Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения в структуре ДНК у мутантов ассоциативных альфапротеобактерий Azospirillum Brasilense по жгутикованию и социальному поведению

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изменения в структуре ДНК у мутантов ассоциативных альфапротеобактерий Azospirillum Brasilense по жгутикованию и социальному поведению"

005538688

Ковтунов Евгений Анатольевич

ИЗМЕНЕНИЯ В СТРУКТУРЕ ДНК У МУТАНТОВ АССОЦИАТИВНЫХ АЛЬФАПРОТЕОБАКТЕРИЙ А7ЖР1ШЫиМ В1Ы8ИЕЖЕ ПО ЖГУТИКОВАНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ ПОВЕДЕНИЮ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Саратов-2013

005538688

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки "Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов" Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Кацы Елена Ильинична

Официальные оппоненты:

Ерошенко Галина Александровна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, главный научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии

Плешакова Екатерина Владимировна - доктор биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» Министерства образования и науки Российской Федерации, профессор кафедры биохимии и биофизики

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра» Российской академии наук

Защита диссертации состоится «26» декабря 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.

46).

Автореферат разослан « > ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А. А.

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Объект исследования - стимулирующие рост растений почвенные альфапротеобактерии вида Azospirillum brasilense. Эти бактерии обладают разнообразными характеристиками, существенными для взаимовыгодного ассоциативного взаимодействия с растениями: способностью к азотфиксации и денитрификации, синтезу фитогормонов, аэротаксису и хемотаксису, индивидуальной (активное плавание в жидкостях) и социальной (роение или распространение по влажным поверхностям с образованием микроколоний) подвижности, формированию биопленок и др.

Посредством активного передвижения (А. brasilense имеют редко встречающееся смешанное жгутикование), используя межклеточную коммуникацию и микромодификацию внешней среды, азоспириллы заселяют новые территории, в том числе, фотосферу. Эти бактерии распространены в разнообразных климатических поясах и приспособлены как к самостоятельному существованию, так и к формированию ассоциаций с широким кругом растений (Assmus et al., 1995; Bashan, Holguin, 1997; Molina-Favero et al., 2008; Spaepen et al., 2009; Fibach-Paldi et al., 2011; Helman et al., 2011). Достаточно давно известна способность азоспирилл и к существованию в организме человека (см., например, Cohen etal., 2004).

Поэтому не удивительно, что эти бактерии обладают пластичным геномом большого размера (до 8 миллионов пар нуклеотидов), представленным не только одной или более хромосомами, но и многочисленными плазмидами (Martin-Didonet et al., 2000; Кацы, 2002; Петрова с соавт., 2005; Kaneko et al., 2010; Katsy, 2011; Wisniewski-Dye et al., 2011). С использованием разнообразных экспериментальных подходов наиболее хорошо изучены бактерии штаммов А. brasilense Sp7 (типовой) и Sp245 (факультативный эндофит, привлекающий особое внимание в связи со способностью к проникновению в корни пшеницы). Недавно были опубликованы данные о почти полной нуклеотидной последовательности хромосомы и шести плазмид (из семи известных) А. brasilense Sp245 (Wisniewski-Dye et al., 2011) и ряда других штаммов азоспирилл. Однако значительная часть предсказанных генов азоспирилл не имеет гомологов в существующих базах данных; функция лишь 60-67% генов может быть более или менее достоверно предсказана; и лишь очень небольшая фракция этих генов была исследована экспериментально.

В последние годы стало понятно, что бактерии могут собираться в организованные группы, обмениваться информацией, распределять задачи, учиться на прошлом опыте благодаря краткосрочной эпигенетической памяти и совместно выбирать наиболее оптимальные варианты взаимодействия с внешней средой и другими организмами, т.е. вести "социальную" жизнь, ранее считавшуюся привилегией только высших организмов (Ben-Jacob, 2008). Исследования разнообразных проявлений социального поведения микроорганизмов ("ощущение кворума", формирование биопленок, роение, тянущая подвижность и пр.) способствуют развитию нового раздела микробиологии -социомикробиологии (Parsek, Greenberg, 2005).

Одним из факторов, определяющих адаптивные возможности азоспирилл, является их подвижность. Она обеспечивается наличием жгутиков, что позволяет посредством тактических реакций перемещаться к наиболее благоприятным условиям, закрепляться на поверхности высших организмов, в том числе, растений. В жидких средах азоспириллы перемещаются благодаря наличию единственного полярного жгутика. При выращивании на плотных и полужидких средах некоторые виды Azospirillum, в

том числе, A. brasilense, синтезируют многочисленные латеральные жгутики (Tarrand et al., 1978; Hall, Krieg, 1983, 1984; Falk et al., 1985; Khammas et al., 1989; Schloter et al., 1994). Коллективные перемещения микроорганизмов зависят не только от механизмов, обеспечивающих собственно движение, но и от межклеточных контактов, опосредуемых мажорными компонентами клеточной поверхности, продукции сурфактантов и ряда других факторов (Harshey, 2003).

Способность к колонизации корневой системы растений повышается в результате перехода индивидуально движущихся микробных клеток к коллективной миграции (Дебабов, 1999; Олескин с соавт., 2000; Verstraeten et al., 2008). Следствием этого является увеличение приспособляемости бактерий к обитанию в гетерогенных экологических нишах.

При изучении механизмов становления ассоциативного симбиоза нельзя не учитывать наличие особого биологического явления — формирования бактериальных биопленок. Биопленки с дифференцированными клетками бактерий, с гетерогенными микронишами и водными каналами, представляющими примитивную циркуляторную систему, напоминают организацию многоклеточных организмов (Гостев, Сидоренко, 2010). Форма существования микроорганизмов в виде биопленок - это эволюционно выгодный способ надклеточной организации как патогенных, условно-патогенных, так и ассоциативных представителей прокариот.

Перечисленное выше делает бактерии A. brasilense Sp245 интересным объектом для экспериментального изучения молекулярных основ растительно-микробного ассоциативного взаимодействия и социального поведения бактерий. Использование в экспериментальных исследованиях не только штамма дикого типа, но и оригинальных мутантов определенных классов, по-видимому, может способствовать получению новой информации о генетических аспектах социального поведения этих бактерий.

Цель диссертационной работы заключалась в идентификации генетических локусов A. brasilense, мутагенез которых сопровождается существенными изменениями в жгутиковании и социальном поведении бактерий.

В соответствии с поставленной целью в ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Анализ изменений в первичной структуре 85-МДа плазмиды (р85), произошедших в результате ее слияния с вектором для омегонового мутагенеза pJFF350 у производного штамма A. brasilense Sp245 с ускоренным роением.

2. Генетико-физиологическая характеристика нескольких омегоновых мутантов A. brasilense Sp245, имеющих дефекты в образовании полярного и латеральных жгутиков.

3. Мониторинг процесса формирования биопленок на абиотических поверхностях и корнях проростков пшеницы штаммом A. brasilense Sp245 и его мутантами по структуре гликополимеров клеточной поверхности и подвижности.

Научная новизна работы. Охарактеризованы изменения в первичной структуре плазмиды р85 у одного из дериватов штамма A. brasilense Sp245 с ускоренным роением; аннотированы несколько новых генов р85. На примере мутантов A. brasilense SK039 и A. brasilense Sp245.1610 впервые показано, что вставка инсерционного элемента в одну из копий генов липидного обмена, кодирующих 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназу (jnmsB) или 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазу (fabG), не сказываясь на жизнеспособности бактерий, вызывает появление дефектов в жгутиковании и подвижности. На примере мутанта A. brasilense Sp245.1063 впервые описано негативное влияние инактивации лишь одной из копий гена JlhB, кодирующего

компонент жгутикового экспортного аппарата, на сборку жгутиков двух видов -конститутивного полярного и индуцибельных латеральных. Выявлено влияние мутаций в генах flhB, mmsB или fabG на эффективность формирования биопленок A. brasilense Sp245 на гидрофильной и гидрофобной абиотических поверхностях. У деривата А. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой и новым О-полисахаридом обнаружена способность к более активному, по сравнению с родительским штаммом, формированию биопленок на корнях растения-хозяина.

Научно-практическая значимость работы. Инсерционные мутанты А. brasilense Sp245, полученные в настоящей работе, могут быть использованы в новых работах по изучению механизмов регуляции социального поведения азоспирилл. Штаммы А. brasilense Sp245.1063 и A. brasilense Sp245.1610 депонированы в коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН под номерами ШРРМ 521 и ШРРМ 522, соответственно. Представленная в данной работе информация свидетельствует о необходимости более детального исследования вклада ферментов липидного метаболизма и мультисенсорной гибридной гистидинкиназы/регулятора ответа, кодируемой хромосомным локусом AZOBR_150176, в процессы, существенные для успешной сборки жгутиков и обеспечения подвижности А. brasilense Sp245 в средах разной плотности.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Определенные изменения первичной структуры 85-МДа плазмиды штамма Azospirillum brasilense Sp245 в результате интеграции чужеродной ДНК приводят к ускорению роения бактерий.

2. Инактивация только одной из копий гена flhB, кодирующего компонент жгутикового экспортного аппарата, у бактерий А. brasilense Sp245 может сопровождаться дефектами в образовании и конститутивного полярного жгутика, и индуцибельных латеральных жгутиков.

3. Вставка инсерционного элемента только в одну из копий генов ферментов липидного обмена 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы (mmsB) и 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазы (fabG) может приводить к дефектам в подвижности и жгутикованин А. brasilense Sp245.

4. У дефектных по жгутиковой подвижности flhB, mmsB или fabG мутантов A. brasilense Sp245 модифицирована способность к формированию биопленок на гидрофобных и гидрофильных абиотических поверхностях.

5. Спонтанное изменение химической структуры О-полисахарида А. brasilense Sp245 оказывает позитивное влияние на процесс формирования биопленок азоспирилл на корнях проростков пшеницы.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в рамках трех плановых тем НИР: "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense" (№ госрегистрации 01200606181), "Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями" (№ госрегистрации 01200904390) и "Генетический анализ социального поведения альфапротеобактерий Azospirillum brasilense" (№ госрегистрации 01201359055) (научный руководитель - д.б.н. проф. Е.И. Кацы). Исследования частично поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований 06-04-48204-а, 12-04-00262-а (руководитель - д.б.н. проф. Е.И. Кацы) и 13-04-01276-а (руководитель - к.б.н. Л.П. Петрова).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.

Отдельные эксперименты выполнялись при участии коллег из ИБФРМ РАН: д.б.н. проф. Е.И. Кацы, к.б.н. Л.П. Петровой, д.б.н. А.В. Шелудько, к.б.н. М.П. Чернышовой, к.б.н. Ю.А. Филипьечевой, Е.М. Телешевой, д.б.н. О.И. Соколова, к.б.н. М.К. Соколовой и К.Х.Н. A.M. Бурова. Секвенирование ДНК выполнено в лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ под руководством к.б.н. А.Г. Прилипова. Автор признателен всем коллегам за помощь в работе.

Апробация работы. Сделаны доклады на IV Межрегиональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008); V и VI Всероссийских конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2010, 2012); III, IV и VI Всероссийских с международным участием конгрессах студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия 2010" (Нижний Новгород, 2010), "Симбиоз-Россия 2011" (Воронеж, 2011; присужден Диплом оргкомитета конгресса за лучший доклад (1-е место) в подсекции "Микробиология") и "Симбиоз-Россия 2013" (Иркутск, 2013; присужден Диплом оргкомитета конгресса за лучший доклад (2-е место) в секции "Микробиология и биотехнология"; объявлена Благодарность оргкомитета конгресса за активное участие и большое количество заданных вопросов), VH Молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2011) и научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва-Пущино, 2011; присужден Диплом лауреата конкурса молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 18.09.2013, протокол № 196.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе, 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 21 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 256 источников, из них 55 на русском и 201 на английском и немецком языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы дана краткая характеристика ассоциативного растительно-микробного взаимодействия и бактерий рода Azospirillum; основных гликополимеров поверхности бактериальной клетки; структуры бактериальных жгутиков и социального поведения бактерий.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы бактерии штамма A. brasilense Sp245 дикого типа (Baldani et al., 1983) и восемь его мутантов по образованию липополисахаридов (ЛПС, Lps), полисахаридов, связывающих калькофлуор (ПССК; Cal), полярного (Fla) и латеральных (Laf) жгутиков, плаванию (Mot) и роению (Swa): Lpsl"" LpsII" Ca ГА. brasilense Sp245.5 (Петрова, 1998); Lpsir СаГ Mot" Swa" KM018, Lpsir KM139 и Lpsl" Cal" KM252 (Katzy et al, 1998); Swa++ BK570 (Кацы с соавт., 2001); leaky FlaTMot" Swa" SK039 (Scheludko ei ah, 1998); Fla" LaF Sp245.1063 и leaky FlaTMot" Laf Sp245.1610 (получены в данной работе); три штамма Escherichia coli и семь плазмид, две из которых, pOmegon-Km-Sp245.1063E и pOmegon-Km-Sp245.161ОЕ, сконструированы в данной работе. У деривата А. brasilense Sp245.5 (Петрова, 1998) спонтанная утрата 85-МДа (р85) и 120-МДа (р120) плазмид при одновременном образовании новой мегаплазмиды коррелировала с коренными преобразованиями в синтезе ЛПС и ПССК (Кацы с соавт., 2002). СаГ-штамм А. brasilense Sp245 одновременно синтезирует LpsI, несущий кислый олигосахарид кора/О-специфический полисахарид (ОПС), и LpsII, содержащий нейтральный олигосахарид кора/ОПС. При этом ОПС LpsI и LpsII - гомополимер, состоящий из остатков D-рамнозы. ОПС мутантного штамма построен из дисахаридных повторяющихся звеньев Л^ацетил-Д-галактозамина и Лг-ацетил-.0-маннозаминуроновой кислоты (Федоненко с соавт., 2010). Культуры А. brasilense выращивали при 28-30°С на малатно-солевой среде (Döbereiner, Day, 1976) с NH4CI (1 г/л) (MSM) или среде LB (Sambrook et al, 1989); Е. coli - на LB при 37°С.

Ппазмидный состав бактерий анализировали с использованием метода Eckhardt (1978). Препаративное выделение, анализ и клонирование ДНК выполняли с использованием стандартных методик (Sambrook et al., 1989). Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием алгоритмов BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) и Fasta (http://www.ebi.ac.uk/fasta33). Положение инициирующих кодонов в открытых рамках считывания (otf) определяли в соответствии с расстоянием от предсказанных последовательностей Шайн-Дальгарно и по результатам выравнивания соответствующих аминокислотных последовательностей со сходными белками из баз данных. Свойства белковых продуктов otf изучали с помощью инструментов, представленных на серверах Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk), PSORTb (http://www.psort.org/psortb), ProDom (http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html), PredictProtein (http://www.predictprotein.org), SMART (http://smart.embl-heidelberg.de), SUPERFAMILY (http://supfam.org/SUPERFAAlILY/hmm.html), SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop) и SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP).

Подвижность бактерий оценивали при двух различных условиях выращивания: в жидкой и полужидкой, содержащей 0.4-0.5% Bacto агара, MSM. Через 18 ч роста азоспирилл в жидкой среде готовили препарат "висячая капля" на предметном стекле. Предметные стекла просматривали в просвечивающий световой микроскоп Jenaval (Jena, Германия). Оценивали подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа. Для определения скорости и траектории движения клеток проводили видеозапись при световой микроскопии препаратов жидких бактериальных культур. Видеофайлы анализировали способом, описанным ранее (Шелудько с соавт., 2006). В полужидкий агар бактериальные клетки вносили уколом петлей, инкубировали при 30°С, через 24 и 48 ч инкубации измеряли диаметр макроколоний. Когда какой-либо из исследованных штаммов не роился или образовывал маленькие зоны роения (макроколонии), инкубационный период пролонгировали до 72 ч (для большей уверенности в

мутантном фенотипе). Клетки неподвижных клонов анализировали с использованием просвечивающей электронной микроскопии.

Способность бактерий к формированию биопленок изучали согласно рекомендациям, приведенным в работе (Ferriere, Clarke, 2003). Использовали температуру (28°С), время инкубации (6 суток) и питательную среду (LB), оптимальные для формирования прочно закрепленных на границе между жидкостью и твердой гидрофильной или гидрофобной поверхностью биопленок бактерий A. brasilense дикого типа (Шелудько с соавт., 2008). Ночные культуры бактерий в LB разводили стерильной средой в 100 раз, вносили суспензии в ячейки полистирольных планшетов с 96 лунками (по 200 мкл) или 5-мл стеклянные пробирки (по 1 мл) и инкубировали без встряхивания при 28°С в течение 6 суток. Планктонные бактерии удаляли аспирацией, ячейки планшетов или пробирки осторожно промывали водой, добавляли соответствующий объем 1% водного раствора красителя кристаллического фиолетового, инкубировали при комнатной температуре 10 мин, удаляли раствор и осторожно промывали планшеты и пробирки водой. Для оценки биомассы бактерий связавшийся с биопленками краситель растворяли в 200 мкл (в лунке планшета) или 2.5 мл (в пробирке) смеси ацетон:этанол (20 мл:80 мл) и измеряли оптическую плотность раствора при А590 в планшетах (на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С) и пробирках (на фотоколориметре КФК-2).

Для изучения бактериальной колонизации корней проростков пшеницы использовали семена мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum сорта Саратовская 29), любезно предоставленные сотрудниками НИИ сельского хозяйства Юго-Востока РАСХН (Саратов). Стерильные трехдневные проростки пшеницы получали в соответствии с рекомендациями, описанными в работе (Yegorenkova el al., 2001). Перед проращиванием зерновки последовательно промывали в 0.5% растворе додецилсульфата натрия и водопроводной воде; стерилизовали с поверхности, выдерживая в 70% этаноле 3 мин; промывали стерильной дистиллированной водой; погружали на 3 мин в раствор [этанолмеркурхлорид (330 мг/л) + цетилпиридиний хлорид (660 мг/л)]. Простерилизованные семена, тщательно отмытые стерильной дистиллированной водой, проращивали в темноте на плотной MSM при 28°С в течение трех суток. Для культивирования проростков пшеницы использовали среду для выращивания растений (Sigma Cell Culture Catalogue, 1994) следующего состава (г/л): КН2РО4 - 4, СаС12 - 1.25, Н3ВО3 - 0.0016, CuS04 х 5НгО - 0.028, MgS04 - 0.09, Na2Mo04 х 2Н20 - 0.0025, KJ - 0.008, ZnS04 - 0.015, FeS04 * 7Н20 - 0.028, EDTA Na2 -0.037 (pH 6.0).

Инокуляцию пшеницы проводили, замачивая проростки при покачивании с частотой 25 об/мин в суспензии отмытых 50 мМ фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (рН 7.0) бактерий (А59о=0.5), выращенных в жидкой MSM. Через 3 ч проростки переносили в стерильный ФСБ и однократно отмывали. Затем помещали их над слоем жидкости в пробирки, содержащие 15 от среды для выращивания растений. Далее культивировали в течение 7 дней при комнатной температуре и естественном освещении.

Трех- или 10-суточные проростки переносили в стерильный ФСБ, однократно отмывали (5 мин), у трех растений отделяли корни, которые затем гомогенизировали в ФСБ. Гомогенат использовали для определения численности бактерий методом подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ). При определении КОЕ из каждой пробы готовили два параллельных ряда разведений. Высевы приводили на плотную MSM, в которую при необходимости добавляли канамицин. Для контроля

наличия посторонней микрофлоры на корнях параллельно высевы проводили на среду LB с канамицином и без него. Количество бактерий, высеваемых с корней, пересчитывали на одно растение. Во всех случаях проводили не менее девяти независимых экспериментов.

Распределение бактериальных клеток и образование биопленок на поверхности корней исследовали с использованием фазово-контрастного микроскопа Jenaval (Jena, Германия) и флуоресцентного микроскопа DMLB (Leica, Германия). Образование бактериальных агрегатов на кончиках корневых волосков оценивали в четырех независимых экспериментах при микроскопии корней, определяя процент корневых волосков с клеточными агрегатами на верхушке от общего числа волосков на 50-90 произвольно выбранных участках корня.

Для конфокальной сканирующей лазерной микроскопии корни 14-тидневных проростков пшеницы фиксировали в растворе 4% формальдегида в течение 3-х часов. Блокировку неспецифических сайтов связывания на корнях проводили в течение 4-х ч в ФСБ, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.02% Твин-20 (pH 7.0). После этого корни инкубировали в течение ночи при 4°С в растворе фаговых миниантител к поверхностным антигенам A. brasilense Sp245 и отмывали в ФСБ (pH 7.0). Миниантитела, полученные к поверхностным антигенам А. brasilense Sp245 с использованием комбинаторной фаговой библиотеки антител овцы (Griffin. 1, Великобритания), были любезно предоставлены коллегами из лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН (Dykman et al., 2012). Вторичное мечение проводили в течение 4-х ч антифаговыми кроличьими антителами, после чего корни опять отмывали в ФСБ, pH 7.0. Окончательную окраску осуществляли ослиными антикроличьими антителами, меченными Alexa Fluor 594 (Molecular probes, США). Отмывали препараты в ФСБ, pH 7.0.

При приготовлении препаратов для просвечивающей электронной микроскопии использовали сеточки с формваровой подложкой. Сеточку помещали на поверхность капли (20 мкл) суспензии бактерий. Через 20 мин сеточку снимали и фиксировали прикрепившиеся клетки высушиванием на воздухе. Зафиксированные клетки контрастировали раствором уранил ацетата (2%). Готовые препараты просматривали на просвечивающем электронном микроскопе LIBRA 120 (Германия) при ускоряющем напряжении 120 кВ.

Экстракцию суммарных клеточных липидов азоспирилл проводили стандартным методом (Методы общей бактериологии, 1984). Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) из экстрактов анализировали на газовом хроматографе Shimadzu GC-2010 (Shimadzu, Япония) с использованием колонки Equity-1 (Supelco, США). Идентифицировали жирные кислоты (ЖК) по бактериальному стандарту метиловых эфиров жирных кислот. Относительное содержание определенных МЭЖК в препаратах выражали в процентах от суммы площадей пиков всех МЭЖК, обнаруженных хроматографически. Метилирование проводили по методу, описанному в работе (Mayer et al., 1985).

Все количественные результаты были получены в нескольких повторностях, по меньшей мере, в 4-х, а, как правило, в семи-девяти независимых экспериментах и подвергнуты статистической обработке с использованием пакета Microsoft Office Excel 2010. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика кодирующих последовательностей р85, прилегающих к месту вставки вектора pJFF350 у мутанта A. brasilense ВК570 с ускоренным роением.

Ранее были получены производные A. brasilense Sp245, содержащие коинтеграт p85::pJFF350, мигрирующие в полужидких средах примерно в 2.5 раза быстрее родительского штамма (Swa^ мутант ВК570) (рис. 1) или утратившие способность к роению (Swa~ мутанты leaky Fla" Laf SK051 и Mot" SK248) (Кацы с соавт,, 2001). В отличие от производных Л. brasilense SK051 и SK248, мутант ВК570 после слияния р85

с pJFF350 сохранил жгутикование дикого типа (Кацы с -, соавг., 2001).

Рис. 1. Колонии, сформированные клетками A. brasilense Sp245 (а) и его Swa" мутанта ВК570 (б). Концентрация агара в среде 0.4%, время инкубации 48 ч. Масштабная линейка > '"i^'ii, соответствует 10 мм.

Слияние плазмид р85 и вектора для омегонового мутагенеза pJFF350 в клетках мутантов SK051/SK248 и ВК570 опосредовано IS-элементами р85 ISAzbal и ISAzba3, соответственно (Katsy, Prilipov, 2009).

В данной работе в результате анализа ДНК р85, прилегающей к месту слияния с pJFF350 у мутанта ВК570, кроме ISAzba3, гена фаговой интегразы int и orf246, кодирующей консервативный гипотетический белок (Katsy, Prilipov, 2009), выявлены еще четыре orf со свойствами кодирующих последовательностей (рис. 2).

Рис. 2. Физико-генетическая карта Л7го1-фрагмента плазмиды р85 штамма А. ЬгазИете 8р245, интеграция в который вектора рОТЭбО (Ре11ау еГ а1., 1989) привела к изменениям в подвижности бактерий. Открытые рамки считывания и направление их транскрипции обозначены стрелками. Цифры в названиях ог/ соответствуют количеству аминокислотных остатков в предсказанных продуктах трансляции {оф35х начинается, а ог/119х заканчивается за пределами секвенированного фрагмента р85). Над картой показаны изменения в структуре р85 после ее слияния с ДНК рЛТ350 (серый прямоугольник), опосредованного К-элементом р85 ВАгЬаЗ. Кроме 3.8-тпн омегона-Кт и опУ из рВЯ325, в состав рЛТ350 входят опТ (серый ромб на схеме) и нетранспозируемый Ш* (белый ромб). В скобках приведено название мутанта А. ЪгавИете 8р245. несущего коинтеграт р85::р1РР350. Сайты рестрикции: X - ХкоЬ Е - ЕсоМ. Масштабная линейка соответствует 1 т.п.н.

Две из идентифицированных о//, неполная ог/135х и оф145, кодируют консервативные гипотетические белки. Еще две, оф19, прилегающая к месту слияния р85 с рЛ*Р350, и соседняя с ней оф19х, на наш взгляд, представляют наибольший интерес для последующего экспериментального изучения.

По результатам РэоПВ анализа (http://www.psort.org/psortb) предсказанный продукт трансляции оф!9 локализован за пределами цитоплазмы - в цитоплазматической

предсказанный гомолог 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы и других дегидрогеназ 3-гидроксикислот (ферменты липидного обмена) (рис. 4).

оттх от з <м??б ши

C«43S0S4. 00©01Ш.

a-rs^^çtiHsaSjnspsTAWiW^wa» Пмйюдеизмиаяа -трдаедукг«^ «пят»

» родственные

Рис. 4. Схема сегмента хромосомной ДНК бактерий штамма A. brasilense Sp245, омегоновый мутагенез которого привел к появлению leaky Fla7Mot" Swa" мутанта A. brasilense SK039. Открытые рамки считывания и направление их транскрипции обозначены стрелками. Цифры в названиях orf соответствуют количеству аминокислотных остатков в предсказанных продуктах трансляции (orfl56x начинается за границей клонированной и секвенированной ДНК). Возможные функции белковых продуктов orf приведены на схеме. Место инсерции омегона (£2) в orf293 (mmsB) у мутанта A. brasilense SK039 показано перевернутым треугольником.

С использованием алгоритма BLASTn было установлено, что в рекомбинантной плазмиде pOmegon-Km-SK039E (GenBank accession nos GQ168586-GQ168588, HM776586, HM776587) клонирован £соШ-фрагмент хромосомы Sp245 с координатами 2561173-2568444 (GenBank accession no. НЕ577327). Однако в нуклеотидной последовательности, депонированной в GenBank под номером НЕ577327, в позиции 2565187, 2565236 и 2567540 есть вставка "лишнего" G, С и С, соответственно. В связи с этим обстоятельством зарубежные коллеги описали псевдогены AZOBR_l 80076 и AZOBR_l 80077 вместо выявленной нами мембранной гибридной сенсорной гистидинкиназы/регулятора ответа (GenBank accession nos. GQ168588) и только фрагмент гена mmsB (в их обозначении - AZOBR_l 80080) вместо полной orf293 (mmsB) (GenBank accession no. HM776586).

В pOmegon-Km-SK039E омегон встроился за 479-м нуклеотидным остатком orf293/mmsB с дупликацией 9 п.н. (5-TAGCAGGCC-3). Таким образом, вставка омегона (имеющего длину 3.8 т.п.н.) локализуется примерно в середине orf293 (mmsB), и расчетная длина мутантного полипептида составляет 159 аминокислотных остатков вместо 293. Так как направление транскрипции orf293 и ближайших к ней orf не совпадает, возможный полярный эффект инсерции омегона на экспрессию генов предсказанной FAD/FMN-дегидрогеназы (orfl56x) и консервативного гипотетического белка (orf076) нами не рассматривался.

Предшественниками ряда ЖК (в том числе, гидроксиизобутирата) являются разветвленные аминокислоты валин, изолейцин и лейцин. Деградация этих аминокислот (АК) и ЖК используется многими протеобактериями для выработки энергии. Было проведено сравнение способности штаммов A. brasilense Sp245 и SK039 к использованию разветвленных АК в качестве единственного источника азота и/или углерода и энергии. В результате обнаружены межштаммовые различия в ответе A. brasilense на разветвленные АК при культивировании бактерий в жидких средах с аэрацией. Так, рост мутанта SK039 на среде с валином в качестве единственного

источника углерода или лейцина в качестве источника N и (или) С был подавлен существенно сильнее, чем у Sp245. На среде с валином или изолейцином в качестве единственного источника С и N наблюдалась обратная картина. На плотных средах через 36 ч инкубации количество колоний на средах с АК не отличалось от этого показателя на среде с малатом и азотом, но на полужидких средах с АК (вместо малата) колонии были мельче.

Ранее была выявлена связь между ЖК профилем клеток некоторых грамотрицательных бактерий и их способностью к роению (возможно, из-за вариаций в текучести клеточных мембран). Жирные кислоты могут также выполнять функцию межклеточных сигналов коммуникации и входить в состав биосурфактантов, способствующих передвижению бактерий по поверхностям (Lindum et al., 1998; Lai et al., 2005; Huang et al., 2007). Нами была предпринята попытка выявления возможных различий в ЖК составе клеток A. brasilense Sp245 и SK039, выращенных на жидких или плотных, бедной (MSM) или богатой (LB) средах. С использованием газо-жидкостной хроматографии МЭЖК установлено, что качественный состав ЖК у исследованных штаммов одинаков. Характерными ЖК для азоспирилл (независимо от состава/типа среды) оказались элаидиновая (транс-9-октадекановая кислота), пальмитолеиновая (цис-9-гексадеценовая кислота) и пальмитиновая (гексадекановая) кислоты. Однако были выявлены небольшие различия в относительном содержании некоторых ЖК в экстрактах клеток A. brasilense Sp245 и SK039. Так, в клетках штаммов Sp245/SK039, цис-9-гексадеценовая и октадекановая (стеариновая) кислоты составляли соответственно 18.7/13.0% и 3.1/6.3% при культивировании бактерий в жидкой бедной среде MSM и 11.4/7.7% и 2.8/4.8% - в богатой среде LB. Вероятно, появление дефектов в жгутиковании и подвижности мутанта A. brasilense SK039 связано с трудно детектируемыми изменениями в липидном метаболизме клеток и ЖК составе клеточных мембран.

Получение и характеристика новых омегоновых мутантов A. brasilense Sp245 с изменениями в социальной подвижности. Для более детального изучения вклада отдельных генов в реализацию подвижности азоспирилл мы получили новых омегоновых мутантов Sp245 с использованием случайного омегонового мутагенеза Sp245 посредством скрещивания азоспирилл с донорным штаммом Е. coli S17-1 (pJFF350). Частота возникновения трансконъюгантов составила 8.4 х 10~7 по отношению к количеству реципиентных клеток в коньюгационной смеси. Частота возникновения спонтанных KmR клонов азоспирилл была ниже 10~9. Полученные 1714 KmR эксконъюгантов А. brasilense Sp245 проанализировали на способность к плаванию в жидкой среде и роению на полужидких средах. Количество клонов, образовывавших макроколонии меньшего (5 мм), чем в случае дикого типа (-20 мм), диаметра составило 5.6%. Колонии, сформированные клетками мутанта Sp245.1610, инокулированного уколом в среды, содержащие 0.4% Bacto агара, в отличие от роящихся бактерий штамма Sp245, остаются на месте укола. Штамм Sp245.1063 образует зернистые зоны распространения, так же, как и полученный ранее мутант SK039 (рис. 5).

Сравнительный электронно-микроскопический анализ клеток штаммов А. brasilense Sp245 и Sp245.1063 выявил у мутанта полную утрату способности к образованию латеральных жгутиков и существенные дефекты в продукции полярного (рис. 6). До 90% клеток мутанта Sp245.1063 из культур, выращенных в жидких (18 ч) или на

плотных (42 ч) средах, лишены Fla; около 10% клеток несут очень короткую полярную органеллу.

Рис 5. Вид колоний штамма А. brasüense Sp245 (1) и его мутантов Sp245.i610 (2), SK039 (3) и Sp245.1063 (4) на полужидких (0.4% агара) средах MSM (верхний ряд) и LB (нижний ряд). Время инкубации 72 ч. Масштабная линейка соответствует 10 мм.

ÊÊ

% шЁмЁЁк-

Рис. 6. Электронные

} микрофотографии клеток штамма А. ЬгаяИепяе 8р245 (1, 2) и его омегонового мутанта А. Ъгазйепзе 8р245.1063 (3, 4). Бактерии выращивали в жидкой (1,3) или на плотной (2, 4) МвМ. Масштабная линейка соответствует 1 мкм.

У мутанта A. brasilense Sp245.1610 произошла полная утрата способности к образованию латеральных жгутиков и наблюдались существенные дефекты в продукции полярного жгутика. Примерно 62% клеток мутанта Sp245.1610 из культур, выращенных в жидких (18 ч) или на плотных (42 ч) средах, лишены Fla; около 29% клеток несут очень короткую полярную органеллу; на остальных клетках в популяции выявляется длинный Fla. При этом около 2.5% клеток в популяции Sp245.1610 сохранили подвижность в жидких средах.

В результате проделанной работы отобран полностью обездвиженный Fla La Г мутант А. brasilense Sp245.1063 и leaky FlaTMof La Г A. brasilense Sp245.1610, большинство клеток в популяции которого неподвижны или "дрожат", а клетки, сохранившие подвижность, единичны. Значимых различий в среднем размере клеток, скорости роста и плазмидном профиле бактерий штаммов А. brasilense Sp245, Sp245.1063 и Sp245.1610 не обнаружено.

Следующим этапом работы стал анализ первичной структуры ДНК, мутагенез которой сопровождался изменениями в характере жгутикования и подвижности бактерий. Наличие сведений о первичной структуре геномов нескольких штаммов азоспирилл, в том числе, А. brasilense Sp245 (GenBank accession nos. HE577327-HE577333), является хорошим подспорьем для работ по экспериментальному анализу генетической регуляции синтеза и работы двух флагеллярных систем.

Для характеристики мутантного локуса было осуществлено клонирование ЕсоКХ-фрагмента геномной ДНК штамма Л. brasilense Sp245.1063, несущего вставку омегона-Кт - с отбором трансформантов Е. coli DH1, приобретших устойчивость к канамицину. В результате секвенирования полученной таким образом рекомбинантной плазмиды pOmegon-Km-Sp245.1063Е установлено, что в ее составе клонирован 16.4-т.п.н. £соЫ-фрагмент хромосомы А. brasilense Sp245 с координатами 23372372353586, включающий локусы AZOBR_150175-AZOBR_150194 (GenBank accession no. HE577327). У мутанта A. brasilense Sp245.1063 вставка омегона-Km локализована в районе 924-го нуклеотидного остатка хромосомной копии гена flhB. По концам омегона в ДНК штамма A. brasilense Sp245.1063 выявлен прямой повтор последовательности из 9 п.н. (5 -CTCCTCGGC-3 ) Расположенные перед flhB гены fliE-fliQ2-fliR кодируют соответственно белок крюка-базального тела FliE и участвующие в синтезе жгутика белки FliQ и FÜR (GenBank accession nos YP_005032138, YP_005032137 и YP_005032136) (рис. 7).

a

AZOBKJÎ017S AZQB3RJ5017« flhB ftiR fUQZ flŒ

Рис. 7. Схема сегмента хромосомной ДНК мутанта A. brasilense Sp245.1063, содержащего вставку инсерционного элемента Omegon-Km. Горизонтальными стрелками обозначены кодирующие последовательности и направление их транскрипции; вертикальной стрелкой - место вставки омегона (П) в ген flhB.

На расстоянии 51 п.н. от 3-конца rem. flhB находится транскрибируемая в том же направлении orf AZOBRJ 50176, предполагаемым продуктом которой является гибридная мультисенсорная гистидинкиназа/регулятор ответа (GenBank accession no. YP_005032134). Orf AZOBR_150175, кодирующая гипотетический белок (GenBank accession no. YP_005032133), транскрибируется в противоположном направлении. Не исключено, что вставка омегона-Km недалеко от З'-конца гена flhB оказала влияние на экспрессию близлежащей AZOBR_150176. Перспективным представляется анализ возможного участия белкового продукта orf AZOBR_150176 в восприятии сигнала о попадании бактерий на плотные/вязкие среды и в передаче этого сигнала к генетическому аппарату синтеза латеральных жгутиков.

В плазмиде AZOBR_p4 A. brasilense Sp245 в составе кластера флагеллярных генов, включающего и структурный ген флагеллина Laf, локализуется вторая копия гена flhB (orf AZOBR р410073) (GenBank accession no. HE577331) (назовем ее flhB2). Нуклеотидные последовательности двух генов flhB штамма Sp245 идентичны на 72%. Белки FlhBl и FlhB2 (GenBank accession nos YPJD05032135 и YP_004986942), состоящие соответственно из 358 и 366 аминокислотных остатков, обладают 43% идентичностью/62% сходством. В составе белков FlhB выделяют мембранный N-коицевой и цитоплазматический С-копцевой домены (Soutourina et al, 2003; Anderson et al., 2010). Вставка омегона-Km в ген flhBJ у деривата A brasilense Sp245.1063, по-видимому, привела к укорочению белкового продукта этого гена на 50 аминокислотных остатков, входящих в состав большого цитоплазматического С-домена. Данная мутация могла негативно сказаться на взаимодействии FlhB с другими белками-экспортерами компонентов жгутика. Консервативный аминокислотный мотив

А5Ж Uh

8.8!

Hh

Рис. 9. Относительное количество биомассы в пленках А. ЬгаэИете 8р245 и I „ I | I его мутантов, сформированных за 6 суток

! | на границе раздела: 1 - "жидкая ЬВ -

стекло" и 2 - "жидкая ЬВ - полистирол" ! (Аяо), определенное в результате

окрашивания клеток кристаллическим [ фиолетовым. Доверительные интервалы

\ определены для 95% уровня значимости.

Sil

Sp245 Sp245.1:0S3 SpZ4S-.l$K> ЖО»

ШШ гт

По-видимому, различия в морфологии биопленок, формируемых на гидрофильной поверхности клетками штаммов Sp245.1610 и Sp245, связаны не только с утратой подвижности, но и с возможным изменением ЖК состава клеточных мембран у мутантного штамма. На примере псевдомонад (Murray et al., 2010) было показано, что между роением (за счет синтеза латеральных жгутиков) и способностью образовывать биопленки существует обратная зависимость: чем выше жгутиковая подвижность, тем ниже способность к образованию биопленок. Напротив, клетки неподвижных мутантных штаммов Salmonella typhimurium неспособны к формированию биопленок (Романова с соавт., 2006). Практически все использованные в нашей работе мутанты с нарушением продукции и функционирования жгутиков могут использовать для перемещения по полужидким средам распространение с образованием микроколоний. Поэтому можно предположить, что подобное распространение компенсирует утрату жгутиковой подвижности у мутантов, и является одним из способов распространения клеток при формировании биопленок на абиотических поверхностях.

Колонизация корней проростков пшеницы бактериями штамма A. brasilense Sp245 и его мутантами с измененными полисахаридами. Важную роль в бактериальной агрегации и формировании растительно-бактериальной ассоциации, по-видимому, играют полисахариды, являющиеся доминирующими структурами поверхности азоспирилл и принимающие участие в "заякоривании" бактерий на поверхности корней растений и их распространении по корню. Так как основу биопленок составляют полисахариды, все, что влияет на их продукцию, может оказать влияние на способность бактерий образовывать биопленки. Одной из задач данной работы стало изучение особенностей колонизации корней проростков пшеницы ранее полученными в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН дериватами штамма Sp245, имеющими разные классы мутаций в структуре полисахаридов. Известно, что начальные этапы колонизации корневой системы азоспириллами обеспечиваются способностью бактерий перемещаться по направлению к корням при помощи жгутиков (Bashan, 1986; Steenhoudt, Vanderleyden, 2000). Мы инкубировали инокулированные растения в течение трех часов при равномерном покачивании, чтобы обеспечить штамму дикого типа и его мутанту КМ018 по подвижности равные шансы на контакт с поверхностью корня. Затем корни части проростков растирали, и определяли количество адсорбированных на корнях клеток методом высева серийных разведений на плотные среды и подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) (рис. 10, 1). Остальные растения выращивали на среде для растений в течение семи суток и определяли количество клеток, заселивших корни (рис. 10, 2).

Можно предположить, что, благодаря геномным перестройкам, которые привели к таким изменениям, биосинтез полисахаридов пошел по другому пути, может быть, более древнему. И новый ЛПС позволяет бактериям образовывать более толстые биопленки с большим количеством полисахаридного матрикса на любых поверхностях, что повышает их адаптивные свойства.

Самые низкие показатели колонизации продемонстрировали мутанты штамма A. brasilense Sp245 серии КМ, у которых нарушился синтез одного из двух ЛПС, характерных для родительского штамма. Однако динамика колонизации проростков бактериями мутантных штаммов КМ139 и КМ252 не отличается от заселения корней бактериями дикого типа (в процессе заселения растущих корней количество высеваемых клеток снижается) (рис. 10). Ранее была изучена способность этих мутантов к колонизации абиотических поверхностей. Только КМ018 имел менее выраженные биопленки, чем у дикого типа, как на гидрофильной, так и на гидрофобной поверхности. Но LpsIT СаГ Mot" Swa" мутант КМ018 утратил подвижность, что, по-видимому, также влияет на формирование биопленок, в том числе, и на поверхности корней. Lpsr СаГ мутант КМ252 образовывал даже более толстые биопленки на гидрофильной абиотической поверхности, чем Sp245 (Шелудько с соавт., 2008). Исходя из этого, можно предположить, что для формирования полноценных биопленок A. brasilense Sp245 на поверхности корней пшеницы необходимо наличие и LpsI, и LpsII.

В случае инокуляции проростков пшеницы культурой A. brasilense Sp245.5 корневых волосков, свободных от бактерий, наблюдается больше, чем у растений, инокулированных культурами A. brasilense Sp245, КМ018, КМ139 и КМ252. Так агрегаты бактерий на кончике корневых волосков у растений, заселенных Sp245.5, наблюдаются в два раза реже, чем в случае других штаммов.

Степень выраженности биопленок на поверхности корня в случае всех штаммов согласуется с численностью бактерий, заселивших корневую систему. Радикальные изменения в составе и структуре ОПС у штамма Sp245.5 приводят к активизации процессов бактериальной адсорбции на корнях пшеницы и заселения корней с образованием мощных биопленок (см. рис. 11). Таким образом, синтез бактериями полноценного ЛПС и ПССК во многом определяет численность клеток штамма Sp245, колонизирующих корни и формирующих биопленки, степень выраженности биопленок и их расположение на корневой поверхности. Радикальные изменения в составе и структуре ОПС у штамма Sp245.5 коррелируют с активизацией процесса формирования биопленок не только в корневой системе проростков пшеницы. Очень перспективным партнером пшеницы может стать штамм A. brasilense Sp245.5, обладающий существенно более высоким колонизационным потенциалом, чем другие изученные штаммы азоспирилл, и образующий хорошо сформированную биопленку на поверхности корня, в зоне всасывания и на кончике корня.

ВЫВОДЫ

1. У мутанта Azospirillum brasilense Sp245 с ускоренным роением (штамм ВК570) вектор для омегонового мутагенеза pJFF350 интегрировал в ДНК 85-МДа плазмиды по соседству с генами гипотетических экстрацитоплазматических белков из семейств 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат сульфотрансфераз и белков толерантности к толуолу Ttg2.

2. Вставка искусственного транспозона Omegon-Km в хромосомную копию гена flhB (flhBl), кодирующего компонент жгутикового экспортного аппарата, сопровождается дефектами в образовании конститутивного полярного жгутика (Fla) и индуцибельных латеральных жгутиков (Laf) у соответствующего мутанта А. brasilense Sp245. Поскольку к З'-концу гена flhBl прилегает транскрибируемый в том же направлении ген мультисенсорной гибридной гистидинкиназы/регулятора ответа, не исключено участие этого белка в индукции синтеза Laf в ответ на повышение плотности окружающей среды.

3. Инсерция омегона-Km в хромосомный ген mmsB, кодирующий 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназу, сопровождается появлением у мутанта А. brasilense Sp245 значительных дефектов в образовании Fla и обездвиживанием Laf.

4. Вставка омегона-Km в расположенный в плазмиде AZOBR_pl А. brasilense Sp245 ген fabG, кодирующий 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазу, приводит к существенным дефектам в сборке Fla и к полной утрате Laf и способности к роению.

5. У дефектных по синтезу или работе жгутиков flhBl, mmsB и fabG мутантов штамма А. brasilense Sp245 снижена способность к образованию биопленок на гидрофобных поверхностях. На абиотических гидрофильных поверхностях поведение мутантов различается: в отличие от flhBl и mmsB штаммов, у fabGl мутанта А. brasilense Sp245 наблюдается активизация процесса формирования биопленок.

6. Дериват А. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой и новым О-полисахаридом обладает повышенной, по сравнению с родительским штаммом Sp245, способностью к образованию биопленок на корнях ассоциативного партнера — растений пшеницы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Коетунов Е.А., Шелудько A.B., Katfbi Е.И. Изменения в первичной структуре 85-МДа плазмиды, влияющие на жгутикование и подвижность бактерии Azospirillum brasilense Sp245 II Генетика. - 2012. - Т. 48, № 1. - С. 138-141.

2. Коетунов Е.А., Петрова Л.П., Шелудько A.B., Kaifbi Е.И Инсерционный мутагенез хромосомной копии гена flhB сопровождается дефектами в образовании полярного и латеральных жгутиков у бактерий Azospirillum brasilense Sp245 II Генетика. - 2013. - Т. 49, №8.-С. 1013-1016.

3. Коетунов Е.А., Шелудько A.B., Чернышова М.П., Петрова Л.П., КацыЕ.И. Мутанты Azospirillum brasilense Sp245 со вставкой омегона в генах липидного метаболизма mmsB или fabG дефектны по подвижности и жгутикованию // Генетика. - 2013. - Т. 49, № 11. — С. 1270-1275.

Публикации в материалах конференций

4. Коетунов Е.А., Петрова Л.П., Бурыггш Г.Л., Кацы Е.И. Анализ внутригеномных различий у модельного штамма ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и

его производных // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. IV Межрегион, конф. мол. уч. - Саратов: Научная книга, 2008. - С. 58.

5. Ковтунов Е.А., Петрова Л.П., Шелудько A.B., Кацы Е.И. Получение мутантов ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense по образованию жгутиков, социальной подвижности и структуре поверхностных полисахаридов // Симбиоз-Россия 2010: Сб. тез. Ш Всеросс. с междунар. уч. конгр. студ. и аспир.-биологов. - Нижний Новгород, 2010. - С. 97.

6. Ковтунов Е.А., Петрова Л.П., Шелудько A.B., Кацы Е.И. Получение мутантов ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense с изменениями в социальном поведении // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. V Всеросс. конф. мол. уч. - Саратов: Научная книга, 2010. - С. 24.

7. Ковтунов Е.А., Петрова Л.П., Шелудько A.B., Кацы Е.И. Колонизация корней проростков пшеницы ассоциативными бактериями Azospirillum brasilense и их мутантами с измененными полисахаридами // Симбиоз-Россия 2011: Матер. IV Всеросс. с междунар. участ. конгр. студ. и аспир.-биологов. - Воронеж: Издат.-полиграф, центр Воронеж, госуд. ун-та, 2011.-Т. 1.-С. 70-73.

8. Ковтунов Е.А., Петрова Л.П., Шелудько A.B., Соколова М.К, Соколов О.И., Кацы Е.И. Особенности взаимодействия с корнями проростков пшеницы дериватов ризобактерий Azospirillum brasilense с измененной структурой О-полисахаридов // Актуальные аспекты современной микробиологии: Матер. VII Молодеж. шк.-конф. с междунар. уч. - М.: Макс Пресс, 2011. - С. 25-27.

9. Ковтунов ЕА, Шелудько A.B., Кацы Е.И. Мутагенез гомолога 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы приводит к дефектам в жгутиковании и подвижности альфапротеобактерий Azospirillum brasilense Sp245 // Науч. конф. по биоорган, химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова": Сб. тез. -М.-Пущино, 2011. - Т. 2. - С. 33.

10. Телешева ЕМ., Филипьечева Ю.А., Ковтунов Е.А., Варшаломидзе О.Э., Любунь Е.В., Шелудько A.B. Влияние меди на формирование ассоциации азоспириллы - проростки пшеницы // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. VI Всеросс. конф. мол. уч. - Саратов: Научная книга, 2012. - С. 112.

11. Шелудько A.B., Филипьечева Ю.А., Ковтунов ЕА, Телешева ЕМ., Любунь Е.В., Петрова Л.П. Влияние мутаций в синтезе липополисахаридов на формирование биопленок Azospirillum brasilense в условиях повышенного содержания ионов меди // Экологические проблемы промышленных городов: Матер, б-й Всеросс. научно-практич. конф. с междунар. участ. - Саратов: Сарат. госуд. технич. ун-т, 2013. - С. 171.

12. Ковтунов Е.А., Петрова Л.П., Шелудько A.B., Филипьечева ЮА., Телешева ЕМ., Гринёв B.C., Кацы Е.И. Формирование биоплёнок штаммом Azospirillum brasilense Sp245 и его мутантами, дефектными по роению // Симбиоз-Россия 2013: Матер. VI Всеросс. с междунар. участ. конгр. мол. уч.-биологов. - Иркутск: Аспринт, 2013. - С. 79-80.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 08.11.2013.

Гарнитура Times. Печать Riso. _Усл. печ. л. 1,28. Тираж 100 экз. Заказ 0445_

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачёвская, 161, офис 320 ® 27-26-93