Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense"



Шелудько Андрей Вячеславович

ГЕНЕТИКО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЦИАЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ АгОЗРШИШМ ВЫБИЕ^Е

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Саратов-2010

004613908

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научный консультант

доктор биологических наук Елена Ильинична Кацы

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Лидия Владимировна Карпунина

доктор биологических наук, доцент

Маргарита Юрьевна Грабович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Галина Александровна Ерошенко

Ведущая организация:

Всероссийский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Защита диссертации состоится « 8 » декабря 2010 г. в 13°° ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13). Тел. /факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК. Автореферат разослан «¿9» октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета г-

доктор биологических наук, профессор В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бактерии рода Azospirillum являются модельным объектом в исследованиях молекулярных механизмов ассоциативного взаимодействия растений и микроорганизмов. Азоспириллы - ризобактерии, стимулирующие рост и развитие растений (PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), благодаря своей способности к фиксации атмосферного азота, продукции фитогормонов, контролю фитопатогенов и др. (Berg, 2009; Lugtenberg, Kamilova, 2009). Существование в гетерогенных условиях почвы, смена экологических ниш (почва - ризосфера - растение) требуют от бактерий богатого набора адаптивных способностей.

Наличие специализированных двигательных органелл, наряду со способностью реагировать на постоянно изменяющиеся условия окружающей среды посредством тактических реакций, существенно расширяет адаптационные возможности бактерий, живущих в разнообразных местах обитания (Armitage 1992; Кацы, 1996; Дебабов, 1999; Vladimirov, Sourjik, 2009). Эффективность экспансии микроорганизмов повышается в результате перехода индивидуально движущихся клеток к коллективной миграции (Henrichsen, 1972; Дебабов, 1999; Олескин с соавт., 2000; Verstraeten et al., 2008). В настоящее время описано значительное количество типов индивидуальной и коллективной подвижности микроорганизмов (плавание, роение, скольжение, тянущая подвижность и др.). Особенности совместного перемещения микроорганизмов определяются механизмами, обеспечивающими движение; межклеточными контактами, обусловленными мажорными компонентами клеточной поверхности; а в некоторых случаях зависят от продукции сурфактантов и ряда других факторов (Harshey, 2003). Генетико-физиологический анализ изменений в подвижности бактерий и архитектуре их клеточной поверхности необходим для выяснения механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.

Исследование подвижности и хемотаксиса бактерий является одной из динамично развивающихся областей современной микробиологии. Столь пристальное внимание к проблеме во многом вызвано тем обстоятельством, что на сравнительно простой биологической системе, каковой является бактериальная клетка, можно установить закономерности, лежащие в основе поведенческих реакций, которые можно экстраполировать на более сложные системы (Adler, 1987; Иваницкий, 1999; Олескин, 2009). Наряду с классическими объектами Escherichia coli и Salmonella typhimurium внимание исследователей привлекают и почвенные бактерии. Именно у них обнаружены более сложные, чем у Enterobacteriaceae, хемосенсорные системы, большее разнообразие двигательных органелл и механизмов, приводящих клетки в движение. Усложнение организации систем подвижности и хемотаксиса у почвенных бактерий считают отражением высокой пластичности их метаболизма (Manson et al., 1998; Кацы, 2003).

В природных экосистемах большинство бактерий существуют в виде прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет собой сложный строго регулируемый биологический процесс. Формирование микроорганизмами биопленочных сообществ является одной из стратегий выживания бактерий не только в окружающей среде, но и в инфицируемых макроорганизмах. В составе биопленок бактерии объединены сложными межклеточными связями и во многом функционально сходны с многоклеточными организмами (Shapiro, 1998; Ильина с соавг., 2004; Dobretsov et al., 2009). Учитывая то обстоятельство, что в случае ассоциативного взаимодействия не происходит образования каких-либо

специфических структур, наподобие клубеньков, характерных для бобово-ризобиального симбиоза (Pedrosa, 1988), формирование азоспириллами биопленок может играть существенную роль в успешном функционировании ассоциации.

В последнее десятилетие интенсивное изучение разнообразных процессов, реализуемых при наличии достаточной плотности популяции микроорганизмов ("ощущение кворума", формирование биопленок или плодовых тел, различные способы коллективной подвижности, синтез экзоферментов, конъюгативный перенос плазмид и пр.), вышло на качественно новый теоретический и методический уровень. В 2005 г. для данной области исследований предложено название "социомикробиология" (Parsek, Greenberg, 2005). В обзоре A.B. Олескина (2009) отмечено, что бактерии проявляют различные формы коллективного поведения (кооперацию, координированную агрессию и избегание); бактериальные системы характеризуются контактной и дистантной коммуникацией; микроорганизмы формируют надклеточные системы, которые можно рассматривать как бактериальные биосоциальные системы, по аналогии с сообществами животных. Бактериальные биосоциальные системы характеризуются целостностью, единым жизненным циклом и иерархической или сетевой организацией (Олескин, 2009). Таким образом, выбор популяцией микроорганизмов оптимального варианта взаимодействия с внешней средой и клетками высших организмов, осуществляемый в результате обмена информацией между отдельными особями, можно считать социальным поведением.

Новые знания о генетических и внешних факторах, влияющих на социальное поведение ассоциативных бактерий, стимулирующих рост и развитие растений, будут полезны при разработке аграрных биотехнологий, методов мониторинга состояния окружающей среды (создание биосенсоров) и фиторемедиации загрязненных почв.

В качестве основного объекта данного исследования выбраны бактерии штамма Azospirillum brasilense Sp245, обладающие всеми характеристиками, которые могут влиять на их ассоциативное взаимодействие с растениями (диазотрофность, хемотаксис, подвижность, образование фитогормонов, полисахаридов клеточной поверхности и др.). Кроме того, бактерии данного штамма, наряду с бактериями штаммов А. brasilense Sp242, Spl07 и Spl08 (Baldani et al., 1983) и A. irakense КВС1 (Faure et al., 1999), способны не только колонизировать ризосферу, но и проникать внутрь корней и существовать в них в метаболически активном состоянии (Döbereiner, De-Polli, 1981; Залп, Patriquin, 1984). Все перечисленное выше делает бактерии А. brasilense Sp245 крайне интересным объектом для изучения молекулярных основ адаптационного потенциала почвенных микроорганизмов. В работе были использованы и другие штаммы азоспирилл - представители видов А. brasilense, A. halopraeferans, A. irakense и A. lipoferum.

Бактерии рода Azospirillum способны к ассоциативному взаимодействию с чрезвычайно широким кругом растений, распространены практически во всех климатических зонах и экологических нишах (в почве, в корнях растений, на поверхности подземной и надземной частей растений, в воде и др.) (Umali-Garcia et al., 1980; Басилашвили, Нуцубидзе, 1984; Федорова с соавт., 1985; Assmus et al, 1995; Bashan, Holguin, 1997). В данном контексте интересно сравнение поведения А. brasilense Sp245 и других штаммов для выявления универсальных механизмов, обеспечивающих разнообразные проявления социальной активности азоспирилл.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в комплексном генетико-физиологическом анализе социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense.

В связи с поставленной целью в наши задачи входило следующее:

1. Охарактеризовать социальную подвижность штаммов А. ЬгаяИете дикого типа и мутантов штамма А. ЬгазИепзе 8р245 с изменениями в жгутиковании и составе углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности.

2. Оценить роль полисахаридов и белка-гемагглютинина, локализованных на клеточной поверхности, в реализации социальной подвижности бактерий штамма А. brasilen.se Бр245.

3. Изучить возможное влияние на подвижность азоспирилл ряда внешних факторов (состав среды культивирования; присутствие прижизненного красителя конго красного, корневых экссудатов проростков пшеницы, растительных и грибного лектинов, поликлональных антител на поверхностные полимеры бактериальных клеток).

4. Охарактеризовать нуклеотидную последовательность сегмента резидентной 85-МДа плазмиды штамма А. ЬпиИепзе Бр245, мутагенез которого приводит к дефектам в жгутиковании и/или подвижности азоспирилл.

5. Провести анализ изменений в структуре генома А. ЬгаяЦегие 8р245, сопровождающихся вариациями в социальной подвижности этих бактерий.

6. Исследовать процесс формирования биопленок культурами штамма А. ЬгахПете Бр245 и его мутантов с изменениями в структуре клеточной поверхности и подвижности на абиотических плотных средах и на корнях проростков пшеницы.

Научная новизна работы. Дана характеристика новых проявлений социальной подвижности азоспирилл: ускоренное роение, зависящее от работы жгутиков, и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний, реализуемое и в отсутствие жгутиков. Описаны новые экстраклеточные органеллы бактерий штамма А. ЬгаяЦепзе Бр245 - полярный пучок пилей, продукция которых, возможно, альтернативна сборке полярного жгутика

Установлено, что социальная подвижность азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбировать прижизненный краситель конго красный.

Показано, что межклеточные контакты бактерий А. ЬгавИете 5р245, двигающихся в полужидких средах, опосредуются взаимодействиями белка-гемагглютинина и 0-специфического полисахарида этих бактерий.

Определены некоторые факторы (сниженная концентрация кислорода, аминокислоты аспарагиновая кислота, серин и треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам ЛГ-ацетил-[3-В-глюкозамина, соли аммония, нитраты и нитриты), способствующие переходу части популяции клеток А. ЬгайИете от плавания и роения к распространению с образованием микроколоний или оказывающие модулирующее действие на скорость движения клеток.

Обнаружено, что спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид А. Ьга$Иеп$е 8р245 оказывают заметное влияние на социальное поведение бактерий. В ДНК 85-МДа плазмиды А. ЬгавИепзе $р245 идентифицированы гены Иф7? и ссоИ, предсказанные белковые продукты которых могут влиять на поведенческие реакции бактерий.

Выявлены поверхностные структуры бактерий и типы подвижности, участвующие в процессе формирования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность" или на корнях проростков пшеницы.

Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены оригинальные мутанты штамма А. ЬгаяНепхе 8р245 с изменениями в индивидуальной

и социальной подвижности, продукции жгутиков и поверхностных полисахаридов, которые могут быть полезны при изучении механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Разработанные методические приемы и теоретические положения нашли применение в исследованиях, выполняемых в пяти лабораториях ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, биохимии, микробиологии, иммунохимии и экологической биотехнологии), объектами которых были не только бактерии рода Azospirilhim, но и бактерии других родов (что частично отражено в публикациях, представленных в списке основных публикаций по теме диссертации).

Предложенная биотест-система, основанная на ингибировании подвижности разных штаммов азоспирилл поликлональными антителами на поверхностные бактериальные структуры, может быть использована для первичной оценки серологического родства этих бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности интактных клеток.

Результаты работы использованы при подготовке учебно-методического пособия "Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам" / Составители: Шелудько A.B., Кацы Е.И., Матера Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Широков A.A., Щеголе» С.Ю. / Под ред. Игнатова В.В. Саратов: Научная книга, 2007. 56 с. Данное пособие, рекомендованное к печати кафедрой органической и биоорганической химии и кафедрой биохимии и биофизики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), предназначено для студентов и аспирантов химического и биологического факультетов СГУ.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Ускоренное роение и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний представляют собой новые проявления социальной подвижности азоспирилл. Коллективное движение азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбирировать прижизненный краситель конго красный.

2. Распространение бактерий А. brasilense Sp245 по полужидким средам опосредуется взаимодействием белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Источники азота в окружающей среде и кислород модулируют гемагглютинирующие свойства бактериальных клеток и, как следствие, подобные взаимодействия.

3. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам /У-ацетил-р-Ь-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток А. brasilense от плавания или роения к распространению с образованием микроколоний. На эффективность роения азоспирилл влияют природа источника азота в среде, концентрация кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы.

4. Генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма А. brasilense Sp245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и подвижности азоспирилл. На социальное поведение азоспирилл могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в р85 генов hdfR и ccoN - негативный регулятор транскрипции жгутикового мастер-оперона flhDC и каталитическая субъединица I цитохромоксидазы, соответственно.

5. Изменения состава и (или) структуры плазмид А. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Липополисахариды, полисахариды, связывающие калькофлуор, и полярный жгутик участвуют в организации биопленок А. brasilense на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность".

6. После "заякоривания" на корнях пшеницы формирование биопленки клетками штамма А. brasilense Sp245 и его нероящихся мутантов опосредовано распространением с образованием микроколоний. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма А. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

7. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии чужеродного лектина, "распознаются" организмом, продуцирующим лектин, с наименьшим проявлением антагонизма.

8. Эффект ингибирования подвижности азоспирилл антителами на поверхностные структуры или лектинами различного происхождения может быть использован для оценки серологического родства бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности клеток.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН в рамках трех плановых тем НИР: "Изучение генов почвенных азотфиксирующих бактерий, определяющих их взаимодействие со злаками" (№ госрегистрации 01960001676); "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образование мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense" (№ госрегистрации 01200606181); "Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями" (№ госрегистрации 01200904390). Работа частично поддержана фантом Президента РФ МК-235.2003.04 для молодых кандидатов наук (канд. биол. наук A.B. Шелудько) и их научных руководителей (д-р биол. наук Е.И. Кацы); грантами Президента РФ НШ-1529.2003.4, НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 для ведущей научной школы засл. деятеля науки РФ, д-ра биол. наук, проф. В.В. Игнатова; грантом Роснауки № 2005-РИ-112/001 (рук. - д-р биол. наук, проф. В.В. Игнатов); грантом Фонда содействия отечественной науке для канд. биол. наук A.B. Шелудько и грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 06-04-48204-а (рук. - д-р биол. наук Е.И. Кацы).

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в планировании и осуществлении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. Автор выражает искреннюю признательность своему научному консультанту - заведующей ЛГМ ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Е.И. Кацы за многолетнюю помощь и всестороннюю поддержку работы. Автор признателен участвовавшим в проведении исследований сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.П. Петровой, канд. биол. наук И.В. Борисову, канд. биол. наук О.В. Кулибякиной и О.Э. Варшаломидзе; сотрудникам лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.Ю. Матора, канд. биол. наук Г.Л. Бурыгину и канд. биол. наук A.A. Широкову; сотрудникам лаборатории биохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.П. Антонкж, канд. биол. наук A.B. Тугаровой и В.А. Крестиненко; сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.В. Степановой, канд. биол. наук Е.Г. Пономаревой и канд. биол. наук Е.П. Ветчннкиной; сотруднику лаборатории физиологии

растительной клетки ИБФРМ РАИ канд. биол. наук М.К. Соколовой; чей вклад отражен в совместных публикациях; а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН, способствовавшим успешному выполнению работы.

Апробации работы. Материалы диссертации были представлены на 5-й Школе-конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000). 10-м Международном конгрессе IUMS The "World of Microbes" (Париж, 2002), 1-й и 2-й Региональных конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов. 2002. 2004), 6-й, 9-й и 10-й Школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2000, 2005, 2006), международной конференции "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plauts will) Technogenic Environmental Pollutants" (Саратов, 2003), 3-й Всероссийской школе-конференции "Химия и биохимия углеводов" (Саратов, 2004), 30-м конгрессе FEBS (Будапешт, 2005), Всероссийской конференции "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты" (Саратов, 2005), Международной научной конференции "Мжробш бютехнолоп'Г (Одесса, 2006), Международной школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" (Москва-Пущино, 2006), 3-й и 4-й Межрегиональных конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2006, 2008), Всероссийской конференции с международным участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), Международной научной конференции "Микроорганизмы и биосфера" (Москва,

2007), 5-м Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии "Успехи медицинской микологии" (Москва, 2007), Международном рабочем совещании "Azospirillum VII and related PGPR: Genomics, molecular ecology, plant responses and agronomic significance" (Монпелье, 2007), Международной конференции "Вавиловские чтения-2007", посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Саратов, 2007), Международной научно-практической конференции "Вавиловские чтения-2008", посвященной 95-летию Саратовского госагроуниверситета (Саратов,

2008), 5-м Московском междуиар. конгр. "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009), отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН (Саратов, 2003, 2004, 2008).

Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 09.06.2010, протокол № 175.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ, в том числе, 18 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 321 странице машинописного текста, содержит 24 таблицы и 54 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 14 подразделов), а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 510 литературных источников, из них 80 па русском и 430 на английском языках. В приложении приведены аннотированные пуклеотидные последовательности обсуждаемых в работе генов 85-МДа плазмиды бактерий штамма Л. brasilense Sp245, депонированные в международную базу .данных GenBank (NCBI, США) (GenBank acccssion по. EU 194339. EU784I44. EIJ595702, EU595701 и EU595706).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает подразделы: 1.1 Общая характеристика ассоциативных бактерий рода Azospirillum; 1.2 Мажорные углеводсодержащие полимеры бактериальной поверхности; 1.3 Межклеточная коммуникация бактерий; 1.4 Двигательные органеллы бактерий; 1.5 Поведение бактерий, обусловленное подвижностью; 1.6 Формирование бактериями биопленок.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы бактерии штаммов дикого типа А. brasilense Cd, K.R77, S17, S27, Sp7, Spl07, Sp245, SpBrl4, SR8, SR15, SR55, SR75, SR80, UQ1794 и UQ1796, A. halopraeferans AU4, A. ¡rakense КАЗ и К.ВС1, A. lipoferum Sp59b, SpRG20a и SpRGóxx; 36 мутантов (табл. 1) и спонтанных производных A. brasilense Sp245; три мутанта A. brasilense S27 (KS107, KS109 и KS122); три штамма Escherichia coli; 11 рекомбинантных плазмид; а также растительный и грибной объекты - мягкая яровая пшеница Triticum aesíivum cv. Саратовская 29 и базидиальный ксилотроф Grifóla frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917.

Таблица 1. Характеристика мутантов A. brasilense Sp245

Штамм Фенотип Характеристика плазмид

Sp245 Дикий тип р85, р120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

Sp245.5 СаГ Lpsl" LpsII" Swaf * четыре плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

КМ018 СаГ LpsII" Mot" Swa" Gri+ р85, р120::С)п^оп-К.т и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

КМ127 Lpsl" Swa**

КМ134 Lpsl" Swa"'

КМ139 Lpsir Swa"

КМ252 СаГ Lpsl" Swa+

КМ348 Lpsl" Swa"

SK048 Fla" Mot' Swa" Gri+

SK051 Leaky Fla" Lar Mot" Swa" Gri+ р85::р.1РР350, р120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

SK248 Mot" Swa" Gri*

ВК570 Swa""'

ВК571 Swa"

BK759G Fla' Swa" Gri"

ВК.759Р Fla+ Swa"" 36-МДа плазмида, р120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

ВК.468 Swa" р85, р120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

SK005 Fla" Laf Mot" Swa" Grf

SK039 Leaky Fla" Mot" Swa" Gri+

SK237 Fla" Swa" Gri+ j

SK454 Fla" leaky Laf Swa" Gri"

SK.531 Fla" Laf Mot" Swa"

SK586 Fla" Laf Swa"

KZ019 Fla' Swa" р120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

KZ020 Leaky Fla" Mot" Swa"

KZ044 Fla" Swa"

KZ042 Swa" р85::р511Р5011, р120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа

KZ050 Swa*'

Примечание: * - диффузная колония.

В главе 2 описаны: питательные среды и условия выращивания бактерий, гриба и проростков пшеницы: методы изучения ряда биохимических, физиологических и морфологических характеристик бактериальных культур: иммунохимические методы анализа различий в продукции бактериями полисахаридов и белков; методы анализа ДНК и свойств предсказанных белковых продуктов кодирующих последовательностей. Все количественные результаты подвергали статистической обработке с использованием пакета Microsoft Office Excel 2003 (11.6355.6360) SIM. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Индивидуальная и социальная подвижность азоспирилл, зависящая от работы жгутиков. Выросшие в жидкой среде азоспириллы синтезируют длинный жгугик (Па), располагающийся па одном из полюсов клетки. Активность Fla обеспечивает возможность клеткам штамма Sp245 плавать прямолинейно вдоль их длинной оси со средней скоростью 29.0±1.1 мкм/с. После точечного посева в агаризованиую питательную среду клетки Sp245 переходят к роению при помощи жгутиков и формируют макроколонию, имеющую вид концентрической структуры (Svva' фенотип, от англ. swarming) (рис. I). Внимание к поведению азоспирилл па полужидких агаризованных средах обусловлено возможностью в данных условиях смоделировать физико-химические свойства муцигеля (Скворцов, 1994), окружающие бактерии на корнях растения. Стоит отметить, что использование агаризованных сред позволяет выявить у бактерий способность к различным типам коллективной подвижности, опосредуемым не только жгутиками, но и обусловленными другими механизмами (Henrichsen, 1972). Формирование роящимися клетками па средах, содержащих от 0.4-0.6% агара, концентрических макроколоний у штамма Sp245 происходит после 2.5-5-часового латентного периода и сопровождается увеличением на 15-20% продольного размера клеток и, как и у других штаммов Л. brasilense (Moens et al., 1995), синтезом дополнительных латеральных жгутиков (Laf). Концентрические макроколонии образуют роящиеся бактерии всех штаммов, исследованных нами, - представителей А. brcisilense, А. halopraeferans, Л. irakense и Л. lipoferum. что позволяет определить описанную морфологию колоний как характерную для pomAzospirillum. Отчасти что может быть обусловлено формой клеток азоспирилл и характером расположения на них жгу тиков.

Получены производные штамма A. brasilense Sp245, распространяющиеся по полужидким средам со скоростью коллективной миграции клеток, превышающей подвижность родительского штамма (Swa1- -фенотип), а также мутанты, утратившие способность к жгутиковой подвижности (Swa—фенотип) (табл. I. рис. 1). Например, штамм ВК570. клетки которого распространяются в малатно-солевой среде (MSM) с 0.3 или 0.4% агара примерно в 2 раза быстрое, чем у штамма Sp245 (рис. I). Клетки 1Ж570 движутся активнее Sp245 также и в жидкой среде (34.8т. 1.0 и 24.0а 1.1 мкм/с. соответственно). Различия в поведении

Рис, I. Колонии, сформированные A. brasilense Sp245 (а), его Swa'*-мутантом ВК.570 (б) и

Swa*—мутантами SK.051 (в), SK.248 (г). Концентрация аг ара в среде 0.3%, время инкубации 72 ч. Масштабная линейка соответствует К) мм.

Swa"~. Svva"-мутантов не зависели от использованного источника \ глерода или азота в среде.

Считается, что именно активность Laf обеспечивает роение азоспирилл на агаризованных средах. Однако в отличие от сохраняющего подвижность на полужидких средах Fla" Laf-мутанта/(.¿/гш/еиле Sp7 (Hall. Krieg, 1983), полученные нами Fla* Laf, FlaVMot" Laf и МоГ Laf" Omegon-Km-мутанты (SK039, SK048 и SK248) штамма Sp245. а также Fla" leaky Laf мутант SK454, синтезирующий Laf n меньшем количестве, не способны к роению с образованием концентрических макроколоний. Fla" leaky Lar (KZ019 и KZ044) и Mot" leaky Fla" Laf (K/.020) In5-Mob -мутанты мутанты Sp245. а также Tnphok Fla" Laf' (KS 107 и KS 122) и Fla" leaky Lap (KS 109) мутанты A. brasilense S27 тоже не способны к роению. Результаты изучения поведения в полужидких средах Fla" Lai /Fla" leaky I.,al" производных A. brasilense Sp245 и S27 и данные по подвижности аналогичных мутантов штамма Sp7 (Hall, Krieg. 1983) свидетельствуют о том, что мы наблюдаем некоторые внутривидовые различия, характеризующие роль I.,af в обеспечении подвижности азоспирилл на агаризованных средах. По крайней мере, у двух штаммов, А. brasilense Sp245 и S27, и Fla обеспечивает распространение бактерий по полужидким средам.

3.2 Миграция A. brasilense с образованием микроколоний, не зависящим от жгутиков. Наблюдения за поведением одного из Swa'-мутантов штамма Sp245. SK048 (Fla" Mot") позволили нам выявить скрытый потенциал, обеспечивающий распространение азоспирилл по полужидким средам. Бактерии дикого типа за 18 ч инкубации образуют концентрические колонии. Клетки мутанта более 18 ч остаются в точке инокуляции (Swa'-фенотип), а зачем начинают перемещаться, формируя небольшие диски, состоящие из клеточных агрегатов - Gri-распространепие (от англ. granular inclusions) (рис. 2). Как правило, морфология макроколоний соответствует определенному способу социальной подвижности микроорганизмов (Henrichsen. 1972). Возможно, изменение морфологии макроколоний у SK048 обусловлено использованием клет ками способа коллективной миграции, скрытытого у дикого типа

Рис. 2. Колонии, сформированные А. brasilense Sp245 (а) и ero Svva" мутантом SK.048 (6) и полужидкой MSM Концентрация агара 0.4%, время инкубации 72 ч.

в лабораторных условиях, но ставшего единственным способом

распространения мутанта.

Способность к Gri-распространению удалось обнаружи ть не только у мутанта SK048, но и у ряда других Swa~-производных штамма Sp245. Инокулированные с плотной MSM в среды, содержащие от 0.2 до 0.9% агара, клетки омегоновых Swa'-мутантов (SK005. SK039, SK048, SK051, SK237. SK248, SK454, SK531. SK586, KM0I8. BK759G), в отличие от роящихся штаммов Sp245 и ВК570, либо остаются в месте укола, либо образуют зернистые зоны распространения. В случае SK248 бактерии остаются в точке инокуляции в полужидкий агар, но иногда образуют зернистые или смешанные мутно-зернистые колонии. В полужидкой MSM мутанты SK005 (Fla" Laf Mol"), SK039 (leaky Fla" Mot"). SK048 (Fla" Mot"), SK051 (leaky Fla" Laf Mol"). SK237 (Fla"). SK248 (Mot"). SK454 (Fla" leaky Laf) и KM0I8 (СаГ Lpsll" МоГ) демонстрировали фенотипическую вариацию (либо Svva" Gri", либо Svva" Gri'~ фенотип) при одной и той же температуре независимо от концентрации (от 0.2 до 0.6%) агара и используемого источника углерода. В случае SK53I (Fla" Laf Mol") и SK586 (Fla" Laf) клетки преимущественно оставались н точке инокуляции Svva"

ОгГ-фенотип колоний. При концентрации агара » среде выше 0.6% все использованные в эксперименте штаммы к 48 ч инкубации либо остаются в месте инокуляции, либо начинают распространяться, но не в толще и не по поверхности агара, а по дну чашки Петри, если там имеется немного влаги. Стоит отметить, что клетки штамма дикого типа, мигрирующие по дну чашки Петри, также иногда распространяются с образованием микроколоний. Me исключено, что дефицит кислорода, который будет возникать под толщей агара, может способствовать переходу клеток Sp245 к Gri-подвижиости. Причина такого перехода может быть обусловлена подавлением подвижности при помощи жгугиков в условиях недостатка кислорода. Так, у A. brasilense вращение полярного жгутика обеспечивается трансмембранпой разностью потенциалов Na+ (ApNal), в создании которой существенную роль играет активируемая дыханием натриевая помпа (Wood el al., 1998).

Период, предшествующий Gii-распространению, например, у штаммов А. brasilense SK048, SK039, SK051, SK248 и SK454 длится около 24-42 ч. Муганты не отличаются от дикого типа в скорости роста. По-видимому, у Gri*-мутантов, активация генов, обеспечивающих Gri-распространение, происходит при достижении определенной плотности популяции бактерий через стадию неподвижных особей. На средах с концентрацией агара от 0.4% и выше на клетках штаммов Sp245, SK039, SK048 и SK248 синтезируются многочисленные Laf. У SK454 Laf образуются в меньшем количестве, а у SK05I Laf отсутствуют. Однако диаметр'Оп4-колоний, образуемых мутантами, не зависел от присутствия Laf или от их количества. Так, у S КОЗ 9, SK048, SK248, SK454 и SK051 через 48 ч инкубации на полужидкой MSM с 0.4% агара размер колоний составлял 7.1±0.8, 10.7±1.3, 7.3±0.9, 10.4±1.0 и 8.0±0.7 мм, соответственно. Таким образом, на способность к Gri'-paciipo стране] шю и эффективность такого способа миграции бактерий не влияет присутствие на клетках Laf. В пользу данного предположения свидетельствует поведение в полужидких средах клеток KZ019, KZ020 и KZ044 - '\~n5-Mobмутантов A. brasilense Sp245. Сохраняя способность к синтезу Laf, клепси мутантов KZ019, KZ044 (Fla" leaky Laf") и KZ020 (Mot" leaky Fla") на полужидких средах неподвижны (Svva~ Grr-фенотип), как и омегононые мутанты SK.531 (Fla" Laf Mot") и SK586 (Fla" Laf"), лишенные Laf.

Мы не наблюдали заметных различий в морфологии колоний у Sp245 и его Gri'-мутантов, выращенных на плотных средах MSM или LB. Большинство мутантов не отличались от штамма Sp245 дикого типа по продукции О-спенифических полисахаридов (ОПС) и полисахаридов, связывающих калькофлюор (Г1ССК) (Са1+-фенотин). Исключением являлись SK051 имеющий СаГ-феиотип, а также СаГ-штамм КМ018, утративший один из липополисахаридов (ЛПСП). Однако ряд других мутантов (КМ 127, КМ 139. КМ252 и КМ 139) с изменениями в продукции ОПС и Г1ССК сохраняли способность к плаванию и роению. Таким образом, у Оп+-мутаитов способ распространения с образованием микроколоний не связан с какими-либо общими дефектами в продукции полисахаридов, локализованных на клеточной поверхности.

Анализ поведения A. brasilense Sp245 и его Svva'-мутаитов на полужидких средах свидетельствует, что утрата способности к роению мутантами Sp245 с нарушениями продукции и функционирования жгутиков позволила обнаружить у A. brasilense способ распространения с образованием, микроколоний, который скрыт у штамма дикого типа. Вероятно, для реализации механизма Gn-распроетранения бактерии ne используют жгутики. Интересно, , какие же клеточные структуры могуг способствовать миграции бактерий и формированию агрегатов. Просвечивающая

электронная микроскопия клеток SK048, выращенных на плотной среде, показала наличие пучка иилей па одном из полюсов клетки. Необходимо отметить, что хотя и жидких аэрируемых культурах около 10% клеток SK.048 все еще продуцировали длинный или укороченный Fla (Шелудько, 2000), мы никогда не наблюдали Fla у бактерий SK048, выросших на плотной среде. Пучок пилей был также обнаружен на полюсе клеток других омегоновых мутантов и самого штамма Sp245, выращенных в жидкой или па плотной среде. Необходимо отметить, что визуализировать пили было довольно сложно, возможно, из-за их хрупкости. Расположение обнаруженных на клетках азоспирилл нилей соответствует локализации образующих полярный пучок пилей Bfp (от англ. bundle-forming pilus). Bfp обеспечивают тянущую подвижность Pseudomonas aeruginosa и ряда других грам-отрицательпых бактерий, скольжение почвенных бактерий Myxococcus xantus и требуются для агрегации клеток (Henrichsen el al., 1972; Harshey, 2003). При световой микроскопии мы наблюдали характерные для тянущей подвижности подергивания клеток у SK048 в капельке жидкости, выдавленной из плотной среды, на которой рос мутант, после наложения на колонии покровного стекла. Подергивания клеток, сопровождающиеся изменением их положения в пространстве, отмечены нами и при микроскопии Gri-колоний, например, SK048, SK051, SK248 или SK454, сформированных бактериями в полужидкой среде.

Мы ни разу не наблюдали Fla и полярные пили на одной и той же клетке при просмотре препаратов для просвечивающей электронной микроскопии клеток, выращенных на плотной среде или в жидкой культуре. Вероятно, продукция на полюсе клетки либо вращающегося Fla, либо пилей являются альтернативными состояниями вегетативных клеток азоспирилл. Необходимо отметить, что распространение с образованием микроколоний наблюдалось в случае мутантов А. brasilense Sp245 (SK005, SK039, SK048, SK051, SK237, SK248, SK454, КМ018, BK759G), у которых Fla либо не продуцировался, либо был парализован. Кроме того, при предварительном культивировании родительского штамма в статичных условиях, неблагоприятных для работы Fla, наблюдается пусть незначительное, но увеличение частоты перехода азоспирилл к Gri+-pacnpoaранению (см. ниже). Возможно, собственно вращающийся Fla или иные компоненты функционирующей Fla-сиетсмы каким-то образом вовлечены в регуляцию частоты фенотипической вариации у Л. brasilense. Также не исключено, что у систем, обеспечивающих Svva- или Gri-подпижностъ, существуют общие контролирующие элементы, поскольку среди мутантов A. brasilense Sp245 с различными нарушениями в продукции и функционировании жгутиков встречаются Svva~ ОтГ-штаммы (SK531. SK586, К/019. KZ020 и KZ044). К настоящему времени в литературе появились сообщения, свидетельствующие о том, что у азоспирилл в геноме присутствуют локусы, обуславливающие синтез пилей (Кацы, 2002а; Valverde et al., 2006).

Наблюдения за поведением Sp245 и его Svva"-M>TaiiTOB на полужидких средах позволили обнаружить у азоспирилл способ распространения с образованием микроколоний, скрытый у штамма дикого типа, что может быть обусловлено как большей скоростью миграции Svva^-KJierOK (рис. 2), так и доминированием в популяции Sp245 роящихся особей. Возможно, тестирование подвижности в полужидких средах отдельных бактериальных клопов позволит охарактеризовать фепоттпшческие вариации в способах распространения Sp245. Оказалось, что после инокуляции в полужидкую MSM (0.4% агара) отдельных колоний Sp245 с плотной MSM через 48 ч шесть (3<1(Г') из 1814 клонов демонстрируют GiT'-фепогин. Необходимо отметить, что мы наблюдали синтез ВГр не только у Swa~-мутантов, по и

у клеток дикого типа. Восемьдесят одна колония (5* КГ2) вообще не распространилась в агаре (Swa~ Gri"), а другие клоны образовали кольца роения. Проверка стабильности выявленных производных Sp245 показала, что в использованных нами лабораторных условиях клоны лого штамма со спонтанным (¡ri' или Swa~~<[>eiioTniioM оказались нестабильными (бактерии восстанавливали способность к роению). По описанной выше экспериментальной схеме было изучено поведение мутанта SK048 и отмечено появление Swa" колоний с частотой МО . Эти Swa"--колонии впоследствии дали начало Gr i' и Swa"-iiOTOMi<aM. Остальные колонии, образованные отдельными клонами SK048, были Gri+.

Образование клеточных агрегатов на корнях растений характерно для азоспирилл (Murlhy, Ladha, 1987), но природа клеточных структур и механизмов, определяющих агрегацию бактерий, остается не выясненной. Не исключено, что в случае клонов, выделенных после колонизации штаммом Sp245 корней пшеницы (бактерии находились 7 суток или 21 день на растениях, росших в жидкой среде), Gri+-раснросгранение станет преобладать. Однако анализ подвижности на полужидкой MSM клонов Sp245, выделенных после колонизации этим штаммом корней пшеницы, не подтвердил данное предположение - увеличивалось лишь число Swa" Gri"-колоиий, высеянных с корней 24-дпевиых растений (10"' клоков). Не исключено, что способ распространения A. brasilense в форме микроколоний, или клеточных агрегатов, является предпочтительным лишь при определенных условиях окружающей среды, например, в слизи, выделяемой корнями растений.

Для А. brasilense было показано (Wood et al., 1998), что связанная с дыханием активность Na-помпы, гю-пидимому, служит движущей силой для вращения Fla. Интересно было определить, стимулируют ли условия недостатка кислорода появление Gri+ или Swa'-колоний. Серийные разведения 24-ч статичных культур Sp245 смешивали с расплавленной MSM, содержащей 0.4% агара и выливали смесь на чашки Пегри. После застывания агара инкубировали при 32°С. Через 48 ч колонии формировали пераспространяющиеся Swa'-клоны (259 клопов) (размер колоний не изменялся через 72 или 144 ч), колонии с мутноватым Оп+~феногипом (34 клона) или колонии с Swa-феиотипом (остальные из 3235 клонов). Таким образом, частота появления Swa" (8*10"2) или Gri+ (I * НГ2)-фенотипа слегка возрастала в результате преипкубапии Sp245 без аэрации с последующей инокуляцией бактерий непосредственно в полужидкую среду, в которой возможно формирование области с пониженным содержанием кислорода, неблагоприятно влияющей на работу Па. Стоит отметить, что Swa" или Сп+-феногип оказался нестабильным и в этой серии экспериментов. Клетки SK048, выращенные в жидкой среде в условиях недостатка кислорода, протестировали так же, как и Sp245. Четыре из 680 колоний (6* 1(Г5), появившихся через 72 ч, показали смешанный фенотип. У двух колоний наблюдались небольшие кольца роения, а в случае двух других клонов Swa-сектора

распространялись из Gr¡+.....зон. После одного пассажа этих 4-х колоний па плотной

MSM и последующей инокуляции уколом в полужидкую среду псе клеточные линии демонстрировали Swa'-фенотип в течение 48 ч и стали зернистыми через 72 ч. Тридцать пя ть (~5Х 10~2) из 680 колоний, появившихся в полужидкой среде через 72 ч, были Swa". а осгакшаяся 641 колония - Gri'.

3.3 Особенности продукции и работы ф.тагсл.г у роишнхеи дериватов Gri+-штаммоп А. brasilense и у производных А. brasilense с ускоренным роением. Ин тересен BK759.G - Па" Gri "-мутант Sp245, клетки кот орого из сектора зоны роения, выходящей из Gri'-колонии, сохраняют способность к роению, в о тличие от особей с подобным поведением у SK048. Гак, часто па полужидкой среде у BK759.G

из произвольной точки зоны распространении микроколониями возникает фронт роения (рис. 3). Клопы, отсеянные из образовавшихся фронтон роения (ВК759.Р). приобретали устойчивый фенотип S\vaTl. Способность к Swa "-распространению сохранялась у них после многократ ных пассажей па плотной среде. Важно отметить, что переходы BK75Q.G к роению происходили только в полужидкой среде. Инокулированные в такую среду бактерии, выращенные в бульонной культуре, или отдельные колонии с плотной , среды, всегда давали . Grf-фенотип. Электронная микроскопия ВК759.Р показала, что клетки восстанавливали способность к синтезу Fla, отсутствующего у BK759.G, как в жидких, гак и на агаризованны.х средах. Количество Laf у ВК759.Р сохранялось на уровне штаммов Sp245, BK759.G и BK57I (Swa"). Таким образом, результаты изучения морфологии клеток Gri4--мутанта BK759.G и его Swa -производного BIC759.P показывают, что переход от Отт распространения к роению сопровождается восстановлением Fla.

Довольно часто на 3-4-е сутки после посева культуры клеток штамма А. lvasilen.se Sp245 уколом в полужидкую MSM от внешней границы колец роения начинают отходить так называемые

"протуберанцы" (или

выпячивания), имеющие большую скорость роения (рис. Зв). В результате рассева бактерий из протуберанцев до

отдельных колоний и перепроверки скорости их роения были отобраны пять спонтанных производных Sp245 со стабильным фенотипом Swa" (Sp245.PI-Sp245.P5). На полужидкой среде диаметр колец роения, формируемых штаммами Sp245.Pl-Sp245.P5. превышал таковой у Sp245 примерно в 1.8-2.5 раза. 1 !ри этом еще более быстро роящиеся клопы в популяции Swa1^ —производных Sp245 не появлялись. Скорость роста в жидкой и на плотной MSM у Sp245 и Sp245.Pl-Sp245.P5 была практически одинаковой. На плотной MSM морфология колоний Swa+<—вариантов была такой же, как у родительского штамма. В жидких культурах характер движения клеток Swa1 -производных Sp245 не отличался от такового у штамма дикого типа, а в средах, содержащих 0.3-0.4% агара, они перемещались, как и у ВК570, на более протяженные отрезки, чем клетки дикого типа. В жидкой или содержащей 0.3% агара MSM (па клетках есть только Fla) скорость движения отдельных клеток Swa' производных Sp245 (Sp245.PI-Sp245.P5). как и у ВК570. была выше, чем у Sp245. а при большей концентрации агара (па клетках есть Fla и Laf) эти различия исчезали. По-видимому, удлинение траектории прямолинейного движения и увеличение скорости движения клеток Swa - штаммов зависели от активности именно Fla.

Можно сделать несколько предположений о причине Swa' -фенотипа азоспирилл. Например, ускоренная миграция в полужидких средах может бы ть следст вием каких-то изменений в клеточной энергетике, обеспечивающей вращение I la (Wood el и!.. 1998). Взаимосвязь между высокими скоростями миграции в полужидких средах и подвижностью при помощи Fla прослеживается в случае омегонового Swa"-мутанта ВК570 и спонтанных Swa ' -производных Sp245.Pl-Sp245.P5.

Появление среди клеток BK759.G. формирующих агрегаты при колонизации

Рис. 3. Макроколонии, сформированные клетками штамма Л.

ЬгстИепяе 8р245 (а. в) и его мутанта ВК759.С (б) в М8М, содержащей 0.4% агара. Время инкубации 72 ч. Масштабная линейка соответствует 10 мм. Стрелки указывают на концентрические выбросы (протуберанцы).

If.

полужидких сред, субпопуляции бактерий с восстановленной способностью не просто к роению, а к роению, эффективность которою гораздо выше, чем у родительского штамма, наводит на мысль, что Svvu" "-фенотип ВК759.Р связан с активностью I Ia. Однако у Swa++-MyraHTOB ВК759.Р, ВК468 и ВК571 клетки движутся при помощи Fla в жидких средах с той же скоростью, что и бактерии родительского штамма (у ВК759.Р, ВК468 и BK57I скорость составляла 29.2 ± 2.5, 33.2 ± 1.5 и 31.9 ± 2.0 мкм/с, соответственно, а у Sp245 - 30.3 ± 1.5 мкм/с). Таким образом, ускоренная миграция в полужидких средах может быть не только следствием каких-то изменений в клеточной энергетике, обеспечивающей вращение Fla (Wood et al., 1998), но и обусловлена другими причинами. Возможно, у каких-то Svvaw-np0H3B0ÄHi.ix структура полярного жгутика, обеспечивающего активность роящихся клеток, модифицирована таким образом, что Fla способен эффективнее вращаться в полужидком агаре. Например, показано, что флагеллип Flay Л. brasi'lerne Sp7 гликозилирован (Moens et al, 1995). Также показано, что филамент Fla у А. brasilense покрыт полисахаридным чехлом (Бурыгин, 2003). Можно предположить, что модификация в гликозильной части флагеллина или в его полисахаридном чехлике приводит к облегчению вращения Fla в полужидких средах. Нельзя исключать, что 8\уа++-производные сверхпродуцируют позитивный гипотетический регулятор коллективного распространения бактерий в полужидких средах (или у них снижен уровень синтеза негативного регулятора). Причина быстрого распространения также может быть приписана более интенсивному потреблению питательных соедииений и, в результате, ускоренному образованию градиентов последних, по которым двигались бактерии. Однако стоит отметить, что скорость роста в жидкой и на плотной MSM у всех омсгоновых мутантов не отличается от таковой у штамма Sp245.

3.4 Блипннс продуктов бактериального метаболизма па социальную подвижность азоспнрилл. Получены косвенные данные, что характер и эффективность распространения азоспирилл в полужидких средах обусловлены продуцируемыми бактериями метаболитами. Так между макроколониями азоспирилл остаются незараегающие зоны (демаркационные зоны) (например, рис. 3). В местах сближения границ фронтов движущихся бактерий форма колонии искажается. Образование незарастающих зон происходит независимо от состава среды. Столкновение фронтов движущихся бактерий может быть обусловлено ингибируюшим действием метаболитов, выделяемых микроорганизмами, концентрация которых удваивается в зоне сближения колоний (Иваницкий, 1999). Выделяемые азоспириллами какие-либо ингибиторы могут способствовать перемещению клеток из точки инокуляции (как при Svva-, так и при Gri-подвижности), а также препятствовать сближению микроколоний при Gri-раснрострапении. Их действие на медленно движущиеся клетки Gri'-мутаптов будет мешать сближению бактерий, что может способствовать образованию клеточных агрегатов, состоящих из сохраняющих межклеточные связи потомков изолированных друг от друга особей.

3.5 Влиинис модификации клеточной поверхности, вызванных адсорбцией нрпжпшенного красителя конго красного, на подвижность азоспирилл. Механизмы, обусловливающие вариации и коллективной подвижности бактерий, зависят не только от работы двигательных органелл. но и от межклеточных взаимодействий (Harshey, 2003), которые определяются структурой бактериальной поверхности. По-видимому, изменения в структуре бактериальной поверхности могут быть индуцированы адсорбцией на клетках прижизненных красителей. Так,

утлеводеодержащис полимеры А. brasilense способны к образованию комплексов с коиго красным (Skvortsov, Ignatov. 1998). В результате на плотной среде с красителем колонии азоспирилл приобретают красную окраску (Bastarrachea et al, 1988). Следует отметить, что конго красный может взаимодействовать и с белковыми компонентами поверхности бактерий (1 lammar et al., 1995).

При определении способности к адсорбции коиго красного штаммом Sp245, его 8\\'а1+-производными и неспособными к роению мутантами строгой корреляции между интенсивностью адсорбции красителя бактериями, инкубируемыми на плотной среде с красителем, и размером и морфологией колоний, образующихся в полужидкой MSM, нами не выявлено. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в жидких 24-часовых культурах А. brasilense Sp245 в MSM без красителя или с коиго красным (37.5 мкг/мл), было практически одинаковым. Выращенные в жидкой MSM, содержащей 37.5 мкг/мл красителя, клетки обладали внешне нормальным Fla. При культивировании в жидкой MSM, содержащей конго красный (но не при добавлении красителя к выросшей культуре), скорость движения клеток, за исключением клонов CRP (см. ниже), снижалась (табл. 2).

Таблица 2. Средняя скорость движения клеток штамма/f. brasilense Sp245 и его

производных, выращенных в жидкой или полужидкой среде

Штамм А.brasilense Средняя скорость движения клеток, мкм/с

в жидкой среде в полужидкой MSM с концентрацией агара, %

MSM MSM + конго красный* 0.3 0.4 0.6

Sp245 29.0Ü.1 14.9±0.7 14.4Ü.8 12.4±1.1 8.7±1.3

13К.570 34.8Ü.0 21.4±2.7 19.9±|.8 14.0±|.9 8.8±1.2

Sp245.Pl 36.8±2.1 17.7±1.0 17.7±1.4 13.3±0.6 8.2±0.9

Sp245.P2 34.3±1.9 18.9±1.б 18.2±1.2 14.3±1.8 8.3±1.3

Sp245.P3 36.0±2.2 22.4±2.3 18.1±1.3 14.1±1.2 8.7±1.4

Sp245.P4 36.7±3.4 19.8±2.0 17.3Ü.2 14.0Ü.3 8.4*1.2

Sp245.P5 35.3±2.5 19.2±2.2 18.2*1.8 14.2±1.6 8.&Ы.З

Sp245.CRP 28.5±2.0 26.0±1.8 13.6±1.3 12.8±1.1 8.2X1.1

Sp245.Pl.CRP! 30.5±2.9 26.7±1.9 13.6±1.5 11.Ш.8 7.8Ü.O

Sp245.Pl.CR.P2 29.3±2.3 24.5±1.9 I3.7Ü.2 12.6±1.0 8.7±1.0

Примечание: *Копцентрация конго красного составляла 37.5 мкг/мл.

На полужидкой MSM, содержащей конго красный, штаммы Sp245, Sp245.Pl-Sp245.PS и ВК570 радикально меняли свое поведение и начинали мигрировать с образованием микроколоний (рис. 46) через 24 ч после инокуляции (без красителя движение начиналось через 2.5-5 ч). Макроколоиии названных штаммов имели светло-красную окраску. В случае мутантов SK048. SK051, SK248 и SK454 конго красный не влиял на продолжительность фазы (~24-42 ч), предшествующей началу Сп-распростраиения.

Выделены производные Sp245 (Sp245.CRP) и Sp245.PI (Sp245.PI.CRPl-Sp245.Pl.CRP4), способные к роению и в присутствии красителя. При тгом зоны роения, и отличие от светло-красных Gri' -макроколоний, приобретали в полужидкой среде оранжевую окраску.

На плотной MSM CRP-варианты адсорбировали конто красный по-разному: колонии Sp245.CRP и Sp245.PI.CRIM были светло-розовыми, а Sp245.IM.CRP2 -ярко-красными. Иными словами, изменение плотности среды и/или концентрации кислорода и/или локальной концентрации бактерий влияло на структуру клеточной поверхности азоспирилл. взаимодействующей с красителем. Диаметр колец роения.

образуемых штаммами Sp245.PI.CRP(I--4) и Sp245.CRP в полужидкой MSM. был примерно па 32% меньше, чем гаковой у Sp245. В присутствии 37.5 мкг/мл конго красного диаметр колец роения Sp245.CRP и Sp245.PI.CRP(l-4) уменьшался. Скорость движения клеток Sp245. Sp245.CRP и Sp245.Pl.CRP в жидкой MSM без красителя была практически одинаковой (табл. 2). При выращивании бактерий в жидкой среде с конго красным скорость перемещения клеток Sp245.CRP и Sp245.Pl.CRP. в отличие от таковой у штамма дикого типа и его еуперрояшихея производных, почти не снижалась (табл. 2). По-видимому, варианты Sp245.CRP и Sp245.PI.CRP способны преодолевать ингибирующее действие конго красного за счет модификации экстраклеточных соединений, образующих комплексы с красителем. Стоит отметить, что модификации экстраклеточных соединений в случае роящихся в присутствии конго красного производных Sp245.Pl, возможно, затрагивают структуры, связанные с Fia, поскольку скорость движения клеток Sp245.Pl.CRPl и Sp245.Pl.CRP2 ниже, чем у родительского варианта. Это могут быть изменения в гликозильной части флагеллина или в его полисахаридном чехлике.

Выло изучено влияние разных концентраций конго красного на коллективную подвижность н полужидкой MSM штамма А. brasilense Sp245 и его мутантов. Обнаружен ИР' переход Sp245 и ВК570 от образования концентрических колец роения (при

концентрации конго красного, не ШИИ ШШ1

превышающей 2.3 мкг/мл) через Рис. 4. Колонии, образованные

макроколонии смешанного мутно-зернистого А- h'™'e"se Sp245 » полужидкой MSM: , , т т г> т / без конго красного (а), с 37.5 мкг/мл

фенотипа (в присутствии 2.3-9.3 мкг/мл конго 1 ... v ''

1 конто красного (б); световая микроскопия

красного) к распространению с образованием макроколонийспанелиб(в). Содержание

микроколоний (при концентрации красителя агара0.4%, время инкубации 72 ч.

выше 9.3 мкг/мл). У SK05I, SK248 и SK454 на Масштабная линейка соответствует

средах с конго красным отмечено замедление IOmkmîbI.

коллективной подвижности и сохранение зернистой морфологии макроколоний.

Скорости движения одиночных клеток штамма Sp245, выращенных в жидкой MSM с копго красным или в полужидкой MSM с 0.3-0.4% агара, различались мало (табл. 2). Па полужидких средах без конго красного, независимо от содержания агара и степени торможения клеток, культуры Sp245 формировали концентрические кольца роения. Зернистые макроколонии Sp245 образовывались только в присутствии красителя. Вероятно, Sp245 продуцирует, по меньшей мере, два соединения, взаимодействующие с конго красным и способствующие коллективной миграции бактерий. Если конго красный блокирует соединение, необходимое для роения клеток, у бактерий снижается подвижность, обеспечиваемая жгутиками, и индуцируется G ri -фенотип. Второе из соединений, возможно образующее менее прочный или менее специфичный комплекс с красителем, может быть необходимым как для роения, так и для распространения азоспирилл с образованием микроколоний. Слабое взаимодействие конго красного со вторым соединением приводит к небольшому снижению скорости Cri '-распространения бактерий. Когда первое соединение заблокировано, другие компоненты клеточной поверхности могут восполнить недостающие функции (например, в результате повышения уровня продукции), помочь клеткам преодолеть ингибирующее действие конго красного и возобновить роение (если жгутиковый аппарат клеток не поврежден в результате мутации).

Описана способность поверхностных полимеров поверхности клеток A. brasilense Sp245 адсорбировать конго красный. Так, смещение длинноволнового максимума поглощения конго красного, свидетельствующее о формировании комплекса (Wood, 1980), в случае добавления к раствору красителя липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК) штамма Sp245 составляло 19 нм, а в случае добавления кислых полисахаридов (ПС), выделенных из полисахарид-липидного комплекса (ПСЛК) этого штамма, - 5 нм (Коннова, 2002). Смещение максимума поглощения можно наблюдать не только при добавлении к раствору красителя препаратов бактериальных полимеров, но и в том случае, если конго красный адсорбирован на поверхности интактных клеток (Weimer et al., 1998). По нашим наблюдениям смещение максимума поглощения конго, накопленного клетками штамма Sp245, составляет 19.4±1.8 нм, что сопоставимо с показателем, свидетельствующим о формировании комплекса красителя с ЛПБК штамма Sp245.

Бактерии рода Azospirillum способны к ассоциативному взаимодействию с чрезвычайно широким кругом растений. При колонизации корней растений часто происходит образование микроколоний азоспирилл посредством неизученных механизмов (Burdman et al., 2000). Формирование зернистых дисков на средах с конго красным наблюдалось у 15 исследованных штаммов A. brasilense (Cd, KR77, SI7, S27, Sp7, Spl07, Sp245, SpBrI4, SR8, SR15, SR55, SR75, SR80, UQ1794, UQ1796) дикого типа, у 2-х штаммов A. irakense (КАЗ, КВС1) и 2-х штаммов A. lipoferum (Sp59b, SpRG20a), независимо от их происхождения или различий в скорости роения на среде без красителя. Отсутствие перехода к Gri-распространению отмечалось у штаммов А. halopraeferans AU4 и A. lipoferum SpRGóxx.

3.6 Роль полисахаридов клеточной поверхности в реализации социальной подвижиости A. brasilense. Выше показано, что азокраситель конго красный осуществляет роль модулирующего фактора, нарушающего контакты между бактериями. Вероятно, природа взаимодействий, определяющих такие контакты азоспирилл, может определяться поверхностными полисахаридами.

3.6.1 Изменения в подвижности у cal и Ips мутантов/1. brasilense Sp245. Анализ поведения на полужидких средах нескольких классов cal и Ips мутантов Sp245 показал, что наиболее существенно изменилось поведение на агаризованных средах спонтанного мутанта Cal" Lpsr LpsIF" Sp245.5. В полужидкой среде клетки Sp245.5 формируют "диффузную" колонию, тогда как бактерии дикого типа образуют четко очерченный диск. В случае мутанта фронт движущихся бактерий в отличие от дикого типа характеризуется несколько меньшей плотностью клеток. Размер колоний, сформированных за 36 ч подвижными клетками Sp245.5 на MSM (0.4% агара), превышает таковой у Sp245 и составляет соответственно штамму 26.1±0.8 и 21.8±0.8 мм. Интересно, что у мутанта скорость движения клеток в жидких средах (обеспечиваемая активностью Fla) ниже, чем у дикого типа (17,1±0.8 и 29.0±1.1 мкм/с, соответственно). В присутствии конго красного распространяющиеся клетки Sp245.5, в отличие от Sp245, сохраняют морфологию колоний, наблюдаемую на среде без красителя. Таким образом, последствиями существенных изменений в свойствах поверхностных полисахаридов могут быть изменения межклеточных контактов, опосредуемых либо полисахарид-полисахаридными взаимодействиями, либо связями полисахаридов с белковыми или липидными компонентами бактериальной поверхности.

Если мутация приводит к изменениям, затрагивающим свойства одного или двух полисахаридов, столь радикальных изменений в поведении клеток, как у Sp245.5, не наблюдается. Клетки омегоновых мутантов штамма Sp245, относящихся к классам

СаГ ЬрйГ (КМ252), ЬрэГ (КМ 127, КМ134, КМ348) ~ и Lp.sH" (КМ 139), распространяются по полужидким средам, формируя колонии, морфология которых характерна для родительского штамма. Однако у КМ127, КМ 134, КМ348 и КМ139 диаметры колоний превышают размер колоний 8р245. Скорость плавания клеток у КМ127, КМ 134, КМ348 и КМ139 не отличается от скорости движения Яр245. В случае КМ252 отличия в скорости распространения по полужидким средам незначительны. Стоит отметить, что у клеток КМ252 наряду с утратой Ьря! произошли изменения в синтезе ПССК.

3.6.2 Подвижность А. ЬгахИете в присутствии поликлональпых антител на полисахариды и флагеллии. Антитела можно рассматривать как модулирующий фактор, усиливающий или ингибирующий межклеточные взаимодействия, обусловленные поверхностными структурами бактерий. Проведено исследование подвижности различных штаммов в присутствии штаммоспецифичных антител (Ат) на ЛИС штаммов А. ЬгазИе>ие 8р245 и Эр7, а также Ат на флагеллии типового штамма Йр7. Диаграмма зависимост и процента подвижных клеток и средней скорости подвижных клеток Бр245 от концентрации штаммоспецифичных Ат на ЛПС (рис. 5) показала, что увеличение концентрации Ат приводило к полному прекращению движения бактерий. Снижение скорости движения подвижных клеток в присутствии Ат, а также визуально наблюдаемые при этом резкие остановки свободно плавающих клеток А. ЬгазИепхе или переход от поступательного движения клеток к кувырканию позволили заключить, что подавление движения вызвано взаимодействием антител с полярным жгутиком бактерий, покрытым чехлом, в состав которого входят ЛПС. Добавление как Ат на флагеллии, так и Ат на ЛПС другого штамма, не приводило к такому эффекту (табл. 3).

Таблица 3. Влияние антител различной специфичности на процентное содержание подвижных клеток А. Ьга$11ете и их скорость движения _

Подвижные клетки А. ЬгазИепзе, %

Штамм без антител Лт/ЛПС5„7 Ат/ЛПСад« Лт/флагеллиН5П7

5р7 1 85.5±2.2 0 84.0±3.3 62.7±2.7

Бр245 85.8±3.8 84.ШЗ.З 0 82.8±2.7

5р107 84.0±2.8 81,2±2.9 63.8±4.0 77.8±2.6

Средняя скорость подвижных клеток А. ЪгазНепье, мкм/с

г5р7 36.7±2.8 0 36.0±3 7 28.5±1.0

5р245 29.9±3.5 32.7±1.8 0 32.3±2.9

5р107 31.3±5.2 31.9±3.2 26.3±1.5 31.6±2.3

Примечание: Концентрация всех использованных в экспериментах антител составляла 1 мг/мл.

Последнее послужило отправной точкой для разработки серологического теста, заключающегося в ингибировании подвижности бактерий вида А. ЬгайИеюе при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител на ЛПС. О специфичности взаимодействия антител с бактерями в данном тесте судили, оценивая подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа и определяя скорость движения у случайно выбранных подвижных клеток. В серии экспериментов по исследованию подвижности клеток 11 штаммов А. ЬгайИете (Чр1. Сс1, 81155, 81*80. Бр245, 817, Б27, 81*15. 81<75, 8рЮ7 и 8К8) в присутствии Ат на ЛПС определены штаммы, показывающие антигенные перекресты с 8р7 или 8р245. Выявлена корреляция между наличием антигенных перекрестов в реакции иммунодиффузии и снижением процента подвижных клеток и их скорости в присутствии Ат па ЛИС 8р7 или Бр245 у штаммов Бр7. Сс1. 8К5х 8К80 или 8р245. 817, 827, 8К15, 8К75. ЛПС штаммов 8р245

срсдня* а'опск-а

тдапшеннмк, 50

цнщенткое содфяатк поаышшхкяет;

и 8р107 в тесте иммунодиффузии демонстририровати лишь минорные антигенные различия, свидетельствующие о том, что в составе ОПС1 штамма 8рЮ7 отсутствуют некие антигенные детерминанты, присутствующие в составе ОПС1 штамма Бр245. Вследствие этого Ат на ЛПС Бр245 (в концентрации, ингибирующей подвижность клеток данного штамма) лишь незначительно изменяли подвижность клеток Эр 107 в жидкой и полужидкой средах. Ингибирующий эффект достигался увеличением концентрации Ат на ЛПС вр245, поскольку это приводило к увеличению количества Ат на общие для 8р245 и 8р 107 детерминанты. Таким образом, тест на ингибирование подвижности бактериальных клеток в присутствии Ат может быть информативным при исследовании углеводных антигенных детерминант, представленных в составе клеточной поверхности.

Штаммоспецифические Ат на ЛПС (в отличие от Ат на флагеллин) также снижали скорость распространения Бр245 или 8р7 в полужидких средах. Размер бактериальных колоний в присутствии штаммоспецифических Ат на ЛПС значительно уступал их диаметру в контрольных экспериментах. Мутант 8р245.5 с полностью измененным ЛПС сохранял диаметр колец роения в присутствии Ат на ЛПС 8р245. Таким образом, снижение скорости движения клеток, обусловленное взаимодействием Ат на ЛПС с полярным жгутиком (чехлом) и возникновением на линии фронта движущихся бактерий иммунных агрегатов, тормозящих

распространение азоспирилл в

кояцнкрадаи Аг т&т Рис. 5. Зависимость средней скорости движения клеток (/) и процента подвижных клеток (2) А. ЬгазИете 8р245 от концентрации Ат на ЛПС данного штамма.

полужидком агаре, позволяет рассматривать антитела как модулирующий фактор, усиливающий межклеточные контакты, обусловленные взаимодействиями с участием полисахаридов. Говоря о межклеточных контактах, обусловленных взаимодействиями с участием полисахаридов, необходимо отметить, что агрегацию клеток азоспирилл в жидкой культуре опосредуют взаимодействия полисахаридов и белков-гемагглютининов (Никитина с соавт. 1994, 2001). Возможно, при колонизации полужидких сред аналогичные лектин-углеводные взаимодействия обеспечивают контакты между движущимися клетками.

3.7 Влияние поверхностного гемагглютинина А. ЬпиИеп\е 8р245 на социальную подвижность этих бактерий. Уровень продукции полисахаридов и активность гемагтлютининов азоспирилл изменяются в зависимости от наличия в среде связанного азота и его химической природы (Yagoda-Shagam е/ а1., 1988; Никитина с соавт., 2005), что в свою очередь может влиять на формирование межклеточных контактов. Изучение подвижности А. Ьгаз'Лете показало, что в аэробных условиях на полужидких средах без источника связанного азота клетки штамма 8р245 формируют макроколонии, превышающие диаметр колоний, образованных в присутствии аммония, нитрата или нитрита (рис. 6). На среде без азота через 36 ч после инокуляции бактерии распространяются в 3.7 раза быстрее в толще среды, чем по ее поверхности, а в присутствии аммония, нитрата или нитрита

ДЩМСф ЬСЛОКИЛ. '.['

50 т

о,2\

беч связанного lAeilS-

гг s —— KNO, ■ВВП»

ЮЮг Щ»

беч связанного а-мтз ИИВкшиш

, ЙИШИш-

" KNOj

KN0z

< 10 20 30

дшвтр Kwwmia №i

эти различия составляют только 1.4-1.6 раза (рис. 66). Вероятно, азоспириллы. будучи микроаэрофилами (Tarrand et al.. 1978). в отсутствие азота преимущественно формируют колонию в микронише, благоприятной для работы нитрогеназы. Присутствие связанного азота, в том числе, и его накопление при азотфикеации (например, к 72 ч инкубации) способствует развитию колонии на поверхности среды. На средах с 0.2-0.4% агара » ряду "аммоний-нитрат-нитрит" наблюдается уменьшение размера ,, п

колоний (рис. 6а, б). Максимальный диаметр колоний на полужидкой MSM (0.4% ' агара), содержащей хлорид

аммония или нитрат калия, не зависит от

концентрации соли в диапазоне 1-3 г/л. Изменение концентрации аммония или нитрата в среде выращивания не влияет на скорость индивидуального движения клеток штамма Sp245 в жидкой среде. Так, при концен трации солей 1 или 3 г/л скорость и ндивидуального движения клеток,

соответственно, составляет

28.6±1.5 и 28.6±1.4 мкм/с в присутствии аммония и 29.9±1.5 и 29.8±1.4 мкм/с в присутствии нитрата. Скорость движения клеток, выросших на среде с нитритом, несколько уменьшается с увеличением его концентрации. Клетки, выросшие в присутствии 1 г/л или 3 г/л нитрита, двигаются, соответственно, со скоростью 24.4*1.2 или 22.44-1.4 мкм/с. Однако диаметр колоний в сходных условиях не изменяется.

Таким образом, па MSM, содержащей 0.2-0.4 % агара и аммоний, нитрат или нитрит, скорость движения отдельных клеток - не единственный показатель, определяющий размер колоний. Возможно, присутствующий в среде источник азота влияет на взаимодействия, определяющие контакты между перемещающимися бактериями, что сказывается на диаметре колоний. На средах с 0.6% агара роль взаимодействий, модулируемых источником азота, становится не столь существенной, очевидно, в результате того, что клетки на более плотных средах между собой находятся в более тесном контакте.

Агглютинацию трипсинизированных эритроцитов вызывают жидкие бактериальные культуры Sp245, выросшие в стационарных условиях на среде с 1 г/л хлорида аммония, суспензии клеток этих культур в фосфатно-солевом буфере (ФСЬ) и культу рал ьная жидкость, освобожденная от бактерий. Во всех случаях титр реакции агглютинации составил 1:4. Обработанные в течение 8 ч трипсином клетки штамма 8р245 утрачивали способность агглютинировать трипсинизировапные эритроциты. На проявление агглютинирующей активности бактерий в отношении нативных

; кониенТрпня агара. %

Рис.6. Характеристика колоний, формируемых А. ЬгаяНепяе 5р245 после точечной инокуляции суспензии клеток в полужидкие среды, содержащие разные источники азота (1 т/л), а - на средах с концентрацией агара 0.2, 0.4 или 0.6%. (/ -без связанного азота; (2-4) в присутствии: 2 - N1 1,|С1, 3 - КЫО.ч, 4 - КЫОг). Время инкубации - 36 ч. б - на средах, содержащих 0.4% агара (/ - диаметр колоний на поверхности агара; 2 -диаметр колоний в толще агара). Время инкубации - 36 ч и 72 ч.

эритроцитов, несущих белковые рецепторы, чувствительные к трипсину, влияют мутации в синтезе полисахаридов. В суспензиях клеток в ФСБ, выросших в жидкой MSM с аммонием, у мутантов КМ252 (Lpsf СаГ) и КМ348 (LpsP) титр реакции агглютинации составил, как и у Sp245, 1:16. У мутантов КМ139 (Lpsü") и Sp245.5 (LpsF LpsII" Cal") титр реакции гемагглютинации, соответственно, составил 1:4 и 1:32. Не исключено, что у мутантов различия в гемагглютинирующей активности обусловлены не только разной структурой полисахаридов, но и разным влиянием последних на активность гемагглютининов.

Способность культур штамма Sp245 вызывать агглютинацию эритроцитов изменяется в зависимости от источника связанного азота в среде выращивании бактерий. Титр агглютинации трипсинизированных эритроцитов жидкими культурами Sp245, выросшими в стационарных условиях на среде с 1 г/л нитрита или нитрата калия, составил 1:16, а в случае 1 г/л хлорида аммония - 1:4. Изменение содержания хлорида аммония в среде выращивания (1, 3 или 0.05 г/л) не влияло на агглютинирующие свойства культур Sp245.

В случае Sp245 повышение гемагглютинирующей активности бактерий и уменьшение диаметра "колец роения" в средах с нитратом или нитритом позволяют полагать, что размер сформированных подвижными клетками колоний может зависеть от поверхностных структур, опосредующих гемагглютинацию. Не исключено, что существует связь между способностью поверхностных полимеров, участвующих в формировании межклеточных взаимодействий, вызывать агглютинацию эритроцитов и влиять на подвижность бактерий.

Добавление к суспензии клеток Sp245 гемагглютинина (ГА), выделенного с поверхности клеток этого штамма, приводит к заметному снижению скорости движения бактерий в жидких средах (рис. 7). Эффект сохраняется более 30 мик инкубации. Присутствие ЛПС, ЛПБК или ПСЛК не сказывается на подвижности бактерий. Исследование подвижности мутантов Sp245 с нарушениями в продукции

полисахаридов в присутствии ГА показало, что он не влияет на

подвижность клеток мутанта 8р245.5 с кардинальной перестройкой в структуре

полисахаридов. ГА вызывает незначительное снижение скорости движения мутантов КМ252 и КМ348, (ОПСГ), и замедляет движение клеток мутанта КМ 139 (ОПС1Г) (рис. 7).

Предварител ьная инкубация ГА с ЛПС, ЛПБК и ОПС1

скорость движения клеток, мкм'с 40

КМ1» КМ252

ШП1ММ

скорость движения клеток 8|>245, мкм'с 41) i

И

30 i

5(1 i 13 j 10-j

kOHlWI«l>!lUIW 1 A Sp J4?, MkT-MI

Рис. 7. Влияние полимеров, выделенных с поверхности клеток штамма 8р245, на подвижность А. brasilea.se в жидких средах, а - скорость движения клеток разных штаммов азоспвриял а: I - ФСБ;

2 - ФСБ + ГА. Концентрация ГА - 5

«кг/мл. Вра.т янхубацин - 1 .мин. б — скорость дыгження клеток штамма ?р245 в:

/ - ФСБ; 2 - ФСБ + ЛПС, 3 - ФСБ + ЛПБК, 4 - ФСБ + ПСЛК., 5 -ФСБ + ОПС1, 6 ФСБ + ОГК л'. Концентрация полисахаридом - 50

мкг/'мл. Время иккуЗаи.ии - 1 мин.

приводит к ингибированию его воздействия на скорость 1 движения клеток. В присутствии ПСЛК или ОПСН действие ГА на скорость движения бактерий на 9.3 или 12.6% менее эффективно в сравнении с незаблокированным белком (рис. 7). У штамма Sp245 в состав Л ПС, ЛПБК и ПСЛК входят' сходные моносахариды и антигены, идентичные таковым у ОПС1 (Коннова с соавт., 2005). Результаты измерения скорости движения мутантов и данные ингибиторного анализа позволяют говорить о значительном сродстве ГА к ЛПС Sp245. Моносахариды рамноза, глюкоза, галактоза и глюкозамин, входящие в состав ЛПС, ЛПБК или ПСЛК, не блокируют действие ГА на подвижность. Следует отметить, что рамноза находилась в L-форме. В тоже время ОПС1 и ОПСН, представляющие собой линейные D-рамнаны (Федоненко с соавт., 2004), подавляют (в разной степени) влияние ГА на скорость движения бактерий Sp245. Степень сродства ГА к ОПС, скорее всего, обусловлена конформацией и зарядом последнего. Так, кислый ОПС1 полностью снимает эффект воздействия ГА на подвижность клеток Sp245, а нейтральный ОПСН ингибирует данную активность ГА только на 12.6%. При этом отсутствие ОПСН у мутанта КМ 139 не позволяет ГА вызвать снижение скорости движения клеток мутанта с той же эффективностью, что и у штамма дикого типа (рис. 7). Только в случае мутанта Sp245.5, утратившего ОПС, содержащий D-рамнан, подвижность клеток не изменялась в присутствии ГА. В полужидких средах Sp245.5 формирует "диффузные" колонии, тогда как бактерии дикого типа образуют четко очерченные кольца. Образование "диффузных" колоний происходит, несмотря на то, что в ФСБ гемагглютинирующая активность суспензии клеток Sp245.5 вдвое превышает таковую у Sp245 (1:32 у мутанта и 1:16 у родительского штамма). Необходимо отметить, что результаты определениия специфичности ГА Sp245 (лаборатория микробиологии ИБФРМ РАН) ингибированием углеводами реакции гемагглютинации согласуются с данными влияния ГА на подвижность бактерий.

Из литературных данных известно, что контакты бактерий, распространяющихся по агаризованной среде, опосредованы белковыми структурами и ЛПС. Так, у бактерий M. xanthus углевод-белковые взаимодействия необходимы для коллективного, скоординированного скольжения клеток и формирования структур надклеточного уровня (при агрегации и споруляции) (Bowden et al., 1998; Will et al., 1998). Результаты настоящей работы позволили впервые описать роль межклеточных контактов, обусловленных взаимодействиями ГА и ОПС в распространении азоспирилл - бактерий, использующих для движения жгутики. Подобные взаимодействия бактерий модулируются, в частности, в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода, что, в свою очередь, может иметь значение при бактериальной колонизации корневой системы растения.

3.8 Молекулярно-генетическая характеристика мутантов A. brasilense Sp245 по социальной подвижности. В таблице 1 представлена молекулярно-генетическая характеристика Fla, Laf, Mot, Swa h Gri -мутантов A. brasilense Sp245, полученных с помощью Omegon-Km и Тп5-А/о6-мутагенеза. Характеристика основана на результатах ECL-гибридизации ДНК мутантов с меченными пероксидазой зондами, содержащими ДНК транспозонов или векторов для мутагенеза и анализа плазмидного состава по методу Eckhardt (1978). Штамм А. brasilense Sp245 содержит плазмиды р85 (с молекулярной массой 85-МДа), р120 (120-МДа) и три плазмиды с молекулярной массой >300 МДа (Кацы, 1992). Поскольку плазмиды составляют весомую долю генома А. brasilense, закономерен интерес к роли этих внехромосомных элементов в обеспечении поведения бактерий (Кацы, 2002а).

Образование коинтегратов векторов для мутагенеза с р85 приводит как к утрате

способности клеток синтезировать функционирующие флагеллы, так и к появлению бактерий с ускоренным роением. В случае инсерций омегона в р 120 нарушается не только продукция и функционирование жгутиков, но и изменяются свойства поверхностных полисахаридов. Среди этих мутантов с нарушениями синтеза ЛПС ряд клонов демонстрируют Swa^-фенотип:

Анализ плазмидного состава штаммов А. brasilense BK759G (Оп+-фенотип) и ВК759Р (Swa^-фенотип) показал, что различия в подвижности Сп+-мутанта и его Swa^-производного согласуются с плазмидной перестройкой. Из плазмидного профиля ВК759Р исчезает р85 и появляется новая плазмида с молекулярной массой 36 МДа. Можно предположить, что новый 36-МДа репликон, обнаруженный в геноме ВК759Р, сохраняет локусы, необходимые для ускоренного роения, а генетические элементы, необходимые для Gri-распространения либо элиминированы, либо их интеграция в другие репликоны клетки затрудняет/блокирует их экспрессию.

Гибридизация ВатШ- и А7ю1-переваров тотальной ДНК Sp245 и его мутантов ВК468, ВК571, ВК759Р и BK759G с ДНК вектора pJFF350 и различными зондами (табл. 4) позволила более подробно исследовать вышеуказанную перестройку. Результаты гибридизации показали, что переход BK759G от распространения с образованием микроколоний к ускоренному роению (ВК759Р) сопровождается изменениями длин фрагментов рестрикции тотальной ДНК, гибридизующихся с фрагментами р85 и р120. Эффективность распространения в полужидких средах клеток ВК759Р сопоставима со скоростью роения ВК468 и ВК571 (Svva^-^фенотип). Однако картина гибридизации pJFF350, фрагментов р85 и р120 с ДНК этих трех . Swa**—штаммов различается (табл. 4). Таким образом, переход от Gri+— распространения клеток мутанта BK759G к Бша^-подвижности (ВК759Р) сопровождается перестройкой генома, затрагивающей плазмиды, а возрастание скорости коллективного роения бактерий, по-видимому, обуславливают несколько генетических локусов/4. brasilense Sp245.

Таблица 4. Полиморфизм длин фрагментов рестрикции тотальной. ДНК А. brasilense

Штамм А. brasilense Рестриктазы, использованные для гидролиза ДНК Размер фрагментов рестрикции ДНК (т.п.н.), прогибридизовавшихся с зондами

1 (р85-1) 2(р85-2) 3(р120-1) 4(р120-2)

Sp245 (Swa+) Xhol 16.6; 11.1 12.8 13.6 7.8

ВатШ 15 4 14.5 ~2t

ВК468 (переход от Swa4 к Swa++) Xhol 16.6; 11.1 12.8 13.6 7.8

ВатШ 15 4. 14.5 -21

ВК571 (переход от Swa* к S\vaT+) Xhol 16.6; 11.1 - 13.6 7.8

ВатШ 15 - 14.5 -21

BK759G (переход от Swa+ к Grf) Xhol -23; 11.1 12.8 13.6 7.8

ВатШ -21; 15 4 15 -21

ВК759Р (переход от Gri* к Swa") Xhol 11.7 15 15 8.1

ВатШ -21; 15.9 но. 19.1; 15.9 -26

Примечание: Зонды: 1 -2.4-т.п.н. £соЯ1-фрагмент р85, несущий локусы Аа, 1а/, то1, 2- 1.1-т.п.н, ЯсоШ-фрагмент р85, несущий локус 3 - 14-т.п.н. Ва7нН1-фрагмент, несущий

локусы р120 1рз1,lps.Il и са/; 4 - 8.3-т.п.н. ВатН1-фрагмент, несущий локусы р 120/1а, яга. Н о.-не определяли.

Вероятно, для функционирования генов, обеспечивающих подвижность бактерий с образованием микроколоний, присутствие в геноме репликона р85 является существенным. Например, у трех 8\уа~ ОгГ-мутантов штамма Эр245 с различными

нарушениями в продукции и функционировании жгутиков, KZ019, KZ044 и KZ020, исследование плззмидного профиля показало утрату р85 (табл. 1).

В случае сохранивших р85 мутантов штамма Sp245 с похожими дефектами в продукции и функционировании флагелл (BK759G, SK039, SK237 или SK454) утрата способности к роению компенсируется Gri^-распространением. У мутанта Sp245.5 (утрачены р85 и р120) поведение клеток в полужидких средах не изменяется в щжсутствии конго красного, способствующего переходу азоспирилл к Gri-подвижности. В настоящей работе представлены два мутанта Sp245, содержащие коинтеграт p85::pJFF350, дефектные по жгутикованию или подвижности: SK051 и SK248. Несмотря на интефацию pJFF350 в плазмиду с молекулярной массой 85 МДа, SK051 и SK248 сохраняют способность к Gr^-распространению. Таким образом, прослеживается некоторая зависимость между отсутствием в экстрахромосомном состоянии р85 у клеток мутантов с измененными Flâ и/или Laf системами и потерей ими способности к распространению с образованием микроколоний. Стоит отметить, что утрата подвижности наблюдается и в тех случаях, когда транспозон встраивается в хромосомную ДНК (мутанты SK531 (Fla" LaГ Mot") и SK586 (Fla" leaky Laf")).

Данные о роли генетических яокусов р85 в обеспечении подвижности неоднозначны. Так, подвижность в жидких и полужидких средах у ряда исследованных ранее производных Sp245, утративших р85, не отличаются от таковых у родительского штамма (Кацы с соавт., 1994). Одним из возможных объяснений неоднозначности данных о роли р85 в обеспечении подвижности может быть не истинная элиминация плазмиды из клетки, а интеграция этой плазмиды или локусов fla/laflswa/gri в другие репликоны. Не исключено, что интеграцию обуславливают мобильные элекменты, обнаруженные в составе р85 (Katsy, Prilipov, 2009). Так, в случае мутанта SK248 слияние pJFF350 и р85, опосредованное ISAzbal и lSAzba2 (Katsy, Prilipov, 2009), приводит к утрате способности клеток двигаться при помощи жгутиков (Mot" Swa"-^eHOTHn). Следует отметить, что динамическая организация района р85, примыкающего к ISAzbal и ISÂzba2, может сказываться на экспрессии генов расположенных вблизи от IS-элементов. Далее мы охарактеризовали ряд обнаруженных в ДНК р85 A. brasilense генов, продукты экспрессии некоторых из которых, по-видимому, могут опосредовать поведенческие реакции бактерий.

Физико-генетическая карта секвенированного сегмента р85 A. brasilense Sp245 из рекомбинантной lum

плазмиды рЕК248Х приведена на рис. 8. В результате анализа нуклеотидной последовательности Xhol-фрагмента р85,

клонированного в составе плазмиды рЕК248Х, были идентифицированы гены norCBQD и nirK, важные для осуществления

денитрификации.

Рядом с nirK локализованы orf208 и orflSl. В ORF181 обнаружены два гемэритриновых домена. Полагают, что бактериальный гемэритрин является регулятором ответа на NO (Strube et al., 2007),

пыО юО пи8 псЛ Ш аШиПИ ссвН **пмс йрА МШИ

Рис.8. Физико-генетическая карта сегмента 85-МДа плазмвды A.brasilense Sp245, клонированного в составе рЕК248Х. Горизонтальными стрелками обозначены кодирующие последовательности и направление их транскрипции. Названия генов приведены под схемой. Сайты рестрикции: X - XhoV, Е -EcoRI. Горизонтальной линией выделен ScoRI-фрагмент длиной 2.4 т.п.н., использованный как зонд в реакциях блоттинг-гибридизации ДНК. Двунаправленными стрелками показаны целевые участки ПЦР-амплификации ДНК с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Масштабная линейка над картой соответствует 1 т.п.н.

играет значимую роль при попадании организмов в условия лимитации но кислороду, будучи его накопителем (Strubc el al., 2007), и опосредует анаэротактис бактерий в качестве кислородного сенсора (Isaza et al., 2006).

В секвенированном фрагменте р85 обнаружена также orJ293, кодирующая регулятор транскрипции семейства LysR из 293 аминокислотных звеньев. Регуляторы LysR участвуют и контроле транскрипции разнообразных генов, в том числе, в условиях кислородного стресса. ORF293 обладает значимым сходством с HdfR из Paracoccus denitrificans, Envinia carotovora, E. coli, Shigella flexneri и других бактерий. HdfR известен как репрессор транскрипции мастер-оперона flhDC, продукты которого необходимы для экспрессии остальных флагеллярпых генов у Е. coli и друг их бактерий (Ко, Park, 2000).

Многие бактерии адаптируются к микроаэрофильным условиям, благодаря образованию цитохром с оксидазы cbby-тш. кодируемой опероиом ccoNOQP. Ген ccoN впервые выявлен нами в плазмидной ДНК азоспирилл. Кодируемая р85 каталитическая субъединица I (CcoN) цитохром с оксидазы обладает свойствами, достаточными для работы фермента в качестве протонной помпы. Трансмембранпый протонный потенциал, в частности, используется как источник энергии для вращения бактериальных жгутиков (Скулачев, 1989).

В секвенированном сегменте р85 обнаружен ген metC. В случае Е. coli metC-мутапты, дефектные по синтезу гомоцистеина, имели более высокий уровень экспрессии гена флавогемоглобина (limp), индуцируемого NO (Membrillo-Hernández et al., 1998). Продукт or/164, по-видимому, не связан с процессами денитрификации или регуляции метаболизма в ответ на оксиды азота и редокс-статус клетки.

Локализация охарактеризованного комплекса генов в р85 Sp245 недалеко от IS-элементов ISAzbal и \?¡Azba2 (рис. 8) свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов, что может сказываться на поведении бактерий. Так у спонтанного мутанта Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой исчезновение р85 и одного из двух фрагментов тотальной ДНК, гомологичных 2.4-т.п.н. EcoRI-фрагменту р85, содержащему, как выяснилось, часть гена nirK, а также ог/208 и ог/181, сопровождалось утратой способности бактерий к нитритредукции (Кацьг, 20026). Скорость движения клеток Sp245.5 в жидкой среде сильно редуцирована.

Не исключено, что появление спонтанных Swa^-производиых (Sp245.Pl-Sp245.P5) обусловлегго изменениями в структуре ДНК р85, затрагивающими комплекс генов, расположенный недалеко от IS элементов IS Azbal и \SA~bo2. Использован метод ПЦР-амплификации на ДНК названных штаммов целевых районов р85 с парами специфических прямых и обратных праймеров к генам nirK-or/208, hd/R, hd/R-ccoN, ccoN-metC и or/414 (рис. 8). 11ЦР с парой праймеров, специфичных к З'-концу гена hd/R (у Sp245 продукт амплификации имеет длину 411 п.н.), давали негативные результаты па ДНК из суперроящихся штаммов Sp245.Pl и Sp245.P5. Таким образом, спонтанные перестройки, приводящие к появлению Swa++-вариантов, в ряде случаев сопровождаются угратой или существенной модификацией rena/;í//7í, локализованного в р85.

Известно, что на активность транскрипции генов может влиять общая структура окружающей ДНК, особенно степень ее суперспирализации. Эта структура модулирует, а иногда и определяет силу промоторов (Perez-Martin et al.. 1994). Возможно, мы имеем дело именно с таким случаем, а интеграция в р85 вектора pJFF350 является препятствием для осуществления па должном уровне подобной регуляции экспрессии ряда генов р85. В пользу данного предположения говорит тот факт, что у мутанта SK051 вектор pJFF350 интегрировал в гот же сайт р85. что и у

мутанта 5К248. Различия между двумя коинтегратами р85::р]РК350 заключаются лишь в утрате примерно 1.5 т.п.н. ДНК вектора из коннтеграта, образовавшегося в клетках штамма §К051. Фенотип у мутантов А. ЬгаьИете БК051 и 8К248 разный.

3.9 Подвижность А. ЬтаяИете 8р245 в лабораторных средах разного состава. Возникает вопрос, в каких условиях азоспириллы используют потенциал, предоставляемый тем или иным типом подвижности. Выявление факторов внешней среды, способствующих доминированию одного из способов распространения, интересно с точки зрения изучения механизмов адаптации азоспирилл к обитанию в разнообразных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.

Проведено сравнение скорости плавания и особенностей социальной подвижности в присутствии солей аммония, нитратов или нитритов у А. ЬгайИеме 8р245 и его спонтанных Б^'а++-вариантов 8р245.Р, у двух из которых утрачен ген Уи1]К. В жидкой среде для нитратредукции (МРББ) с нитратом калия клетки Sp245.Pl, 8р245.РЗ и Sp245.PS, выросшие в условиях интенсивной аэрации, как и в случае МЭМ с аммонием (см. табл. 2), плавали значительно быстрее, чем особи вр245. При замене нитрата на нитрит у Бр245 и 5р245.РЗ подвижность подавлялась, а у Sp245.Pl и Sp245.PS скорость движения практически не снижалась. У бактерий, выращенных в условиях недостатка кислорода в жидкой МРБЗ, скорость движения клеток Sp245.Pl, 8р245.РЗ и Sp245.PS снижается, не зависит от источника азота и близка к показателю, характерному для вр245 в сходных условиях в присутствии нитрата. Однако у 8р245 при замене нитрата на нитрит при недостатке кислорода клетки плавают медленнее.

Диаметр колоний, формируемых в полужидкой МБМ всеми исследованными штаммами, максимален в отсутствие солей азота в среде и снижается при добавлении солей азота (1 г/л) в ряду "Ш4С1 > КШ3 > КШ2". При этом на среде М8М с КЫ02 все исследованные варианты 8р245.Р утрачивают способность к 8ууа++-распространению. Однако на полужидкой среде МРвв, отличающейся от М8М более богатым составом (добавлен пептон, 5 г/л) и содержащей сукцинат вместо малата, штамм Sp245.PS оказывается менее чувствительным к токсическому действию нитрита и сохраняет 8\уа+4-фенотип. Измерение скорости движения клеток на полужидкой МРЗБ показало, что на среде с нитратом клетки Sp245.Pl, Sp245.PS и Sp245.PS двигаются быстрее родительского штамма На среде с нитритом скорость движения клеток падает у Sp245.Pl, 8р245.РЗ и 8р245, а межштаммовые различия нивелируются. В случае штамма Бр245.Р5 замена нитрата на нитрит не влияет на подвижность клеток.

Таким образом, выявлены различия в поведении спонтанных вариантов 8р245.Р с изменениями в структуре р85, имеющих одинаковый Зхуа^-фенотип в присутствии молекулярного азота или хлорида аммония, при замене источников азота в среде на нитрат или нитрит.

Переходы в способах распространения у Бр245 при использовании богатых полужидких сред МР8Б или ЬВ выявить не удалось. Возможно, в случае использования среды, насыщенной ростовыми факторами, доля клеток с Сп-распространением мала, поскольку в среде могут находиться факторы, значительно увеличивающие число роящихся бактерий, В результате поток роящихся азоспирилл не позволяет наблюдать особи, формирующие агрегаты. В связи с этим предположением интересны наблюдения за поведением 8р245 на средах, в которых один и тот же субстрат может быть источником углерода и азота, например, аминокислот. В присутствии малата и аммония, или без них диаметры макроколоний не различаются как в случае 5р245, так и ВК570, 5К048 или 8К454. Самые крупные макроколонии выявляются у 8р245, но не у ВК570 и 8К048, при добавлении в среду

iuiaiiHim или триптофана. Пролин стимулирует роение ВК570. I! случае SK048 н SK454 ни одна из 18 исследованных аминокислот не способствовала увеличению скорости Gr ¡-подвижности. Снижение скорости распространения происходи!' » присутствии аспарагина, аспарагиновой кислоты или треонина как в случае Swa- , так и Gri-поднижпости (у Sp245, ВК.570, SK048 и SK.454), Гистидпн, глутамип. «алии, метионин или пролин блокировали подвижность SK048 и SK454. Таким образом, и случае Swa", Swa>+ или Сп+-подвижноети набор аминокислот, влияющих па эффективность распространения бактерий, различен. Вероятно, это имеет определенное значение в процессе адаптации азоспирилл к существованию в симбиозе с растениями, поскольку состав корневых экссудатов (преимущественное содержание в составе той или иной аминокислоты) может определять преобладание того или иного фенотипа подвижности.

В случае Sp245 аспарагиновая кислота, серии или треонин способствовали индукции Gn'-ноднижности. Интересен тот факт, что аминокислоты, которые влияют па проявление Gri+ фенотипа у Sp245, не стимулируют скорость движения Gri'-мутантов SK048 или SK.454. Более того, на среде с аспарагиновой кислотой и треонином колонии SK048 и SK.454 мельче. Вероятно, факторы, способствующие переходу клеток к Gri-подвижпости, и факторы, активизирующие скорость мигрирующих подобным образом бактерий, различаются.

ЗЛО Социальная подвижность А. brasitense в присутствии корневых экссудатов пшеницы. Исследовано влияние корневых экссудатов пшеницы (к/э) па характер/эффективность подвижности азоспирилл. Установлено, что диаметр колоний, сформированных Sp245 на полужидкой MSM (0.4% агара) с добавлением к/э 10-дпевных проростков пшеницы, значительно превышает контрольный. У рояшегося мутанта КМ252 с изменениями в синтезе полисахаридов размер колоний в присутствии к/э возрастает, но различия не столь существенны, как у родительского штамма. В то же время, у Swa+,-MyTaHTOB ВК468, BK57I и ВК759Р увеличения размера колоний в присутствии к/э не происходит. При этом к/э пс оказывают существенного влияния на скорость роста бактериальных культур. Различий в скоростях движения клеток, выросших в жидких средах с к/э, и без них также не наблюдается. Анализ гетерогенности популяции азоспирилл в способах распространения в полужидких средах показал, что присутствие к.b способствует доминированию в популяции Sp245 роящихся клопов. Так, после 48 ч инкубации (MSM + среда для растений) 81% колоний Sp245 имели Swa+- фенотип, 18.3% Swa"- и 0.7% СгГ-фенотип. На MSM + к/э 100% колоний Sp245 были Swa'", В случае мутантов КМ018 и BK759G добавление к/э способствовало возрастанию частоты перехода к роящимся вариантам.

Вероятно, на полужидких средах в присутствии к/э повышается эффективность коллективного распространения клеток Sp245. При этом к/э не влияют на скорость индивидуального движения клеток за счет активности полярного жгутика, как в случае Sp245, так и в случае Swa^-Myrairron ВК468, ВК571, HK750I'. роепие которых не зависит от присутствия к/э. Интересно, что экссудаты способствуют доминированию Swa'-icaonoB или уменьшению числа Swa" и Gri '-клонов, встречающихся в популяции Sp245, KM0I8 и BK759G. Вероятно, к/э проростков пшеницы способны оказывать модулирующее действие па механизмы/системы, обеспечивающие скоординированную подвижность А. hraxi/ense Sp245 в полужидких средах. При этом поведение Swa1 ^-производных Sp245, клетки которых двигаются со скоростью, близкой к скорости, наблюдаемой у родительского штамма, не зависит от присутст вия корневых экссудатов. Возможно, эффект обусловлен тем, что у мутантов

системы, обеспечивающие скоординированную подвижность, максимально антивны и дополнительный сигнал, индуцируемый наличием в среде к/э, в этом случае не является столь значимым.

Можно предположить, что в составе к/э присутствуют компоненты, "имитирующие" действие внутрипопуляционных бактериальных факторов (Teplitski et al., 2000), регулирующих социальное поведение азаспирилл. При этом клетки Swа44—мутантов не воспринимают сигнал либо из-за высокого уровня продукции собственного регулятора или в результате изменения системы "рецепции". Добавление к/э пшеницы в среду для роста бактерий приводит к изменению соотношения моносахаридов а составе экзополисахаридов и электрофоретического профиля ЛПС A. brasilense Cd (Fischer et al., 2003). He исключено, что к/э модифицируют какие-либо поверхностные полимеры Sp245, участвующие в формировании контактов между бактериями, перемещающимися в полужидкой среде, а в случае Swa^-мутантов эти изменения не являются существенными. Так, в случае LpsI" Cal"-мутанта КМ252 корневые выделения, присутствующие в среде, лишь незначительно стимулируют роение, тогда как клетки родительского штамма перемещаются в два раза быстрее. Таким образом, корневые экссудаты проростков пшеницы стимулируют роение клеток A. brasilense Sp245 по непонятному механизму и способствуют переходу неподвижных или ОгГ-клонов к роению.

3.11 Подвижность A. brasilense в присутствии растительных лектинов, обладающих разной специфичностью. Известно, что взаимодействие компонентов поверхности азоспирилл, содержащих остатки Л'-ацетил-(^-Е)-глюкозам ина, с агглютинином зародышей пшеницы (WGA) может опосредовать ранние этапы формирования растительно-бактериальных ассоциаций и индуцировать соответствующие изменения в метаболизме бактерий (Антонюк, 2005). Так как двигательная активность бактерий важна для формирования их симбиозов с растениями (Кацы, 2003), интересно выяснить, оказывают ли фитолектины влияние на этот аспект поведения азоспирилл.

3.11.1 Скорость плавания A, brasilense в присутствии лектинов растений. В присутствии WGA, агглютинина клубней скорость движения, картофеля (STA) или лектина из утесника обыкновенного (UEAII), обладающих сродством к //-ацетил-Р-Д-глюкозамину или его олигомерам, скорость плавания клеток штамма Sp245 снижалась (рис. 9). Конканавалин А (СопА) или фитогемагглютинин-Р (РНА-Р), обладающие иной углеводной специфичностью, на подвижность Sp245 не влияли.

Более подробно изучение специфичности ингибирования движения бактерий

осуществляли на примере WGA. В результате блокировки активных центров WGA глюкозамином или его олигомером, N,N',N"-триацетилхитотриозой (хитотриозой),

ингибирующая активность WGA

элиминировалась. Рамноза или глюкоза, входящие в состав полисахаридов клеточной поверхности штамма Sp245, но не являющиеся гаптенами для данного лектина (Коннова с соавт., 1992), не влияли на способность

3*10-" 5*10' 5» 10"* 5.10-' 5" 10° 3*10'

концентрация белка, мкг.'мл

Рис. 9. Подвижность клеток А. brasilense Sp245 в жидких средах

в присутствии 0.0005-50 мкг/мл WGA (1), STA (2), UEAII (3), СопА (41 и РНА-Р (5V

WGA. снижать подвижность азоспирилл. Напротив, добавление препарата ЛПБК. содержащего остатки глюкозамина, приводило к практически полному восстановлению скорости плавания бактерий, характерной для клеток в отсутствие WGA. Контрольные эксперименты показали, что ни одно из используемых для блокирования веществ само по себе не вызывало снижения скорости плавания бактерий. По-видимому, снижение скорости плавания азоспирилл в присутствии WGA происходило в основном вследствие специфического связывания этого лектина с полимерами поверхности бактерий, содержащими глюкозамин. Скорость плавания клеток штамма A. brasilense Sp 107 в присутствии WGA уменьшалась » меньшей степени, чем у Sp245. При этом для обоих штаммов характерен близкий моносахаридный состав полисахаридной части экзоподимеров, но у Spl 07 выявлен более низкий процент содержания глюкозамина в составе полимеров клеточной поверхности по сравнению с Sp245 (Коннова с соавт., 1992).

3.11.2 Влияние фитолектинов на поведение A. brasilense в полужидких средах. В полужидкой MSM с WGA или STA образовывались колонии Sp245 смешанного мутно-зернистого фенотипа (рис. 10), что может свидетельствовать о переходе части популяции от роеиия к распространению с образованием микроколоний. BSA или СопА такого эффекта не вызывали (рис. 10). При блокировке активных центров WGA хитотриозой не удалось полностью ингибировать влияние фитолектина на поведение Sp245. В пределах колонии, сформированной бактериями в присутствии WGA и хитотриозы, встречаются агрегаты, хотя и не в гаком количестве, как в случае среды, содержащей только лектин (рис. 10). WGA обладает способностью связываться с нейраминовой кислотой. Это может частично объяснить образование клеточных агрегатов в присутствии WGA с заблокированными центрами связывания хитотриозой. Только хиготриоза не способствует распространению клеток Sp245 с образованием агрегатов, но влияет на форму формируемых колоний (рис. 10). Возможно, на полужидкой MSM с манатом хитотриоза является дополнительным источником углерода, и, как следствие этого, бактерии, скорее всего, перемещаются как по градиенту маната, так и хитотриозы.

Замена малата в полужидкой MSM. содержащей WGA или STA. на такие источники углерода, как сукцинат. арабиноза или фруктоза, не влияла на морфологию макроколоний, формируемых штаммом Sp245.

Вероятно, переход азоспирилл от Swa-подвижности к Gri-распространснию, в присутствии лектинов со сродством к остаткам ЛА-аиегил-р-О-глюкозамина является следствием снижения подвижности бактерий при помощи жгутиков (см. пункт 3.1 1.1) и возможных изменений межклеточных взаимодействий, необходимых для роения.

Рнс.10. Колонии, сформированные А. ЬгаяИете 8р245 (а-з) и Эр 107 (и) после точечной инокуляции суспензии клеток в полужидкую М5М. На среде

без добавок (а); в присутствии: 50 мкг/мл В5А (б), 0.5 мкг/мл СопА (п), 0.5 мкг/мл WGЛ (г, и), 5 мкт/мл \VCiA

(д), 0.5 мкг/мл ЭТА (е), 50 мкг/мл хитотриозы (ж) и 0.5 мкг/мл \УОА + 50

мкг/мл хитотриозы (з). Время инкубации 48 ч. Масштабная линейка соответствует 10 мм

3J2 Формирование биопленок .4. brasitense пи абнотччссипх поверхностях.

Методом солевой агрегации проведена оценка суммарной относительной гидрофобноети планктонных клеток Л. brasitense Sp245 и сто мутантов по синтезу полисахаридов и подвижности: КМ018, КМ 127. КМ 134, КМ 139, КМ252, КМ348. SK048, SK05I, SK248 и SK454, инкубированных -20 ч в жидкой LB. Гидрофобиость выращенных клеток всех исследованных штаммов существенно не различается. У мутанта A. brasitense Sp245.5 радикальное изменение структуры Л ПС и утрата ПССК (Кацы с соавт., 2002; Фелонеико с соавт., 2010) сопровождается небольшим, по статистически достоверным, увеличением гидрофобности клеточной поверхности, Не исключено, что в случае Sp245.5 начальный этап взаимодействия с гидрофобной средой протекает быстрее, чем у других штаммов. У остальных штаммов, ио-пилимому, гидрофобные силы вносят примерно одинаковый вклад в прикрепление клеток к твердой поверхности.

В первые 24-48 ч инкубации бактерий в жидкой среде LB на поверхности пробирок или лунок планшетов формировались тонкие пленки, при микроскопии которых просматривались разрозненные клеточные агрегаты (микроколонии), легко смываемые при аспирации суспензий и промывании планшета или пробирки водой. Через 72-96 ч инкубации микроколонии сливались в достаточно прочную и плотную пленку с более ровной поверхностью.

С использованием окрашивания бактерий кристаллическим фиолетовым осуществлено сравнение биомассы в пленках (рис. 11), формируемых Sp245 и его мутантами за 96 ч на границе раздела фаз "жидкость (LB) - твердая гидрофильная ПОВерХНОСТЬ (СГеКЛО)" И АтюиАк "жидкость (1,В) - твердая гидрофобная поверхность (полистирол)". 11а

гидрофильной поверхности примерно равноценные биопленки КМ 127, КМ 134 и КМ348 (LpsT) и КМ252 (СаП LpsP) лучше выражены, чем у штамма дикого типа, Возможно, это объясняется изменением заряда клеток названных мутантов вследствие

утраты кислого JU1CI. Толщина пленок, формируемых Sp245, КМ 124, КМ 134, КМ 139 и К.М348 на гидрофобной среде, не имеет существенных различий, что согласуется с примерно одинаковой гидрофобпостыо их клеток. На поверхности полистирола СаГ Lpsll" МоГ Svva'-мугант KM0I8 и СаГ (.рвГ-мугаит КМ252 образуют более тонкие пленки. Общей характеристикой КМ018 и КМ252 является утрата ПССК. Биопленки, образуемые на гидрофобной и гидрофильной среде СаГ LpsI" Lpsir-мутантом Sp245.5, обладающим радикально измененной структурой клеточной поверхности, толще, чем у штамма Sp245 и сто омегоновых мутантов (рис. II). У SK05I (leaky Fla" 1.,аГ МоГ Grih СаГ) толщина пленок, формируемых как па стекле, так и на полистироле, была менее выраженной. Пример мутантов KM0I8 и SK.05I показывает, что одновременное нарушение в продукции и функционировании жгу гиков и синтезе полисахаридов приводит к тому, что клетки значительно хуже формируют биопленки как на гидрофильной, так и па гидрофобной поверхности. У

5ХМ8 8К051 5КМ8 КШ8 КМШ Ш34 КМ13» КМ252 КМ-ЯЗ Зр2455

Ш1ЙКМ

Рис. 11 Относительное количество биомассы в пленках штаммов А. Ьга.чИете, формируемых на границе раздела: / -"жидкая 1.В - полистирол" (Ам) и 2 - "жидкая 1 В - стекло" (/Ьчи), определенное в результате окрашивания клеток кристаллическим Фиолетовым.

МоГОгГ-мутшгга SK248 биопленки окрашиваются па уровне Sp245 как на стекле, так и на полистироле. Вероятно, в стационарной культуре полярный жгутик в большей степени определяет прикрепление бактерий к поверхности, а не подвижность клегок в составе пленки. У мутантов SK048 (Fia- Mot" Gri') и SK454 (F la" leaky 1.аГ С i ri" > на стекле биоплепки образуются хуже, чем у дикого типа Однако на полистироле они. как и SK248, формируют биопленку на уровне Sp245.

Общий уровень выявления полисачаридиых антигенных детерминант в биоплепках (для сравнения количества антигенов использовали иммунофермептпый анализ (ИФА). используя Ат на ЛГ1С Sp245), образуемых на гидрофобной поверхности Sp245 и мутантов КМ 127, КМ 134 и КМ348, и КМ252, различается несущественно. В то же время планктонные клетки этих Lpsr-муттштов взаимодействуют с антителами менее эффективно, чем Sp245. С учетом примерно равного количества биомассы (см. рис. И) в биоплепках Sp245 и КМ 127, КМ 134, КМ348 можно предположить, что при взаимодействии с твердой поверхностью в клетках перечисленных мутантов активируется синтез полисахаридов. 15 случае штамма КМ252 уровень продукции полисахаридов, очевидно, повышается в еще большей степени. Общее количество нолисахаридных антигенов, продуцируемых Lpsir-мутантом КМ 139 в бульонной культуре и биоплепках, значительно выше, чем у других штаммов. Различия в уровне продукции белковых антигенов, выявляемых в биопленках Sp245, КМ127, КМ139, КМ252, КМ348 и Sp245.5, не существенны. У мутантов КМ018 и КМ 134 количество экспонированных белковых антигенов снижено по сравнению с другими штаммами; однако в случае КМ018 это снижение коррелирует с меньшей толщиной биоплепки.

В результате проделанной работы установлено, что сохраняющие жгутиковую подвижность LpsI""—штаммы образуют более толстые биопленки на гидрофильной поверхности. Мутанты с нарушениями в продукции Г1ССК формируют менее выраженные биопленки на твердой гидрофобной поверхности. Дефекты в продукции ПССК в совокупности с утратой жгутиковой подвижности негативно сказываются на способности азоспирилл к закреплению на гидрофобной и гидрофильной поверхности. Утрата Lpsll при сохранении Г1ССК не приводит к изменениям в поведении мутантов на гидрофобной поверхности - по-видимому, за счет повышения уровня продукции других полисахаридов. Радикальная перестройка в структуре полисахаридпых антигенов коррелирует с активизацией процесса формирования биопленок соответствующего мутанта (Sp245.5) па разнообразных поверхностях. Таким образом, липополиеахариды и полисахариды, связывающие калыдафлуор. участвуют в структурной организации биопленок азоспирилл на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность". Для формирования азоспириллами устойчивой биопленки продукция латеральных жгутиков, скорее веет, не является существенной. Мутанты Sp245, образующие биоилеику со сходной биомассой, различаются по продукции Laf, например, КМ018 (СаГ Lpsll" Mot") и SK05I (leaky Fla" Laf Mot") или SK048 (Fla" Mot") и SK454 (Fla" leaky 1,аГ). В гоже время отсутствие полноценного полярного жгутика может существенно влият ь па образование бионлепок.

Как оказалось, спонтанные (как у мутанта Sp245.5) или индуцированные (как у штаммов КМ018, КМ127. КМ134. КМ139. КМ252, КМ348. SK048. SK248 и SK051) изменения состава и (или) структуры плазмин /1. bnmkme Sp245 оказывают замет« влияние на социальную активность л их бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биоплеиок.

3-1

3.13 Изменения в подвижности бактериальных клеток при н\ нервнчпом контакте с потенциальным партером на примере взаимодействии A. brasilense и базндномицеш Grifóla frondosa (Гг.) S.I'. Gray. При изучении свойств лектииа. выделенною с поверхности мицелия базидиальпого ксплотрофа G. frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917, авторами была установлена его необычная углеводная специфичность к ОГ1С ЛПС A. brasilense Sp245 (Степанова с соавт., 2007), представляющему собой линейный D-рампан (Fedonenko el al., 2002). Совместное культивирование G. frondosa 0917 с бактериями штамма A. brasilense Sp245 дикого типа или его мутантами по синтезу полисахаридов показало, что присутствие азоспирилл в кокультуре сказывалось на росте мицелия в целом положительно. Однако в случае совместной культуры со штаммами КМ018 и КМ 139 зона первичного контакта по периметру подсева представлена характерным кольцом воздушного редкого мицелия. В случае штаммов КМ252 и КМ348 во всех опытах такая зона была более выраженной, что можно трактовать как более резкое проявление антагонизма. Это еще очевиднее, если сравнить указанные смешанные культуры с чистой (контрольной), морфологически однородной культурой гриба, а также с совместной культурой гриба с диким штаммом Sp245, которая по морфологии практически ничем не отличается от контрольной. Заметные различия в морфологии кокультур наблюдали в опытах с предобработкой растущих гиф препаратом ОПС1 перед подсевом бактериальных культур, по сравнению с опытами по их совмещению без предобработки. Возможным объяснением наблюдаемых эффектов является блокировка лектииа ОГ1С1, что в конечном итоге привело к временному затруднению в контакте гиф с бактериями. Но в процессе дальнейшего роста выработка лектииа растущими гифами привела к распознаванию и более скорой "идентификации" штаммов Sp245, КМ018 и КМ 139 по сравнению со штаммом КМ252 и КМ348, у которых зона противостояния гораздо ярче выражена, чем в остальных случаях.

Мицелиальный лектин G. frondosa 0917 замедляет индивидуальную подвижность клеток A. brasilense Sp245 (рис. 12). Исследование подвижности бактерий мутантов КМ 139, КМ252 и КМ348 до и после их инкубации с лектином в концентрации 10 мкг/мл показало, что под влиянием лектнна подвижность КМ 139 замедляется. В случае КМ252 и КМ348 этого не происходит. Вероятно, лектин G. frondosa 0917 вызывает замедление индивидуальной подвижности

азоспирилл только у тех штаммов, в ЛПС которых экспонирован 011С1, являющийся шггеном лектину.

Таким образом, штаммы A. brasilense Sp245, КМ018 и КМ 139. в клеточной стенке которых экспонирован ОПС(, являющийся гаитеном грибного лектииа, распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма. При этом лектин влияет на подвижность бактерий, что свидетельствует об участии специфических лектин-углсводных взаимодействий в первичном контакте мицелия G. frondosa и /I. brasilense в процессе совместного культивирования. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость

зо -

ri- (-h

2 i? 4- =Е

É щ

Щ 9 S

щ и

üj crz

si>2(j

км! 39 i-:

пггамм

1'ис. 12. Сравнительная характеристика подвижности ратных штаммов A. brasilense в отсутствие лсктина (1) и в присутствии 10 мкг/мл лекти на G. frondosa 0917 (2).

"распознаются

(»V

KOExiCftpaGieiwo W

движения u жидких средах и присутствии лектина G. frondosa. грибом с наименьшим проявлением антагонизма.

3.14 Колонизация корней пшеницы A. brasilense с различиями в социальной подвижности. Исследована динамика колонизации корней пшеницы штаммом А. brasilense Sp245 и его Swa~ Gr i'-мутантам и. Начальные этапы колонизации азоспириллами корневой системы растений зависят от способности бактерий перемешаться по направлению к корням растения (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000). Данное обстоятельство обусловило наш выбор условий инокуляции (с покачиванием инкубационных сосудов), обеспечивающих штамму дикого типа и его мутантам по жгутиковапию и подвижности равные шансы на контакт с поверхностью корня. Через сутки после инокуляции определяли количество бактерий, "заякоривающихся" на корнях проростков. На седьмые сутки после инокуляции в корневой системе пшеницы увеличивается количество разветвленных корней, по сравнению с контрольными образцами, что служит индикатором позитивного влияния бактерий.

В выбранных условиях после 3 ч инкубации суспензии бактерий с трехсуточными проростками количество бактерий, прикрепившихся к корням, стабилизировалось. Мутанты SK.048, SK051 и SK454 имели сниженную по сравнению с Sp245 способность к адсорбции на корнях (рис. 13). Мы не обнаружили у штамма Sp245 и использован н ых мутантов

различия в продукции или антигенной структуре

поверхностных углеводных полимеров. Исключение

представляет SK051, в отличие от других штаммов имеющий СаГ фенотип. Гидрофобность клеток дикого и мутантных штаммов существенно не различается. Таким образом, на этапе прикрепления к корням пшеницы клеток всех исследованных штаммов

гидрофобные силы и

полисахаридные компоненты клеточной поверхности, по-видимому, вносят примерно одинаковый вклад. Сниженная но сравнению со штаммом Sp245 способность клеток мутантов к адсорбции на корнях может быть обусловлена отсутствием у них Fla.

Через сутки па корнях "заякоривадось" -30%

адсорбировавшихся клеток Sp245. В случае мутантов SK.048. SK.051 и SK454 на корнях остается, соответственно. -59, 44 и 21% клеток (рис. 13). Высевы с 10-дневных проростков показали, что после "заякориваиия" бактерий на растении численность популяций штамма Sp245 и его

SK048 SK05Í Ar)

SK454 ¡ КрЫЗ ureaMiffcí и ttiíTvm/ís

3X0)8 SK0SI Ali

Рис.13. Динамика колонизации корней проростков пшеницы штаммами А. ЬпкИапае а - количество КОЕ в гомогенатах корней в пересчете па одно растение, б -уровень связывания с гомогенатами корней антител на полисахаридные антигены Яр245 (Ат I) и антигел на белковые антигены (Ат 2), выявляемый ИФА. / трехдневные проростки после 3 ч инкубации в суспензии бактерий; 2 - проростки через 24 ч после инокуляции; 3 - проростки через 7 суток после инокуляции.

мутантов возрастает примерно в одинаковой степени (рис. 13). Наблюдаемое снижение численности азоснирилл на корнях растущих проростков можно объяснить muí ранней в среду для выращивания растений части адсорбировавшихся клеток. Это предположение было подтверждено результатами высевов бактерий из сред после извлечения растений.

Таким образом, динамика колонизации проростков пшеницы мутантами и родительским штаммом свидетельствует о том, что после "заякоривания" клеток механизм распространения с образованием микроколоний (ОгГ-фенотип) может достаточно эффективно обеспечить заселение бактериями растущих корней. Стоит отметать, что увеличение количества разветвленных корней у 10-дневных проростков, инокулироваппых клетками Sp245 или его мутантов, не зависит от количества бактерий, изначально адсорбировавшихся па растении.

Предположение о реализации у азоснирилл, заселяющих корни проростков пшеницы, механизма распространения с образованием микроколоний подтверждают микроскопические наблюдения. Па этапе инокуляции в случае штамма Sp245 адсорбировавшиеся на корневых полосках бактерии располагались равномерно, без предпочтительного группирования в какой-либо зоне. В случае инокуляции штаммами SK048. SK051 и SK454 встречались корневые волоски, заселенные бактериями, располагающимися вдоль волоска в виде агрегатов. Уже через 24-48 ч после инокуляции растений клетки штамма Sp245 обнаруживались па корнях в виде агрегатов наряду с равномерно распределенными особями. Па седьмые сутки агрегаты клеток, оставшихся на поверхности корня, образовывали скопления в случае проростков, заселенных как штаммом Sp245, так и мутантами SK048, SK051 и SK454.

Формирование азоспириллами афегатов в процессе их распространения по корневой системе растения, вероятно, является следствием воздействия на бактериальную копуляцию определенных внешних факторов. Например, в полужидких средах с агглютинином зародышей пшеницы часть популяции Sp245 переходит от роения к распространению с образованием микроколоний. Дополнительным стимулом, обеспечивающим переход бактерий к Gri-распространеншо ¡n planta, может стать недостаток кислорода, поскольку в опытах m vilro предварительное культивирование в условиях дефицита кислорода приводило к увеличению количества Svva'Gri'-клонов в популяции клеток штамма Sp245.

Через педелю после инокуляции проростков пшеницы скопления клеток штамма Sp245 или его мутантов выявляли на поверхности корпя и корневых волосков и при нммунофлуореецентной микроскопии (рис. 14). Флуоресценция комплекса ФИТЦ-мечепных Ат (ослиные антикроличьи Ат, коцъюгировешные с флуоресцеииюотиоцианатом) с антителами к полисахаридам штамма Sp245 (Ат I) или антителами, выявляющими белковые структуры (Ат 2), наблюдалась на корнях отдельными светящимися участками. Комплекс Ат 1 или Ат 2 с ФИТЦ-мечсппыми антителами позволил выявить бактерии, находящиеся в корневых волосках 10-дневных проростков, инокулированных как клетками штамма Sp245, так и SK048, SK05I или SK454 (рпс. 14). На трехдневных проростках с только что адсорбированными клетками значительные скопления бактерий удалось визуализировать лишь при использовании антител к полисахаридам. При применении антител па бактериальные белковые антигены сигнал флуоресценции наблюдали только у редких групп бактерий среди большого количества клеток, адсорбировавшихся па поверхности корней трехдневных проростков. Таким образом, в случае прикрепившихся азоснирилл белковые структуры выявляются Ат 2 в

меньшей степени, чем у бактерии, адаптировавшихся к существованию на растении. Необходимо отметит ь, что сигнала в контролях не наблюдали.

Таким образом, результаты иммунофлуорешеитной микроскопии свидетельствуют, что полисахаридные и белковые детерминанты мотут участвовать » организации биопленок на корнях пшеницы, как и в случае образования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная или гидрофобная поверхности". По-видимому,

бактериальные гликополимеры и белки обеспечивают не только прикрепление бактериальной биопленки к поверхности корня (Иос)п§иеу.-Ыауагго е! о/., 2007), но и участвуют в организации ее строения, вовлекая в этот процесс факторы растительного происхождения, в том числе, и способствующие переходу азоспирилл к микроколониальному распространению. Одной из стадий формирования биопленки и на стекле или полистироле также является образование клеточных агрегатов, но в дальнейшем микроколонии сливаются в единый слой корней проростков пшеницы через 7 суток после

Рис.14, Иммунофлуоресцентная микроскопия

клеток. Напротив, на поверхности корня после "заякоривании" бактерий их расположение в составе микроколоний преобладает.

Иммунофлуоресцентная микроскопия с антителами на антигены клеточной

инокуляции культурами A. brasiknse Sp245 и SK048. а, б, г, е - Sp24S; в, д - SK048; ж - без инокуляции (контроль), а, б. в, ж с антителам«

на полисахариды Sp245 (Дт 1): г, д - с антителами на белки (Ат 2); с - с антителами на полисахариды A. brasilense Sp7 (Ат 3) (контроль). / - проходящий свет, 2 -

поверхности оактерии позволила выявить возбуждающий свет(494 им). Стрелка указывает экспонированные полисахаридные или на скопление бактерий на одном из корневых белковые детерминанты у азоспирилл, волосков. Масштабные линейки соответствуют

10 мкм

находящихся непосредственно на корне

проростков пшеницы. Иммуноферментный анализ и параллельный подсчет КОК использовались для обнаружения возможных изменений в содержании полисахаридных и белковых антигенов при адаптации азоспирилл к существованию на корнях растений.

13 ИФА с Ат 1 на клетках штаммов A. brasilense Sp245, SK048, SK051 и SK454 т культур, использованных для инокуляции растений, выявляется сходное количество полисахаридных детерминант. Какие-либо различия в иммунохимических характеристиках Л ПС исследованных штаммов азоспирилл также не были обнаружены. Результаты иммунофлуорешеитной микроскопии инокулированных корней проростков пшеницы, подсчета КОЕ в гомогепатах инокулированных корней (рис. 13а) и ИФА этих же гомогенатов (рис. 136) свидетельствуют о том. что в течение недели вариации в содержании полисахаридов, узнаваемых Ат \. соответствуют изменениям в количестве заселивших корни клеток дикого и мутаитных штаммов

Иммунохнмический анализ белков, выделенных с поверхности клеток штамма Sp245 и его Fla" Svva" Gri-мутанта SK048, распространяющихся и полужидком агаре, выявил один и тог же мажорный антиген в составе данных препаратов. При этом, в отличие от препарата Sp245, па иммуноэлектрофореграмме препарата SK048 наблюдается двойной пик, сформированный линиями преципитации, что может быть следствием существования двух изоформ соответствующего антигена. В ИФЛ с Лт 2 ночных культур бактерий, использованных для инокуляции растений, у штаммов Sp245 и SK051 выявляется примерно одинаковое, а у SK048 и SK454 незначимо меньшее количество экспонированных белковых детерминант. Незначительное увеличение количества белковых детерминант, экспонированных иа клетках штаммов Sp245, SK048, SK051 и SK454 через 7 суток после инокуляции проростков пшеницы, статистически недостоверно (рис. 136). Численность клеток штамма Sp245 на корнях за это же время снижается практически на порядок, а в случае мутантов SK048, SK05I и SK454 данный показатель сохраняется примерно на исходном уровне. Эти результаты являются косвенным свидетельством того, что при адаптации к корням растений в клетках штамма А. brasiknse Sp245 заметно активизируется синтез белковых детерминант, узнаваемых Лт 2.

Таким образом, в настоящей работе нами подтверждены данные других авторов (Croes et а!., 1993) о том, что у На~-мутантов A. brasilense, утративших филамепт полярного жгу тика, снижается способность к адсорбции па корнях пшеницы. Впервые показано, что после "заякоривания" на корнях клетки штамма А. brasilense Sp245 дикого тина и его Fla" Svva" Сп+-мутантов заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью. При этом образование микроколоний (клеточных агрегатов) на поверхности корней характерно как для штамма дикого типа, так и для его Fla" Svva" Сп+-мутантов. Установлено, что в процессе адаптации к существованию на корнях у штамма А. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Азоспириллы привлекают внимание исследователей коллективного поведения микроорганизмов в основном в качестве модели для изучения механизмов изменения характера жгутикования при переходе бактерий от свободного плавания к роению (Merino et al., 2006). Однако разнообразные проявления коллективного поведения микроорганизмов зависят не только от бактериальных систем, функционирование которых напрямую связано с поведенческим процессом ("ощущение кворума", формирование биопленок, плодовых тел, роение, скольжение, тянущая подвижность и пр.), по и от факторов, способствующих наиболее успешной адаптации микроорганизмов к условиям их обитания (Олескин, 2000). Так, способность азоспирилл перемещаться в почве по направлению к корням растения и наличие у них чувствительной системы хемотаксиса обусловливают заселение бактериями растений (Sleenhoudt, Vanderleyden, 2000). Первые этапы взаимодействия бактерий с поверхностью корпя опосредуют полисахариды, белки и полярный жгутик. Однако механизмы подвижности, позволяющие клеткам А. brasilense после закрепления на поверхности корня сформировать биоиленку, и относительный вклад в этот процесс разнообразных полимеров клеточной поверхности у А. brasilense не известны.

Анализ генетических причин и физиологических последствий изменений в способах коллективного подвижности бактерий, архитектуре их клеточной поверхности оказался весьма интересной задачей и позволил расширить существующие представления о поведении азоспирилл. В своих исследованиях мы

использовали созданную в лаборатории генетики микроорганизмов ИЬФРМ РАН уникальную коллекцию мутантов и спонтанных производных А. brasilense по признакам, связанным с продукцией поверхностных структур и функционированием систем, обеспечивающих бактериальную подвижность. Мы исследовали роль тех структур, которые первыми вступают во взаимодействие с окружающей средой и во многом определяют поведение микроорганизма: аппарат подвижности, полисахаридсодержащие полимеры и белки бактериальной поверхности.

Результаты настоящей работы позволили нам расширить существующие представления о роении азоспирилл. Так, нами показано, что, по крайней мере, у двух штаммов А. brasilense, Sp245 и S27, роение бактерий но полужидким средам, помимо латеральных флагелл, обеспечивает полярный жгутик. Получены новые экспериментальные подтверждения существенной роли межклеточных контактов в реализации роения азоспирилл. В случае роения 15 исследованных штаммов Л. brasilense, двух штаммов А. irakense и двух штаммов А. ¡ipofenm формирование межклеточных контактов обусловлено поверхностными структурами, взаимодействующими с конго красным.

Азоспириллы обладают потенциалом, повышающим скорость роения бактерий ио агаризованным средам (Бада^-фенотип). Ускоренное роение азоспирилл на полужидких средах можегг быть следствием изменений, зат рагиваготцих механизмы, обеспечивающие вращение флагелл (получены мутанты и спонтанные производные А. brasilense Sp245, клетки которых двигаются быстрее особей родительского штамма) или изменений в продукции поверхностных полисахаридов (ряд мутантов А. brasilense Sp245 с изменениями в продукции полисахаридов имеет Swa^-фепотип). Также возможно, что Й\уан-фсиотип обусловлен снижением или возрастанием уровня продукции бактериальных факторов, регулирующих социальное поведение азоспирилл или изменением систем "рецепции", воспринимающих эти факторы.

Наблюдения за поведением ряда Swa'-мутаптов штамма А. brasilense Sp245 позволили нам выявить скрытый потенциал, обеспечивающий распространение азоспирилл по полужидким средам. Клетки мутантов длительное время остаются в точке инокуляции (К\\'а~-фенотин), а затем начинают перемещаться, формируя диски, состоящие из клеточных агрегатов - Grf--распространение. Способ распространения с образованием микроколоний не связан с какими-либо общими дефектами в продукции полисахаридов, локализованных на клеточной поверхности. Более того, межклеточные взаимодействия, обусловленные поверхностными структурами бактериальной клетки, важны для реализации Оп+-распространения.

Изучение морфологии клеток С>г\"-мутантов и их подвижности в полужидком агаре позволяет полагать, что, реализуя механизм распространения с образованием микроколоний, бактерии не используют жгутики. При этом на одном из полюсов клеток Gri мутантов обнаружен пучок пилей. Необходимо отметить, что пучок пил ей был также обнаружен на полюсе клеток и у штамма Sp245. Вероятно, продукция на полюсе клетки либо вращающегося Fla, либо пилей являются альтернативными состояниями вегетативных клеток азоспирилл.

В популяции клеток А. brasilense Sp245 с низкой частотой появляются клоны, распространяющиеся с образованием Gri -колоний (3*1 (Г). и неподвижные клоны (5х 10'"). Частота появления СгГ-клонов слегка возрастает (до Iх 10~2) в результате преипкубации Sp245 без аэрации. Клоны Sp245 со спонтанным Gri"- или Svva" Gri"-фенотипом оказались нестабильными, а S\va*-<()cnoTHii доминировал в популяции. Охарактеризованная нами впервые фснотиническая диссоциация азоспирилл ио признаку подвижности клеток в гелеобразных средах подтверждена результатами

анализа диссоциативного спектра популяций, вырастающих после рассева цистоподобных покоящихся клеток на плотных средах (работы сотрудников Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва). Авторами (Погорелова с соавт., 2009) показано, что диссоцианты А. brasilense Sp7 или Sp245 помимо колониально-морфологических признаков различались в способах распространения в полужидких средах (отмечены Swa+-, Swa'Grf- и Swa+ Gri+-фенотипы).

Подавление роення бактерий рода Azospirillum (показано для 15 исследованных штаммов А. brasilense дикого типа, 2-х штаммов А. irakense и 2-х штаммов А. lipoferum) и стабильное проявление у них способности к распространению с образованием микроколоний может быть индуцировано адсорбцией на клетках "прижизненного" красителя конго красного. Модификации экстраклеточных соединений, которые бактерии используют для реализации социальной подвижности, могут способствовать переходу от Gri-распространения к роению в присутствии конго красного.

Появление среди клеток СгГ-мутанта, формирующих агрегаты на полужидком агаре, субпопуляции бактерий с восстановленной способностью к роению сопровождается возобновлением продукции полярного жгутика. Такие производные приобретают устойчивый фенотип Swa**. Субпопуляция особей, обладающих повышенной скоростью миграции, возникает и в популяции роящихся клеток. Вероятно, у А. brasilense существует либо механизм запуска экспрессии систем, необходимых для ускоренного движения бактерий, либо быстро двигающиеся особи, изначально присутствующие в популяции, формируют Swa^-субпопуляцию в ответ на внешние или внутрипопуляционные стимулы.

Нами показано, что скорость перемещения азоспирилл снижается в присутствии специфических антител на липополисахариды. Снижение скорости движения клеток, обусловленное взаимодействием антител на ЛПС с полярным жгутиком (чехлом) и возникновением на линии фронта движущихся бактерий иммунных агрегатов, тормозящих распространение азоспирилл в полужидком агаре, позволяет рассматривать антитела как модулирующий фактор, усиливающий межклеточные контакты, обусловленные взаимодействиями с участием полисахаридов.

Результаты настоящей работы позволили впервые описать роль межклеточных контактов, обусловленных взаимодействиями гемагглютинина и О-специфического полисахарида в распространении азоспирилл, использующих для движения жгутики. Подобные взаимодействия бактерий модулируются, в частности, в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода.

Штамм А. brasilense Sp245, являющийся модельным объектом наших исследований, содержит плазмиды р85, р120 и три плазмиды с молекулярной массой >300 МДа (Кацы, 1992). Поскольку плазмиды составляют весомую долю генома А. brasilense, закономерен интерес к выяснению роли этих ДНК в обеспечении поведения бактерий (Кацы, 2002а). Ранее нами было продемонстрировано, что в плазмидах р85 и р120 находятся локусы, инсерционный мутагенез которых приводит к Fla", Mof и LaF-фенотипу мутантов (Shelud'ko et ai, 1998; Шелудько, 2000; Кацы, 20026). Результаты, представленные в настоящей работе, свидетельствуют, что интеграция вектора pjFF350 в плазмиду р85 приводит к разным фенотипическим проявлениям: к утрате способности клеток синтезировать функционирующие флагеллы и, как следствие, к Swa'-фенотипу или к появлению бактерий с ускоренным роением. Стоит отметить, что при включении pJFF350 в ДНК р85 отсутствует строгая сайт-специфичность. В случае вставки Omegon-Km в плазмиду

р 120 нарушается не только продукция и функционирование жгутиков (Svva"— фенотип), но и изменяются свойства поверхностных полисахаридов. При этом у ряда мутантов изменения в синтезе полисахаридов сопровождаются повышением скорости роения. Необходимо отметить, что, утратив способность к роению, мутанты с ипсерциями, локализованными » р85 или р 120, сохраняют способность к распространению с образованием микроколоний.

Переход от Grï'-pacnpoeipaiгения (BK759G) к Swa' '-подвижности (ВК759Р) сопровождается исчезновением р85 и появлением новой плазмиды с молекулярной массой 36 M Да. Вероятно, для функционирования генов, обеспечивающих Gri-распространение, присутствие в геноме ренликона р85 является существенным. Гак, ряд Swa" GH'-мугантов штамма Sp245 утратили р85, а у мутанта Sp245.5 (утрачены 85- и 120-МДа репликопы) поведение клеток в полужидких средах не изменяется в присутствии конго красного, способствующего переходу азоспирилл к Gri -подвижности. Swa" ОгГ-фенотип наблюдается и в тех случаях, когда траненозоп встраивается в хромосомную Д1IK.

Интересным оказалось то, что эффективность распространения в полужидких средах клеток A. brasilense ÜK759P (S wa+'-производного мутанта BK759G) сопоставима со скоростью роения ВК468 и ВК571. Однако молекулярно-гснстичсский анализ показал, что за проявление Swa++^]>enoTnna у мутантов, по-видимому, отвечают множество локусов, гомологичные фрагментам ДНК р85 или р120, несущим информацию о продукции флагелл или полисахаридов Sp245. Таким образом, переход от Gri'-распространения клеток мутанта BK759G к SwaM-подвижности (ВК759Р) сопровождается перестройкой генома, затрагивающей плазмиды, а возрастание скорости коллективного роения бактерии, по-видимому, обуславливают несколько генетических локусов А. brasilense Sp245,

Одним из возможных объяснений неоднозначности данных о роли р85 в обеспечении подвижности может быть не истинная элиминация плазмиды из клетки, а интеграция этой плазмиды или локусов fla/Iaflswa/gri в другие репликопы. Не исключено, что интефацию обуславливают мобильные элементы, обнаруженные в составе р85 (Katsy, Prilipov, 2009). В секвепированпом фрагменте ДНК р85 А. brasilense нами обнаружены гены, продукты экспрессии некоторых из которых, по-видимому, могут опосредовать поведенческие реакции бактерий. Так, продукт ог(293 обладает значимым сходством с HdfR. I Id (К известен как репрессор транскрипции мастер-оперона flliDC, продукты которого необходимы для экспрессии ocra.ui.пых флагеллярных генов у Е. coli и других бактерий (Ко, Park, 2000). Рядом с heißt в р85 выявлен ccoN - ген каталитической субъединицы 1 цитохромоксидазы, являющейся интегральным белком цитоплазматической мембраны. Эта кодируемая р85 56-кДа субъединица содержит' участки и каталитические центры, достаточные для работы фермента в качестве протонной помпы. Трансмембраиный протонный потенциал, в частности, используется как источник энергии для вращения бактериальных флагелл.

Локализация охарактеризованного комплекса гомон в р85 А. brasilense Sp245 недалеко от IS-элементов \SAzbal и \SAzba2 свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов, что может сказываться па поведении бактерий. Оказалось, что у двух спонтанных Swa"-npon3Bo;nn.ix (Sp245.P1 и Sp245.PS) ИЦР с парой праймеров, специфичных к З'-копцу гена hdfR. давали негативные результаты. Таким образом, спонтанные перестройки, приводящие к появлению Swa4 '-вариантов, » ряде случаев сопровождаются утратой или модификацией гена iidßt, локализованного в р85. Стоит- еше раз отмстить, что рядом с liciJR в р85 локализован ссо<Х. Таким образом, выявленное нами спонтанное изменение первичной структуры исследуемого

района 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245 может влиять на экспрессию генов hd/R и ccoN и, как следствие, на появление субпопуляций азоспирилл с ускоренным роением.

Результаты проделанной работы свидетельствуют, что на полужидких средах подвижные клетки бактерий рода Azospirillum способны переходить от плавания или роения к неподвижному состоянию, распространению с образованием микроколоний или ускоренному роению. Подобное многообразие способов коллективной подвижности бактерий описано только у P. aeruginosa (Kohler el al, 2000). Возникает вопрос, в каких условиях азоспириллы используют потенциал, предоставляемый тем или иным типом подвижности.

Такие аминокислоты, как аспарагиновая кислота, серии или треонин, способствовали индукции Gr^-подвижности у A. brasilense Sp245. В случае роения, Swa+-, Swa^- или Оп+-подвижности спектр аминокислот, влияющих на эффективность распространения бактерий, различен. Вероятно, это имеет определенное значение в процессе адаптации азоспирилл к существованию в симбиозе с растениями, поскольку состав корневых экссудатов (преимущественное содержание в экссудатах той или иной аминокислоты) может определять преобладание того или иного фенотипа подвижности. По нашим наблюдениям, корневые экссудаты проростков пшеницы стимулируют роение клеток A. brasilense Sp245 по пока непонятному механизму и способствуют переходу неподвижных или Grf-клонов к роению.

В настоящей работе нами впервые показано, что лектины со сродством к остаткам Л,-ацетил-^-1>-глюкозамина (WGA или STA) наиболее заметно влияют и на коллективную подвижность Sp245, стимулируя переход части популяции к распространению в полужидких средах с образованием микроколоний. Мы предполагаем, что в присутствии лектинов со сродством к остаткам Л'-ацетил-JJ-D-глюкозамина переход азоспирилл от 5\уа+-подвижности к Оп+-распространению является следствием снижения подвижности бактерий при помощи жгутиков и возможных изменений межклеточных взаимодействий, необходимых для роения.

Интересными оказались результаты, свидетельствующие, что специфические взаимодействия лектинов различного происхождения с клетками A. brasilense влияют на скорость движения бактерий. В конечном итоге это сказывается на контакте бактерий с целостным организмом, продуцирующим лектин. В настоящей работе с использованием мутантов Sp245 по образованию ЛПС установлено, что лектин G. frondosa, как и фитолектины, оказывает тормозящее влияние на движение А. brasilense, но при условии сохранения на поверхности азоспирилл специфического галтена - ОПС1. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина G. frondosa (в природе A. brasilense и G. frondosa занимают разные экологические ниши), "распознаются" грибом с наименьшим проявлением антагонизма. Данная находка, на наш взгляд, позволяет использовать результаты влияния лектинов на скорость движения бактерий для прогнозирования развития взаимодействий между организмами.

Изучение такого проявления социального поведения микробов как формирование биопленок позволило нам впервые охарактеризовать некоторые структуры, участвующие в данном процессе у азоспирилл. Показано, что в структурной организации биопленок азоспирилл на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность" участвуют липополисахариды и полисахариды, связывающие калькофлуор. Как оказалось, спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры

плазмид А. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок. Организация биопленок на корнях пшеницы происходит при участии полисахаридных и белковых детерминант бактериальной поверхности. По-видимому, бактериальные гликополимеры и белки обеспечивают не только прикрепление бактериальной биопленки к поверхности корня, но и участвуют в организации ее строения, вовлекая в этот процесс факторы растительного происхождения. Одной из стадий формирования биопленки и на стекле или полистироле является образование клеточных агрегатов, но в дальнейшем микроколонии сливаются в единый слой клеток. Напротив, на поверхности корня после "заякоривания" бактерий их расположение в составе микроколоний преобладает. В настоящей работе нами впервые показано, что после "заякоривания" на корнях клетки штамма А. brasilense Sp245 дикого типа и его Fla" Swa" Gi-Г-мугантов заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью. Установлено, что в процессе адаптации к существованию на корнях у штамма А. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

Разработанные в рамках настоящего исследования методические приемы позволили предложить тест, основанный на ингибировании подвижности азоспирилл антителами на поверхностные бактериальные структуры или лектинами различного происхождения. Тест может быть использован для определения серологического родства бактерий и исследования экспонированных углеводных и белковых детерминант в составе поверхности интактных клеток.

В ходе выполнения работы открылись новые перспективы для дальнейших исследований. Так, обнаружение таких фактов, как модулирующее действие корневых экссудатов и фитолектинов на социальную подвижность азоспирилл, активация синтеза белковых детерминант у бактерий, формирующих биопленку на корнях пшеницы, дает возможность для развития исследований, направленных на выяснение механизмов обмена сигналами между партнерами ассоциативного симбиоза.

Автор надеется, что выполненная работа послужит основой для продолжения изучения механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Данное исследование может найти дальнейшее практическое применение при конструировании бактерий, перспективных для использования в биотехнологии.

ВЫВОДЫ

1. В полужидких средах микроколониальное распространение А. brasilense Sp245 не зависит от работы жгутиков и происходит при участии поверхностных структур бактериальной клетки, способных адсорбирировать "прижизненный" краситель конго красный. Адсорбция на клетках конго красного приводит к подавлению роения азоспирилл и стабильному проявлению у них способности к распространению с образованием микроколоний.

2. Эффективность зависящего от работы жгутиков роения А. brasilense Sp245 определяется не только скоростью движения клеток, но и свойствами и составом поверхностных полисахаридов этих бактерий.

3. Межклеточные контакты бактерий А. brasilense Sp245, распространяющихся по полужидким средам, опосредованы взаимодействиями белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Подобные взаимодействия бактерий модулируются в

зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода.

4. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам А'-ацетил-р-О-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток A. brasilense к распространению с образованием микроколоний. Источники азота, недостаток кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы оказывают модулирующее действие на зависящие от работы жгутиков скорость движения клеток и роение бактерий.

5. Определенные генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма А. brasilense Sp245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и социальной подвижности азоспирилл. На подвижность клеток могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в р85 генов hdfR - негативного регулятора транскрипции жгутикового мастер-оперона flhDC и ccoN -каталитической субъединицы I цитохромоксидазы.

6. Спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид А. brasilense Sp245, приводящие к дефектам в образовании липополисахаридов, полисахаридов, связывающих калькофлуор, и полярного жгутика, оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Перечисленные компоненты клеток азоспирилл участвуют в организации биопленок А. brasilense на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность".

7. После "заякоривания" на корнях пшеницы клетки штамма А. brasilense Sp245 и его мутантов, распространяющихся с образованием микроколоний, заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью, формируя клеточные агрегаты. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма А. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

8. Специфические взаимодействия чужеродных лектинов с клетками А. brasilense влияют на скорость движения бактерий, что сказывается на контакте с организмом, продуцирующим лектин. Так, бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина базидиомицета Grifóla frondosa, "распознаются" грибом с наименьшим проявлением антагонизма.

9. Ингибирование подвижности азоспирилл антителами на поверхностные бактериальные структуры или лектинами различного происхождения может быть использовано в качестве теста, позволяющего оценивать серологическое родство бактерий и исследовать степень экспонированности углеводных и белковых компонентов в составе поверхности интактных клеток.

Условные обозначения и сокращения: orf - открытая рамка считывания; ORF - белковый продукт orf, р85 - 85-МДа плазмида штамма А. brasilense Sp245; р 120 - 120-МДа плазмида штамма А. brasilense Sp245; ЛПС, LPS - липополисахарид; ОПС - О-специфический полисахарид; ПССК - полисахариды, связывающие калькофлуор; ЛПБК - липополисахарид-белковый комплекс; ПСЛК - полисахарид-липидный комплекс; СаГ/СаГ адсорбция/отсутствие адсорбции калькофлуора; Fla - полярный жгутик; FlaVfla" -наличие/отсутствие полярного жгутика; MotTMot" - подвижность/отсутствие подвижности в жидких средах; Laf - латеральные жгутики; LafVlaF - наличие/отсутствие латеральных жгутиков; Bfp - пучок пилей; Swa+/Swa~ - наличие/отсутствие роения бактерий; Swa++ -ускоренное роение; Gri+ - распространение бактерий в полужидкой среде с образованием микроколоний; LB - среда Luria-Bertani; MSM - малатно-солевая среда; MPSS - среда для

нитратредукции; ФСБ - фосфатно-солевой буфер; ИФА - твердофазный непрямой иммуноферментный анализ; КОЕ - колониеобразуюшие еденицы; BSA - бычий сывороточный альбумин; СопА - конканавалин A (Canavalia ensi/ormis)', PHA-P -фитогемагглютинин-Р (Phaseolus vulgaris); STA - агглютинин клубней картофеля {Solatium tuberosum)', UEA11 - лекгин из утесника обыкновенного (Ulex europaeus); WGA - агглютинин зародышей пшеницы (Triticum vulgaris).

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Scheluilio А. И, Katsy EJ., Ostudin N.A., Gringaus O.K., Panasenko V.l. Novel classes of Azospirillum brasiiense mutants with defects in the assembly and functioning of polar and lateral flagella (статья на англ. языке) // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1998. № 4. С. 33-37.

2. Katzy E.I., Matora L.Yu„ Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasiiense Sp245 in production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. V. 40, № 1. P. 7383.

3. Кацы Е.И., Шелудько A.B. Картирование локуса Jla в плазмиде с молекулярной массой 120 МДа у бактерий Azospirillum brasiiense Sp245 //Генетика. 1999. Т. 35, № 10. С. 1367-1372.

4. Кацы Е.И., Шелудько А.В. Использование транспозонового Тг\pboA мутагенеза для получения мутантов Azospirillum brasiiense по подвижности и жгутикованию // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2000. № 4. С. 17-20.

5. Кацы Е.И., Борисов КВ., Шелудько А.В. Влияние интеграции вектора pJFF350 в 85-МДа плазмиду Azospirillum brasiiense Sp245 на жгутикование и подвижность бактерий // Генетика. 2001. Т. 37, №2. С. 183-189.

6. Камнееа А.Б., Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько А.В., Панасенко В.И. Комплементационный анализ мутантов ассоциативных бактерий Azospirillum brasiiense Sp245 и S27, дефектных по подвижности и жгутикованию // Генетика. 2001. Т. 37, № 2. С. 190-196.

7. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на клетке Azospirillum brasiiense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. Т. 70, № 5. С. 662-667.

В. Шелудько А.В., Борисов И.В., Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Кацы Е.И. Влияние конго красного на подвижность бактерий Azospirillum brasiiense //Микробиология. 2006. Т. 75, №1. С. 62-69.

9. Лощинта Е.А., Никитина В.Е., Цивипева О.М., Степанова Л.В., Пономарева Е.Г., Шелудько А.В. Морфолого-культуральные характеристики базидиомицета Lentinus edodes при совместном культивировании с бактериями рода Azospirillum // Вести. Сарат. roe. аграрн. ун-та. 2006. № 6. С. 13-14.

10. Бурыгин Г.Л., Широкое А.А., Шелудько А.В., Кацы Е.И,, Щеголее С.Ю., Матора Л.Ю. Выявление чехла на поверхности полярного жгутика Azospirillum brasiiense // Микробиология. 2007. Т. 76, № 6. С. 822-829.

11. Stepanova L.V., Schelud'ko AV., Katsy ЕЛ., Ponomareva E.G., Nikitina V.E. The role of lectin-carbohydrate biospecific interactions between medicinal basidiomycetes mushroom Grifola frondosa (Dicks.: Fr.) S. F. Gray and Azospirillum brasiiense during their co-cultivation II Int. J. Med. Mushrooms. 2008. V. 10, № 1. P. 65-72.

12. Шелудько А,В., Кулибякина O.B., Широкой A.A., Петрова Л.П., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Влияние мутаций в синтезе липополисахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор, на формирование биопленок Azospirillum brasiiense // Микробиология. 2008. Т. 77, № 3. С. 358-363.

13. Golubev S.N., Schelud'ko А.У., Muratova A.Yu., Makarov О.Е., Turkovskaya О.У. Assessing the potential of rhizobacteria to survive under phenanthrene pollution // Water Air Soil Pollut. 2009. V. 198, №14. P. 5-16.

14. Schelud'ko A.V., Makrushin K.V., Tugarova A.V., Krestinenko V.A., Panasenko V.I., Antoiyuk LP., Katsy E.I. Changes in motility of the rhizobacterium Azospirillum brasiiense in the presence of plant lectins//Microbiol. Res. 2009. V. 164, №2. P. 149-156.

15. Borisov I.V., Schelud'ko A.V., Petrova L.P., Katsy EJ. Changes in Azospirillum brasiiense motility and the effect of wheat seedling exudates // Microbiol, Res. 2009. V. 164, № 5. P. 578-587.

16. Шелудько А.В., Пономарева Е.Г., Варшаломидзе О.Э., Ветчинкина Е.П., Кацы Е.И., Никитина В.Е. Гемагглютинирующая активность и подвижность бактерий Azospirillum brasiiense в присутствии разных источников азота // Микробиология. 2009. Т. 78, № 6. С, 749-756.

17. Петрова Л.П., Варшаломидзе О.Э., Шелудько А.В., Кацы Е.И. Локализация генов денитрификации в плазмидной ДНК Azospirillum brasilense // Генетика. 2010. Т. 46, № 7. С. 904910.

18. Шелудько А.В., Широкое А.А., Соколова М. К., Соколов О. И., Петрова Л.П., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Колонизация корней пшеницы бактериями Azospirillum brasilense с различной подвижностью И Микробиология. 2010. Т. 79, № 5 С. 696-704.

Статьи в сборниках

19.Шелудько А.В., Крестиненко В.А., Бурыгин Г.Л., Богомолова И.С. Изучение факторов, влияющих на тип пространственных структур, формируемых подвижными бактериями Azospirillum brasilense Sp245 // Сб. "Нелинейные дни для молодых в Саратове-2003". Саратов: ГосУНЦ "Колледж", 2003. С. 237-241.

20. Шелудько АВ., Тугарова А.В., Бурыгин ГЛ., Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Кацы Е.И. Моделирование условий, влияющих на способы распространения Azospirillum brasilense по агаризованным средам II Сб. ст. 2-й регион, конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой". Саратов: Научная книга, 2005. С. 82-89.

21. Степанова Л.В., Никитина В.Е., Шелудько А.В. Совместное культивирование базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.R Gray и ризобактерии Azospirillum brasilense: значение специфических взаимодействий при первичном контактировании // Сб. матер. 5-го Всеросс. конгресса по медицинской микологии "Успехи медицинской микологии" / Ред. Ю.В. Сергеев. М.: Национальная академия микологии, 2007. Т. IX. С. 261-265.

22. Варшаломидзе О.Э., Шелудько А.В., Пономарева Е.Г., Никитина В.Е., Кацы Е.И. Влияние источников азота на подвижность и свойства клеточной поверхности Azospirillum brasilense II Сб. "Биология: традиции и инновации в XXI веке" / Ред. Т.В. Балтина. Казань: Изд-во КГУ, 2008. С. 29-31.

23. Кацы Е.И., Шелудько А.В., Петрова Л.П., Варшаломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Шульгин С.В. Спонтанные и индуцированные изменения в социальной подвижности ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense // Бюлл. МОИП. Отдел биол. 2009. Т. 114, № 2, прил. 1. С. 132-133.

Учебно-методическое пособие

24.Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам / Составители: Шелудько А.В., Кацы Е.И:, Матора Л.Ю., Бурыгин ГЛ., Широков А. А., Щеголев С.Ю. I Ред. В.В. Игнатов. Саратов: Научная книга, 2007. 56 с.

Тезисы докладов

25. Шелудько А В., Кацы Е.И., Борисов И.В. Поведение ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense Sp245, характеризующейся смешанным жгутикованием, в полужидких средах II Сб. тез. шк.-конф. "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000 г.). Пущино, 2000. Т. 1. С. 214.

26Borisov I.V., Petrova LP., Shelud'ko A.V., Katzy E.l. Genetic analysis of flagellar production and spreading in semiliquid media in the plant-associated bacterium Azospirillum brasilense II The World of Microbes. Abstr. Xth IUMS Intern. Congr. Bacterid. Appl. Microbiol. (Paris, France, 2002). Paris, 2002. P. 79.

27. Шелудько А., Кацы E„ Борисов Я, Абрамов А., Скрипаль А. Энергообеспечение вращения полярной флагеллы ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense И Биология - наука XXI века: 6-я Путинская шк.-конф. молодых ученых (Пущино, 2002 г.): Сб. тез. Тула: Изд-во Тул. гос. пед. ун-та им. JI. Толстого, 2002. Т. 1. С. 75-76.

2i.Katsy E.I., Borisov [.V., Petrova L.P., Shelud'ko A.V. Genetic and phenotypic variability in the populations of Azospirillum brasilense И Molecular Plant-Microbe Interactions: New Bridges between Past and Future. Abstr. Xlth Intern. Congr. Molecular Plant-Microbe Interactions (St.-Petersburg, Russia, 2003). St.-Petersburg, 2003. P. 311.

29 Katsy E.l, Petrova L.P., Shelud'ko A.V., Borisov I.V., Kamneva A.B., Matveeva E.V., Matora LYu.,

Burygin G.L. Properties of the plant-growth promoting rhizobacterium Azospirillum brasilense relevant to colonization of artificial media and wheat roots and to bioremediation 11 Abstr. Intern. Symp. "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants" (Saratov, Russia, 2003). Saratov, 2003. P. 15-16.

30 Макруипт K.B., Шелудько А.В., Бурыгин Г.Л.;Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Матора Л.Ю.,

Кацы Е.И. Быстрая идентификация штаммов Azospirillum brasilense с использованием видеоанализа подвижности микроорганизмов в присутствии антител на поверхностные антигены

// Матер. 2-й регион, конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2004 г.). Саратов: Научная книга, 2004. С. 21-22.

31. Шелудъко АД, Тугарова А.В., Кацы ЕЖ., Панасенко В.И., Крестиненко В.А., Антонюк J1J1. Участие фитолектинов в регуляции подвижности ризобакгерии Azospirillum brasileme II Биология - наука XXI века: 9-я Междунар. Пущинская шк.-конф. молодых ученых (Пущино, 2005 г.). Пущино, 2005. С. 219.

И.Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудъко АВ., Петрова Л.П., Панасенко В.И. Генетический анализ подвижности и образования компонентов клеточной поверхности у ассоциативных альфа-протеобакгерий Azospirillum brasileme // Матер. Всеросс. конф. "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты" (Саратов, 2005 г.). Саратов: Научная книга, 2005. С. 10-12.

ЪЪ.Tugar ova A.V., Sheludko А. К, Katzy E.I., Panasenko V.I., Antonyuk LP. Phytolectins as biologically active substances for rhizobacteria of the genus Azospirillum IIFEBS J. 2005. V. 272, Suppl. 1 (Abstr. 30th FEBS Congr., Budapest, Hungary, 2005). P. 77.

34.Кацы ЕЖ, Петрова Л.П., Шелудъко АВ., Кухибякина О.В., Борисов КВ., Макрушин К.В., Широков АА., Мотора Л.Ю., Соколова М.К, Соколов О.И., ХлебцовБ.Н. Изменения в структуре клеточной поверхности, социальная активность и взаимодействие Azospirillum brasileme с пшеницей Н М1жнар. наук. конф. "Мшробш б!отехнолопГ (Одесса, Украина, 2006 г.): Тез. допов. Одесса: Астропринг, 2006. С. 65.

35. Борисов И.В., Петрова Л.П., Шелудъко А.В., Кацы ЕЖ Фазовые вариации в подвижности ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense сопровождаются изменениями в архитектуре генома // Междунар. шк.-конф. "Генетика микроорганизмов и биотехнология" (Москва-Пущино, 2006 г.): Сб. тез. Москва-Пущино, 2006. С. 34.

36. Шелудъко АВ., Широков АЛ, Кулибякина О.В., Петрова Л.П., Хяебцов Б.Н., Соколова М.К, Мотора Л.Ю., Кацы ЕЖ Изменения в социальной активности и взаимодействие Azospirillum brasilense с проростками Triticum aestivum П Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / III Межрегион, конф. мол. уч.: Сб. матер. Саратов: Научная книга, 2006. С. 18.

37. Katsy El, Prilipov A.G., Petrava LP., Borisov IV., Schelud'ko AV., Kulibyakina O.K. Properties and functions of the Azospirillum brasilense Sp245 and Sp7 plasmids relevant to associative interactions of these bacteria with plants II Abstr. Intern. Sci. Conf. "S.P. Kostychev and Contemporary Agricultural Microbiology" (Yalta, Ukraine, 2007). Chemihiv: CSTEI, 2007. P. 14.

38. Шелудъко A.B., Широков A.A., Кулибякина O.B., Пономарева Е.Г., Тугарова АВ., Никитина В.Е., Антонюк Л.П., Мотора Л.Ю., Кацы Е.И. Внутрипопуляционные и внешние факторы, определяющие изменения в социальной активности Azospirillum brasilense // Сб. матер. Всеросс. конф. с междунар. участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007 г.). Саратов: Научная книга, 2007. С. 42.

39. Шелудъко АВ., Тугарова АВ., Широков АА., Пономарева Е.Г., Никитина В.Е., Антонюк Л.П., Мотора Л.Ю., Кацы ЕЖ. Внешние факторы, влияющие на социальную активность стимулирующих рост растений бактерий рода Azospirillum II Матер, междунар. науч. конф. "Микроорганизмы и биосфера" (Москва, 2007 г.). М.: Макс Пресс, 2007. С. 149-150.

40. Кацы ЕЖ, Петрова Л.П., Шелудъко АВ., Варшаломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Прилипав А.Г. Изменения в структуре плазмид и вариации в проявлении признаков, значимых для взаимодействия ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense с растениями// Матер. 5-го Московского междунар. конгр. "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Ч. 1. (Москва, 2009). М.: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. С. 283.

Подписано в печать 25.10.2010. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Усл.пл.

2. Тираж 100 экз. Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО "Ракурс" 410012, г. Caparoj^rJ. Казачья, 79/85,

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шелудько, Андрей Вячеславович

Условные обозначения и сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общая характеристика ассоциативных бактерий рода АгозртПит.

1.2 Мажорные углеводсодержащие полимеры бактериальной поверхности.

1.3 Межклеточная коммуникация бактерий.

1.4 Двигательные органеллы бактерий.

1.4.1 Жгутики.

1.4.2 Пили.

1.5 Поведение бактерий, обусловленное подвижностью.

1.5.1 Движение жгутиковых бактерий.

1.5.2 Хемотаксис бактерий.

1.5.3 Коллективная подвижность бактерий.

1.5.3.1 Роение бактерий.

1.5.3.2 Тянущая подвижность бактерий.

1.5.3.3 Скольжение бактерий.

1.6 Формирование бактериями биопленок.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объекты исследования.

2.1.1 Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе.

2.1.2 Растительный и грибной объект, использованные в работе.

2.2 Питательные среды и условия культивирования.

2.3 Методы изучения ряда биохимических, физиологических и морфологических признаков бактериальных культур.

2.4 Иммунохимические методы анализа различий в продукции бактериями полисахаридов и белков.

2.5 Методы изучения гемагглютинирующих свойств бактерий.

2.6 Изучение подвижности бактерий.

2.6.1 Изучение подвижности бактериальных клеток в жидкостях.

2.6.2 Изучение коллективной подвижности бактерий в полужидких средах.

2.7 Генетические методы.

2.8 Методы оценки способности бактерий к формированию биопленок.

2.9 Изучение колонизации растений бактериями.

2.10 Совместное культивирование базидиомицета G. frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917 и штаммов A. brasilense.

2.11 Статистическая обработка результатов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Индивидуальная и социальная подвижность азоспирилл, зависящая от работы жгутиков.

3.2 Миграция A brasilense с образованием микроколоний, не зависящая от жгутиков.

3.3 Особенности продукции и работы флагелл у роящихся дериватов Gri+ штаммов A. brasilense и у производных A. brasilense с ускоренным роением.

3.4 Влияние продуктов бактериального метаболизма на социальную подвижность азоспирилл.

3.5 Влияние модификаций клеточной поверхности, вызванных адсорбцией прижизненного красителя конго красного, на подвижность азоспирилл.

3.6 Роль полисахаридов клеточной поверхности в реализации социальной подвижности A.brasilense.

3.6.1 Изменения в подвижности у cal и Ips мутантов A. brasilense

Sp245.

3.6.2 Подвижность A. brasilense в присутствии поликлональных антител на полисахариды и флагеллин.

3.7 Влияние поверхностного гемагглютинина A. brasílense Sp245 на социальную подвижность этих бактерий.

3.8 Молекулярно-генетическая характеристика мутантов A. br asílense Sp245 по социальной подвижности.

3.9 Подвижность A. brasilense Sp245 в лабораторных средах разного состава.

ЗЛО Социальная подвижность A. brasilense в присутствии корневых экссудатов пшеницы.

3.11 Подвижность A. brasilense в присутствии растительных лектинов, обладающих разной специфичностью.

3.11.1 Скорость плавания^. brasilense в присутствии лектинов растений.

3.11.2 Влияние фитолектинов на поведение A brasilense в полужидких средах.

3.12 Формирование биопленок A. brasilense на абиотических поверхностях.

3.12.1 Относительная гидрофобность клеточной поверхности A. brasilense Sp245 и его мутантов по образованию ПССК, ЛПС и подвижности.

3.12.2 Различия в эффективности формировании биопленок штамма А brasilense Sp245 и его мутантов на поверхности стекла и пластика.

3.12.3 Иммуноферментный анализ биопленок дикого и мутантных штаммов A. brasilense.

3.13 Изменения в подвижности бактериальных клеток при их первичном контакте с потенциальным партнером на примере взаимодействия А. brasilense и базидиомицета Grifóla frondosa (Fr.) S.F. Gray.

3.13.1 Совместное культивирование G. frondosa 0917 с бактериями штамма A. brasilense Sp245 дикого типа или его мутантами по синтезу полисахаридов.

3.13.2 Изучение подвижности^. brasilense Sp245 и его мутантов по синтезу полисахаридов в присутствии лектина G. frondosa 0917.23О

3.14 Колонизация корней пшеницы штаммами A. brasilense с различиями в социальной подвижности.

3.14.1 Динамика колонизации корней пшеницы штаммом A. brasilense Sp245 и его Swa~ Gri+мутантами.

3.14.2 Образование агрегатов A. brasilense в процессе колонизации корней пшеницы.

3.14.3 Анализ полисахаридных и белковых антигенов, экспонированных на поверхности клеток штамма A brasilense Sp245 и его мутантов по подвижности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense"

Актуальность проблемы. Бактерии рода Azospirillum являются модельным объектом в исследованиях молекулярных механизмов ассоциативного взаимодействия растений и микроорганизмов. Азоспириллы - ризобактерии, стимулирующие рост и развитие растений (PGPR — Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), благодаря своей способности к фиксации атмосферного азота, продукции фитогормонов, контролю фитопатогенов и др. (Berg, 2009; Lugtenberg, Kamilova, 2009). Существование в гетерогенных условиях почвы, смена экологических ниш (почва - ризосфера - растение) требуют от бактерий богатого набора адаптивных способностей.

Наличие специализированных двигательных органелл, наряду со способностью реагировать на постоянно изменяющиеся условия окружающей среды посредством тактических реакций, существенно расширяет адаптационные возможности бактерий, живущих в разнообразных местах обитания (Armitage 1992; Кацы, 1996; Дебабов, 1999; Vladimirov, Sourjik, 2009). Эффективность экспансии микроорганизмов повышается в результате перехода индивидуально движущихся клеток к коллективной миграции (Henrichsen, 1972; Дебабов, 1999; Олескин с соавт., 2000; Verstraeten et al., 2008). В настоящее время описано значительное количество типов индивидуальной и коллективной подвижности микроорганизмов (плавание, роение, скольжение, тянущая подвижность и др.). Особенности совместного перемещения микроорганизмов определяются механизмами, обеспечивающими движение; межклеточными контактами, обусловленными мажорными компонентами клеточной поверхности; а в некоторых случаях зависят от продукции сурфактантов и ряда других факторов (Harshey, 2003). Генетико-физиологический анализ изменений в подвижности бактерий и архитектуре их клеточной поверхности необходим для выяснения механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.

Исследование подвижности и хемотаксиса бактерий является одной из динамично развивающихся областей современной микробиологии. Столь пристальное внимание к проблеме во многом вызвано тем обстоятельством, что на сравнительно простой биологической системе, каковой является бактериальная клетка, можно установить закономерности, лежащие в основе поведенческих реакций, которые можно экстраполировать на более сложные системы (Adler, 1987; Иваницкий, 1999; Олескин, 2009). Наряду с классическими объектами Escherichia coli и Salmonella typhimnrhim внимание исследователей привлекают и почвенные бактерии. Именно у них обнаружены более сложные, чем у Enterobacteriaceae, хемосенсорные системы, большее разнообразие двигательных органелл и механизмов, приводящих клетки в движение. Усложнение организации систем подвижности и хемотаксиса у почвенных бактерий считают отражением высокой пластичности их метаболизма (Manson et al., 1998; Кацы, 2003).

В природных экосистемах большинство бактерий существуют в виде прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет собой сложный строго регулируемый биологический процесс. Формирование микроорганизмами биопленочных сообществ является одной из стратегий выживания бактерий не только в окружающей среде, но и в инфицируемых макроорганизмах. В составе биопленок бактерии объединены сложными межклеточными связями и во многом функционально сходны с многоклеточными организмами (Shapiro, 1998; Ильина с соавт., 2004; Dobretsov et al., 2009). Учитывая то обстоятельство, что в случае ассоциативного взаимодействия не происходит образования каких-либо специфических структур, наподобие клубеньков, характерных для бобово-ризобиального симбиоза (Pedrosa, 1988), формирование азоспириллами биопленок может играть существенную роль в успешном функционировании ассоциации.

В последнее десятилетие интенсивное изучение разнообразных процессов, реализуемых при наличии достаточной плотности популяции микроорганизмов ("ощущение кворума", формирование биопленок или плодовых тел, различные способы коллективной подвижности, синтез экзоферментов, конъюгативный перенос плазмид и пр.), вышло на качественно новый теоретический и методический уровень. В 2005 г. для данной области исследований предложено название "социомикробиология" (Parsek, Greenberg, 2005). В обзоре A.B. Олескина (2009) отмечено, что бактерии проявляют различные формы коллективного поведения (кооперацию, координированную агрессию и избегание); бактериальные системы характеризуются контактной и дистантной коммуникацией; микроорганизмы формируют надклеточные системы, которые можно рассматривать как бактериальные биосоциальные системы, по аналогии с сообществами животных. Бактериальные биосоциальные системы характеризуются целостностью, единым жизненным циклом и иерархической или сетевой организацией (Олескин, 2009). Таким образом, выбор популяцией микроорганизмов оптимального варианта взаимодействия с внешней средой и клетками высших организмов, осуществляемый в результате обмена информацией между отдельными особями, можно считать социальным поведением.

Новые знания о генетических и внешних факторах, влияющих на социальное поведение ассоциативных бактерий, стимулирующих рост и развитие растений, будут полезны при разработке аграрных биотехнологий, методов мониторинга состояния окружающей среды (создание биосенсоров) и фиторемедиации загрязненных почв.

В качестве основного объекта данного исследования выбраны бактерии штамма Azospirillum brasilense Sp245, обладающие всеми характеристиками, которые могут влиять на их ассоциативное взаимодействие с растениями (диазотрофность, хемотаксис, подвижность, образование фитогормонов, полисахаридов клеточной поверхности и др.). Кроме того, бактерии данного штамма, наряду с бактериями штаммов А. brasilense Sp242, Spl07 и Spl08 (Baldani et al., 1983) и A. irakense KBC1 (Faure et al., 1999), способны не только колонизировать ризосферу, но и проникать внутрь корней и существовать в них в метаболически активном состоянии (Döbereiner, De-Polli, 1981; Jain, Patriquin, 1984). Все перечисленное выше делает бактерии A. brasilense Sp245 крайне интересным объектом для изучения молекулярных основ адаптационного потенциала почвенных микроорганизмов. В работе были использованы и другие штаммы азоспирилл - представители видов А. ЬгаБИете, А. Иа1оргае[егат, А. Ь'акете и А. Иро/егит.

Бактерии рода Аго.^р1гИ1ит способны к ассоциативному взаимодействию с чрезвычайно широким кругом растений, распространены практически во всех климатических зонах и экологических нишах (в почве, в корнях растений, на поверхности подземной и надземной частей растений, в воде и др.) (итаН-вагсаа е/ а1, 1980; Басилашвили, Нуцубидзе, 1984; Федорова с соавт., 1985; Азбгпш ег а1., 1995; ВаБИап, Но^шп, 1997). В данном контексте интересно сравнение поведения А. ЬгазИете Бр245 и других штаммов для выявления универсальных механизмов, обеспечивающих разнообразные проявления социальной активности азоспирилл.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в комплексном генетико-физиологическом анализе социального поведения ассоциативных бактерий АгоБртПит ЬгаяИете.

В связи с поставленной целью в наши задачи входило следующее:

1. Охарактеризовать социальную подвижность штаммов А ЬгаяПете дикого типа и мутантов штамма А. ЪгазИете 8р245 с изменениями в жгутиковании и составе углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности.

2. Оценить роль полисахаридов и белка-гемагглютинина, локализованных на клеточной поверхности, в реализации социальной подвижности бактерий штамма А ЬгазИете 8р245.

3. Изучить возможное влияние на подвижность азоспирилл ряда внешних факторов (состав среды культивирования; присутствие прижизненного красителя конго красного, корневых экссудатов проростков пшеницы, растительных и грибного лектинов, поликлональных антител на поверхностные полимеры бактериальных клеток).

4. Охарактеризовать нуклеотидную последовательность сегмента резидентной 85-МДа плазмиды штамма А. ЬгаяИете Бр245, мутагенез которого приводит к дефектам в жгутиковании и/или подвижности азоспирилл.

5. Провести анализ изменений в структуре генома А. ЬгаяИете 8р245, сопровождающихся вариациями в социальной подвижности этих бактерий.

6. Исследовать процесс формирования биопленок культурами штамма А. ЫшНете Бр245 и его мутантов с изменениями в структуре клеточной поверхности и подвижности на абиотических плотных средах и на корнях проростков пшеницы.

Научная новизна работы. Дана характеристика новых проявлений социальной подвижности азоспирилл: ускоренное роение, зависящее от работы жгутиков, и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний, реализуемое и в отсутствие жгутиков. Описаны новые экстраклеточные органеллы бактерий штамма А. ЬгаяНете 8р245 - полярный пучок пилей, продукция которых, возможно, альтернативна сборке полярного жгутика.

Установлено, что социальная подвижность азоспирилл ' определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбировать прижизненный краситель конго красный.

Показано, что межклеточные контакты бактерий А. Ьга8Иете Бр245, двигающихся в полужидких средах, опосредуются взаимодействиями белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида этих бактерий.

Определены некоторые факторы (сниженная концентрация кислорода, аминокислоты аспарагиновая кислота, серии и треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам Л^-ацетил-Р-О-глюкозамина, соли аммония, нитраты и нитриты), способствующие переходу части популяции клеток А. ЬгаяПете от плавания и роения к распространению с образованием микроколоний или оказывающие модулирующее действие на скорость движения клеток.

Обнаружено, что спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид А. ЬгазИете 8р245 оказывают заметное влияние на социальное поведение бактерий. В ДНК 85-МДа плазмиды А. ЬгазИете 8р245 идентифицированы гены и ссоЫ, предсказанные белковые продукты которых могут влиять на поведенческие реакции бактерий.

Выявлены поверхностные структуры бактерий и типы подвижности, участвующие в процессе формирования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность" или на корнях проростков пшеницы.

Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены оригинальные мутанты штамма А. brasilense Sp245 с изменениями в индивидуальной и социальной подвижности, продукции жгутиков и поверхностных полисахаридов, которые могут быть полезны при изучении механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Разработанные методические приемы и теоретические положения нашли применение в исследованиях, выполняемых в пяти лабораториях ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, биохимии, микробиологии, иммунохимии и экологической биотехнологии), объектами которых были не только бактерии рода Azospirillum, но и бактерии других родов (что частично отражено в публикациях, представленных в списке основных публикаций по теме диссертации).

Предложенная биотест-система, основанная на ингибировании подвижности разных штаммов азоспирилл поликлональными антителами на поверхностные бактериальные структуры, может быть использована для первичной оценки серологического родства этих бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности интактных клеток.

Результаты работы использованы при подготовке учебно-методического пособия "Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам" / Составители: Шелудько A.B., Кацы Е.И., Матора Л.Ю., Бурыгин ГЛ., Широков A.A., Щеголев С.Ю. / Под ред. Игнатова В.В. Саратов: Научная книга, 2007. 56 с. Данное пособие, рекомендованное к печати кафедрой органической и биоорганической химии и кафедрой биохимии и биофизики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), предназначено для студентов и аспирантов химического и биологического факультетов СГУ.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Ускоренное роение и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний представляют собой новые проявления социальной подвижности азоспирилл. Коллективное движение азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбирировать прижизненный краситель конго красный.

2. Распространение бактерий А. ЬгаяИете Бр245 по полужидким средам опосредуется взаимодействием белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Источники азота в окружающей среде и кислород модулируют гемагглютинирующие свойства бактериальных клеток и, как следствие, подобные взаимодействия.

3. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам уУ-ацетил-[3-0-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток А. ЬгаяНете от плавания или роения к распространению с образованием микроколоний. На эффективность роения азоспирилл влияют природа источника азота в среде, концентрация кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы.

4. Генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма А. ЬгаяИете Бр245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и подвижности азоспирилл. На социальное поведение азоспирилл могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в р85 генов к(Щ. и ссоИ - негативный регулятор транскрипции жгутикового мастер-оперона /¡ИОС и каталитическая субъединица I цитохромоксидазы, соответственно.

5. Изменения состава и (или) структуры плазмид А. ЬгаяПете Бр245 оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Липополисахариды, полисахариды, связывающие калькофлуор, и полярный жгутик участвуют в организации биопленок А. ЫтПете на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность".

6. После "заякоривания" на корнях пшеницы формирование биопленки клетками штамма А. brasilense Sp245 и его нероящихся мутантов опосредовано распространением с образованием микроколоний. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма А. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

7. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии чужеродного лектина, "распознаются" организмом, продуцирующим лектин, с наименьшим проявлением антагонизма.

8. Эффект ингибирования подвижности азоспирилл антителами на поверхностные структуры или лектинами различного происхождения может быть использован для оценки серологического родства бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности клеток.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН в рамках трех плановых тем НИР: "Изучение генов почвенных азотфиксирующих бактерий, определяющих их взаимодействие со злаками" (№ госрегистрации 01960001676); "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образование мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense" (№ госрегистрации 01200606181); "Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями" (№ госрегистрации 01200904390). Работа частично поддержана грантом Президента РФ МК-235.2003.04 для молодых кандидатов наук (канд. биол. наук A.B. Шелудько) и их научных руководителей (д-р биол. наук Е.И. Кацы); грантами Президента РФ НШ-1529.2003.4, НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 для ведущей научной школы засл. деятеля науки РФ, д-ра биол. наук, проф. В.В. Игнатова; грантом Роснауки № 2005-РИ-112/001 (рук. - д-р биол. наук, проф. В.В. Игнатов); грантом Фонда содействия отечественной науке для канд. биол. наук A.B. Шелудько и грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 06-04-48204-а (рук. - д-р биол. наук Е.И. Кацы).

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в планировании и осуществлении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. Автор выражает искреннюю признательность своему научному консультанту - заведующей ЛГМ ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Е.И. Кацы за многолетнюю помощь и всестороннюю поддержку работы. Автор признателен участвовавшим в проведении исследований сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.П. Петровой, канд. биол. наук И.В. Борисову, канд. биол. наук О.В. Кулибякиной и О.Э. Варшаломидзе; сотрудникам лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.Ю. Матора, канд. биол. наук Г.Л. Бурыгину и канд. биол. наук A.A. Широкову; сотрудникам лаборатории биохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.П. Антонюк, канд. биол. наук A.B. Тугаровой и В.А. Крестиненко; сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.В. Степановой, канд. биол. наук Е.Г. Пономаревой и канд. биол. наук Е.П. Ветчинкиной; сотруднику лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН канд. биол. наук М.К. Соколовой; чей вклад отражен в совместных публикациях; а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН, способствовавшим успешному выполнению работы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-й Школе-конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), 10-м Международном конгрессе IUMS The "World of Microbes" (Париж, 2002), 1-й и 2-й Региональных конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2002, 2004), 6-й, 9-й и 10-й Школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2000, 2005, 2006), международной конференции "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants" (Саратов, 2003), 3-й Всероссийской школе-конференции "Химия и биохимия углеводов" (Саратов, 2004), 30-м конгрессе FEBS (Будапешт, 2005), Всероссийской конференции "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты" (Саратов, 2005), Международной научной конференции "MÍKpo6HÍ бютехнологп" (Одесса, 2006), Международной школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" (Москва-Пущино, 2006), 3-й и 4-й Межрегиональных конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2006, 2008), Всероссийской конференции с международным участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), Международной научной конференции "Микроорганизмы и биосфера" (Москва, 2007), 5-м Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии "Успехи медицинской микологии" (Москва, 2007), Международном рабочем совещании "Azospir ilium VII and related PGPR: Genomics, molecular ecology, plant responses and agronomic significance" (Монпелье, 2007), Международной конференции "Вавиловские чтения-2007", посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Саратов, 2007), Международной научно-практической конференции "Вавиловские чтения-2008", посвященной 95-летию Саратовского госагроуниверситета (Саратов, 2008), 5-м Московском междунар. конгр. "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009), отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН (Саратов, 2003, 2004, 2008).

Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 09.06.2010, протокол № 175.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ, в том числе, 18 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 321 странице машинописного текста, содержит 24 таблицы и 54 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 14 подразделов), а также заключения, выводов, списка цитируемой

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шелудько, Андрей Вячеславович

ВЫВОДЫ

1. В полужидких средах микроколониальное распространение A. brasilense Sp245 не зависит от работы жгутиков и происходит при участии поверхностных структур бактериальной клетки, способных адсорбирировать "прижизненный" краситель конго красный. Адсорбция на клетках конго красного приводит к подавлению роения азоспирилл и стабильному проявлению у них способности к распространению с образованием микроколоний.

2. Эффективность зависящего от работы жгутиков роения A. brasilense Sp245 определяется не только скоростью движения клеток, но и свойствами и составом поверхностных полисахаридов этих бактерий.

3. Межклеточные контакты бактерий A. brasilense Sp245, распространяющихся по полужидким средам, опосредованы взаимодействиями белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Подобные взаимодействия бактерий модулируются в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода.

4. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам ТУ-ацетил-Р-Б-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток A. brasilense к распространению с образованием микроколоний. Источники азота, недостаток кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы оказывают модулирующее действие на зависящие от работы жгутиков скорость движения клеток и роение бактерий.

5. Определенные генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма А. brasilense Sp245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и социальной подвижности азоспирилл. На подвижность клеток могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в р85 генов hdfR — негативного регулятора транскрипции жгутикового мастер-оперона flhDC и ccoN — каталитической субъединицы I цитохромоксидазы.

6. Спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245, приводящие к дефектам в образовании липополисахаридов, полисахаридов, связывающих калькофлуор, и полярного жгутика, оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Перечисленные компоненты клеток азоспирилл участвуют в организации биопленок А. brasilense на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность".

7. После "заякоривания" на корнях пшеницы клетки штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов, распространяющихся с образованием микроколоний, заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью, формируя клеточные агрегаты. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

8. Специфические взаимодействия чужеродных лектинов с клетками А. brasilense влияют на скорость движения бактерий, что сказывается на контакте с организмом, продуцирующим лектин. Так, бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина базидиомицета Grifóla frondosa, "распознаются" грибом с наименьшим проявлением антагонизма.

9. Ингибирование подвижности азоспирилл антителами на поверхностные бактериальные структуры или лектинами различного происхождения может быть использовано в качестве теста, позволяющего оценивать серологическое родство бактерий и исследовать степень экспонированности углеводных и белковых компонентов в составе поверхности интактных клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Азоспириллы привлекают внимание исследователей коллективного поведения микроорганизмов в основном в качестве модели для изучения механизмов изменения характера жгутикования при переходе бактерий от свободного плавания к роению (Moens et al, 1995; Кацы, 1996; Stewart et al., 2003; Berleman, Bauer, 2004; Merino et al., 2006). Такая дифференцировка клеток, плавающих при помощи полярного жгутика, в роящиеся клетки выражается в синтезе дополнительных латеральных жгутиков, которые короче и тоньше полярного жгутика и отличаются от него серологически (Tarand et al., 1978; Hall, Krieg, 1983, 1984; Khammas et al., 1989; Schloter et al., 1994). Однако разнообразные проявления коллективного поведения микроорганизмов зависят не только от бактериальных систем, функционирование которых напрямую связано с поведенческим процессом ("ощущение кворума", формирование биопленок, плодовых тел, роение, скольжение, тянущая подвижность и пр.), но и от факторов, способствующих наиболее успешной адаптации микроорганизмов к условиям их обитания (Дебабов, 1999; Олескин, 2000). Так, способность азоспирилл перемещаться в почве по направлению к корням растения и наличие у них чувствительной системы хемотаксиса обусловливают заселение бактериями растений (Reinhold et al., 1985; Mandimba et al., 1986; Bashan, 1986; Steenhoudt, Vanderleyden, 2000). Получены данные о начальных этапах колонизации азоспириллами корневой системы растений - адсорбции и "заякоривании" клеток. Первые этапы взаимодействия бактерий с поверхностью корня опосредуют полисахариды, белки с лектиновой активностью и полярный жгутик (Croes et al, 1993; Аленькина с соавт., 1998; Федоненко с соавт., 2001; Yegorenkova el al, 2001; Rodríguez-Navarro et al, 2007). Однако механизмы подвижности, позволяющие клеткам A. brasilense после закрепления на поверхности корня сформировать биопленку, и относительный вклад в этот процесс разнообразных полимеров клеточной поверхности у A. brasilense не известны.

Анализ генетических причин и физиологических последствий изменений в способах коллективного подвижности бактерий, архитектуре их клеточной 1 поверхности оказался весьма интересной задачей и позволил расширить существующие представления о поведении азоспирилл. В своих исследованиях мы использовали созданную в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН уникальную коллекцию мутантов и спонтанных производных A. brasilense по признакам, связанным с продукцией поверхностных структур и функционированием систем, обеспечивающих бактериальную подвижность. В своей работе мы исследовали роль тех структур, которые первыми вступают во взаимодействие с окружающей средой и во многом определяют поведение микроорганизма: аппарат подвижности, полисахаридсодержащие полимеры и белки бактериальной поверхности.

Результаты настоящей работы позволили нам расширить существующие представления о роении азоспирилл.

Так, нами впервые показано, что, по крайней мере, у двух штаммов A.brasilense, Sp245 и S27, роение бактерий по полужидким средам, помимо латеральных флагелл, обеспечивает полярный жгутик. На полужидких средах Fla- Laf'/Fla" leaky LaF производные этих штаммов не способны к роению.

Получены новые экспериментальные подтверждения существенной роли межклеточных контактов в реализации роения азоспирилл. В случае роения 15-ти исследованных штаммов A. brasilense, двух штаммов A. irakense и двух штаммов A. lipoferum формирование межклеточных контактов обусловлено поверхностными структурами, взаимодействующими с конго красным.

Азоспириллы обладают потенциалом, повышающим скорость роения бактерий по агаризованным средам (Swa^-фенотип). Ускоренное роение азоспирилл на полужидких средах может быть следствием изменений, затрагивающих механизмы, обеспечивающие вращение флагелл (получены мутанты и спонтанные производные A. brasilense Sp245, клетки которых двигаются быстрее особей родительского штамма) или изменений в продукции поверхностных полисахаридов (ряд мутантов A. brasilense Sp245 с различными изменениями в продукции полисахаридов имеет Swa^-фенотип). Также возможно, что Swa^-фенотип обусловлен снижением или возрастанием уровня продукции внутрипопуляционных бактериальных факторов, регулирующих социальное поведение азоспирилл или изменением систем "рецепции", воспринимающих эти факторы.

Наблюдения за поведением ряда Swa~—мутантов штамма А. brasilense Sp245 (отсутствие способности к роению у мутантов обусловлено различными дефектами в продукции и функционировании флагелл) позволили нам выявить скрытый потенциал, обеспечивающий распространение азоспирилл по полужидким средам. Клетки мутантов длительное время остаются в точке инокуляции (Swa"-{J)eHOTHn), а затем начинают перемещаться, формируя диски, состоящие из клеточных агрегатов — Оп+-распространение. Способ распространения с образованием микроколоний не связан с какими-либо общими дефектами в продукции полисахаридов, локализованных на клеточной поверхности. Более того, межклеточные взаимодействия, обусловленные поверхностными структурами бактериальной клетки важны для реализации Gri '-распространения.

Изучение морфологии клеток Оп+-мутантов и их подвижности в полужидком агаре позволяет полагать, что, реализуя механизм распространения с образованием микроколоний, бактерии не используют жгутики. При этом на одном из полюсов клеток Grr-мутантов обнаружен пучок пилей. Необходимо отметить, что пучок пилей был также обнаружен на полюсе клеток и у штамма Sp245. Мы ни разу не наблюдали Fla и полярные пили на одной и той же клетке при просвечивающей электронной микроскопии препаратов клеток, выращенных на плотной среде или в жидкой культуре. Вероятно, продукция на полюсе клетки либо вращающегося Fla, либо пилей являются альтернативными состояниями вегетативных клеток азоспирилл.

В популяции клеток А. brasilense Sp245, обладающих Swa^eHoranoM, с низкой частотой появляются клоны, распространяющиеся с образованием Gri+-колоний (3x10"3), и неподвижные клоны (5x10-2). Частота появления Gri+-клонов слегка возрастает (до 1хЮ~2) в результате преинкубации Sp245 без аэрации с последующей инокуляцией бактерий непосредственно в полужидкую среду. Клоны 8р245 со спонтанным вгт- или 8луа~ОгГ-фенотипом оказались нестабильными, а 8\^а+-фенотип доминировал в популяции. Охарактеризованная нами впервые фенотипическая диссоциация азоспирилл по признаку подвижности клеток в гелеобразных средах подтверждена результатами анализа диссоциативного спектра популяций, вырастающих после рассева цистоподобных покоящихся клеток на плотных средах (работы сотрудников Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва). Авторами (Погорелова с соавт., 2009) показано, что диссоцианты А. ЬгаяПете Бр7 или Бр245 помимо колониально-морфологических признаков различались в способах распространения в полужидких средах (отмечены , 8у/а~ОгГ- и 8луа+ вгг-фенотипы).

Подавление роения бактерий рода АгоБрЫПит (показано для 15-ти исследованных штаммов А. ЬгаБИете дикого типа, двух штаммов А. /гакепзе и двух штаммов А. Иро/егит) и стабильное проявление у них способности к распространению с образованием микроколоний может быть индуцировано адсорбцией на клетках "прижизненного" красителя конго красного. Подобный переход в социальной подвижности азоспирилл обусловлен изменениями в структуре бактериальной поверхности в результате адсорбции на клетках красителя. Модификации экстраклеточных соединений, которые бактерии используют для реализации социальной подвижности, могут способствовать переходу от распространения с образованием микроколоний к роению в присутствии конго красного.

Появление среди клеток Оп+-мутанта, формирующих агрегаты на полужидком агаре, субпопуляции бактерий с восстановленной способностью к роению сопровождается возобновлением продукции полярного жгутика. Такие производные приобретают устойчивый фенотип Зхуа"1"4". Субпопуляция особей, обладающих повышенной скоростью миграции, возникает не только среди бактерий, распространяющихся с образованием микроколоний, но и в популяции роящихся клеток. Вероятно, у А. ЪгахИете существует либо механизм запуска экспрессии систем, необходимых для ускоренного движения бактерий, либо быстро двигающиеся особи, изначально присутствующие в популяции, формируют Эша^-субпопуляцию в ответ на внешние или внутрипопуляционные стимулы.

Нами показано, что скорость перемещения азоспирилл снижается в присутствии специфических антител на липополисахариды. Снижение скорости движения клеток, обусловленное взаимодействием антител на липополисахариды с полярным жгутиком (чехлом) и возникновением на линии фронта движущихся бактерий иммунных агрегатов, тормозящих распространение азоспирилл в полужидком агаре, позволяет рассматривать антитела как модулирующий фактор, усиливающий межклеточные контакты, обусловленные взаимодействиями с участием полисахаридов.

Результаты настоящей работы позволили впервые описать роль межклеточных контактов, обусловленных взаимодействиями гемагглютинина и О-специфического полисахарида в распространении азоспирилл - бактерий, использующих для движения жгутики. Подобные взаимодействия бактерий модулируются, в частности, в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода, что, в свою очередь, может иметь значение при бактериальной колонизации корневой системы растения-хозяина.

Штамм A. brasilense Sp245, являющийся модельным объектом наших исследований, содержит плазмиды р85 (с молекулярной массой 85 МДа), р120 (120 МДа) и три плазмиды с молекулярной массой >300 МДа (Кацы, 1992). Поскольку плазмиды составляют весомую долю генома A. brasilense, закономерен интерес к выяснению роли этих ДНК в обеспечении поведения бактерий (Кацы, 2002а). С этой целью были проведены эксперименты по локализации инсерционных мутаций в геноме производных штамма Sp245 с изменениями в жгутиковании и подвижности.

Ранее нами было продемонстрировано, что в плазмидах р85 и р120 находятся локусы, инсерционный мутагенез которых приводит к Fia", Mot" и ЬаГ фенотипу мутантов (Shelud'ko et al., 1998; Шелудько, 2000; Кацы, 20026). Результаты представленные в настоящей работе, свидетельствуют, что интеграция вектора pJFF350 в плазмиду р85 приводит к разным фенотипическим проявлениям: к утрате способности клеток синтезировать функционирующие флагеллы и, как следствие, к Swa'-фенотипу или к появлению бактерий с ускоренным роением (фенотип мутантов ВК570 (Swa"^), BK759G (Fla"), SK051 (leaky Fla'LaFMotf) и SK248 (Mot-)). Стоит отметить, что при включении pJFF350 в ДНК р85 отсутствует строгая сайт-специфичность. В случае вставки Omegon-Km в плазмиду р120 нарушается не только продукция и функционирование жгутиков (8ша"-фенотип), но и изменяются свойства поверхностных полисахаридов (фенотип мутантов SK048 (Fia- Mot") и КМ018 (СаГ Lpsir Mot")). При этом у ряда мутантов изменения в синтезе полисахаридов сопровождаются повышением скорости роения (КМ127 (LpsF), КМ 134 (Lpsi"), КМ139 (Lpsir), КМ348 (LpsF)). Необходимо отметить, что, утратив способность к роению, мутанты с инсерциями, локализованными в р85 или р120, сохраняют способность к распространению с образованием микроколоний.

Переход от Grf-распространения (BK759G) к Swa^-подвижности (ВК759Р) сопровождается исчезновением р85 и появлением новой плазмиды с молекулярной массой 36 МДа. Вероятно, для функционирования генов, обеспечивающих подвижность бактерий с образованием микроколоний, присутствие в геноме репликона р85 является существенным. Например, у трех Swa" Grr-мутантов штамма Sp245 с различными нарушениями в продукции и функционировании жгутиков, Fla" leaky LaF KZ019 и KZ044, а также Mot" leaky Fla" KZ020, исследование плазмидного профиля показало утрату р85. С другой стороны, в настоящей работе представлены два мутанта A. brasilense Sp245, содержащие коинтеграт p85::pJFF350, дефектные по жгутикованию или подвижности: leaky Fla" LaF Mot" SK051 и Mot" SK248. Несмотря на интеграцию pJFF350 в плазмиду с молекулярной массой 85 МДа, бактерии штаммов SK051 и SK248 сохраняют способность к распространению с образованием микроколоний. Таким образом, прослеживается некоторая взаимосвязь между отсутствием в экстрахромосомном состоянии р85 у клеток мутантов с измененными Fla- и/или Laf-системами и потерей ими способности к распространению с образованием микроколоний. Стоит отметить, что у мутанта Sp245.5 (утрачены 85- и 120-МДа репликоны) поведение клеток в полужидких средах не изменяется в присутствии конго красного, способствующего переходу азоспирилл к Grr-подвижности. Утрата Gri+-подвижности наблюдается и в тех случаях, когда транспозон встраивается в хромосомную ДНК (Swa~ Grf-мутанты SK531 (Fla- Laf Mot" фенотип) и SK586 (Fla~ leaky LaF фенотип)).

Интересным оказалось то, что эффективность распространения в полужидких средах клеток ВК759Р Бша^ производного BK759G сопоставима со скоростью роения ВК468 и ВК571 (Swa^-фенотип). Однако молекулярно-генетический анализ показал, что за проявление Блуа^-фенотипа этих мутантов отвечает множество локусов, гомологичных фрагментам ДНК р85 или р120, несущих информацию о продукции флагелл или полисахаридов Sp245. Таким образом, переход от Сп+-распространения клеток мутанта BK759G к Swa*4— подвижности (ВК759Р) сопровождается перестройкой генома, затрагивающей плазмиды, а возрастание скорости коллективного роения бактерий, по-видимому, обуславливают несколько генетических локусов A. brasilense Sp245.

Одним из возможных объяснений неоднозначности данных о роли р85 в обеспечении подвижности может быть не истинная элиминация плазмиды из клетки, а интеграция этой плазмиды или локусов flallaflswa/gri в- другие репликоны. Не исключено, что интеграцию обуславливают мобильные элекменты, обнаруженные в составе р85 (Katsy, Prilipov, 2009). В случае мутанта A. brasilense SK248 слияние pJFF350 и р85, опосредованное ISAzbal (Katsy, Prilipov, 2009), приводит к утрате способности клеток двигаться при помощи жгутиков (Mot- Swa^-фенотип).

В секвенированном фрагменте ДНК р85 A. brasilense нами обнаружены гены, продукты экспрессии некоторых из которых, по-видимому, могут опосредовать поведенческие реакции бактерий. Так, продукт orf293 обладает значимым сходством с HdfR из M. magnetotacticum, Paracoccus denitrificans, Erwinia carotovora, E. coli, Shigella flexneri и других бактерий. HdfR известен как репрессор транскрипции мастер-оперона flhDC, продукты которого необходимы для экспрессии остальных флагеллярных генов у Е. coli и других бактерий (Ко, Park, 2000). Рядом с hdß. в р85 выявлен ccoN - ген каталитической субъединицы I цитохромоксидазы, являющейся интегральным белком цитоплазматической мембраны. Эта кодируемая р85 56-кДа субъединица цитохромоксидазы состоит из 502 аминокислот, содержит 12 трансмембранных спиральных участков и металлосодержащие каталитические центры, достаточные для работы фермента в качестве протонной помпы, сопрягающей восстановление молекулярного кислорода до воды с переносом протонов через мембрану. Трансмембранный протонный потенциал, в частности, используется как источник энергии для вращения бактериальных жгутиков.

Локализация охарактеризованного комплекса генов в р85 A. brasilense Sp245 недалеко от IS-элементов ISAzbal и ISAzba2 свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов, что может сказываться на поведении бактерий. Оказалось, что у двух спонтанных Зхуа^-производных (Sp245.Pl и Sp245.P5) ПЦР с парой праймеров, специфичных к З'-концу гена hdfR (у Sp245 продукт амплификации имеет длину 411 п.н.), давали негативные результаты. Таким образом, спонтанные перестройки, приводящие к появлению Swo44—вариантов, не обладают строгой сайт-специфичностью и в ряде случаев сопровождаются утратой гена hdfR, локализованного в р85. Стоит еще раз отметить, что рядом с hdfR в р85 локализован ccoN. Таким образом, выявленное нами спонтанное изменение первичной структуры исследуемого района 85-МДа плазмиды А. brasilense Sp245 может влиять на экспрессию генов hdfR и ccoN и, как следствие, на появление субпопуляций азоспирилл с ускоренным роением.

Результаты проделанной работы позволяют заключить, что на полужидких средах подвижные клетки бактерий рода Azospirillum способны переходить от плавания или роения к неподвижному состоянию, распространению с образованием микроколоний или ускоренному роению. Подобное многообразие способов коллективной подвижности бактерий описано только у P. aeruginosa (Kohler et al., 2000). Возникает вопрос, в каких условиях азоспириллы используют потенциал, предоставляемый тем или иным типом подвижности. Выявление факторов внешней среды, способствующих доминированию одного из способов распространения, интересно с точки зрения изучения механизмов адаптации азоспирилл к обитанию в разнообразных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.

Такие аминокислоты, как аспарагиновая кислота, серин или треонин, способствовали индукции вгГ-подвижности в случае штамма А. brasilense Sp245. Интересен тот факт, что аминокислоты, которые влияют на проявление Gri -фепотипа Sp245 - аспарагиновая кислота, серин и треонин - не стимулируют увеличение скорости движения мутантов, обладающих таким же фенотипом подвижности. Скорее всего, факторы, способствующие переходу азоспирилл к СгГ-подвижности, и факторы, активизирующие скорость распространяющихся подобным образом бактерий, различаются. В случае роения, Swa++- или вгГ-подвижности спектр аминокислот, влияющих на эффективность распространения бактерий, различен. Вероятно, это имеет определенное значение в процессе адаптации азоспирилл к существованию в симбиозе с растениями, поскольку состав корневых экссудатов (преимущественное содержание в составе той или иной аминокислоты) может определять преобладание того или иного фенотипа подвижности. По нашим наблюдениям, корневые экссудаты проростков пшеницы стимулируют роение клеток А. brasilense Sp245 по пока непонятному механизму и способствуют переходу неподвижных или Gri+-iüiOHOB к роению.

Известно, что взаимодействие компонентов поверхности азоспирилл, содержащих остатки А^-ацетил-р-О-глюкозамина, с агглютинином зародышей пшеницы может опосредовать ранние этапы формирования растительно-бактериальных ассоциаций и индуцировать соответствующие изменения в метаболизме бактерий (Skvortsov, Ignatov, 1998; Антонюк, 2005).

В настоящей работе нами впервые показано, что лектины со сродством к остаткам ТУ-ацетил-р-Б-глюкозамина (WGA или STA) наиболее заметно влияют и на коллективную подвижность Sp245, стимулируя переход части популяции к распространению в полужидких средах с образованием микроколоний. Мы предполагаем, что в присутствии лектинов со сродством к остаткам Ж-ацетил-р-О-глюкозамина переход азоспирилл от Swa+-подвижности к Сп+-распространению является следствием снижения подвижности бактерий при помощи жгутиков и возможных изменений межклеточных взаимодействий, необходимых для роения.

Интересными оказались результаты, свидетельствующие, что специфические взаимодействия лектинов различного происхождения с клетками A. brasilense влияют на скорость движения бактерий. В конечном итоге это сказывается на контакте бактерий с целостным организмом, продуцирующим лектин. В настоящей работе, с использованием мутантов Sp245 по образованию ЛПС, содержащих вставки искусственного транспозона в разных локусах р120, установлено, что лектин G. frondosa, как и фитолектины, оказывает тормозящее влияние на движение A. brasilense, но при условии сохранения на поверхности азоспирилл специфического гаптена - ОПС1. Так как ОПС1 (кислый) и ОПСИ (нейтральный), выделенные из ЛПС A. brasilense Sp245, состоят из идентичных субъединиц, очевидно, что даже незначительные изменения конформации углеводного рецептора, обусловленные следовым количеством негативно заряженных компонентов, могут стать решающим фактором в определении специфической активности лектина и, как следствие, реакций организмов на лектин. С другой стороны бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина G. frondosa (в природе A. brasilense и G. frondosa занимают разные экологические ниши), "распознаются" грибом с наименьшим проявлением антагонизма. Данная находка, на наш взгляд, позволяет использовать результаты влияния лектинов на скорость движения бактерий для прогнозирования развития взаимодействий между организмами.

Изучение такого проявления социального поведения микробов как формирование биопленок позволило нам впервые охарактеризовать некоторые структуры, участвующие в данном процессе у азоспирилл. Показано, что в структурной организации биопленок азоспирилл на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность" участвуют липополисахариды и полисахариды, связывающие калькофлуор. Как оказалось, спонтанные (как у мутанта Sp245.5) или индуцированные (как у штаммов КМ018, КМ127, КМ134, КМ139, КМ252,

КМ348, SK048, SK248 и SK051) изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок.

Организация биопленок на корнях пшеницы, как и в случае образования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная или гидрофобная поверхности", происходит при участии полисахаридных и белковых детерминант бактериальной поверхности. По-видимому, бактериальные гликополимеры и белки обеспечивают не только прикрепление бактериальной биопленки к поверхности корня (Croes et al., 1993; Аленькина с соавт., 1998; Федоненко с соавт., 2001; Yegorenkova et al., 2001; Rodríguez-Navarro et al., 2007), но и участвуют в организации ее строения, вовлекая в этот процесс факторы растительного происхождения, в том числе, и способствующие переходу азоспирилл к микроколониальному распространению (например, фитолектины). Одной из стадий формирования биопленки и на стекле или полистироле является образование клеточных агрегатов, но в дальнейшем микроколонии сливаются в единый слой клеток. Напротив, на поверхности корня после "заякоривания" бактерий их расположение в составе микроколоний преобладает. В настоящей работе нами впервые показано, что после "заякоривания" на корнях клетки штамма А. brasilense Sp245 дикого типа и его Fia" Swa~ Gri'-мутантов заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью. При этом образование микроколоний (клеточных агрегатов) на поверхности корней характерно как для штамма дикого типа, так и для его Fia" Swa~ СгГ-мутантов. Установлено, что в процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

Разработанные в рамках ^ настоящего исследования методические приемы позволили предложить тест, основанный на ингибировании подвижности азоспирилл антителами на поверхностные бактериальные структуры или лектинами различного происхождения. Тест может быть использован для определения серологического родства бактерий и исследования экспонированных углеводных и белковых детерминант в составе поверхности интактных клеток.

В ходе выполнения работы открылись новые перспективы для дальнейших исследований. Так, обнаружение таких фактов, как модулирующее действие корневых экссудатов и фитолектинов на социальную подвижность азоспирилл, активация синтеза белковых детерминант у бактерий, формирующих биопленку на корнях пшеницы, дает возможность для развития исследований, направленных на выяснение механизмов обмена сигналами между партнерами ассоциативного симбиоза.

Автор надеется, что выполненная работа послужит основой для продолжения изучения механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Данное исследование может найти дальнейшее практическое применение при конструировании бактерий, перспективных для использования в биотехнологии.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шелудько, Андрей Вячеславович, Саратов

1. Антонюк Л.П. Растительные лектины как факторы коммуникации в симбиозах // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Ред. Игнатов B.B. М.: Наука, 2005. - С. 118-159.

2. Басилашвили Л.А., Нуцубидзе H.H. Распространение азоспирилл в некоторых почвах Грузии // Сообщения АН Грузин. ССР. 1984. - Т. 114. -С. 617-620.

3. Бирюзова В.И., Поглазова М.И., Мишина Т.И., Поглазов Б.Ф. Структура и физико-химические свойства бактериальных жгутиков // Микробиология. — 1979.-Т. 48.-С. 868-871.

4. Бисько H.A., Билай В.Т. Влияние бактерий рода Bacillus на жизнедеятельность вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr) Kumm. в частично замкнутой искусственной экосистеме // Микология и фитопатология. 1995. - Т. 29. - С. 1-7.

5. Борисов И.В. Генетический анализ вариаций в подвижности и поверхностных структурах ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense: Дис. канд. биол. наук. Саратов, 2004. - 164 с.

6. Брезгунов В.Н., Завальский Л.Ю., Лазарев A.B., Попов В.Г. Хемотаксис бактерий // Успехи микробиологии. 1989. - Т. 23. - С. 3-28.

7. Будрене Е.О. Образование пространственно упорядоченных структур в колониях подвижных бактерий на агаре // Доклады АН СССР. 1985. - Т. 283.-С. 470-473.

8. Бурыгин Г.Л. Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенныхбактерий рода Azospirillum: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов, 2003. — 22 с.

9. Волошин С.А., Капрельянц A.C. Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях // Биохимия. 2004. - Т. 69. - С. 1555-1564.

10. Волошин С.А., Шлеева М.О., Сыроешкин A.B. Роль меклеточных контактов для инициации роста и образования временно некультивируемого состояния культурой Rhodococcus rhodochrous при развитии на бедных средах // Микробиология. 2005. - Т. 74. - С. 489-497.

11. Глаголев А.Н. Таксис у бактерий // Успехи микробиологии. 1983. — Т. 18. -С. 163-192.

12. Головачева P.C., Жилина Н.В. Жгутиковый аппарат археобактерий рода Sulfurococcus И Микробиология, 1988.—Т. 57.-С. 516-518.

13. Громов Б.В. Строение бактерий / Учебное пособие. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1985.- 192 с.

14. Дебабов В.Г. Жизнь бактерий за стенами лабораторий // Молекулярная биология. 1999. - Т. 33. - С. 1074-1084.

15. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Дыкман Л.А., Игнатов

16. B.В. Роль полисахаридсодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense Sp245 в адсорбции бактерий на корнях проростков пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70. - С. 45-50.

17. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом // Молекулярная биология. 2001. - Т. 35.1. C. 268-277.

18. Иваницкий Г.Р. Биофизика на рубеже столетия: автоволны // Биофизика. -1999.-Т. 44.-С. 773-775.

19. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. - Т. 40. - С. 1445-1456.

20. Итальянская Ю.В., Никитина В.Е., Пономарева Е.Г., Аленькина С.А. Лектины бактерий рода Azospirillum И Изучение и применение лектинов. Т.

21. Тарту: Изд-во Тартус. ун-та, 1989. - С. 179-184.

22. Карпунина Л.В. Роль агглютинирующих белков ризобий и азотфиксирующих бацилл при взаимодействии с растениями // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред. Игнатова B.B. М.: Наука, 2005. - С. 98-117.

23. Карпунина Л.В., Вишневецкая O.A., Богатырев В.А., Никитина В.Е., Итальянская Ю.В. Определение локализации лектинов, агглютининов почвенных азотфиксирующих бактерий // Микробиология. — 1995. Т. 64. -С.453-457.

24. Кацы Е.И. Плазмида р85 Azospirillum brasilense Sp245: изучение круга возможных хозяев и несовместимости с плазмидами Azospirillum brasilense Sp7 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1992. - № 910. - С 8-11.

25. Кацы Е.И. Генетико-биохимические и экологические аспекты подвижности и хемотаксиса у фитопатогенных, симбиотических и ассоциированных с растениями бактерий // Успехи современной биологии. 1996. - Т. 116. - С. 579-593.

26. Кацы Е.И. Характеристика генов, выявленных в ДНК 120-МД плазмиды у мутанта бактерий Azospirillum brasilense Sp245, дефектного по продукции полярного жгутика и роению // Генетика. 2002а. - Т. 38. - С. 22-32.

27. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями / Под ред. Игнатова В.В. -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. 169 с.

28. Кацы Е.И. Молекулярно-генетический анализ ассоциативного взаимодействия бактерий и растений // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред.

29. Игнатова B.B. -М.: Наука, 2005. С. 17-45.

30. Кацы Е.И. Молекулярная генетика ассоциативного взаимодействия бактерий1

31. Р и растений / Под ред. Игнатова B.B. М.: Наука, 2007. - 86 с.1.\

32. Кацы Е.И., Шелудько A.B. Картирование локуса fla в плазмиде сIмолекулярной массой 120 МДа у бактерий Azospirillum brasilense Sp245 // Генетика. 1999. - Т. 35. - С. 1367-1372.

33. Кацы Е.И., Шелудько A.B. Использование транспозонового TriphoA мутагенеза для получения мутантов Azospirillum brasilense по подвижности и жгутикованию // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2000.-№4.-С. 17-20.

34. Кацы Е.И., Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Транспозоновый мутагенез, элиминация и мобилизация плазмид азотофиксирующей бактерии Azospirillum brasilense Sp245 II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1990. - № 2. - С. 29-32.

35. Кацы Е.И., Борисов И.В., Машкина А.Б., Панасенко В.И. Влияние плазмидного состава на реакции хемотаксиса у ассоциированных со злаками бактерий Azospirillum brasilense Sp245 II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 1994. № 2. - С. 29-32.

36. Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько A.B. Влияние интеграции вектора pJFF350 в 85-МДа плазмиду Azospirillum brasilense Sp245 на жгутикование и подвижность бактерий // Генетика. 2001. - Т. 37. - С. 183-189.

37. Кацы Е.И., Камнева А.Б., Борисов И.В. Одиночные инсерции омегона в ДНК Azospirillum brasilense могут приводить к дефектам в нескольких видах бактериальной подвижности // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2004. - № 3. с. 40-41.

38. Кацы Е.И., Петрова Л.П., Кулибякина О.В., Прилипов А.Г. Анализ плазмидных локусов Azospirillum brasilense, кодирующих ферменты синтеза (липо)полисахаридов// Микробиология. 2010. - Т. 79. - С. 239-245.

39. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. // Биохимия. 1993. - Т. 58. № 2. - С. 166-81.

40. Коннова С.А. Экзополисахариды бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Spl07: Дис. д-ра биол. наук. М.: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 2002. - 367 с.

41. Коннова С.А., Макаров O.E., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Полисахаридсодержащие биополимеры бактерий рода Azospirillum: разнообразие химического строения и функций // Микробиол. журн. 1992. -Т. 54.-С. 31-42.

42. Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Игнатов В.В. Структура и функции гликополимеров поверхности азоспирилл // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред. Игнатова В.В. М.: Наука, 2005. - С. 46-69.

43. Лившиц М.А., Балабеков Б.Ч., Волькенштейн М.В. Диссипативные структуры в растущей колонии подвижных бактерий // Биофизика. 1988. -Т. 33.-С. 647-652.

44. Матвеев В.Ю., Петрова Л.П., Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Образование коинтегратов pAS8-1213 и плазмиды Azospirillum brasilense Sp245 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1989. - № 7. - С.8.10.

45. Матора Л.Ю. Углеводные антигены и их вклад в строение клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum: Автореф. дис. д-ра биол. наук. Саратов, 2004. 23 с.

46. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 1998. - Т. 67. - С. 815-820.

47. Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Антигенная идентичность липополисахаридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense И Микробиология. -2002.-Т. 71. -С. 211-214.

48. Метлина А.Л., Поглазов Б.Ф. Конформационные изменения флагеллина при самосборке // Доклады АН СССР. 1969. - Т. 187. - С. 459-461.

49. Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев: Наукова думка, 1982.-551 с.

50. Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями // Под ред. Игнатова B.B. М.: Наука, 2005. - 135с.

51. Нго Т., Ленхофф Г. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ. / Под ред. Нго Т., ЛенхоффаГ. -М.: Мир, 1988. С. 172-192.

52. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Итальянская Ю.В., Пономарева Е.Г. Очистка и сравнение лектинов с клеточной поверхности активных и неактивных по гемагглютинации клеток азоспирилл // Биохимия. 1994. -Т. 59. - С. 656-662.

53. Никитина В.Е., Аленышна С.А., Пономарева Е.Г., Савенкова H.H. Изучение роли лектинов клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы // Микробиология. 1996. - Т.65. - С. 165-170.

54. Никитина В.Е., Пономарева Е.Г., Аленькина С.А., Коннова С.А. Участиебактериальных лектинов клеточной поверхности в агрегации азоспирилл // Микробиология. 2001. - Т. 70. - С. 471-476.

55. Николаев Ю.А. Дистантные взаимодействия между клетками бактерий // Микробиология. 1992.-Т. 61.-С. 1066-1071.

56. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка "город микробов" или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. - 2007. — Т. 76. — С. 149-163.

57. Олескин А.В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях // Микробиология. 1993. - Т. 62. - С. 389-403.

58. Олескин А.В. Биосоциальность одноклеточных (на материале исследованией прокариот) // Журнал общей биологии. — 2009. Т. 70. - С. 225-238.

59. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. - Т. 69. - С. 309-327.

60. Петрова Л.П., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Борисов И.В., Кацы Е.И. Анализ ДНК, ряда культурально-морфологических свойств и структуры липополисахаридов у близкородственных штаммов Azospirillum brasilense II Микробиология. 2005. - Т. 74. - С. 224-230.

61. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология. Новосибирск: Наука, 1978. -287 с.

62. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.Ф., Барышева Н.Н., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое изучениеазоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология.- 1988. Т. 57. - С. 275-278.

63. Проворов H.A., Воробьев Н.И. Эволюционная генетика клубеньковых бактерий: молекулярные и популяционные аспекты // Генетика. 2000. - Т. 36.-С. 1573-1587.

64. Сафронова И.Ю., Ботвиненко И.В. Межклеточный матрикс Bacillus subtilis 271: полимерный состав и функции // Микробиология. 1998. - Т. 67. - С. 55-60.

65. Скворцов И.М. Муцигель и слизь поверхности корней растений // Успехи современной биологии. 1994. - Т. 114. - С. 372-384.

66. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989. - 564 с.

67. Степанова JI.B., Никитина В.Е., Бойко A.C. Выделение и характеристика лектина с поверхности мицелия Grifóla frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917 II Микробиология. 2007. - T 76. - С. 488-493.

68. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986.- 136 с.

69. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70. - С. 384-390.

70. Федорова Л.С., Позднякова Л.И., Каневская C.B. Выделение азоспирилл из культурных и дикорастущих злаков Саратовской области // Микробиология.- 1985. Т. 54. № 4. - С. 684-685.

71. Шелудько А.В. Получение и характеристика мутантов модельного штамма ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 по продукции и функционированию полярного и латеральных жгутиков: Дис. канд. биол. наук. Саратов: РосНИПЧИ "Микроб", 2000. - 115 с.

72. Шнырева А.В., Дружинина И.С., Дьяков Ю.Т. Генетическая структура комплекса Pleurotus ostreatus sensu lato на территории Московской области // Генетика. 1998. - Т. 34. - С. 1610-1618.

73. Цыганов М.А., Крестьева И.Б., Лысоченко И.В., Медвединский А.Б., Иваницкий Г.Р. Фрактальная самоорганизация в популяциях бактерий Escherichia coir, компьютерное моделирование // Доклады академии наук. -1996.-Т. 351.-С. 561-564.

74. Adler J. Chemotaxis in bacteria // Science. 1966. - V: 153. - P. 708-716.

75. Adler J. Effect of amino acids and oxygen on chemotaxis in Escherichia coli И J. Bacteriol. 1966a. -V. 92. - P. 121-129.

76. Adler J. Chemotaxis in bacteria // Annu. Rev. Biochem. 1975. - V. 44. - P. 341356.

77. Adler J. How motile bacteria are attracted and repelled by chemicals: an approach to neurology // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1987. - V. 368. - P. 163-173.

78. Aizawa S.-I. Bacterial flagella and type III secretion systems // FEMS Microbiol. Lett.-2001.-V. 202.-P. 157-164.

79. Aizawa S.-I., Dean C.E., Jones C.J., Macnab R.M., Yamaguchi S. Purification and characterization of the flagellar hook-basal body complex of Salmonella typhimurium li J. Bacteriol. 1985. - V. 161. - P. 836-849.

80. Alam M., Oesterhelt D. Purification, reconstruction and polymorphic transition of halobacterial flagella // J. Mol. Biol. 1987. - V. 176. - P. 495-499.

81. Albareda M., Dardanelli M., Sousa C., Megías M., Temprano F., Rodríguez-Navarro D. Factors affecting the attachment of rhizospheric bacteria to bean and soybean roots // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 259. - P. 67-73.

82. Alberti L., Harshey R.M. Differentiation of Serrada marcescens 274 into swimmer and swarmer cells // J Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 4322-4328.

83. Alexandre G., Greer S.E., Zhulin I.B. Energy taxis is the dominant behavior in Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 6042-6048.

84. Allison C., Hughes C. Bacterial swarming: an example of prokariotic differentiation and multicellular behaviour // Sci. Prog. Edinburgh. 1991. - V. 75.-P. 403-422.

85. Allison C., Lai H-C., Hugles C. Co-ordinate expression of virulence genes during swarm-cell differentiation and population migration of Proteus mirabilis II Mol. Microbiol. 1992. - V. 6. - P. 1583-1591.

86. Allison C., Lai H-C., Gygi D., Hughes C. Cell differentiation of Proteus mirabilis is initiated by glutamine, a specific chemoattractant for swarming cells // Mol. Microbiol. 1993. - V. 8. - P. 53-60.

87. Aim R.A., Mattick J.S. Identification of a gene, pilV, required for type 4 fimbrial biogenesis in Pseudomonas aeruginosa whose product possesses a prepilin-like leader sequence I I Mol. Microbiol. 1995. - V. 16. - P. 485-496.

88. Aim R.A., Mattick J.S. Genes involved in the biogenesis and function of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa II Gene. 1997. - V. 192. - P. 89-98.

89. Ames P., Bergman K. Competitive advantage provided by bacterial motility in the formation of nodules by Rhizobium meliloti H J. Bacteriol. 1981. - V. 148. - P. 728-908.

90. Ames P., Parkinson J.S. Transmembrane signalling by bacterial chemoreceptors: E. coli transducers with locked signal autput // Cell. 1988. - V. 55. - P. 817826.

91. Anderson J., Smith T., Hoover T. Sense and sensibility: flagellum-mediated gene regulation // Trends Microbiol. 2010. - V. 18. - P. 30-37.

92. Armitage J.P. Behavioral responses in bacteria // Annu. Rev. Physiol. 1992. - V. 54.-P. 683-714.

93. Armitage J.P., Macnab R.M. Unidirectional, intermittent rotation of the flagellum of Rhodobacter sphaeroides // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 5765-5770.

94. Armitage J.P, Gallagher A., Johnston A.W.B. Comparison of the chemotactic behaviour of Rhizobium leguminosarum with and without the nodulation plasmid // Mol. Microbiol. 1988. - V. 2. - P. 743-748.

95. Armitage J.P., Schmitt R. Bacterial chemotaxis: Rhodobacter sphaeroides and Sinorhizobium meliloti variations on a theme? I I Microbiology. - 1997. - V. 143.-P. 3671-3682.

96. Arnold J.W., Shimkets L.J. Inhibition of cell-cell interactions in Myxococcus xanthus by congo red I I J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 5765-5770.

97. Arnosti D.N., Chamberlin MJ. Secondary a factor controls transcription of flagellar and chemotaxis genes in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86.-P. 830-834.

98. Atsumi T., McCarter L., Imae Y. Polar and lateral flagellar motors of marine Vibrio are driven by different ion-motive forces // Nature. 1992. - V. 355. -P. 182-184.

99. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. -1983.-V. 29.-P. 924-929.

100. Baldani J., Caruso L., Baldani V.L.D., Goi S.R., Dobereiner J. Recent advances in BNF with non-legume plants // Soil Biol. Biochem. 1997. - V. 29. - P. 911922.

101. Barak R., Nur I., Okon Y. Detection of chemotaxis in Azospirillum brasilense II J. Appl. Bacteriol. 1983. - V. 54. - P. 399-403.

102. Barbieri P., Galli E. Effect on wheat root development of inoculation with an Azospirillum brasilense mutant with altered indole-3-acetic acid production // Res. Microbiol. 1993. - V. 144. - P. 69-75.

103. Barbieri P., Zanelli T., Galli E., Zanetti G. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production// FEMS Microbiol. Lett. 1986. - V. 36. - P. 87-90.

104. Bardy S.L., Ng S.Y.M., Jarrell K.F. Procaryotic motility structures // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 295-304.

105. Barton L.L., Johnstone G.V., Miller S.O. The effect of Azospirillum brasilense on iron adsorption and translocation by sorghum // J. Plant Nutr. — 1986. — V. 9. — P. 557-565.

106. Bashan Y. Migration of the rhizosphere bacteria Azospirillum brasilense and Pseudomonas fluorescens towards wheat roots in the soil // J. Gen. Microbiol. -1986.-V. 132.-P. 3407-3414.

107. Bashan Y. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture // Biotech. Adv. 1998. - V. 16. - P. 729-770.

108. Bashan Y. Interactions of Azospirillum spp. in soils: a review// Biol. Fertil. Soil. 1999. -V. 29.-P. 246-256.

109. Bashan Y., Levanony H. Horizontal and vertical movement of Azospirillum brasilense Cd in the soil and along the rhizosphere of wheat and weeds in controlled and field environments // J. Gen. Microbiol. 1987. - V. 133. - P. 3473-3480.

110. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. - P. 103-121.

111. Bashan Y., Levanovy H., Girma M. Changes in proton efflux of intact wheat roots induced by Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Microbiol. 1989. - V. 39.-P. 691-697.

112. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. Azospirillum-plmt relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003) // Can. J. Microbiol. -2004. P. 50. - P. 521-577.

113. Bastarrachea F., Zamudio M., Rivas R. Non-encapsulated mutants of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum H Can. J. Microbiol. 1988. - V. 34. - P. 24-29.

114. Belas M.R., Colwell R.R. Adsoiption kinetics of laterally and polarly flagellated Vibrio H J. Bacteriol. 1982. - V. 156. - P. 1568-1580.

115. Belas R., Scheider R., Melch M. Characterization of Proteus mirabilis precocious swarming mutants: identification of rsbA, encoding a regulator of swarming behavior.//J. Bacteriol. 1998. -V. 180. - P. 6126-6139.

116. Berg G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture // Appl. . Microbiol. Biotechnol. 2009. - V. 84. - P. 11 -18.

117. Berg H.C. Bacterial behaviour //Nature. 1975. -V. 254. - P. 389-392.

118. Berg H.C., Brown D.A. Chemotaxis in Escherichia coli analyzed by three-dimensional tracking // Nature. 1972. - V. 239. - P. 500-504.

119. Bergman K., Gulash-Hoffee M., Hovestadt R.E., LaRosiliere R.C, Ronco P.G., Sul L. Physiology of behavioral mutants of Rhizobium meliloti: evidence for a dual chemotaxis pathway // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 3249-325.

120. Bergman K., Nalty E., Su L. Mutations in the two flagellin genes of Rhizobium meliloti //J. Bacteriol. 1991.-V. 173.-P. 3716-3723.

121. Bibikov S., Biran R., Rudd K., Parkinson J. A signal transducer for aerotaxis in Escherichia coli IIJ Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 4075-4079.

122. Bis'ko N.A., Bilay V.T. Effects of Bacillus macerans Fr. on growth of Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr) Kumm. I I In: Science and cultivation of edible fungi / Ed. Elliott T.J., Balkema A.A. Rotterdam: Brookfield. - 1995. - V. 2. - P. 843-846.

123. Bleakley B., Gaskins M., Hubbell D., Zam S. Floe formation by Azospirillum lipoferum grown on poly-beta-hydroxybutyrate // Appl. Environ. Microbiol. -1988. V. 54. - P. 2986-2995.

124. Bowden M.G., Kaplan H.B. The Myxococcus xanthus lipopolysaccharide O-antigen is required for social motility and multicellular development // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 275-284.

125. Boyer M., Bally R., Perrotto S., Chaintreuil C., Wisniewski-Dye F. A quorum-quenching approach to identify quorum-sensing-regulated functions in Azospirillum lipoferum II Res. Microbiol. 2008. - V. 159. - P. 699-708.

126. Brandner J.P., Kroos L. Identification of the W4400 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus // J. Bacterid. — 1998. V. 180. -P. 1995-2002.

127. Brentjens R.J., Ketterer M., Apicella M.A., Spinola S.M. Fine tangled pili expressed by Haemophilus ducreyi are a novel class of pili // J. Bacteriol. 1996. -V. 178.-P. 808-816.

128. Brown D.A., Berg H.C. Temporal stimulation of Chemotaxis in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1974. - V. 71. - P. 1388-1392.

129. Brumbley S.M., Denny T.P. Cloning of wild-type Pseudomonas solanacearum phcA, a gene that when mutated alters expression of multiple traits that contribute to virulence // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 5677-5685.

130. Budrene E.O., Berg H. Dynamics of formation of symmetrical patterns by chemotactic bacteria //Nature. 1995. - V. 376. - P. 49-53.

131. Burdman S., Yurkevitch E., Schwartsburd B., Hampel M., Okon Y. Aggregation in Azospirillum brasilense: effects of chemical and physical factors and involvement of extracellular components // Microbiology. 1998. - V. 144. - P. 1989-1999.

132. Burdman S., Yurkevitch E., Schwartsburd B., Okon Y. Involvement of outer membrane proteins in the aggregation of Azospirillum brasilense H Microbiology. 1999,-V. 145.-P. 1145-1152.

133. Burdman S., Okon Y., Jurkevitch E. Surface characteristics of Azospirillum brasilense in relation to cell aggregation and attachment to plant roots // Crit. Rev. Microbiol. 2000. - V. 26. - P. 91-110.

134. Chang Y., Tang T., Li J. Isolation of a flagellar operon in Azospirillum brasilense and functional analysis of FlbD // Res Microbiol. 2007. - V. 158. -P. 521-528.

135. Chet I., Mitchell R. Ecological aspects of microbial chemotactic behavior // Ann. Rev. Microbiol. 1976. -V. 30. -P. 221-239.

136. Choma A., Russa R. Chemical analysis of Azospirillum- lipopolysaccharides // Arch. Microbiol. 1987. -V. 146. - P. 341-345.

137. Costerton J., Greessy G.G., Cheng K. How bacteria stick // Sei. Amer. 1978. -V. 238.-P. 86-95.

138. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E. Microbial biofilms // Annu. Rev. Microbiol. 1995.-V. 49. - P. 711-745.

139. Croes C.L., Moens S., van Bastelaere E., Vanderleyden J., Michiels K. The polar flagellum mediated Azospirillum brasilense adsorption to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1993.-V. 139.-P. 960-967.

140. Currier W.W., Strobel G.A. Characterization and biological activity of trefoil chemotactin//Plant Sei. Lett. 1981. -V. 21. -P. 159-165.

141. Dahm H., Rozycki H., Strzelczyk E., Li C.Y. Production of B-group vitamins by Azospirillum spp. grown in media of different pH at different temperatures // Zentralbl. Microbiol. 1993. -V. 148. - P. 195-203.

142. Daniels R., Vanderleyden J., Michiels J. Quorum sensing and swarming migration in bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 2004. - V. 28. - P. 274-288.

143. Darzin A. The pilG gene product, required for Pseudomonas aeruginosa pilus production and twitching motility, is homologous to the enteric, single-domain response regulator CheY // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 5934-5944.

144. Darzin A. Characterization of a Pseudomonas aeruginosa gene cluster involved in pilus biosynthesis and twitching motility: sequence similarity to the Chemotaxis proteins of the gliding bacterium Myxococcus xanthus II Mol.

145. Microbiol.- 1994.-V. 11.-P. 137-153.

146. Darzin A. The Pseudomonas aeruginosa pilK gene encodes a chemotactic methyltransferase (CheR) homologue that is translationally regulated // Mol. Microbiol. 1995.-V. 15.-P. 703-717.

147. Darzins A., Russell M.A. Molecular genetic analysis of type-4 pilus biogenesis and twitching motility using Pseudomonas aeruginosa as a model system a review//Gene.-1997.-V. 192.-P. 109-115.

148. Dazzo F. B., Truchet G. L. Interactions of lectins and their saccharide receptors in the Rhizobium-legume symbiosis // J. Membr. Biol. 1983. - V. 73. - P. 1-16.

149. Del Gallo M., Haegi A. Characterization and quantification of exocellular polysaccharides in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum // Symbiosis. 1990. -V. 9. - P. 155-161.

150. Del Gallo M., Negi M., Neyra C.A. Calcofluor- and lectin- binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II J. Bacteriol. 1989. -V. 171. - P. 3504-3510.

151. DeLange R.F., Chang J.Y., Shaper J.H., Glazer A.N. Amino acid sequence of flagellin of Bacillus subtilis 168. III. Tryptic peptides, N-bromosuccinimide peptides, and the complete amino acid sequence // J. Biol. Chem. 1976. - V. 251.-P. 705-711.

152. DePamphilis M.L., Adler J. F. Fine structure and isolation of the hook-basal body complex of flagella Escherichia coli and Bacillus subtilis 11 J. Bacteriol. -1971.-V. 105.-P. 384-395.

153. De-Polli H., Bohlool B.B., Dobereiner J. Serological differentiation of Azospirillum species belonging to different host-plant specificity groups // Arch. Microbiol. 1980. - V. 126. - P. 217-222.

154. De Maagd R.A., Rao A.S., Mulders I.H., Goosen-de Roo L., van Loosdrecht

155. Vfl67. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm // Science. 1998. - V. 280. - P. 295298.

156. Dimmitt K., Simon M. Purification and thermal stability of intact Bacillus subtilis fiagella// J. Bacteriol. 1971. - V. 105. - P. 369-375.

157. Dobereiner J. Ten years Azospirillum 11 Azospirillum III: Genetics, Physiology, Ecology / Ed. Klingmuller W. Berlin: Springer, 1983. - EXS48. - P.9-23.

158. Dobereiner J., De-Polli H. Nitrogen-fixing rhizocoenosis // In: The Soil-Root System in Relation to Brazilian Agriculture. Parana, 1981. - P. 175-198.

159. Dobretsov S., Teplitski M., Paul V. Mini-review: quorum sensing in the marine environment and its relationship to biofouling // Biofouling. 2009. - V. 25. - P. 413-427.

160. Doerr J., Hurek T., Reinhold-Hurek B. Type IV pili are involved in plant-microbe and fungus-microbe interactions // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 7-17.

161. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - V. 15. - P. 167-193.

162. Driks A., Bryan R., Shapiro 1., DeRosier D.J. The organization of the Caulobacter crescentus flagellar filament // J. Mol. Biol. 1989. - V. 206. - P. 627-636.

163. Dubreuil J.D., Fairbrother J.M. Biochemical and serological characterization of E. coli fimbrial antigen N 165 // Microbiol. Lett. 1992. - V. 95. - P. 219-224.

164. Eberl L., Christiansen G., Molin S., Givskov M. Differentiation of Serratia liquefaciens into swarm cells is controlled by the expression of the flhDC master operon // J. Bacteriol. 1996a. - V. 178. - P. 554-559.

165. Eberl L., Molin S., Givskov M. Surface motility of Serratia liquefaciens MG1 // J. Bacteriol.-1999.-V. 181.-P. 1703-1712.

166. Eckert B., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffes M., Hartmann A. Azospirillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 1726.

167. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria // Plasmid. 1978. - V. 1. - P. 584-588.

168. Eshdat Y., Ofek I., Yachow-Yah Y., Sharon N., Mirelman D. Isolation of mannose-specific lectin from E. coli and its role in the adherence of the bacteria to epitelial cells II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. - V. 85. - P. 15511559.

169. Eskew D.L., Focht D.D., Ting LP. Nitrogen fixation, denitrification, and pleomorphic growth in a highly pigmented Spirillum lipoferum II Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V. 34. - P. 582-585.

170. Falk E.C., Döbereiner J., Johnson J.L., Krieg N.R. Deoxyribonucleic acid homology of Azospirillum amazonense Magalhäes et al. 1984 and emendation ofthe description of the genus Azospirillum II Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. - V. 35. — P.117-118.

171. Fallik E., Okon Y., Fischer M. The effect of Azospirillum brasilense inoculation on metabolic enzyme activity in maize root seedlings // Symbiosis. 1988. - V. 6.-P. 17-28.

172. Faure D., Desair J., Keijers V., Bekri M.A., Proost P., Henrissat B., Vanderleyden J. Growth of Azospirillum irakense KBC1 on the aryl (3-glucoside salicin requires either salA or salB II J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 30033009.

173. Fedonenko Yu.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - V. 337. - P. 869-872.

174. Fellay R., Krisch H.M., Prentki P., Frey J. Omegon-Km: a transposable element designed for in vivo insertional mutagenesis and cloning of genes in Gramnegative bacteria // Gene. 1989. - V. 76. - P.215-226.

175. Fend P., Sugasawar, R.Schantz A. Identification of a common enterobacterial flagellin epitope with a monoclonal antibody // J. Gen. Microbiol. 1990. - V. 136.-P. 337-342.

176. Fernandez L.A., Berenguer J. Secretion and assembly of regular surface structures in Gram-negative bacteria IIFEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24. -P. 21-44.

177. Ferriere L., Clarke D.J. The RcsC sensor kinase is required for normal biofilm formation in Escherichia coli K-12 and controls the expression of a regulon in response to growth on a solid surface // Mol. Microbiol. 2003. - V. 50. - P. 1665-1682.

178. Figurski D.H., Helinski D.R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans // Proc. Natl. Acad. Sci.US A. 1979.-V. 76.-P. 1648-1652.

179. Fischer S.E., Miguel M.J., Mori G.B. Effect of root exudates on the exopolysaccharide composition and the lipopolysaccharide profile of Azospirillum brasilense Cd under saline stress // FEMS Microbiol. Lett. 2003.1. V.219.-P. 53-62.

180. Forest K.T., Tainer J.A. Type-4 pilus-structure: outside to inside and top to bottom a minireview // Gene. - 1997. - V. 192. - P. 165-169.

181. Franche C., Elmerich C. Physiological properties and plasmid content of several strains of Azospirillum brasilense and A. lipoferum 11 Ann. Microbiol. Inst. Pasteur. 1981. -V. A132. -P. 3-18.

182. Fräser G.M., Hughes C. Swarming motility // Curr. Opin. Microbiol. 1999. -V. 2.-P. 630-635.

183. Fsihi H., Cole S.T. The Mycobacterium leprae genome: systematic sequence analysis identifies key catabolic enzymes, ATP-dependent transport systems and a novel polA locus associated with genomic variability // Mol. Microbiol. 1995. -V. 16.-P. 909-919.

184. Fuerst J.A., Perry J.W. Demonstration of lipopolysaccharide on sheathed flagella Vibrio cholerae 0:1 by protein A-gold immunoelectron microscopy // J. Bacteriol. — 1988. V. 170.-P. 1488-1494.

185. Fujinami S., Terahara N., Krulwich T., Ito M. Motility and Chemotaxis in alkaliphilic Bacillus species II Future Microbiol. 2009. - V. 4. - P. 1137-1149.

186. Fujita Y., Oiahi K., Aida K. Sugar specificity of antihemagglutinin produced by Streptomyces sp. I I Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. - Vol. 53. - P. 485-501.

187. Furness R.B., Fräser G.M., Hay N.A., Hughes C. Negative feedback from a Proteus class II flagellum export defect to the flhDC master operon controlling cell division and flagellum assembly // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 55855588.

188. Galloway R.J., Taylor B.L. Histidine starvation and adenosine 5-triphosphate depletion in Chemotaxis of Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1989. - V. 144.-P. 1068-1075.

189. Garcia-Horsman J.A., Barquera B., Rumbley J., Ma J., Gennis R.B. The superfamily of heme-copper respiratory oxidases // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. -P. 5587-5600.

190. Gaworzewska E.T., Carlile M.J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminozarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants // J. Gen. Microbiol. 1983. - V. 128. - P. 1179-1188.

191. Geis G., Suerbaum S., Forsthoff B., Leying H., Opferkuch W. Ultrastructure and biochemical studies of the flagellar sheath of Helicobacter pylori II J. Med. Microbiol. 1993. -V. 38. - P. 371-377.

192. Gerl L., Sumper M. Halobacterial flagellins are encoded by a multigene family // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 13246-13251.

193. Gilboa-Garber N. Purification and properties of hemagglutinin from Pseudomonas aeruginosa and its reaction with human blood cells // Biochim. Biophys. Acta. 1972. - Vol. 273. - P. 165-173.

194. Givaudan A., Baghdiguian S., Lanois A., Boemare N. Swarming and swimming changes with concomitant phase variation in Xenorhabdus nematophilus II Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 1408-1413.

195. Givskov M., Eberl L., Christiansen G., Benedik M.J., Molin S. Induction of phospholipase- and flagellar synthesis in Serratia liquefaciens is controlled by expression of the flagellar master operon flhDC I I Mol. Microbiol. 1995. - V. 15.-P. 445-454.

196. Gotz R., Schmitt R. Rhizobium meliloti swims by unidirectional intermittent rotation of right-handed flagellar helices I I J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 3146-3150.

197. Gotz R., Limmer N., Ober R., Schmitt R. Motility and chemotaxis in two strains of Rhizobium with complex flagella I I J. Gen. Microbiol. 1982. - V. 128. - P. 789-798.

198. Goy M.F., Springer M.S., Adler J. Sensory transduction in Escherichia colt role of a protein methylation reaction in sensory adaptation I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74. - P. 4954-4968.

199. Gould J., Northcote D.H. Cell-cell recognition of host surfaces by pathogens. The adsorption of maize (Zea mays) root mucilage by surfaces of pathogenic fungi // Biochem. J. 1986. - V. 233. - P. 395-405.

200. Greer-Phillips S.E., Stephens B.B., Alexandre G. An energy taxis transducerpromotes root colonization by Azospirillum brasilense // J. Bacteriol. — 2004. -V. 186.-P. 6595-6604.

201. Guerry P., Aim R.A., Power M.E., Logan S.M., Trust T.J. Role of two flagellin genes in Campylobacter motility // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 47574764.

202. Gulash M., Ames P., La Rosiliere R.C., Bergman K. Rhizobia are attracted to localized sites on legume roots. // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 48. - P. 149-152.

203. Gygi D., Hughes C. A cell-surface polysaccharide that faciltates rapid population migration by differentiated swarm cells of Proteus mirabilis II Mol. Microbiol. -1995.-V. 17.-P. 1167-1175.

204. Haathela K., Korhonen T.K. In vitro adhesion of N2-fixing enteric bacteria to roots of grasses and cereals // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49. - P. 1186-1190.

205. Hall P.G., Krieg N.R. Swarming of Azospirillum brasilense on solid media // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - P. 1592-1594.

206. Hall P.G., Krieg N.R. Application of the indirect immunoperoxidase stain technique to the flagella of Azospirillum brasilense II Appl. Eniron. Microbiol. -1984.-V. 47.-P. 433-435.

207. Hall-Stoodley L., Costerton J., Stoodley P. Bacterial biofilm: from the natural environment to infection diseases // Microbiology. 2004. - V. 2. - P. 95-108.

208. Hammar M., Arnqvist A., Bian Z., Olsen A., Normark S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12 // Mol. Microbiol. 1995. - V. 18. - P. 661670.

209. Harshey R.M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal // Annu. Rev. Microbiol. 2003. - V. 57. - P. 249-273.

210. Harshey R.M., Toguchi A. Spinning tails: homologies among bacterial flagellar systems // Trends Microbiol. 1996. - V. 4. - P. 226-231.

211. Harwood C.S. A methyl-accepting protein is involved in benzoate taxis in Pseudomonasputida II J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P.4603-4608.

212. Hauwaerts D., Alexandre G., Das S.B., Vanderleyden J., Zhulin I.B. A major chemotaxis gene cluster in Azospirillum brasilense and relationships between chemotaxis opérons in alpha-proteobacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2002. -V. 208.-P. 61-67.

213. Hazelbauer G.L. Bacterial chemoreceptors // Curr. Opin. Struct. Biol. 1992. -V. 2.-P. 505-510.

214. Heinrich D., Hess D. Chemotactic attraction of Azospirillum lipoferum by wheat roots and characterization of some attractants // Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31.-P. 26-31.

215. Henrichsen J. Bacterial surface translocation: a survey and a classification // Bacteriol. Rev. 1972. - V. 36. - P. 478-503.

216. Henrichsen J. The occurrence of twitching motility among gram-negative bacteria // Acta Pathol. Microbiol. Scand. B. 1975. - V. 83. - P. 171-178.

217. Hess J.F., Oosawa K., Kaplan N., Simon M.I. Phosphorylation of three proteins in the signaling pathway of bacterial chemotaxis // Cell. 1988. - V. 53. - P. 7987.

218. Heumann W. Conjugation in star-forming Rhizobium lupini // Mol. Gen. Genet. 1968.-V. 102.-P. 132-144.

219. Homma M., Kutsukake K., lino T., Yamaguchi S. Hook-associated proteins essential for flagellar filament formation in Salmonella typhimurium // J. Bacteriol.- 1984.-V. 157.-P. 100-108.

220. Homma M., lino T., Kutsukake K., Yamaguchi S. In vitro reconstitution offlagellar filaments onto hooks of filamentless mutants of Salmonella typhimurium by addition of hook-associated proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. -V. 83.-P. 6169-6173.

221. Homma M., Aizawa S.-I., Dean C.E., Macnab R.M. Identification of the M-ring protein of the flagellar motor of Salmonella typhimurium H Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. -V. 84.-P. 7483-7487.

222. Homma M., DeRosier D.J., Macnab R.M. Flagellar hook and hook-associated proteins of Salmonella typhimurium and their relationship to other axial components of the flagellum // J. Mol. Biol. 1990. - V. 213. - P. 819-832.

223. Homma M., Kutsukake K., Hasebe M., lino T., Macnab R.M. FlgB, FlgC, FlgF and FlgG. A family of structurally related proteins in the flagellar basal body of Salmonella typhimurium II J. Mol. Biol. 1990a. - V. 211. - P. 465-477.

224. Ikeda T., Homma M., lino T., Asakura S., Kamiya R. Localization and stoichiometry of hook-associated proteins within Salmonella typhimurium flagellaII J. Bacteriol. 1987. - V. 169.-P. 1168-1173.

225. Jain D.K., Patriquin D.G. Root hair deformation, bacterial attachment and plant growth in wheat- Azospirillum association // Appl. Environ. Microbiol. 1984. -V. 48.-P. 1208-1213.

226. Jain D.K., Patriquin D.G. Characterization of a substance produced by Azospirillum which causes branching of wheat root hairs I I Can. J. Microbiol.1985.-V. 31.-P. 206-210.

227. Jiang Z.-Y., Gest H., Bauer C.E. Chemosensoiy and photosensory perception in purple photosynthetic bacteria utilize common signal transduction components // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 5720-5727.

228. Jiang Z.-Y., Rushing B.G., Bai Y., Gest H., Bauer C.E. Isolation of Rhodospirillum centenum mutants defective in phototactic colony motility by transposon mutagenesis II J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 1248-1255.

229. Jonatan R.K. Bacterial inhibition of fungal growth and pathogenicity // Microbial Ecology in Health and Disease. 1999. - V. 11. - P. 129-142.

230. Jones C.J., Homma M., Macnab R.M. L-, P-, and M-ring proteins of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium\ gene sequences and deduced protein sequences // J. Bacteriol. 1989. -V. 171. - P. 3890-3900.

231. Joys T.M., Martin J.F. Identification of amino acid changes in serological mutants of the i-flagellar antigen of Salmonella typhimurium II Microbios. -1973.-V. 7.-P. 71-73.

232. Kaiser D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns // Curr. Biol. 2007. - V. 17. -P. 561-570.

233. Kalmokoff M.L., Jarrell K.F. Cloning and sequencing of a multigene family encoding the flagellins of Methanococus voltae II J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 7113-7125.

234. Kalmokoff M.L., Jarrell K.F., Koval S.F. Isolation of flagella from the archaebacterium Methanococcus voltae by phase separation with Triton X-l 14 // J. Bacteriol.- 1988.-V. 170.-P. 1752-1758.

235. Kaneko T., Minamisawa K., Isawa T., Nakatsukasa H., Mitsui H., Kawaharada Y., Nakamura Y., Watanabe A., Kawashima K., Ono A., Shimizu Y., Takahashi C., Minami C, Fujishiro T., Kohara M., Katoh M., Nakazaki N., Nakayama S.,

236. Yamada M., Tabata S., Sato S. Complete genomic structure of the cultivated rice endophyte Azospirillum sp. B510 // DNA Res. 2010. - V. 17. - P. 37-50.

237. Kape R., Parniske M., Werner D. Chemotaxis and nod gene activity of Bradyrhizobium japonicum in response to hydroxycinnanic acids and isoflavonoids 11 Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - P.316-319.

238. Kaplan H. B., Piamann L. A Myxococcus xanthus cell density-sensing system required for multicellular development // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 139.-P. 89-95.

239. Kapulnik Y., Okon Y., Henis Y. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation // Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31. - P. 881-887.

240. MDa plasmid involved in replicon fusions // Plasmid. 2009. - V. 62. - P.1.22-29.

241. M 262. Katzy E.I., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. - V. 40. - P. 73-83.

242. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A.D., Kaiser P. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere // Soil. Res. Microbiol. 1989. - V. 140. - P.679-693.

243. Killinger A.H. Lysteria monocytogenes II In: Manual of Clinical Microbiology. 2nd ed. / Eds. Lennette E.H., Spaulding E.H., Truant J.P. Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1974. - P. 135-139.

244. Kimmel S., Reinhold-Hurek B., Fendrik I., Niemann E.G. Contribution of Chemotaxis and aerotaxis to the establishment of Azospirillum in the rhizosphere // Symbiosis. 1990. - V. 9. - P. 195-197.

245. Kirby J. Chemotaxis-like regulatory systems: unique roles in diverse bacteria // Annu. Rev. Microbiol. -2009. -V. 63. P. 45-59.

246. Kloos K., Mergel A., Rösch C., Bothe H. Denitrification within the genus

247. Azospirillum and other associative bacteria // Austr. J. Plant Physiol. 2001. - V. 28.-P. 991-998.

248. Ko M., Park C. H-NS-Dependent regulation of flagellar synthesis is mediated by a LysR family protein // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 4670-4672.

249. Koga T., Ishimoto K., Lory S. Genetic and functional characterization of the gene cluster specifying expression of Pseudomonas aeruginosa pili // Infect. Immun. 1993. -V. 61. - P. 1371-1377.

250. Kohler T., Curty L.K., Barja F., van Delden C., Pechere J.-C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 5990-5996.

251. KomedaY., Silverman M., Simon M. Identification of the structural gene for the hook subunit protein of Escherichia coli flagella // J. Bacteriol. 1978. - V. 133. -P. 364-371.

252. Kozlovsky Y., Cohen I., Golding I., Ben-Jacob E. Lubricating bacteria model for branching growth of bacterial colonies // Physic. Rev. 1999. - V. 59. - P. 70257035.

253. Krieg N.R. Biology of the chemoheterotrophic spirilla // J. Bacteriol. 1976. -V. 40.-P. 55-115.

254. Krieg N.R., Döbereiner J. Genus Azospirillum (Tarrand, Krieg and Dobereiner 1979) // In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Krieg N.R., Holt J.G. Baltimore, 1984. - P. 94-104.

255. Krupski G., Götz R., Ober K., Pleier E., Schmitt R. Structure of complex flagellar filaments in Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1985. - V. 162. - P. 361-366.

256. Kuo S.C., Koshland D.E., Jr. Roles of cheY and cheZ gene products in controlling flagellar rotation in bacterial Chemotaxis of Escherichia coli II J. Bacteriol.-1987.-V. 169.-P. 1307-1314.

257. Kutsukake K., IinoT. A trans-acting factor mediates inversion of a specific DNA segment in flagellar phase variation of Salmonella // Nature. — 1980. V. 284. -P. 479-481.

258. Kutsukake K.5 Ohya Y., Yamaguchi S., IinoT. Transcriptional analysis of the flagellar regulon of Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1990. — V. 172. - P. 741-747.

259. Kutsukake K., lino T. Role of the FliA-FlgM regulatory system on the transcriptional control of the flagellar regulon and flagellar formation in Salmonella typhimurium I I J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 3598-3605.

260. Kutsukake K., Iyoda S., Ohnishi K., lino T. Genetic and molecular analyses of the interaction between the flagellum-specific sigma and anti-sigma factors in Salmonella typhimurium IIEMBO J. 1994. - V. 13. - P. 4568-4576.

261. Kuwajima G., Asaka J.-I., Fujiwara T., Fujiwara T., Node K., Kondo E. Nucleotide sequence of the hag gene encoding flagellin of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1986. -V. 168. - P. 1479-1483.

262. Lambden P., Heckels J., McBride H., Watt P. The identification and isolation of novel pilus types produced by variants of N. gonorrhoeae P9 // FEMS Microbiol. Lett. 1981.-V. 10.-P. 339-341.

263. Laratta W.P., Choi P.S., Tosques I.E., Shapleigh J.P. Involvement of the PrrB/PrrA two-component system in nitrite respiration in Rhodobacter sphaeroides 2.4.3: evidence for transcriptional regulation // J. Bacteriol. 2002. -V. 184.-P. 3521-3529.

264. Lasik J., Vancura V., Hanzlikova A., Wurst M. Polysaccharide compounds in the rhizosphere // In: Interrelationships between Microorganisms and Plants in Soil. Proceed. Intern. Symp. -Praha, 1989. P. 315-321.

265. Lawn A.M. Comparison of the flagellins from different flagellar morphotypes of Escherichia coli II J. Gen. Microbiol. 1977.-V. 101.-P. 112-130.

266. Leive L., Shovlin V.K., Mergenhagen S.E. Physical, chemical and immunological properties of lipopolysaccharides released from Escherichia coli by ethylenediaminetetraacetate // J. Biol. Chem. 1968. - V. 243. - P. 63846391.

267. Lengeler J.W., Vogler A.P. Molecular mechanisms of bacterial chemotaxis towards PTS-carbohydrates // FEMS Microbiol. Rev. 1989. - V. 63. - P. 81-92.

268. Levanony H., Bashan Y., Romano B., Klein E. Ultrastructural localization and identification of Azospirillum brasilense Cd on and within wheat root by immuno-gold labeling // Plant Soil. 1989. - V. 117. - P. 207-218.

269. Li C., Louise C.J., Shi W., Adler J. Adverse conditions which cause lack of flagella in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 2229-2235.

270. Lindahl A., Faris A., Wadstrom T., Hjerten S. A new test based on 'salting out1 to measure relative surface hydrophobicity of bacterial cells // Biochim. Biophys. Acta. 1981. -V. 677. - P. 471-476.

271. Lopez de Victoria G., Lovell C.R. Chemotactic behavior of Azospirillum species to aromatic compounds // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 29512955.

272. Lopez de Victoria G., Fielder D.R., Zimmer-Faust R.K., Lovell C.R. Motility behavior of Azospirillum species in response to aromatic compounds // Can. J. Microbiol. 1994. - V. 40. - P. 705-711.

273. Loiy S. Secretion of proteins and assembly of bacterial surface organelles: shared pathways of extracellular protein targeting // Curr. Opin. Microbiol. -1998.-V. 1.-P. 27-35.

274. Losick R., Shapiro L. Checkpoints that couple gene expression to morphogenesis // Science. 1993. - V. 262. - P. 1227-1228.

275. Losick R., Kaiser D. Why and how bacteria communicate // Sei. Amer. 1997. -V. 276.-P. 68-73.

276. Low D., Braaten B., van der Woude M. Fimbriae // In: Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology / Ed. Neidharts F.C. Washington: ASM Press, 1996.-P. 146-157.

277. Lu H.-M., Motley S.T., Lory S. Interactions of the components of the general secretion pathway: role of Pseudomonas aeruginosa type IV pilin subunits in complex formation and extracellular protein secretion // Mol. Microbiol. 1997. -V. 25.-P. 247-259.

278. Lugtenberg B., Kamilova F. Plant-growth-promoting rhizobacteria // Annu. Rev. Microbiol. -2009. V. 63.-P. 541-556.

279. Luke C.J., Penn C.W. Identification of a 29 kDa flagellar sheath protein in Helicobacter pylori using a murine monoclonal antibody // Microbiology. -1995.-V. 141.-P. 597-604.

280. Lynch J.M., Whipps J.M. Substrate flow in the rhizosphere // Plant Soil. 1990. -V. 129.-P.1-10.

281. Lynch W.H. Effect of temperature on Pseudomonas fluorescens Chemotaxis // J. Bacteriol. 1980. -V. 143. - P. 338-342.

282. Macnab R.M. Genetics and biogenesis of bacterial flagella // Annu. Rev. Genet. 1992.-V. 26.-P. 131-158.

283. Macnab R.M. The bacterial flagellum: reversible rotary propellor and type III export apparatus // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 7149-7153.

284. Macnab R.M., Koshland D.E., Jr. The gradient sensing mechanism in bacterial chemotaxis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. - V. 69. - P. 2509-2512.

285. Macnab R.M., Ornston M.K. Normal-to-curly flagellar transitions and their role in bacterial tumbling stabilization of an alternative quaternary structure by mechanical force // J. Mol. Biol. 1977. - V. 112. - P.l-30.

286. Macnab R.M., Aizawa S.-I. Bacterial motility and the bacterial flagellar motor // Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1984. -V. 13. - P. 51-83.

287. Maeda K., Imae Y., Shioi J.-I., Oosawa F.-J.B. Effect of temperature on motility and chemotaxis of Escherichia coli // J. Bacteriol. 1976. - V. 127. - P. 10391046.

288. Magalhaes F.M., Baldani J.I., Sonto S.M., Kuykendall J.R., Dobereiner J. A new arid-tolerant Azospirillum species // Ann. Acad. Brasil Science. 1983. -V. 55. -P. 417-429.

289. Mandimba G., Heulin T., Bally R., Guckert A., Balandreau J. Chemotaxis of free-living bacteria towards a maize mucilage // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 129-139.

290. Manson M.D., Armitage J.P., Hoch J.A., Macnab R.M. Bacterial locomotion and signal transduction // J. Bacteriol. 1998. -V. 180. - P. 1009-1022.

291. Marchal K., Sun J., Keijers V., Haaker H., Vanderleyden J. A cytochrome cbb3 (cytochrome c) terminal oxidase in Azospirillum brasilense Sp7 supports microaerobic growth // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 5689-5696.

292. Martin P.R., Hobbs M., Free P.D., Jeske Y., Mattick J.S. Characterization of pilO, a new gene required for the biogenesis of type 4 fimbriae in Pseudomonasaeruginosa II Mol. Microbiol. 1993. - V. 9. - P. 857-868.

293. Martin P.R., Watson A.A., McCaul T.F., Mattick J.S. Characterization of a five gene cluster required for the biogenesis of type 4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa II Mol. Microbiol. 1995. - V. 16. - P. 497-508.

294. Martinez R.J., Ichiki A.T., Lundh N.P., Tronick S.N. A single amino acid substitution responsible for altered flagella morphology // J. Mol. Biol. 1968. -V. 34. - P. 559-564.

295. Matora L., Sumaroka M., Dykman L., Serebrennikova O., Shchyogolev S. Revealing a cap on the polar flagellum of Azospirillum brasilense Sp245 // In: Abstr. Xllth Int. Cong. On N2-fixation. Parana, Brasil, 1999. - P. 99.

296. Matsuura S., Kamiya R., Asakura S. Transformation of straight flagella and recovery of motility in a mutant Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1978. - V. 118.-P. 431-440.

297. Mattick J.S. Type IV pili and twitching motility II Ann. Rev. Microbiol. 2002. -V. 56.-P. 289-314.

298. McBride M.J. Bacterial gliding motility: multiple mechanisms for cell movement over surfaces // Annu. Rev. Microbiol. 2001. - V. 55. - P. 49-75.

299. McCarter L. Genetic and molecular characterization of the polar flagellum of Vibrioparahaemolyticus II J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 1595-1609.

300. McCarter L.L. OpaR, a homolog of Vibrio harveyi LuxR, controls opacity of Vibrio parahaemolyticus 11 J. Bacteriol. 1998. -V. 180. - P. 3166-3173.

301. McCarter L.L. The multiple identities of Vibrio parahaemolyticus II J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 181. -P. 51-57.

302. McCarter L.L. Polar flagellar motility of the Vibrionaceae II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - V. 65. - P. 445-462.

303. McCarter L.L., Silverman M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of

304. Vibrio parahaemolyticus // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 731-736.

305. McCarter L., Silverman M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus //Mol. Microbiol. 1990. -V. 4. - P. 1057-1062.

306. McCarter L.L., Wright M.E. Identification of genes encoding components of the swarmer cell flagellar motor and propeller and a sigma factor controlling differentiation of Vibrio parahaemolyticus H J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 3361-3371.

307. McCarter L., Hilmen M., Silverman M. Flagellar dynamometer controls cell differentiation of V. parahaemolyticus II Cell. 1988. - V. 54. - P. 345-351.

308. McClain J., Rollo D.R., Rushing B.G., Bauer C.E. Rhodospirillum centenum utilizes separate motor and switch components to control lateral and polar flagellum rotation // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 2429-2438.

309. Mehnaz S., Weselowski B., Lazarovits G. Azospirillum canadense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. - V. 57. - P. 620-624.

310. Mehnaz S., Weselowski B., Lazarovits G. Azospirillum zeae sp. nov., a diazotrophic bacterium isolated from rhizosphere soil of Zea mays 11 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007a. - V. 57. - P. 2805-2809.

311. Merino S., Shaw J.G., Tomás J.M. Bacterial lateral flagella: an inducible flagella system // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 263. - P. 127-135.

312. Michiels K., De Troch P., Onyeocha I., Van Gool A., Elmerich C., Vanderleyden J. Plasmid localization and mapping of two Azospirillum brasilense loci that affect exopolysaccharide syntesis // Plasmid. 1989. - V. 21. -P. 142-146.

313. Michiels K., Croes C.L., Vanderleyden J. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1991. - V.137.-P. 2241-2246.

314. Minamino T., Imada K., Namba K. Molecular motors of the bacterial flagella // Curr. Opin. Struct Biol. -2008. -V. 18. P. 693-701.

315. Mishkind M., Keegstra K., Palevitz B.A. Distribution of wheat germ agglutinin in young wheat plants // Plant Physiol. 1980. - V. 66. - P. 950-955.

316. Mishkind M., Raikhel N.V., Palevitz B.A., Keegstra K. Immunocytochemical localization of wheat germ agglutinin in wheat // J. Cell Biol. 1982. - V. 92. -P. 753-764.

317. Mishkind M.L., Raikhel N.V., Palevitz B.A., Keegstra K. The cell biology of wheat germ agglutinin and related lectins // Prog. Clin. Biol. Res. 1983. - V. 138-P. 163-176.

318. Moens S., Michiels K., Keijers V., Van Leuven F., Vanderleyden J. Cloning, sequencing, and phenotypic analysis of lafl, encoding the flagellin of lateral flagella of Azospirillum brasilense Sp7 // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 5419-5426.

319. Moens S., Schloter M., Vanderleyden J. Expression of the structural gene, lafl, encoding the flagellin of the lateral flagella in Azospirillum brasilense Sp7 // J. Bacteriol. 1996. -V. 178. - P. 5017-5019.

320. Moens S., Vanderleyden J. Functions of bacterial flagella // Crit. Rev. Microbiol. 1996.-V. 22.-P. 67-100.

321. Molina-Favero C., Creus C.M., Simontacchi M., Puntarulo S., Lamattina L. Aerobic nitric oxide production by Azospirillum brasilense Sp245 and its influence on root architecture in tomato // Mol. Plant-Microbe Interact. 2008. -V. 21.-P. 1001-1009.

322. Morgan D.G., Baumgartner J.W., Hazelbauer G.L. Proteins antigenically related to methyl-accepting chemotaxis proteins of Escherichia coli detected in a widerange of bacterial species // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 133-140.

323. Mori E., Fulchieri M., Indorato C., Fani R., Bazzicalupo M. Cloning, nucleotide sequencing, and expression of the Azospirillum brasilense Ion gene: involvement in iron uptake // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 3440-3446.

324. Morris N.S., Stickler D.J., McLean RJ. The development of bacterial biofilms on indwelling urethral catheters // World J. Urol. 1999. - V. 17. - P. 345-350.

325. Motta E.D.S., De Barros L.H.G.P. Motion of magnetotactic microorganisms // J. Exp. Biol.-1986.-V. 121.-P. 153-163.

326. Mullin D.A., Newton A. Ntr-like promoters and upstream regulatory sequence ftr are required for transcription of a developmentally regulated Caulobacter crescentus flagellar gene // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 3218-3227.

327. Murthy M.G., Ladha J.K. Differential colonization of Azospirillum lipoferum on roots of two varieties of rice // Biol. Fertil. Soils. 1987. - V. 4. - P. 3-7.

328. Murthy M.G., Ladha J.K. Influence of Azospirillum inoculation on the mineral uptake and growth of rice under hydroponic conditions // Plant Soil. 1988. - V. 108.-P. 281-285.

329. Neyra C.A., Hageman R.G. Relationship between carbon dioxide, malate, and nitrate accumulation and reduction in corn (Zea mays L.) seedlings // Plant Physiol. 1976. - V. 58. - P. 726-730.

330. Nicholas D.J.D., Nason A. Determination of nitrate and nitrite // Methods Enzymol. V. 3. / Ed. S.P. Colowick, N.O. Kaplan. New York: Academic Press, 1957.-P. 981-984.

331. Niwano M., Taylor B.L. Novel sensory adaptation mechanism in bacterial Chemotaxis to oxygen and phosphotransferase substrates // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-1982.-V. 79.-P. 11-15.

332. Nowlin D.M., Nettieton D.D., Ordal G.W., Hazelbauer G.L. Chemotactic transducer proteins of Escherichia coli exhibit homology with methyl-accepting proteins from distantly related bacteria // J. Bacteriol. 1985. - V. 163. - P. 262266.

333. Nuijten P J.M., Asten A.J.A.M.V., Gaastra W., van der Zeijest B.A.M. Structural and functional analysis of two Campylobacter jejuni flagellin gene // J. Biol. Chem. 1990.-V. 265.-P. 17798-17804.

334. O'Brien E.J., Bennett P.M. Structure of straight flagella from a mutant Salmonella // J. Mol.,Biol. 1972. -V. 70. - P. 133-152.

335. Ochsner U.A., Koch A.K., Fiechter A., Reiser J. Autoinducer-mediated regulation of rhamnolipid biosurfactant synthesis in Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995. - V. 92. - P. 6424-6428.

336. Okon Y., Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum inoculated roots//Plant Soil. 1986. -V. 90. - P. 3-16.

337. Okon Y., Labandera-Gonzalez C.A. Agronomic applications of Azospirillum: an evaluation of 20 years worldwide field inoculation // Soil Boil. Biochem. — 1994. -V. 26.-P. 1591-1601.

338. Okon Y., Itzigsohn R. The development of Azospirillum as a commercial inoculant for improving crop yields // Biotech. Adv. 1995. - V. 13. - P. 415424.

339. Okon Y., Albrecht S.L., Burris RH. Carbon and ammonia metabolism of Spirillum lipoferum II J. Bacteriol. 1976. - V. 128. - P. 592-597.

340. Oleskin A.V. Social behaviour of microbial populations // J. Basic Microbiol. -1994.-V. 34.-P. 425-439.

341. Ordal G.W., Nettieton D.O., Hoch G. Genetics of Bacillus subtilis Chemotaxis: Isolation and mapping of mutations and cloning of Chemotaxis genes // J. Bacteriol. 1983.-V. 154.-P. 1088-1097.

342. O'Toole GA., Kolter R. The initiation of biofilm formation in Pseudomonasfluorescens WCS365 preceeds via multiple, convergent signaling pathway: a genetic analysis // Mol. Microbiol. 1998. - V. 28. — P. 449-461.

343. Ouchterlony O., Nilsson L.-A. Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis // In: Handbook of Experimental Immunology. V. I. Immunochemistry / Ed Weiz D.M. -Oxford: Alden Press, 1979. P. 19-33.

344. Pacovsky R.S. Metabolic differences in Zea-Glomus-Azospirillum symbioses // Soil Biol. Biochem. 1989. -V. 21. - P. 953-960.

345. Pallen M., Gophna U. Bacterial flagella and Type III secretion: case studies in the evolution of complexity // Genome Dyn. 2007. - V. 3. - P. 30-47.

346. Parge H., Forest K.T., Hickey M.J., Christensen D.A., Getzoff E.D., Tainer J.A. Structure of the fibre-forming protein pili at 2.6 A resolution // Nature. 1995. -V. 378.-P. 32-38.

347. Parish C.R., Ada G.L. Clevage of bacterial flagellins with cianogen bromide. Chemical and physical properties of the protein fragments // Biochem. J. — 1969. -V. 113.-P. 489-499.

348. Parsek M.R., Greenberg E.P. Sociomicrobiology: the connections between quorum sensing and biofilms // Trends Microbiol. 2005. - V. 13. - P. 27-33.

349. Patriquin D.G., Dobereiner J. Light microscopy observation of tetrasolium-reducing bacteria in the endorhyzosphere of maize and other grasses in Brazil // Can. J. Microbiol. 1978. - V. 24. - P. 734-742.

350. Patriquin D.G., Dobereiner J., Jain D.K. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses // Can. J. Microbiol. 1983. -V. 29. - P. 900915.

351. Pedrosa F.O. Physiology, biochemistry and genetics of Azospirillum and other root-associated nitrogen-fixing bacteria // Crit. Rev. Plant Sci. 1988. - V. 6. -P. 345-384.

352. Peng G., Wang H., Zhang G., Hou W., Liu Y., Wang E.T., Tan Z. Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - V. 56. - 1263-1271.

353. Perez-Martin J., Rojo F., de Lorenzo V. Promoters responsive to DNA bending: a common theme in prokaryotic gene expression // Microbiol. Rev. 1994. - V. 58.-P. 268-290.

354. Peumans W.J., Van Damme E.J. Lectins as plant defense proteins // Plant Physiol. 1995. - V. 109. - P. 347-352.

355. Plazinski J., Rolfe B.G. Analysis of pectolytic activity of Rhizobium and Azospirillum strains isolated from Trifolium repens H J. Plant Physiol. — 1985. -V. 120.-P. 181-187.

356. Pleier E., Schmitt R. Identification and sequence analysis of two related flagellin genes in Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1989. - V. 171. -P. 1467-1475.

357. Pleier E., Schmitt R. Expression of two Rhizobium meliloti flagellin genes and their contribution to the complex filament structure I I J. Bacteriol. 1991. - V. 173.-P. 2077-2085.

358. Postma P.W., Lengeier J.W., Jacobson G.R. Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. - P. 543-594.

359. Pringent-Combaret C., Vidal O., Dorel C., Lejeune P. Abiotic surface sensing and biofilm dependent regulation of gene expression in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1999 - V. 181. - P. 5993-6002.

360. Pruß B.M., Matsumura P. A regulator of the flagellar regulon of Escherichia coli,flhD, also affects cell division 11 J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 668-674.

361. Pruß B.M., Markovic D., Matsumura P. The Escherichia coli flagellar transcriptional activator flhD regulates cell division through induction of the acid response gene cadA II J. Bacteriol. 1997.-V. 179. - P. 3818-3821.

362. Ramey B.E., Koutsoudis M., von Bodman S.B., Fuqua C. Biofilm formation in plant-microbe associations // Curr. Opin. Microbiol. 2004. - V. 7. - P. 602-609.

363. Rashid M.H., Kornberg A. Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. - V. 97. - P. 4885-4890.

364. Ratiner Y.A. Two genetic arrangements determining flagellar antigen specificities in two dipnasic E. coli strains II FEMS Microbiol. Lett. 1985. - V.29.-P. 317-322.

365. Rauprich O., Matsushita M., Weijer C.J., Siegert F, Esipov S.E., Shapiro J.A. Periodic phenomena in Proteus mirabilis swarm colony development // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 6525-6538.

366. Reinhold B., Hurek T., Fendrik I. Strain-specific chemotaxis of Azospirillum spp.//J. Bacteriol.-1985.-V. 162.-P. 190-195.

367. Rich J.J., Heichen R.S., Bottomley P.J., Cromack K.Jr., Myrold D.D. Community composition and functioning of denitrifying bacteria from adjacent meadow and forest soils // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 59745982.

368. Robinson J.B., Tuovinen O.H., Bauer W.D. Role of divalent cations in the subunit associations of complex flagella from Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. -1992.-V. 174.-P. 3896-3902.

369. Rodelas B., Salmeron V., Martinez-Toledo M.V., Gonzalez-Lopez J. Production of vitamins by Azospirillum brasilense in chemically-defined media // Plant and Soil. 1993.-V. 153.-P. 97-101.

370. Rodriguez-Navarro D.N., Dardanelli M.S., Ruiz-Sainz J.E. Attachment of bacteria to the roots of higher plants // FEMS Microbiol. Lett. 2007. - V. 272. -P. 127-136.

371. Roman S.J., Meyers M., Volz K., Matsumura P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by supresor of flagellar switch mutations // J. Bacteriol. 1992. -V. 174.-P. 6247-6255.

372. Rudel T., Scheurerpflug I., Meyer T.F. Neisseria PilC protein identified as type-4 pilus tip-located adhesin // Nature. 1995. - V. 373. - P. 357-359.

373. Salhi B., Mendelson N.H. Patterns of gene expression in Bacillus subtilis colonies // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 5000-5008.

374. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual.

375. Second ed. NY: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. V. 1-3.

376. Sar N., McCarter L., Simon M., Silverman M. Chemotactic control of the flagellar systems of Vibrio parahaemolyticus // J. Bacterid. 1990. - V. 172. -P. 334-341.

377. Sarig S., Kapulnik Y., Okon Y. Effect of Azospirillum inoculation on nitrogen fixation and growth of several winter legumes //Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 335-342.

378. Sarig S., Blum A., Okon Y. Improvement of the water status and yield of field-grow grain sorgum (Sorghum bicolor) by inoculation with Azospirillum brasilense I I J. Agric. Sci. 1988. - V. 110. -P. 271-277.

379. Sauer K., Camper A.K., Ehrlich G.D., Costerton J.W., Davies D.G. Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 1140-1154.

380. Schloter М., Moens S., Croes С., Hartmann A., Michiels К. Characterization of cell surface components of Azospirillum brasilense Sp7 as antigenic determinants for strain-specific monoclonal antibodies 11 Microbiology. 1994. - V. 140. - P. 823-828.

381. Schloter M., Assmus В., Hartmann A. The use of immunological methods to detect and identify bacteria in the environment // Biotech. Adv. 1995. - V. 13. -P. 75-90.

382. Schloter M., Hartmann A. Endophytic and surface colonization of wheat roots (Triticum aestivum) by different Azospirillum brasilense strains studied with strain-specific monoclonal antibodies I I Symbiosis. 1998. - V. 25. - P. 159179.

383. Schmidt E.L. Initiation of plant root-microbe interactions // Ann. Rev. Microbiol. 1979. -V. 33. - P. 355-376.

384. Segall J.E., Block S.M., Berg H.C. Temporal comparisons in bacterialchemotaxis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 8987-8991.

385. Semmler A.B.T., Witchurch C.B., Leech A.J., Mattick J.S. Identification of a novel gene, fim V, involved in twitching motility in Pseudomonas aeruginosa II Microbiology.-2000.-V. 146.-P. 1321-1332.

386. Serganova I.S., Polosina Y.Y., Kostyukova A.S., Pyatibratov M.G., Fedorov O.V. Flagella of halophilic archeae: biochemical and genetic analysis // Biochemistry. 1995. - V. 60. - P. 953-957.

387. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns // BioEssays. 1995. -V. 17.-P. 597-607.

388. Shapiro J.A. Thinking about bacterial population as multicellular organisms // Annu. Rev. Microbiol. 1998. - V. 52. - P. 81-104.

389. Shea C., Nunley J.W., Smith-Somerville H.E. Variable expression of gliding and swimming motility in Deleya marinda II Can. J. Microbiol. 1991. - V. 37. - P. 808-814.

390. Shi W., Li C., Louise C.J., Adler J. Mechanism of conditions causing lack of flagella in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 2236-2240.

391. Silverman M., Simon M. Characterization of Escherichia coli flagellar mutants that are insensitive to catabolite repression // J. Bacteriol. 1974. - V. 120. - P. 1196-1203.

392. Silverman M., Simon M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility // Nature. 1974a. - V. 249. - P. 73-79.

393. Silverman M., Simon M. Bacterial flagella // Ann. Rev. Microbiol. 1977. - V. 31.-P. 397-419.

394. Silwerman M., Simon M. Phase variation: genetic analysis of switching mutants //Cell. 1980.-V. 19.-P. 845-854.

395. Simon R. High frequency mobilization of gram-negative bacterial replicons by the in vivo constructed Tn5-Mob transposon // Mol. Gen. Genet. 1984. - V. 196.-P. 413-420.

396. Skerker J.M., Berg H.C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 6901-6904.

397. Skvortsov I.M., Ignatov V.V. Extracellular polysaccharides and polysaccharide-containing biopolymers from Azospirillum species: properties and the possible interaction with plant roots 11FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 165. - P. 223229.

398. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg B.J J. Roles of flagella, lipopolysaccharide, and Ca+ dependent cell surface protein in attachment of Rhizobium leguminosarum biovar viciae to pea root hair tips // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 569-572.

399. Smith D.G. The Proteus swarming phenomenon // Sci. Prog. 1972. - V. 60. -P. 487-506.

400. Smyth C.J., Marron M.B., Twohig J.M.G.J., Smith S.G.J. Fimbrial adhesins: similarities and variations in structure and biogenesis // FEMS Immunol. Med. Microbiol.-1996-V. 16.-P. 127-139.

401. Somers E., Vanderleyden J. Rhizosphere bacterial signaling: a love parade beneath our feet // Crit. Rev. Microbiol. 2004. - V. 30. - P. 205-240.

402. Sosinsky G.E., Francis N.R., Stallmeyer M.J.B., DeRosier D.J. Substructure of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium II J. Mol. Biol. 1992. - V. 223. - P.171-184.

403. Soto G.E., Hultgren S.J. Bacterial adhesins: common themes and variations in architecture and assembly//J. Bacteriol. 1999.-V. 181.-P. 1059-1071.

404. Sowa Y., Berry R. Bacterial flagellar motor // Quart. Rev. Biophys. 2008. - V. 41.-P. 103-132.

405. Spormann A.M. Gliding motility in bacteria: insights from studies of Myxococcus xanthus II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - V. 63. - P. 621-641.

406. Springer W.R., Koshland D.E., Jr. Identification of a protein methyltransferase as the cheR gene product in the bacterial sensing system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1977.-V. 74.-P. 533-537.

407. Spudich J, Koshland D.E., Jr. Non-genetic individuality: chance in the single cell // Nature. 1976. - V. 262. - P.467-471.

408. Stanley N.R., Britton R.A., Grossman A.D., Lazazzera B.A. Identification of catabolite repression as a physiological regulation of biofilm formation by Bacillus subtilis by use of DNA microarrays // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. — P. 1951-1957.

409. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects I IFEMS Microbiol Rev. 2000. - V. 24. - P 487-506.

410. Steenhoudt O., Keijers V., Okon Y., Vanderleyden J. Identification and characterization of a periplasmic nitrite reductase in Azospirillum brasilense Sp245 //Arch. Microbiol. 2001. -V. 175. P. 344-352.

411. Steenhoudt O., Ping Z., Vande Broek A., Vanderleyden J. A spontaneous chlorate-resistant mutant of Azospirillum brasilense Sp245 displays defects in nitrate reduction and plant root colonization I I Biol. Fertil. Soils. 2001. - V. 33. -P. 317-322.

412. Stephens B., Loar S., Alexandre G. Role of CheB and CheR in the complex chemotactic and aerotactic pathway of Azospirillum brasilense I I J. Bacteriol. -2006. V. 188. - P. 4759-4768.

413. Stock J. Mechanisms of receptor function and the molecular biology of information processing in bacteria // Bio Essays. 1987. - V. 6. - P. 190-203.

414. Stock J., Kersulis G., Koshland D.E., Jr. Neither methylating nor demethylating enzymes are required for bacterial chemotaxis // Cell. 1985. - V. 42. — P .683690.

415. Socket R.E., Armitage J.P., Evans M.C.W. Methylation-independent and methylation-dependent chemotaxis in Rhodobacter sphaeroides and Rhodospirillum rubrum II J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P.5808-5814.

416. Strom M., Lory S. Structure, function and biogenesis of type IV pili // Annu. Rev. Microbiol. 1993. - V. 47. - P. 565-596.

417. Strom M., Nunn D., Lory S. Multiple roles of the pilus biogenesis protein PilD: involvement of PilD in excretion of enzymes from Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol.-1991.-V. 173.-P. 1175-1180.

418. Strom M., Nunn D.N., Lory S. Posttranslational processing of type IV prepilin and homologs by PilD of Pseudomonas aeruginosa II Methods Enzymol. 1994. -V. 235.-P. 527-540.

419. Strube K., de Vries S., Cramm R. Formation of a dinitrosyl iron complex by NorA, a nitric oxide-binding di-iron protein from Ralstonia eutropha HI 6 11 J. Biol. Chem. 2007. -V. 282. - P. 20292-20300.

420. Suzuki T., lino T., Horiguchi T, Yamaguchi S. Incomplete flagella structures in non-flagellate mutants of Salmonella typhimurium I I J. Bacteriol. 1978. - V. 133.-P. 904-915.

421. Taylor B.L., Koshland D.E., Jr. Reversal of flagellar rotation in monotrichous and peritrichous bacteria: genetration of changes in direction // J. Bacteriol. -1974.-V. 119.-P. 640-642.

422. Thanassi D.G., Hultgren S.J. Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane // Curr. Opin. Cell Biol. 2000. - V. 12. - P. 420430.

423. Terashima H., Kojima S., Homma M. Flagellar motility in bacteria structure and function of flagellar motor // Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2008. - V. 270. - P. 3985.

424. Tien T.M., Diem H.G., Gaskins M.H., Hubell D.H. Polygalacturonic acid transeliminase production by Azospirillum species // Can. J. Microbiol. 1981. — V. 27.-P. 426-431.

425. Tolker-Neilsen T., Christiansen G., Holmstrom K., Eberl L., Rasmussen T.B., Sternberg C., Molin S., Givskov M. Assessment of flHDC mRNA levels in individual Serratia liquefaciens swarm cells // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 2680-2686.

426. Tomaskov I.S., Morgan D.G., DeRosier D.J. Rotational symmetry of the C ring and a mechanism for the flagellar rotary motor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1999.-V. 96.- P. 10134-10139.

427. Tronick S.R., Martinez R.J. Methylation of the flagellin of Salmonella typhimurium 11 J. Bacteriol. 1971. - V. 105. - P. 211-219.

428. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. - V. 119. - P. 115-119.

429. Ueno T., Oosawa K., Aizawa S.-I. M ring, S ring and proximal rod of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium are composed of subunits of a single protein, FliF // J. Mol. Biol. 1992. - V. 227. - P. 672-677.

430. Umali-Garcia M., Hubbell D.H., Gaskins M.H., Dazzo F.B. Association of Azospirillum with grass roots // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - V. 39. - P. 219-226.

431. Valverde A., Okon Y., Burdman S. cDNA-AFLP reveals differentially expressed genes related to cell aggregation of Azospirillum brasilense II FEMS Microbiol Lett. -2006.-V. 265.-P. 186-194.

432. Vanbleu E., Marchal K., Lambrecht M., Mathys J., Vanderleyden J. Annotation of the pRhico plasmid of Azospirillum brasilense reveals its role in determining the outer surface composition // FEMS Microbiol. Lett. 2004. -V. 232. - P. 165-172.

433. Van Doom J., Boonekamp P.M., Oudega B. Partial characterization of fimbriae of Xanthomonas campestris pv. hyacinthi II Mol. Plant-Microbe Interact. 1994. -V.7.-P. 334-344.

434. Van Rijn P., Vanstokem M., Vanderleyden J., de Mot R. Isolation of behavioral mutants of Azospirillum brasilense by using Tn5 lacZ II Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 990-996.

435. Verstraeten N., Braeken K., Debkumari B., Fauvart M., Fransaer J., Vermant J., Michiels J. Living on a surface: swarming and biofilm formation // Trends. Microbiol. 2008. - V. 16. - P. 496-506.

436. Verstraeten N., Braeken K., Debkumari B., Fauvart M., Fransaer J., Vermant J., Michiels J. Living on a surface: swarming and biofilm formation // Trends Microbiol. 2008. - V. 16. - P. 496-506.

437. Vladimirov N., Sourjik V. Chemotaxis: how bacteria use memory // Biol. Chem. 2009. - V. 390. - P. 1097-2104.

438. Walker K.E., Moghaddame-Jafari S., Lockatell C.V., Johnson D., Belas R. ZapA, the IgA-degrading metalloprotease of Proteus mirabilis, is a virulence factor expressed specifically in swarmer cells // Mol. Microbiol. — 1999. V. 32. -P. 825-836.

439. Wall D., Kaiser D. Type IV pili and cell motility // Mol. Microbiol. 1999. - V. 32.-P. 1-10.

440. Wei X., Bauer W.D. Tn5-induced and spontaneous switching of Sinorhizobium meliloti to faster-swarming behavior // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65.-P. 1228-1235.

441. Weimer R., Creighton C., Stassinopoulos A., Youderian P., Hartzell P. A chaperone in the HSP70 family controls production of extracellular fibrills by Myxococcus xanthus 11 J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 5357-5368.

442. Weissborn A., Steinman H.M., Shapiro L. Characterization of the Caulobacter crescentus flagellar filament. Peptide analysis and filament organization // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - P. 2066-2074.

443. Wieland F.G.P., Sumper M. Halobacterial flagellins are sulfated glycoproteins // J. Biol. Chem. 1985. -V. 260. - P. 15180-15185.

444. Whitchurch C.B., Mattick J.S. Characterization of a pilU required for twitchingmotility but not phage sensitivity in Pseudomonas aeruginosa I I Mol. Microbiol.- 1994.-V. 13.-P. 1079-1091.

445. Whiteside T.M., Phodes-Roberts M. E. Biochemical and serological properties of purified flagella and flagellins of some Pseudomonas spp. // J. Gen. Microbiol.- 1985.-V. 131.-P. 873-883.

446. Will D., Wu S.S., Kaiser D. Contact stimulation of Tgll and type IV pili in Myxococcus xanthus II J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 759-761.

447. Wilson D.R., Beveridge T.J. Bacterial flagellar filaments and their component flagellins // Can. J. Microbiol. 1993. - V. 39. - P. 451-472.

448. Wintenberg K.K., Anderson T., Montie T.C. Phosphorylated tyrosine in the flagellum protein of Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. — 1990. V. 172. -P. 5135-5139.

449. Woo S., Fogliano V., Scala F., Lorito M. Synergism between fungal enzymes and bacterial antibiotics may enhance biocontrol // Antonie Van Leeuwenhoek. -2002.-V. 81.-P. 353-356.

450. Wood C.C., Ritchie R.J., Kennedy I.R. Membrane potential, protom and sodium motive forces in Azospirillum brasilense Sp7-S // FEMS Microbiol. Lett. 1998. -V. 164.-P. 295-301.

451. Wood P.J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides // Carbohydr. Res. 1980. - V. 85. - P. 271-287.

452. Xie C.H., Yokota A. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from the roots of the rice plant Oryza sativa II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. - V. 55. - P. 1435-1438.

453. Xie Z., Ulrich L., Zhulin I., Alexandre G. PAS domain containing chemoreceptor couples dynamic changes in metabolism with chemotaxis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. - V. 107.-P. 2235-2240.

454. Yegorenkova I.V., Konnova S.A., Sachuk V.N. Ignatov V.V. Azospirillum brasilense colonisation of wheat roots and the role of lectin-carbohydrate interactions in bacterial adsorption and root-hair deformation // Plant Soil. -2001.-V. 231.-P. 275-282.

455. Young C.C., Hupfer H., Siering C., Ho M.J., Arun A.B., Lai W.A., Rekha P.D., Shen F.T., Hung M.H., Chen W.M., Yassin A.F. Azospirillum rugosum sp. nov., isolated from oil-contaminated soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - V. 58.-P. 959-963.

456. Zhou J., Lloyd S.A., Blair D.F. Electrostatic interaction between rotor and stator in the bacterial flagellar motor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. -P. 6436-6441.

457. Zhou Y., Wei W., Wang X., Xu L., Lai R. Azospirillum palatum sp. nov., isolated from forest soil in Zhejiang province, China // J. Gen. Appl. Microbiol. -2009.-V. 55.-P. 1-7.

458. Zhulin I.B., Armitage J.P. Motility, chemokinesis, and methylation-independent chemotaxis in Azospirillum braslense II J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 952958.

459. Zhulin I.B., Tretyakova S.E., Ignatov V.V. Chemotaxis of Azospirillum brasilense towards compounds typical of plant root exudates // Folia Microbiol. -1988.-V. 33.-P. 277-280.

460. Zimmer W. Roeben K., Bothe H. An alternative explanation for plant growth promotion by bacteria of the genus Azospirillum II Planta. -1988. -V. 176. P. 333-342.

461. Zumft W.G. Cell biology and molecular basis of denitrification // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. - V. 61. - P. 533-616.