Генетический анализ вариаций в подвижности и поверхностных структурах ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense

Борисов, Игорь Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетический анализ вариаций в подвижности и поверхностных структурах ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ вариаций в подвижности и поверхностных структурах ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense"

На правах рукописи

Борисов Игорь Викторович

Генетический анализ вариаций в подвижности и поверхностных структурах ассоциативных бактерий Azospirillum br asílense

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2004

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Е.И. Кацы Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Попов

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Л.А. Дыкман Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита диссертации состоится «¿¿'»декабря 2004 г. «¡/0» . на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13). Тел. / факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного с о г - - -

доктор биологических наук

Vu&JOV-Lf

<%bOSL

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие современных методов исследования в микробиологии, генетике, молекулярной биологии значительно продвинуло наше понимание механизмов взаимодействия геомериды - совокупности всех организмов, населяющих планету (Реймерс, 1991). Между тем нельзя не признать некоторую однобокость современных исследований в том, что касается объектов изучения: их подавляющее количество составляют организмы, напрямую связанные с жизнью человека: патогены и используемые в практических целях микроорганизмы.

В современном мире сформулирована задача изучения и сохранения биоразнообразия как неотъемлемой части поступательного и стабильного развития человечества. Почва является не только основой для обеспечения населения Земли продуктами питания, но и средой динамического взаимодействия между организмами разных таксонов и, в первую очередь, между растениями и микроорганизмами - основными компонентами биоразнообразия почв. Взаимодействия растений с микроорганизмами принято классифицировать на паразитизм, симбиоз, мутуализм или ассоциативное взаимодействие, синойкию (наименее тесное сожительство, безразличное для обоих сожителей). Если два первых варианта подробно изучаются как экономически важные для человеческой деятельности формы взаимодействия, то два последних привлекают меньше внимания. Между тем именно здесь находится часть, определяющая устойчивость почвы как системы, а, следовательно, и ее бонитет (качественная характеристика свойств почвы как суммарный показатель плодородия).

Бактерии рода Azospirillum занимают уникальное положение: типичные представители почвенных микроорганизмов, они способны вступать в ассоциативное взаимодействие с разнообразными растениями (Bashan, Holguin, 1997). Необходимость жизни как в скудных по источникам питания условиях почвы, так и в специфичных условиях ассоциации, привела к наличию у этих бактерий широкого спектра адаптационных способностей и, как следствие, к формированию генома большого объема (Martin-Didonet et al., 2000). Необычна система хемотаксиса азоспирилл - энергетический таксис как основа существования в экстремальных и варьирующих почвенных условиях при наличии сложного метаболизма (Alexandre et al., 2000). Необычно разнообразие двигательных органелл (полярный жгутик, многочисленные латеральные жгутики, полярный пучок пилей) и, соответственно, типов подвижности (Шелудько, Кацы, 2001). Наличие необычных фазовых переходов в популяции азоспирилл свидетельствует о существовании тонких механизмов адаптации к конкретным экологическим нишам (Alexandre, Bally, 1999; Шелудько, Кацы, 2001). Все перечисленное выше, наряду с факторами, важными для взаимодействия с растениями, делает бактерии рода Azospirillum крайне интересным объектом для изучения молекулярных основ адаптационного потенциала почвенных микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Целью нетический

анализ вариаций в коллективной подвижн

структурах

(двигательные органеллы, полисахариды) у стимулирующих рост и развитие растений бактерий вида ^ояртИыш brasilense. В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать лабораторные условия, способствующие стабильному проявлению модельным штаммом А. brasilense Sp245 способности к нескольким видам коллективной подвижности.

2. Идентифицировать мутанты А. brasilense Sp245 с фенотипами, соответствующими определенным фазовым вариациям в подвижности штамма дикого типа.

3.Получить молекулярные зонды на основе фрагментов 85- и 120-МДа плазмид А. brasilense Sp245, применимые для анализа геномов мутантов и штаммов А. brasilense дикого типа.

4. Изучить генетические перестройки, сопровождающие вариации в подвижности и поверхностных структурах А. brasilense.

5. Исследовать распространенность гомологичных локусов, определяющих подвижность, образование жгутиков и липополисахаридов, в ДНК штаммов А. brasilense Sp245, Sp7, Cd и SR75, выделенных на разных континентах.

6. Картировать вставки инсерционного элемента (омегона) в ДНК двух мутантов А. brasilense Sp245, имеющих дефекты в разных системах подвижности.

Научная новизна работы. Выделены фенотипическис варианты А. brasilense Sp245, демонстрирующие ускоренное роение ("суперроение"), а также подобраны условия для стабильного проявления этим штаммом способности к распространению в полужидкой среде с образованием микроколоний. Идентифицированы инсерционные мутанты А brasilense Sp245 с фенотипами, соответствующими известным на сегодняшний день фазовым вариациям в коллективной подвижности азоспирилл (роение; суперроение; отсутствие миграции в полужидкой среде; распространение с образованием микроколоний). На примере одного из мутантов А. brasilense Sp245 ФЮ59), показано, что переход азоспирилл от распространения с образованием микроколоний к ускоренному роению сопровождается исчезновением 85-МДа репликона и появлением плазмиды с молекулярной массой 36 МДа. Показано, что процесс образования коинтегратов вектора для омегонового мутагенеза pJFF350 и 85-МДа плазмиды А. brasilense Sp245 не является сайт-специфичным и приводит к образованию мутантов с разным фенотипом (отсутствие жгутиков; паралич жгутиков или ускоренное роение). Показано, что одиночные вставки инсерционного элемента (омегона) в ДНК А. brasilense Sp245 могут сопровождаться одновременными дефектами в нескольких системах бактериальной подвижности. Выявлена дупликация локусов fla/laf/mot/swa, определяющих жгутикование и подвижность А. brasilense Sp245, с локализацией одной из копий в 85-МДа плазмиде, а второй - в ином клеточном репликоне. Установлено, что появление у спонтанного мутанта А. brasilense Sp245.5 дефектов в трофическом хемотаксисе, липополисахаридах и полисахаридах, связывающих флуоресцентный краситель калькофлуор, коррелирует с генетической перестройкой, приведшей к полной или частичной

утрате 85-МДа плазмиды и к включению, по меньшей мере, части 120-МДа плазмиды (при реорганизации локусов ^) в новый мегарепликон. Показано наличие гомологичных фрагментов ДНК в плазмидах Л. brasilense Sp245, Sp7 и Cd. Установлено, что у штамма Л. bmsUense Sp7 и его производного штамма Cd, выделенных из разных растений, стабильные различия в морфологии колоний коррелируют с утратой 115-МДа плазмиды и ее молекулярного маркера. На модели штаммов Л. bmsUense Sp7 и Cd показана возможность использования 2.4-тпн EсоRI-фрагмент плазмиды р85 Л. brasilense Sp245, несущего локусflaflaf/mot/swa, для дифференциации генетических перестроек, происходящих при пассажах на разных растениях. Впервые показано присутствие гомологичных //«-локусов в двух плазмидах неродственных штаммов Л. brasilense Sp245 и SR75, взаимодействующих с пшеницей в разных географических регионах.

Научно-практическая значимость. Создана коллекция мутантов А. brasUense Sp245, имеющих фенотипы, аналогичные фенотипам фазовых вариантов по коллективной подвижности, используемая в ИБФРМ РАН для исследования генетико-физиологических механизмов адаптации бактерий к средам разной плотности. Подобрана тест-система для стабильного проявления штаммом Л. brasUense Sp245 способности к распространению в полужидкой среде с образованием микроколоний, что позволяет начать изучение генетико-физиологических механизмов названного процесса. Создан набор зондов на основе фрагментов 85- и 120-МДа плазмид Л. brasilense Sp245, применимый для исследования родственных взаимоотношений и функций многочисленных плазмид, обнаруженных у бактерий рода AzospirШum. Материалы, полученные в диссертации, использованы при выполнении в ИБФРМ РАН плановой темы НИР "Изучение генов азотофиксирующих бактерий, определяющих их взаимодействие со злаками" (№ госрегистрации 01960001676; рук-ли - д-р биол. наук Е.И. Кацы; д-р биол. наук, проф. В.И. Панасенко); гранта Президента РФ "Выяснение молекулярно-генетических механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных технологий" для поддержки ведущей научной школы заслуженного деятеля науки РФ, д-ра биол. наук, проф. В.В. Игнатова (НШ-1529.2003.4); гранта РФФИ "Генетический анализ кодируемой плазмидами продукции О-специфических полисахаридов и жгутиков у ассоциативных бактерий Azospirittum bmsUeme" (99-04-48034а; рук-ль - д-р биол. наук Е.И. Кацы).

Положения, выносимые на защиту.

1. Добавление в полужидкую малатно-солевую среду красителя конго красного (в концентрации 0.004%) способствует стабильному проявлению у штамма Л. brasUense Sp245 способности к распространению с образованием микроколоний.

2. Создана коллекция мутантов Л. bmsUense Sp245, имеющих фенотип, соответствующий определенным фазовым вариациям в коллективной подвижности штамма дикого типа: суперроение; распространение с образованием микроколоний; отсутствие миграции в полужидком агаре.

3. Использование молекулярных зондов, полученных на основе фрагментов 85- и 120-МДа плазмид A. brasilense Sp245, позволяет выявлять гомологичные последовательности и перестройки в геноме разных штаммов азоспирилл.

4. Интеграция в 85-МДа плазмиду A. brasilense Sp245 вектора для инсерционного мутагенеза (pSUP5011 или pJFF350) приводит к образованию разных продуктов слияния и к разнообразным изменениям в жгутиковании и коллективной подвижности бактерий.

5. Переход одного из мутантов A. brasilense Sp245 от распространения с образованием микроколоний к суперроению сопровождается перестройками в плазмидных ДНК этого штамма, заключающихся в исчезновении 85-МДа репликона и появлении плазмиды с молекулярной массой 36 МДа.

6. В плазмидах A. brasilense (р85 из Sp245 и pl 15 из Sp7, а также в р 120 из Sp245 и р90 из штаммов Sp7 и Cd) существуют гомологичные локусы, определяющие подвижность, образование жгутиков и полисахаридов.

7. Стабильные различия в морфологии колоний близкородственных штаммов A. brasilense Sp7 и Cd, выделенных из разных растений, коррелируют с утратой 115-МДа плазмиды. Использование фрагмента р85 из A. brasilense Sp245 для зондирования геномов азоспирилл позволяет дифференцировать штаммы A. brasilense Sp7 и Cd.

8. В двух плазмидах неродственных штаммов A. brasilense Sp245 и SR75 существуют гомологичные lps-локусы, что коррелирует с выявленной другими авторами идентичностью повторяющегося звена О-специфических полисахаридов этих штаммов.

9. Одиночные инсерции омегона в ДНК мутантов A. brasilense Sp245 (SK039 и SK586) сопровождаются появлением дефектов в системах подвижности, зависящих от присутствия на клетке разных двигательных органелл (полярный и латеральные жгутики, полярный пучок пилей): плавания, роения и распространения в полужидких средах с образованием микроколоний.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-м и 6-м Международных совещаниях "Azospirillum and Related Microorganisms" (Ганновер, 1991; Шарвар, 1994), на 8-м Восточноевропейском симпозиуме по биологической фиксации азота (Саратов, 1992), на 9-м Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995), на 10-м Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на 1-м Рабочем совещании микробиологов Поволжья (Саратов, 2000), на 5-й и 6-й Школах-конференциях молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000, 2002), на 10-м Международном конгрессе IUMS The "World of Microbes"" (Париж, 2002), на 1-й и 2-й Региональных конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2002, 2004), на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов "Вавиловские чтения-2003" (Саратов, 2003), на 3-й Всероссийской школе-конференции "Химия и биохимия углеводов" (Саратов, 2004), на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН (Саратов, 1999, 2003, 2004). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном

заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 18.10.2004 г., протокол № 155.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с изложением и обсуждением собственных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 305 источников. Объем диссертации составляет 164 машинописные страницы. Работа содержит 32 рисунка и 7 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает подразделы: 1.1. Бактерии рода Azospirillum как модельный объект в исследовании явления ассоциативности; 1.2. Свойства и функции плазмид азоспирилл; 1.3. Подвижность бактерий; 1.4. Фазовые вариации бактерий.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы штаммы A. brasilense Sp245, Sp7, Cd, SR75 дикого типа и 19 мутантов азоспирилл, из которых 8 охарактеризованы автором; 5 штаммов Escherichia coli; 20 плазмид, 12 из которых сконструированы в данной работе. В главе 2 также описаны: состав питательных сред и условия выращивания бактерий; методы мобилизации плазмид; методы препаративного выделения плазмидной и тотальной ДНК из бактерий; приемы работы с ДНК (гель-электрофорез, рестрикционный анализ, лигирование, трансформация бактерий, электроэлюция фрагментов ДНК из агарозных гелей, нерадиоактивная блоттинг-гибридизация ДНК); методы изучения подвижности и хемотаксиса бактерий.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Типы подвижности штамма A. brasilense Sp245 на полужидких

средах. Подвижность бактерий играет важную роль в колонизации корней растений (Croes et al., 1993). Считается, что выделяемые корнями полисахариды формируют вокруг корней гелеобразную структуру - муцигель (Gould, Northcote, 1985; Скворцов, 1994). Поэтому наше внимание привлекло распространение азоспирилл на полужидких средах, моделирующих физические условия геля. Клетки A. brasilense на малатно-солевой среде (MSM) с 0.4% агара согласованно распространяются (роятся), образуя две четкие зоны роения (Hall, Krieg, 1983). Нами описывается самопроизвольное формирование зон более быстродвижущихся клеток при роении A. brasilense, которые мы назвали протуберанцами (рис. 1). Бактерии (Sp245.P), высеянные из подобных протуберанцев, по морфологии колоний на плотной среде не отличались от исходного штамма. При росте не полужидкой среде Sp245.P демонстрировали ускоренное роение (суперроение, Swa++-фенотип) (табл. 1) и изменения 2-й зоны роения, распадающейся на равномерно распределенные сегменты. Нами впервые описаны суперроящиеся фазовые варианты азоспирилл.

Рис. 1. Образование "протуберанца" при роении А ЬаНете Зр245 на полужидкой МЗМ (72-часовая культура).

Таблица 1. Диаметр зон распространения, образуемых А Ьгазйепзе Sp245, его суперроящимся вариантом Sp245.P и инсерционными мутантами по подвижности в МЗМ. содержащей 0.4% агара

Штамм A brasilens е Диаметр зон распространения (мм), формируемых через 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 120 ч

Sp245 10.32±0.74 24.24±1.34 36.36±2.39 58.35±5.39 68 62±5.42

Sp245.P 22.6Ш.61 61.28±2.78 84.20±5.64 н.о. н.о.

KZ042 15.37±3.39 30.75±6.90 50.00± 11.61 61.83±14.59 н.о.

KZ050 19.16±6.46 42.50±7.65 68 00± 13.22 78.75±8.21 но.

ВК468 25.25±3.48 52.88*6.2 81.50±9.63 86.66±8.64 н.о.

ВК570 27.50±3.93 54.45±8.77 73.12±9.06 84.60±7.05 но.

BK759.G 0 6.40±0.40 8 80±0.47 13.00±1.00 15.00±1.20

ВК759.Р 24.40±2.51 57.44±3.86 88.87±3.36 н.о. н.о.

Примечание. В таблице приведены средние арифметические значения 12-80 независимых определений ± среднее квадратичное отклонение.

Для ряда бактерий выявлена корреляция образования 8ша++-фенотип с изменениями в продукции экзополисахаридов (ЭПС) (Wei, Bauer, 1999; Brumbley, Denny, 1990). Штамм Sp245 дикого типа и его 8ша++-клоны не различались по морфологии и окраске колоний на плотной среде с красителем конго красным, который связывается с ЭПС. Однако в присутствии 0.004% конго красного в полужидкой среде наблюдалось ингибирование роения азоспирилл и их переход к распространению с образованием микроколоний (Оп++-фенотип). Появление с низкой частотой в популяции Sp245 клонов с Gri+-фенотипом было описано ранее, но в исследованных условиях такие клоны были нестабильны и возвращались к роению (Шелудько, Кацы, 2001).

Таким образом, кроме ранее описанных Swa+, Gri+ Swa~ и Gri" Swa" фенотипических вариантов A. brasilense Sp245 (Шелудько, Кацы, 2001), нами идентифицированы Swa++-dfhbfyns этого штамма. Подобрана модификация полужидкой среды MSM (добавление 0.004% красителя конго красного), способствующая устойчивому проявлению Gri++-фенотипа Sp245, что можно в дальнейшем использовать при исследовании механизмов, обеспечивающих распространение бактерий в полужидком агаре с образованием микроколоний.

3.2. Идентификация и генетическая характеристика мутантов A.brasilense Sp245 с изменениями в подвижности. Наличие разнообразных

форм подвижности A. brasilense Sp245 на (в) полужидкой среде требует изучения генетических факторов, ответственных за эти процессы. Мы провели

скрининг коллекции транспозоновых и омегоновых мутантов А. brasilense 8р245, созданной ранее в нашей лаборатории (Кацы, 2002), в поисках инсерционных мутантов, повторяющих вышеописанные фенотипические вариации в коллективной подвижности 8р245.

Транспозоновые мутанты 8р245 (штаммы К2042 и К2050), у которых произошла интефация вектора-"самоубийцы" р8иР5011 в 85-МДа плазмиду (р85) (Кацы с соавт., 1990) проявляют на полужидкой среде более высокую скорость роения, чем дикий тип (см. выше табл. 1). При гибридизации ДНК р8иР5011 с ,Л7го1-рестриктами тотальной ДНК обоих мутантов обнаруживаются по три одинаковых позитивных фрагмента ДНК, что свидетельствует о присутствии двух копий Tn5-Mob в одном и том же .АТиЙ-фрагменте. В то же время набор сильнопозитивных .ЕсоЫ-фрагментов тотальной ДНК у К2042 и К2050 различен (рис. 2). Последний факт свидетельствует о различиях в структуре продуктов слияния р85 и р8иР5011, которые могли быть следствием встраивания вектора в различной ориентации. Таким образом, у суперроящихся транспозоновых мутантов К2042 и К2050 произошла коинтеграция (с удвоением Tn5-Mob) суицидального вектора р8иР5011 в разной ориентации с одним и тем же А%о1-фрагментом р85.

Из полученной ранее коллекции омегоновых мутантов A. bmsUense 8р245 (Ка12у й а1., 1998) нами был отобран мутант с повышенной скоростью роения в полужидкой среде - ВК570 (см. выше табл. 1). Электронная микроскопия показала, что у ВК570 нет явных изменений жгутикового аппарата. Установлено, что у штамма ВК570 инсерция омегона-Кт произошла в р85.

Рис. 2. Результаты Саузерн-гибридизащш Xhoï- (панель А) и ЕсоШ (панель Б) фрагментов рестрикции тотальной ДНК A.brasilense KZ042 (1), KZ050 (2) и Sp245 (4) с меченной пероксидазой ДНК pSUP5011. В качестве позитивного контроля был использован BgHl-гидролизах pSUPSOl I (3). Слева показано положение маркерных Xhol- и ficûRI-фрагментов рестрикции ДНК фага X. Примечание: в области ЕсоRI-фрагментов тотальной ДНК мутантов, имеющих длину менее 3.5 тпн, позитивные сигналы не обнаружены.

Саузерн-гибридизация Xhol-

перевара тотальной ДНК, выделенной клеток A. brasilense BK570, с меченной пероксидазой ДНК вектора pJFF350 выявила только один позитивный фрагмент размером около 20 тпн (рис. 3). Результаты EcoRI-гидролиза и блоттинг-гибридизации с вектором pJFF350 тотальной ДНК мутанта ВК570 свидетельствуют о присутствии омегона-Km в

большем из двух позитивных .EcoRI-фрагментов и оставшейся части pJFF35O -в меньшем фрагменте (см. рис. 3).

Рис. 3. Сравнение гибридизационных профилей А brasiknse SK051 и ВК570. Тотальная клеточная ДНК, выделенная из Л brasiknse, былагидролизованаЖо/ (А) или £coRl (Б), разделена экектрофорезом в 0 7% геле, перенесена по Southern на мембрану Hybond-N+ и ECL прогибридизована с меченой pJFF350. А: 1 - SK051, 2 -Sp245, 3 - pJFF350 (Я;и<ЛН-перевар, позитивный контроль), 4 - ВК570 Б 1 - SK051, 2 - нативная pJFF350, 3 - Sp245, 4 - ВК570. Мобильность маркерных Xhol, EcoRl и Hindlll фрагментов ДНК фага % и их длина в тпн приведены слева от блотов

Таким образом, из вышеприведенных данных следует, что у мутанта A brasiknse BK570 произошло слияние суицидального вектора pJFF350 с р85.

Коинтеграция различных суицидальных векторов с р85 штамма Sp245 была и раньше описана в нашей лаборатории (Матвеев с соавт., 1989; Кацы с соавт., 1990). С целью выявления возможных причин подобного явления мы исследовали ДНК еще двух омегоновых мутантов Sp245 (штаммы SK051 и SK248), у которых ранее при гибридизации по Саузерну с ДНК pJFF350 был выявлен позитивный сигнал в р85 и в 23-т.п н. Xhol-фрагменте тотальной ДНК (Scheludko et al., 1998).

Мутант SK051 лишен полярного и латеральных жгутиков (фенотип Fla" Laf), a SK248 имеет парализованный полярный жгутик и не способен к роению (Mot" Swa"). Таким образом, коинтеграция одного и того же суицидального вектора с плазмидой р85 (мутанты ВК570, SK051 и SK248) приводит к разным фенотипическим проявлениям.

Для объяснения подобного эффекта необходимо было убедиться в том, что слияние происходит в разных локусах. С этой целью были клонированы KmR-фрагменты из ATloI-переваров тотальной ДНК SK051, SK248 и ВК570 (плазмиды рЕК051Х, рЕК248Х и рВК570Х, соответственно) Рестрикционные карты рЕК051Х и рЕК248Х (рис. 4), построенные с использованием десяти различных эндонуклеаз, а также с помощью неполного одиночного и двойного гидролиза при последующей гибридизации с меченными пероксидазой фрагментами pJFF350 показали, что у SK051 и SK248 произошло встраивание суицидального вектора pJFF35O в один и тот же -фрагмент р85, но в различные сайты и с образованием разных продуктов слияния.

ЕсоШ- гибридизационные профили SK051 и ВК570 (см. выше рис. 3) были разными; кроме того, в отличие от SK051 и SK248, штамм ВК570 не был дефектен по жгутикованию и подвижности. Поэтому мы сделали вывод об отсутствии строгой сайт-специфичности для включения pJFF350 в ДНК р85.

Различия в физических картах рЕК051Х, рЕК248Х и рВК570Х (см. рис. 4) могут быть причиной разного фенотипического проявления коинтеграции р1ЕЕ350 с р85.

Рис. 4. Схема рекомбинантных плазмид рЕК051Х, рЕК248Х и рВК570Х. Сайты рестрикции: В- ВатШ, Bg - Е - ЕепШ, Н - ШпЛИ, 8т-5/яя1,Х -ХНо1. Горизонтальные стрелки показывают повторы последовательностей р85, содержащих сайты £со1У-»5^Л1-»5так Серые прямоуголиники соответствуют внешним лимитам гомологии с р.ТЕЕ350, которые были продемонстрированы в реакциях гибридизации по Саузерну. Карта р1РР350 приведена для сравнения. В плазмиде рЕКОвК обнаружена делеция размером около 1 тпн в районе, соответствующем олТ-Ш ,ав плазмидах рЕК248Х и рВК570Х -увеличение этой области примерно на 0.3 тпн.

При построении физических карт плазмид рЕК051Х и рЕК248Х была выявлена интересная деталь: в ДНК р85, с обеих сторон от сайта слияния р!РР350 с р85 у мутантов 8К051 и вК248 обнаружены последовательности длиной около 1 тпн, содержащие повторы сайтов рестрикции —I—►

8та1 (если читать в направлении к р1ЕЕ350) (см. рис. 4). Подобное расположение сайтов указывает на возможное наличие протяженных (длиной порядка 1 тпн) обращенных повторов нуклеотидов. Наличие длинных обращенных повторов, в свою очередь, может свидетельствовать о нахождении в составе р85 элемента, схожего по структуре с транспозонами. Транспозоны представляют собой фрагменты ДНК, фланкированные обращенными последовательностями инсерционных элементов - 18 (Хесин, 1984).

Ранее в нашей лаборатории была получена коллекция мутантов 8р245 с измененным плазмидным составом (Кацы, 1990). Мы сконцентрировали свое внимание на мутантах, изменения плазмидного состава которых тем или иным способом затронули р85: К2012 с делецией величиной 10 МДа в р85; К2127 и К2135, утратившие 85-МДа репликон; К2160, содержащий коинтеграт р85::р8иР5011; спонтанный мутант 8р245.5, утративший 85- и 120-МДа

репликоны, и Sp245.5-160 - производный Sp245.5, в который с помощью плазмиды RP4-4 был мобилизован коинтеграт p85::pSUP5011 из KZ160.

При микроскопическом исследовании мутантов A brasilense Sp245 в логарифмической фазе роста из богатой (TSB) или синтетической (MSM) питательных сред отличия в их подвижности от штамма дикого типа не выявлены. Был изучен ответ A. brasilense Sp245 и его мутантов с измененным плазмидным составом на различные хемоэффекторы, присутствующие в корневых эксудатах пшеницы. Оказалось, что делетирование фрагмента р85 (у KZ012) или исчезновение этого репликона из экстрахромосомного состояния (у KZ127 или KZ135) не отражается на ответе мутантов на все использованные хемоэффекторы (в концентрации 1 мМ). При снижении концентрации хемоэффекторов до 1 мкМ интенсивность хемотактического ответа у мутантов и штамма дикого типа практически не меняется. В то же время штамм Sp245.5 лишился способности к трофическому хемотаксису на сахара и аминокислоты (за исключением аланина и глутаминовой кислоты). Стоит отметить, что у названного мутанта были обнаружены отличия от штамма Sp245 в структуре липополисахаридов (ЛПС) и, незначительные, в составе белков внешней мембраны. Возможно, СЬе"<-фенотип Sp245.5 является следствием описанных перестроек в структуре его оболочки. Введение в Sp245.5 плазмиды p85::pSUP5011(pHC. 5) (из штамма KZ160, имеющего такой же фенотип, что и Sp245) не сказывается на поведении трансконъюгантов Sp245.5-160, что позволяет предположить связь Che" -фенотипа мутанта Sp245.5 с исчезновением 120-МДа репликона из экстрахромосомного состояния.

Рис. 5. Электрофореграмма плазмидных ДНК А ЬаПете 8р245 (1); 8р245.5 (3), утратившего репликоны с молекулярной массой 85 и 120 МДа; К160 (2), содержащего коинтеграт р85. р8ИР5011; вр245.5-160 (4), полученного в результате мобилизации р85:.р8ИР5011 из К160 в вр245 5. Слева указана молекулярная масса плазмид; сИг -линейные фрагменты ДНК.

3.3. Использование клонированных фрагментов 85- и 120-МДа плазмид А. ЬгазИете 8р248для поиска гомологичных последовательностей в геномах других штаммов А. Ьга8йете. В результате генетических исследований, проводимых с коллекцией омегоновых мутантов А. Ьrasilense 8р245, в наших руках оказался набор клонированных фрагментов р85 и р!20. Было решено использовать эти фрагменты в качестве зондов для выявления гомологичных последовательностей в плазмидах других штаммов А. Ьrasilense и для более полной характеристики генетических перестроек, произошедших у спонтанного мутанта 8р245.5.

Мутант A. brasilense Sp245.5, утративший 85- и 120-МДа плазмиды, сохранил нормальную подвижность и жгутикование. Для выявления возможного слияния ДНК р85 и / или р120 с другими клеточными репликонами была осуществлена Саузерн-гибридизация плазмидных ДНК и рестриктов тотальной ДНК Sp245 и Sp245.5 с фрагментами р85 и р120, фланкирующими вектор pJFF35O или омегон у мутантов SK051, SK248 и SK048 (Кацы, Шелудько, 1999). Для получения зондов использовали препараты плазмид рЕК051Х, рЕК248Х (см. рис. 4) и pOmegon-Km-/fa048X (Кацы, Шелудько, 1999).

Анализ представленных на рис. 6 гибридизационных £coRI- и BamYÜ. профилей тотальной ДНК A. brasilense Sp245 и Sp245.5 свидетельствует о сохранении исходного набора позитивных и -фрагментов

рестрикции, гибридизующихся с фрагментом р120, несущим локус(ы) flа.Эти результаты демонстрируют сохранение выявленных в р120 локусов fla у штамма Sp245.5.

При использовании в качестве зонда 2.4-тпн EcoRI-фрагмента р85, прилегающего к слиянию с pJFF350 у Fla La F мутанта SK051 и Mot" Swa" мутанта SK248, в тотальной ДНК Sp245 выявлено два гомологичных фрагмента (размером около 2.7 и 2.4 тпн), больший из которых отсутствует у Sp245.5. Вместо двух позитивных ÂïwHI-фрагментов, детектируемых в ДНК Sp245, у мутанта определяется только один (см. рис. 6).

Рис. 6. Результаты Саузерн-гибридизации разделенных в агарозном геле £coRI- (3-4) и ВатШ- (5-6) фрагментов тотальной ДНК A. brasiknse Sp245 (3, 5) и Sp245.5 (4, 6) (панель А) с 8.3-тпн Л7ю1-фрагментом р120 (Б) и с 2.4-тпн £соШ-фрагментом р85 (В). Слева показано положение маркерных £coRI-, Xho\ - и Bgl11 -фрагментов ДНК фага X.

По-видимому, есть дупликация гомологичных генов (имеющихся в использованном зонде) в ДНК Sp245, чем и объясняется сохранение нормальной подвижности и жгутикования у Sp245.5 и ряда мутантов, не содержащих р85.

Как видно из рис. 7Б, положительный сигнал в реакции гибридизации с _АТю1-фрагментом р120, фланкирующим инсерцию омегона у Fla" Swa" мутанта SK048, дает плазмида с молекулярной массой более 300 МДа, появившаяся у Sp245.5 в результате плазмидной перестройки. При использовании в качестве зонда 2.4-тпн EcoRI-фрагмента р85, прилегающего к слиянию с pJFF350 у Fla Laf мутанта SK051 и Mot Swa мутанта SK248, плазмиды Sp245.5 позитивного ответа не дали (рис. 7В).

1234563456 3456

-- Рис. 7. Результаты Саузерн-гибридизацш

разделенных в агарозном геле плазмидных ДНК А brasilense Sp245.5 (1) и Sp245 (2) (А) с 8.3-тпн Xhol фрагментом р120 (Б) или с 2.4-тпн £coRl фрагментом р85 (В).

В реакциях блоттинг-гибридизацш плазмид A. brasilense (рис. 8) выявлен« гомология 8.3-тпн Л7ю1-фрагменту р120 и: Sp245 в 90-МДа плазмиде Sp7, а такж( слабые сигналы на уровне плазмид i молекулярной массой более 300 МДа и линейных фрагментов ДНК (рис. 8Б). С 2.4-тпн £соИ-фрагментом р85 из A. brasilense Sp245 гибридизуется 115-МД; плазмида Sp7 (рис. 8В).

'«с*

Рис. 8. Результаты Саузерн-гибридизацш разделенных в агарозном геле плазмидны: ДНК А. ЬгаяИете Йр245 (1) и Бр7 (2) (панел] А) с 8.3-тпн .А7ю1-фрагментом р120 (Б) и с 2.4 тпн ¿¿»М-фрагментом р85 (В).

ДНК р120, клонированная в вида плазмиды рОте§оп-Кт-//и348Х I содержащая, по меньшей мере, дв; локуса 1р$ (КаЬгу е1 а1., 1998), был; использована нами в качестве зонда 1 \ ь

реакциях ЕСЬ-гибридизации с ЕсоШ-и Яа/яШ-фрагментами тотальной ДНК А. ЬгазНеюе Бр245 и его спонтанного Ьрэ мутанта Бр245.5 (рис. 9).

Рис. 9. Идентификация ГсоШ- и ВатШ-фрагментов рестрикции тотальной ДНК А. ЬгсчИеюе Бр245 и 5р245.5, гибридизующихся с ДНК р120, несущей локусы 1р5 и представленной в рОгт^оп-Кш-/р5348Х. 1 - ЛЛ-фрагменты ДНК фага Я; £соШ перевары ДНК: 2 - фага А.; 3 -8р245; 4 - вр245.5: ЛшШ-перевары ДНК: 5 - Бр245; 6 - Бр245.5. А - рестрикционные фрагменты, разделенные гель-электрофорезом. Б - результаты блоттинг-гибридизации геля с панели А с меченным пероксидазой фрагментом р120.

Р|

Сравнение спектра позитивных £coRI- и &гтН1-фрагментов, выявленных в тотальной ДНК Sp245 и его Lps мутанта (см. рис. 9), с учетом информации о количестве и длине jEcoRI-фрагментов, содержащихся в ДНК р 120, использованной в качестве зонда (Katzy et al., 1998), позволяет предположить следующее. Кроме iscoRI-фрагмента размером около 6.2 тпн, находящегося в составе рекомбинантной плазмиды pOmegon-Km-/|ps348X, в ДНК Sp245 обнаруживается еще один позитивный фрагмент такого же размера. Образование высокомолекулярной плазмиды у Sp245.5 сопровождается реорганизацией одного из этих ЯсоМ-фрагментов (несущего локусы lps), появлением в результате двух новых гибридизующихся с р120 EcoRI-фрагментов и уменьшением длины одного из слабопозитивных BamYM-фрагментов (см. рис. 9).

Таким образом, вышеприведенные результаты свидетельствуют о включении немодифицированных локусов и измененных локусов

Ips/cal, выявленных в 120-МДа плазмиде, в состав новой мегаплазмиды у штамма Sp245.5. Обнаружены два £coRI-фрагмента, гомологичные локусу из р85, в ДНК A.brasllense Sp245 и сохранение одной из копий в ДНК мутанта Sp245.5.

Использование вышеназванных зондов для гибридизации с ДНК А. brasilense Sp7 позволило впервые выявить сильно выраженную гомологию фрагментам р120 в 90-МДа плазмиде и фрагменту р85 - в 115-МДа плазмиде Sp7.

Матвеевым с соавт. (1987) получены косвенные данные о возможном участии p115 штамма Sp7 в регуляции процесса R-S-диссоциации у азоспирилл. Этими авторами было замечено, что исчезновение 115-МДа репликона из клеток Sp7 коррелирует с закреплением у бактерий S-фенотипа, т.е. гладкой морфологии колоний (соответствующий штамм назван Sp7-S).

В отличие от A. brasilense Sp7, Sp7-S и множества других штаммов азоспирилл, культуры штамма A brasilense Cd на минимальных синтетических средах не претерпевают диссоциацию и в течение многих лет стабильно сохраняют S-фенотип. Следует отметить, что Sp7 и Cd состоят в очень близком родстве. Штамм Sp7 был выделен из ризосферы Digitaria decumbens, a Cd - из корней Cynodon dactylon после инокуляции этого растения культурой Sp7 (Eskew et al., 1977; Tarrand et al., 1978). Показаны практически полная идентичность двумерных белковых карт (De Mot, Vanderleyden, 1989) и полиморфизма длин 5/?е1-фрагментов рестрикции ДНК (Gundisch et al., 1983), 100%-ная гомология хромосомной ДНК (Tarrand et al., 1978), а также небольшие различия в полиморфизме длин (в интервале 1.7-0.3 тпн) BglU-фрагментов рестрикции ДНК штаммов Sp7 и Cd (Giovanetti et al., 1990). Моноклональные антитела на флагеллин полярного жгутика Sp7 узнавали и флагеллин Cd. Однако моноклональные антитела на ЛПС и 85-кДа белок внешней мембраны Sp7 не связывались клетками Cd (Kirchhof et al., 1997). Можно предположить, что различия в антигенах клеточной поверхности Sp7 и Cd возникли вследствие адаптации этих бактерий к разным условиям существования (Kirchhof et al., 1997).

Нами обнаружено, что на плотной картофельной среде (РМ) рост 8р7 ингибируется при содержании цетавлона, равном 0.05%, а Сё выдерживает в два раза большую концентрацию этого катионного поверхностно-активного вещества. При культивировании на плотной М8М или глицериново-солевой среде 8р7 и Сё имеют одинаковый уровень устойчивости к цетавлону - 0.03%. На РМ А. Ьrasiiense 8р7 и Сё формируют сильно ослизненные колонии, по-видимому, за счет изменений в продукции ЭПС. Ранее другими авторами отмечалось, что ЭПС А. Ьrasilense Сё и 8р7 имеют разный моносахаридный состав, зависящий от источника углерода в среде культивирования бактерий (Коннова, 2003). Возможно, различиями в уровне продукции и (или) составе ЭПС у 8р7 и Сё, более заметными при росте на среде РМ, объясняется повышенный уровень устойчивости штамма Сё к цетавлону. На полужидкой М8М уже через 18 ч культура Сё формирует зоны роения в два раза большего диаметра, чем у 8р7. Возможно, и это связано с различиями в составе и уровне продукции ЭПС у 8р7 и Сё.

Нам представлялось интересным выяснить, какие перестройки в геноме близкородственных штаммов сопровождают появление вышеперечисленных различий между 8р7 и Сё. Как и в случае штамма 8р7-8 (Матвеев с соавт., 1987), плазмидный профиль А Ьrasilense Сё отличается от такового у 8р7 отсутствием 115-МДа репликона (рис. 23А). Оказалось, что в реакциях блоттинг-гибридизации 90-МДа плазмида А. Ьrasilense Сё ведет себя подобно р90 из 8р7: позитивные сигналы получены при гибридизации с фрагментами р120 (рис. 10В, 10Г), а негативный - при гибридизации с фрагментом р85 (рис. 10Б).

Рис. 10. Выявление гомологии фрагментам р120 и р85 из А. Ьтя1ете 8р245 в плазмидной ДНК А. Ь^Неже 8р7 и Сё. А - плазмиды Эр245 (I), Сё (2) и Эр7 (3), разделенные горизонтальным гель-электрофорезом. Б, В, Г - Саузерн-гибридизация геля с панели А с меченным пероксидазой 2.4-тпн £со1И-фрагменгом р85 из рЕК051Х (Б), с ДНК р120 из pOmegon-Km-/?a048X (В) и pOmegon-Km-(Г). Молекулярная масса плазмид в МДа указана слева.

Кроме того, при гибридизации £соК1 -переваров тотальной ДНК вр7 и Сё с двумя фрагментами р120, несущими локусы и гомологичными

р90, межштаммовые различия выявлены не были. Таким образом, какие-либо различия в организации или функционировании р90 у штаммов А. Ьrasilense 8р7 и Сё нами не обнаружены.

В реакции блоттинг-гибридизации с 2.4-тпн ЕсоЫ-фрагментом р85, несущим локус и гомологичным даже в нестрогих

условиях (при использовании в отмывочном буфере не 6 М, а 1 М мочевины) в £соЮ-переваре тотальной ДНК штамма Сё, в отличие от 8р7, 8р7-8 и 8р245, выявляется лишь один сильный сигнал вместо двух. Следует отметить, что

дупликация ряда генов А. ЬгазИете, при которой гомологичные копии имеют разную - плазмидную и хромосомную - локализацию, является установленным фактом (Кацы, 2002) Использованный нами фрагмент р85 также имеет гомолога, локализованного в другом репликоне А. Ьга$Иете. В строгих условиях с вышеназванным фрагментом р85 гибридизуются два £соШ-фрагмента ДНК штаммов Бр245, Бр7 и 8р7-8 и один £соШ-фрагмент ДНК

Рис. 11. Идентификация £л>Ш-фрагоентов рестрикции тотальной ДНК А. ЬгсяИеюе 8р245, 5р7, 8р7-8 и С(), гибридизующихся с 2.4-т.п.н. £соЫ-фрагментом р85 из рЕК051Х. 1-4 - £еоШ-перевары ДНК 8р245 (I); Бр7 (2); 5р7-Э (3) и Са (4); 5 - ЯшЛИ-фрагменты ДНК фага X. После электрофореза в агарозном геле фрагменты ДНК А. ЬгсчИепве переносили по Саузерну на мембраны НуЬопё-Ы* и гибридизовали с зондом, меченным пероксидазой. Справа приведен размер ЯЫШ-фрагментов ДНК фага Я. в тан.

Полученные результаты позволяют предположить, -чго у штамма БрТ-Б произошла интеграция, по меньшей мере, фрагмента р115 или всей плазмиды в хромосому. Напротив, у штамма Сс! (возможно, вследствие приспособления к существованию в иных экологических условиях), вероятно, произошла истинная элиминация р115.

Недавно нашими коллегами из лаборатории биохимии ИБФРМ РАН была установлена идентичность повторяющегося звена О-ПС у штамма А. brasilense Sp245, выделенного из корней пшеницы в Бразилии, и у штамма А. brasilense SR75, изолированного из проростков пшеницы в Саратове. О-ПС обоих штаммов состоят из пентасахаридных звеньев и являются гомополимерами D-рамнозы (Fedonenko et я1., 2002; Федоненко с соавт., неопубликованные данные).

В связи с обнаруженной идентичностью структуры О-ПС у А. brasilense SR75 и Sp245 возникла задача сравнительного анализа ДНК этих штаммов. Полученные нами данные свидетельствуют о существенных различиях в структуре геномов А. brasilense SR75 и Sp245. Так, эти штаммы имеют разный плазмидный состав. Гидролиз тотальной ДНК SR75 и Sp245 эндонуклеазами рестрикции приводит к образованию разных наборов фрагментов рестрикции (рис. 12, А). Саузерн-гибридизация с 8.3-тпн фрагментом р120, фланкирующим инсерцию омегона у мутанта SK048, утратившего полярный жгутик и способность к роению, не позволяет выявить в ДНК SR75 значимой гомологии названному фрагменту (рис. 12, В).

В качестве зонда в реакциях ДНК-гибридизации был также использован фрагмент р120, содержащий, по меньшей мере, два локуса р и один локус cat. В результате в тотальной ДНК А. brasilense SR75 (рис. 12Б) и в двух

штамма Сс1 (рис. 11).

1 2 3 4 5 ТП.Н.

мегаплазмидах этого штамма обнаружена значимая гомология использованому /рт-зонду.

Рис 12. Поиск гомологии фрагментам р120 из АЬгткте Бр245 в тотальной ДНК А. ЬгазИете 51175. А: 1,2 - ЕсоШ- и 3,4 - ВатШ-фрагменты рестрикции тотальной ДНК штаммов вр245 (1, 3) и 81175 (2, 4); Б, В - Саузерн-гибридизация геля с панели А с меченной пероксидазой ДНК р120 из плазмид рОп^оп-Кт-/;м348Х (Б) и рОгг^оп-Кт-/7о048Х (В). Слева указаны положение и длина (в тпн) некоторых фрагментов рестрикции ДНК фага X.

Итак, осуществленный нами физический и гибридизационный анализ ДНК показал наличие явных различий в организации геномов А. ЬгавИепве вр245 и 8К75. Тем не менее, локусы, гомологичные -зонду из р120, находятся в плазмидных ДНК 8Я75 и, как у 8р245, представлены более чем в одной копии и диспергированы по разным плазмидным репликонам.

3.4. Характеристика омегонового мутанта A. brasilense Sp24S, демонстрирующего распространение в полужидкой среде с образованием микроколоний и расщепление на субпопуляции с образованием роящихся клонов. Ранее (Кацы, Шелудько, 1999; Шелудько, Кацы, 2001) было показано, что некоторые омегоновые мутанты A. brasilense 8р245 распространяются в полужидкой среде с образованием микроколоний. В данной работе идентифицирован омегоновый мутант A. brasilense БК759.0, имеющий отличия от вышеназванных штаммов. При выращивании на полужидкой среде БК759.0 часто, из произвольной точки зоны распространения микроколониями, появляется фронт роения (рис. 13). Клоны, отсеянные из образовавшихся фронтов роения, приобретали фенотип Бууэ^и были названы ВК759.Р (табл. 1). Необходимо отметить, что подобные переходы происходили только в полужидкой среде.

Рис 13. Образование зон роения при росте БК7590 на полужидкой среде. 72-часовые культуры на среде М8М, содержащей 0.4% Бакто агара.

Результаты гель-электрофореза по Экхардту показали, что различия в подвижности БК7590 и ВК759Р коррелируют с плазмидной перестройкой: из плазмидноге профиля исчезает р85 и появляется новая плазмида с мол. массой 36 МДа (рис. 14).

Рис. 14. Плазмидный профиль мутантов ВК759Р (1) и БК7590 (2) Молекулярная масса плазмид в МДа указана слева.

Гибридизация Ват№- иЛЛйр е в ар о в тотальной ДНК ВК759Р и БК759С с вектором р1РР350 и фрагментами 85- и 120-МДа плазмид родительского штамма 8р245, показала, что переход от БК7590 к ВК759Р сопровождается изменением молекулярных масс фрагментов, с которыми гибридизуются зонды. Таким образом, фенотипический переход от СН+ -мутанта БК7590 к Би^-мутанту ВК759Р сопровождается перестройкой генома, затрагивающей плазмиды.

3.5. Одиночные инсерции омегона в ДНКA. brasilenseмогут приводить к дефектам в нескольких видах бактериальной подвижности. Механизмы,

посредством которых у A. brasilense регулируется образование того или иного вида двигательных органелл, не известны. Ранее было описано наличие в популяции A. brasilense Sp245 клонов с неустойчивым фенотипом Swa" Gri" (Шелудько, Кацы, 2001). В связи с этим представляет интерес подробное изучение Fla, Laf, Mot и Swa мутантов A. brasilense Sp245, полученных ранее с помощью омегонового мутагенеза (Scheludko et al., 1998).

В настоящей работе использованы не способные к активному плаванию и нероящиеся мутанты A. brasilense Sp245 с leaky фенотипом: leaky Fla'/МоГ штамм SK039 и Fla" leaky Laf" штамм SK586. В отличие от других нероящихся омегоновых мутантов A. brasilense Sp245, имеющих дефекты в жгутиковании, у SK586 не выявляется Swa" Gri+ фенотип.

С помощью ECL-гибридизации по Саузерну гидролизатов тотальной ДНК A. brasilense с ДНК вектора для омегонового мутагенеза pJFF350 (содержащего в составе омегона один 5оЛ-сайт и ни одного £соИ-сайта) в тотальной ДНК мутанта SK586 обнаружены по одному позитивному £coRI фрагменту и по два позитивных Sali-фрагмента (рис. 14).

Негативные результаты гибридизации с вектором pJFF350 нативных плазмид азоспирилл свидетельствуют о локализации омегона в хромосомной ДНК.

Рис. 14. Локализация вставки омегона в ДНК мутанта А brasilense Sp245 leaky Fla~/Mot~ SK586. 1 - фрагменты ДНК фага X; 2 - ДНК pJFF350; 3 - £соМ-фрагменты ДНК Sp245:4 - icoRI-фрагменты ДНК SK586; 5 - &Л-фрагменты ДНК Sp245; 6 - Sfl/I-фрагмеаты ДНК SK586.

Клонирование fcoRI-фрагментов тотальной ДНК мутантов, гибридизующихся с pJFF350, в Е. coli DH1 и физическое картирование полученных рекомбинантных плазмид показали, что, несмотря на множественные дефекты в подвижности, в разных участках генома штаммов SK039 и SK586 содержится по одной копии омегона.

Таким образом, с использованием методов гибридизации, клонирования и физического картирования ДНК показано, что одиночные вставки искусственного транспозона (омегона) в геном A. brasilense Sp245 могут вызывать одновременную блокировку процессов, зависящих от присутствия на клетке двигательных органелл разного типа (полярный и латеральный жгутики, полярный пучок пилей): плавания, роения и распространения бактерий в полужидких средах с образованием микроколоний.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция инсерционных мутантов Azospirillum brasilense Sp245 с фенотипами, соответствующими фазовым вариациям в подвижности штамма дикого типа (ускоренное роение; распространение в полужидком агаре с образованием микроколоний; отсутствие миграции в полужидком агаре), используемая для генетического анализа таких вариаций.

2. Получен набор молекулярных зондов на основе клонированных фрагментов 85- и 120-МДа плазмид A. brasilense Sp245, применяемый для выявления гомологичных последовательностей ДНК и генетических перестроек у других штаммов A. brasilense.

3. Показано, что интеграция в 85-МДа плазмиду A. brasilense Sp245 векторов для инсерционного мутагенеза (pSUP5011 или pJFF35O) приводит к образованию разных продуктов слияния и к появлению изменений в жгутиковании и подвижности бактерий, заключающихся в утрате или обездвиживании полярного и латеральных жгутиков, в ускорении роения.

4. Установлено, что при переходе от движения с образованием микроколоний в полужидком агаре к суперроению у одного из мутантов А. brasilense Sp245 происходят перестройки в плазмидных ДНК, состоящие в исчезновении 85-МДа плазмиды и появлении плазмиды с молекулярной массой 36 МДа.

5. Показано, что плейотропная спонтанная мутация у штамма A. brasilense Sp245.5, заключающаяся в появлении дефектов в трофическом хемотаксисе, синтезе липополисахаридов и связывающих калькофлуор полисахаридов, связана с полной или частичной утратой 85-МДа плазмиды и с изменениями в структуре Ips локусов, сопровождающими образование в клетках нового высокомолекулярного репликона, включившего ДНК 120-МДа плазмиды.

6. Продемонстрирована гомология нуклеотидных последовательностей плазмид типового (Sp7) и модельных (Sp245, Cd) штаммов A. brasilense: p85 из Sp245 и 115-МДа плазмиды из Sp7, с одной стороны; р 120 из Sp245 и 90-МДа плазмиды из Sp7 и Cd, с другой стороны.

7. Установлено, что у близкородственных штаммов A. brasilense Sp7 и Cd, выделенных из разных растений, стабильные различия в морфологии колоний

коррелируют с утратой 115-МДа плазмиды. Использование фрагмента р85 из А. brasilense Sp245 для зондирования геномов азоспирилл позволяет дифференцировать штаммы A. brasilense Sp7 и Cd.

8. Показано, что идентичность повторяющегося звена О-специфических полисахаридов неродственных штаммов A. brasilense Sp245 и SR75 коррелирует с наличием в их плазмидах гомологичных //и-локусов.

9. Выявлено, что одиночные инсерции омегона в ДНК A. brasilense Sp245 могут сопровождаться одновременным нарушением систем подвижности, зависящих от присутствия на клетке двигательных органелл разного типа (полярный и латеральные жгутики, полярный пучок пилей): плавания, роения и распространения в полужидких средах с образованием микроколоний.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Х.Кацы ЕЖ., Борисов И.В., Машкина А.Б., Панасенко В.И. Влияние плазмидного состава на реакции хемотаксиса у ассоциированных со злаками бактерий Azospirillum brasilense Sp245 // Молекуляр. генетика, микробиол. вирусол. - 1994. - № 2. - С. 29-32.

2. Katzy К, Petrova L, Borisov /., Panasenko V. Genetical aspects of indole acetate production in Azospirillum brasilense Sp245 // Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics, Physiology, Ecology / Ed. Fendrik I., Del Gallo M., Vanderleyden J., de Zamaroczy M. - NATO ASI Series G: Ecological Studies. -Berlin: Springer, 1995. - Vol. G37. - P. 113-119.

3. Katzy E., Borisov I., Petrova L Physical and genetic analysis of an 85-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications / Ed. Tikhonovich I., Provorov R, Romanov V., Newton W.E. -Dordrecht: Kluwer, 1995. - P. 247.

А. Кацы ЕЖ, Борисов И.В., Шелудько А.В. Влияние интеграции вектора pJFF35O в 85-МДа плазмиду Azospirillum brasilense Sp245 на жгутикование и подвижность бактерий // Генетика. - 2001. - Т. 37, № 2. - С. 183-189.

Ь.Камнева А.Б., Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько А.В., Панасенко В.И. Комплементационный анализ мутантов ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и S27, дефектных по подвижности и жгутикованию // Генетика. - 2001. - Т. 37, № 2. - С. 190-196.

6. Кацы ЕМ, Борисов И.В., Петрова Л.П., Матора Л.Ю. Использование фрагментов 85- и 120-МДа плазмид Azospirillum brasilense Sp245 для изучения плазмидной перестройки у этих бактерий и для поиска гомологичных последовательностей в плазмидах Azospirillum brasilense Sp7 // Генетика. -2002.-Т. 38, №2.-С. 182-189.

7. Кацы ЕЖ., Камнева А.Б., Борисов И.В. Одиночные инсерции омегона в ДНК Azospirillum brasilense могут приводить к дефектам в нескольких видах бактериальной подвижности // Молекуляр. генетика, микробиол. вирусол. -2004.-№3.-С. 40-41.

%. Katzy E.I., Borisov I. V., Panasenko V.I. Azospirillum brasilense Sp245 plasmid p85: Some aspects of its maintenance in the native surroundings and in

Azospirillum brasilense Sp7 // Abstr. 5th Intern. Workshop Azospirillum & Related Microorganisms. - Hannover, Germany, 1991. - Abstr. Ш-Р8.

9. Katzy E, Brodnikova N, Borisov /., Egorenkov D., Mashkina A., Panasenko V. Genetic analysis of Azospinllum brasilense II Abstr. YIII Eastern Europe Symp. Biol. Nitrogen Fixation "Nitrogenfix'92". - Saratov, Russia, 1992. - P. 32.

10. Mashkina A., Katzy E.I., Borisov I. Analysis of Azospirillum brasilense Sp245 derivatives defective in Chemotaxis // Abstr. VIII Eastern Europe Symp. Biol. Nitrogen Fixation "Nitrogenfix'92". - Saratov, Russia, 1992. - P. 61.

11. Katzy El, Mashkina A.B., Petrova L.P., Borisov I.V., Malinin M.L, Panasenko V.I. Genetical aspects of indole acetate production and Chemotaxis in Azospirillum brasilense Sp245 // Abstr. NATO Advanced Research Workshop Azospirillum & Related Microorg. - Sarvar, Hungary, 1994.

12. Кацы Е.И., Петрова Л.П., Машкина А.Б., Малинин МЛ., Борисов И.В., Панасенко В.И. Генетический анализ ассоциированных со злаками бактерий Azospirillum brasilense Sp245// 9-й Баховский коллоквиум по азотфиксации: Сб. тез. - Пущино: ОНТИ ПНЦ, 1995. - С. 56.

13. Katzy ЕЛ., Borisov I.V. Physical and genetic analysis of an 85-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 // Abstr. 10th Intern. Congr. Nitrogen Fixation. -St. Petersburg, 1995. -N105.

14. Борисов И.В., Кацы Е.И., Шелудъко А.В. Рекомбинация плазмиды р85 штамма Azospirillum brasilense Sp245 с векторами для инсерционного мутагенеза и влияние соответствующих коинтегратов на распространение бактерий в полужидких средах // Сб. тез. школы-конфер. "Горизонты физико-химической биологии". - Пущино, 2000. - Т. 1. - С. 190.

15. Шелудько А.В., Кацы ЕМ, Борисов И.В. Поведение ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense Sp245, характеризующейся смешанным жгутикованием, в полужидких средах // Сб. тез. школы-конфер. "Горизонты физико-химической биологии". - Пущино, 2000. - Т. 1. - С. 214.

16. Katzy ЕЛ., Scheludko A.V., Borisov I.V. Diverse motility organelles mediate social behaviour in the plant-associated bacterium Azospirillum brasilense II Abstr. 13th Intern. Confer. Nitrogen Fixation. - Hamilton, Canada, 2001. - P. 71.

17. Borisov I.V., Petrova L.P., Shelud'ko A.V., Katzy E.I. Genetic analysis of flagellar production and spreading in semiliquid media in the plant-associated bacterium Azospirillum brasilense II The World of Microbes. Abstr. Xth IUMS Intern. Congr. Bacteriol. Appl. Microbiol. -Paris, 2002. - P . 79.

18. KatsyE., Scheludko A., Borisov L Polar bundle-forming pilus formation and behaviour of Azospirillum brasilense in semiliquid media // Abstr. 9th Intern. Symp. Nitrogen Fixation with Non-Legumes. - Leuven, 2002.

19. Борисов И.В., Кацы Е.И. Генетический анализ вариаций в способах распространения Azospirillum brasilense в полужидком агаре // Матер. 1-й регион, конфер. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой". - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2002. - С. 13.

20. Камнева А.Б., Борисов И.В., Шелудько А.В., Кацы Е.И. Физический и комплементационный анализ нероящихся мутантов ассоциированных с растениями бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и S27 // Матер. 1-й регион.

конфер. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой". - Саратов: Изд-во Саратов, ун-та, 2002. - С. 17.

21. Борисов КВ., Кацы Е.И. Коинтеграция вектора pJFF350 с плазмидой р85 Azospirillum brasilense Sp245 // Биология - наука XXI века: 6-я Пущинская школа-конфер. молодых ученых: Сб. тез. - Тула: Изд-во Тул. гос. пед. ун-та им. Л. Толстого, 2002. - Т. 1. - С. 219-220.

22. Шелудько А., Кацы Е., Борисов И., Абрамов А., Скрипаль А. Энергообеспечение вращения полярной флагеллы ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense II Биология - наука XXI века: 6-я Пущинская школа-конфер. молодых ученых: Сб. тез. - Тула: Изд-во Тул. гос. пед. ун-та им. Л. Толстого, 2002. - Т. 3. - С. 75-76.

23. Katsy E.I, Borisov I.V., Petrova L.P., Sheludko A.V. Genetic and phenotypic variability in the populations of Azospirillum brasilense II Molecular Plant-Microbe Interactions: New Bridges between Past and Future. Abstr. Xlth Intern. Congr. Molecular Plant-Microbe Interactions. - St.-Petersburg, 2003. - P. 311.

24. Katsy E.I., Petrova L.P., Sheludko A.V., Borisov I.V., Kamneva A.B., Matveeva E. V., Matora L.Yu., Burygin G.L Properties of the plant-growth promoting rhizobacterium Azospirillum brasilense relevant to colonization of artificial media and wheat roots and to bioremediation // Abstr. Intern. Symp. "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants". - Saratov, 2003. - P. 15-16.

25. Борисов И.В., Петрова Л.П., Кацы Е.И. Участие плазмид в регуляции подвижности полезных ризосферных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 // "Вавиловские чтения-2003" / Матер, межрегион, науч. конфер. молодых ученых и спец-тов системы АПК Приволжского федерального округа. Секция физиологии и защиты растений. - Саратов: ФГОУ ВПО "Саратовский ГАУ", 2003. - С. 27-28.

26. Кацы Е.И., МатораЛ.Ю., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Бурыгин Г.Л., Борисов И.В. Участие плазмид ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense в регуляции образования углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности // Химия и биохимия углеводов. Материалы конференции / III Всероссийская школа-конференция. - Саратов: ООО «Ракурс», 2004. С. 35.

27. Борисов И.В., Петрова Л.П., Овсиенко А.И., Кацы Е.И. Вариации в подвижности Azospirillum brasilense Sp245 и влияние на них корневых эксудатов проростков пшеницы // Матер. 2-й регион, конфер. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой". -Саратов: Изд-во "Научная книга", 2004. - С. 14.

*21 9 5 5

РНБ Русский фонд

2005-4 19302

Подписано в печать 11.11.2004 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Объем 1,0 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 329.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 304645506500043 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Борисов, Игорь Викторович

Условные обозначения и сокращения.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактерии рода АгозртИит как модельный объект в исследовании явления ассоциативности.

1.1.1. Таксономическое положение и краткая характеристика рода и видов азоспирилл.

1.1.2. Основные этапы ассоциативного взаимодействия азоспирилл с растениями. Свойства азоспирилл, важные для позитивного влияния на растения.

1.2. Свойства и функции плазмид азоспирилл.

1.3. Подвижность бактерий.

1.3.1. Строение бактериальных жгутиков, типы жгутикования.

1.3.2. Источники энергии для вращения жгутиков бактерий.

1.3.3. Роение бактерий.

1.3.4. Возможные механизмы хемотактических реакций у бактерий.

1.3.5. Пили IV типа и тянущая подвижность бактерий.

1.4. Фазовые вариации бактерий.

1.4.1. Неправильное спаривание в результате соскальзывания ДНКполимеразного комплекса с коротких нуклеотидных повторов.

1.4.2. Сайт-специфическая рекомбинация.

1.4.3. "Перетасовка" генов.

1.4.4. Фазовые вариации бактерий, затрагивающие систему подвижности.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе.

2.2. Питательные среды и условия выращивания бактерий.

• 2.3. Препаративное выделение плазмид.

2.4. Выделение тотальной ДНК из бактерий.

2.5. Манипуляции с ДНК и блоттинг-гибридизация ДНК.

2.6. Изучение подвижности бактерий.

2.7. Изучение хемотаксиса бактерий.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Типы подвижности штамма A brasilense Sp245 на полужидких средах.

3.1.1. Выявление спонтанных производных A. brasilense Sp245 с повышенной скоростью распространения на полужидких средах.

3.1.2. Выявление условий, индуцирующих распространение A. brasilense Sp245 в полужидкой среде с образованием микроколоний.

3.2. Идентификация и генетическая характеристика мутантов

A. brasilense Sp245 с изменениями в подвижности.

3.2.1. Влияние коинтеграции векторов-"самоубийц" с 85-МДа плазмидой A. brasilense Sp245 на подвижность бактерий в полужидких средах.

3.2.2. Влияние изменения плазмидного состава на поведение

Ф A.brasilense Sp245 в полужидких средах.

3.3. Использование клонированных фрагментов 85- и 120-МДа плазмид A. brasilense Sp245 для поиска гомологичных последовательностей в геномах близкородственных штаммов А. brasilense.

3.3.1. Гибридизационный анализ ДНК штаммов A. brasilense Sp245,

Sp245.5 и Sp7 с использованием клонированных фрагментов 85и 120-МДа плазмид Л. brasilense Sp245.

3.3.1.1. Использование 8.3-тпн фрагмента р120 из плазмиды pOmegonрЕК248Х в качестве зондов для изучения плазмидной перестройки у спонтанного мутанта Л. brasilense Sp245.5 и для поиска гомологичных последовательностей в плазмидах

A.brasilense Sp7.

3.3.1.2. Использование ^¿Л-фрагмента р120, содержащего локусы lps, для изучения плазмидной перестройки у спонтанного Lps мутанта A brasilense Sp245.5 и для поиска гомологичных последовательностей в плазмидах A brasilense Sp7.

3.3.2. Анализ ДНК и ряда культурально-морфологических свойств у близкородственных штаммов A. brasilense Sp7 и Cd.

3.3.2.1. Культурально-морфологические характеристики A. brasilense

Sp7 и Cd.

3.3.2.2. Сравнительный физический анализ ДНК A. brasilense Sp7 и Cd.

3.3.3. Сравнительный анализ ДНК штаммов A. brasilense SR75 и

Sp245. Ill

3.4. Характеристика омегонового мутанта A brasilense Sp245, демонстрирующего распространение в полужидкой среде с образованием микроколоний и расщепление на субпопуляции с образованием роящихся клонов.

3.5. Одиночные инсерции омегона в ДНК A. brasilense могут приводить к дефектам в нескольких видах бактериальной подвижности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический анализ вариаций в подвижности и поверхностных структурах ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense"

Бактерии рода АгоьртИит занимают уникальное положение: типичные представители почвенных микроорганизмов, они способны вступать в ассоциативное взаимодействие с разнообразными растениями (ВазИап, Но^шп, 1997). Необходимость жизни как в скудных по источникам питания условиях почвы, так и в специфичных условиях ассоциации, привела к наличию у этих бактерий широкого спектра адаптационных способностей и, как следствие, к формированию генома большого объема (Martin-Didonet et al., 2000). Необычна система хемотаксиса азоспирилл - энергетический таксис как основа существования в экстремальных и варьирующих почвенных условиях при наличии сложного метаболизма (Alexandre et al., 2000). Необычно разнообразие двигательных органелл (полярный жгутик, многочисленные латеральные жгутики, полярный пучок пилей) и, соответственно, типов подвижности (Шелудько, Кацы, 2001). Наличие необычных фазовых переходов в популяции азоспирилл свидетельствует о существовании тонких механизмов адаптации к конкретным экологическим нишам (Alexandre, Bally, 1999; Шелудько, Кацы, 2001).

Все перечисленное выше, наряду с факторами, важными для взаимодействия с растениями, делает бактерии рода Azospirillum крайне интересным объектом для изучения молекулярных основ адаптационного потенциала почвенных микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы был генетический анализ вариаций в коллективной подвижности и поверхностных структурах (двигательные органеллы, полисахариды) у стимулирующих рост и развитие растений бактерий вида Azospirillum brasilense. В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать лабораторные условия, способствующие стабильному проявлению модельным штаммом A. brasilense Sp245 способности к нескольким видам коллективной подвижности.

2. Идентифицировать мутанты A. brasilense Sp245 с фенотипами, соответствующими определенным фазовым вариациям в подвижности штамма дикого типа.

3. Получить молекулярные зонды на основе фрагментов 85- и 120-МДа плазмид А. ЪгаъИете 8р245, применимые для анализа геномов мутантов и штаммов А. Ьгоб Пете дикого типа.

4. Изучить генетические перестройки, сопровождающие вариации в подвижности и поверхностных структурах А. ЬгаяНете.

5. Исследовать распространенность гомологичных локусов, определяющих подвижность, образование жгутиков и липополисахаридов, в ДНК штаммов А. ЬгазНете 8р245, 8р7, Сё и 81175, выделенных на разных континентах.

6. Картировать вставки инсерционного элемента (омегона) в ДНК двух мутантов А. ЬгаБИете 8р245, имеющих дефекты в разных системах подвижности.

Научная новизна работы. Выделены фенотипические варианты А. ЬгаБИете 8р245, демонстрирующие ускоренное роение ("суперроение"), а также подобраны условия для стабильного проявления этим штаммом способности к распространению в полужидкой среде с образованием микроколоний.

Идентифицированы инсерционные мутанты А. Ьгазйете 8р245 с фенотипами, соответствующими известным на сегодняшний день фазовым вариациям в коллективной подвижности азоспирилл (роение; суперроение; отсутствие миграции в полужидкой среде; распространение с образованием микроколоний).

На примере одного из мутантов А. ЬгавИете 8р245 (ВК759), показано, что переход азоспирилл от распространения с образованием микроколоний к ускоренному роению сопровождается исчезновением 85-МДа репликона и появлением плазмиды с молекулярной массой 36 МДа.

Показано, что процесс образования коинтегратов вектора для омегонового мутагенеза р1РР350 и 85-МДа плазмиды А. ЬгаяНете 8р245 не

4 является сайт-специфичным и приводит к образованию мутантов с разным фенотипом (отсутствие жгутиков; паралич жгутиков или ускоренное роение).

Показано, что одиночные вставки инсерционного элемента (омегона) в ДНК A. brasilense Sp245 могут сопровождаться одновременными дефектами в нескольких системах бактериальной подвижности.

Выявлена дупликация локусов fla/laf/mot/swa, определяющих жгутикование и подвижность A. brasilense Sp245, с локализацией одной из копий в 85-МДа плазмиде, а второй - в ином клеточном репликоне.

Установлено, что появление у спонтанного мутанта A. brasilense Sp245.5 дефектов в трофическом хемотаксисе, липополисахаридах и полисахаридах, связывающих флуоресцентный краситель калькофлуор, коррелирует с генетической перестройкой, приведшей к полной или частичной утрате 85-МДа плазмиды и к включению, по меньшей мере, части 120-МДа плазмиды (при реорганизации локусов lps) в новый мегарепликон.

Показано наличие гомологичных фрагментов ДНК в плазмидах А. brasilense Sp245, Sp7 и Cd. Установлено, что у штамма^, brasilense Sp7 и его производного штамма Cd, выделенных из разных растений, стабильные различия в морфологии колоний коррелируют с утратой 115-МДа плазмиды и ее молекулярного маркера. На модели штаммов A. brasilense Sp7 и Cd показана возможность использования 2.4-тпн iscoRI-фрагмент р85 плазмиды A. brasilense Sp245, несущего локус fla/laf/mot/swa, для дифференциации генетических перестроек, происходящих при пассажах на разных растениях.

Впервые показано присутствие гомологичных lps-локусов в двух плазмидах неродственных штаммов A. brasilense Sp245 и SR75, взаимодействующих с пшеницей в разных географических регионах.

Научно-практическая значимость. Создана коллекция мутантов А. brasilense Sp245, имеющих фенотипы, аналогичные фенотипам фазовых вариантов по коллективной подвижности, используемая в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН для исследования генетикот физиологических механизмов адаптации бактерий к средам разной плотности. Подобрана тест-система для стабильного проявления штаммом А. ЪгавИете 8р245 способности к распространению в полужидкой среде с образованием микроколоний, что позволяет начать изучение генетико-физиологических механизмов названного процесса. Создан набор зондов на основе фрагментов 85- и 120-МДа плазмид А. ЬгаБПете 8р245, применимый для исследования родственных взаимоотношений и функций многочисленных плазмид, обнаруженных у бактерий рода АгозртПит.

Материалы, полученные в диссертации, использованы при выполнении в ИБФРМ РАН плановой темы НИР "Изучение генов азотофиксирующих бактерий, определяющих их взаимодействие со злаками" (№ государственной регистрации 01960001676; руководители - д-р биол. наук Е.И. Кацы; д-р биол. наук, проф. В.И. Панасенко); гранта Президента РФ "Выяснение молекулярно-генетических механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных технологий" для поддержки ведущей научной школы заслуженного деятеля науки РФ, д-ра биол. наук, проф. В.В. Игнатова (НШ-1529.2003.4); гранта РФФИ "Генетический анализ кодируемой плазмидами продукции О-специфических полисахаридов и жгутиков у ассоциативных бактерий АгозртИит ЪгаБИете" (99-04-48034а; руководитель - д-р биол. наук Е.И. Кацы).

Положения, выносимые на защиту.

1. Добавление в полужидкую малатно-солевую среду красителя конго красного (в концентрации 0.004%) способствует стабильному проявлению у штамма А. Ъгавйете 8р245 способности к распространению с образованием микроколоний.

2. Создана коллекция мутантов А. ЬгаБйете 8р245, имеющих фенотип, соответствующий определенным фазовым вариациям в коллективной подвижности штамма дикого типа: суперроение; распространение с образованием микроколоний; отсутствие миграции в полужидком агаре.

3. Использование молекулярных зондов, полученных на основе фрагментов 85- и 120-МДа плазмид А. ЬгаБИете 8р245, позволяет выявлять гомологичные последовательности и перестройки в геноме разных штаммов азоспирилл.

4. Интеграция в 85-МДа плазмиду А. ЬгаБИете 8р245 вектора для инсерционного мутагенеза (р811Р5011 или р1РР350) приводит к образованию разных продуктов слияния и к разнообразным изменениям в жгутиковании и коллективной подвижности бактерий.

5. Переход одного из мутантов А. ЬгаБИете Бр245 от распространения с образованием микроколоний к суперроекию сопровождается перестройками в плазмидных ДНК этого штамма, заключающихся в исчезновении 85-МДа репликона и появлении плазмиды с молекулярной массой 36 МДа.

6. В плазмидах А. ЬгаБИете (р85 из Бр245 и р115 из 8р7, а также в р 120 из Бр245 и р90 из штаммов 8р7 и Сс1) существуют гомологичные локусы, определяющие подвижность, образование жгутиков и полисахаридов.

7. Стабильные различия в морфологии колоний близкородственных штаммов А. ЬгаБИете Бр7 и Сс1, выделенных из разных растений, коррелируют с утратой 115-МДа плазмиды. Использование фрагмента р85 из А. ЬгаБИете 8р245 для зондирования геномов азоспирилл позволяет дифференцировать штаммы А. ЬгаБИете 8р7 и Сс1.

8. В двух плазмидах неродственных штаммов А. ЬгаБИете 8р245 и БЯ75 существуют гомологичные /ря-локусы, что коррелирует с выявленной другими авторами идентичностью повторяющегося звена О-специфических полисахаридов этих штаммов.

9. Одиночные инсерции омегона в ДНК мутантов А. ЬгазНете Бр245 (8К039 и 8К586) сопровождаются появлением дефектов в системах подвижности, зависящих от присутствия на клетке разных двигательных органелл (полярный и латеральные жгутики, полярный пучок пилей): плавания, роения и распространения в полужидких средах с образованием микроколоний.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-м и 6-м Международных совещаниях "Azospirillum and Related Microorganisms" (Ганновер, 1991; Шарвар, 1994), на 8-м Восточноевропейском симпозиуме по биологической фиксации азота (Саратов, 1992), на 9-м Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995), на 10-м Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на 1-м Рабочем совещании микробиологов Поволжья (Саратов, 2000), на 5-й и 6-й Школах-конференциях молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000, 2002), на 10-м Международном конгрессе IUMS The "World of Microbes" (Париж, 2002), на 1-й и 2-й Региональных конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2002, 2004), на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов "Вавиловские чтения-2003" (Саратов, 2003), на 3-й Всероссийской школе-конференции "Химия и биохимия углеводов" (Саратов, 2004), на отчетных научных конференциях Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (Саратов, 1999, 2003, 2004). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 18.10.2004 г., протокол № 155.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Борисов, Игорь Викторович

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция инсерционных мутантов АгоБртИит ЪгаБйете Бр245 с фенотипами, соответствующими фазовым вариациям в подвижности штамма дикого типа (ускоренное роение; распространение в полужидком агаре с образованием микроколоний; отсутствие миграции в полужидком агаре), используемая для генетического анализа таких вариаций.

2. Получен набор молекулярных зондов на основе клонированных фрагментов 85- и 120-МДа плазмид А. ЪгаБйете 8р245, применяемый для выявления гомологичных последовательностей ДНК и генетических перестроек у других штаммов А. ЪгаБПете.

3. Показано, что интеграция в 85-МДа плазмиду А. ЬгаяПете Бр245 векторов для инсерционного мутагенеза (р8ЦР5011 или р1РР350) приводит к образованию разных продуктов слияния и к появлению изменений в жгутиковании и подвижности бактерий, заключающихся в утрате или обездвиживании полярного и латеральных жгутиков, в ускорении роения.

4. Установлено, что при переходе от движения с образованием микроколоний в полужидком агаре к суперроению у одного из .мутантов А. ЬгазИете 8р245 происходят перестройки в плазмидных ДНК, состоящие в исчезновении 85-МДа плазмиды и появлении плазмиды с молекулярной массой 36 МДа.

5. Показано, что плейотропная спонтанная мутация у штамма А. ЬгаБИете 8р245.5, заключающаяся в появлении дефектов в трофическом хемотаксисе, синтезе липополисахаридов и связывающих калькофлуор полисахаридов, связана с полной или частичной утратой 85-МДа плазмиды и с изменениями в структуре локусов, сопровождающими образование в клетках нового высокомолекулярного репликона, включившего ДНК 120-МДа плазмиды.

6. Продемонстрирована гомология нуклеотидных последовательностей плазмид типового (Sp7) и модельных (Sp245, Cd) штаммов A. brasilense: р85 из Sp245 и 115-МДа плазмиды из Sp7, с одной стороны; р120 из Sp245 и 90-МДа плазмиды из Sp7 и Cd, с другой стороны.

7. Установлено, что у близкородственных штаммов A. brasilense Sp7 и Cd, выделенных из разных растений, стабильные различия в морфологии колоний коррелируют с утратой 115-МДа плазмиды. Использование фрагмента р85 из A. brasilense Sp245 для зондирования геномов азоспирилл позволяет дифференцировать штаммы A. brasilense Sp7 и Cd.

8. Показано, что идентичность повторяющегося звена О-специфйческих полисахаридов неродственных штаммов A. brasilense Sp245 и SR75 коррелирует с наличием в их плазмидах гомологичных lps-локусов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактерии рода Azospirillum являются одним из основных модельных объектов в исследованиях молекулярных механизмов явления ассоциативного взаимодействия растений и микроорганизмов. Существование в сложных гетерогенных условиях почвы, смена экологических ниш (почва - ризосфера - растение) требует от азоспирилл богатого набора адаптивных способностей. Действительно, азоспириллы обладают редким среди микроорганизмов набором типов подвижности. Так, на сегодняшний день, у штамма A. brasilense Sp245 и его производных выявлена способность не только к плаванию и роению, но и к распространению с образованием микроколоний. Аналогичное разнообразие способов разрозненного и коллективного движения бактерий описано только у P. aeruginosa (Kohler et al., 2000).

В ходе исследований нами впервые для азоспирилл описаны фазовые вариации в скорости роения на полужидкой среде.

В своей работе мы исследовали те структуры, которые первыми вступают во взаимодействие с окружающей средой и во многом определяют экологический успех микроорганизма: аппарат подвижности и поверхность клетки. Соответственно перед нами встал вопрос об определении генетических детерминант, отвечающих за вариации в экспрессии этих структур.

Для своих исследований мы воспользовались созданной ранее в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН коллекцией мутантов и вариантов A. brasilense по признакам, связанным с поверхностными структурами (морфология колоний, образование экстраклеточных органелл), а также собрали коллекцию мутантов по подвижности, повторяющих фазовые вариации дикого типа. Так, для фенотипа Swa++ (ускоренное роение) штамма дикого типа Sp245 были подобраны в качестве моделей его суперроящиеся омегоновые мутанты ВК570 и ВК759Р. Оказалось, что мутации затронули 85-МДа плазмиду A. brasilense Sp245. У штамма ВК570 произошла коинтеграция вектора-"самоубийцы" с р85, а у ВК759Р -перестройка с исчезновением р85 из плазмидного профиля и появлением новой плазмиды с молекулярной массой 38 МДа. При этом мутации произошли в разных участках генома, что может свидетельствовать о сложности аппарата, отвечающего за регуляцию скорости роения азоспирилл.

Неустойчивому фенотипу Swa" Gri+ (распространение с образованием микроколоний) A. brasilense Sp245 дикого типа соответствует в качестве модели мутант BK759G, распространяющийся в полужидком агаре с образованием микроколоний. На полужидких средах данный мутант периодически дает расщепления с образованием суперроящихся клонов (ВК759Р). Гибридизационный анализ ДНК BK759G и ВК759Р показал наличие генетической перестройки, сопровождающей смену типа движения.

Фенотипу Swa" Gri" (отсутствие распространения в полужидкой среде) А. brasilense Sp245 дикого типа соответствует мутант SK586, у которого вследствие одиночной инсерции омегона произошла блокировка процессов, зависящих от присутствия на клетке двигательных органелл разного типа (полярный и латеральные жгутики, полярный пучок пилей): плавания, роения и распространения в полужидких средах с образованием микроколоний. Данный факт может быть свидетельством наличия единых регуляторных или структурных компонентов, необходимых для обеспечения подвижности разных типов.

Генетический анализ мутантов по подвижности позволил уточнить функции и свойства плазмид A. brasilense Sp245. Так, оказалось, что коинтеграция суицидального вектора с р85 не носит сайт-специфичного характера и способна вызывать разнообразные фенотипические проявления: мутант SK051 лишен полярного и латеральных жгутиков (фенотип Fla" ЬаГ), мутант SK248 имеет парализованный полярный жгутик и не способен к роению (Mot- Swa-), а мутант ВК570 имеет повышенную способность к роению на полужидких средах (фентип Swa++).

Кроме того, в ходе картирования р85 выявлена последовательность, предположительно, являющаяся мобильным элементом. Мобильные элементы часто обуславливают внутригеномные перестройки, что могло бы объяснить поведение р85 как эписомы (Кацы, 20026).

Показано наличие дупликации локусов ßa/laf/mot/swa в ДНК Sp245 с размещением одного локуса на р85, а другого - на хромосомной ДНК.

Созданный в ходе работы набор зондов из фрагментов плазмид А. brasilense Sp245 позволил по новому подойти к анализу имеющегося банка мутантов и диссоциантов азоспирилл.

Так, было показано, что крупная геномная перестройка у мутанта А. brasilense Sp245.5 сопровождается образованием высокомолекулярной плазмиды с реорганизацией р120, происходящей, по-видимому, в результате гомологичной рекомбинации между р120 и другим репликоном и последующей неправильной эксцизии р120 или неточного разрешения коинтеграта (с захватом части ДНК другого репликона). Продемонстрирована элиминация, по крайней мере, участка р85, несущего локусы ßa/laf/mot/swa, у мутанта Sp245.5. Сохранение жгутикования и подвижности дикого типа мутантом Sp245.5 обеспечивается, вероятно, хромосомной копией локусов ßa/laf/mot/swa, что ставит вопрос о взаимодействии двух гомологичных локусов. Интересно, какова функция локуса ßa/laf/mot/swa, находящегося в р85, если все функции подвижности клетки могут быть выполнены хромосомным гомологом?

Получение зондов, содержащих плазмидную ДНК азоспирилл, является сложной задачей, особенно актуальной ввиду того, что плазмиды азоспирилл довольно крупных размеров и не имеют легко различимых маркеров. Получив в руки такой мощный инструмент как молекулярные ДНК-зонды, мы смогли использовать его для установления родства плазмид близкородственных штаммов азоспирилл и для мониторинга генетических перестроек, сопровождающих адаптации азоспирилл к разным условиям среды.

Ранее, по причине несовместимости плазмид, высказывались предположения о родстве между р85 из Sp245 и pi 15 из Sp7 (Кацы, 1992). Использование зондов на основе резидентных плазмид Sp245 позволило нам впервые показать значимую гомологию между р85 и pi 15, а также р120 и р90 из штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7, соответственно.

Культура типового штамма A. brasilense Sp7 расщепляется с образованием форм, различающихся свойствами поверхности - R и S. По имевшимся косвенным данным, в этом процессе принимает участие 115-МДа плазмида (Матвеев с соавт., 1987). Взаимные переходы между R- и S-вариантами достаточно часты и образование стабильной S-формы сопровождается утратой pi 15 из плазмидного профиля (Матвеев с соавт., 1987). Проведенный нами генетический анализ показал, что у штамма Sp7-S произошла интеграция, по меньшей мере, фрагмента pi 15 или всей плазмиды в хромосому.

При взаимодействии микроорганизма и растения происходит селекция форм микроорганизма, наиболее конкурентоспособных при колонизации конкретного вида растений в данных условиях обитания. Штамм A. brasilense Cd был выделен из корней Cynodon dactylon после инокуляции этого растения культурой Sp7 (Eskew et al., 1977; Tarrand et al., 1978). Сам штамм Sp7 был выделен из ризосферы Digitaria decumbens. Вероятно, смена хозяина привела к появлению различий в антигенах клеточной поверхности Sp7 и Cd вследствие адаптации этих бактерий к специфичным условиям взаимодействия с разными хозяевами (Kirchhof et al., 1997). Кроме того, нами было обнаружено повышение устойчивости штамма Cd к катионному поверхностно-активному веществу - цетавлону на средах, способствующих повышенной продукции ЭПС. Также было показано, что на полужидких средах штамм Cd значительно превосходит Sp7 по скорости роения. Данный эффект также можно было бы объяснить повышением продукции ЭПС, играющего роль смазки при движении клеток по полужидкому агару. В результате наших исследований с применением специфических ДНК-зондов генома деривата Sp7 - Cd, были получены данные о, вероятно, истинной элиминации р115 при отсутствии изменений в р90. Штамм Cd на плотной среде формирует колонии S-типа и не расщепляется с образованием R-форм в отличие от Sp7. Возможно, это связано с полной утратой р 115 в ходе адаптации Cd к новому растению-партнеру.

Выше был описан пример, когда смена партнера приводит к адаптации, коррелирующей с генетическими перестройками. Мы также исследовали штаммы A. brasilense, выделенные в отдаленных географических регионах из растения-хозяина одного вида. Так, модельный штамм Sp245 выделен из корней пшеницы в Бразилии, а штамм SR75 изолирован из проростков пшеницы в Саратовской области. Мы проводили гибридизацию плазмид и гидролизатов тотальной ДНК обоих штаммов с фрагментом р120 из штамма Sp245, несущим lps-локус. Прежде всего, необходимо отметить, что плазмидный состав и картина рестрикции тотальной ДНК этих штаммов существенно различались. При этом гибридизация показала, что локусы, гомологичные lps-зонду из р120, находятся в плазмидных ДНК SR75 и, как и у Sp245, представлены более чем в одной копии и диспергированы по разным плазмидным репликонам. Таким образом, продемонстрировано, что за синтез идентичного повторяющегося звена О-ПС у обоих штаммов, по видимому, отвечают гомологичные гены. Вероятно, продукты этих генов играют важную роль во взаимодействии именно с пшеницей как партнером. Возникает вопрос о происхождении гомологичных генов, отвечающих за синтез О-ПС у двух разных штаммов. Геномы обоих штаммов различаются. Достаточно сказать, что попытка найти гомологию у SR75 fla/swa-локусу из р120 штамма Бр245 не увенчалась успехом. Таким образом, возникновение гомологии можно было бы объяснить конвергенцией под действием одинаковых условий селекции или горизонтальным переносом генов, дающих преимущества. Конвергенция признаков широко распространена, но возникновение при этом гомологичных последовательностей вызывает сомнения. Вероятнее всего, гены, дающие качественные преимущества при взаимодействии именно с пшеницей, проникли на американский материк вместе с эндофитами зерна пшеницы. Распространение среди местной популяции азоспирилл, взаимодействующих с новым для них видом -пшеницей, эти гены могли приобрести за счет горизонтального переноса. Для разрешения этого вопроса необходимо секвенирование /ря-локусов обоих штаммов (для подтверждения степени гомологии) и сравнительные исследования бразильских штаммов, взаимодействующими с другими видами растений (для изучения распространенности гомологии). Ответ на этот вопрос смог бы дать возможность судить о скорости и масштабах горизонтального распространения генов бактерий, дающих преимущества во взаимодействии с агрокультурами.

В ходе работы открылись новые перспективы для исследований. Созданный в ходе работы набор молекулярных зондов на основе клонированных фрагментов 85- и 120-МДа плазмид А. ЬгаяИете 8р245 будет в дальнейшем использоваться для исследований фазовых перестроек генома азоспирилл и генетических изменений при адаптациях к разным растениям-партнерам. Коллекция инсерционных мутантов по подвижности позволит найти ответы на вопросы связанные с необычной регуляцией подвижности азоспирилл. Обнаруженная распространенность гомологичных последовательностей в геномах азоспирилл позволит по новому оценить эволюцию их генома и вклад в него горизонтального переноса генов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борисов, Игорь Викторович, Саратов

1. Баканчикова Т.И., Клгшачева В.А., Боровок И.А., Майсурян А.Н. Плазмиды Azospirillum brasilense // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1985. - №. 1. - С. 12-17.

2. Баканчикова Т.И., Лобанок Е.В., Павлова-Иванова JI.K, Редъкина Т.В., Нагапетян Ж.А., Майсурян А.Н. Подавление процесса опухолеобразования у двудольных растений штаммами Azospirillum brasilense И Микробиология. 1993. - Т 62, № 3. - С. 515-523.

3. Кацы Е.И. Изучение плазмид азотофиксирующих ассоциированных со злаками бактерий Azospirillum brasilense II Дисс. канд. биол. наук. Саратов: ВНИПЧИ "Микроб", 1991. - 170 с.

4. Кацы Е.И. Плазмида р85 Azospirillum brasilense Sp245: Изучение круга возможных хозяев и несовместимости с плазмидами Azospirillum brasilense Sp7 11 Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -1992.-№9-10.-С. 8-11.

5. Кацы Е.И. Характеристика генов, выявленных в ДНК 120-МДа плазмиды у мутанта бактерии Azospirillum brasilense Sp245, дефектного по продукции полярного жгутика и роению // Генетика. 2002а. - Т. 38, № 1.-С. 22-32.

6. Кацы Е.И. Свойства и функции плазмид ассоциированных с растениями бактерий рода Azospirillum II Успехи современной биологии. 2002b. - Т. 122, № 4. - С. 353-364.

7. Кацы Е.И., Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Транспозоновый мутагенез, элиминация и мобилизация плазмид азотофиксирующей бактерии Azospirillum brasilense Sp245 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1990. - № 2. - С. 29-32.

8. Кацы Е.И., Шелудъко A.B. Картирование локуса fla в плазмиде с молекулярной массой 120 МДа у бактерии Azospirillum brasilense Sp245 II Генетика. 1999. - Т. 35, № 10. - С. 1367-1372.

9. Коннова С.А. Полисахаридсодержащие биополимеры бактерий рода Azospirillum: разнообразие химического строения и функций: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. М.: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 2003.-42 с.

10. Майсурян А.Н., Баканчикова Т.И., Погосов В.З., Климачева В.А., Боровок И.А. Генетические свойства Azospirillum brasilense II Бюлл. ВНИИСХМ. 1985. - Т. 42, № 1. - С. 51-54.

11. Матвеев В.Ю., Петрова Л.И, Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Особенности диссоциации в культурах Azospirillum brasilense Sp7 II Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. 1987. - № 8. - С. 16-18.

12. Матвеев В.Ю., Петрова Л.П., Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Образование коинтегратов pAS8-1213 и плазмиды Azospirillum brasilense Sp245 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1989. -№7.-С. 8-10.

13. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense II Микробиология. 2003. - Т. 72, № 1. - С. 60-63.

14. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.Ф., Барышева H.H., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология. 1988. - Т. 57, № 2. - С. 275-278.

15. Реймерс Н.Ф. Популярный биологический словарь. М.: Наука, 1991.-536 с.

16. Скворцов И.М. Муцигель и слизь поверхности корней растений // Успехи современной биологии. 1994. - Т. 114, № 3. - С. 372-384.

17. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989. - 564 с.

18. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М.: Наука, 1984. - 472 с.

19. Шелудъко A.B. Получение и характеристика мутантов модельного штамма ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 по продукции и функционированию полярного и латеральных жгутиков: Дис. канд. биол. наук. Саратов: РосНИПЧИ "Микроб", 2000.-115 с.

20. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на клетке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. - Т. 70, №5. - С. 662-667.

21. Adler J. Chemotaxis in bacteria // Science. 1966. - V. 153. - P.709-716.

22. Aizawa S.-I. Bacterial flagella and type III secretion systems // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - 202. - P. 157-164.

23. Aizawa S.-I., Dean C.E., Jones C.J., Macnab R.M., Yamaguchi S. Purification and characterization of the flagellar hook-basal body complex of Salmonella typhimurium // J. Bacteriol. 1985. - V. 161. - P. 836-849.

24. Akhurst R.J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis // J. Gen. Microbiol. 1980. -V. 121.-P. 303-309.

25. Akhurst R.J. Antibiotic activity of Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with insect pathogenic nematodes of the families Heterorhabditidae and Steinernematidae II J. Gen. Microbiol. 1982. - V. 128.-P. 3061-3065.

26. Alam M., Oesterhelt D. Morphology, function and isolation of halobacterial flagella // J. Mol. Biol. 1987. - V. 176. - P. 459-475.

27. Alexandre G., Jacoud C., Faure D., Bally R. Population dynamics of a motile and non-motile Azospirillum lipoferum strain during rice colonization and motility variation in the rhizospere // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. - V. 19.-P. 271-278.

28. Alexandre G., Bally R. Emergence of laccase-positive variant of Azospirillum lipoferum occurs via a two-step phenotype switching process // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 174. - P. 371-378.

29. Alexandre G., Greer S.E., Zhulin I.B. Energy taxis is the dominant behavior in Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 60426048.

30. Allison C., Hughes C. Bacterial swarming as an example of prokariotic differentiation and multicellular behaviour // Sei. Progr. Edinburgh.- 1991.-V. 75.-P. 403-422.

31. Allison C., Lai H-C., Hughes C. Co-ordinate expression of virulence genes during swarm-cell differentiation and population migration of Proteus mirabilis II Mol. Microbiol. 1992. - V. 6. - P. 1583-1591.

32. Allison C., Lai H-C., Gygi D., Hughes C. Cell differentiation of Proteus mirabilis is initiated by glutamine, a specific chemoattractant for swarming cells // Mol. Microbiol. 1993. - V. 8. - P. 53-60.

33. Allmeier H., Cresnar B., Greek M., Schmitt R. Complete nucleotide sequence of Tn 1721: gene organization and a novel gene product with features of a Chemotaxis protein II Gene. 1992. - V. 111. - P. 11 -20.

34. Alm R.A., MattickJ.S. Identification of a gene, pilV, required for type 4 fimbrial biogenesis in Pseudomonas aeruginosa whose product possesses a prepilin-like leader sequence // Mol. Microbiol. 1995. - V. 16. - P. 485-496.

35. Alm R.A., Bodero A. J., Free P.D., MattickJ.S. Identification of a new gene, pilZ, essential for type 4 fimbrial biogenesis in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1996. - V. 1. - P. 46-53.

36. Alm R.A., Mattick J.S. Genes involved in the biogenesis and function of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa II Gene. 1997. - V. 192. - P. 89-98.

37. Ames P., Parkinson J.S. Transmembrane signaling by bacterial chemoreceptors: Escherichia coli transducers with locked signal output // Cell.- 1988.-V. 55.-P. 817-826.

38. Armitage J.P., Macnab R.M. Unidirectional, intermittent rotation of the flagellum of Rhodobacter sphaeroides II J. Bacteriol. — 1987. V. 169. -P. 5765-5770.

39. Armitage J.P., Schmitt R. Bacterial Chemotaxis: Rhodobacter sphaeroides and Sinorhizobium meliloti variations on a theme? // Microbiology. - 1997. - V. 143. - P. 3671-3682.

40. Arnold J. W., Shimkets L.J. Inhibition of cell-cell interactions in Myxococcus xanthus by congo red // J. Bacteriol. 1988. -V. 170. -P. 514518.

41. Atsumi T., McCarter L., Imae Y. Polar and lateral flagellar motors of marine Vibrio are driven by different ion-motive forces // Nature. 1992. - V. 355.-P. 182-184.

42. Bally R., Givaudan A. Mobilization and transfer of Azospirillum lipoferum plasmid by the Tn5-Mob transposon into a plasmid-free Agrobacterium tumefaciens strains // Can. J. Microbiol. 1988. - V. 34. - P. 1354-1357.

43. Barak R, Nur I., Okon Y. Aerotactic response of Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 1982. -V. 52. - P. 643-649

44. Barak R, Nur L, Okon Y. Detection of Chemotaxis in Azospirillum brasilense II J. Appl. Bacteriol. 1983. - V. 54. - P. 399-403.

45. Barbierio C., Zanelli T., Galli E., Zanetti G. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1986. - V. 36. - P. 87-90.

46. Barbieri P., Galli E. Effect on wheat root development of inoculation with an Azospirillum brasilense mutant with altered indole-3-acetic acid production // Res. Microbiol. 1993. - V. 144. - P. 69-75.

47. Bardy S.L., Ng S.Y.M., Jarrell K.F. Procaryotic motility structures // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 295-304.

48. Barton L.L., Johnstone G.V., Miller S.O. The effect of Azospirillum brasilense on iron adsorption and translocation by sorghum // J. Plant Nutr. -1986.-V. 9.-P. 557-565.

49. Bashan Y., Levanovy H., Girma M. Changes in proton efflux of intact wheat roots induced by Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Microbiol. -1989.-V. 39.-P. 691-697.

50. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. — 1997. -V. 43.-P. 103-121.

51. Belas M.R., Colwell R.R. Adsorption kinetics of laterally and polarly flagellated Vibrio II J. Bacteriol. 1982. - V. 156. - P. 1568-1580.

52. Berg D.E. Control of gene expression by a mobile recombinational switch // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1980. - V. 77. - P. 4880-4884.

53. Bergman K., Gulash-Hoffee M., Hovestadt R.E., Larosiliere R.C., Ronco P.G., Su L. Physiology of behavioral mutants of Rhizobium meliloti: Evidence for a dual Chemotaxis pathway // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 3249-3254.

54. Bieber D., Ramer S.W., Wu C.-Y., Murray W.J., Tobe T., Fernandez R., Schoolnik G.K. Type IV pili, transient bacterial aggregates, and virulence of enteropathogenic Escherichia coli II Science. 1998. - V. 289. - P. 21142118.

55. Biek D., Roth J.R. Regulation of Tn5 transposition in Salmonella typhimurium II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1980. - V. 77. - P. 6047-6051.

56. Birkenbihl R.P., Vielmetter W. Complete maps of IS1, IS2, IS3, IS4, IS5, IS30 and IS 150 locations in Escherichia coli K12 // Mol. Gen. Genet. — 1989.-V. 220.-P. 147-153.

57. Boemare N.E., Louis C., Kuhl G. Etude ultrastructurale des cristaux chez Xenorhabdus spp., bacteries infeodees aux nematodes entomophages Steinernematidae et Heterorhabditidae II C. R. Soc. Biol. 1983. - V. 177. -P. 107-115.

58. Boemare N.E., Akhurst R.J. Biochemical and physiological characterization of colony form variants in Xenorhabdus spp. (Enterobacteriaceae) II J. Gen. Microbiol. 1988. - V. 134. - P. 1835-1845.

59. Brehelin M., Cherqui A., Drif L., Luciani J., Akhurst R.J., Boemare N.E. Ultrastructural study of surface components of Xenorhabdus sp. in different cell phases and culture conditions // J. Invertebr. Pathol. 1993. - V. 61.-P. 188-191.

60. Brentjens R.J., Ketterer M., Apicella M.A., Spinola S.M. Fine tangled pili expressed by Haemophilus ducreyi are a novel class of pili I I J. Bacteriol. -1996.-V. 178.-P. 808-816.

61. Brimer C.D., Montie T.C. Cloning and comparison of fliC genes and identification of glycosylation in the flagellin of Pseudomonas aeruginosa atype strain // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 3209-3217.

62. Brumbley S.M., Denny T.P. Cloning of wild-type Pseudomonas solanacearum phcA, a gene that when mutated alters expression of multiple traits that contribute to virulence // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 56775685.

63. Caballero-Mellado J., Lopez-Reyes L., Bustillos-Cristales R. Presence of 16S rRNA genes in multiple replicons in Azospirillum brasilense II FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 178. - P. 283-288.

64. Caetano-Anolles G., Crist-Estes D.K., Bauer W.D. Chemotaxis of Rhizobium meliloti to the plant flavone luteolin requires functional nodulation genes 11 J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 3164-3169.

65. Calos M.P., Miller J.H. Transposable elements // Cell. 1980a. - V. 20.-P. 579-595.

66. Calos M.P., Miller J.H. Molecular consequences of deletion formation mediated by the transposon Tn9 // Nature. 1980b. - V. 285. - P. 38-41.

67. Croes C.L., Moens S., Van Bastelaere E., Vanderleyden J., Michiels K.W. The polar flagellum mediates Azospirillum brasilense adsorption to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1993. - V. 139. - P. 2261-2269.

68. Darzin A. The pilG gene product, required for Pseudomonas aeruginosa pilus production and twitching motility, is homologous to the enteric, single-domain response regulator CheY // J. Bacteriol. 1993. - V. 175.-P. 5934-5944.

69. Darzin A. The Pseudomonas aeruginosa pilK gene encodes a chemotactic methyltransferase (CheR) homologue that is translationally regulated // Mol. Microbiol. 1995. - V. 15. - P. 703-717.

70. Del Gallo M., Negi M., Neyra C.A. Calcofluor- and lectin- binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 3504-3510.

71. Del Gallo M., Fendrik I. The rhizosphere and Azospirillum II Azospirillum / Plant Associations / Ed. Okon Y. Boca Raton: CRC Press, 1994.-P. 57-75.

72. De Mot R., Vanderleyden J. Application of two-dimensional protein analysis for strain fingerprinting and mutant analysis of Azospirillum species // Can. J. Microbiol. 1989. - V. 35. - P. 960-967.

73. DePamphilis M.L., Adler J. Purification of intact flagella from Escherichia coli and Bacillus subtilis II J. Bacteriol. 1971. - V. 105. - P. 376 -407.

74. Dimmitt K., Simon M. Purification and thermal stability of intact Bacillus subtilis flagella // J. Bacteriol. 1971. - V. 105. - P. 369-375.

75. Dobereiner J., De-Polli H. Nitrogen-fixing rhizocoenosis // The Soil / Root System in Relation to Brazilian Agriculture. Parana, 1981. - P. 175198.

76. Dobereiner J. Ten years Azospirillum II Azospirillum III: Genetics, Physiology, Ecology / Ed. Klingmuller W. Berlin: Springer, 1983. - EXS48. — P.9-23.

77. Doig P., Kinsella N., Guerry P., Trust T.J. Characterization of a post-translational modification of Campylobacter flagellin: Identification of a serospecific glycosylation moiety // Mol. Microbil. 1996. - V. 19. - P. 379387.

78. Driks A., Bryan R., Shapiro l, DeRosier D.J. The organization of the Caulobacter crescentus flagellar filament // J. Mol. Biol. 1989. - V. 206. - P. 627-636.

79. Eberl L., Christiansen G., Molin S., Givskov M. Differentiation of Serratia liquefaciens into swarm cells is controlled by the expression of the flhDC master operon // J. Bacteriol. 1996a. - V. 178. - P. 554-559.

80. Eberl L., Molin S., Givskov M. Surface motility of Serratia liquefaciens MG1 // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 1703-1712.

81. Eckert B., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffes M., Hartmann A. Azospirillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2001.-V. 51.-P. 17-26.

82. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria // Plasmid. 1978. - V. 1. - P. 584-588.

83. El-Komy H.M., Abdel-Samad H.M., Hetta A.M., Barakat N.A. Possible roles of nitrogen fixation and mineral uptake induced by rhizobacterial inoculation on salt tolerance of maize // Acta Microbiol Pol. -2004.-V. 53.-P. 53-60.

84. Elmerich C., Franche C. Azospirillum genetics: plasmids, bacteriophages and chromosome mobilisation // Azospirillum Genetics, Physiology, Ecology. Basel: Birkhauser, 1982. P. 9-17.

85. Ely B. Transposition of Tn7 occurs at a single site on the Caulobacter crescentus chromosome // J. Bacteriol. 1982. - V. 151. - P. 1056-1058.

86. Eskew D.L., Focht D.D., Ting I.P. Nitrogen fixation, denitrification, and pleomorphic growth in a highly pigmented Spirillum lipoferum II Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V. 34. - P. 582-585.

87. FalkE.C., Dobereiner J., Johnston J.L., Krieg N.R. Deoxyribonucleic acid homology of Azospirillum amazonense Magalhaes et al. 1984 and emendation of the description of the genus Azospirillum II Intern. J. Syst. Bacteriol. 1985. - V. 35. - P. 117-118.

88. Fallik E., Okon Y, Fischer M. The effect of Azospirillum brasilense inoculation on metabolic enzyme activity in maize root seedlings // Symbiosis. 1988. - V. 6.-P. 17-28.

89. Fedonenko Y.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - V. 337. - P. 869-872.

90. Forest K.T., Tainer J.A. Type-4 pilus-structure: outside to inside and top to bottom a minireview // Gene. - 1997. - V. 192. - P. 165-169.

91. Fuerst J.A., Perry J.W. Demonstration of lipopolysaccharide on sheathed flagella Vibrio cholerae 0:1 by protein A-gold immunoelectron microscopy // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 1488-1494.

92. Furness R.B., Fraser G.M., Hay N.A., Hughes C. Negative feedback from a Proteus class II flagellum export defect to the flhDC master operon controlling cell division and flagellum assembly // J. Bacteriol. 1997. - V. 179.-P. 5585-5588.

93. Geis G., Suerbaum S., Forsthoff B., Leying H., Opferkuch W. Ultrastructure and biochemical studies of the flagellar sheath of Helicobacter pylori II J. Med. Microbiol. 1993. - V. 38. - P. 371-377.

94. Ghosal D., Sommer H., Saedler H. Nucleotide sequence of the transposable DNA-element IS2 // Nucl. Acids Res. 1979. - V. 6. - P. 11111122.

95. Giovanetti L., Ventura S., Bazzicalupo M., Fani R., Materassi R. DNA restriction fingerprint analysis of the soil bacterium Azospirillum II J. Gen. Microbiol.- 1990,-V. 136.-P. 1161-1166.

96. Wl.Giraudo A., Alonso M, Calzolari A. Plasmid content in strains of Azospirillum sp. // Rev. Argent. Microbiol. 1986. - V. 18. - P. 97-103.

97. Givaudan A., Bally R. Melanin production by Azospirillum lipoferum strains // Abstr. 5th Intern. Sympos. N2-Fixation with Non-Legumes. -Florence, 1990.-P. 115.

98. Givaudan A., Bally R. Similarities between large plasmids of Azospirillum lipoferum II FEMS Microbiol Lett. 1991. - V. 78. - P. 245-252.

99. Givaudan A., Baghdiguian S., Lanois A., Boemare N. Swarming and swimming changes with concomitant phase variation in Xenorhabdus nematophilus 11 Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 1408-1413.

100. Givskov M., Eberl L., Christiansen G., Benedik M.J., Molin S. Induction of phospholipase- and flagellar synthesis in Serratia liquefaciens is controlled by expression of the flagellar master operon flhDC II Mol. Microbiol. 1995. - V. 15. - P. 445-454.

101. Glagolev A.N., Skulachev V.P. The proton pump is a molecular engine of motile bacteria // Nature. 1978. - V. 272. - P. 280-282.

102. Gotz R, Limmer N., Ober K., Schmitt R. Motility and chemotaxis in two strains of Rhizobium with complex flagella // J. Gen. Microbiol. 1982. -V. 128.-P. 789-798.

103. Gotz R., Schmitt R. Rhizobium meliloti swims by unidirectional, intermittent rotation of right-handed flagellar helices // J. Bacteriol. 1987. -V. 169.-P. 3146-3150.

104. Gould J., Northcote D.H. Cell-cell recognition of host surfaces by pathogens. The adsorption of maize {Zea mays) root mucilage by surfaces of pathogenic fungi // Biochem. J. 1986. - V. 233. - P. 395-405.

105. Greer-Phillips S.E., Stephens B.B., Alexandre G. An energy taxis transducer promotes root colonization by Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - P. 6595-6604.

106. Guerry P., Aim R.A., Power M.E., Logan S.M., Trust T.J. Role of two flagellin genes in Campylobacter motility II J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 4757-4764.

107. Giindisch C., Baur M., Kirchhof G., Bode W., Hartmann A. Characterization of Azospirillum strains by RFLP and pulsed-field gel electrophoresis // Microb. Releases. 1993. - V. 2. - P. 41-45.

108. Gygi D., Hughes C. A cell-surface polysaccharide that faciltates rapid population migration by differentiated swarm cells of Proteus mirabilis II Mol. Microbiol.- 1995,-V. 17.-P. 1167-1175.

109. Gygi D., Fraser G., Dufour A., Hughes C. A motile but non-swarming mutant of Proteus mirabilis lacks FlgN, a facilitator of flagella filament assembly // Mol. Microbiol. 1997. - V. 25. - P. 597-604.

110. Habermann P., Klaer R., Kuhn S., Starlinger P. IS4 is found between eleven or twelve base pair duplications // Mol. Gen. Genet. 1979. - V. 175. -P. 369-373.

111. Hall P.G., Krieg N.R. Swarming of Azospirillum brasilense on solid media // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - P. 1592-1594.

112. Hallet B. Playing Dr Jekyll and Mr Hyde: combined mechanisms of phase variation in bacteria // Curr. Opin. Microbiol. 2001. - V. 4. - P. 570581.

113. Harayama S., Tsuda M., lino T. Tnl insertion mutagenesis in Escherichia coli K-12 using a temperature-sensitive mutant of plasmid RP4 // Mol. Gen. Genet. 1981. -V. 184. - P. 52-55.

114. Harshey R.M. Bees aren't the only ones: swarming in Gram-negative bacteria // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13. - P. 389-394.

115. Hauwaerts D., Alexandre G., Das S.B., Vanderleyden J., Zhulin LB. A major chemotaxis gene cluster in Azospirillum brasilense and relationships between chemotaxis operons in alpha-proteobacteria // FEMS Microbiol. Lett. -2002.- V. 208.-P. 61-67.

116. Hazelbauer G.L. Bacterial chemoreceptors // Curr. Opin. Struct. Biol. 1992.-V. 2.-P. 505-510.

117. Heinrich D., Hess D. Chemotactic attraction of Azospirillum lipoferum by wheat roots and characterization of some attractants // Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31. - P. 26-31.

118. Henrichsen J. Bacterial surface translocation: a survey and a classification // Bacteriological Reviews. 1972. - V. 36. - P. 478-503.

119. Hess J.F., Oosawa K, Kaplan N., Simon M.I. Phosphorylation of three proteins in the signaling pathway of bacterial chemotaxis // Cell. 1988. -V. 53.-P. 79-87.

120. Heulin T., Bally R., Balandreau J. Isolation of a very efficient N2-fixing bacteria from the rhizosphere of rice // Azospirillum genetics, physiology, ecology. Basel: Birkhauser, 1982. - P. 92-99.

121. Homma M., Kutsukake K, lino T., Yamaguchi S. Hook-associated proteins essential for flagellar filament formation in Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1984. -V. 157. - P. 100-108.

122. Homma M., DeRosier D.J., Macnab R.M. Flagellar hook and hook-associated proteins of Salmonella typhimurium and their relationship to other axial components of the flagellum 11 J. Mol. Biol. 1990a. - V. 213. - P. 819832.

123. Homma M., Kutsukake K., Hasebe M., lino T., Macnab R.M. FlgB, FlgC, FlgF and FlgG. A family of structurally related proteins in the flagellar basal body of Salmonella typhimurium 11 J. Mol. Biol. 1990b. - V. 211. - P. 465-477.

124. Homma M., Oota H., Kojima S., Imae Y. Chemotactic responses to an attractant and a repellent by the polar and lateral flagellar systems Vibrio alginolyticus II Microbilogy. 1996. - V. 142. - P. 2777-2783.

125. Howell-Adams B., Seifert H.S. Molecular models accounting for the gene conversion reactions mediating gonococcal pilin antigenic variation // Mol. Microbiol. 2000. - V. 37. - P. 1146-1158.

126. Hughes K.T., Gillen K.L., Simon M.J., Karlinsey J.E. Sensing structural intermediates in bacterial flagellar assembly by export of a negative regulator // Science. 1993. - V. 262. - P. 1277-1280.

127. Hyde D.R., Tu C.P. Insertion sites and the terminal nucleotide sequences of the Tn4 transposon // Nucl. Acids Res. 1982, - V. 10. - P. 3981-3993.

128. Kato S., Okamoto M., Asakura S. Polymorphic transition of the flagellar polyhook from Escherichia coli and Salmonella typhimurium II J. Mol. Biol. 1984.-V. 173.-P. 463-468.

129. KatzyE.I., Brodnikova N.A., Egorenkov D.A., Panasenko V.I., Ignatov V. V. Anthranilate and indole-3-acetate production in Azospirillum brasilense Sp245 mutant derivatives // Symbiosis. 1992. - V. 13. - P. 147-150.

130. KatzyE.I., Matveev V. Yu., Panasenko V.I. Use ofpSUP5011 for mobilization of Azospirillum brasilense plasmids // Abstr. 7th Intern. Congr. Nitrogen Fixation. Koln / FRG, 1988. - P. 9-59.

131. Katzy E.I., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in production of lipopolysaccharides I I Plasmid. 1998. - V. 40. - P. 73-83.

132. Khurana R., Uversky V.N., Nielsen L., Fink A.L. Is Congo Red an Amyloid-specific Dye? // J. Biol. Chem. Vol. 2001. - V. 276. - P. 2271522721.

133. Kimmel S., Reinhold-HurekB., FendrikI., Niemann E.G. Contribution of Chemotaxis and aerotaxis to the establishment of Azospirillum in the rhizosphere // Symbiosis. 1990. - V. 9. - P. 195-197.

134. Kirchhof G., Schloter M., Assmus B., Hartmann A. Molecular microbial ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes // Soil Biol. Biochem. 1997. -V. 29. - P. 853-862.

135. Kleckner N. Translocatable elements in procaryotes // Cell. 1977. -V. 11.-P. 11-23.

136. Koga T., Ishimoto K., Lory S. Genetic and functional characterization of the gene cluster specifying expression of Pseudomonas aeruginosa pili // Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 1371-1377.

137. Kohler T., Curty L.K., Barja F., van Delden C., Pechere J.-C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 5990-5996.

138. Kostriken R., Morita C, Heffron F. Transposon Tn3 encodes a site-specific recombination system: identification of essential sequences, genes,and actual site of recombination // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1981. - V. 78.-P. 4041-4045.

139. Kostrzynska M., Betts J.D., Austin J.W., Trust T.J. Identification, characterization, and spatial localization of two flagellin species in Helicobacter pylori flagella // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 937-946.

140. Kuo S.C., Koshland D.E., Jr. Roles of cheY and cheZ gene products in controlling flagellar rotation in bacterial Chemotaxis of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1987.-V. 169.-P. 1307-1314.

141. Larsen S.H., Reader R.W., Kort E.N., Tso W.-W., Ader J. Change in direction of flagellar rotation is the basis of the chemotactic response in Escherichia coli II Nature (London). 1974. - V. 249. - P. 74-77.

142. Lawn A.M. Comparison of the flagellins from different flagellar morphotypes of Escherichia coli II J. Gen. Microbiol. 1977. - V. 101. - P. 112-130.

143. YT&.Lengeler J.W., Vogler A.P. Molecular mechanisms of bacterial chemotaxis towards PTS-carbohydrates // FEMS Microbiol. Rev. 1989. - V. 63.-P. 81-92.

144. Levanony H., Bashan Y., Romano B., Klein E. Ultrastructural localization and identification of Azospirillum brasilense Cd on and within wheat root by immuno-gold labeling // Plant Soil. 1989. - V. 117. - P. 207218.

145. Loake G.J., Ashby A.M., Shaw C.H. Attraction of Agrobacterium tumefaciens C58C1 towards sugars involves a highly sensitive chemotaxis system // J. Gen. Microbiol. 1988. - V. 134. - P. 1427-1432.

146. Lopez de Victoria G., Fielder D.R., Zimmer-Faust R.K., Lovell C.R. Motility behavior of Azospirillum species in response to aromatic compounds // Can. J. Microbiol. 1994. - V. 40. - P. 705-711.

147. Lopez de Victoria G., Lovell C.R. Chemotactic behavior of Azospirillum species to aromatic compounds // Appl. Environ. Microbiol. -1993. V. 59. - P. 2951-2955.

148. Losick R., Shapiro L. Checkpoints that couple gene expression to morphogenesis // Science. 1993. - V. 262. - P. 1227-1228.

149. Low D., Braaten B., van der Woude M. Fimbriae //In: Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology / Ed. Neidharts F.C. -Washington: ASM Press, 1996. P. 146-157.

150. Luke C.J., Penn C.W. Identification of a 29 kDa flagellar sheath protein in Helicobacter pylori using a murine monoclonal antibody // Microbiology. 1995. -V. 141. - P. 597-604.

151. Macnab R.M., Aizawa S.-I. Bacterial motility and the bacterial flagellar motor // Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1984. - V. 13. - P. 51-83.

152. Martin P.R., Hobbs M., Free P.D., Jeske Y., Mattick J.S. Characterization of pilQ, a new gene required for the biogenesis of type 4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa // Mol. Microbiol. 1993. - V. 9. - P. 857-868.

153. Martin P.R., Watson A.A., McCaul T.F., Mattick J.S. Characterization of a five gene cluster required for the biogenesis of type 4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa II Mol. Microbiol. 1995. — V. 16. - P. 497-508.

154. Matora L., Sumaroka M., Dykman L., Serebrennikova O., Shchyogolev S. Revealing a cap on the polar flagellum of Azospirillum brasilense Sp245 // Abstr. XHth Intern. Congr. N2-fixation. Parana, Brasil, 1999.-P. 99.

155. Matveev V.Yu., Sen A.N., Panasenko V.I. Plasmid content of Azospirillum strains from cereals // Folia Microbiol. 1988b. - V. 33. - P. 273-276.

156. McBride M.J. Bacterial gliding motility: multiple mechanisms for cell movement over surfaces // Annu. Rev. Microbiol. 2001. - V. 55. - P. 49-75.

157. McCarter L.L., Hilmen M., Silverman M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus II Cell. -1988.-V. 54.-P. 345-351.

158. McCarter L.L. OpaR, a homolog of Vibrio harveyi LuxR, controls opacity of Vibrio parahaemolyticus II J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 31663173.

159. McCarter L.L. The multiple identities of Vibrio parahaemolyticus II J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 181. - P. 51-57.

160. McCarter L.L. Polar flagellar motility of the Vibrionaceae II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - V. 65. - P. 445-462.

161. McCarter L.L., Silverman M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus II J. Bacteriol. 1989. - V. 171. -P. 731-736.

162. McCarter L.L., Wright M.E. Identification of genes encoding components of the swarmer cell flagellar motor and propeller and a sigma factor controlling differentiation of Vibrio parahaemolyticus II J. Bacteriol. -1993.-V. 175.-P. 3361-3371.

163. McClain J., Rollo D.R., Rushing B.G., Bauer C.E. Rhodospirillum centenum utilizes separate motor and switch components to control lateral and polar flagellum rotation // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 2429-2438.

164. Mehrl.J., Seifert H.S. Differential roles of homologous recombination pathways in Neisseria gonorrhoeae pilin antigenic variation, DNA transformation and DNA repair // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 697710.

165. Mendelson N.H., Salhi B. Patterns of reporter gene expression in the phase diagram of Bacillus subtilis colony forms // J. Bacteriol. 1996. - V. 178.-P. 1980-1989.

166. Michiels K., De Troch P., Onyeocha I., Van Gool A., Elmerich C., Vanderleyden J. Plasmid localization and mapping of two Azospirillum brasilense loci that affect exopolysaccharide synthesis // Plasmid. 1989. - V. 21.-P. 142-146.

167. Michiels K., Croes C.L., Vanderleyden J. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1991.-V. 137.-P. 2241-2246.

168. Moens S., Michiels K., Vanderleyden J. Glycosylation of the flagellin of the polar flagellum of Azospirillum brasilense, a Gram-negative nitrogen-fixing bacterium // Microbiology. 1995. - V. 141. - P. 2651-2657.

169. Moens S., Schloter M., Vanderleyden J. Expression of the structural gene, lafl, encoding the flagellin of the lateral flagella in Azospirillum brasilense Sp7 // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 5017-5019.

170. Mori E., Fulchieri M., Indorato C., Fani R., Bazzicalupo M. Cloning, nucleotide sequencing, and expression of the Azospirillum brasilense Ion gene: involvement in iron uptake // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 3440-3446.

171. Moxon E.R., Rainey P.B., Nowak M.A., Lenski R.E. Adaptive evolution of highly mutable in pathogenic bacteria // Curr. Biol. 1994. - V. 4.-P. 24-33.

172. Moxon E.R., Thaler D.S. The tinkerer's evolving tool-box // Nature. -1997.-V. 387.-P. 659-662.

173. Neyra C.A., Hageman R.G. Relationship between carbon dioxide, malate, and nitrate accumulation and reduction in corn (Zea mays L.) seedlings II Plant Physiol. 1976. - V. 58. - P. 726-730.

174. Okino H., Isomura M., Yamaguchi S., Magariyama Y., Kudo S., Aizawa S.-I. Release of flagellar filament-hook-rod complex by a Salmonella typhimurium mutant defective in the M ring of the basal body // J. Bacteriol. -1989.-V. 171.-P. 2075-2082.

175. Okon Y, Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum inoculated roots // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 3-16.

176. Onyeocha I., Vieille C., Zimmer W., Baca B., Flores M., Palacios R., Elmerich C. Physical map and properties of a 90-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp7 // Plasmid. 1990. - V. 23. - P. 169-182.

177. Oiiow J.C.G. Ecology, physiology, and genetics of fimbriae and pili // Annu. Rev. Microbiol. 1993. - V. 29. - P. 79-108.

178. Pacovsky R.S. Metabolic differences in Zea-Glomus-Azospirillum symbioses // Soil Biol. Biochem. 1989. - V. 21. - P. 953-960.

179. Parge H., Forest K.T., Hickey M.J., Christensen D.A., Getzoff E.D., Tainer J.A. Structure of the fibre-forming protein pili at 2.6 A resolution // Nature. 1995. - V. 378. - P. 32-38.

180. Patriquin D.G., Dobereiner J. Light microscopy observation of tetrasolium-reducing bacteria in the endorhyzosphere of maize and other grasses in Brazil // Can. J. Microbiol. 1978. - V. 24. - P. 734-742.

181. Plazinski J., Rolfe B.G. Azospirillum-Rhizobium interaction leading to a plant growth stimulation without nodule formation // Can. J. Microbiol. -1985a.-V. 31.-P. 1026-1030.

182. Plazinski J., Rolfe B.G. Analysis of pectolytic activity of Rhizobium and Azospirillum strains isolated from Trifolium repens II J. Plant Physiol. -1985b.-V. 120.-P. 181-187.

183. Pleier E., Schmitt R. Identification and sequence analysis of two related flagellin genes in Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1989. - V. 171. -P. 1467-1475.

184. Pleier E., Schmitt R. Expression of two Rhizobium meliloti flagellin genes and their contribution to the complex filament structure I I J. Bacteriol. — 1991.-V. 173.-P. 2077-2085.

185. Postma P.W., Lengeier J.W., Jacobson G.R. Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria // Microbiol. Rev. 1993. -V. 57.-P. 543-594.

186. Rak B. Gal mRNA initiated within IS2 // Mol. Gen. Genet. 1976. -V. 149.-P. 135-143.

187. Rashid M.H., Romberg A. Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. - V. 97. - P. 4885-4890.

188. Rauprich O., Matsushita M., Weijer C.J., Siegert F, Esipov S.E., Shapiro J.A. Periodic phenomena in Proteus mirabilis swarm colony development II J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 6525-6538.

189. Redkina T. V. Fungistatic activity of bacteria of the genus Azospirillum 11 Agrokem. Estalajt. 1990. - V. 39. - P. 465-468.

190. Reinhold B., Hurek T., Fendrik I. Strain-specific Chemotaxis of Azospirillum spp. // J. Bacteriol. 1985. - V. 162. - P. 190-195.

191. Richard G.F., Paques F. Mini- and microsatellite expansion: the recombination connection // EMBO Rep. 2000. - V. 1. - P. 122-126.

192. Robinson J.B., Tuovinen O.H., Bauer W.D. Role of divalent cations in the subunit associations of complex flagella from Rhizobium meliloti И J Bacteriol. 1992. - 174. - P. 3896-3902.

193. Rudel Т., Scheurerpflug I., Meyer T.F. Neisseria PilC protein identified as type-4 pilus tip-located adhesin // Nature. 1995. - V. 373. - P. 357-359.

194. Russell M.A., Dazins A. The pilE gene product of Pseudomonas aeruginosa, requred for pilus biogenesis, share amino acid sequence identity with the N-termini of type 4 prepilin proteins // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13.-P. 973-985.

195. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual Second edition. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.-V. 1-3.

196. Sarig S., Blum А., Окоп Y. Improvement of the water status and yield of field-grow grain sorgum {Sorghum bicolor) by inoculation with Azospirillum brasilense II J. Agric. Sci. 1988. - V. 110. -P. 271-277.

197. Azospirillum brasilense Sp7 as antigenic determinants for strain-specific monoclonal antibodies // Microbiology. 1994. - V. 140. - P. 823-828.

198. Shah S., Karhanis V., Desai A. Isolation and characterization of siderophore, with antimicrobial activity, from Azospirillum lipoferum M // Curr. Microbiol. 1992. - V. 25. - P. 347-351.

199. Sheffery M., Newton A. Reconstitution and purification of flagellar filaments from Caulobacter crescentus II J. Bacteriol. 1977. - V. 132. - P. 1027-1030.

200. Shi W., Zhou Y, Wild J., Adler J., Gross C.A. DnaK, DnaJ, and GrpE are required for flagellum synthesis in Escherichia coli II J. Bacteriol. — 1992. -V. 174.-P. 6256-6263.

201. Silverman M, Simon M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility // Nature (London). 1974. - V. 249. - P. 73-74.

202. Silverman M., Simon M. Bacterial flagella // Annu. Rev. Microbiol. -1977.-V. 31.-P. 397-419.

203. Simon R. High frequency mobilization of gram-negative bacterial replicons by the in vivo constructed Tn5-Mob transposon // Mol. Gen. Genet. -1984.-V. 196.-P. 413-420.

204. Simon M.I., Emerson S.U., Shaper J.H., Bernard P.D., Glazer A.N. Classification of Bacillus subtilis flagellins // J. Bacteriol. 1977. - V. 130. -P. 200-204.

205. Singh M, Wenzel W. Detection and characterization of plasmids in Azospirillum I I Azospirillum Genetics, Physiology, Ecology. Basel: Birkhauser, 1982. - P. 44-51.

206. Skorupska A., Brzezinska M., Choma A., Kulinska D., Lorkiewicz Z. Physiological characterization, plasmids and bacteriocinogenicity of Azospirillum II Microbios. 1985. - V. 44. - P. 243-251.

207. Sosinsky G.E., Francis N.R., Stallmeyer M.J.B., DeRosier D.J. Substructure of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium II J. Mol. Biol. 1992.-V. 223. - P.171-184.

208. Soto G.E., Hultgren S.J. Bacterial adhesins: common themes and variations in architecture and assembly // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 1059-1071.

209. Springer W.R., Koshland D.E., Jr. Identification of a protein methyltransferase as the cheR gene product in the bacterial sensing system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74. - P. 533-537.

210. Stock J., Koshland D.E., Jr. A protein methylesterase involved in bacterial sensing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. - P. 36593663.

211. Strom M, Lory S. Structure, function and biogenesis of type IV pili // Annu. Rev. Microbiol. 1993. - V. 47. - P. 565-596.

212. Strom M.S., Nunn D., Lory S. Multiple roles of the pilus biogenesis protein PilD: involvement of PilD in excretion of enzymes from Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 1175-1180.

213. Strom M., Nunn D.N., Lory S. Posttranslational processing of type IV prepilin and homologs by PilD of Pseudomonas aeruginosa II Methods Enzymol. 1994. -V. 235. - P. 527-540.

214. Thanassi D.G., Hultgren S.J. Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane // Curr. Opin. Cell Biol. 2000. -V. 12.-P. 420-430.

215. A.Thomas G.M., Poinar G.O. Xenorhabdus gen. nov., a genus of enthomopathogenic and nematophilic bacteria of the family Enterobacteriaceae II Int. J. Syst. Bacteriol. 1979. - V. 29. - P. 352-360.

216. Thomas-Bauzon D., Weinhard P., Villecourt P., Balandreau J. The spermosphere model: its use in growing, counting, and isolating N2-fixing bacteria from the rhizosphere of rice // Can. J. Microbiol. 1982. - V. 28. -P. 922-928.

217. Thomashow L.S., Rittenberg S.C. Isolation and composition of sheathed flagella from Bdellovibrio bacteriovorus 109J // J. Bacteriol. 1985. -V. 163.-P. 1047-1054.

218. Tien T.M., Diem H.G., Gaskins M.H., Hubell D.H. Polygalacturonic acid transeliminase production by Azospirillum species // Can. J. Microbiol. -1981.-V. 27.-P. 426-431.

219. Tolker-Neilsen T., Christiansen G., Holmstrom K., Eberl L., Rasmussen T.B., Sternberg C., Molin S., Givskov M. Assessment of flhDC mRNA levels in individual Serratia liquefaciens swarm cells // J. Bacteriol. -2000. V. 182. - P. 2680-2686.

220. Tomaskov I.S.y Morgan D.G., DeRosier D.J. Rotational symmetry of the C ring and a mechanism for the flagellar rotary motor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 10134-10139.

221. Tronick S.R., Martinez R.J. Methylation of the flagellin of Salmonella typhimurium // J. Bacteriol. 1971. - V. 105. - P. 211-219.

222. Ueno T., Oosawa K., Aizawa S.-I. M ring, S ring and proximal rod of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium are composed of subunits of a single protein, FliF // J. Mol. Biol. 1992. - V. 227. - P. 672-677.

223. Vanbleu E., Marchal K., Lambrecht M., Mathys J., Vanderleyden J. Annotation of the pRhico plasmid of Azospirillum brasilense reveals its role in determining the outer surface composition // FEMS Microbiol Lett. 2004. -V. 232.-P. 165-172.

224. Van Rhijn P., Vanstockem M., Vanderleyden J., de Mot R. Isolation of behavioral mutants of Azospirillum brasilense by using Tn5lacZ II Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 990-996.

225. Vanstockem M., Michiels K., Maris M., Vanderleyden J., Van Gool A. Developments in the genetic analysis of Azospirillum II In: Mol. Gen. Genet. Plant-Microbe Interact. / Eds. Verma D.P.S., Brisson N. Dordrecht: Martinus Nijhoff, 1987.-P. 313-316.

226. Vieille C., Elmerich C. Characterization of two Azospirillum brasilense Sp7 plasmid genes homologous to Rhizobium meliloti nodPQ II Mol. Plant-Microbe Interact. 1990. - V. 3. - P. 389-400.

227. Walker K.E., Moghaddame-Jafari S., Lockatell C.V., Johnson D., Belas R. ZapA, the IgA-degrading metalloprotease of Proteus mirabilis, is a virulence factor expressed specifically in swarmer cells // Mol. Microbiol. — 1999.-V. 32.-P. 825-836.

228. Wall D., Kaiser D. Type IV pili and cell motility // Mol. Microbiol. -1999.-V. 32.-P. 1-10.

229. Wang A., Dai X., Lu D. The transposition properties of Tn2 in E.coli II Cell. 1980. - V. 21. - P. 251-255.

230. Wei X., Bauer WD. Tn5-induced and spontaneous switching of Sinorhizobium meliloti to faster-swarming behavior // Appl. Environ. Microbiol. 1999. -V. 65. - P. 1228-1235.

231. Whitchurch C.B., Mattick J.S. Characterization of a pilU required for twitching motility but not phage sensitivity in Pseudomonas aeruginosa II Mol. Microbiol. 1994. -V. 13. - P. 1079-1091.

232. Wilson D.R., Beveridge T.J. Bacterial flagellar filaments and their component flagellins // Can. J. Microbiol. 1993. - V. 39. - P. 451-472.

233. Wood A.G., Menezes E.M., Dykstra C., Duggan D.E. Methods to demonstrate the megaplasmids (or minichromosomes) in Azospirillum II Azospirillum Genetics, Physiology, Ecology. / Ed. Klingmuller W. Basel: Birkhauser, 1983.-P. 18-34.

234. Wood C.C., Ritchie R.J., Kennedy I.R. Membrane potential, proton and sodium motive forces in Azospirillum brasilense Sp7-S // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 164. - P. 295-301.

235. Wren B. W. Microbial genome analysis: insights into virulence, host adaptation and evolution II Nat. Rev. Genet. 2000. - V. 1. - P. 30-39.

236. Автор искренне и глубоко благодарен своему научному руководителю д-ру биол. наук Елене Ильиничне Кацы за многолетнюю опеку и терпение. Без постоянного руководства и контроля со стороны Елены Ильиничны данная работа не состоялась бы.

237. Спасибо всем сотрудникам коллектива ИБФРМ РАН за помощь и поддержку в моей работе.

Информация о работе

Борисов, Игорь Викторович
кандидата биологических наук
Саратов, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Генетический анализ вариаций в подвижности и поверхностных структурах ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы