Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение липополисахаридов бактерий рода Azospirillum и их роли при контактных взаимодействиях микроорганизмов с растениями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение липополисахаридов бактерий рода Azospirillum и их роли при контактных взаимодействиях микроорганизмов с растениями"

РГй ол

На правах рукописи

/ Б и;0Л 1893

СЕРЕБРЕННИКОВА Оксана Борисовна

Изучение липополисахаридов бактерий рода Агозр1гН1ит и их роли при контактных взаимодействиях микроорганизмов с растениями

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-1998

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растении и микроор низмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН), г. Саратов

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный coтpyд^

Мшпор а Л.Ю

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Таранен ко Т. Л

доктор медицинских наук, профессор

Куляш Ю.В.

Ведущая организация: Государственный научный центр прикладной микробиоло Министерства здравоохранения РФ, 142279, п. Оболе! Серпуховской район, Московская область.

Защита состоится 8 июля 1998 г. на заседании диссертационного совета Д074.32 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микр (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб"

Автореферат разослан " "_ 1998 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Г.А. Корш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Выяснение молекулярных основ контактных взаимодей-гвий ассоциативных бактерий с растительными партнерами становится одним из точевых моментов в решении комплекса проблем, связанных с использованием яв-гния ассоциативной азотфиксации для создания современных средств защиты и по-лшения производительности сельскохозяйственно значимых растений. Очевидно, го для изучения механизма, определяющего такие взаимодействия, большой интерес эедставляют данные о структуре и функциях компонентов клеточной поверхности астений и микроорганизмов.

Липополисахариды (ЛПС) грамотрицательных бактерий являются уникальным шссом биополимеров. Располагаясь на внешней поверхности наружной мембраны и эразуя комплексы с белками, ЛПС принимают непосредственное участие во взаимо-:йствии бактерий с окружающей средой. В целом ряде работ, посвященных изучено бобово-ризобиального симбиоза, было показано участие бактериальных ЛПС в ггановлении симбиотических отношений (Kato et al., 1979; Wolpert and Albersheim, )76). Активная роль ЛПС была установлена также и при фитопатогенезе - в экспе-шентах по ингибированию ЛПС процессов образования опухолей у двудольных 1стений, вызванных патогенными агробактериями (Whatley et al., 1976).

В отличие от ризобий и агробактерий, структура и биологические свойства ЛПС :социативных бактерий, в частности, азоспирилл в литературе отражены слабо. Сво->дноживущие грамотрицательные бактерии рода Azospirillum способны вступать в :социативные взаимоотношения с растениями, но не используют при этом ярко вы-1женных атрибутов симбиоза, присущих, например, ризобиям. Большое внимание к юспириллам, особенно заметное по публикациям в отечественной и зарубежной ггературе последних лет, связано с их потенциально высокой азотфиксирующей ггивностью, способностью продуцировать фитогормоны и иные физиологически ггивные вещества, частым обнаружением азоспирилл в ризосфере злаков в самых анообразных сельскохозяйственных регионах.

Трудности исследований взаимоотношений растений с представителями свобод-зживущей микрофлоры отчасти объясняются отсутствием признанного физиологи-:ского теста, характеризующего результаты взаимодействий таких микроорганизмов растениями. Установление ассоциативных взаимоотношений между партнерами в шном случае не приводит к образованию у растений каких-либо четко определяе-ых морфологических структур, подобных клубенькам, опухолям и пр. Таким обра-iM, при оценке участия ЛПС азоспирилл в их контактных взаимодействиях с расте-1ями оказывается существенным выбор информативных физиолого-биохимических жтериев, характеризующих результаты этих взаимодействий.

При выборе метода изучения клеточной поверхности почвенных бактерий мы от-1ем предпочтение иммунохимическому анализу, учитывая при этом два.обстоятельна. Во-первых, высокую селективность и чувствительность определения разнооб-изных органических соединений в реакциях типа антиген (Аг) + антитело (Ат). Во-орых, достаточную убедительность предположения о том, что антигенные компо-:нты клеточной поверхности исследуемых микроорганизмов могут оказаться доста-

точно активными также и при их взаимодействии с клетками растительных партии ров.

Целью данной работы было получение сведений об особенностях синтеза строения полисахаридной части ЛПС азоспирилл в связи с проблемой микробно диссоциации; анализ гетерогенности фракций бактериальных ЛПС и оценка их во: можного вклада в формирование внеклеточных структур азоспирилл - капсульног полисахарида (КПС) и экзополисахарида (ЭПС); оценка участия бактериальных ЛП( в контактных взаимодействиях азоспирилл с растениями. В соответствии с этим, данной работе были сформулированы следующие основные задачи:

1. Оценить изменения в структуре ЛПС типового штамма А.ЬгазИегие Бр1 при И-диссоциации.

2. Исследовать антигенный состав и особенности строения О-антигенной части ЛП< штамма А.ЬгазИеюе Бр245 и оценить вклад отдельных фракций О-специфически полисахаридов в формирование КПС и ЭПС данных бактерий.

3. Исследовать роль ЛПС азоспирилл при бактериальной адгезии на корнях пшен* цы и в модельных растительных системах.

4. Оценить участие ЛПС азоспирилл в запуске ответных биохимических реакци инокулированных растений.

Научная новизна работы состоит в том, что в ней впервые для азоспирилл ус тановлен нетипичный случай Я-Б диссоциации для штамма А.ЬгсяИете Бр7, при кс торой не происходит качественных изменений в структуре полисахаридных звенье О-специфических полисахаридов (О-ПС), а изменяется лишь степень их антигеннс сти. Для объяснения этого феномена предложена схема, иллюстрирующая перерас пределение вкладов двух основных О-антигенов, присущих как исходному бактер1 альному штамму, так и его Б-варианту, в "архитектуру" клеточной поверхности в зг висимости от возраста культур.

Для штамма А.ЬгаяИете Бр245 впервые показано, что и капсула, и ЭПС этог штамма состоят из вещества, гомологичного одному из двух выявленных для него С ПС.

Установлено стимулирующее действие предобработки растительного материал препаратами изолированных ЛПС на прикрепление бактерий А.ЬгазИете Бр245 корням пшеницы и на агглютинацию морковных клеток бактериями данного штамм; Выявлено также агглютинирующее действие изолированных ЛПС при их добавлени к суспензиям азоспирилл, что может быть связано с проявлением эффекта стерич( ского исключения клеток, аналогичного известному из литературы действию прот< огликанов на суспензии клеток животных.

Показано, что предобработка корней пшеницы препаратом изолированных ЛП< А-ЬгаяИегке Бр245 приводит к усилению синтеза белков апопласта, сравнимому аналогичным эффектом при инокуляции растений целыми клетками данного штамм; Это можно считать свидетельством возможной активной роли ЛПС азоспирилл так» и на уровне, обеспечивающем запуск специфических ответных реакций со сторон] растений при их взаимодействии с клетками исследуемых нами микроорганизмов.

Практическая значимость работы заключается, в частности, в том, что н примере решения конкретных задач изучения азоспирилл в ней продемонстрирован

:окая эффективность комплексного иммуноанализа как средства, позволяющего i относительно низких затратах на несложном оборудовании получать разнообраз-о информацию о тонких деталях структурной организации клеточной поверхности 1венных бактерий.

Выполненная в работе идентификация О-специфического полисахарида, гомоло-[ного по составу основным внеклеточным структурам A.brasilense Sp245, может :спечить целенаправленный поиск эффективных биоспецифических зондов при »ведении цитохимических, таксономических и экологических исследований азос-»илл.

Развитая в работе методология и полученные результаты скрининга большого :ла мутантов азоспирилл с измененными свойствами клеточной поверхности ис-1ьзованы при проведении плановых НИР сотрудниками Лаборатории генетики кроорганизмов (ЛГМ) и Лаборатории физической химии клеточных структур Е>ХКС) ИБФРМ РАН, а также при выполнении проекта "Создание эффективной »тест-системы для мониторинга почвенных азотфиксирующих бактерий, ассоции-(анных с высшими растениями" в соответствии с Госзаказом от Миннауки РФ в шах ГНТП "Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии 1иотехнологии" (Распоряжение № 816ф от 15.03.95 г. и последующие, научный :оводитель зав. лаб. к.ф.-м.н. Щеголев С.Ю.).

Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и томных работ студентами биологического факультета СГУ. Основные положения, выносимые автором на защиту:

Нетипичный характер микробной диссоциации типового штамма A.brasilense Sp7 и интерпретация выявленных закономерностей с учетом особенностей О-антигенного строения клеток данного штамма.

Явление иммунохимической гетерогенности О-специфических полисахаридов A.brasilense Sp245 и доказательство антигенной идентичности материала внеклеточных структур (КПС и ЭПС) данного штамма одному из двух исследованных О-ПС.

Агглютинирующее действие ЛПС азоспирилл, способствующее адгезии бактерий на растительном материале.

Доказательство активной роли ЛПС азоспирилл при их контактных взаимодействиях с растениями на уровне, обеспечивающем запуск специфических ответных реакций со стороны партнера.

Работа выполнена в ЛФХКС ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой Р "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микро-анизмов и растений" (№ гос. per. 01890017743, научный руководитель зав. лаб. к. л. н. Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту "Создание зективной биотест-системы для мониторинга почвенных азотфиксирующих бакте-i, ассоциированных с высшими растениями" и проектом INTAS "Физико-[ическое исследование бактериальных метаболитов, молекулярных структур и комплексов, вовлеченных в растительно-микробные ассоциативные взаимоотно-шя" (проект 96-1015).

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлен] виде устных и стендовых сообщений на: 1-ой Европейской конференции по азотф сации (Сегед, Венгрия, 1994), Рабочем совещании "Azospirillum и родственные м роорганизмы" (Шарвар, Венгрия, 1994), 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфю ции (Москва, Россия, 1995), 10-ом Международном конгрессе по азотфикса1 (Санкт-Петербург, Россия, 1995), 8-ом Международном конгрессе по молекулярн микробно-растительным взаимодействиям (Ноксвил, США, 1996), 2-ой Европейа конференции по азотфиксации (Познань, Польша, 1996), 11-ом Международном к грессе по азотфиксации (Париж, Франция, 1997), а также на отчетных научных к ференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ в зарубежных и оте ственных научных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обз литературы, трех глав, включающих описание материалов и методов исследоваи изложение полученных результатов с их обсуждением и заключение, выводов и с ска использованных литературных источников. Работа изложена на страни машинописного текста, включает 22 рисунка и 3 таблицы. Список литературы сод жит 163 наименования, в том числе - 145 зарубежных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования

В работе использовали типовые штаммы почвенных азотфиксирующих бакте! A. brasilense Sp245 и Sp7 (R-вариант), а также их мутанты: S-вариант штамма Sp мутанты штамма Sp245 - КМ018, КМ252 и КМ348 с измененной структурой ЛПС вариант штамма Sp7 был любезно предоставлен сотрудником ЛГМ ИБФРМ Р. Л.П. Петровой. Канамицин-устойчивые мутанты с измененной структурой ЛПС бь получены в результате омегонового мутагенеза штамма Sp245. Показано, что инс ции омегона у этих мутантов локализованы в плазмиде 120 MD (Katzy et al., 19! Данные мутанты были любезно предоставлены для наших исследований сотрудни ми ЛГМ ИБФРМ РАН Е.И. Кацы и А.В. Шелудько по результатам скрининга ою 400 мутантных штаммов с моноспецифическими Ат против ЛПС исходного штамм

Бактерии выращивали в течение 18 часов на жидкой синтетической малатной с де (Doebereiner and Day, 1976) и в течение 72 часов на плотной среде того же сост с добавлением 1.5% агара при 30 °С. Культуры отмывали в забуференном фосфат« физрастворе (ЗФР) и осаждали центрифугированием.

Для получения моноспецифических Ат к ЛПС азоспирилл использовали ори нальную методику иммунизации кроликов целыми бактериальными клетками, пр варительно обработанными 2%-ным глутаровым альдегидом (Matora et al., 19! Фракции IgG получали из антисывороток осаждением сульфатом аммония (Кэбо Мейер, 1968). Титры антител определяли в реакциях иммунодиффузии и агглютн ции.

Препараты ЛИС полупим по мегод\ Хичкока и lïpavна (Hitchcock and Broun. )83) протеиназной обработкой целых клегок. а также экстракцией с помошыо ОД ГА ,eive et ai. 1968). В отдельных экспериментах использовали хроматографически штенные препараты ЛГТС штаммов Sp7 и Sp245. а также препараты КПС и ЭГ1С таммa Sp245. выделенные и любезно предоставленные нам сотрудниками Лабора-)рии биоорганической химии ИБФРМ РАН.

Двойную иммунодиффузию проводили согласно стандартной процедуре по Оух-:рлони (Ouchterlonv and Nilsson. 1979), линейный и тандемный иммуноэлектрофоре-.1 - по описанию Аксельсен с соавторами (Axelson et ai, 1973).

Выделенный ЛПС анализировали с помощью ДСН-электрофореза по методу Хич-жа и Брауна (Hitchcock and Brown, 1983) в 12.5% ПААГ. С целью визуализации ПС гели окрашивали серебром (Tsai and Frasch. 1982) и/ил» использовали для элек-юпереноса на нитроцеллюлозные фильтры ("Millipore", 0.45 мкм) с последующей имунодетекцией блотов (Tsang et ai, 1983).

Дот-анализ целых бактериальных клеток, иммобилизованных на нитроцеллюлозе, эоводили по методике, описанной Богатыревым с соавторами (Bogatyrev et ai, )91). В качестве биоспецифического маркера, выявляющего адсорбированные на

тетках Ат, использовали конъюгат коллоидного золота с белком А (непрямое мече-«).

Исследование влияния предобработки проростков пшеницы препаратом ЛПС на 1гезию бактерий на корнях растений проводили с помощью радиоиндикаторного тализа по методике, описанной в статье Солововой с соавторами (Solovova et al., )94). В работе использовали сорт пшеницы Саратовская 29 (яровой гексаплоид). элученный из НИИСХ Юго-Востока (г. Саратов).

Эксперименты по агглютинации суспензии морковных клеток под действием бак-:рий проводили по стандартной методике (Matthysse et ai, 1981). Способность ЛПС глютиннровать 2%-ную суспензию эритроцитов исследовали методом серийных 5укратных разведений ЛПС в планшетах с U-образнымп лунками.

Влияние обработки корней пшеницы препаратом ЛПС на индукцию ответных ре-щий у растений оценивали по изменению синтеза мажорных белков апопласта. С технизацию, проращивание зерен, инокуляцию проростков и выделение внеклеточных :лков из корней проростков пшеницы проводили как описано в работе Игнатова с >авторами (Ignatov et ai, 1994).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности R-S диссоциации типового штамма A.brasilense Sp7

Явление диссоциации бактерий известно с 20-х гг. как своеобразная форма измен-iBocTii. в основе которой лежат мутации. Она проявляется в образовании двух типов элоний при рассеве чистой культуры на плотной питательной среде. Согласно тра-щионным представлениям о микробной диссоциации, различие между R- и S-фиантами обусловлено отсутствием О-спеипфических цепей в составе ЛПС у R-фианта.

В 1987 г. впервые была обнаружена спонтанная изменчивость морфологии коле ний штамма А.ЬгазИепяе Бр7 (Матвеев с соавт., 1987). Было показано, что образов; ние стабильной Б-формы штамма Бр7 связано с исчезновением плазмиды 115 М1 (р115), характерной для плазмидного профиля исходной Я.-формы. Заметим, чт внешний вид колоний "молодых" (18-часовых) культур Бр7-Я и Бр7-Б очень схоя Однако по прошествии примерно 72 часов исходный штамм Бр7-И. формирует шерс

ховатые колонии с неровным краем, часто врастак щие в агар. При этом колонии мутантного Бр7-штамма остаются гладкими и блестящими и не прс являют даже со временем фенотипических признако] характерных для исходного штамма.

Мы исследовали структурные изменения ЛПС Б и Б-вариантов типового штамма А.ЬгазИетг Бр7. 0< новным инструментом анализа служили моноспещ фические Ат к ЛПС, полученные для 18-часовы ("молодых") и 72-часовых ("старых") культур Я- и 5 форм. Ат к ЛПС получали иммунизацией кролико целыми клетками, обработанными 2%-ным раствс ром глугарового альдегида. Ранее было показано, чт такой способ иммунизации приводит к синтезу Ат н липополисахаридные Аг азоспирилл (Ма1:ога е/ а! 1995).

При сравнении результатов иммунизации живот ных молодой и старой Я-формами бактерий в имм) ноэлектрофоретическом профиле последней отмеч( но исчезновение одной полосы преципитации. Т.е Ат к старой Я-форме выявляли только один из дву О-ПС, характерных для ЛПС как Я-, так и Б-форм] (рис.1). При этом сами препараты были идентична между собой по числу выявляемых (двух) антигенны компонентов. Для Б-формы наблюдали обратну! картину: только Ат к старой Б-форме выявляли об Аг в препаратах ЛПС (рис.2) (необходимо отметит) что на рис. 1-6, представляющих результаты иммунс химических экспериментов, нами использован сквозное обозначение всех Аг и Ат).

Таким образом, для штамма А.ЬгазИете Бр7 м] обнаружили нетипичный случай Я-Б диссоциацш при которой не происходит качественных изменени в структуре полисахаридных звеньев О-ПС, а измею ется лишь их антигенность. Заметим, что выявленны особенности иммунного ответа не могут быть связ; ны с гетерогенностью самих культур, поскольку дл каждого эксперимента их однородность контролирс валась по плазмидному составу: наличию (у Бр7-Р или отсутствию (у Бр7-Б) в плазмидном профил плазмиды р115.

Рис. 1. Линейный иммуно-электрофорез препаратов ЛПС, выделенных из молодых культур Бр7-Б (2) и Бр7-Я (3), с Ат к молодой Я-форме (с) и старой Я-форме (<1).

Л

Рис. 2. Линейный иммуно-электрофорез препарата ЛПС, выделенного из молодой культуры Бр7-Я (3), с Ат к молодой Б-форме (а) и старой Б-форме (Ь).

Мы предположили (схема на ис.З), что утрата р 115 приводит к ому, что у мутантного S-варианта зменяется характер синтеза одного з О-ПС, который мы условно обо-начили как R-антиген. По анало-ии, второй из двух идентифициро-анных О-ПС мы обозначили как S-нтиген. В рамках данной схемы [ы допускаем, что основной вклад формирование характерной мор-юлогии колоний для старой R-юрмы, очевидно, вносит R-нтиген. Преимущественным син-езом именно этого О-ПС на доста-очно поздних стадиях роста куль-уры Sp7-R и его экранирующим ействием по отношению ко второ-:у О-ПС (S-антигену), можно, по-идимому, объяснить морфологи-еские (и упомянутые выше имму-ологические) особенности R-юрмы A.brasilense Sp7. У молодой ультуры, утратившей р 115 (S-форма), R-антиген, очевидно, сильно экранирован S-нтигеном, и заметно иммуногенным этот О-ПС становится только у старой S-формы актерий (рис.3).

Рис. 4 и 5 демонстрируют результаты экспериментов, подтверждающих данную

Рис. 3. Предполагаемая схема R-S диссоциации A.brasilense Sp7:

Y.

. ■ R-антиген

Y <

i - S-антиген

. v . -

r'[ ~ ; i-

%

*t

• ••Р.-

k'; (

л

I

: .• f..

Рис. 4. Линейный иммуноэлектрофорез репаратов ЛПС, выделенных из моло-ых культур - Sp7-S (2) и Sp7-R (3), с Ат молодой S-форме (а).

Рис. 5. Линейный иммуноэлектрофорез препарата ЛПС, выделенного из молодой культуры 8р7-Я (3), с Ат к молодой Б-форме (а) и старой Я-форме (с1).

' )

i '

v _ w ' HI

G U

Рис. 6. Сравнительный иммунодиффузион-ный анализ препаратов ЛПС, выделенных из 4-х видов культур, с 4-мя вариантами Ат к ним:

1-ЛПСSCT

2 - ЛПС SM

3 - ЛПС RM 4-ЛПС Ял

а - Ат к Su

b - Ат к Sct

с - At к RM d - At к Rc

S-

- . * jy

1 2 3

Рис.7. Электрофоретическое разделение в ПААГ ЛПС молодой Л-формы Бр7 (I) и визуализация антигенных детерминант в иммуноб-лоте с Ат к молодой Б-форме (2) и старой Б-форме (3). Б - Б-антиген, Я - И-антиген.

схему. Ат к молодой S-форме выявляю только один антиген в препаратах ЛПС независимо от того, из какой форм: бактерий они были выделены (рис.4). ] то время как Ат к молодой S-форме и А к старой R-форме выявляют разны антигены в составе одного и того ж препарата ЛПС (рис.5). На рис.6 приве дены сравнительные данные, получеь ные для 4-х типов препаратов ЛПС с 4 мя видами Ат к ним. Можно видеть, чт картина иммунопреципитации зависи от вида использованных Ат и не зависи от вида и возраста культуры, из которо выделен Аг - препарат ЛПС. Таким оt разом, все изложенные выше экспер!-ментальные результаты согласуются приведенной на рис.3 схемой.

На рис.7 представлены результат] электрофоретического разделения в пс лиакриламидном геле (ПААГ) ЛПС мс лодой R-формы (1) и выявления £ антигена с помощью Ат к молодой S форме (2). Рис.7 (3) демонстрирует та* же четкое выявление R-антигена в сс ставе данного ЛПС с помощью Ат к стг рой S-форме, поскольку, как было отме чено выше, у старой S-формы иммунс генным становится также и R-Ar. S-Ar данном случае выявляется более четк (увеличение интенсивности полос), ве роятно, благодаря наличию у Я- и £ антигенов общих детерминант.

Подводя итог результатам, привс дённым в данном разделе, можно, пс видимому, констатировать непримет мость в нашем случае традиционны представлений о микробной диссоциг ции, подробно описанной для энтерс бактерий. Имеется достаточно основ; ний для заключения о том, что как R так и S-варианты A.brasilense Sp7 имею в своём составе полноценный ЛПС развитой структурой О-антигена. Сам ж

Рис. 8. Двойная иммунодиффузия препаратов ЛПС штаммов А.ЬгавИепзе 5р245 (1), КМ018 (2), КМ252 (3) и КМ348 (4) с Ат на ЛПС А.ЬгсиПете Бр245 (А)

еход от Я- к Б-варианту связан, по нашему мнению, с перераспределением вкла-двух О-ПС (чётко выявленных как для исходного штамма, так и для его Банта) в архитектуру клеточной поверхности независимости от возраста культур.

2. Иммунохимическая гетерогенность О-специфических полисахаридов штамма А-ЬгавНепве Бр245

ммунохимическое исследование ЛПС, вьщеленных из наружной мембраны бакте-днкого штамма А. ЬгазИете Бр245 и его антов с измененной структурой ЛПС 1018, КМ252 и КМ348) позволило уста-ить, что для штамма Бр245 (как и для ового штамма Бр7) характерно наличие х О-ПС в составе ЛПС, которые мы значили как 0-ПС1 и 0-ПС2. На рис.8 сно видеть, что Ат против ЛПС исход-э штамма выявляют 0-ПС1 в препарате

2 штамма КМ018 и 0-ПС2 в препаратах

3 штаммов КМ252 и КМ348. На рис.9 азаны электрофоретические профили И этих штаммов и визуализованы анти-тае детерминанты в результате имму-ерментного анализа с Ат к ЛПС штамма 45.

влияние пиков преципитации, образо-яых препаратами ЛПС штамма Бр245 и мутантов, в тандемном иммуноэлектро-езе свидетельствует о наличии общих 1генных детерминант в составе О-ПС 1 и ЕС2 (рис.10, 11). Аналогичное иммунос-лвание отмечено в дот-анализе интакт-: клеток штаммов КМ018 и КМ252 с оклональными Ат, специфичными к I) исходного штамма 5р245, выявляемое редством комплекса белок А + коллоид-золото. Эти данные также свидетельст-г о наличии в составе 0-ПС1 и 0-ПС2 1актерных для КМ018 и КМ252, соот-:твенно) абсолютно идентичных анти-1ых детерминант.

Эдновременно с этим, на иммуноэлек-}>орефаммах препаратов ЛПС с поли-иальными Ат к ЛПС Бр245 (см. рис.10 и отчетливо наблюдаются так называемые >ры (отмечены стрелками). Это, в свою

2 3 4 1

Рис. 9. Электрофоретическое разделение в ПААГ ЛПС штамма А.ЬгазНеюе Бр245 и его мутантов и визуализация антигенных детерминант с помощью иммуноблота:

А — электрофоретический профиль в ПААГ ЛПС Эр245 (1), К.М018 (2), КМ252 (3) и К.М348 (4);

В - результат иммуноблота этих ЛПС с Ат на ЛПС исходного штамма 5р245.

* J

Рис. 10. Тандемный иммуноэлектрофорез препаратов ЛПС, выделенных из штаммов A.brasilense Sp245 (2), К.М018 (3) и КМ252 (1), с Ат на ЛПС Sp245.

0-ПС1

Sp245

0-ПС2

Рис. 12. Схема строения О-ПС для исходного штамма А.Ьга$Иете Бр245 и его мутантов КМ018 и КМ252

1 2 3©3 2 4

Рис. 13. Двойная иммунодиффузия препаратов ЛПС (1), 0-ПС1 (2), ЭПС (3) и КПС (4) с Ат на ЛПС A.brasilense Sp245 (а)

Рис. 11. Тандемный иммуноэлектрофс препаратов ЛПС, выделенных из штам: A.brasilense КМ018 (2) и КМ252 (1), с Ai ЛПС Sp245.

очередь, свидетельствует о том, что в ставе 0-ПС2 имеются также антиген? детерминанты, отсутствующие у О-ПС 1.

Наши представления об особенное строения 0-ПС1 и 0-ПС2 и их вкладе в хитектуру клеточной поверхности исход го и мутантных штаммов A.brasile Sp245, основанные на всей сумме при денных выше экспериментальных резуль тов, резюмированы на рис. 12. Главн отличием 0-ПС2 от 0-ПС1 следует, ве ятно, признать структурную гетерогенно этого полисахарида, обусловленную на чием в его составе, по крайней мере, Д] различающихся по химическому строен структурных элементов.

Ранее Матора с соавторами было ус новлено (Matora et al., 1995), что для аз пирилл (в частности, для штамма Sp2 характерно отсутствие специфически капсульного материала. Капсула и ЭПС данном случае представляют собой специфические фрагменты ЛПС, экскре руемые клеткой в окружающую сре Слияние полос преципитации, образов ных препаратами ЛПС, КПС и ЭПС, вы ленных из штамма Sp245, и О-Г (КМ018) свидетельствует об идентично их антигенных детерминант (рис.13). 1 капсула и ЭПС штамма Sp245 состоят вещества, гомологичного 0-ПС1. Tai образом, из двух О-ПС, входящих в сос

С исследуемого штамма, именно 0-ПС1 формирует вещество капсулы и ЭПС rasilen.se Бр245.

Полученные сведения дают, по-видимому, основания для уточнения существую-< в настоящее время представлений о самостоятельной роли ЭПС данных бакте-I в формировании ассоциативных взаимоотношений азоспирилл с растениями, а же могут способствовать созданию биоспецифических зондов для цитохимиче-х, таксономических и экологических исследований азоспирилл.

3. Оценка участия ЛПС азоспирилл в установлении ассоциативных взаимоотношений бактерий с растениями

Данные о локализации ЛПС в наружной мембране бактерий, об участии ЛПС в ъюгационных процессах и о роли, которую играют ЛПС в детерминировании ангиной специфичности грамотрицательных микроорганизмов, указывают на воз-шое активное участие бактериальных ЛПС также во взаимодействии бактерий с гениями-партнерами.

В данной части работы представлены результаты исследования роли ЛПС азоспи-л при их контактных взаимодействиях с растениями. В работе использовали: 1мм А. ЬгазИете Бр245, в качестве растительного объекта - пшеницу сорта Сара-:кая 29, в качестве дополнительной модельной растительной системы - суспензи-ую культуру клеток моркови. Необходимо отметить, что изначально этот штамм

1 выделен из поверхностно-стерилизованных корней пшеницы (ВаМаш е1 а1.,

3).

Мы изучали влияние ЛПС на адгезию азоспирилл на корнях проростков пшеницы тлютинацию культуры морковных клеток под действием бактериальной суспен-. Нами было исследовано также изменение уровня синтеза мажорных полипепти-в корневом апопласте проростков пшеницы, обработанных ЛПС азоспирилл.

3.1 Роль ЛПС азоспирилл в бактериальной адгезии

С применением радиоиндика-ного анализа было обнаруже-что предварительная обработ-корней пшеницы препаратом

2 штамма А.ЬгазИепзе Бр245 снижает, как в аналогичных териментах с агробактериями 1а11еу ег а/., 1976), а, напротив, 1ичивает количество бактерий ного штамма, прикрепивших-к корням растений (рис.14), убация корней в растворе

3 при концентрации 0.6 -корня приводит к увеличе-) адсорбции бактерий на кор-

пшеницы в 1.5 раза, а при

ГЧ, импульсы

Контроль

0,6

1,5

мкг/г корня

Рис. 14. Влияние предварительной обработки корней пшеницы препаратом ЛПС Л.бгеш/егсге Бр245 на количество бактерий данного штамма, прикрепившихся к корням растения.

концентрации I.5 vir г-корня Ю раз по сравнению с контро. (корнями, не подвергнутыми работке ЛПС). При использс ним в качестве растительн объекта суспензионной культ} морковных клеток мы так же яснили, что предварительная работка растительного матери бактериальным ЛПС при его нечной концентрации 15 мкг усиливает агглютинацию морк ных клеток азоспнриллами шт ма Sp245 (рис.15). Таким ос зом, было установлено сти, пирующее влияние предва тельной обработки растений г паратом бактериального ЛПС на агглютинацию морковных к ток бактериями штал A.brasilense Sp245, так и на п крепление бактерий данного штамма к корням пшеницы.

С целью оценки возможного участия ЛПС азоспирилл в бактериальной адгезии уровне неспецифических связей мы провели эксперименты по агглютинации (i самоагглютинации) азоспирилл штамма Sp245 под действием ЛПС, выделенных разных штаммов, включая сам данный штамм.

Было установлено, что во всех случаях непосредственно после добавлени: гомогенной суспензии клеток штамма Sp245 препаратов ЛПС с конечной кони трацией 15 мкг/мл происходит частичная агрегация бактериальных клеток. Г этом все препараты ЛПС, независимо от штамма, из которого они были выделе одинаково эффективно вызывали агрегацию клеток штамма Sp245.

Полученные результаты можно, вероятно, объяснить эффектом электровалент! связей, возникающих между кислыми фракциями О-ПС и основными белками, в дящими в состав внешней мембраны бактерий. Возможно также участие в это: нейтральных полисахаридных фракций ЛПС по механизмам типа специфических левод-лектиновых взаимодействий, о чем свидетельствуют полученные нами рез> таты агглютинации эритроцитов кролика под действием хроматографически очши ного препарата ЛПС штамма Sp245 (титр агглютинации составлял 2,5 мкг/мл).

ЛПС азоспирилл являются сложными молекулами, включающими в свой сос гидрофобные (липидные) фрагменты и проявляющими анионные свойства. Учиты это, можно допустить, что в проведенных нами экспериментах бактериальные Л1 подобно протеогликанам, также могли выступать в роли неспецифических фактор действующих по механизму стерического исключения (Бычков и Кузьмина, 19' Последнее проявляется в тенденции к вытеснению клеток из гомогенной суспензг

А В

Рис. 15. Влияние предварительной обработки культуры клеток моркови препаратом ЛПС А.ЬгсиЦепзе Бр245 на степень агглютинации морковных клеток под действием данного штамма азоспирилл:

А - культура морковных клеток + суспензия бактерий штамма Бр245,

В - культура морковных клеток, предварительно обработанных препаратом ЛПС Бр245 + суспензия бактерий данного штамма.

гдельную фазу, что может способствовать сближению их поверхностей до расстоя-1Й, достаточных для проявления эффекта агглютинации.

При использовании препарата нативного ЛПС (полученного экстракцией ЭДТА) ы наблюдали исключение эритроцитов в отдельную фазу в интервале концентраций ПС 10 - 40 мкг/мл, в то время как при концентрациях ЛПС ниже указанных за то же >емя эксперимента (60 минут) происходила лишь частичная седиментация эритро-тгов под действием силы тяжести. Необходимо отметить, что в препарате нативного ПС (в отличие ог хроматографически очищенного) оказывается существенно более лсоким содержание липидов, что, очевидно, увеличивает степень его гидрофобно-и. Это, вероятно, и создаёт предпосылки для вытеснения эритроцитов в отдельную 1зу под действием нативного ЛПС (подобно отмеченному выше эффекту стериче-:ого исключения).

Подобное неспецифическое действие ЛПС на клеточные суспензии азоспирилл эжет иметь вполне определенный биологический смысл. Известна тенденция бакте-1й образовывать агрегаты при их адгезии на корнях растений, а также наличие полных скоплений бактериальных клеток в ризосфере (МаПИуББе, 1985). С этой точки ения агглютинирующее действие ЛПС азоспирилл, обильно экскретируемых данями бактериями в окружающую среду, можно рассматривать как проявление меха-1зма адаптации, облегчающего клеточную адгезию на корнях растений.

3.2 Оценка участия ЛПС азоспирилл в запуске ответных реакций у инокулированных растений

Как было отмечено выше, при оценке эффективности колонизации растений мик-юрганизмами оказывается актуальным выбор достаточно информативных физиоло--биохимических тестов, характеризующих результаты взаимодействия. Одним из ких тестов может служить упомянутая выше оценка числа бактерий, прикрепив-ихся к корням растений. Однако большой интерес, по нашему мнению, могут пред-авлять также эксперименты, непосредственно характеризующие ответные биохи-гееские реакции со стороны растений на их взаимодействие с ассоциативной мик-|флорой.

В качестве такого теста мы использовали результаты электрофоретического ис-едования уровня синтеза мажорных полипептидов в апопласте корней пшеницы, [окулированных штаммами азоспирилл. Как было установлено ранее, изменение личества отдельных белков апопласта инокулированных растений является досто-рным показателем установления определенного рода взаимоотношений между рас-нием и микроорганизмом (1§па1оу е( а!., 1995). Проведенные эксперименты показа-[ (рис. 16), что предобработка корней пшеницы препаратом изолированных ЛПС ЬгаьИете Бр245 приводит к усилению синтеза белков апопласта, сравнимому с алогичным действием при инокуляции растений культурами нативных клеток бак-рий данного штамма.

Это свидетельствует о возможной активной роли ЛПС азоспирилл также и на овне, обеспечивающем запуск специфических ответных реакций со стороны стений на их взаимодействие с клетками исследуемых нами микроорганизмов.

Таким образом, вся сумма результ; тов, полученных в данной работе, дае достаточно оснований для заключения том, что ЛПС азоспирилл являютс компонентами клеточной поверхност1 активно участвующими в контактны взаимодействиях с растением, как и уровне неспецифической бактериально адгезии, так и на уровне запуска ответ ных реакций у растения-хозяина.

ABC Рис. 16. Влияние инокуляции целыми клетками и 48-часовой обработки препаратом ЛПС A.brasilense Sp245 на биосинтез внеклеточных белков в корнях пшеницы. Флюоро-грамма электрофореза |4С-глицин-меченных белков, выделенных из апопласта корней: А - стерильных растений, В - инокулированных целыми клетками, С - обработанных препаратом ЛПС (50 мкг/мл).

ВЫВОДЫ

1. Комплекс современных вариантов иммуноанализа, примененный для почвенны азотфиксирующих бактерий рода АюяртИит, позволил выявить особенност структурной организации липополисахаридных антигенов при Я-Б диссоциаци культур, установить факт гетерогенности ЛПС исследованных штаммов и оценит вклад отдельных О-специфических полисахаридов в формирование капсульног полисахаридного слоя.

2. Для типового штамма А.ЪгаьНепзе Бр7 установлен нетипичный характер Я-диссоциации, при которой не происходит кардинальных изменений в структур полисахаридных звеньев О-ПС, а изменяется лишь их антигенность, что являете следствием перераспределения вкладов двух основных О-антигенов (выявлении как для исходного штамма, так и для его спонтанного мутанта) в архитектур клеточной поверхности в зависимости от возраста культур.

3 составе J1 ПС штамма A.brasilense Sp245 обнаружены два О-специфических по-1исахарида и установлено, что капсула и ЭПС данного штамма состоят из вешест-ja, содержащего антигенные детерминанты, идентичные детерминантам 0-ПС1.

Установлено стимулирующее действие предобработки растительного материала трепаратами изолированных ЛПС на адгезию бактерий A.brasilense Sp245 к кор-мм пшеницы и на агглютинацию морковных клеток бактериями данного штамма, 1 также агглютинирующее действие изолированных ЛПС при их добавлении к :успензиям азоспирилл и эритроцитов (и, в ряде случаев, выделение последних в сдельную фазу), что обусловлено относительно быстрым (десятки минут) установлением "неспецифических" связей между компонентами микробных и растительных клеток без включения ответных реакций со стороны партнеров.

Локазано, что достаточно длительная (десятки часов) предобработка корней пше-тацы препаратом изолированных ЛПС A.brasilense Sp245 приводит к усилению :интеза белков апопласта, сравнимому с аналогичным действием при инокуляции эастений культурами нативных клеток бактерий данного штамма, что свидетель-:твует о существенной роли ЛПС азоспирилл при контактных взаимодействиях бактерий с растениями не только на уровне неспецифической бактериальной адге-1ии, но и на уровне запуска ответных реакций со стороны растений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

viatora L., Solovova G., Serebrennikova О., Selivanov N., Shchyogolev S. mmunological properties of Azospirillum cell surface: the structure of carbohydrate mtigens and evaluation of their involvement in bacteria-plant contact interaction // In: izospirillum VI and Related Microorganisms. - Heidelberg, Berlin: Springer Verlag, 1995,- P. 377-382.

Затора Л.Ю., Соловова Г.К., Серебренникова О.Б., Селиванов Н.Ю., Щеголев Г.Ю. О роли липополисахаридов бактерий при их контактных взаимодействиях с )астениями для ассоциативных азотфиксаторов рода Azospirillum И Тез. докл. 9-го заховского коллоквиума по азотфиксации- Москва, 1995,- Пущино, ОНТИ ПНЦ 3АН, 1995,-С.58.

viatora L., Solovova G., Serebrennikova О., Selivanov N., Shchyogolev S.

mmunological properties and evaluation of the involvement of lipopolysaccharides in

)\ant-Azospirillum contact interactions // In: Preceedings of the 1st European Nitrogen

7ixation Conference.- Officina Press, Szeged, Hungary, 1994,- P.347.

viatora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchyogolev S. On the

nvolvement of lipopolysaccharides in bacteria-plant contact interactions for nitrogen-

ixing associative bacteria of the genus Azospirillum II In: Nitrogen Fixation:

fundamentals and Applications - Proc. of the 10th International Congress on Nitrogen

-ixation, St.-Petersburg, Russia, May 28 - June 3, 1995 - P.340.

viatora L., Petrova L., Serebrennikova O., Ponomaryova Т., Panasenko V. and

shchyogolev S. Recent data on the R-S dissociation in Azospirillum brasilense Sp7

cultures // 8th Internationa! Congress Molecular Plant-Microbe Interactions - Knoxv; Tennessee, July 14-19, 1996: Bookofabstr.

6. Matora L., Serebrennikova O., Ponomaryova T., Petrova L. and Shchyogolev S. 1 dissociation in Azospirillum brasilense Sp7: immunochemical aspects // 2nd Europ Nitrogen Fixation Conference.- Poznan, Poland, September 8-13, 1996: Book of abs P.181.

7. Matora L., Petrova L., Serebrennikova O., Shmatenko N., Panasenko V., Shchyogc S. Influence of the plasmid content on the lipopolysaccharide antigens of Azospiril brasilense Sp245 and Sp7 II In: Biological Nitrogen Fixation for 21st Century - Proc the 11th International Congress on Nitrogen Fixation, Paris, France, July 20-25, 199 P.391.

8. Katzy E., Matora L., Serebrennikova 0., Scheludko A. Involvement of a 120-M Plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in production of lipopolysaccharide; Plasmid. 1998 - 40 - In press.

Подписано к печати 14.05 9$ Ответственный за выпуск Мельников А Г. Объем 1 п. л Тираж 100.

Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.