Структурные особенности липополисахаридов азоспирилл в связи с их участием в коммуникации микроорганизмов в ризосфере

Бойко, Алевтина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурные особенности липополисахаридов азоспирилл в связи с их участием в коммуникации микроорганизмов в ризосфере
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурные особенности липополисахаридов азоспирилл в связи с их участием в коммуникации микроорганизмов в ризосфере"

На правах рукописи

Бойко Алевтина Сергеевна

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ АЗОСПИРИЛЛ В СВЯЗИ С ИХ УЧАСТИЕМ В КОММУНИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В РИЗОСФЕРЕ

03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0034Т20ЬА

Саратов - 2009

003472064

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: < доктор биологических наук, профессор

Коннова Светлана Анатольевна

кандидат биологических наук Федоненко Юлия Петровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Тараненко Татьяна Михайловна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Тульская Елена Михайловна

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследова-

тельский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится «10» июня 2009 г. в 10.00 ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.1 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте института http:www.ibppm.saratov.ru/obyav_dis.html

Автореферат разослан «-}-» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

В.Б. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В процессе растительно-бактериального взаимодействия, а также в адаптации к условиям окружающей среды важнейшую роль играет поверхность клетки микроорганизма. Наружный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий содержит трехкомпоненгаые молекулы липополисахаридов (ЛПС), которые закреплены в ней при участии погруженных в фосфолипидный слой липидов А и экспонированы в окружающее пространство углеводными составляющими, представленными коровым олигоса-харидом и О-специфическим полисахаридом (ОПС). Такое строение макромолекул ЛПС характерно для всех бактерий - комменсалов, мутуалистов и патогенов животных и растений.

Ключ к пониманию функций ЛПС в коммуникации микробов с другими организмами находится в первичной химической структуре макромолекул. В последнее время на примере рада бактерий - ксантомонад, псевдомонад, агро-бакгерий, ризобий - показано, что вариации в структуре корового олигосахари-да и липидной части ЛПС могут быть связаны с различными типами взаимодействий этих бактерий с растениями (Newman et al., 2007). Однако в большей степени структурный анализ ЛПС сфокусирован на ОПС, которые вследствие поверхностного расположения вовлечены в процессы узнавания микроорганизма макрохозяином и инициацию иммунной реакции организма. Установлены некоторые факты участия этих макромолекул в ассоциативных взаимоотношениях, модельным объектом изучения которых являются бактерии рода Azospirillum. Обнаружено, что ЛПС-содержащие экстракты из клеток азоспи-рилл стимулируют агрегацию бактерий (Matora et al., 2001) и прикрепление их к поверхности корня (Matora et al., 1995), а изолированные препараты ЛПС индуцируют деформации корневых волосков проростков пшеницы (Федоненко с соавт., 2001). Выявлено снижение количества адсорбированных на корнях клеток мутантного штамма КМ252, дефектного по синтезу ЛПС, по сравнению с родительским A. brasilense Sp245 (Федоненко с соавт., 2001). Однако все эти биологические эффекты получены на препаратах очень ограниченного количества штаммов, главным образом, на примере ЛПС бактерий A. brasilense Sp245, которые являются эндофитными (D6bereiner and Day, 1976). Любое изменение в составе молекулы ЛПС может отражаться на его свойствах и биологической активности, а структура углеводного компонента и соотношение жирных кислот (ЖК) в ЛПС разных штаммов азоспирилл характеризуются высокой вариабельностью и зависят от условий существования микроорганизмов.

Кроме того, полисахаридный участок молекулы ЛПС содержит антигенные детерминанты, которые определяют серологическую специфичность бактерий и могут быть доступны для узнавания клетками других организмов. На основании наличия общих антигенных детерминант в ЛПС шесть штаммов бактерий рода Azospirillum поделены на две серогруппы (Коннова, 2006). Однако для выяснения химической основы серологического родства и создания пол-

ноценной серологической классификации азоспирилл требуются данные о структурах ОПС других штаммов.

В связи с вышеизложенным цель данной работы заключается в выявлении особенностей структуры молекул ЛПС азоспирилл разных серогрупп в связи с коммуникативной ролью в ризосфере.

Для реализации цели в ходе исследования решались следующие задачи:

1. Анализ и характеристика химического состава препаратов ЛПС и ОПС, выделенных из внешних мембран восьми штаммов бактерий рода Azospirillum.

2. Сравнительное исследование структур повторяющихся звеньев ОПС азоспирилл и выявление химической основы их серологического родства.

3. Исследование активности ЛПС в коммуникации азоспирилл разных серогрупп с растительными и бактериальными клетками.

4. Выявление изменений в структуре ЛПС бактерий А. brasilense Sp245.5, произошедших в результате спонтанного изменения плазмидного состава.

Научная новизна работы. Установлены структуры ОПС и выявлена химическая основа серологического родства бактерий А. brasilense S27, Spl07, SRI 5, SR80, SR55 и А. lipoferum RG20a.

Впервые в ОПС штаммов азоспирилл, выделенных из ризосферы дикорастущих растений (Zerna inermis и Sericostoma pauciflorum), в качестве повторяющихся звеньев идентифицированы линейные гомоолигомеры D-рамнозы.

Впервые для азоспирилл в ОПС бактерий А. brasilense SR55 обнаружено восьмичленное повторяющееся звено с глюкуроновой кислотой в боковой цепи.

Идентифицированы два повторяющихся звена различной структуры в ОПС бактерий А. brasilense SR80.

Расшифрована уникальная структура повторяющегося звена ОПС спонтанного мутанта А. brasilense Sp245.5, образовавшегося в результате длительного хранения на богатой среде культуры А. brasilense Sp245.

Впервые в комплексе с ЛПС бактерий А. brasilense SRI 5 идентифицирован Ns-( 1 -карбоксиэтил)-орнитин, принадлежащий к классу опинов.

Выявлено повышенное содержание непредельных ЖК в гидрофобных компонентах ЛПС четырёх штаммов азоспирилл (А- brasilense SR80, SR55, SR8 и SRI 5), выделенных из почв Саратовской области. Установлено, что ЛПС азоспирилл с различными соотношениями ЖК и/или структурами повторяющихся звеньев отличаются по активности в отношении растений.

Научно-практическая значимость. Выявленный факт биосинтеза гли-кополимеров иной структуры в связи с геномными перестройками может быть использован для прогнозирования изменений природных штаммов при длительном хранении в лабораторных условиях. Кроме того, полученные данные способствуют пониманию роли плазмидной ДНК в формировании структур клеточной поверхности, участвующих в ассоциативном взаимодействии.

дования, применяются сотрудниками лабораторий биохимии, микробиологии, иммунохимии ИБФРМ РАН для проведения биологических и иммунохимиче-ских экспериментов. Полученные антитела (AT), специфичные к ЛПС бактерий A. brasilense SR55 и S17, могут быть использованы как инструменты для выявления соответствующих эпитопов в составе гликополимеров различного происхождения.

Результаты данной работы используются в преподавании студентам биологического и химического факультетов Саратовского государственного университета курсов «Основы гликологии» и «Химия и биохимия углеводов».

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Повторяющиеся звенья О-специфических полисахаридов бактерий A. brasilense Spl07, S27 и A. lipoferum RG20a являются пента-В-рамнанами, A. brasilense SR15 - тетра-Б-рамнанами. Присутствие в структурах О-специфических полисахаридов D-рамнозы является химической основой серологического родства и обоснованием отнесения вышеуказанных штаммов к серогруппе I. С липополисахаридом A. brasilense SRI5 прочно ассоциирован N -(1-карбоксиэтил)-орнитин.

2. О-специфический полисахарид бактерий A. brasilense SR55 состоит из октасахарвдных звеньев с D-глюкуроновой кислотой в боковой цепи; в составе О-специфического полисахарида A. brasilense SR80 содержится два повторяющихся звена различной структуры. О-специфические полисахариды азоспи-рилл, включенных в состав серогруппы II, являются разветвленными гетеропо-лисахаридами, содержащими среди прочих Сахаров L-рамнозу и D-галактозу.

3. У мутанта A. brasilense Sp245.5, образовавшегося в результате плаз-ми дных перестроек в геноме бактерий A. brasilense Sp245 при длительном хранении на богатой среде, синтезируется О-специфический полисахарид, отличный по структуре от такового родительского штамма.

4. Существенную роль, определяющую активность бактерий в отношении растений, играют как структура О-специфических полисахаридов, так и соотношение жирных кислот в липидах А липополисахаридов.

Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, представлены на следующих научных форумах: конференции «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005 г.); 10-ой Всероссийской Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука 21 века» (Пущино, Россия, 2006 г.); 3-ей и 4-ой Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006 г., 2008 г.); 2-ой конференции стран Балтии по микробным полисахаридам «2nd Baltic meetings on microbial carbohydrates» (Росток, Германия, 2006 г.); Международной школе-конференции молодых ученых «Прикладные и фундаментальные аспекты ответных, сигнальных процессов и процессов развития в системах корень-микроорганизм» (Санкт-Петербург, Россия, 2007 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты ис-

следования симбиотических систем» (Саратов, Россия, 2007 г.); 14-ом Европейском симпозиуме «14th Eurocarb» (Любек, Германия, 2007 г.).

Доклад «Структура и участие липополисахарида Azospirillum brasilense SR55 во взаимодействии с корнями пшеницы» на научной конференции «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2008 г.) удостоен диплома I степени.

Диссертационная работа обсуждена и рекомендована к защите на совместном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии и биофизики СГУ им. Н.Г. Чернышевского 3 марта 2009 года.

Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Структуры гликополимеров и их функции в растительно-микробных взаимодействиях» (№ гос. per. 0120.040358, научный руководитель - заслуженный деятель науки РФ, проф. В.В. Игнатов). Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: в 2005-2007 гг. № 05-04-48123, руководитель проф. Игнатов В.В. и в 2008-2010 гг. № 08-0400669, руководители проф. Игнатов В.В. и проф. Коннова С.А., а также грантами Президента РФ на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в совместной работе с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии СГУ. Серологические исследования ЛПС выполнены совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН, эксперименты по ингибированию агглютинирующей активности лектина Grifóla frondosa проведены сотрудниками лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН, анализ состава ЖК ЛПС осуществлен сотрудниками лаборатории структурных методов исследования ИБФРМ РАН, спектры адерного магнитного резонанса (ЯМР) сняты и расшифрованы совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов ИОХ РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей. Доля личного участия автора в подготовке совместных публикаций составляет до 70 %.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ в отечественных и зарубежных научных изданиях, из них 2 статьи в журналах из перечня, рекомендованного Высшей аттестационной комиссией Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов исследования, а также результатов и их обсуждения, заключения, выводов, благодарностей и списка цитируемой литературы, содержащего 368 источников, в том числе 280 зарубежных. Работа изложена на 129 страницах, содержит 14 рисунков и 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава посвящена описанию современного состояния исследований по проблеме формирования ассоциативного симбиоза и роли отдельных структур поверхности бактериальной клетки на разных стадиях взаимодействия азоспи-рилл с растением. Особое внимание уделено структурно-функциональной характеристике гликополимеров поверхности азоспирилл.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В таблице 1 представлены штаммы бактерий рода АгозртИит, из внешних мембран которых получены препараты ЛПС.

Таблица 1.

Штаммы бактерий рода АгохртИит, применяемые в работе

Бактериальный штамм Растение-хозяин От кого получен штамм Ссылка

A. lipofenm RG20a Triticum aestivum L. J. Döbereiner, Empresa Brasileira Pesquisa Agropecua ria, Rio de Janeiro, Бразилия Baldani et al., 1983

A. brasilense Spl07 Triticum aestivum L. Tarrand eta!., 1978

A. brasileme S27 Sericostoma pauciflorum L. N.A. Lahiri. Division of Soilater-Plant relationship, Central Arid Zon Institute, Jodhpur, Индия Не описан

A. brasileme SR15 Dactilis glomerata L. Вьщелены сотрудниками ИБФРМ РАН (Саратов) из ризосферы злаков Саратовской области Позднякова с соавт., 1988

A. brasilense SR55 Triticum durum L. Харьковская 46

Л. brasilense SR8 Zerna inermis

A. brasilense SR80 Triticum aestivum L. Саратовская 49

A. brasilense Sp245.5 Спонтанный мутант, утративший 40-, 85- и 120-МДа плазмиды и образовавший репликон с молекулярной массой более 300 МДа при многолетнем хранении транс-коньюгатов Бр245^4) на богатой среде; получен в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН Кацы с со-авт., 2002

Все микроорганизмы культивировали на жидкой малатно-солевой среде (Konnova et al., 1994) при 30 °С до окончания экспоненциальной фазы роста, удаляли капсулу и биомассу высушивали ацетоном. В качестве растительного объекта использовали семена мягкой яровой пшеницы Triticum aestivum сорта Саратовская 29 репродукции 2006 г., полученные из ВНИИСХ Юго-Востока г. Саратова.

Выделение ЛПС из сухой бактериальной массы осуществляли горячим 45 % водным фенолом (Кульшин с соавт., 1987). Экстракты подвергали гель-фильтрации. Электрофорез препаратов ЛПС в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия проводили в соответствии с методикой (Hitchcock

and Brown, 1983), визуализацию ЛПС осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе азотнокислого серебра (Tsai and Frasch, 1982). ОПС изолировали из ЛПС деградацией 2% СН3СООН (100 °С, 4-5 ч). Колориметрическое определение содержания в препаратах ЛПС углеводов, 2-кето-З-дезоксиоктоновой кислоты (КДО), белков, фосфора выполняли, как описано (Konnova el al., 1994). Измерения проводили на Specord 40 (Analytik Jena AG, Германия). Нейтральные моносахариды в ОПС анализировали методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) в виде ацетатов полиолов (Sawardeker el al., 1965), уроновые кислоты - в виде ацетилированных метилгликозидов (Варбанец с соавт., 2006) на хроматографе Hewlett-Packard 5890. Абсолютные конфигурации нейтральных моносахаридов определяли ГЖХ ацетилированных гликозидов с (11)-2-октанолом (Leontein et al., 1978), а уроновых кислот - в виде ацетилированных (К)-2-бутилгликозццов (Варбанец с соавт., 2006). Метилирование ОПС осуществляли СН31 или CD3I в диметилсульфоксиде в присутствии метилсульфинилметанида по методике (Hakomori, 1964) и анализировали методом ГЖХ-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) на хроматографе Hewlett-Packard 5989А. Состав ЖК в липиде А ЛПС анализировали на хроматографе Shimadzu GL-2010 (Япония). Метилирование ЛПС проводили по методу (Mayer et al., 1985). Деградацию по Смиту осуществляли окислением полисахарида 0.1 М NaI04 (72 ч при 20 °С). 'Н- и 13С-ЯМР-спектры записывали на спектрометре Bruker DRX-500 для растворов ОПСвОгО.

Поликлональные AT получали иммунизацией кроликов ЛПС с адъювангом Фрейнда и осаждали из антисывороток (NH4)2S04. Двойную радиальную иммунодиффузию проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979). Исследование изменения морфологии корневых волосков пшеницы под действием ЛПС выполняли, как описано в работе Конновой с соавторами (1995). Световую микроскопию образцов корней осуществляли на интерференционно-поляризационном микроскопе Биолар PI. Результаты регистрировали при помощи цифровой камеры-окуляра Scopetek DCM35 (КНР). Изучение влияния ЛПС на адсорбцию бактерий проводили, как описано Егоренковой с соавторами (2001). Исследование трофического таксиса азоспирилл выполняли по методу (Adler, 1966). Влияние ЛПС на агрегацию бактериальных клеток изучали с применением метода (Madi and Henis, 1989). Результаты подвергали статистической обработке (Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ биополимерного состава и жирных кислот липополисахаридов

Из внешних мембран бактерий A. lipoferum RG20a, Л. brasilense Spl07, SRI 5, SR8, SR55, SR80 и S27 выделены ЛПС (выход 1-3 % от веса сухих клеток). Выбранные штаммы азоспирилл изолированы из почв разных климатических зон, четыре штамма - из зоны с резкоконтинентальным климатом Сара-

товской области, где летом вследствие засухи происходит засоление изначально плодородных почв (каштановых и черноземов) (Энциклопедия Саратовского края, 2002). ЛПС, экспонированные О-специфическими цепями в экстраклеточное окружение, играют важную роль в процессах адаптации грамотрица-тельных бактерий к воздействию внешней среды (Rietschel et al., 1994). Поэтому изучение поверхности аборигенных штаммов азоспирилл (как наиболее приспособленных к таким особенностям климата) является необходимым в свете возможного их применения для создания микробных удобрений, эффективных в условиях Нижнего Поволжья.

Исследование ЛПС методом электрофореза в ПААГ показало, что они представляют собой гетерогенные по длине ОПС популяции молекул. В препаратах ЛПСб!«, ЛПСб27 и JinCSRi5 молекулы с длинными и короткими О-цепями присутствуют приблизительно в равном количестве, в JlIICspjo7 и

ЛПСмкоа преобладают длинноцепочечные ОПС, тогда как в ЛПСз^ доминируют короткоцепочечные формы с высокой скоростью миграции в геле.

Данные, отраженные в электрофоретическом профиле, коррелируют с результатами анализа биополимерного состава ЛПС, который, в целом, типичен для гликополимеров этого класса. Наибольшее содержание углеводов выявлено в ЛПС5рю7 (50.9 %), далее оно убывает в ряду ЛПСк02оа - ЛПС5[ш - ïïnCSRi5 -ЛГ1Сз27 - ЛПС5й8 - ЛПС5к55 (37.4 - 14.8 %). Во всех препаратах идентифицирована КДО (1.3-2.8 %), в корово-липидной (как показали дальнейшие исследования) области ЛПСЖ8, ЛПСбки и ЛГО^мб содержится фосфор (0.9-3.3 %). В ЛПСЖ15 обнаружено нехарактерно высокое количество белка (5.4 %), тогда как в остальных препаратах оно не превышает 1 %.

Все исследуемые в рамках данной работы ЛПС имеют характерные для азоспирилл профили ЖК. В разных соотношениях в них присутствуют 3-гидрокситетрадекановая (3-ОН-С14:о), гексадекановая (С^о), 3-гидроксигексадекановая (3-OH-Ci6o) и октадеценовая кислоты (C18:i). В составе ЛПС большинства штаммов также обнаружена нанодекановая кислота (Ci9.o)> а ЛПС3!Ш к тому же содержит дидекановую (С120). 3-гидроксидидекановую (З-ОН-С^о) и гексадеценовую (C]6 i) ЖК. В ЛПС большинства исследованных штаммов азоспирилл суммарное количество гид-роксикислот составляет от 50 до 73 %, что согласуется с данными, полученными дня других грамотрицательных бактерий (Красикова с соавт., 1989). Исключением является ЛПСЛО20а. в котором наблюдается соотношение гидрокси-кислоты : непредельные : предельные ЖК - 28:1:1. В настоящее время установлена структура липида А только одного штамма азоспирилл - A. lipoferum SpBrl7 (Chôma and Komaniecka, 2008), и, учитывая известные представления о консервативности липида А в пределах рода бактерий, можно предположить, что лишь небольшая часть в составе макромолекул ЛПСяогоа имеет вторичные ацильные заместители, представленные Ci6:o и С18:ь В липидах А большинства изучаемых штаммов азоспирилл количество непредельных кислот преобладает над предельными, тогда как в ЛПСв27 и ЛПСКС2оа содержание Cjs.i и С)б.о приблизительно одинаковое (штаммы S27 и RG20a изолированы из почв в зонах с

тропическим и субтропическим климатом). В ЛПС бактерий, выделенных в Саратовской области, доминирование непредельных ЖК, возможно, связано с приспособлением микроорганизмов к выживанию в неблагоприятных условиях резкоконтинентального климата.

Таким образом, нами получены препараты ЛПС семи штаммов азоспи-рилл, которые различаются по содержанию углеводов, КДО, фосфорсодержащих заместителей, а также по соотношению ЖК в липидах А. Известно, что структура гидрофобного компонента молекулы определяет токсичность ЛПС, тогда как полисахаридный участок несет антигенные детерминанты. Явление корреляции серологического родства бактерий и продукции сходных по строению полисахаридных антигенов часто применяют при сравнительных исследованиях гликополимеров. Поэтому следующий раздел нашей работы посвящен определению места исследуемых штаммов в серологической классификации азоспирилл.

Иммунохимическое исследование липополисахаридов

ЛПС представляют собой термостабильные антигены поверхности клеток грамотрицательных бактерий. Для выявления серологической принадлежности исследуемых штаммов к серогруппам I или II (Коннова, 2006) мы получили по-ликлональные АТ, специфичные к ЛПС бактерий А. ЬгазНете 81155 и Б17, а также использовали ранее полученные АТ на препараты ЛПСквсь ЛПС$Р7, ЛПС$р59ь и клетки А. ЬгазИете 8р245, обработанные глутаровым альдегидом. Из перечисленных АТ только АТ$Р245 образуют преципитат с группой полимеров - ЛПС827, ЛПСкШо, ЛПСзр,о7, ЛПС8р245 и ЛПС5Ю5 (рис. 1А). При этом ЛПСзрю? и ЛПС827 обнаруживают по две полосы преципитации с АТ5Р245, а ЛПСкогоа и ЛПС8К15 - только по одной из полос, соответствующих разным антигенным детерминантам, что может быть связано с меньшим экспонированием второго эпигопа, а также с некоторыми различиями в их структуре. При этом преципитация ЛПС5ш5 АТб^э наблюдается только при четырехкратном увеличении концентрации препарата по сравнению с ЛПС других штаммов.

В составе ЛПСзмз и ЛПСква при взаимодействии как с АТ$ц55, так и с АТквс! выявляется, как минимум, по две общие антигенные детерминанты, при этом ЛПСквс1 имеет собственный антиген (рис. 1Б, В), соответствующий индивидуальной полосе в иммунодиффузии. С АТква взаимодействуют ЛПС ранее отнесенных к серогруппе II штаммов А. ЬгаьНеже Бр7 и С«3. Наблюдается также преципитация АТ8р7 ЛПС-содержащими экстрактами из клеток А. ЪгавМете 8Я80 и 81155 (рис. 1Г). Мы предполагаем, что присутствующие в них антигены имеют более низкую молекулярную массу и устраняются на этапе гель-фильтрации экстрактов, так как очищенные ЛПСб^ и ЛПСзяао сродства к АТ5р7 не проявляют.

На основании полученных данных штаммы А. ЬгаяИете 827, 8р107, БЯ15 и А. Цро/егит 1Ю20а отнесены к серогруппе 1, в которую входят также штаммы Бр245 и 81175 (Коннова, 2006). Бактерии А. ЪгахИете 81155 и 81180 включены в серогруппу II, которая объединяет А. ЬгазИете Сс1, 8р7, А. Нро/егит 8р59Ь и

А. пакете КВС1 (Коннова, 2006). Так как в ОПС всех перечисленных штаммов серогруппы I содержатся остатки Б-рамнозы (Б-Ют), а в ОПС бактерий серо-группы II - Ь-рамнозы (Ь-ЯЬа) и Б-галактозы (0-Са1), мы предполагаем, что именно эти моносахариды могут являться ключевыми для узнавания АТ представителей соответствующих серогрупп. ЛПС8яз не даёт серологических перекрестов с ЛПС других штаммов азоспирилл, следовательно, бактерии А. Ъгазйете 8Я8 могут быть выделены в отдельную серогруппу. Ранее отсутствие взаимодействия с АТ, специфичными к ЛПС бактерий обеих серогрупп, показано для ЛГ1С517, у которого установлено наличие двух ОПС с уникальными структурами повторяющихся звеньев (Реёопепко е/ а!., 2008).

Spl07

Sp245

S27 i« AT,fSe IRIJ

SR80 AT

|РГ

? ; SR55J

■ ■

|vBCl KBCl/fr,

шШ

SR8

SR55

о ojio о о

о о о ою

S17

OIO/IO

Рис. 1. Двойная радиальная иммуноднффузия: в периферических лунках находятся антигены - ЛПС тестируемых штаммов азоспирилл, в центральных - ATsp245 (А), ATkbci (Б), ATsrjs (В), ATsP7 (Г). Под фотографиями представлены соответствующие им схемы серологических перекрестов.

Полученные нами ATSn взаимодействия с ЛПС исследуемых штаммов азоспирилл, в том числе и с ЛПСзяв, не обнаруживают, что подтверждает их высокую специфичность. Однако ATSn выявляют общие антигенные детерминанты в ЛПС$Р7 и ЛПСсс! (рис. 2), которые в ЛПС8п содержатся в очень небольшом количестве (ATsn не дают с ЛПСяп аналогичной полосы преципитации, но имеются искривления полос в сторону лунки с OJ0 О ЛПС517). ЛПС5р7 и jmCsn при взаимодействии с

ATsn образуют шпору, что свидетельствует о некоторых различиях в составе соответствующих антигенных детерминант.

Таким образом, результаты серологических исследований препаратов ЛПС азоспирилл позволяют дополнить серогруппу I микроорганизмами А. brasilense Spl07, S27, SRI 5 и А. lipoferum RG20a, а серогруппу II - А. brasilense SR55 и SR80.

О vO

CT о

Рис. 2. Образование полос преципитации ATsn с

mcsi7, nncSp7 и mccd.

Поскольку применяемые АТ являются поликлональными, мы можем только предполагать наличие общих структурных фрагментов в полисахарид-ных цепях серологически близких штаммов. Поэтому следующий этап нашей работы посвящен выяснению химической основы серологического родства разных штаммов азоспирилл, а также исследованию ОПС бактерий, проявивших серологическую индивидуальность (А. ЪгстПете 8118).

Исследование структур О-специфических полисахаридов азоспирилл

ОПС с выходами от 15.7 до 43 % были получены в процессе мягкого кислотного гидролиза ЛПС и последующей хроматографической очистки водорастворимой фракции гидролизата. С целью установления полной структуры повторяющихся звеньев для каждого из исследованных ОПС определяли состав и абсолютные конфигурации, положения замещения и последовательность расположения моносахаридов в цепи. Для уточнения структуры ОПСзвдо и ОПСзюз препараты подвергали периодатному окислению.

С применением методов ГЖХ, ГЖХ-МС и ЯМР-спектроскопии (см. раздел «Материалы и методы») установлено, что единственным компонентом ОПС5р)07, ОПСзли, ОПСб27 и ОПСмиоа является О-Юи в пиранозной форме, которая замещена во втором либо в третьем положениях в соотношениях 3:1 (в ОПС8ш5) и 3:2 (в ОПСвг?, ОПС8р107 и ОПСквго*)- На основании этих данных сделан вывод о линейной структуре исследуемых ОПС, а также показано существование отличий в размере повторяющихся звеньев азоспирилл в пределах се-рогруппы 1.

13С-ЯМР-спектры ОПСбрют, ОПСэ27 и ОПСкс20а идентичны друг другу и соответствующим спектрам исследованных ранее ОПС$р245 и ОПСбют (Федо-ненко с соавт., 2005). В них присутствуют сигналы метальных групп (С6) пяти остатков ИЬа, пяти аномерных атомов углерода (С1) и двадцати вторичных углеродных атомов моносахаридных циклов (рис. ЗА). 'Н-ЯМР-спектры этих полимеров также идентичны и содержат сигналы пяти метальных групп (Н6), пяти аномерных протонов (Н1) и остальных протонов. Таким образом, повторяющиеся звенья ОПСБрю?, ОПС827 и ОПСц.о20а представлены линейными пентарамна-нами:

Можно предположить, что выявленные серологические отличия идентичных по структуре ОПС препаратов ЛПСя02оа, ЛПСбрю? и ЛПС527 являются следствием конформационных различий молекул, связанных с разнообразием ацильных заместителей в липидах А и степенью полимеризации ОПС.

Анализ ЯМР-спекгров ОПСвян (рис. ЗБ) покаывает, что он тоже является Б-рамнаном, но с тетрасахаридным повторяющимся звеном:

RhaC6

Сигналы моносахаридных

циклов Rha

RbaCl

110 100 90 80 70 60 SO 40 30 20 М.Д.

RhaC6

Сигналы моносахаридных циклов Rha

ОгаС5

ОгаСЗ

А1аС2 „

RhaCl I °mC4

flUlÍL^ilI

175 100 90 80 70 60 50 40 30 20 м.д. Рис. 3.13С-ЯМР-спектры ОПС азоспирилл серогруппы I: А - ОПС|«з2оа; В - OnCsRij.

УаСЗ

Отсутствие одного остатка 3-замещенной D-Rha в OIICsris является наиболее вероятной причиной его низкой активности в серологических экспериментах с ATSp245> так как известно, что комплекс антиген-АТ тем прочнее, чем точнее соответствуют конформации взаимодействующих участков молекул.

В ЯМР-спектрах OIICsris, помимо сигналов моносахаридных остатков, выделяются две спиновые системы, соответствующие замещенным остаткам аминокислот - орнитина (Огп) и аланина (Ala) (рис. ЗБ). Обнаруженное соединение идентифицировано как Ns-( 1 -карбоксизтил)-орнитин, который в комплексе с бактериальным полисахаридом выявлен впервые. Его присутствие, по-видимому, объясняет высокую концентрацию «белка» (5.4 %), показанную методом Бредфорд в JIIICsRi5- Изомер М5-(1-карбоксиэтил)-орнитина №-(1-карбоксиэтил)-орнигин (окгопиновая кислота) выделяется опухолевыми тканями растений в ходе взаимодействия с фитопатогеном Agrobacterium tumefaciens (Hack and Kemp, 1977). Присутствие подобного компонента является ивдиви-

дуальной особенностью штамма Л. brasilense SRI 5 и, вероятно, связано с какими-то условиями его существования.

Распад по Смиту OÜCsru, проведенный для выяснения природы N5-(l-карбоксиэтил)-орнитина, показал, что он не полимеризован. Возможно, это соединение за счёт каких-либо физико-химических взаимодействий достаточно прочно ассоциировано с OIICsris, но однозначно можно утверждать, что структурным компонентом повторяющегося звена оно не является.

Для доказательства определяющей роли D-Rha в формировании структуры иммунодоминантных эпитопов на поверхности бактерий, отнесенных к се-рогруппе I, проведены эксперименты по йнгибированию взаимодействия ATSp245 С JinCsRis, jmcsp245, ЛПС5Ю5 и ЛПСКО20а- Методом иммунодиффузии обнаружено, что ингибирующую активность проявляют гомологичные ОПС и препарат D-Rha, который получен по методике, разработанной сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (Смолькина и др., неопубликованные данные). При этом коммерческие препараты L-Rha и D-Gal преципитацию не подавляют.

Абсолютные конфигурации моносахаридных остатков оказались значимым фактором и для реализации процесса взаимодействия OnCsP245 с эндолек-тином, изолированным из дикариотического мицелия ксилотрофного гриба Grifóla frondosa 0917. В ходе работы, проведенной совместно с сотрудниками лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН, установлена способность ОПС8р245 в концентрации 13.9 мкг/мл ингибировать связывание лектина с нативными эритроцитами кролика. L-Rha подобного действия не оказывает. Полученные результаты позволяют говорить о возможном участии ЛПС азоспирилл серогруп-пы I во взаимодействии с рамнозоспецифичными лектинами разных организмов. Это предположение согласуется с данными (Stepanova et al., 2008), которые показывают, что присутствие азоспирилл в среде культивирования G. frondosa 0917 ускоряет рост мицелия и образование примордиев, а также вызывает изменение морфологии гриба. В свою очередь, добавление лектинов G. frondosa 0917 в среду роста азоспирилл уменьшает подвижность бактерий (Степанова, 2008). Таким образом, обнаруженные факты свидетельствуют о возможности участия ЛПС в коммуникации азоспирилл с другими почвенными организмами за счёт углевод-белковых взаимодействий.

У азоспирилл многие гены, вовлеченные в ассоциативные взаимоотношения (в частности, ответственные за синтез полисахаридов поверхности клетки), расположены в плазмидах. Переход «симбиотических» генов в экстрахромосомное состояние повышает вероятность их модификации или утраты на сапрофитной стадии жизненного цикла бактерии без видимых изменений жизнеспособности. В свете изучения активности ЛПС азоспирилл в отношении корней растения интересным представляется исследование состава и структуры повторяющегося звена ОПС спонтанного мутанта Л. brasilense Sp245.5, предоставленного сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН. Плазмидные перестройки мутанта ассоциируются со значительными из-

менениями в синтезе полисахаридов клеточной поверхности, в том числе ЛПС (Кацы с соавт., 2002; Matora et al., 1990).

Нами показано, что в JinCSp24S5 (выход 3.1 %) содержится 12.5 % углеводов, 0.8 % белка и 2.3 % КДО, а элекгрофореграмма свидетельствует о присутствии длинноцепочечных форм молекул, различающихся по количеству повторяющихся звеньев. От описанных ранее препаратов ЛПС мутанта отличает меньшая прочность связи между остатками КДО и D-GlcN липида А, а также присутствие в гидрофобном компоненте молекулы, помимо характеристических ЖК, пентадекановой кислоты (2.1 %) и двух неидентифицированных ЖК, суммарное количество которых достигает 19 %.

С применением перечисленных ранее методов исследования полисахаридов нами установлена уникальная структура повторяющегося звена OnCsP24s.5> состоящего из 2-ацетамидо-2-дезокси-0-галакгозы (D-GalpNAc) и 2-ацетамидо-2-дезокси-0-маннуроновой кислоты (D-ManpNAcA):

—6>p-D-Gal^N Ас-( 1 —>4)-a-D-Man/?NAcA-( 1 —

Таким образом, мутант A. brasilense Sp245.5 имеет другой моносахарид-ный состав и меньший размер повторяющегося звена ОПС, чем кардинальным образом отличается от родительского штамма A. brasilense Sp245. Предполагается, что потеря способности к синтезу рамнана и биосинтез иного ОПС является результатом адаптации бактерий к новым условиям существования.

В составе ОПС всех представителей серогруппы II, структуры которых установлены ранее сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН, обнаружены L-Rha и D-Gal. В OnCsRso и OnCsRss методом ГЖХ нами также идентифицированы эти моносахариды. Последующим анализом методом ГЖХ-МС в OnCSR55, кроме того, выявлены 3-0-метилрамноза (З-0-Me-Rha) и D-глюкуроновая кислота (D-GlcA). Конновой с соавторами (1995) отмечалось большое содержание ее эпимерной формы - D-галактуроновой кислоты в кал-сульных полисахаридах бактерий рода Azospirillum. Присутствие уроновой кислоты в составе ОПС азоспирилл впервые показано в настоящей работе. С помощью методов метилирования и ЯМР-спектроскопии установлено, что структурной единицей OnCsRss является разветвленный восьмичленный гетерооли-госахарид следующей структуры:

2 t 1

a-D-GIcAp

Такое длинное повторяющееся звено для полисахаридов азоспирилл показано впервые.

Методами ГЖХ и ГЖХ-МС в составе OnCSR8o выявлено преобладание D-Gal, представленной 3-замещенным, 4-замещенным и 2,3-дизамещенным остатками. Кроме того, в препарате обнаружены 3,4-дизамещенная и терминальная L-фукоза (L-Fuc), терминальная L-Rha и 3-замещенная D-GalNAc. Посколь-

ку при расшифровке первичной структуры ОПС5я8о возникли затруднения, мы провели деградацию по Смиту. Анализ спектров полученных продуктов позволил установить наличие в составе ОЖ^о двух повторяющихся звеньев со структурами I и II:

а-Ь-Риср

-*3)-р-0-СаШАср-( 1 —>3)-а-1>Оа!рЧ 1 -*3)-р-0-0а1/Н 1 -»

II а-Ь-ЯЬар

—>4>а-ЬГиср-(1—>4>р-0-Са1р(1-^

Это второй случай идентификации у азоспирилл двух различных олигоса-харидных фрагментов в составе ОПС. Аналогичное явление было установлено Федоненко с соавторами (2008) для штамма Л. ЬгазПете 817, изолированного с корней жемчужного проса в Индии. Для обоих штаммов остается неясным, входят ли эти структуры в состав одной О-специфической цепи в виде отдельных блоков либо представляют собой два самостоятельных ОПС.

В составе ОПСзяв обнаружены Ь-ВДа, Б-глюкоза (Б-вк), 2-ацетамидо-2-дезокси-Б-глюкоза (0-С1сЫАс) в соотношении -7:4:1. Анализ частично метилированных ацетатов полиолов методом ГЖХ-МС показал, что в ОПСэкз содержатся остатки 2- и 4-замещенных Ь-Юш, терминальных Б-С1с и 0-С1сЫАс, 3,4-дизамещенной Ь-Шш, а также терминальной гептозы. Следовательно, ОПСбм является разветвленным гетерополисахаридом с 3,4-дизамещенной Юга в точке ветвления. Однако на данном этапе работы нам не удалось расшифровать структуру ОПСбя8 вследствие его гетерогенности. Данные ЯМР-анализа позволяют говорить либо о чередовании в цепи достаточно больших фрагментов с индивидуальными повторяющимися звеньями (наличие сложной регулярности), либо о нерегулярном строении полисахарида. Возможно, такая структура гликана является адаптационной особенностью конкретного штамма для узнавания широкого круга растений-хозяев.

Таким образом, нами установлены структуры ОПС семи штаммов азоспирилл и получено химическое обоснование разделения этих бактерий и ранее исследованных штаммов азоспирилл на две серогруппы. Обнаружено, что имму-нодоминантные эпитопы О-ангигенов бактерий, отнесенных к серогруппе I, представлены олигомерами Б-ВДа. Выявлено, что ОПС всех азоспирилл, отнесенных к серогруппе II, являются разветвленными гетерополисахаридами, в составе которых присутствуют остатки Ъ-Юга и Б-Са1. Этот факт подтверждает наше предположение о важности данных Сахаров в процессах узнавания АТ антигенов серогруппы II. Серологическая индивидуальность ЛПС5я8, очевидно, объясняется отсутствием Б-ва!, а также характером замещения Ь-И1а, ее локализацией в цепи или иной аномерной конфигурацией связи.

Поскольку Ь-Шт и В-Са1 в составе ЛПС азоспирилл серогруппы II определяют специфичность взаимодействия антиген/АТ, справедливо предполо-

жить, что и в ризосфере они доступны для узнавания. На поверхности азоспи-рилл идентифицированы лектины, специфичные к L-Rha, D-Gal и моносахаридам, занимающим терминальное положение в OIICsrss и OÜCsrso - D-GlcA и L-Fuc (Никитина с соавт., 1994). Следовательно, не исключена роль этих остатков в процессах агрегации и флокуляции бактериальных клеток. Никитиной с соавторами (2001) отмечено затруднение преципитации изолированного ЛПС бактериальными лектинами. Это может быть связано с формированием при растворении ЛПС достаточно крупных мицелл, в которых между ОПС отдельных молекул образуются водородные связи, что уменьшает доступность специфических гаптенов. Тем не менее, (с учетом результатов, полученных для азоспирилл - см. выше) вполне справедливо предположить участие этих молекул в контактных взаимодействиях как внутри вида, так и в межвидовой коммуникации бактерий с организмами, населяющими ризосферу, в том числе за счет углевод-белковых взаимодействий.

Богатые Rha полисахариды часто встречаются на поверхности бактерий-фитопатогенов, а также необходимы ризобиям для процесса нодуляции (Здоро-венко с соавт., 2007; Broughton et al., 2006). ЛПС эндофигных бактерий А. Ьга-silense Sp245, вызывающий усиление синтеза белков апопласта пшеницы (Matara et al., 1995), содержит рамнановую О-специфическую цепь. В полисахаридах большинства штаммов азоспирилл, колонизирующих поверхность корня, также присутствует Rha в D- или L-форме. Возможно, этот сахар играет определенную роль и в процессе формирования ассоциации в экзоризосфере. В последующих экспериментах мы исследуем активность ЛПС азоспирилл разных серогрупп в отношении растений пшеницы.

Исследование участия липополисахаридов в начальных стадиях формирования ассоциации

ЛПС отводится важная роль в реализации растительно-микробных взаимодействий. При контакте патогенных и симбиотических бактерий с хозяином ЛПС уменьшают проницаемость мембраны для выделяемых растением реакционноспособных соединений: фитоалексинов и белков, в том числе ферментов (Newman et al., 2007). В данном разделе работы исследован вклад ЛПС различной структуры в адсорбцию азоспирилл, а также выполнено сравнительное изучение способности ЛПС индуцировать деформации корневых волосков проростков пшеницы.

В качестве контроля наблюдали корни проростков в среде Фареуса без ЛПС. При инкубации 2-х суточных проростков пшеницы с ЛПС (125 мкг/мл) формируются различные деформации корневых волосков (рис. 4), среди которых преобладают несимметричные раздвоения (рис. 4Б). Под действием ЛПС5К8 и ЛПС$27 волоски ветвятся одновременно в нескольких точках (рис. 4В). Примечательно, что бактерии A. brasilense S27 и SR8, в отличие от остальных используемых в работе штаммов, выделены не из ризосферы пшеницы.

¡r

: волосков проро-

"Г

А Б

Рис. 4. Корневые волоски с нормальной морфологией (А) и виды деформаций, возникающие под влиянием ЛПС (Б, В).

Индуцирующая активность препаратов возрастала в ряду ЛПС827 < JinCSR55 < JiriC'sRs = jmCsRso < JinCRG20a (рис. 5) Несмотря на сходное строение повторяющихся звеньев ОПС, ЛПС527, ЛПСяогоа и ЛПСяи5 различались по интенсивности воздействия на морфологию корневых волосков проростков. При этом ЛПС827 и ранее протестированный ЛПС8Р245 (Федоненко с соавт., 2001), имеющие сходные электрофорети-ческие профили и имму-нохимические свойства, по эффективности влияния на корневые волоски оказались практически одинаковыми.

Возможно, одной из причин наблюдаемых различий активности исследуемых штаммов серогруппы I является то, что ОПС в зависимости от длины цепи в той или иной мере может экранировать специфические сайты связывания во избежание их преждевременного «узнавания» макропартнером. По мнению Косен-ко с соавторами (2004), такой механизм реализуется при формировании бобово-

ризобиального симбиоза. Показано, что с увеличением длины ОПС Xanthomonas campestris pv. campestris возрастает скручивание молекулы ЛПС, и это положительно коррелирует с повышением эффективности подавления реакции гиперчувствительности Arabidopsis thaliana (Newman et al., 2007).

В случае с A. brasílense SR 15 возможна реализация отличного от других штаммов механизма взаимодействия с растением, который может быть связан с присутствием ассоциированного с ЛПСЖ15 опина - N5-( 1 -карбоксиэтил)-орнитина. Кроме того, эти бактерии имеют существенные отличия в составе гликополимеров капсулы. Показано, что капсульные липополисахарид-белковые комплексы Л. brasilense SRI5, в отличие от препаратов других штам-

ШСерогруппа!

KCeporpynnall

М Контроль

Рис. 5. Диаграмма активности ЛПС азоспирилл в отношении морфологии корневых волосков проростков пшеницы.

мов азоспирилл, способны вызывать агглютинацию трипсинизированных эритроцитов кролика (Конновас соавт., 1995).

Биологические свойства ЛПС также зависят от состава и соотношения ЖК в гидрофобном участке молекулы (Кле15сЬе1 е( а/., 1994). Для ЛПСиозоа, ЛПС52? и ЛПСвян прослеживается корреляция активности в отношении морфологии корневых волосков с количеством гидроксикислот в липидах А. Их содержание у вызывающего наибольшее число деформаций ЛПСкс20а> как упоминалось выше, составляет 92 %. В ЛПС5Ю5, индифферентном в отношении корней проростков пшеницы, разница между количеством гидроксикислот и других ЖК (предельных и непредельных) оказывается незначительной (соотношение составляет 4:1:2.5). Кроме того, липид А А. ЬгахПеюе БШб содержит ЖК с двенадцатью атомами углерода в цепи.

Для ЛПСзмо, ЛПСбкз и ЛПСзк^, ОПС которых представлены гетерополи-сахаридами, не выявляется четкой зависимости активности от соотношения ацильных заместителей в липидах А. Вероятно, у каждого штамма бактерий состояние мембраны, определяемое характером и количеством ЖК, является оптимальным для жизнедеятельности в соответствующих условиях среды, в том числе и при контакте с растением.

В случае ЛПСвя8, ЛИСв^ и ЛПСЖ80 возможна определенная роль различных заместителей полисахаридных цепей в адаптации к тому или иному виду растения-хозяина и в связи с этим реализация различных механизмов коммуникации с растительными клетками. Так, Фишер с соавторами (2003) обнаружены изменения в моносахаридном составе ЛПС бактерий А. ЪгааИете С<1, первоначально изолированных из ризосферы свинороя пальчатого, под влиянием корневых экссудатов растений пшеницы. Возможно, встраивание боковых заместителей О-цепи происходит на более поздних стадиях биосинтеза как модификация с целью приспособления к условиям среды, в частности, в ответ на действие сигнальных молекул определенного растения. Наличие такого механизма предполагается для псевдомонад (Здоровенко с соавт., 2007), а также показано для Кос1-факгоров ризобий (Проворов и Тихонович, 2007).

У азоспирилл не наблюдается строгой приуроченности к колонизации определенного вида растений, поэтому присутствие разных боковых заместителей на фоне высокого содержания Ь-ЯЬа в ОПСвяв, возможно, позволяет бактериям А. ЬгайИете 8118 эффективно взаимодействовать с широким кругом хозяев, о чем свидетельствует активность препарата ЛПСзвд в отношении корней проростков пшеницы. Кроме того, наличие в терминальном положении остатков Б-ИсЫАс позволяет предположить участие ОПС5л8 во взаимодействии с агглютинином зародышей пшеницы.

Терминальные остатки Юш и Рис ОПСяио могут участвовать в узнавании и индукции ответной реакции макросимбионта. Поскольку Рис встречается в муцигелях большинства растений (Яоу е! а!., 2002), с наличием этого моносахарида в составе поверхностных полимеров бактерий связывают проявление мимикрии для преодоления иммунной защиты растения-хозяина. Очевидна роль Б-С1сА наряду с фосфатными группами коровою олигосахарида в формирова-

нии повышенной плотности отрицательного заряда на углеводном компоненте JinCsRi5, что определяет конформацию молекулы и влияет на ответную реакцию растительного организма, как это показано для Xanthomonas campestris (Silipo et al., 2005). В то же время метилирование одного из остатков L-Rha может обеспечивать реализацию тесного контакта JIFICsrss с клетками растений за счет гидрофобных взаимодействий, как это описано для ризобий (Kannenberg and Carlson, 2001);

Таким образом, в результате проведенных экспериментов выявлена разная активность ЛПС, отличных по моносахаридному составу и соотношению ЖК. Мы предполагаем, что для полимеров с идентичной структурой повторяющихся звеньев определяющим критерием интенсивности воздействия является конформация молекулы, обусловленная соотношением аципьных остатков в липиде А и длиной полисахаридной цепи. При наличии боковых цепей в ОПС необходимо также учитывать характер терминальных заместителей, которые, благодаря своему положению, могут вступать в непосредственный контакт с поверхностными структурами клеток растений и принимать участие в инициации ответной реакции макрохозяина.

Адсорбция - один из начальных этапов взаимодействия азоспирилл с корнями растений. Мы обратились к исследованию роли ЛПС в адсорбции бактерий A. brasilense SR55 и SR8, ОПС которых представлены разветвленными гетерополисахаридами, отличными по моносахаридному составу и структуре. Интересно, что в ЛПС обоих штаммов присутствуют сахара, характерные для полисахаридсодержащих материалов капсулы, а именно уроновая кислота CJmCSR55) и глюкозамин (ЛПСда).

В случае участия ЛПС в процессе специфической адсорбции мы ожидали уменьшения количества клеток, прикрепившихся к корням, предобработанным раствором соответствующего полимера в концентрации 1 мг/мл. Однако предобработка корней HIICsRg не приводила к изменению количества адсорбированных клеток A. brasilense SR8, а в экспериментах с A. brasilense SR55 показано достоверное увеличение колониеобразующих единиц (КОЕ) (на 17 %) при высевах из суспензии корней, обработанных ЛПСзм5- Мы предположили, что ЛПС8К55 способен вызывать агрегацию бактерий, а это может повышать количество КОЕ при подсчете за счет клеток, не связанных с поверхностью корня, и маскировать эффект ингибирования адсорбции. Однако проведенные эксперименты показали, что ЛПС5М5 в концентрациях от 1 мкг до 1 мг/мл не стимулирует агрегацию бактерий A. brasilense SR55.

В поисках причин повышения количества адсорбированных клеток после обработки корней ЛПСзгм мы обратились к исследованию таксиса бактерий к ЛПС. Бактерии инокулировали в полужидкий агар, содержащий в качестве единственного источника углерода ЛПС8К55 (1 мг/мл), и через 36 ч наблюдали образование хемотаксических колец (d 18.0 + 4.3 мм), что свидетельствует о наличии таксиса микроорганизмов к препарату (рис. 6). Бактерии A. brasilense Sp245, собственный ЛПС которых характеризуется иной структурой полисаха-ридного компонента, на среде с ЛПС8л55 также формируют хемотаксические

кольца (d 31.6 ± 4.8 мм). Поскольку выбранный метод (Adler, 1966) предполагает, что при росте на среде с аттрактантом бактерии создают его градиент в процессе потребления, мы предполагаем, что в условиях отсутствия иных источников углерода азоспи-риллы способны утилизировать ЛПС. Это может являться одним из механизмов переживания неблагоприятных условий существования бактерий и свидетельствует о высокой мобильности ферментативной системы азоспирилл, что дает им некоторые преимущества в условиях естественной конкуренции.

Возможно, после предобработки корней раствором полимера, его молекулы связываются с поверхностью и привлекают азоспирилл, тем самым стимулируя прикрепление бактерий к корню.

Нужно отметить, что ранее показано участие капсульных полисахаридов бактерий А. brasilense SR80 и Sp245 в адсорбции клеток на корнях пшеницы (Егоренкова с соавт., 2001). После предобработки проростков ЛПС-содержащим экстрактом из клеток А. brasilense Sp245 количество адсорбированных бактерий на корнях возрастало (Matora et al., 1995). При этом как в полисахаридах капсулы, так и в ЛПС А. brasilense Sp245 преобладающим сахаром является D-Rha. Моносахаридный состав препаратов .IinCsRss и ЛПС5и8 отличается от ЛПС§р245 большим разнообразием, различна и структура повторяющихся звеньев ОПС, каждая из которых характеризуется наличием собственных детерминант, доступных для контактных взаимодействий с эукариотическими и бактериальными клетками.

Итак, в данном разделе работы выявлено наличие таксиса микроорганизмов А. brasilense SR55 и Sp245 к ЛПС$К55, ОПС которого является разветвленным гетерополисахаридом. Кроме того, обнаружена зависимость активности ЛПС азоспирилл с D-рамнановым повторяющимся звеном ОПС (серогруппа I) от соотношения ацильных заместителей в липидах А. Для штаммов азоспирилл, ОПС которых различаются по структуре, подобной корреляции не наблюдается. В данном случае возможна реализация разных механизмов коммуникации с растением, которые зависят, в том числе, от характера моносахаридных заместителей цепи ОПС.

Рис. 6. Трофический хемотаксис азоспирилл: А -А. ЬгазНеюе 8Я55 на среде с ЛПСзмз; Б-А. ЬгазИете 8р245 на среде с ЛПСзюз; В -А. ЬгавИете 8К55 на среде с декстраном (10 кДа). Стрелками обозначена ширина хемотаксических колец (<1).

ВЫВОДЫ

1. Показано, что О-специфические полисахариды бактерий штаммов A. brasilense Spl07, S27 и A. lipo/erum RG20a представлены линейными гомопо-лимерами, повторяющиеся звенья которых построены из пяти остатков D-рамнозы. Повторяющееся звено О-цепиЛ. brasilense SRI 5 отличается от них отсутствием 3-замещенного остатка D-рамнозы и наличием прочно ассоциированного N5-( 1 -карбоксиэтил)-орнитина, который в комплексе с бактериальным полисахаридом обнаружен впервые.

2. Впервые установлено, что повторяющееся звено О-специфического полисахарида А. brasilense SR55 является разветвленным гетерооктасахаридом с D-глюкуроновой кислотой в боковой цепи, а в О-специфическом полисахариде бактерий А. brasilense SR80 содержится два типа повторяющихся звеньев, различных по структуре.

3. На основании присутствия в липополисахаридах общих антигенных детерминант - олигомеров D-рамнозы - бактерии А. brasilense Spl07, S27, SR15 и A. lipoferum RG20a включены в состав серогруппы I. Бактерии A. brasilense SR55 и SR80 отнесены к серогруппе II на основании наличия в О-ангигенах общих иммунодоминантных эгаггопов, в состав которых, очевидно, входят остатки L-рамнозы и D-галактозы. Бактерии A. brasilense SR8 выделены в отдельную серогруппу.

4. Впервые обнаружено, что у мутанта A. brasilense Sp245.5, образовавшегося в результате спонтанных изменений в геноме бактерий A. brasilense Sp245, происходит утрата способности к синтезу рамнана и осуществляется биосинтез О-специфического полисахарида иной уникальной структуры.

5. Выявлено, что на активность липополисахаридов азоспирилл серогруппы I в отношении морфологии корневых волосков проростков пшеницы оказывают влияние соотношение жирных кислот, длина О-цепей, а для липополисахаридов с разветвленными гетероолигосахаридными повторяющимися звеньями О-специфических полисахаридов - характер терминальных моносахаридов.

6. Показана способность A. brasilense SR55 и Sp245 к трофическому таксису при выращивании на среде с липополисахаридом бактерий A. brasilense SR55 в качестве единственного источника углерода.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

* - публикация в изданиях перечня ВАК

1) Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Boyko A.S., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Immunochemical characterization of the lipopolysaccharides from a group of Azospirillum brasilense strains // 2nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates. Rostock, Oct. 2006. - Rostock, 2006. - P. 25.

2) Бойко A.C., Бумагина 3.M., Коннова O.H., Федоненко Ю.П., Коннова С.А., Игнатов В.В. Характеристика липополисахарида Azospirillum brasilense SR55 II Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: сб. тез. IШ Межрегион. шк.-конф. мол. уч. Саратов, 10-12 окт. 2006. - Саратов, 2006. - С. 11.

3) Stepanova L.V., Nikitina V.E., Konnova S.A., Boyko A.S. Isolation and characterization of saline-soluble hemagglutinin from the hypha surface of the dicaryotic mycelium of the xylotrophic basidiomycete Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray strain 0917 // Abstr. XXIII Intern. Carbohydrate Symp. Whistler, Canada, July 23-28, 2006. - Whistler,

2006.-P. 424.

4) *Степанова Л.В., Никитина B.E., Бойко A.C. Выделение и характеристика лектина с поверхности мицелия Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray И Микробиология. -

2007. - T. 76, № 4. - С. 488-493.

5) Бойко А.С., Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова С.А., Игнатов В.В. Характеристика липополисахарида диазотрофных ризобактерий Azospirillum brasi-iense SR55II Изв. Сарат. ун-та. Сер. Химия. Биология. Экология. - 2007. - Т. 7, вып. 1. -С. 60-63.

6) Бойко А.С., Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова С.А. Игнатов В.В. Характеристика поверхностных гликополимеров ризобактерий Azospirillum brasilense SR55 и S17 // Биология - наука XXI века: сб. тез. / 10-я Пущинская шк.-конф. мол. уч. Пущино, 17-21 апр. 2006. - Пущино, 2006. - С. 183.

7) Бойко А.С., Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие полисахаридов бактерий рода Azospirillum в начальных стадиях колонизации корней пшеницы // Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиоти-ческих систем: сб. тез. / Всеросс. конф. с международ, участием. Саратов, 25-27 сент. 2007. - Саратов, 2007 - С. 60.

8) Fedonenko Yu.P., Boyko A.S., Konnova O.N., Konnova S.A., Ignatov V.V. Serological studies on the nitrogen-fixing bacteria Azospirillum spp. // 14th Europ. Carbohydrate Symp. Lubek, Germany, Sept. 2-7,2007. - Lubek, 2007. - P. 283.

9) Boyko A.S., Konnova O.N., Fedonenko Yu.P., Konnova S.A., Ignatov V.V. Structural and functional peculiarities of the LPS of A. brasilense SR55 at the early stages of wheat-root colonization // Evolution of plant-microbe interactions: vol. of abstr. / Meet, of the Research Consortium. Saint-Peterburg, Russia, June 25 - July 2, 2007. - Saint-Peterburg, 2007. - P. 49.

10) "Коннова O.H., Бойко A.C., Бурыгин Г.Л., Федоненко Ю.П, Матора Л.Ю., Коннова С.А., Игнатов В.В. Химические и серологические исследования липополиса-харидов бактерий рода Azospirillum II Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 3, -С. 350-357.

11) Бойко А.С., Федоненко Ю.П., Коннова О.Н., Коннова С.А., Игнатов В.В. Характеристика липополисахаридов азоспирилл I серогруппы // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: сб. тез. / IV Межрегион. конф. мол. уч. Саратов, 14-16 окт. 2008. - Саратов, 2008. - С. 47.

12) Федоненко Ю.П., Коннова О.Н., Бойко А.С., Коннова С.А., Игнатов В.В. Новые структуры О-полисахаридов азоспирилл // Там же. - С. 63.

13) Бойко А.С., Стрельникова-Ааб Е.Н., Смолькина О.Н. Состав липополисахарида ризобактерий Azospirillum brasilense SR8 и его активность в отношении корней проростков пшеницы // Исследования молодых ученых и студентов в биологии: сб. ст.-2009.-Вып. 6.-С. 10-13.

Подписано в печать 04.05.2009 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 120 экз. Заказ № 094.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бойко, Алевтина Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Взаимовыгодные растительно-бактериальные взаимодействия в ризосфере

1.2 Бактерии рода Azospirillum как удобная модель исследования механизма формирования ассоциации

1.3 Роль поверхностных структур бактериальной клетки на разных этапах формирования ассоциативного симбиоза

1.4 Гликополимеры бактериальной поверхности, участвующие в формировании растительно-микробной ассоциации

1.4.1 Состав и функции экзополисахаридов и полисахаридов капсулы азос-пирилл

1.4.2 Структурно-функциональная характеристика липополисахаридов бактерий рода Azospirillum

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Приборы и материалы

2.3 Методы исследования

2.3.1 Выделение липополисахаридов и О-специфических полисахаридов

2.3.2 Хроматографические методы

2.3.3 ЯМР-спектроскопия

2.3.4 Электрофорез в поляакриламидном геле

2.3.5 Химические методы исследования

2.3.6 Серологические методы исследования

2.3.7 Методы исследования биологической активности липополисахаридов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Сравнительный анализ биополимерного состава и жирных кислот липополи- 48 сахаридов

3.2 Иммунохимическое исследование липополисахаридов азоспирилл

3.3 Исследование структур повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов азоспирилл 61 3.3.1 Исследование структур повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов азоспирилл серогруппы I

3.3.2 Исследование структуры О-специфического полисахарида спонтанного мутанта Л. brasilense Sp245.

3.3.3 Исследование структур повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий A. brasilense SR8, SR55 и SR80 76 3.4 Исследование участия липополисахаридов в начальных стадиях формирования ассоциации

3.4.1 Исследование активности липополисахаридов в отношении корневых волосков проростков пшеницы

3.4.2 Исследование участия липополисахаридов в адсорбции азоспирилл на поверхности корней проростков пшеницы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные особенности липополисахаридов азоспирилл в связи с их участием в коммуникации микроорганизмов в ризосфере"

Актуальность проблемы. В процессе растительно-бактериального взаимодействия, а также в адаптации к условиям окружающей среды важнейшую роль играет поверхность клетки микроорганизма. Наружный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий содержит трехкомпонентные молекулы липополисахаридов (ЛПС), которые закреплены в ней при участии погруженных в фосфолипидный слой липидов А и экспонированы в окружающее пространство углеводными составляющими, представленными коровым олигосаха-ридом и О-специфическим полисахаридом (ОПС). Такое строение макромолекул ЛПС характерно для всех бактерий - комменсалов, мутуалистов и патогенов животных и растений.

Ключ к пониманию функций ЛПС в коммуникации микробов с другими организмами находится в первичной химической структуре макромолекул. В последнее время на примере ряда бактерий — ксантомонад, псевдомонад, агробактерий, ризобий — показано, что вариации в структуре корового олигосахарида и липидной части ЛПС могут быть связаны с различными типами взаимодействий, в которые эти бактерии вступают с растениями (Newman et al., 2007). Однако в большей степени структурный анализ ЛПС сфокусирован на ОПС, которые вследствие поверхностного расположения, вовлечены в процессы узнавания симбионта макрохозяином и инициацию иммунной реакции организма. Установлены некоторые факты участия этих макромолекул и в ассоциативных взаимоотношениях, модельным объектом изучения которых являются бактерии рода Azospirillum. Обнаружено, что ЛПС-содержащие экстракты из клеток азоспирилл стимулируют агрегацию бактерий (Matora et al., 2001) и прикрепление их к поверхности корня (Matora et al., 1995), изолированные препараты ЛПС индуцируют деформации корневых волосков проростков пшеницы (Федоненко с соавт., 2001). Выявлено снижение количества адсорбированных на корнях пшеницы клеток мутантного штамма КМ252, дефектного по синтезу ЛПС, по сравнению с родительским A. brasilense Sp245 (Федоненко с соавт., 2001). Однако все эти биологические эффекты получены на препаратах очень ограниченного количества штаммов, главным образом, на примере ЛПС бактерий А brasilense Sp245, которые являются эндофитными (Dobereiner and Day, 1976). Любое изменение в составе молекулы ЛПС может отражаться на его свойствах и биологической активности, а структура углеводного компонента и соотношение жирных кислот (ЖК) в молекулах ЛПС разных штаммов азоспирилл характеризуются высокой вариабельностью и зависят от условий существования микроорганизмов.

Для реализации цели в ходе исследования решались следующие задачи:

4. Выявление изменений в структуре липополисахарида бактерий A. brasilense Sp245.5, произошедших в результате спонтанного изменения плазмидного состава.

Научная новизна работы. Установлены структуры ОПС и выявлена химическая основа серологического родства бактерий A. brasilense S27, Spl07, SRI 5, SR80, SR55 и A. li-poferum RG20a.

Впервые для азоспирилл в OnCsR55 обнаружено восьмичленное повторяющееся звено с глюкуроновон кислотой в боковой цепи.

Идентифицированы два повторяющихся звена различной структуры в OUCsrso

Расшифрована уникальная структура повторяющегося звена ОПС спонтанного мутанта^. brasilense Sp245.5, образовавшегося в результате длительного хранения на богатой среде культуры A. brasilense Sp245. g

Впервые в комплексе с ЛПС бактерий A. brasilense SRI 5 идентифицирован N -(1-карбоксиэтил)-орнитин, принадлежащий к классу опинов.

Выявлено повышенное содержание непредельных ЖК в гидрофобных компонентах ЛПС четырёх штаммов азоспирилл (A. brasilense SR80, SR55, SR8 и SR15), выделенных из почв Саратовской области. Установлено, что ЛПС азоспирилл с различными соотношениями ЖК п/или структурами повторяющихся звеньев отличаются по активности в отношении растений.

Научно-практическая значимость. Выявленный факт биосинтеза гликополимеров иной структуры в связи с геномными перестройками может быть использован для прогнозирования изменений природных штаммов при длительном хранении в лабораторных условиях. Кроме того, полученные данные способствуют пониманию роли плазмидной ДНК в формировании структур клеточной поверхности, участвующих в ассоциативном взаимодействии.

Результаты исследования необходимы для химического обоснования серологической классификации бактерий рода Azospirillum, которая может использоваться для экспресс-идентификации штаммов азоспирилл. Препараты ЛПС восьми штаммов азоспирилл, полученные в ходе диссертационного исследования, применяются сотрудниками лабораторий биохимии, микробиологии, иммунохимии ИБФРМ РАН для проведения биологических и иммунохимических экспериментов. Полученные антитела, специфичные к ЛПС бактерий A. brasilense SR55 и SI7 могут быть использованы как инструменты для выявления соответствующих эпитопов в составе гликополимеров различного происхождения.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Повторяющиеся звенья О-специфических полисахаридов бактерий A. brasilense Spl07, S27 и A. lipofenim RG20a являются пента-Б-рамнанами, A. brasilense SRI 5 - тетра-D-рамнанами. Присутствие в структурах О-специфических полисахаридов D-рамнозы является химической основой серологического родства и обоснованием отнесения вышеуказанных штаммов к серогруппе I. С липополисахаридом A. brasilense SRI 5 прочно ассоциирован с

N -(1-карбоксиэтил)-орнитин.

2. О-специфический полисахарид A. brasilense SR55 состоит из октасахаридных звеньев с D-глюкуроновой кислотой в боковой цепи; в составе ОПС A. brasilense SR80 содержится два повторяющихся звена различной структуры. О-специфические полисахариды азоспирилл, включенных в состав серогруппы II, являются разветвленными гетерополисахаридами, содержащими среди прочих Сахаров L-рамнозу и D-галактозу.

3. У мутанта A. brasilense Sp245.5, образовавшегося в результате плазмидных перестроек в геноме бактерий A. brasilense Sp245 при длительном хранении на богатой среде, синтезируется О-специфический полисахарид, отличный по структуре от такового родительского штамма.

Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, представлены па следующих научных форумах: конференции «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005 г.); 10-ой Всероссийской Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука 21 века» (Пущино, Россия, 2006 г.); 3-ей и 4-ой Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006 г., 2008 г.); 2-ой конференции стран Балтии по микробным полисахаридам «2nd Baltic meetings on microbial carbohydrates» (Росток, Германия, 2006 г.); Международной школе-конференции молодых ученых «Прикладные и фундаментальные аспекты ответных, сигнальных процессов и процессов развития в системах корень-микроорганизм» (Санкт-Петербург, Россия, 2007 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, Россия, 2007 г.); 14-ом Европейском симпозиуме «14th Eurocarb» (Любек, Германия, 2007 г.).

Доклад «Структура и участие липополисахарида Azospirillum brasilense SR55 во взаимодействии с корнями пшеницы» на научной конференции молодых ученых «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2008 г.) удостоен диплома I степени.

Диссертационная работа обсуждена и рекомендована защите на совместном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии и биофизики СГУ им. Н.Г. Чернышевского 3 марта 2009 года.

Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Структуры гликополимеров и их функции в растительно-микробных взаимодействиях» (№ гос. per. 0120.040358, научный руководитель - заслуженный деятель науки РФ, проф. В.В. Игнатов). Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: в 2005-2007 гг. № 05-04-48123, руководитель проф. Игнатов В.В. и в 20082010 гг. №08-04-00669, руководители проф. Игнатов В.В. и проф. Коннова С.А., а также грантами Президента РФ на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в совместной работе с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии СГУ. Серологические исследования ЛПС выполнены совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН, эксперименты по ингибированию агглютинирующей активности лектина Grifola frondosa проведены сотрудниками лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН, анализ состава ЖК ЛПС осуществлен сотрудниками лаборатории структурных методов исследования ИБФРМ РАН, ЯМР-спектры сняты и расшифрованы совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов ИОХ РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей. Доля личного участия автора в подготовке совместных публикаций составляет до 70 %.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов исследования, а также результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 368 источников, в том числе 280 зарубежных. Работа изложена на 129 страницах, содержит 14 рисунков и 8 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бойко, Алевтина Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что О-специфические полисахариды бактерий штаммов A. brasilense Spl07, S27 и A. lipoferum RG20a представлены линейными гомополимерами, повторяющиеся звенья которых построены из пяти остатков D-рамнозы. Повторяющееся звено О-цепи A. brasilense SRI 5 отличается от них отсутствием 3-замещенного остатка D-рамнозы и наличием прочно ассоциированного N -(1-карбоксиэтил)-орнитина, который в комплексе с бактериальным полисахаридом обнаружен впервые.

2. Впервые установлено, что повторяющееся звено О-специфического полисахарида A. brasilense SR55 является разветвленным гетерооктасахаридом с D-глюкуроновой кислотой в боковой цепи, а в О-специфическом полисахариде бактерий Л. brasilense SR80 содержится два типа повторяющихся звеньев, различных по структуре.

3. На основании присутствия в липополисахаридах общих антигенных детерминант - олигомеров D-рамнозы - бактерии A. brasilense Spl07, S27, SRI 5 и A. lipoferum RG20a включены в состав серогруппы I. Бактерии A. brasilense SR55 и SR80 отнесены к серогруппе II на основании наличия в О-антигенах общих иммунодоминантных эпито-пов, в состав которых, очевидно, входят остатки L-рамнозы и D-галактозы. Бактерии A. brasilense SR8 выделены в отдельную серогруппу.

4. Впервые обнаружено, что у мутанта A brasilense Sp245.5, образовавшегося в результате спонтанных изменений в геноме бактерий A. brasilense Sp245, происходит утрата способности к синтезу рамнана и осуществляется биосинтез О-специфического полисахарида иной уникальной структуры.

5. Выявлено, что активность липополисахаридов азоспирилл серогруппы I в отношении морфологии корневых волосков проростков пшеницы обусловлена соотношением жирных кислот и длиной О-цепей, а у азоспирилл, О-специфические полисахариды которых являются разветвленными гетерополисахаридами, также зависит от характера заместителей боковых цепей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактерии рода Azospirillum изолированы с корней как злаковых, так и представителей других семейств растений (Dobereiner and Day, 1976; Tarrand et al., 1978; Patriquin et al., 1983). С конца 80-х годов прошлого века азоспириллы считаются модельным объектом в изучении явления ассоциативности. В отличие от ризобий, они не образуют клубеньки при колонизации макрохозяина, а располагаются на поверхности корня в естественных углублениях, покрываются муцигелем и закрепляются при помощи фибрилл, в формировании которых, по всей видимости, участвуют бактериальные экзополисахариды (Pinheiro et al., 2002). Установлена роль полисахаридсодержащих комплексов капсулы в начальной стадии прикрепления бактерий к корневой поверхности за счет лектин-углеводных взаимодействий и изменения морфологии корневых волосков проростков (Коннова с соавт., 1995; Егоренкова с соавт., 2001; Yegorenkova et al., 2001). Показано участие в формировании ассоциации ЛПС, занимающих около 70 % поверхности внешней мембраны клеток грамотрицательных бактерий (Федоненко с соавт., 2001; Арефьева с соавт., 2006; Широков, 2008; Matora et al., 2001). Однако механизм взаимодействия азоспирилл с растениями остается неясным, поэтому необходимо накопление данных о структурах гликополимеров поверхности бактериальных клеток и связанной с ними биологической активности в отношении макросимбионта.

В настоящей работе исследованы структуры повторяющихся звеньев О-специфических цепей и состав ЖК ЛПС азоспирилл, в том числе аборигенных штаммов, которые характеризуются высоким содержанием Ci§:b На основании наличия общих О-антигенных детерминант бактерии отнесены к разным серогруппам. В состав серогруппы I включены штаммы A. brasilense Spl07, S27, SRI 5 и A. lipoferum RG20a, ЛПС которых серологически близки, но имеют и индивидуальные особенности. Так, ЛПС1Ш20а и JinCsRis с ATsp245 обнаруживают только по одной из двух полос преципитации, соответствующих разным антигенным детерминантам. Методом ингибирования AT в иммунодиффузии установлено, что химической основой серологического родства азоспирилл серогруппы I является наличие у них общих олиго-О-рамнаповых фрагментов. Свежевыделенная D-Rha ингибирует взаимодействие антиген/AT намного слабее, чем гомологичные ОПС. Анализ ОПС химическими и физическими методами позволил установить строение их повторяющихся звеньев. Структурными единицами OnCspio7, OnCs27 и ОПСяого оказались идентичные пентасахри-ды, состоящие исключительно из остатков D-Rha. Отличается от других представителей серогруппы I лишь OnCsRis, в повторяющемся звене которого отсутствует один остаток

3-замещенной D-Rlia. Эта особенность строения, очевидно, является объяснением пониженной активности антигена в реакции иммунодиффузии. Кроме того, в комплексе с JHICsris находится опин N -(1-карбоксиэтил)-орнитин. Причину разницы в количестве полос преципитации ОПСяогоа мы связываем с отличиями конформации полисахаридного участка ЛПС, на которую оказывает влияние, в том числе, гидрофобный компонент. Особенностью липида А ОПСяогоа является повышенное содержание гидроксикислот на фоне незначительного количества характерных для азоспирилл предельных и непредельных заместителей.

Бактерии A. brasilense SR55 и SR80 отнесены к серогруппе II на основании наличия в их ЛПС антигенных детерминант, общих с ЛПС бактерий A. irakense КВС1 и A. brasilense Sp7 (для ЛПС-содержащих экстрактов). Повторяющиеся звенья ОПС всех штаммов азоспирилл серогруппы II представлены разветвленными гетерополисахаридами, в составе которых обязательно присутствуют L-Rha и D-Gal. Установлено, что структурной единицей ОПСэя55 является октасахарид с терминальным остатком D-GlcA, а в OnCsRso содержится два повторяющихся звена разной структуры. OnCsRs, по-видимому, имеет нерегулярное строение или состоит из больших повторяющихся блоков, структуры которых на данном этапе не определены. Хотя среди моносахаридов OnCsRs доминирует L-Rha, в реакциях иммунодиффузии ЛПCsR8 не обнаруживает серологических перекрестов с ЛПС представителей серогруппы II. Вероятно, это связано с особенностями конфигурации связи либо локализацией остатков в полисхаридной цепи. На основании проведенных экспериментов ЛПCsR8 выделен в отдельную серогруппу. Серологическая обособленность ранее была обнаружена для ЛШ^п, для которого впервые установлено присутствие двух повторяющихся звеньев в ОПС, одно из которых имеет ранее не встречавшуюся у азоспирилл структуру. Однако специфичные к ЛПСз17 AT не выявляют общих антигенных детерминант с ЛПCsR8, что говорит о совершенно новой для описанных штаммов азоспирилл структуре OnCsRs

На примере ЛПС бактерий серогруппы I с D-рамнановыми повторяющимися звеньями ОПС обнаружено влияние соотношения ЖК в липидах А на активность ЛПС в изменении морфологии корневых волосков пшеницы. Эксперименты показали, что влияние ЛПС возрастает с увеличением количества гидроксикислот в их гидрофобных компонентах. Для ЛПС представителей серогруппы II и A. brasilense SR8, которые различаются также по моносаха-ридному составу ОПС, трудно проследить подобную корреляцию. Несомненно, большое влияние на активность полимера оказывает количество и характер заместителей в боковой цепи, о чем свидетельствуют данные об изменении моносахаридного состава ЛПС бактерий Л. brasilense Cd под влиянием корневых экссудатов разных растений (Fischer et al., 2003).

Исследовано участие JIIICsrss и JIUCsrs, ОПС которых представлены гетер ополисаха-ридами, в адсорбции гомологичных штаммов на поверхности корней пшеницы. В составе ОПС выбранных препаратов содержатся компоненты, характерные для полисахаридсодер-жащих материалов капсулы - уроновая кислота (JinCsRss) и D-GlcNAc, являющийся специфическим гаптеном АЗП (JinCsRs). После предобработки корней проростков пшеницы ЛПС мы ожидали обнаружить уменьшение количества прикрепившихся к ним клеток. Тем не менее, разницы по сравнению с контролем для бактерий A. brasilense SR8 не наблюдалось, а в экспериментах с A. brasilense SR55, напротив, показано их достоверное увеличение. Следовательно, несмотря на то, что в составе капсулы ЛПС в комплексе с белком принимает участие в лектин-углеводных взаимодействиях с корнями пшеницы (Yegorenkova et al., 2001), ЛПС внешней мембраны такой способностью не обладает и имеет свои собственные функции во взаимодействии с макрохозяином. Как показали дальнейшие эксперименты, одной из возможных причин, стимулирующих прикрепление клеток к корням, предобработанным раствором ЛПС8К55, может являться положительный трофический таксис бактерий A. brasilense к ЛПCsR55 при отсутствии в среде роста иных источников углерода. Мы предполагаем, что молекулы .nnCsR55 связываются с поверхностью корней и являются аттрактантом для микроорганизмов.

Многие гены азоспирилл, ответственные за синтез поверхностных полимеров, локализованы в плазмидах. В результате длительного хранения на богатой питательной среде у бактерий A. brasilense Sp245 спонтанно осуществилась реорганизация плазмид и образовался мутант A. brasilense Sp245.5, у которого наблюдались значительные изменения О-антигенных детерминант по сравнению с диким типом (Кацы с соавт., 2002; Matora et al., 1990). Установлена структура повторяющегося звена OnCsP245.5, состоящего из двух мо-носахаридных остатков - D-GalpNAc и D-ManpNAcA. Экспрессия генов биосинтеза ОПС с иным моносахаридным составом и структурой повторяющегося звена, вероятно, является результатом адаптации микроорганизма к существованию в предложенных условиях. Этот факт подтверждает важность ЛПС как фактора коммуникации азоспирилл с окружающей средой, а также представляет интерес для дальнейшего выяснения роли Rha и ее полимеров во взаимоотношениях с растениями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бойко, Алевтина Сергеевна, Саратов

1. Антонюк Л.П. Глутаминсинтетаза ризобактерий Azospirillum brasilense-. особенности катализа и регуляции // Прикладная биохимия и микробиология. — 2007. Т. 43, № 3. - С. 272-278.

2. Антонюк Л.П., Евсеева Н.В. Лектин пшеницы как фактор растительно-микробной коммуникации и белок стрессового ответа // Микробиология. — 2006. — Т. 75, № 4. С. 544-549.

3. Арефьева О.А., Рогачева С.М., Кузнецов П.Е., Хлебцов Б.Н., Толмачев С.А., Купадзе М.С. Липосомы в изучении механизма агрегации бактерий и их адсорбции на корнях растений // Биолог, мембраны. 2006. - Т. 23, № 3. - С. 195-202.

4. Баканчикова Т.И., Мякиньков А.Г., Павлова-Иванова Л.К., Майсурян А.Н. Участие генов хемотаксиса в установлении ассоциативных взаимоотношений между Azospirillum brasilense и пшеницей // Молекулярн. генетика. 1989. — Т. 4. - С. 24-32.

5. Бергельсон Л. Мембраны, молекулы, клетки. М.: Наука, 1982. - 182 с.

6. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серотипировании азоспирилл // Микробиология. 1991. - Т. 60. - С. 524-529.

7. Большой практикум по физиологии растений / Под ред. Б.А. Рубина. — М.: Высшая школа, 1978. 408 с.

8. Бурыгин Г.Л., Широков А.А., Шелудько А.В., Кацы Е.И., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. Выявление чехла на поверхности полярного жгутика Azospirillum brasilense // Микробиология. 2007. - Т. 76, № 6. - С. 822-829.

9. Варбанец Л.Д. Эндотоксины грамотрицательных бактерий: структура и биологическая роль // Микробиол. журн. 1994. — Т. 56, № 3. — С. 76-97.

10. Варбанец Jl.Д., Винарская Н.В. Структура, функции, биологическая активность грамотрицательных микроорганизмов // Токсини м!крооргашзм1в. — 2002. — С. 1-7.

11. Варбанец Л.Д., Здоровенко Г.М., Книрель Ю.А. Методы исследования эндотоксинов. Киев: Наукова думка, 2006. - 237 с.

12. Ветчинкина Е.П., Соколов О.И., Никитина В.Е. Внутриклеточные лектины на разных стадиях развития Lentinus edodes II Микробиология. 2008. — Т. 77, № 4. — С. 496-501.

13. Дорошенко Е.В., Булыгина Е.С., Спиридонова Е.М., Турова Т.П., Кравченко И.К. Выделение и характеристика азотофиксирующих бактерий рода Azospirillum из почвы сфагнового болота // Микробиология. 2007. - Т. 76, № 1. - С. 107-115.

14. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Дыкман Л.А., Игнатов В.В. Роль полисахарид со держащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерий на корнях проростков пшеницы // Микробиология. — 2001. — Т. 70, № 1. — С. 45-50.

15. Захарова И.Я., Варбанец Л.Д. Углеводсодержащие биополимеры мембран бактерий. — Киев: Наукова думка, 1983. 128 с.

16. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. -Киев: Наукова думка, 1982. 192 с.

17. Здоровенко Г.М., Веремейченко С.Н. Сравнительная характеристика липополисахаридов различных штаммов Pseudomonas fluorescens (биовар I) // Микробиология. — 2001.-Т. 70,№4.-С. 509-518.

18. Здоровенко Г.М., Здоровенко Э.Л., Варбанец Л.Д. Особенности состава, строения и биологические свойства липополисахаридов различных штаммов Pseudomonas syringae pv. atrofaciens II Микробиология. 2007. - Т. 76, № 6. - С. 774-789.

19. Иванов В.П. Растительные выделения и их значения в жизни фитоценозов. -М.: Наука, 1973.-294 с.

20. Иванова Н.С., Васюк Л.Ф., Кислин Е.Н. Эффективность инокуляции люпина желтого ассоциативными азотфиксаторами // Сельскохоз. биол. 1992. — № 5. — С. 97-103.

21. Иммунология / Под ред. У. Пола. Т. 3. - М.: Мир, 1989. - 360 с.

22. Камнев А.А., Садовникова Ю.Н., Антонюк Л.П. Влияние дефицита азота и лек-тина пшеницы на состав и структуру некоторых биополимеров Azospirillum brasilense Sp245 // Микробиология. 2008. - Т. 77, № 2. - С. 278-281.

23. Кацы Е.И. Молекулярная генетика ассоциативного взаимодействия бактерий и растений / Под ред. Игнатова В.В. — М.: Наука, 2007. 86 с.

24. Кацы Е.И. Свойства и функции плазмид ассоциированных с растениями бактерий рода Azospirillum II Успехи соврем, биол. 2002. - Т. 122, № 4. — С. 353-364.

25. Кацы Е.И., Борисов И.В., Машкина А.Б., Панасенко В.И. Влияние плазмидного состава на реакции хемотаксиса ассоциированных со злаками бактерий Azospirillum brasilense Sp245 // Молекул, генетика. 1994. - № 2. - С. 29-34.

26. Книрель Ю.А. Липополисахариды грамотрицательных бактерий // Прогресс химии углеводов / Под ред. И.В. Торгова- М.: Наука, 1985. С. 54-71.

27. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий // Биохимия. 1994а. - Т. 58, вып. 2. - С. 166-181.

28. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий // Биохимия. 19946. - Т. 58, вып. 2. - С. 182-201.

29. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий // Биохимия. — 1995. Т. 59, вып. 12. - С. 1325-1383.

30. Коннова О.Н. Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum: Дис. канд. биол. наук. Саратов, 2006.-164 с.

31. Коннова С.А. Полисахаридсодержащие биополимеры бактерий рода Azospirillum: разнообразие химического строения и функций: Дис. д-ра биол. наук. Москва, 2003. -365 с.

32. Коннова С.А., Брыкова О.Б., Сачкова О.А., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Исследование защитной роли полисахаридсодержащих компонентов капсулы бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 2001. - Т. 70, № 4. - С. 503-508.

33. Коннова С.А., Макаров О.Е., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Экзополисахариды бактерий рода Azospirillum brasilense Sp245 и Spl07 // Микробиол. журн. — 1992. Т. 54, № 2. -С. 31-41.

34. Коннова С.А., Скворцов И.М., Макаров О.Е., Игнатов В.В. Свойства полисаха-ридных комплексов, продуцируемых Azospirillum brasilense, и получаемых из них полисахаридов // Микробиология. 1994. - Т. 63, № 6. - С. 1020-1030.

35. Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Макаров О.Е., Игнатов В.В. Исследование влияния условий выращивания бактерий Azospirillum brasilense на состав внеклеточных полисахаридсодержащих материалов // Изв. РАН сер. биол. 2003. — № 4. - С. 430-437.

36. Косенко Л.В., Затовская Т.В. Изучение липополисахаридов Sinorhizobium meliloti и двух его мутантов, характеризующихся сниженной нодуляционной конкурентоспособностью // Микробиология. 2004. - Т. 73, № 3. - С. 350-357.

37. Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Структура и свойства липида А компонента эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Химия природных соединений. — 1989.-№ 5.-С. 601-616.

38. Кульшин В.А., Яковлев А.П., Аваева С.Н., Дмитриев Б.А. Улучшенный метод выделения полисахаридов из грамотрицательных бактерий // Мол. генетика, микробиология, вирусология. 1987. - № 5. - С. 44-46.

39. Кэбот Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Медицина, 1968. —684 с.

40. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980. — 293 с.

41. Лукин С.А., Кожевин П.А., Звягинцев Д.Г. Азоспириллы и ассоциативная азо-тофиксация у небобовых культур в практике сельского хозяйства // Сельскохоз. биология. — 1987.-№ 1.-С. 51-58.

42. Мальцева Н.Н., Волкогон В.В. Азотофиксирующая бактерия Azospirillum lipoferum (Beijerinck) в почве, ризосфере и ризоплане сельскохозяйственных растений // Мик-робиол. журн. 1984. - Т. 46, № 1. - С. 6-8.

43. Матора Л.Ю. Углеводные антигены и их вклад в строение клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum: Дис. д-ра биол. наук. — Саратов, 2004. 266 с.

44. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотофиксирующих бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 1998. - Т. 67, № 6. - С. 815-820.

45. Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Антигенная идентичность капсульных полисахаридов, экзополисахаридов и О-специфических полисахаридов в Azospirillum brasilense II Микробиология. 2002. - Т. 71, № 2. - С. 211-214.

46. Мурас В.А., Варбанец Л.Д., Житкевич Н.В. Липополисахариды S- и R-форм Pseudomonas syringae pv. phaseolicola II Микробиол. журн. — 1987. —Т. 49,№4. —С. 9-11.

47. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Итальянская Ю.В., Пономарева Е.Г. Очистка и сравнение лектинов с клеточной поверхности активных и неактивных по гемагглютинации клеток азоспирилл // Биохимия. 1994. - Т. 59, вып. 5. - С. 656-662.

48. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Пономарева Н.Н., Савенкова Н.Н. Изучение роли лектинов клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 2. - С. 165-170.

49. Никитина В.Е., Пономарева Е.Г., Аленькина С.А., Коннова С.А. Участие бактериальных лектинов клеточной поверхности в агрегации азоспирилл // Микробиология. — 2001. Т. 70, № 4. - С. 471-476.

50. Петров Р.В. Иммунология. — М.: Медицина, 1983. — 386 с.

51. Петрова Л.П. Генетические аспекты продукции компонентов клеточной поверхности у ассоциативных азотофиксирующих бактерий Azospirillum brasilense: Дис. канд. биол. наук. Саратов, 1998. - 111 с.

52. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.Ф., Барышева Н.Н., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология. 1988. - Т. 57, № 2. - С. 275-278.

53. Проворов Н.А. Эволюционно-генетическая основа понятия симбиоза // Журн. общей биологии. 2001. - Т. 62, № 6. - С. 472-495.

54. Проворов Н.А. Эволюция генетических систем симбиоза у клубеньковых бактерий // Генетика. 1996. - Т. 32, № 8. - С. 1029-1040.

55. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Ред. Н.С. Егоров. — М.: Изд-во МГУ, 1983. С. 115-116.

56. Серебренникова О.Б. Изучение липополисахаридов бактерий рода Azospirillum и их роли при контактных взаимодействиях: Дис. канд. биол. наук. — Саратов, 1998. — 119 с.

57. Скворцов И.М. Муцигель и слизь поверхности корней растений // Успехи соврем. биологии. 1994. - Т. 114. - С. 372-383.

58. Скоупс Р. Методы очистки белков. — М.: Мир, 1985. 345 с.

59. Смолькина О.Н., Бурыгин ГЛ., Федоненко Ю.П., Качала В.В., Здоровенко Э.Л., Матора Л.Ю., Коннова С.А., Игнатов В.В. Различия мембранных и капеульных термостабильных антигенов Azospirillum lipoferum Sp59b // Биохимия. 2009. - в печати.

60. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Физические свойства липополисахаридов грамотрицательных бактерий // Биол. мембраны. 1992. - Т. 9, № 3. - С. 245-258.

61. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. - Т. 23, вып. 5. - С. 656-662.

62. Степанова Л.В. Выделение и характеристика мицелиального лектина базидио-мицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray: Дис. канд. биол. наук. Саратов, 2008. - 131 с.

63. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Кооперация растений и микроорганизмов: новые подходы к конструированию экологически устойчивых агросистем // Успехи соврем, биологии. 2007. - Т. 127, № 4. - С. 339-357.

64. Томшич С.В., Командрова Н.А., Вилдмалм Г.Г., Недашковская О.И., Шашков А.С., Перепелов А.В. Структура О-специфического полисахарида морской бактерии Cellulo-phaga baltica // Биоорг. химия. 2007. - Т. 33, № 1. - С. 91-95.

65. Федоненко Ю.П. Липополисахариды азоспирилл — структура, участие во взаимодействии с корнями пшеницы: Дис. канд. биол. наук. — Саратов, 2003. 129 с.

66. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 3. - С. 384-390.

67. Федоров М.В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М.: Гос. изд-во сельскохоз. лит-ры, 1957. - 231 с.

68. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Лощинина Е.А. Выделение и характеристика внеклеточных лектинов Lentinus edodes (Berk.) Sing // Биохимия. — 2008. — Т. 73, вып. 10. — С. 1438-1446.

69. Шелудько А.В., Борисов И.В., Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Кацы Е.И. Влияние конго красного на подвижность бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 2006. - Т. 75, № 1. - С. 62-69.

70. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на клетке A. brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 5. — С. 662-667.

71. Широков А.А. Иммунохимическая идентификация поверхностных структур Azospirillum brasilense, участвующих в реализации «социального» поведения бактерий: Ав-тореф. дис. канд. биол. наук. Саратов, 2008 - 23 с.

72. Энциклопедия Саратовского края. — Саратов: Приволжск. кн. изд-во, 2002. —688 с.

73. Adesemoye А.О., Torbert Н.А., Kloepper J.W. Enhanced plant nutrient use efficiency with PGPR and AMF in an integrated nutrient management system // Can. J. Microbiol. — 2008. V. 54, № 10. - P. 876-886.

74. Adler J. Chemotaxis in bacteria // Science. 1966. - V. 153, № 3737. - P. 708-716.

75. Albus U., Baier R., Hoist O., Puhler A., Niehaus K. Suppression of an elicitor-induced oxidative burst in Medicago sativa cell-cultures by Sinorhizobium meliloti lipopolysaccha-rides // New Phytologist. 2001. - V. 151. - P. 597-606.

76. Alexander C., Rietschel E.T. Bacterial polysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. 2001. - V. 7, № 3. - P. 167-198.

77. Alexandre G., Green S.E., Zhulin I.B. Energy taxis is the dominant behavior in Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 2000. - V. 182, № 21. - P. 6042-6048.

78. Alexandre G.S., Green-Phillips S.E., Zhulin I.B. Ecological role of energy taxis in microorganisms // FEMS Microbiol. Rev. 2004. - V. 28. - P. 113-126.

79. Alexandre G.S., Zhulin I.B. Different evolutionary constraints on chemotaxis proteins CheW and CheY revealed by heterologous expression studies and protein sequence analysis // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P. 544-552.

80. Alexandre G.S., Zhulin I.B. More than one way to sense chemicals // J. Bacteriol. -2001.-V. 183.-P. 4681-4686.

81. Alvarez R. Isolation of atmospheric-nitrogen-fixing spirilla from the waters of the Parana delta and other rivers // Rev. Argent. Microbiol. 1984. - V. 16, № 2. - P. 93-96.

82. Amooaghaie R., Mostajeran A., Emtiazi G. The effect of compatible and noncom-patible Azospirillum brasilense strains on proton efflux of intact wheat roots // Plant Soil. 2002. -V. 243.-P. 155-160.

83. Andrade G., De Leij F.A., Barber S.A. Plant mediated interaction between alfalfa and Rhizobium leguminosarum and arbuscular vesicular mycorrhiza // Appl. Microbiol. 1998. - V. 26. -P. 311-316.

84. Apelbaum A., Yang S. F. Biosynthesis of stress ethylene induced by water deficit // Plant Physiol. 1981. - V. 68. - P. 594-596.

85. Armitage J.P. Bacterial tactic responses // Adv. Microb. Physiol. 1999. - V. 41. -P. 229-289.

86. Aussel L., Therisod H., Karibian D., Perry M.B., Bruneteau M., Caroff M. Novel variation of lipid A structures in strains of different Yersinia species // FEBS Lett. 2000. - V. 465. -P. 87-92.

87. Bais H.P., Weir T.L., Perry L.G., Gilroy S., Vivanco J.M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms// Annu Rev. Plant Biol. 2006. - V. 57. -P. 233-266.

88. Bahat-Samet E., Castro-Sоwinski S., Okon Y. Arabinose content of extracellular polysaccharide plays a role in cell aggregation of Azospirillum brasilense I I FEMS Microbiol. Lett. 2004. - V. 237. - P. 195-203.

89. Baldani J.I., Baldani V.L.D. History of the biological nitrogen fixation research in gramineaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience // An. Acad. Bras. Cienc. — 2005. V. 77, № 3. - P. 549-579.

90. Baldani J.J., Caruso L., Baldani V.L.D., Goi S.R., Dobereiner J. Recent advances in BNF with non-legume plants // Soil. Biol. Biochem. 1997. - V. 29, № 5/6. - P. 911-922.

91. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effect of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. — 1983. V. 29, № 8. — P. 924-929.

92. Baldani V.L.D., Dobereiner J. Host plant specificity in the infection of cereal with Azospirillum spp. // Soil Biol. Biochem. 1980. - V. 12, № 5. - P. 434-439.

93. Barea J.-M., Pozo M.J., Azcon R., Azcon-Aguilar C. Microbial co-operation in the rhizosphere //J. Exp. Bot. 2005. -V. 56. - P. 1761-1778.

94. Bashan Y., De-Bashan L.E. Protection of tomato seedlings against infection by Pseudomonas syringae pv. tomato by using the plant growth-promoting bacterium Azospirillum brasilense 11 Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68, № 6. - P. 2637-2643.

95. Bashan Y., Esther M., Rodriguez-Mendoza M.N., Toledo G., Holgum G., Ferrera-Cerrato R., Pedrin S. Survival of Azospirillum brasilense in bulk soil and rhizosphere of 23 soil types // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61, № 5. - P. 1938-1945.

96. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum!plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43 - P. 103-121.

97. Bashan Y., Holguin G. Root-to-root travel of the beneficial bacterium Azospirillum brasilense II Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60, № 6. - P. 2120-2130.

98. Bashan Y., Levanony H. Adsorption of the rhizosphere bacterium Azospirillum brasilense Cd to soil, sand and peat particles // J. Gen. Microbiol. 1988. - V. 134. - P.l 811-1820.

99. Bashan Y., Levanony H. Factors affecting adsorption of Azospirillum brasilense Cd to root hairs as compared with root surface of wheat // Can. J. Microbiol. 1989. — V. 35. -P. 936-944.

100. Bashan Y., Ream Y., Levanony H., Sade A. Non-specific responses in plant growth, yield, and root colonization of noncereal crop plants to inoculation with Azospirillum brasilense Cd //Can. J. Bot. — 1989.— V. 67.-P. 1317-1324.

101. Bedini E., Carabellese A., Barone G., Parrilli M. First synthesis of the beta-D-rhamnosylated trisaccharide repeating unit of the O-antigen from Xanthomonas campestris pv. campestris 8004 // J. Org. Chem. 2005д. - V. 70, № 20. - P. 8064-8080.

102. Bedini E., De Castro C., Erbs G., Mangoni L., Dow J.M., Newman M., Parrilli M., Unverzagt C. Structure-dependent modulation of a pathogen response in plants by synthetic O-antigen polysaccharides // J. Am. Chem. Soc. 20056. - V. 127. - P. 2414-2416.

103. Bekri M.A., Desair J., Kejers V., Proost P., Searle-van Leeuwen M., Vanderleyden J., Vande Broek A. Azospirillum irakense produces a novel type pectate lyase // J. Bacteriol. — 1999. -V. 181.-P. 2440-2447.

104. Berenblum I., Chain E. An improved method for the colorimetric determination of phosphate // Biochem. J. 1938. - V. 32, № 2. - P. 295-298.

105. Berg R.H., Tyler M.E., Novick N.J., Vasil V., Vasil I.K. Biology of Azospirillum -sugarcane association: Enhancement of nitrogenase activity // Appl. Environ. Microbiol. 1980. -V. 39, №2.-P. 119-125.

106. Bertin C., Yang X., Weston L. The role of root exudates and allelochemicals in the rhizosphere // Plant Soil. 2003. - V. 256. - P. 67-83.

107. Bhattacharya P. Mode of utilization of amino acids as growth substrates by Azospirillum brasilense II Indian J. Exp. Biol. -2005. -V. 43, № 12. -P. 1182-1191.

108. Bibikov S.I., Biran K.E., Rudd K.E., Parkinson J.S. A signal transducer for aerotaxis in Esherichia coli И J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 4075-4079.

109. Bleakley B.H., Gaskin M.H., Hubbel D.N., Zam S.G. Floe formation by Azospirillum lipoferum grown on poly-beta-hydroxybutirate // Appl. Environ. Microbiol. 1988. — V. 54. -P. 2986-2995.

110. Bock K., Pedersen C. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of monosaccharides // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1983. - V. 41. - P. 27-66.

111. Boddey R.M., Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effect of inoculation of Azospirillum spp. On nitrogen accumulation by field-grown wheat // Plant Soil. — 1986. — V. 95. — P. 109-121.

112. Borisov I.V., Schelud'ko A.V., Petrova L.P., Katsy E.I. Changes in Azospirillum brasilense motility and the effect of wheat seedling exudates // Microbiol. Res. 2007. — Epub ahead of print.

113. Brandenburg K., Mayer H., Koch M.H., Wekesser J., Rietschel E., Seydel U. Influence of the supramolecular structure of free lipid A on its biological activity // Eur. J. Biochem. — 1993.-V. 218.-P. 555-563.

114. Breedveld M.W., Miller K.J. Cyclic beta-glucans of members of the family Rhizo-biaceae И Microbiol. Rev. 1994. - V. 58. - P. 145-161.

115. Burdman S., Jurkevitch E., Schwartsburd В., Hampel M., Okon Y. Aggregation of Azospirillum brasilense: effects of chemical and physical factors and involvement of extracellular components // Microbiology. 1998. -V. 144. - P. 1989-1999.

116. Burdman S., Jurkevitch, E., Schwartsburd В., Окоп Y. Involvement of outer-membrane proteins in the aggregation of Azospirillum brasilense // Microbiology. 1999. - V. 145. -P. 1145-1152.

117. Burdman S., Jurkevitch E., Soria-Diaz M.E., Gill Serrano A.M., Okon Y. Extracellu-lare polysaccharide composition of Azospirillum brasilense and characterization // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 489. - P. 259-264.

118. Burdman S., Sarig S., Kigel J., Okon Y. Field inoculation of common bean {Phaseo-lus vulgaris L.) and chick pea (Cicer arietinum L.) with Azospirillum brasilense strain Cd // Symbiosis. 1997. - V. 21. - P. 41-48.

119. Carlson R.W., Kalembasa S., Tirowski D., Pachori P., Noel K.D. Characterization of the lipopolysaccharide from a Rhizobium phaseoli mutant that is defective in infection thread development // J. Bacteriol. 1987. - V. 169, № 11. - P. 4923-4928.

120. Caroff M., Karibian D. Structure of bacterial lipopolysaccharides // Carbohydr. Res. 2003. - V. 338. - P. 2431-2447.

121. Castellanos Т., Ascencio F., Bashan Y. Cell-surface lectins of Azospirillum spp. // Curr. Microbiol. 1998. - V. 36. - P. 241-244.

122. Cattelan A.J., Hartel P.G., Fuhrmann JJ. Screening for plant growth-promoting rhizobacteria to promote early soybean growth // Soil. Sci. Soc. Am. J. -1999.-V. 63.-P. 1670-1680.

123. Ce'rantola S., Montrozier, H. Structural elucidation of two polysaccharides present in the lipopolysaccharide of a clinical isolate of Burkholderia cepacia II Eur. J. Biochem. 1997. -V. 246.-P. 360-366.

124. Chang Y., Tang Т., Li J.L. Isolation of a flagellar operon in Azospirillum brasilense and functional analysis of FlbD // Res. Microbiol. 2007. - V. 158, № 6. - P. 521-528.

125. Chart H., Cheasty Т., Rowe B. Serological identification of infection by verocyto-toxin-producing Escherichia coli II Lett. Appl. Microbiol. 1996. — V. 23, № 5. - P. 322-324.

126. Chazalet V., Uehara K., Geremia R.A., Breton C. Identification of Essential Amino Acids in the Azorhizobium caulinodans Fucosyltransferase NodZ // J. Bacteriol. 2001. - V. 183, №24.-P. 7067-7075.

127. Choma A., Komaniecka I. Characterization of novel lipid A structure isolated from Azospirillum lipoferum lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2008. - V. 343. - P. 799-804.

128. Choma A., Komaniecka I., Sowinski P. Revised structure of the repeating unit of the O-specific polysaccharide from Azospirillum lipoferum strain SpBrl7 // Carbohydr Res. — 2009. — Epub ahead of print.

129. Choma A., Lorkievvicz Z., Russa R. Analysis of Azospirillum lipopolysaccharides // Abstracts of the 9th International Congress on Nitrogen Fixation, 6-11 December, Cancun, Mexico. 1992. Abstr. № 125.

130. Choma A., Russa R., Lorkiewicz Z. Chemical composition of lipopolysaccharide from Azospirillum lipoferum И FEMS Microbiol. Lett. 1984. - V. 22. - P. 245-248.

131. Choma A., Russa R., Mayer H., Lorkiewicz Z. Chemical analysis of Azospirillum lipopolysaccharides // Arch. Microbiol. 1987. - V. 146. - P. 341-345.

132. Chowdhury S.P., Nagarajan Т., Tripathi R., Mishra M.N., Le Rudulier D., Tripathi A.K. Strain-specific salt tolerance and osmoregulatory mechanisms in Azospirillum brasilense II FEMS Microbiol Lett. 2007. - V. 267, № 1. - P. 72-79.

133. Cimmino A., Marchi G., Surico G., Hanuszkiewicz A., Evidente A., Hoist O. The structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide from Pantoea agglomerans strain FL1 // Carbohydr. Res. 2008. - V. 343, № 2. - P. 392-398.

134. Cohen M.F., Han X.Y., Mazzola M. Molecular and physiological composition of Azospirillum spp. isolated from Rhizoctonia solani mycelia, wheat rhizosphere and human skin wounds I I Can. J. Microbiol. 2004. - V. 50. - P. 291-297.

135. Compant S., Nowak B.J., Climent С., Barka E. Ait. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: Principles, mechanisms of action, and future prospects // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. - P. 4951-4959.

136. Croes C.L., Moens S., Van Bastelaere E., Vanderleyden J., Michiels K.W. The polar flagellum mediates Azospirillum brasilense adsorption to wheat roots // J. Gen. Microbiol. — 1993. — V. 139.-P. 2261-2269.

137. Danhorn Т., Fuqua C. Biofilm formation by plant-associated bacteria // Annu Rev. Microbiol. 2007. - V. 61. - P. 401-422.

138. Day J.M., Dobereiner J. Physiological aspects of N2-fixation by Spirillum from digi-taria roots // Biol. Chem. 1976. - V. 8. - P. 46-60.

139. Dazzo F.B. Bacterial attachment as related to cellular recognition in the Rhizobium-legum symbiosis // J. Supramol. Struct. Cell Biochem. 1981. - V. 16. - P. 29.

140. De Polli H., Bohlool B.B., Dobereiner J. Serological differentiation of Azospirillum brasilense species belonging to different host-plant specificity groups // Arch. Microbiol. — 1980. — V. 126, №3.-P. 217-222.

141. De Troch P., Vanderleyden J. Surface properties and motility of Rhizobium and Azospirillum in relation to plant root attachment // Microb. Ecol. 1996. - V. 32. - P. 149-169.

142. Del Gallo M., Fendrik I. The rhizosphere and Azospirillum // AzospirillumlPlant Associations / Ed. Okon Y. Boca Raton. Fl.: CRC Press, 1994.

143. Del Gallo M., Haegi A. Characterization and quantification of exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II Symbiosis. — 1990. — V. 9. — P. 155-161.

144. Del Gallo M., Negi M., Neyra C.A. Calcofluor- and lectin-binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II J. Bacteriol. 1989. — V. 171, №6.-P. 3504-3510.

145. Dobbelaere S., Croonenborghs A., Thys A. Vande Broek A., Vanderleyden J. Phyto-stimulatory effects of Azospirillum brasilense wild type and mutants strains altered in IAA production on wheat // Plant Soil. 1999. - V. 212. - P. 155-164.

146. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbioses in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. I'st Intern. Symp. on N2 Fixation. Washington, 1976.-P. 518-537.

147. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. - V. 28, № 3. -P. 350-356.

148. Dufrene Y.F., Boonaert C.J., Rouxhet P.G. Adhesion of Azospirillum brasilense: Role proteins at the cell support interface // Colloid Surface. 1996. - V. 7, № 3-4. - P. 113-128.

149. Dufrene Y.F., Rouxhet P.C. Surface composition, surface properties, and adhesiveness of Azospirillum brasilense variation during growth // Can. J. Microbiol. - 1996. - V. 42. -P. 548-556.

150. Eckert В., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffels M., Hartman A. Azospirillum doebereinerae sp. nov. a diazotrofic bacterium associated with Miscanthus sinesis 'gi-ganteus'// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 17-26.

151. Falke J.J., Hazelbauer G.L. Transmembrane signaling in bacterial chemoreceptors // Trends Biochem. Sci. 2001. - V. 26. - P. 257-265.

152. Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Kocharova N.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-polysaccharide from the Azospirillum lipoferum Sp59b lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2005. - V. 340. - P. 1259-1263.

153. Fedonenko Yu.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - V. 337. - P. 869-872.

154. Fischer S.E., Miguel M.J., Morri G.B. effect oa root exudates on the polysaccharide composition and the lipopolysaccharide profile of Azospirillum brasilense Cd under saline stress // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V. 219. - P. 53-62.

155. Fisher M.M., Wilcox L.W., Gracham L.E. Molecular characterization of epiphytic bacterial communities of Charophycean green algae // Appl. Environ. Microbiol. 1998. — V. 64. -P. 4384-4389.

156. Fraysse N., Couderc F., Poinsot V. Surface polysaccharides involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis // Eur. J. Biochem. 2003. - V. 270. - P. 1365-1380.

157. Fraysse N., Jabbouri S., Treilhou M., Couderc F., Poinsot V. Symbiotic conditions induce structural modifications of Sinorhizobium sp. NGR234 surface polysaccharides // Glycobi-ology. 2002. - V. 12. - P. 741-748.

158. Frirdich E., Bouwman C., Vinogradov E., Whitfield C. The Role of galacturonic acid in outer membrane stability in Klebsiella pneumoniae II J. Biol. Chem. — 2005. — V. 280, № 30. -P. 27604-27612.

159. Frirdich E., Whitfield C. Lipopolysaccharide inner core oligosaccharide structure and outer membrane stability in human pathogens belonging to the Enterobacteriaceae II J. Endotoxin Res.-2005.-V. 11,№3.-P. 133-144.

160. Gafny R., Okon Y., Kapulnik Y., Fisher M. Adsorption of Azospirillum brasilense to corn roots // Soil Biol. Biochem. 1986. -V. 18, № 1. - P. 69-75.

161. Gage D.J. Infection and invasion of roots by symbiotic, nitrogen-fixing Rhizobia during nodulation of temperate legumes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. - V. 68, № 2. — P. 280-300.

162. Gaur D., Galbraith L., Wilkinson S.G. Structural characterization of a rhamnan and a fucorhamnan, both present in the lipopolysaccharide of Burkholderia vietnamiensis strain LMG 10926 // Eur. J. Biochem. 1998. -V. 258. - P. 696-670.

163. German M.A., Burdman S., Okon Y., Kigel J. Effects of Azospirillum brasilense on root morphology of common bean (Phaseolus vulgaris L.) under different water regimes // Biol. Fertil. Soils. 2000. - V. 32. - P. 259-264.

164. Glick B.R. The enhancement of plant growth by free-living bacteria // Can. J. Microbiol.-1995.-V. 41.-P. 109-117.

165. Glick B.R., Penrose D.M., Li J. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth-promoting bacteria // J. Theor. Biol. 1998. - V. 190, № 1. - P. 63-68.

166. Goebel E.M., Krieg N.R. Fructose catabolism in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II J. Bacteriol. 1984. - V. 159. - P. 86-92.

167. Green-Phillips S.E., Stephens B.B., Alexandre G. An energy taxis transducer promotes root colonization by Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 2004. - V. 186, № 19. -P. 6595-6604.

168. Guillot J., Genaud L., Gueugnot J., Damez M. Purification and properties of two hemagglutinins of the mushroom Laccaria amethystine // Biochemestry. 1983. - V. 22. — P. 5365-5369.

169. Haahtela K., Wartioraara Т., Sundman V. Root-associated N2-fixation (Acetylene reduction) by Enterobacteriaceae and Azospirillum strains in cold-climate spodosoils // Appl. Env. Microbiol. 1981. - V. 41, № 1. - P. 203-206.

170. Hack E., Kemp J.D. Comparison of octopine, histopine, lysopine, and octopinic acid synthesizing activities in sunflower crown gall tissues // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. -V. 78.-P. 785-791.

171. Hakomori S.I. A rapid permetylation of glicolipids and polysaccharides catalyzed by methylsulfinyl carbanion in dimethyl sulfoxide // J. Biochem. 1964. - V. 55. - P. 205-208.

172. Hauwaerts D., Alexandre G., Subrata K. D., Vanderleyden J., Zhulin I.B. A major chemotaxis gene cluster in Azospirillum brasilense and relationships between chemotaxis operons in a-proteobacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 208. - P. 61-67.

173. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. — 1983. V. 154. - P. 269-277.

174. Ho N., Kondakova A.N., Knirel Y.A., Creuzenet C. The biosynthesis and biological role of 6-deoxyheptose in the lipopolysaccharide O-antigen of Yersinia pseudotuberculosis И Mol. Microbiol. 2008. - V. T. 68, № 2. - P. 424-447.

175. Holguin G., Patten C.L., Glick B.R. Genetics and molecular biology of Azospirillum 11 Biol. Fertil. Soils. 1999. - V. 29. - P. 10-23.

176. Hoist O., Ulmer H., Flad H.D., Rietschel E.T. Biochemistry and cell biology of bacterial endotoxins // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. -V. 16. - P. 83-104.

177. Ignatov V., Stadnik G., Iosipenko O., Selivanov N., Iosipenko A., Sergeeva E. Interaction between partners in association "Wheat-Azospirillum brasilense Sp245" // In: Azospirillum

178. VI and Related Microorganism / Eds. I. Fendrik., M. Del Gallo, M. de Zamoroczy, J. Vanderleyden.- Springer, Berlin, 1995. P. 271-278.

179. Jagnow G. Differences between cereal crop cultivars in root-association nitrogen fixation, possible causes of variable yield response to seed inoculation // Plant Soil. 1990. — V. 123.-P. 255-259.

180. Jansson P.E., Keene L., Widmalm G. Computer-assisted structural analysis of polysaccharides with an extended version of CASPER using 1H- and 13C-n.m.r. data // Carbohydr. Res.- 1989.-V. 188.-P. 169-191.

181. Jofxe E., Lagares A., Mori G. Disruption of dTDP-rhamnose biosynthesis modifies lipopolysaccharide core, exopolysaccharide production, and root colonization in Azospirillum brasilense IIFEMS Microbiol. Lett. 2004. - V. 231, № 2. - P. 267-275.

182. Kannenberg E.L., Carlson R.W. Lipid A and O-chain modifications cause Rhizobium lipopolysaccharides to become hydrophobic during bacteroid development // Mol. Microbiol. — 2001.-V. 39.-P. 379-391.

183. Karapelyan G., Kaczynski Z., Iacobellis N.S., Evidente A., Hoist O. The structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide from Burkholderia gladioli pv. Agaricicola II Carbohydr. Res. 2006. - V. 341, № 7. - P. 930-934.

184. Karkhanis D., Zeltner Y., Jackson J., Carlo J. A new and improved microassay to determine 2-keto-3-dezoxyoctonate in lipopolysaccharide of gram-negative bacteria // Anal. Biochem.- 1978.-V. 85,№2.-P. 595-601.

185. Karthikeyan В., Jaleel C.A., Lakshmanan G.M., Deiveekasundaram M. Studies on rhizosphere microbial diversity of some commercially important medicinal plants // Colloids Surf. B. Biointerfaces. -2008. V. 62, № 1 - P. 143-145.

186. Katupitiya S., Millet J., Vesk M. A mutant of Azospirillum brasilense Sp7 impaired in flocculation with a modified colonization pattern and superior nitrogen-fixation in association with wheat // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. -P. 1987-1995.

187. Katzy E.I., Matora L.Y., Serebrennikova O.B., Schelud'ko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in the production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. -V. 40, № 1. - P. 73-83.

188. Kaushik R., Saxena A.K., Tilak K.V.Selection and evaluation of Azospirillum brasilense strains growing at a sub-optimum temperature in rhizocoenosis with wheat 11 Folia Microbiol (Praha). 2001. - V. 46, № 4. - P. 327-332.

189. Kefalogianni I., Aggelis G. Modeling growth and biochemical activities of Azospirillum spp. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 58, № 3. - P. 352-357.

190. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A.D., Keiser P. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil // Res. Microbiol. -1989.-V. 140.-P. 679-693.

191. Kirchhof G., Schloter M., Assmus В., Hartman A. Molecular microbial ecology approaches to diazotrophs associated with non-legumes // Soil. Biol. Biochem. 1997. - V. 29, №5/6.-P. 853-862.

192. Kloss M., Iwwannek K.H., Fendrik I., Newman E.G. Organic acids in the root exudates of Kallar grass (Diplachne fucsa (Linn.) Beauv.) // Biologia. 1984. - V. 26. - P. 107-112.

193. Kondo S., Hisatsune K. Rapid preparation of samples for compositional sugar analysis of the "degraded polysaccharide" fraction of lipopolysaccharides from Vibrio cholerae II Microbiol. Immunol. 1988. - V. 32. - P. 907-915.

194. Kosenko L.V., Zatovska T.V. Interconnection of biochemical and functional properties of lipopolysaccharides from Rhizobium leguminosarum bv. viviae II Curr. Plant Sci. Biotech, agricult. 1995. - V. 27. - P. 698.

195. Laus M.C., Logman T.J., Lamers G.E., Van Brussel A.A.N., Carlson R.W., Kijne J.W. A novel polar surface polysaccharide from Rhizobium leguminosarum binds host plant lectin // Mol. Microbiol. 2006. -V. 59, № 6. - P. 1704-1713.

196. Leclercq A., Guiyoule A., Lioui M.L., Carliniel E., Decallonne J. High homogeneity of the Yersinia pestis fatty acid composition // J. Clin. .Microbiol. 2000. - V. 38, № 4. -P. 1545-1551.

197. Leontein K., Lindberg В., Lonngren J. Assigment of absolute configuration of sugars by g.l.c. of their acetylated glycosides formed from chiral alcohols // Carbohydr. Res. — 1978. -V. 62.-P. 359-362.

198. Lerouge I., Vanderleyden J. O-antigen structural variation: mechanisms and possible roles in animal/plant-microbe interactions // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - V. 26. - P. 17-47.

199. Levanony H., Bashan Y., Romano В., Klein E. Ultrastructural localization and identification of Azospirillum brasilense Cd on and within wheat root by immunogold labeling // Plant Soil. 1989. - V. 117. - P. 207-218.

200. Li В., Xie G.L., Soad A., Coosemans J. J. Suppression of Meloidogyne javanica by antagonistic and plant growth-promoting rhizobacteria // Zhejiang. Univ. Sci. B. 2005. — V. 6, №6.-P. 496-501.

201. Lin S.Y., Young C.C., Hupfer H., Siering C., Arun A.B., Chen W.M., Lai W.A., Shen F.T., Rekha P.D., Yassin A.F. Azospirillum picis sp. nov., isolated from discarded tar // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. - V. 59. - P. 761-765.

202. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N.K. A computer-assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of 13C-NMR data // Carbohydr. Res. 1988. - V. 175. - P. 59-75.

203. Lodowska J., Wolny D., Weglarz L., Dzicrzewicz Z. The structural diversity of lipid A from gram-negative bacteria // Postepy Hig. Med. Dosw. (online). 2007. - V. 61. - P. 106-121.

204. Lugowski C., Romanowska E., Kenne L., Lindberg B. Identification of a trisaccha-ride repeating unit in the enterobacterial common antigen // Carbohydr. Res. 1983. - V. 118 — P. 173-181.

205. Lugtenberg B.J.J., Dekkers L., Bloemberg G.V. Molecular determinants of rhizosphere colonization by Pseudomonas И Annu. Rev. Phytopathol. 2001. - V. 39. -P. 461-490.

206. Lynch J.M. Interactions between bacteria and plant in the root environment // Bacteria and plants. L.N.Y., 1982. - P. 1-23.

207. Madi L., Henis Y. Aggregation in Azospirillum brasilense Cd: conditions and factors involved in cell-to-cell adhesion // Plant Soil. 1989. - V. 115. - P. 115-121.

208. Maeda Y.Y., Watanabe S.T., Chihara C., Rokutanda M. Denaturation and renatura-tion of a |3-1,6; 1,3-glucan, lentinan, associated with expression of T-cell mediated responses // Cancer Res. 1988. -V. 48. - P. 671-675.

209. Magalhaes F.M., Baldani J.I., Souto S.M., Kuykendall J.R., Dobereiner J. A new acid-tolerant Azospirillum species // An. Acad. Bras. Cienc. 1983. -V. 55. - P. 417-430.

210. Mandimba G., Heulin Т., Bally R., Guckert A., Balandreau J. Chemotaxis of free-living bacteria towards maize mucilages // Plant Soil. 1986. - V. 115. - P. 129-139.

211. Marchal K., Vanderleyden J. The "oxygen paradox" of dinitrogen-fixing bacteria // Biol. Fertil. Soils 2000. - V. 30. - P. 363-373.

212. Martin S.J., Siebeling RJ. Identification of Vibrio vidnificus О serovars with antili-popolysaccharide monoclonal antibody // J. Clin. Microbiol. 1991. - V. 29, № 8. - P. 1684-1688.

213. Martinez-Morales L.J., Soto-Urzua L., Baca B.E., Sanchez-Ahedo J.A. Indole-3-butyric acid (IBA) production in culture medium by wild strain Azospirillum brasilense // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V. 228, № 2. - P. 167-173.

214. Matora L.Y., Bogatyrev V.A., Dykman L.A. et al. Effect of plasmid content on cell-surface antigens of Azospirillum brasilense Sp245 // Abstr. 5th Intern. Sympos. N-Fixation with Non-Legume. Florence, Italy, 1990. P. 97.

215. Matora L.Y., Serebrennikova O.B., Shchygolev S.Yu. Structural effects of the Azospirillum lipopolysaccharides in cell suspensions // Biomacromolecules. 2001. - V. 2, № 2. -P. 402-406.

216. Mayer H., Tharanathan R.N., Weckesser J. Analysis of lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria // Meth. Microbiol. 1985. - V. 18. - P. 157-207.

217. McCarter L.L. Dual flagellar systems enable motility under different circumstances // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2004. - V. 7, № 1-2. - P. 18-29.

218. Mehnaz S., Weselowski В., Lazarovits G. Azospirillum canadense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007a. — V. 57, №3.-P. 620-624.

219. Mehnaz S., Weselowski В., Lazarovits G. Azospirillum zeae sp. nov., a diazotrophic bacterium isolated from rhizosphere soil of Zea mays II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 20076. -V. 57, № 12.-P. 2805-2809.

220. Merino S., Shaw J.G., Tomas J.M. Bacterial lateral flagella: an inducible flagella system // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 263, № 2. - V. 127-135.

221. Metting F.B. Jr. Structure and physiological ecology of soil microbial communities // FB Metting Jr., Soil Microbial Ecology. Marcel Dekker, New York, 1992. P. 3-25.

222. Michiels K.W., Croes C.L., Vanderleyden J. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots // J. Gen. Microbiol. — 1991. — V. 137. P. 2241-2246.

223. Michiels K.W., De Troch P., Onyeocha J., Van Gool A., Elmerich C., Vanderleyden J. plasmid localization and mapping of two Azospirillum brasilense loci that affect exopolysaccha-rides synthesis // Plasmid. 1989. - V. 21, № 1. - P. 142-146.

224. Millet E., Avivi Y., Feldman M. Effects of rhizospheric bacteria on wheat yield under field conditions // Plant Soil. 1985. - V. 86. - P. 347-355.

225. Moens S., Michiels K., Vanderleyden J. Glycosylation of the flagellin of the polar flagellum // Microbiology. 1995. - V. 141. - P. 2651-2657.

226. Molinaro A., Silipo A., Lanzetta R., Newman M.A., Dow J.M., Parrilli M. Structural elucidation of the O-chain of the lipopolysaccharide from Xanthomonas campestris strain 8004 // Carbohydr. Res. -2003. V. 338, № 3. - P. 277-281.

227. Morgan J.A.W., Bending G.D., White P.J. Biological costs and benefits to plant-microbe interactions in the rhizosphere // J. Exp. Bot. 2005. - V. 56, № 417. - P. 1729-1739.

228. Morgan P., Dow S. Bacterial adaptation for growth in low nutrient environments. Microbes in extreme environments / Eds. R.A. Herbert, G.A. Codd. L.: Academic., 1987. — P. 187-214.

229. Muratova A.Yu., Turkovskaya O.V., Antonyuk L.P., Makarov O.E., Pozdnyakova L.I., Ignatov V.V. Oil-Oxidizing potential of associative rhizobacteria of the genus Azospirillum II Microbiol. 2005. - V. 74, № 2. - P. 210-215.

230. Nagarajan T, Vanderleyden J, Tripathi AK Identification of salt stress inducible genes that control cell envelope related functions in Azospirillum brasilense Sp7 // Mol. Genet. Genomics. 2007. - V. 278, № 1. - P. 43-51.

231. Nagata Y., Burger M.M. Wheat germ agglutinin: molecular characteristic and specificity for sugar binding // J. Biol. Chem. 1974. - V. 249. - P. 3116-3122.

232. Newman M.-A., Dow J.M., Daniels M.J. Bacterial lipopolysaccharides and plant-pathogen interactions // Europ. J. Plant Pathol. 2001. - V. 107. - P. 95-102.

233. Newman M.A., Dow J.M., Molinaro A., Parrilli M. Priming, induction and modulation of plant defence responses by bacterial lipopolysaccharides // J. Endotoxin Res. 2007. -V. 13, №2.-P. 69-82.

234. Nosko P., Bliss L.C., Cook F.D. The association of free-living nitrogeu-fixing bacteria with plant roots of High Arctic graminoids // Arc. Apl. Res. 1994. - V. 26. - P. 180-186.

235. Okon Y., Itzigsohn R. The development of Azospirillum as a commercial inoculant for improving crop yields // Biotechnol. Adv. 1995. - V. 3, № 3. - P. 415-424.

236. Окоп Y., Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum-moc\i\ate.& roots // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 3-16.

237. Окоп Y., Labandera-Gonzales C.A. Agronomic applications of Azospirillum: An evaluation of 20 years worldwide field inoculation // Soil Biol. Biochem. 1994. - V. 26. -P. 591-1601.

238. Ouchterlony O., Nilsson L.-A. // Handbook Experimental Immunology / Ed. Weiz D.M. Oxford: Alden Press, 1979. V. 1. - P. 19-33.

239. Patriquin D.G., Dobereiner J., Jain D.K. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - P. 900-915.

240. Peng G., Wang H„ Zhang G., Hou W., Liu Y., Wang E.T., Tan Z. Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.-2006.-V. 56.-P. 1263-1271.

241. Pinheiro R.O., Boddey L.H., James E.K., Sprent J.I., Boddey R. Adsorption and anchoring of Azospirillum strains to roots of wheat seedlings // Plant Soil. — 2002. V. 246. — P. 151-166.

242. Poxton I.R. Antibodies to lipopolysaccharide // J. Immunol. Meth. 1995. - V. 186. -P. 1-15.

243. Puvanesarajah V., Schell F.M., Gerhold D., Stacey G. Cell surface polysaccharides from Bradyrizhobium japonicum and a non-nodulating mutant // J. Bacteriol. — 1987. — V. 169. — P.137-141.

244. Pyrog T.P. Biological functions of microbial exopolysaccharides // Mikrobiol. Z. -2001.-V. 63, №5.-P. 80-101.

245. Ramey B.E., Koutsoudis M., von Bodman S.B., Fuqua C. Biofilm formation in plant-microbe associations // Curr. Opin. Microbiol. 2004. - V. 7, № 6. - P. 602-609.

246. Ray M.K., Seshukumar G., Shivaji S. Phosphorylation of lipopolysaccharides in the Antarctic psychrotroph Pseudomonas syringae: a possible role in temperature adaptation // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 4243-4249.

247. Reinhold В., Hurek Т., Fendrik I. Strain-specific chemotaxis of Azospirillum spp. // J. Bacteriol.- 1985.-V. 162, № l.-P. 190-195.

248. Rietschel E.T., Kirikae Т., Schade F.U., Mamat U., Scmidt G., Bacterial endotoxin: molecular relationship and structure to activity and function // FASEB J. — 1994. V. 8. — P. 217-225.

249. Rictschel E.T., Wollenweber H.W., Zahringer U., Luderitz O. Lipid A, the lipid component of bacterial polysaccharides: relation of chemical structure to biological activity // Klin. Wochenschr. 1982. - V. 60, № 4. - P. 705-709.

250. Rocchetta ILL., Burrows L.L., Lam J.S. Genetics of O-antigen biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - V. 63, № 3. - P. 523-553.

251. Rocha R.E.M., Baldani J.I., Dobereiner J. Specificity of infection by Azospirillum spp. in plants with C4 photo synthetic pathway / Associative Nitrogen Fixation. Boca Ration: CRC Press, 1981.-V. 2.-P. 67-69.

252. Rodriguez H., Gonzalez Т., Goire I., Bashan Y. Gluconic acid production and phosphate solubilization by the plant growth-promoting bacterium Azospirillum spp. // Naturwissen-schaften. 2004. - V. 91, № 11. - P. 552-555.

253. Rodriguez-Navarro D.N., Dardanelli M.S., Ruiz-Sainz J.E. Attachment of bacteria to the roots of higher plants II FEMS Microbiol. Lett. 2007. - V. 272, № 2. - P. 127-136.

254. Roy S.S., Mittra В., Sharma S., Das Т.К., Babu C.R. Detection of root mucilages using an anti-fucose antibody // Annal. Botany. 2002. - V. 89. - P. 293-299.

255. Russo A., Vettori L., Felici C., Fiaschi G., Morini S., Toffanin A. Enhanced micro-propagation response and biocontrol effect of Azospirillum brasilense Sp245 on Prunus cerasifera L. clone Mr.S 2/5 plants // J. Biotechnol. 2008. -V. 134. - P. 312-319.

256. Sadasivan L., Neyera C.A. Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum: exopolysaccharides and cyst formation // J. Bacteriol. 1985. - V. 163. - P. 716-723.

257. Saleem M., Arshad M., Hussain S., Bhatti A.S. Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V. 34, № 10. - P. 635-648.

258. Saubidet M.I., Barneix A.J. Growth Stimulation and nitrogen supply to wheat plants inoculated with Azospirillum brasilense II J. Plant Nut. 1998. - V. 21. - P. 2565-2577.

259. Savardecker J.S., Slonecker J.H., Jeans A. Quantitative determination of monosaccharides as their alditol acetates by gas liquid chromatography // Anal. Chem. — 1965. — V. 37. — P. 1602-1603.

260. Schelud'ko A.V., Makrushin KV, Tugarova AV, Krestinenko VA, Panasenko VI, Antonyuk LP, Katsy EI. Changes in motility of the rhizobacterium Azospirillum brasilense in the presence of plant lectins I I Microbiol. Res. 2007. - Epub ahead of print.,

261. Schromm A.B., Brandenburg K., Loppnow H., Moran A.P., Koch M.H.J., Rietschel E.T.H., Seydel U. Biological activities of lipopolysaccharides are determined by the shape of their lipid A portion // Eur. J. Biochem. 2000. - V. 267. - P. 2008-2013.

262. Sengupta P., Bhattacharya Т., Majumed M. Determination of O-antigenic polysaccharide from Escherichia coli 0128 by ELISA-inhibition study 11 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. - V. 28, № 2. - P. 133-137.

263. Shashkov A.S., Lipkind G.M., Knirel Y.A., Kochetkov N.K. Stereochemical factors determining the effects of glycosylation on the 13C chemical shifts in carbohydrates. // Magn. Reson. Chem. 1988. - V. 26. - P. 735-747.

264. Shaw L.J., Morris P., Hooker J.E. Perception and modification of plant flavonoid signals by rhizosphere microorganisms // Environ. Microbiol. — 2006. — V. 8, № 11. — P. 1867-1880.

265. Silipo A., Molinaro A., Sturiale L., Dow J.M., Erbs G., Lanzetta R., Newman M.A., Parrilli M. The elicitation of plant innate immunity by lipopolysaccharide of Xanthomonas campestris И J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 33660-33668.

266. Silversmith R.E., Levin M.D., Schilling E., Bourret R.B. Kinetic characterization of catalysis by the chemotaxis phosphatase CheZ. Modulation of activity by the phosphorylated CheY substrate // J. Biol. Chem. 2008. - V. 283, № 2. - P. 756-765.

267. Skvortsov I.M., Ignatov V.V. Extracellular polysaccharides and polysaccharide-containing biopolymers from Azospirillum species: properties and possible role in interaction with plant roots // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 165. - P. 223-229.

268. Sly L.I., Stackebrandt E. Description of Skermanella parooensis gen. nov. to accommodate Conglomeromonas largomobilis subsp. Largomobilis to the genus Azospirillum II Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - V. 49. - P. 541-544.

269. Soto M.J., Sanjuan J., Olivares J. Rhizobia and plant-pathogenic bacteria: common infection weapons // Microbiology. 2006. - V. 152, Pt 11. - P. 3167-3174.

270. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetics, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24. - P. 487-506.

271. Stephens B.B., Loar S.N., Alexandre G. Role of CheB and CheR in the complex chemotactic and aerotactic pathway of Azospirillum brasilense II J. Bacterid. 2006. - V. 188, № 13. - P. 4759-4768.

272. Stock J.B., Surette M.G. Chemotaxis. In Escherichia coli and Salmonella typhi-murium: Molecular and Cellular Biology // American Society for Microbiol. 1996. - V. 1. -P. 1103-1129.

273. Takayama K., Qureshi N., Macagani P. Complete structure of lipid A obtained from the lipopolysaccharides of the heptoseless mutant Salmonella typhimurium II J. Biolog. Chem. -1983.-V. 258.-P. 12801-12803.

274. Tal S., Smirnoff P., Okon Y. The regulation of poly-P-hydroxybutyrate metabolism in Azospirillum brasilense during balanced growth and starvation // J. Gen. Microbiol. — 1990. — V. 136.-P. 1191-1196.

275. Taylor B.L., Zhulin I.B., Johnson M.S. Aerotaxis and other energy-sensing behavior in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1999. - V. 53. - P. 103-128.

276. Thomas C.J., Surolia A. Mode of molecular recognition of L-fucose by fucose-binding legume lectins. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2000. — V. 268, № 2. P. 262-267.

277. Thomson J., Curtis M.A., Miller S.P.F. N5-(l-Carboxyethyl)-ornithine a new amino acid from the intracellular pool of Streptococcus lactis II J. Bacteriol. 1986. - V. 167, № 2. -P. 522-529.

278. Trent M.S., Stead C.M., Tran A.X., Hankins J.V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis // J. Endotoxin Res. 2006. - 12, № 4. - P. 205-223.

279. Tsagou V., Aggelis G. Growth dynamics of Azospirillum lipoferum at steady and transitory states in the presence of NH // J. Appl. Microbiol. 2006. - V. 100, № 2. - P. 286-295.

280. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver strain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. - V. 119. - P. 115-119.

281. Tyler M.E., Milam J.R., Smith R.L., Schank S.C., Zuberer D.A Isolation of Azospirillum from diverse geographic regions // Can. J. Microbiol. 1979. - V. 25, № 6. -P. 693-697.

282. Van Loon L.C., Bakker P.A., Pieterse C.M. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 1998. - V. 36. - P. 453-483.

283. Van Rhijn P., Fujishige N.A., Lim P.O., Hirsch A.M. Sugar-binding activity of pea lectin enhances heterologous infection of transgenic alfalfa plants by Rhizobium leguminosarum biovar viciae II Plant Physiol. 2001. - V. 126, № 1. - P. 133-144.

284. Vanbleu E., Choudhury B.P., Carlson R.W., Vanderleyden J. The nodPQ genes in Azospirillum brasilense Sp7 are involved in sulfation of lipopolysaccharides // Environ. Microbiol. -2005. — V. 7.-P. 1769-1774.

285. Vande Broek A., Lambrecht M., Vanderleyden J. Bacterial chemotactic motility is important for the initiation of wheat root colonization by Azospirillum brasilense II Microbiol. -1998. V. 144. - P. 2599-2606.

286. Vande Broek A., Vanderleyden J. The role of bacterial motility, chemotaxis and attachment in bacteria-plant interactions // Mol Plant-Microbe Interact. 1995. - V. 8. - P. 800-810.

287. Vendan RT, Thangaraju M.Development and standardization of cyst based liquid formulation of Azospirillum bioinoculant. // Acta Microbiol. Immunol. Hung. 2007. — V. 54, № 2. -P. 167-177.

288. Vessey J.K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers // Plant Soil. -2003.-V. 255.-P. 571-586.

289. Watanabe S., Kodaki Т., Makino K. L-arabinose 1-dehydrogenase: a novel enzyme involving in bacterial L-arabinose metabolism // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 2005. - V. 49. -P. 309-310.

290. Weintraub A. Immunology of bacterial polysaccharide antigens // Carbohydr. Res. -2003. V. 338, № 23. - P. 2539-2547.

291. Westby C.A., Cutshall D.S., Vigil G.V. Metabolism of various carbon sources by Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 1983. - P. 1369-1372.

292. Whipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere // J. Exp. Bot. -2001. V. 52, Spec Issue. - P. 487-511.

293. Xie C.H., Yokota A Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from the roots of the rice plant Oiyza sativa II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. - V. 55, Pt 4. - P. 1435-1438.

294. Yahalom E., Dovrat A., Okon Y., Czosnek H. Effect of inoculation with Azospirillum brasilense strain Cd and Rhizobium on the root morphology of burr medic (Medicago poly-morpha L.) // Isr. J. Bot. 1991. -V. 40. - P. 155-164.

295. Yang C.H., Crowley D.E. Rhizosphere microbial community structure in relation to root location and plant iron nutritional status // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. -P. 345-351.

296. Yost C.K., Rochepeau P., Hynes M.F. Rhizobium leguminosarum contains a group of genes that appear to code for methyl-accepting chemotaxis proteins // Microbiol. 1998. - V. 144. -P. 1945-1956.

297. Zamudio M., Bastarrachea F. Adhesiveness and root hair deformation capacity of Azospirillum strains for wheat seedlings // Soil Biol. Biochem. 1994. - V. 26. - P. 791-797.

298. Zamzc S.E., Ferguson M.A., Moxon E.R., Dweek R.A., Rademacher T.W. Occurrence of 2-keto-deoxyoctonic acid 5-phosphate in lipopolysaccharides of Vibrio cholerae Ogawa and Inaba // Biochem. J. 1987. - V. 245. - P. 583-587.

299. Zdorovenko E.L. Extracellular and cell-wall-bound lipopolysaccharides: differences and similarities in the structure and biological activities // Abstracts of 2nd Baltic meeting on microbial carbohydrates. Rostock, October 4-8. 2006. - P. 26.

300. Zhou Y., Wei W., Wang X., Xu L., Lai R. Azospirillum palatum sp. nov., isolated from forest soil in Zhejiang province, China // J. Jen. Appl. Microbiol. 2009. - V. 55. - P. 1-7.

301. Zhulin I.B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back // Adv. Microb. Physiol. 2001. -V. 45. - P. 157-198.

302. Zhulin I.B., Armitage J.P. The role of taxis in the ecology of Azospirillum II Symbiosis. 1992. - V. 13.-P. 199-206.

303. Zhulin I.B., Armitage J.P. Motility, chemokinesis and methylation-independent chemotaxis of Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. — 1993. — V. 175. — P. 952-958.

304. Zhulin I.B., Bespalov V.A., Johnson M.S., Taylor B.L. Oxygen taxis and proton motive force in Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 5199-5204.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Бойко, Алевтина Сергеевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурные особенности липополисахаридов азоспирилл в связи с их участием в коммуникации микроорганизмов в ризосфере - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы