-50.

13. Иванов А.Ю., Гаврюшкин A.B., Слунова Т.В., Хасанова JI.A., Хасапова З.М. Устойчивость некоторых штаммов бактерий рода Pseudomonas к повреждающему действию ионов тяжелых металлов // Микробиология. 1999. - Т. 68, №3. - С. 366374.

14. Иванов А.Ю.,' Фомченков В.М., Хасанова JI.A. Токсическое действие гидроксилированных ионов тяжелых металлов на цитоплазматическую мембрану бактериальных клеток // Микробиология. 1997. — Т. 66, № 1. — С. 89-91.

15. Ильина Т.С. Суперинтегроны бактерий источники новых генов с адаптивными функциями // Генетика. - 2006. - Т. 42, № 11. - С. 1536-1546.

16. Кацы Е.И. Плазмида р85 Azospirillum brasilense Sp245: Изучение круга возможных хозяев и несовместимости с плазмидами Azospirillum brasilense Sp7 II Мол. гене г. микробиол. вирусол. 1992. - № 9-10. - С. 8-11.

17. Кацы Е.И. Генетико-биохимические и экологические аспекты подвижности и хемотаксиса у фитопатогенных, симбиотических и ассоциированных с растениями бактерий // Усп. соврем, биол. 1996. - Т. 116, № 5. - С. 579-593.

18. Кацы Е.И. Свойства и функции плазмид ассоциированных с растениями бактерий рода Azospirillum II Усп. соврем, биол. 2002а. - Т. 122, № 4. - С. 353-364.

19. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями / Под ред. В.В. Игнатова. -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. — 169 с.

20. Кацы Е.И. Молекулярно-генетический анализ ассоциативного взаимодействия бактерий и растений // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред. В.В. Игнатова. М.: Наука, 2005. - С. 17— 45.

21. Кацы Е.И. Молекулярная генетика ассоциативного взаимодействия бактерий и растений: состояние и перспективы исследований / Под ред. В.В. Игнатова. М.: Наука, 2007. - 86 с.

22. Кацы Е.И., Борисов И.В., Машкина А.Б., Панасенко В.И. Влияние плазмидного состава на реакции хемотаксиса у ассоциированных со злаками бактерий Azospirillum brasilense Sp245 // Мол. генет. микробиол. вирусол. 1994. - № 2. - С. 29-32.

23. Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько A.B. Влияние интеграции вектора pJFF350 в 85-МДа плазмиду Azospirillum brasilense Sp245 на жгутикование и подвижность бактерий // Генетика. 2001. - Т. 37, № 2. - С. 183-189.

24. Кацы Е.И., Петрова Л.П., Кулибякина О.В., Прилипов А.Г. Анализ плазмидных локусов Azospirillum brasilense, кодирующих ферменты синтеза (липо)полисахаридов // Микробиология. 2010. - Т. 79, № 2. - С. 239-245.

25. Ковтунов Е.А., Шелудько A.B., Кацы Е.И. Изменения в первичной структуре 85-МДа плазмиды, влияющие на жгутикование и подвижность бактерии Azospirillum brasilense Sp245 // Генетика. 2012. - Т. 48, № 1. - В печати.

26. Коннова С.А., Макаров O.E., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Полисахаридсодержащие биополимеры бактерий рода Azospirillum: разнообразие химического строения и функций // Микробиол. журн. 1992. - Т. 54, № 2. - С. 31-42.

27. Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Игнатов В.В. Структура и функции гликополимеров поверхности азоспирилл // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред. В.В. Игнатова. М.: Наука, 2005. - С. 4669.

28. Левина Э.Н. Общая токсикология металлов. Л.: Медицина, 1972. - 184с.

29. Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Исследование иммунохимической гетерогенности липополисахаридов Azospirillum brasilense // Микробиология. 2008. -Т. 77,№2.-С. 196-200.

30. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир, 1984. - Т. 1. -С. 339.

31. Миндлин С.З., Петрова М.А., Басс И.А., Горленко Ж.М. Происхождение, эволюция и миграция генов лекарственной устойчивости // Генетика. 2006. - Т. 42, № 11. — С. 1495-1511.

32. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Итальянская Ю.В., Пономарева Е.Г. Очистка и сравнение лектинов с клеточной поверхности активных и неактивных по гемагглютинации клеток азоспирилл // Биохимия. — 1994. — Т. 59, № 5. С. 656-662.

33. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Пономарева Е.Г., Савенкова H.H. Изучение роли лектинов клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 2. - С. 165-170.

34. Никитина В.Е., Пономарева Е.Г., Аленькина С.А., Коннова С.А. Участие бактериальных лектинов клеточной поверхности в агрегации азоспирилл // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 4. - С. 471-476.

35. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 3. - С. 309-327.

36. Петрова Л.П. Генетические аспекты продукции компонентов клеточной поверхности у ассоциативных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов: РосНИПЧИ "Микроб", 1998. - 22 с.

37. Петрова Л.П., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Борисов И.В., Кацы Е.И. Анализ ДНК, ряда культурально-морфологических свойств и структуры липополисахаридов у близкородственных штаммов Azospirillum brasilense II Микробиология. 2005. — Т. 74, № 2. - С. 224-230.

38. Петрова Л.П., Борисов И.В., Кацы Е.И. Плазмидные перестройки у Azospirillum brasilense // Микробиология. 2005а. - Т. 74, № 4. - С. 572-574.

39. Петрова Л.П., Шелудько A.B., Кацы Е.И. Плазмидные перестройки и изменения в формировании биопленок Azospirillum brasilense И Микробиология. 2010. - Т. 79, № 1.-С. 129-132.

40. Проворов H.A., Воробьев Н.И., Андронов Е.А. Макро- и микроэволюция бактерий в системах симбиоза // Генетика. 2008. - Т. 44, № 1. - С. 12-28.

41. Фарранд С.К. Конъюгативные плазмиды и их перенос // Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / Под ред. Г. Спайнка, А. Кондроши, П. Хукаса. Санкт-Петербург: Бионт, 2002. - С. 225-258.

42. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 3. - С. 384-390.

43. Чернышева М.П., Игнатов В.В. Внеклеточные протеолитические и пектинолитические ферменты бактерий рода Azospirillum в процессе ассоциативного взаимодействия с растениями // Сб. докл. XII юбил. конф. "Ферменты микроорганизмов". Казань, 2001. - С. 48-49.

44. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на клетке Azospirillum brasilense полярного пучка пил ей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 5. - С. 662-667.

45. Шелудько А.В., Борисов И.В., Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Кацы Е.И. Влияние конго красного на подвижность бактерий Azospirillum brasilense // Микробиология. — 2006. Т. 75, № 1. - С. 62-69.

46. Шестаков С.В. Как происходит и чем лимитируется горизонтальный перенос генов у бактерий // Эколог, генетика. 2007. - Т. 5, № 2. - С. 12-24.

47. Achouak W., Conrod S., Heulin Т. Phenotipic variation of Pseudomonas brassicacearum as a plant root-colonization strategy П Mol. Plant Microbe Interact. 2004. — V. 17. - P. 872879.

48. Alen'kina S.A., Nikitina V.E. Azospirillum lectin induced changes in the content of nitric oxide in wheat seedling roots // J. Stress Physiol. Biochem. - 2010. - V. 6. - P. 126-134.

49. Alexandre G., Bally R. Emergence of a laccase-positive variant of Azospirillum lipoferum occurs via a two-step phenotypic switching process // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 174.-P. 371-378.

50. Alexandre G., Greer S.E., Zhulin I.B. Energy taxis is the dominant behavior in Azospirillum brasilense И J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 6042-6048.

51. Alexandre G., Jacoud C., Faure D., Bally R. Population dynamics of a motile and a non-motile Azospirillum lipoferum strains during rice root colonization and motility variation in the rhizosphere // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. - V. 19. - P. 271-278.

52. Alexandre G., Rohr R., Bally R. A phase variant of Azospirillum lipoferum lacks a polar flagellum and constitutively expresses mechanosensing lateral flagella // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 4701-4707.

53. Bagai I., Liu W., Rensing C., Blackburn N.J., McEvoy M.M. Substrate-linked conformational change in the periplasmic component of a Cu(I)/Ag(I) efflux system // J. Biol. Chem. 2007. - V. 282. - P. 35695-35702.

54. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - P. 924929.

55. Baldani J.I., Caruso L., Baldani V.L.D., Goi S.R., Dobereiner J. Recent advances in BNF with non-legume plants // Soil Biol. Biochem. 1997. - V. 29. - P. 911-922.

56. Barak R., Nur I., Okon Y. Detection of chemotaxis in Azospirillum brasilense II J. Appl. Bacteriol. 1983.-V. 54.-P. 399-403.

57. Barbieri C., Zanelli T., Galli E., Zanetti G. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1986. - V. 36. - P. 87-90.

58. Barton L.L., Johnstone G.V., Miller S.O. The effect of Azospirillum brasilense on iron adsorption and translocation by sorghum // J. Plant Nutr. 1986. - Y. 9. - P. 557-565.

59. Bashan Y., Levanovy H., Girma M. Changes in proton efflux of intact wheat roots induced by Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Microbiol. 1989. - V. 39. - P. 691-697.

60. Bashan Y., Levanony H. Avidin-biotin complex incorporation into enzyme-linked immunosorbent assay (ABELISA) for improving the detection of Azospirillum brasilense Cd II Curr. Microbiol. 1990. - V. 20. - P. 91-94.

61. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-p\ant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. 1997. -V. 43. - P. 103-121.

62. Bashan Y., Holguin G. Proposal for the division of plant growth-promoting rhizobacteria into two classifications: biocontrol-PGPB (plant growth promoting bacteria) and PGPB // Soil Biol. Biochem. 1998. - V. 30. - P. 1225-1228.

63. Berg H.C. The rotary motor of bacterial flagella // Annu. Rev. Biochem. 2003. - V. 72. -P. 19-54.

64. Bowden M.G., Kaplan H.B. The Myxococcus xanthus lipopolysaccharide O-antigen is required for social motility and multicellular development // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30.-P. 275-284.

65. Braker G., Tiedje J.M. Nitric oxide reductase (norB) genes from pure cultures and environmental samples // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 3476-3483.

66. Brown N.L., Barret S.R., Camakaris J., Lee B.T.O., Rouch D.A. Molecular genetics and transport analysis of the copper-resistance determinant (pco) from Escherichia coli plasmid pRJ1004//Mol. Microbiol.- 1995.-V. 17.-P. 1153-1166.

67. Bruins M.R., Kapil S., Oehme F.W. Microbial resistance to metals in the environment // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2000. - V. 45. - P. 198-207.

68. Burd G.I., Dixon D.G., Glick B.R. A plant growth-promoting bacterium that decreases nickel toxicity in seedlings //Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 3363-3368.

69. Caballero-Mellado J., Lopez-Reyes L., Bustillos-Cristales R. Presence of 16S rRNA genes in multiple replicons in Azospirillum brasilense IIFEMS Microbiol. Lett. — 1999. V. 178. — P. 283-288.

70. Cacciari I., Lippi D., Pietrosanti W. Phytohormone-like substances produced by single and mixed diazotrophic cultures of Azospirillum and Arthrobacter II Plant Soil. 1989. - V. 115. -P. 151-153.

71. Cánovas D., Cases I., de Lorenzo V. Heavy metal tolerance and metal homeostasis in Pseudomonas putida as revealed by complete genome analysis // Environ. Microbiol. -2003.-V. 5.-P. 1242-1256.

72. Charley R.C., Bull A.T. Bioaccumulation of silver by a multispecies community of bacteria // Arch. Microbiol. 1979. -V. 123. - P. 239-244.

73. Chen I., Christie P.J., Dubnau D. The ins and outs of DNA transfer in bacteria // Science. -2005.-V. 310.-P. 1456-1460.

74. Choudhury R., Srivastava S. Zinc resistance mechanisms in bacteria // Curr. Sci. 2001. -V. 81.-P. 768-775.

75. Coombs J.M., Barkay T. Molecular evidence for the evolution of metal homeostasis genes by lateral gene transfer in bacteria from the deep terrestrial subsurface // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 1698-1707.

76. Coombs J.M., Barkay T. New findings on evolution of metal homeostasis genes: evidence from comparative genome analysis of bacteria and archaea // Appl. Environ. Microbiol. -2005. -V. 71. P. 7083-7091.

77. Creus C.M., Graziano M., Casanovas E.M., Pereyra M.A., Simontacchi M., Puntarulo S., Barassi C.A., Lamattina L. Nitric oxide is involved in the Azospirillum brasilense-induced lateral root formation in tomato // Planta. 2005. - V. 221. - P. 297-303.

78. Croes C., Moens S., Van Bastelaere E., Vanderleyden J., Michiels K. The polar flagellum mediates Azospirillum brasilense adsorption to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1993. - V. 139.-P. 2261-2269.

79. Darling A.E., Miklos I., Ragan M.A. Dynamics of genome rearrangement in bacterial populations // PLoS Genet. 2008. - V. 4. - P. el000128.

80. Dekkers L.C., Phoelich C.C., van der Fits L., Lugtenberg B.J.J. A site-specific recombinase is required for competitive root colonization by Pseudomonas fluorescens WCS365 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95. - P. 7051-7056.

81. Dobereiner J., De-Polli H. Nitrogen-fixing rhizocoenosis // The Soil/Root System in Relation to Brazilian Agriculture: Proceed. Symp. Soil/Root System / Ed. R.S. Russell, K. Igue, Y.R. Mehta. Parana, 1981. - P. 175-198.

82. Dobrindt U., Hochhut B., Hentschel U., Hacker J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms // Nat. Rev. Microbiol. 2004. - V. 2. - P. 414-424.

83. Donlan R.M. Biofilms: microbial life on surfaces // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8. - P. 881-890.

84. Douglas S., Beveridge T.J. Mineral formation by bacteria in natural microbial communities // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. - V. 26. - P. 79-88.

85. Eckert B., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffes M., Hartmann A. Azospirilium doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 17-26.

86. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria//Plasmid.- 1978.-V. l.-P. 584-588.

87. Eskew D.L., Focht D.D., Ting I.P. Nitrogen fixation, denitrification, and pleomorphic growth in a highly pigmented Spirillum lipoferum II Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V. 34.-P. 582-585.

88. Falk E.C., Dobereiner J., Johnson J.L., Krieg N.R. Deoxyribonucleic acid homology of Azospirilliim amazonense Magalhaes et al. 1984 and emendation of the description of the genus Azospirillum II Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. - V. 35. - P. 117-118.

89. Faure D., Desair J., Keijers V., Bekri M.A., Proost P., Henrissat B., Vanderleyden J. Growth of Azospirillum irakense KBC1 on the aryl P-glucoside salicin requires either sal A or salB II J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 3003-3009.

90. Fedonenko Y.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - V. 337. - P. 869-872.

91. Fernandes M.A., Mota I.M., Silva M.T., Oliveira C.R., Geraldes C.F., Alpoim M.C. Human erythrocytes are protected against chromate-induced peroxidation // Ecotoxicol. Environ. Saf.- 1999.-V. 43.-P. 38^16.

92. Foster P.L. Stress-induced mutagenesis in bacteria // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2007. -V. 42.-P. 373-397.

93. Ghiglione J.-F., Gourbiere F., Potier P., Philippot L., Lensi R. Role of respiratory nitrate reductase in ability of Pseudomonas fluorescens YT101 to colonize the rhizosphere of maize // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 4012-4016.

94. Goel A.K., Rajagopal L., Nagesh N., Sonti R.V. Genetic locus encoding functions involved in biosynthesis and outer membrane localization of xanthomonadin in Xanthomonas oryzae pv. oryzae // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 3539-3548.

95. Gogarten J.P., Doolittle W.F., Lawrence J.G. Prokaryotic evolution in light of gene transfer // Mol. Biol. Evol. 2002. - V. 19. - P. 2226-2238.

96. Goldberg M., Pribyl T., Juhnke S., Nies D. Energetics and topology of CzcA, a cation/proton antiporter of the resistance-nodulation-cell division protein family // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 26065-26070.

97. Gottfert M., Rothlisberger S., Kundig C. Beck C., Marty R., Hennecke H. Potential symbiosis-specific genes uncovered by sequencing a 410-kilobase DNA region of the Bradyrhizobium japonicum chromosome // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 1405-1412.

98. Gotz R., Schmitt R. Rhizobium meliloti swims by unidirectional intermittent rotation of right-handed flagellar helices // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 3146-3150.

99. Grass G., Rensing C. Genes involved in copper homeostasis in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 2145-2147.

100. Greer-Phillips S.E., Stephens B.B., Alexandre G. An energy taxis transducer promotes root colonization by Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - P. 6595-6604.

101. Guffanti A.A., Wei Y., Rood S.V., Krulwich T.A. An antiport mechanism for a member of the cation diffusion facilitator family: divalent cations efflux in exchange for K+ and H+ // Molecular Microbiology. 2002. - V. 45, № 1. - P. 145-153.

102. Guo X., Flores M., Mavingui P., Fuentes S.I., Hernandez G., Davila G., Palacios R. Natural genomic design in Sinorhizobium meliloti: novel genomic architectures // Genome Res. — 2003.-V. 13.-P. 1810-1817.

103. Gupta A., Matsui K., Lo J.F., Silver S. Molecular basis for resistance to silver cations in Salmonella II Nature Med. 1999. - V. 5. - P. 183-188.

104. Haemig H.A., Brooker R.J. Importance of conserved acidic residues in MntH, the Nramp homolog of Escherichia coli II J. Membr. Biol. 2004. - V. 201. - P. 97-107.

105. Hall P.G., Krieg N.R. Application of the indirect immunoperoxidase stain technique to the flagella of Azospirillum brasilense II Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 47. - P. 433435.

106. HaIlet B. Playing Dr Jekyll and Mr Hyde: combined mechanism of phase variation in bacteria// Curr. Opin. Microbiol. 2001. - V. 4. - P. 570-581.

107. IIalverson L.J., Stacey G. Signal exchange in plant-microbe interaction // Microbiol. Rev. -1986.-V. 50.-P. 193-225.

108. Hasan H., Mori M., Fariduddin Q., Ahmad A. Nitric oxide: chemistry, biosynthesis, and physiological role // Nitric Oxide in Plant Physiology / Ed. S. Hayat, M. Mori, J. Pichtel, A. Ahmad. Weinheim: Wiley-VCH, 2010. - P. 1-16.

109. Hassan M.-E.-T., van der Lelie D., Springael D., Romling U., Ahmed N., Mergeay M. Identification of a gene cluster, czr, involved in cadmium and zinc resistance in Pseudomonas aeruginosa II Gene. 1999. - V. 238. - P. 417—425.

110. Hauwaerts D., Alexandre G., Das S.K., Vanderleyden J., Zhulin I.B. A major chemotaxis gene cluster in Azospirillum brasilense and relationships between chemotaxis operons in alpha-proteobacteria IIFEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 208. - P. 61-67.

111. Heinrich D., Hess D. Chemotactic attraction of Azospirillum lipoferum by wheat roots and characterization of some attractants // Can. J. Microbiol. 1985. -V. 31. - P. 26-31.

112. Henderson I. R., Owen P., Nataro J. P. Molecular switches- the ON and OFF of bacterial phase variation // Mol. Microbiol. 1999. - V. 33. - P. 919-932.

113. Heuer H., Smalla K. Horizontal gene transfer between bacteria // Environ. Biosafety Res. -2007.-V. 6.-P. 3-13.

114. Iyer A., Mody K., Iha B. Biosorption of heavy metals by a marine bacterium // Mar. Pollut. Bull. 2005. - V. 50. - P. 340-343.

115. Jain D.K., Patriquin D.G. Root hair deformation, bacterial attachment and plant growth in wheat-Azospirillum association // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 48. - P. 12081213.

116. Jain D.K., Patriquin D.G. Characterization of a substance produced by Azospirillum which causes branching of wheat root hairs // Can. J. Microbiol. 1985. -V. 31. - P. 206-210.

117. Jain R., Rivera M.C., Moore J.E., Lake J.A. Horizontal gene transfer in microbial genome evolution // Theor. Popul. Biol. 2002. - V. 61. - P. 489^195.

118. Jensen P.E., Reid J.D., Hunter C.N. Modification of cysteine residues in the Chll and ChlH subunits of magnesium chelatase results in enzyme inactivation // Biochem. J. 2000. - V. 352.-P. 435-441.

119. Joys T.M., Martin J.F. Identification of amino acid changes in serological mutants of the i-flagellar antigen oí Salmonella typhimurium // Microbios. 1973. - V. 7. - P. 71-73.

120. Juhas M., Roelof J., van der Meer M., Gaillard R. M., Harding D.W., Hood D., Crook W. Genomic islands: tools of bacterial horizontal gene transfer and evolution // FEMS Microbiol. Rev. 2009. - V. 33. - P. 376-393.

121. Kaakoush N.O., Rañery M., Mendz G.L. Molecular responses of Campylobacter jejuni to cadmium stress // FEBS J. 2008. - V. 275. - P. 5021-5033.

122. Kamnev A.A., Van der Lelie D. Chemical and biological parameters as tools to evaluate and improve heavy metal phytoremediation // Biosci. Rep. — 2000. — V. 20. — P. 239-258.

123. Kaneko T., Minamisawa K., Isawa T. Complete genomic structure of the cultivated rice endophyte Azospirillum sp. B510 // DNA Res. 2010. - V. 17. - P. 37-50.

124. Kaneko T., Nakamura Y., Sato S., Asamizu E., Kato T., Sasamoto S.,Watanabe A., Idesawa K., Ishikawa A., Kawashima K. et al. Complete genome structure of the nitrogen-fixing symbiotic bacterium Mesorhizobium loti H DNA Res. 2000. - V. 7. - P. 331-338.

125. Kape R., Parniske M., Werner D. Chemotaxis and nod gene activity of Bradyrhizobium japonicum in response to hydroxycinnanic acids and isoflavonoids // Appl. Environ. Microbiol. 1991. -V. 57. - P. 316-319.

126. Kapulnik Y., Okon Y., Henis Y. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation // Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31. - P. 881-887.

127. Katsy E.I. Plasmid plasticity in the plant-associated bacteria of the genus Azospirillum II Bacteria in Agrobiology: Plant Growth Responses / Ed. D.K. Maheshwari. Berlin: Springer, 2011.-P. 139-157.

128. Katsy E.I., Prilipov A.G. Mobile elements of an Azospirillum brasilense Sp245 85-MDa plasmid involved in replicon fusions // Plasmid. — 2009. V. 62. - P. 22-29.

129. Katzy E.I., Iosipenko A.D., Egorenkov D.A., Zhuravleva E.A., Panasenko V.I., Ignatov V.V. Involvement of the Azospirillum brasilense plasmid DNA in the production of indole acetic acid // FEMS Microbiol. Lett. 1990. - V. 72. - P. 1-4.

130. Katzy E.I., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in production of lipopolysaccharides // Plasmid. -1998.-V. 40.-P. 73-83.

131. Kehres D.G., Maguire M.E. Emering themes in manganese transport, biochemistry and pathogenesis in bacteria II FEMS Microbiol. Rev. 2003. - V. 27. - P. 263-290.

132. Khalsa-Moyers G.K. Use of proteomics tools to investigate protein expression in Azospirillum brasilense. Dissertation. — Knoxville: University of Tennessee, 2010. — 261 pp.

133. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A.D., Kaiser P. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere // Soil. Res. Microbiol. 1989. - V. 140.-P. 679-693.

134. Kiley P. J., Beinert H. Oxygen sensing by the global regulator, FNR: the role of the iron-sulfur cluster // FEMS Microbiol. Rev. 1999. - V. 22. - P. 341-352.

135. Kleigman J.I., Griner S.L., Helmann J.D., Brennan R.G., Glasfeld A. A structural basis for the metal selective activation of the manganese transport regulator of Bacillus subtilis II Biochemistry. 2006. - V. 45. - P. 3493-3505.

136. Kloos K., Mergel A., Rusch C., Bothe H. Denitrification within the genus Azospirillum and other associative bacteria // Austr. J. Plant Physiol. 2001. - V. 28. - P. 991-998.

137. Ko M.s Park C. H-NS-Dependent regulation of flagellar synthesis is mediated by a LysR family protein // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 4670-4672.

138. Krieg N.R., Dobereiner J. Genus Azospirillum (Tarrand, Krieg and Dobereiner, 1979) // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. N.R. Krieg, J.G. Holt. Baltimore: Williams & Wilkins, 1984. - P. 94-104.

139. Kroer N., Barkay T., Sorensen S., Weber D. Effect of root exudates and bacterial metabolic activity on conjugal gene transfer in the rhizosphere of a marsh plant // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. - V. 25. - P. 375-384.

140. Krupski G., Gotz R., Ober K., Pleier E., Schmitt R. Structure of complex flagellar filaments in Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1985. - V. 162. - P. 361-366.

141. Kunin V. The balance of driving forces during genome evolution in prokaryotes // Genome Res. —2003,-V. 13.-P. 1589-1594.

142. Kutsukake K., lino T. Role of the FliA-FlgM regulatory system on the transcriptional control of the flagellar regulon and flagellar formation in Salmonella typhimurium // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 3598-3605.

143. Kutsukake K., Ohya Y., Yamaguchi S., lino T. Transcriptional analysis of the flagellar regulon of Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 741-747.

144. Laratta W.P., Choi P.S., Tosques I.E., Shapleigh J.P. Involvement of the PrrB/PrrA two-component system in nitrite respiration in Rhodobacter sphaeroides 2.4.3: evidence for transcriptional regulation // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 3521-3529.

145. Lawrence J.G., Ochman H. Amelioration of bacterial genomes: rates of change and exchange // J. Mol. Evol. 1997. - V. 44. - P. 383-397.

146. Lee D.Y., Ramos A., Macomber L., Shapleigh J.P. Taxis response of various denitrifying bacteria to nitrate and nitrite // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. - P. 2140-2147.

147. Lee S.M., Grass G., Haney C.J., Fan B., Rosen B.P., Anton A., Nies D.H., Rensing C. Functional analysis of the Escherichia coli zinc transporter ZitB // FEMS Microbiol. Lett. -2002.-V. 215.-P. 273-278.

148. Legatzki A., Grass G., Anton A., Rensing C., Nies D.H. Interplay of the Czc system and two P-type ATPases in conferring metal resistance to Ralstonia metallidurans // J. Bacteriol. -2003. -V. 185. -P. 4354-4361.

149. Levanony II., Bashan Y., Romano B., Klein E. Ultrastructural localization and identification of Azospirillum brasilense Cd on and within wheat root by immuno-gold labeling // Plant Soil. 1989.-V. 117.-P. 207-218.

150. SO.Liesegang H., Lemke K., Siddiqui R.A., Schlegel H.G. Characterization of the inducible nickel and cobalt resistance determinant cnr from pMOL28 of Alcaligenes eutrophus CH34 // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 767-778.

151. Lin S.Y., Shen F.T., Young L.S., Zhu Z.L., Chen W.M., Young C.C. Azospirillum formosense sp. nov., a novel diazotrophic bacterium isolated from agricultural soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. - July 8 Epub ahead of print.,

152. Lin S.Y., Young C.C., Hupfer H., Siering C., Arun A.B., Chen W.M., Lai W.A., Shen F.T., Rekha P.D., Yassin A.F. Azospirillum picis sp. nov., isolated from discarded tar // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. - V. 59. - P. 761-765.

153. Lin W., Okon Y., Hardy R. Enhanced mineral uptake by Zea mays and Sorghum bicolor roots inoculated with Azospirillum brasilense 11 Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V. 45. -P. 1773-1779.

154. Lino A.R., Farinha C.R., Pereira S., Bursakov S.A. Desulfovibrio gigas: toxicity of copper and molybdenum // Metal Ions in Biology and Medicine. 2006. - V. 9. - P. 231-235.

155. Lins U., Farina M. Phosphorus-rich granules in uncultured magnetotactic bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 172. - P. 23-28.

156. Lopez de Victoria G., Lovell C.R. Chemotactic behavior of Azospirillum species to aromatic compounds // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 2951-2955.

157. Lynch J.M., Whipps J.M. Substrate flow in the rhizosphere // Plant Soil. 1990. - V. 129. -P. 1-10.

158. MacLean A. M., Finan T.M., Sadowsky M.J. Genomes of the symbiotic nitrogen-fixing bacteria of legumes // Plant Physiol. 2007. - V. 144. - P. 615-622.

159. Macnab R.M., Aizawa S.-I. Bacterial motility and the bacterial flagellar motor // Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1984. -V. 13. - P. 51-83.

160. Mahillion J., Chandler M. Insertion sequences // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62. - P.725-774.

161. Mandimba G., Heulin T., Bally R., Guckert A., Balandreau J. Chemotaxis of free living bacteria towards maize mucilage // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 129-139.

162. Mantelin S., Touraine B. Plant growth-promoting bacteria and nitrate availability: impacts on root development and nitrate uptake // J. Experim. Bot. 2004. - V. 55. - P. 27-34.

163. Marchal K., Sun J., Keijers V., Haaker H., Vanderleyden J. A cytochrome cbbi (cytochrome c) terminal oxidase in Azospirillum brasilense Sp7 supports microaerobic growth // J. Bacteriol. 1998. -V. 180. - P. 5689-5696.

164. Martin-Didonet C.C.G., Chubatsu L.S., Souza E.M., Kleina M., Rego F.G.M., Rigo L.U., Yates M.G., Pedrosa F.O. Genome structure of the genus Azospirillum II J. Bacteriol. -2000. V. 182. -P. 4113-4116.

165. Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Shchyogolev S.Yu. Structural effects of the Azospirillum lipopolysaccharides in cell suspension // Biomacromolecules. — 2001. V. 2. — P. 402-406.

166. Matsubara T., Iwasaki H. Enzymatic steps of dissimilatory nitrite reduction in Alcaligenes faecalis II J. Biochem. 1971. - V. 69. - P. 859-868.

167. Mavingui P., Flores M., Guo X., Davila G., Perret X., Broughton W.J., Palacios R. Dynamics of genome architecture in Rhizobium sp. strain NGR234 // J. Bacteriol. 2002. -V. 184.-P. 171-176.

168. Maynard Smith J., Feil E.J., Smith N.H. Population structure and evolutionary dynamics of pathogenic bacteria // BioEssays. 2000. - V. 22. - P. 1115-1122.

169. Mehnaz S., Weselowski B., Lazarovits G. Azospirillum canadense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. - V. 57.-P. 620-624.

170. Mehnaz S., Weselowski B., Lazarovits G. Azospirillum zeae sp. nov., a diazotrophic bacterium isolated from rhizosphere soil of Zea mays // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2007a. V. 57. - P. 2805-2809.

171. Mergeay M., Nies D., Schlegel H.G., Gerits J., Charles P., van Gijsegem F. Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemolithotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals // J. Bacteriol. 1985. - V. 162. - P. 328-334.

172. Michiels K., Vanderleyden J., Elmerich C. Genetics and molecular biology of Azospirillum II Azospirillum plant associations / Ed. Y. Okon. Boca Raton: CRC, 1994. - P. 41-56.

173. Moens S., Michiels K., Vanderleyden J. Glycosylation of the flagellin of the polar flagellum of Azospirillum brasilense, a Gram-negative nitrogen-fixing bacterium // Microbiology. -1995.-V. 141.-P. 2651-2657.

174. Molina-Favero C., Creus C.M., Simontacchi M., Puntarulo S., Lamattina L. Aerobic nitric oxide production by Azospirillum brasilense Sp245 and its influence on root architecture in tomato // Mol. Plant Microbe Interact. 2008. - V. 21. - P. 1001-1009.

175. Moreno-Vivian C., Cabello P., Martinez-Luque M., Blasco R., Castillo F. Prokaryotic nitrate reduction: molecular properties and functional distinction among bacterial nitrate reductases // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 6573-6584.

176. Mori E., Fulchieri M., Indorato C., Fani R., Bazzicalupo M. Cloning, nucleotide sequencing, and expression of the Azospirillum brasilense Ion gene involved in iron uptake // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 3440-3446.

177. Nagakubo S., Nishino K., Hirata T., Yamaguchi A. The putative response regulator BaeR stimulates multidrug resistance of Escherichia coli via a novel multidrug exporter system, MdtABC // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 4161-4167.

178. Navarro C., Wu L.F., Mandrand-Berthelot M.A. The nik operon of Escherichia coli encodes a periplasmic binding-protein-dependent transport system for nickel // Mol. Microbiol. -1993.-V. 9. — P. 1181-1191.

179. Nicholas D.J.D., Nason A. Determination of nitrate and nitrite // Methods in Enzymology / Ed. S.P. Colowick, N.O. Kaplan. New York: Academic Press, 1957. - V. 3. - P. 981-984.

180. Nies D.H. Microbial heavy metal resistance: molecular biology and utilization for biotechnological processes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 51. - P. 730-750.

181. Nies D.H. Efflux-mediated heavy metal resistance in prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. -2003. -V. 27.-P. 313-339.

182. Nikaido H. Multidrug efflux pumps of Gram-negative bacteria // J. Bacteriol. 1996. - V. 178.-P. 5853-5859.

183. Pacovsky R.S. Metabolic differences in Zea-Glomus-Azospirillum symbioses // Soil Biol. Biochem. 1989. - V. 21. - P. 953-960.

184. Patriquin D.G., Dobereiner J., Jain D.K. Sites and process of association between diazotrophs and grasses // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - P. 900-915.

185. Peng G., Wang H., Zhang G., Hou W., Liu Y., Wang E.T., Tan Z. Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - V. 56. - 1263-1271.

186. Philippot L., Clays-Josserand A., Lensi R Use of Tn5 mutants to assess the role of the dissimilatory nitrite reductase in the competitive abilities of two Pseudomonas strains in soil // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - Y. 61. - P. 1426-1430.

187. Qian H., Sahlman L., Eriksson P. O., Hambraeus C., Edlund U., Sethson I. NMR solution structure of the oxidized form of MerP, a mercuric ion binding protein involved in bacterial mercuric ion resistance // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 9316-9322.

188. Rajeshwari R., Sonti R.V. Stationary-phase variation due to transposition of novel insertion elements in Xanthomonas oryzae pv. oryzae // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 47974802.

189. Ramírez-Díaz M.I., Díaz-Pérez C., Vargas E., Riveros-Rosas H., Campos-García J., Cervantes C. Mechanisms of bacterial resistance to chromium compounds // BioMetals. -2008.-V. 21.-P. 321-332.

190. Ratiner Y.A. Two genetic arrangements determining flagellar antigen specificities in two diphasic E. coli strains //FEMS Microbiol. Lett. 1985. - V. 29. - P. 317-322.

191. Reinhold B., Hurek T., Fendrik I. Strain-specific chemotaxis of Azospirillum spp. // J. Bacteriol.- 1985.-V. 162.-P. 190-195.

192. Rensing C., Grass G. Escherichia coli mechanism of copper homeostasis in a changing environment // FEMS Microbiol. Rev. 2003. - V. 27. - P. 197-213.

193. Rensing C., Pribyl T., Nies D.H. New functions for the three subunits of the CzcCBA cation-proton-antiporter // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 6871-6879.

194. Rich J.J., Heichen R.S., Bottomley P.J., Cromack K.Jr., Myrold D.D. Community composition and functioning of denitrifying bacteria from adjacent meadow and forest soils // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 5974-5982.

195. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A., Spiro S., Taylor C.J. Functional, biochemical and genetic diversity of prokaryotic nitrate reductases // Cell. Mol. Life Sci. 2001. - V. 58. -P. 165-178.

196. Robinson N.J., Whitehall S.K., Cavet J.S. Microbial metallothioneins // Adv. Microb. Physiol.-2001.-V. 44.-P. 183-213.

197. Rosen B.P. Biochemistry of arsenic detoxification // FEBS Lett. 2002. - V. 529. - P. 8692.

198. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. -New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

199. Sanchez-Contreras M., Martin M., Villacieros M., O'Gara F., Bonilla I., Rivilla R. Phenotypic selection and phase variation occur during alfalfa root colonization by Pseudomonas fluorescens F113 // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 1587-1596.

200. Sarig S., Kapulnik Y., Okon Y. Effect of Azospirillum inoculation on nitrogen fixation and growth of several winter legumes // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 335-342.

201. Sarig S., Blum A., Okon Y. Improvement of the water status and yield of field-grow grain sorgum (Sorghum bicolor) by inoculation with Azospirillum brasilense II J. Agric. Sci. — 1988.-V. 110.-P. 271-277.

202. Schlimme W., Marchiani M., Hanselmann K., Jenni B. Gene transfer between bacteria within digestive vacuoles of protozoa // FEMS Microb. Ecol. 1997. - Y. 23. - P. 239-247.

203. Schloter M., Moens S., Croes C„ Hartmann A., Michiels K. Characterization of cell surface components of Azospirillum brasilense Sp7 as antigenic determinants for strain-specific monoclonal antibodies // Microbiology. 1994. - V. 140. - P. 823-828.

204. Schmidt H., Hensel M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - V. 17. - P. 14-56.

205. Shah S., Karhanis Y., Desai A. Isolation and characterization of siderophore, with antimicrobial activity, from Azospirillum lipoferum M // Curr. Microbiol. 1992. - V. 25. -P. 347-351.

206. Shah S., Li J., Moffatt B. A., Glick B. R. Isolation and characterization of ACC deaminase genes from two different plant growth-promoting rhizobacteria // Can. J. Microbiol. 1998. -V. 44.-P. 833-843.

207. Shalman L., Wong W., Powlowski J. A mercuric ion uptake role for the integral inner membrane protein, MerC, involved in bacterial ion resistance // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272.-P. 29518-29526.

208. Shi X. Reduction of chromium (VI) and its relationship to carcinogenesis // J. Toxicol. Environ. Health. 1999. - V. 2. - P. 87-107.

209. Shmidt Т., Schlegel H.G. Combined nickel-cobalt-cadmium resistance encoded by the ncc locus of Alcaligenes xylosoxidans 31A11 J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 7045-7054.

210. Silver S. Bacterial silver resistance: molecular biology and uses and misuses of silvercompounds // FEMS Microbiol. Rev. 2003. - V. 27. - P. 341-353. 257.Silverman M., Simon M. Bacterial flagella // Ann. Rev. Microbiol. - 1977. - V. 31. - P. 397^119.

211. Stancheva I., Dimitrov I., Kaloyanova N., Dinev N., Poushkarov N. Improvement of the nitrogen uptake and nitrogen content in maize (Zea mays L.) by inoculation with Azospirillum brasilense II Agrochimica. — 1995. — V. 39. — P. 299-306.

212. Steenhoudt O., Keijers V., Okon Y., Vanderleyden J. Identification and characterization of a periplasmic nitrate reductase in Azospirillum brasilense Sp245 // Arch. Microbiol. 2001. -V. 175.-P. 344-352.

213. Steenhoudt O., Ping Z., Vande Broek A., Vanderleyden J. A spontaneous chlorate-resistant mutant of Azospirillum brasilense Sp245 displays defects in nitrate reduction and plant root colonization // Biol. Fertil. Soils. 2001a. - V. 33. - P. 317-322.

214. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24. - P. 487-506.

215. Stephens B.B., Loar S.N., Alexandre G. Role of CheB and CheR in the complex chemotactic and aerotactic pathway of Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 2006. - V. 188.-P. 4759—4768.

216. Stewart V., Bledsoe P.J., Chen L-L., Cai A. Catabolite repression control of napF (periplasmic nitrate reductase) operon expression in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. -2009.-V. 191.-P. 996-1005.

217. Stoderegger K., Herndl G.J. Production and release of bacterial capsular material and its subsequent utilization by marine bacterioplankton // Limnol. Oceanogr. — 1998. -V. 43. P. 877-884.

218. Strausak D., Solioz M. CopY is a copperinducible repressor of the Enterococcus hirae copper ATPases // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 8932-8936.

219. Strube K., de Vries S., Cramm R. Formation of a dinitrosyl iron complex by NorA, a nitric oxide-binding di-iron protein from Ralstonia eutropha HI6 // J. Biol. Chem. 2007. - V. 282. - P. 20292-20300.

220. Swem D.L., Bauer C.E. Coordination of ubiquinol oxidase and cytochrome cbb3 oxidase expression by multiple regulators in Rhodobacter capsulatus II J. Bacteriol. 2002. - V. 184.-P. 2815-2820.

221. Taghavi S., Mergeay M., Nies D., Van der Lelie D. Alcaligenes eutrophus as a model system for bacterial interactions with heavy metals in the environment // Res. Microbiol. -1997.-V. 148.-P. 536-551.

222. Tal S., Okon Y. Production of the reserve material poly-P-hydroxybutyrate and its function in Azospirillum brasilense II Can. J. Microbiol. 1985. -V. 31. - P. 608-613.

223. Tien T.M., Diem H.G., Gaskins M.H., Hubell D.H. Polygalacturonic acid transeliminase production by Azospirillum species I I Can. J. Microbiol. 1981. - V. 27. - P. 426-431.

224. Top E. M., Springael D. The role of mobile genetic elements in bacterial adaptation to xenobiotic organic compounds // Curr. Opin. Biotech. 2003. -V. 14. - P. 262—269.

225. Toyofuku M., Nomura N., Fujii T., Takaya N., Maseda H., Sawada I., Nakajima T., Uchiyama H. Quorum sensing regulates denitrification in Pseudomonas aeruginosa PAOl // J. Bacteriol. 2007. - V. 189. - P. 4969^1972.

226. Troxler J., Azelvandre P., Zala M., Defago G., Haas D. Conjugative transfer of chromosomal genes between fluorescent pseudomonads in the rhizosphere of wheat // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 213-219.

227. Tugarova A.V., Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Gardiner P.H.E. Azospirillum brasilense resistance to some heavy metals// Metal Ions in Biology and Medicine. 2006. — V. 9. - P. 242-245.

228. Van Alst N.E., Picardo K.F., Iglewski B.H., Haidaris C.G. Nitrate sensing and metabolism modulate motility, biofilm formation, and virulence in Pseudomonas aeruginosa II Infect. Immun. 2007. - V. 75. - P. 3780-3790.

229. Van Elsas J.D., Trevors J.T., Starodub E.E. Bacterial conjugation between pseudomonads in the rhizosphere of wheat // FEMS Microb. Ecol. 1998. - V. 53. - P. 299-306.

230. Van Rhijn P., Vanstockem M., Vanderleyden J., de Mot R. Isolation of behavioral mutants of Azospirillum brasilense by using Tn5 lacZ II Appl. Environ. Microbiol. 1990. -V. 56. -P.990-996.

231. Vanbleu E., Choudhury B.P., Carlson R.W., Vanderleyden J. The nodPQ genes in Azospirillum brasilense Sp7 are involved in sulfation of lipopolysaccharides // Environ. Microbiol. 2005. - V. 7. - P. 1769-1774.

232. Vanbleu E., Marchal K., Lambrecht M., Mathys J., Vanderleyden J. Annotation of the pRhico plasmid of Azospirillum brasilense reveals its role in determining the outer surface composition // FEMS Microbiol. Lett. 2004. - V. 232. - P. 165-172.

233. Verstraeten N., Braeken K., Debkumari B., Fauvart M., Fransaer J., Vermant J., Michiels J. Living on a surface: swarming and biofilm formation // Trends Microbiol. 2008. - V. 16. -P. 496-506.

234. Vial L., Lavire C., Mavingui P., Blaha D., Haurat J., Moenne-Loccoz Y., Bally R., Wisniewski-Dye F. Phase variation and genomic architecture changes in Azospirillum I I J. Bacterid. -2006.-V. 188.-P. 5364-5373.

235. Von Uexkull H. R., Mutert. E. Global extent, development and economic impact of acid soils//Plant Soil.- 1995,-V. 171.-P. 1-15.

236. Wang H., Tseng C-P., Gunsalus R.P. The napF and narG nitrate reductase operons in Escherichia coli are differentially expressed in response to submicromolar concentrations of nitrate but not nitrite // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 5303-5308.

237. Warnecke-Eberz U., Friedrich B. Three nitrate reductase activities in Alcaligenes eutrophus It Arch. Microbiol. 1993. - V. 159. - P. 405-409.

238. Will D., Wu S.S., Kaiser D. Contact stimulation of Tgll and type IV pili in Myxococcus xanthus I I J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 759-761.

239. Xie C.H., Yokota A. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from the roots of the rice plant Oryza sativa II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. - V. 55. - P. 1435-1438.

240. Young C.C., Hupfer H., Siering C., Ho M.J., Arun A.B., Lai W.A., Rekha P.D., Shen F.T., Hung M.H., Chen W.M., Yassin A.F. Azospirillum rugosum sp. nov., isolated from oil-contaminated soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - V. 58. - P. 959-963.

241. Zhou T., Radaev S., Rosen B.P., Gatti D.L. Conformational changes in four regions of the Escherichia coli ArsA ATPase link ATP hydrolysis to ion translocation // J. Biol. Chem. -2001. V. 276. - P. 30414-30422.

242. Zhou Y., Wei W., Wang X., Xu L., Lai R. Azospirillum palatum sp. nov., isolated from forest soil in Zhejiang province, China // J. Gen. Appl. Microbiol. 2009. - V. 55. - P. 1-7.

243. Zhulin I.B., Armitage J.P. Motility, chemokinesis, and methylation-independent Chemotaxis in Azospirillum braslense II J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 952-958.

244. Zimmer W., Roeben K., Bothe H. An alternative explanation for plant growth promotion by bacteria of the genus Azospirillum H Planta. -1988. -V. 176. P. 333-342.

245. Zumft W.G., Vega J.M. Reduction of nitrite to nitrous oxide by a cytoplasmic membrane fraction from the marine denitrifier Pseudomonas perfectomarinus II Biochim. Biophys. Acta. 1979. - V. 548. - P. 484-499.

246. Zumft W.G. Cell biology and molecular basis of denitrification // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997.-V. 61.-P. 533-616.

Информация о работе

Варшаломидзе, Ольга Эдуардовна
кандидата биологических наук
Саратов, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Плазмидные перестройки и изменения в подвижности, метаболизме азота и устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий Azospirillum brasilense - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы