Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum"

На правах рукописи

БУРЫГИН Геннадий Леонидович

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ О- И Н-АНТИГЕНОВ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА лгоБРШыим

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2003

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Матора Л.Ю.

доктор химических наук, профессор Щёголев С.Ю.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Тараненко Т.М.

доктор биологических наук, профессор Карпунина Л.В.

Ведущая организация: Институт микробиологии РАН

Защита состоится " 12 " ноября 2003 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г.Саратов, просп. Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан" октября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулярная архитектура клеточной стенки гра-мотрицательных бактерий достаточно хорошо изучена на примере семейства Enterobacteriaceae. В тоже время, разнообразие грамотрицательных микроорганизмов не исчерпывается представителями этого семейства. Очевидно, что экстраполяция представлений о клеточной стенке семейства энтеробактерий на всю группу грамотрицательных прокариот не вполне правомерна. Основанием для этого, в частности, служат результаты, полученные при изучении клеточной поверхности почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum. К числу таких результатов можно отнести способность азоспирилл к образованию на клетке полярного пучка пилей (Шелудько и Кацы, 2001); наличие углеводных фрагментов в составе полярного жгутика (Moens et al., 1995); обнаружение липополиса-харид-белковых и полисахарид-липидных комплексов в составе капсульного материала (Коннова с соавт., 1994); отсутствие индивидуального капсульного антигена (Матора и Щеголев, 2002); установленный для азоспирилл характер R-S диссоциации, нетипичный для грамотрицательных микроорганизмов (Серебренникова, 1998) и др. Таким образом, азоспирилла, являясь, безусловно, типичным представителем грамотрицательных бактерий, демонстрирует особенности строения своей наружной мембраны. В первую очередь, это относится к структуре основных антигенов - соматического, жгутикового и капсульного. Изучение деталей строения этих важнейших бактериальных антигенов представляет фундаментальный интерес, поскольку даёт возможность узнать, как организована поверхность бактерий, функционирующих в ризосфере растений. Кроме того, такие знания необходимы при создании биоспецифических зондов для экологических и таксономических исследований азоспирилл.

Целью настоящей работы было получение новых сведений о строении жгутикового и соматического антигенов азоспирилл типовых штаммов и изучение топографической диспозиции этих антигенов в составе клеточной поверхности бактерий. В соответствии с этой целью, в данной работе были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать природу ранее обнаруженных антигенных перекрестов для препаратов полярного жгутика с препаратами липополисахарида (ЛПС) бактерий рода Azospirillum.

2. Получить ответ на вопрос, являются ли углеводные фрагменты гликозилиро-ванного флаге длина полярного жгутика азоспирилл специфическими антигенами, или они иммунохимически идентичны соматическому антигену.

3. Провести сравнение иммунохимических, электрофоретических и спектро-фотометрических характеристик ЛПС штаммов азоспирилл, принадлежащих к одному и тому же и к разным серотипам.

4. Оценить иммунохимическую специфичность углеводных антигенов типового штамма A. brasilertse Sp245 на основе конкурентного иммуноанализа с применением современных вариантов методов спектротурбидиметрии и динами-

ческого рассеяния света.

5. Проанализировать изменения липополисахаридных антигенов в зависимости от возраста и условий выращивания бактериальной культуры. Научная новизна работы. Выявлено наличие чехла (липо)полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика бактерий р. АгоъртИит.

Продемонстрировано наличие антигенных перекрёстов у Н-антигена бактерий для представителей видов А. Ьга$йете и А. Нро/егит.

Показано, что углеводные структуры, входящие в состав гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма А. ЬгаяИете 8р7, антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.

Установлено, что структура антигенных детерминант О-специфических полисахаридов (О-ПС) ЛПС азоспирилл меняется под влиянием условий культивирования бактерий на лабораторных средах. При этом экспонированность самих О-ПС в составе соматического антигена варьирует в зависимости от фазы роста бактериальной культуры.

Практическая значимость. Предложенный оригинальный способ получения высокоочищенных препаратов ЛПС, содержащих полный спектр антигенных детерминант и демонстрирующих хорошее разделение при электорофорезе в ПААГ, может быть использован при решении широкого круга исследовательских и практических задач. Использованный в работе тест на ингибирование подвижности бактерий р. АюэртИит при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител (Ат) на ЛПС может быть применён для их быстрой штаммовой идентификации.

Полученные в работе результаты использованы при проведении совместных исследований с сотрудниками группы генетики микроорганизмов Лаборатории генетики, группы биоорганической химии Лаборатории биохимии и Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур ИБФРМ РАН по темам НИР перечисленных научных подразделений. Они отражены также в методическом пособии «Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2003 г.) и использованы при проведении занятий по спецкурсам «Микробиология с основами вирусологии» и «Физико-химические методы исследования биополимеров» со студентами химического факультета Саратовского госуниверситета. Кроме того, результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ. Основные положения, выносимые на защиту:

• Полярный жгутик бактерий рода АгояртПит имеет чехол (ли-по)полисахаридной природы, ассоциированный с поверхностью флагеллы и обладающий экранирующим эффектом.

• Н-антиген демонстрирует наличие антигенных перекрёстов у представителей видов А. ЬгаьНете и А. Нро/егит. Углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма А. ЬгаБИете Бр7 антигенно идентичны фрагментам соматического антигена.

• Спектры поглощения света препаратами ЛПС имеют характерные отличия для серологически различных штаммов, а изменения спектров, наблюдаемые

внутри одного серотипа, коррелируют с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.

• Иммунодоминантным моносахаридом в составе антигенных детерминант липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК) штамма A. brasilense Sp245 является галактоза.

• Антигенные свойства ЛПС азоспирилл зависят от фазы роста культуры и условий культивирования бактерий на лабораторных средах.

• Обработка протеиназой К высокомолекулярного ЛПС-содержащего комплекса, экстрагированного из наружной мембраны азоспирилл, обеспечивает получение высокоочищенных препаратов ЛПС, содержащих полный спектр антигенных детерминант и демонстрирующих эффективное разделение при электорофорезе в ПААГ.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на: 6-ой Европейской конференции по азотфиксации (Севилья, Испания, 2000), Межвузовской конференции молодых учёных «Растение, микроорганизмы и среда» (Санкт-Петербург, Россия 2000), Конференции «Молодые учёные Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, Россия, 2001), 2-ой Всероссийской школе по экологической генетике «Симбиогенетика и эволюция» (Санкт-Петербург, Россия, 2001), 1-ой Региональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2002), 6-ой Путинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино-на-Оке, Россия, 2002), 10-ом Международном Конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии «Мир микробов» (Париж, Франция, 2002), 11-ом Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям растений и микроорганизмов (Санкт-Петербург, Россия, 2003) и Международном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений в условиях техногенных загрязнений» (Саратов, Россия, 2003).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН 24 сентября 2003 года.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 10 опубликованных работах, включая 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованных источников, содержащего 187 источников, и двух приложений. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок и 2 таблицы.

Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. per. 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д. х. и. профессор Щёго-лев С. Ю.). Работа поддержана грантами Комиссии РАН по работе с молодежью по итогам конкурсов 2002 и 2003 г.г. по поддержке базовых кафедр и филиалов

кафедр, созданных при институтах РАН, грантом РФФИ № 02-04-58780з для поездки на 10-й Международный Конгресс по бактериологии и прикладной микробиологии «Мир микробов» (Париж, Франция, 2002) и гратом Президента РФ № НШ-1529.2003.4 на поддержку молодых российских учёных и ведущих научных школ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1

Материалы и методы исследования

В работе использовали штаммы A. brasilense Sp7, Cd, JM125A2, Sp245, Spl07, A. lipoferum Sp59b, E. coli K12, а также мутанты штамма Sp7: 7.K.2, IZ5 и S-вариант штамма Sp7 и мутанты штамма Sp245: КМ018 и КМ252. Мутантный штамм IZ5 был любезно предоставлен Г. Александре (Департамент микробиологии и молекулярной генетики университета г. Лома Линда, Калифорния, США). S-вариант штамма Sp7 был любезно предоставлен Л.П. Петровой (ЛГМ ИБФРМ РАН). КМ018 и КМ252 были получены в результате омегонового мутагенеза штамма Sp245 (Katzy et al., 1998).

Бактерии выращивали на синтетической малатной среде (D6bereiner and Day, 1976) при 30°С. В некоторых случаях малатная среда содержала дополнительно 0.1 М трис(гидроксиметил)аминометана (ТРИС) или 0.1 М N-2-гидрокси-этилпиперазин->Г-2-этансульфоновой кислоты (HEPES). В качестве поддерживающей среды использовали также LB.

Для получения антител на ЛПС азоспирилл использовали методику иммунизации животных целыми бактериальными клетками, предварительно обработанными 2% глутаровым альдегидом (Матора с соавт., 1998). Фракции IgG получали из антисывороток осаждением сульфатом аммония (Кэбот и Мейер, 1968).

Для иммунохимических экспериментов с использованием специфических антител препараты ЛПС получали экстракцией с помощью ЭДТА (Leive et al., 1968) с небольшой модификацией. Для электрофоретических и спектрофотомет-рических экспериментов ЛПС получали с помощью оригинального способа, включающего протеиназную обработку солюбилизата наружных мембран бактериальных клеток. В экспериментах по определению иммунохимической активности О-антигена был использован препарат липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК), выделенный из капсульного материала бактерий штамма А. brasilense Sp245 С.А. Конновой с соавторами (ЛБ ИБФРМ РАН) (1994).

Для получения препарата полярного жгутика отмытые и осажденные клетки ресуспендировали в 40 мл физраствора, забуференного фосфатами. Полученную суспензию гомогенизировали в течение 90 сек с помощью блендера. Для осаждения клеток суспензию дважды центрифугировали в течение 15 мин при 3000g. Полученный супернатант подвергали ультрацентрифугированию в течение 1 часа при 100000g. В некоторых случаях ультрацентрифугирование препарата жгутика проводили в градиенте плотности сахарозы. С целью получения очищенного флагеллина проводили кислотную диссоциацию полярного жгутика с

последующей реассоциацией в нейтральной среде.

Для изучения подвижности бактериальных клеток готовили препарат «раздавленная» или «висячая» капля. Предметные стёкла просматривали в просвечивающий микроскоп JENAVAL (Carl Zeiss, Jena, ГДР) (техника фазово-контрастной микроскопии), используя объектив с широким охватом поля зрения. Во время наблюдений вели видеозапись с помощью видеокамеры DCR-TRV900E (SONY, Япония). Оценивали подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа. При этом у 50-150 случайно выбранных подвижных единичных клеток определяли среднюю скорость движения.

Двойную иммунодиффузию проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979).

ДСН-электрофорез (Hitchcock and Brown, 1983) проводили в 12.5% ПААГ. С целью визуализации ЛПС и белков гели окрашивали серебром (Tsai and Frasch, 1982) или Кумасси R-250, соответственно, а также использовали их для электропереноса на нитроцеллюлозные фильтры («Millipore», 0.45 мкм). Для иммуноде-текции антигенов в качестве первых Ат использовали кроличьи антитела на ЛПС исследуемого штамма (50 мкг/мл), полученные как описано выше. В качестве вторых Ат использовали козлиные антикроличьи антитела, меченные пероксида-зой хрена (Tsang et al., 1983).

Твёрдофазный иммуноанализ целых клеток проводили по методике, описанной в статье Богатырева с соавторами (Bogatyrev et al., 1992), используя в качестве метки конъюгат коллоидного золота с протеином А. Микроскопический анализ проводили на просвечивающем электронном микроскопе «BS-500» («Tesla», ЧССР) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

При проведении конкурентного иммуноанализа ингибирующие моносахариды добавляли к антителам в концентрации 10'2 М. Растворы антител, ЛПБК и ингибиторов - моносахаридов готовили в буфере, содержащем 0.1 M раствор NaCl и 0.01 M ТРИС-НС1 (pH 7.2). Для определения ингибирующего действия моносахаридов использовали метод динамического рассеяния света. Об ингиби-рущем эффекте судили по ослаблению интенсивности светорассеяния на ранних стадиях образования преципитата. Для определения объемной доли биополимера в составе частиц нерастворимых иммунных комплексов использовали вариант метода спектротурбидиметрии (Щёголев, 1999), усовершенствованный с участием аспиранта ИБФРМ РАН Хлебцова Б.Н. и заведующего Лабораторией биосенсоров на основе наноразмерных структур (ЛБНС) ИБФРМ РАН Хлебцова Н.Г.

Измеряли спектры ослабления света в единицах оптической плотности А, обусловленной его рассеянием на взвешенных частицах преципитата. Зависимость А от Л определяли в интервале 400-600 нм. Измерения проводили на спектрофотометре «Specord М40» (Carl Zeiss, Jena, ГДР) с использованием специальной приставки для корректного определения спектров мутности (Хлебцов с со-авт., 1988). Определение размеров иммунных комплексов проводили с помощью метода динамического светорассеяния на установке, описанной Хлебцовым с соавторами (Khlebtsov et al., 2001). Для качественной оценки эффективности ин-гибирования использовали метод двойной иммунодиффузии.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование антигенов полярного жгутика бактерий р. Azospirillum

Результаты исследования антигенов полярного жгутика разделяются на две самостоятельные части, которые включают исследование антигенной специфичности выявленного (липо)полисахаридного чехла, ассоциированного с поверхностью полярного жгутика азоспирилл, и исследование антигенов собственно фла-геллина полярного жгутика.

Выявление (липо)полисахаридного чехла на поверхности полярного

жгутика

С помощью электронной микроскопии и антител на ЛПС нами было выявлено наличие (липо)полисахаридного чехла на поверхности полярного жгутика

штаммов бактерий рода Azospirillum. Рис. 1 демонстрирует взаимодействие коньюгатов протеин А -коллоидное золото и штаммос-пецифичных антител на ЛПС с бактериальной клеткой штамма А. Ъгasílense Sp245. Метка выявляет наличие ЛПС не только на самой клетке, но и на поверхности полярного жгутика.

На рис. 2 приведены результаты сравнительного иммунодиффузионного анализа препарата нативного жгутика, не освобождённого от чехла, и препарата ЛПС штамма Sp245 с антителами на ЛПС данного штамма. Ранее было установлено наличие двух иммунохимически различных О-ПС в составе ЛПС данного штамма (Katzy et al., 1998). В данном случае препарат жгутика образует общую линию преципитации с одним из О-ПС, входящим в состав ЛПС Sp245. Второй О-ПС, характерный для ЛПС данного штамма, также присутствует в составе препарата жгутика, но линия преципитации, соответствующая ему, выражена намного слабее. Отделение чехла от жгутика оказалось возможным только в результате кислотной диссоциации полярного жгутика с его последующей реассоциацией. Однако единственной структурой, сохраняющей нативность после описанных про-

Рис. 1. Взаимодействие коньюгатов протеин А - коллоидное золото с Ат на ЛПС А. Ьга-зИете Бр245 с клетками данного штамма. Длина масштабной метки 200 нм.

Рис. 2. Результаты иммунодиффузионного анализа препарата ЛПС (1) и препарата полярного жгутика (2) А. ЬгаяПете Бр245 с Ат на ЛПС данного штамма.

S-антнген

R-антиген

цедур с полярным жгутиком азоспирилл, был ЛПС. При этом вместо полимерного флагеллина ассоциировались случайные конгломераты молекул.

Исследование углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина

полярного жгутика

Исследование углеводных фрагментов полярного жгутика штамма A. brasilense Sp7, у которого в работе (Moens et al., 1995) впервые для азоспирилл было показано наличие структур данного типа, проводили с помощью двух производных этого штамма IZ5 и 7.К.2. Первый из этих производных был отобран Г. Александре. Штамм IZ5 характеризовался неподвижностью клеток и отсутствием в составе флагеллина полярного жгутика структур, выявляемых с помощью красителей на углеводы (Alexandre, Zhulin, неопубликованные данные). Штамм 7.К.2 был отобран в ЛФХКС ИБФРМ РАН с помощью иммунодиффузионного теста с антителами на ЛПС штамма Sp7. Он отличался отсутствием в составе ЛПС одного из двух характерных для Sp7 О-специфических полисахаридов. Различия в молекулярной массе субъединиц полярного жгутика исходного штамма Sp7 и штамма IZ5 видны на рис 3 А. Кроме того, рисунок 3 Б демонстрирует, что ЛПС IZ5 анти-генно идентичен липополиса-хариду исходного штамма Sp7.

На рис. 4 А представлены результаты иммуноблоттинга препаратов полярного жгутика

Рис. 3 А. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов полярного жгутика Бр7 (1) и Ш.5 (2) (окраска Кумасси).

Б. Результаты иммуноблоттинга с Ат на ЛПС Бр7 препаратов ЛПС Бр7 (1) и Ш (2).

флагеллин

флагеллии

ЛПС

Рис. 4. Результаты иммуноблоттинга препаратов полярного жгутика Бр7 (1) и Ш.5 (2) с Ат на флагеллин полярного жгутика А. И-ро/егит 4В (А) и с Ат на ЛПС Бр7 (Б).

штаммов Sp7 и IZ5 с использованием антител на флагеллин полярного жгутика A. lipoferum 4В, любезно предоставленных Г. Александре (Alexandre et al., 1999). Взаимодействие антител на флагеллин штамма, относящегося к виду А. lipoferum, с препаратами полярного жгутика штаммов, относящихся к виду А. brasilense, свидетельствует о наличии родоспецифичных антигенных детерминант в составе Н-антигена у азоспирилл. Сохранившаяся у мутанта IZ5 способность взаимодействовать с данными антителами говорит о том, что его флагеллин, в отличие от углеводных фрагментов жгутика, очевидно, не претерпел каких-либо изменений.

На рис. 4 Б приведены результаты иммуноблотггинга тех же препаратов полярного жгутика со штаммоспецифичными антителами на ЛПС штамма Sp7. В то время как антитела на флагеллин одинаково эффективно взаимодействуют с препаратами полярного жгутика дикого штамма (гликозилированный флагеллин) и мутанта с негликозилированным жгутиком, антитела на ЛПС распознают только препарат жгутика дикого штамма. При этом как у исходного штамма, так и у его мутанта антитела выявляют сопутствующий жгутику липополисахарид (чехол - см. выше), отдельно мигрирующий в электрическом поле.

Таким образом, мы установили, что антитела на ЛПС распознают некие углеводные структуры, входящие в состав гликозилированного флагеллина полярного жгутика бактерий дикого штамма и, очевидно, гомологичные отдельным фрагментам соматического антигена. Для получения ответа на вопрос, какие

именно структуры в составе ЛПС штамма Sp7 антигенно идентичны углеводным компонентам флагеллина полярного жгутика, мы использовали штамм 7.К.2.

Сравнительный электро-форетический анализ ЛПС штаммов Sp7 и 7.К.2 (рис. 5 А) свидетельствует о том, что в составе ЛПС у 7.К.2 отсутствует один из двух О-ПС, ранее описанный как S-антиген (Матора с соавт., 2003). Поскольку выше было отмечено наличие перекрестной иммунологической реакции между жгутиком и ЛПС, в частности - S-антигеном (рис. 4 Б), логичным представлялось предположение о том, что углеводные фрагменты флагеллина полярного

флагеллин

S-Ar

R-Ar

А Б В

Рис. 5 А. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС Бр7 (1) и 7.К.2 (2) (окраска серебром).

Б. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов полярного жгутика Бр7 (1) и 7.К.2 (2) (окраска Кумасси).

В. Результаты иммуноблоттинга препаратов полярного жгутика данных штаммов с Ат на ЛПС 8р7.

жгутика штамма Бр7 гомологичны фрагментам именно этого О-ПС. Электрофо-ретический анализ с последующей иммунодетекцией препаратов полярного жгутика показал, что флагеллин у штамма 7.К.2 имеет меньшую молекулярную массу и, в отличие от Бр7, и не взаимодействует с антителами на ЛПС данного штамма (рис. 5 Б, В). В составе препарата жгутика исходного штамма антитела выявляли наличие О-антигенных детерминант, как мигрирующих при электрофорезе отдельно, так и находящихся в составе флагеллина полярного жгутика (рис. 5 В). При этом хорошо видно, что в препарате полярного жгутика 7.К.2 Б-антиген не выявляется ни в составе флагеллина, ни в составе сопутствующего материала (чехла). В то же время второй О-ПС (Я-антиген) визуализируется очень четко.

Полученные результаты позволили нам прийти к заключению о том, что углеводные структуры гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма Бр7 могут являться, по своей сути, фрагментами Б-антигена данного штамма. Однако, чтобы сделать безоговорочный вывод об антигенной идентичности этих структур, необходимо было получить антитела на мономеры полярного жгутика штамма Бр7.

Получение и анализ антител на флагеллин А. ЬгазИете Бр7

Самым важным этапом в решении поставленной задачи являлось получение флагеллина штамма 8р7, тщательно освобождённого от (липо)полисахаридного чехла. Мы использовали схему, предложенную Муравлевым с соавт. (1999), и получили антитела на высокоочищенные субъединицы полярного жгутика, разделённые с помощью электрофореза в ПААГ и извлечённые из геля путем специальной диффузии.

Результаты сравнительной иммунодиффузии полученных антител на изолированный флагеллин штамма Бр7 и антител на ЛПС данного штамма представлен на рис. 6. Слияние полос преципитации свидетельствует о том, что субъединицы полярного жгутика имеют общие детерминанты с ЛПС. Мажорная шпора, отмеченная стрелкой на этом рисунке, в свою очередь, свидетельствует о том, что основной пул антител, полученных на изолированный полярный жгутик, специфичен именно Н-антигену.

Углеводные детерминанты гликозилированного флагеллина вносят очень небольшой вклад в иммунный ответ на изолированный жгутик, о чем свидетельствует слабо заметная шпора, обнаруживаемая для препаратов жгутиков 8р7 и 7.К.2 (рис.7). Данный рисунок также демонстрирует характер взаимодействия антител на мономеры жгутика А. ЬгаяИете Бр7 с препаратами изолированных жгутиков

Аг

Рис. 6. Результаты иммунодиф-фузионного анализа препарата полярного жгутика штамма 8р7 (Аг) с Ат на ЛПС (1) и Ат на флагеллин (2) данного штамма.

/ -ч - f

I 5 t

Рис. 7. Результаты иммунодиффузионного анализа препаратов жгутика штаммов А. Ьга-silense Sp7 (1, 4), A. brasílense 7.К.2 (2), А. brasilense Sp245 (3), A. lipoferum Sp59b (5), E. coli K12 (6) с Ат на флагеллин A. brasilense Sp7.

детерминант их углеводных фрагментов, так и фичными) также в идо- и штаммоспецифичных флагеллина.

другого штамма этого же вида (А. brasilense Sp245), штамма другого вида (А. lipoferum Sp59b) и бактерий другого рода (Е. coli К12). Отсутствие взаимодействия со жгутиком Е. coli - свидетельство родовой специфичности всех антигенных детерминант мономеров полярного жгутика азоспирилл. Различная интенсивность взаимодействия антител с препаратами жгутиков других штаммов азоспирилл может привноситься как пггаммовой специфичностью наличием (наряду с родоспеци-детерминант в составе самого

Исследование изменений подвижности клеток азоспирилл при взаимодействии с антителами к О- и Н-антигенам

Для того, чтобы проверить предположение о экранированное™ флагеллина полярного жгутика выявленным нами (липо)полисахаридным чехлом, мы совместно с сотрудниками группы генетики микроорганизмов Лаборатории генетики ИБФРМ РАН провели серию экспериментов по исследованию подвижности азоспирилл штаммов Бр7 и вр245 в присутствии антител на ЛПС данных штаммов и антител на флагеллин штамма Бр7. Мы судили о взаимодействии данных антител с полярным жгутиком азоспирилл, оценивая подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа и определяя среднюю скорость

■■ средняя скорость движения клеток ф % подвижных клеток

Рис. 8. Зависимость процента подвижных клеток и средней скорости движения клеток А. Ьгс&Иете Бр7 от концентрации Ат на ЛПС данного штамма: 1 - контроль (без антител); 2-1 мкг/мл; 3-10 мкг/мл; 4-100 мкг/мл; 5 - 1000 мг/мл.

движения у случайно выбранных подвижных единичных клеток. Во время наблюдений вели видеозапись с помощью видеокамеры.

Диаграмма зависимости процента подвижных клеток и средней скорости подвижных клеток А. ЬгаБИете Бр7 от концентрации штаммоспецифичных антител на ЛПС (рис. 8) свидетельствует о том, что увеличение концентрации данных антител приводило к полному прекращению движения бактерий. При этом ни добавление к клеточной суспензии антител на флагеллин, ни добавление антител на ЛПС другого штамма, не приводило к такому эффекту (Таблица 1). Из этого

Таблица 1. Процент подвижных клеток и средняя скорость подвижных клеток А. ЬгаяНете Бр7 при их взаимодействии с Ат разной специфичности

контроль Ат/ЛПС Бр7 Ат/ЛПС Бр245 Ат/флагеллин Бр7

Процент подвижных клеток, (%) 89.84 0 75.67 62.93

Средняя скорость подвижных клеток, (мкм/с) 35.3±1.23 0 32.24±1.0 28.5±1.05

следует, что флагеллин у азоспирилл действительно изолирован от окружающей среды (липо)полисахаридным чехлом и, вероятно, может участвовать в процессах прикрепления данных бактерий на корнях растения только в качестве носителя субстанции, обеспечивающей адсорбцию.

2. Изучение О-антнгенов азоспирилл

Сравнительный анализ ЛПС различных штаммов азоспирилл

Мы сравнили, насколько различаются между собой иммунохимические, элек-трофоретические и спектрофотометрические характеристики ЛПС штаммов азоспирилл, принадлежащих к одному и тому же и к разным серотипам. На рис. 9 приведены спектры поглощения света продуктами фенол-серной реакции препаратов ЛПС (для краткости ниже мы их будем именовать «спектрами поглощения») для четырёх штаммов азоспирилл, попарно демонстрирующих антигенные перекресты в иммунодоте с гомологичными антителами. Сравнение данных спектров позволяет выявить их характерные особенности для штаммов, принадлежащих к одному серотипу. Спектры поглощения первой пары штаммов (Бр7 и Сф демонстрируют наличие двух пиков поглощения (при длинах волн 410-420 нм и 485 нм). В то же время спектры поглощения препаратов ЛПС двух других штаммов, Бр245 и 8р107, отличаются только одним выраженным пиком поглощения при длине волны 480 нм (рис. 9). Таким образом, принадлежащие к одному виду, но серологически различные штаммы 8р7 и Бр245 (а также Сс1 и Бр107) обнаруживают чёткие отличия спектров поглощения ЛПС. В соответствии с ре-

14

зультатами работы Дюбуа с соавт. (Dubois et al., 1956), это свидетельствует о существенном различии их моно-сахаридного состава.

С другой стороны, эти данные наглядно демонстрируют, что иммунохимиче-ская гетерогенность О-специфических полисахаридов в пределах ЛПС одного штамма не связана с радикальными различиями их моносахаридного состава. Это следует из сравнения спектров поглощения ЛПС для штаммов Sp7 и Cd, отличающихся (по результатам электрофоретического и иммунодиффузионного анализа) отсутствием одного из О-ПС в составе ЛПС штамма Cd. Это наблюдение было подтверждено результатами сравнения спектров поглощения данных ЛПС со спектром ЛПС мутанта 7.К.2. и при сравнении спектров ЛПС Sp245 и его мутантов КМ252 и КМ018, в составе ЛПС которых отсутствуют, соответственно, 0-ПС1 и 0-ПС2. Сходный качественный характер спектров поглощения ЛПС исходного штамма, его производных и мутантов, выявленный в каждом из рассматриваемых случаев, свидетельствует о принципиальном сходстве моносахаридного состава О-специфических полисахаридов в составе ЛПС данных штаммов. Отмечаемые при этом количественные изменения спектров могут быть следствием тех структурных различий, которые и определяют иммунохимическую специфичность каждого конкретного О-ПС.

Описанный поход мы применили также для выявления возможных различий моносахаридного состава ЛПС R- и S-вариантов штамма Sp7. Сравнение спек-трофотометрических и иммунохимических характеристик данных препаратов позволило прийти к выводу о том, что антигенные различия R- и S-вариантов не связаны с существенными изменениями моносахаридного состава их ЛПС.

Конкурентный иммуноанализ в оценке строения углеводных эпитопов

Мы получили сведения о строении антигенных детерминант ЛПБК, выделенного Конновой с соавторами (1994) из капсульного материала штамма А. brasilense Sp245. Для этого был применён известный принцип, основанный на использовании эффекта ингибирования процесса образования нерастворимых комплексов Аг+Ат при добавлении к их смеси различных «конкурентных» соединений с известным химическим строением (Кэбот и Мейер, 1968). В качестве моносахаридов - ингибиторов использовали рамнозу, галактозу, ксилозу и галак-

Я,нм

Рис. 9. Спектры поглощения света продуктами реакции с фенолом и серной кислотой препаратов ЛПС Бр7, Cd, Бр245 и 8р107.

туроновую кислоту, присутствие которых в составе углеводных полимеров поверхности штамма Sp245 было показано ранее (Коннова с соавт., 1994).

Рис. 10 показывает, что только добавление галактозы (Gal) ингибировало реакцию комплексообразования и приводило к уменьшению скорости нарастания и стационарной интенсивности светорассеяния (кривая 2). Добавление других моносахаридов (кривые 3-5) влияло на кинетическую кривую очень незначительно.

Отношение скоростей реакции на начальных участках 1.16/1.60 можно рассматривать как количественный показатель ингибирования процесса формирования иммунных комплексов. Средний радиус частиц иммунных комплексов ЛПБК+Ат по данным динамического светорассеяния был равен 220 нм, а удельная мутность системы по данным спек-тротурбидиметрии составляла 27. Используя эти данные, было определено, что объёмная доля биополимера в частице преципитата составляет примерно 34%. Введение ингибитора (Gal) уменьшало удельную мутность до 16, снижало значение среднего размера частиц на 20% и уменьшало объёмную долю биополимера до 29%. Уменьшение объёмной доли биополимера в преципитате и среднего радиуса частиц может служить дополнительным свидетельством ингибирования взаимодействия антигена и антител. Данные эксперименты были проведены совместно с аспирантом ИБФРМ РАН Хлебцовым Б.Н. (Khlebtsov B.N., Burygin G.L., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G. // Biochim. Biophys. Acta. 2003, submitted for publication).

В качестве независимого метода для сравнительного анализа ингибирующей активности моносахаридов использовали двойную иммунодиффузию. Установлено, что только добавление к антителам галактозы приводило к ослаблению линий преципитации по сравнению с контролем. Таким образом, и в этом случае эффективным ингибитором реакции между ЛПБК и антителами являлся данный моносахарид, что свидетельствует о его доминирующем положении в составе антигенных детерминант ЛПБК штамма Sp245.

Ранее было показано, что определяющую роль в формировании структуры антигенных детерминант штамма A. brasilense Sp7 играют остатки рамнозы и

Время, с

Рис. 10. Кинетические кривые 190 иммунных комплексов ЛПБК+Ат при использовании в качестве ингибиторов галактозы (2), рамнозы (3), ксилозы (4) и галактуроновой кислоты (5) в сравнении с контролем (1). Вставка показывает начальные линейные участки кинетических кривых для систем ЛПБК+Ат (1) и ЛПБК+Ат+Оа1 (2).

галактозы. При этом последний моносахарид демонстрировал наибольшую степень торможения иммунохимических реакций (Матора с соавт., 1998). Таким образом, анализ известных и полученных нами результатов позволяет сделать вывод о том, что иммунохимическая специфичность О-антигенов у данных штаммов азоспирилл определяется не только иммунодоминантным моносахаридом, но общей конфигурацией антигенных детерминат, определяемой положением соседних моносахаридов полимерной или олигомерной цепи. Это заключение согласуется с общим представлением о структуре антигенных детерминант бактериальных полисахаридов (Jann and Westphal, 1975; Kabat, 1980).

Влияние возраста культуры на экспонированность различных О-ПС в составе ЛПС азоспирилл

Клетки азоспирилл, проанализированные на разных фазах роста, демонстрировали в наших экспериментах различную эскпонированность О-специфических полисахаридов в составе ЛПС. Рис. 11 демонстрирует кривую роста штамма Sp245 в сочетании с результатами иммунодиффузионного анализа материала с поверхности клеток, отобранных на различных стадиях роста культуры. Результаты иммунодиффузии говорят о том, что один из О-ПС данного штамма (О-ПС1) визуализуется постоянно, вне зависимости от стадии роста культуры, в то время как второй О-ПС (0-ПС2) выявляется преимущественно на логарифмической и стационарной фазах роста. При этом на поздней логарифмической и ранней стационарной фазах роста культуры полосы преципитации, соответствующие данному О-ПС, проявляются очень слабо (рис. 11). Картина перераспределения вкладов двух О-ПС штамма Sp7 в формирование бактериальной поверхности в зависимости от возраста культуры выглядит более наглядно, поскольку сопровождается изменением морфологии его колоний. Молодые колонии штамма Sp7 имеют гладкий фенотип, но со временем приобретают шероховатую поверхность и неровный край. Преимущественный синтез одного из О-ПС (R-антигена) на поздних стадиях роста культуры (рис. 11) коррелирует с формированием шероховатого фенотипа колоний данного штамма на плотной среде.

Изменение антигенных свойств ЛПС азоспирилл при модификации условий культивирования

В наших экспериментах было обнаружено, что модификация состава лабораторных сред также может приводить к изменению антигенных свойств ЛПС азоспирилл. Таким фактором оказалось добавление 0.1 М ТРИС в среду культивирования бактерий A. brasilense Sp245. На рис. 12 А представлены результаты иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС, выделенных из бактерий, выращенных до логарифмической фазы роста как на среде, содержащей ТРИС, так и без него. В иммунодиффузионном профиле ЛПС штаммов, выращенных на среде, содержащей ТРИС, практически не выявлялась полоса преципитации, соответствующая 0-ПС1. Подобные изменения картины взаимодействия с антителами у данного О-ПС не обнаруживались ни при внесении в среду культивирования 0.1 М HEPES, ни при замене среды культивирования. Кроме того, у ЛПС

Аш

-I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Время, ч

-г-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-Г"

О 2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Время, ч

Рис. 11. Результаты иммунодиффузионного анализа материала с поверхности клеток штаммов Бр245 (А) и Бр7 (Б), взятых на разных стадиях роста культуры.

1 2 3

А

Б

Рис. 12. А. Результаты иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС Бр245 и КМ018 с Ат против ЛПС Бр245 (а). 1 - 8р245, 2 - КМ018, 3 - КМ018, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 4 - Бр245, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 5 - КМ018, выращенного в присутствии 0.1 М НЕРЕБ, 6 - КМ018, выращенного на среде ЬВ.

Б. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС Бр245 (1), КМ018 (2) и ЛПС КМ018, выращенного на среде, содержащей 0.1 М ТРИС (3).

штамма КМ018, выращенного в присутствии ТРИС, в электрофоретическом профиле в ПААГ отсутствовала серия полос с молекулярной массой около 30 кДа, характерных для дикого штамма и мутанта (рис. 12 Б). В то же время спектры поглощения света продуктами реакции с фенолом и серной кислотой препаратов ЛПС штамма КМ018, выращенного как в присутствии ТРИС, так и без него, практически не различались между собой, что свидетельствует о близости их моносахаридного состава. Такие же изменения антигенности ЛПС мы наблюдали у штамма 8р7. В препарате ЛПС данного штамма, выращенного в присутствии ТРИС, также было отмечено исчезновение одной из двух полос преципитации в иммунодиффузии с гомологичными антителами.

Таким образом, выявленное нами модифицирующее влияние ТРИС свидетельствует о том, что параметры культивирования азоспирилл в лабораторных условиях могут влиять на структуру антигенных детерминат их ЛПС.

Модификация способа получения высокоочищенных препаратов ЛПС Нами предложен способ быстрого выделения высокоочищенных препаратов бактериальных липополисахаридов, апробированный на бактериях р. Агозрт1-

lum. В основу предлагаемого усовершенствования положены два различных метода выделения ЛПС. Первый из них основан на экстракции ЛПС из бактериальной мембраны с помощью хелатирующего агента ЭДТА (Leive et al., 1968). Второй позволяет получать препараты ЛПС в количествах, пригодных для анализа в ПААГ (Hitchcock and Brown, 1983). Его принцип заключается в том, что высоко-очищенный не содержащий белка препарат ЛПС получается обработкой предварительно лизированных бактерий высокоэффективным протеолитическим ферментом - протеиназой К. В результате такой обработки ЛПС оказывается единственным биополимером, остающимся в растворе (Hitchcock and Brown, 1983).

Предложенный нами способ заключается в протеиназной обработке не лизата бактерий, а солюбилизата их наружных мембран. Это позволяет упростить процедуру выделения чистого ЛПС, минуя стадию разрушения бактериальных клеток в присутствии додецилсульфата натрия, что, в частности, обеспечивает отсутствие примесей этого соединения в получаемом препарате ЛПС.

Бактерии выращивали на соответствующей питательной среде при оптимальной температуре культивирования до логарифмической фазы роста, отделяли их от среды культивирования с помощью центрифугирования и экстрагировали из них комплекс, состоящий из липополисахарида и белка, путем добавления к клеточной массе буферного раствора, содержащего ЭДТА в количестве 0.01 - 0.05 ммоль на 1 г влажных клеток. Экстракт отделяли от интактных бактериальных клеток с помощью центрифугирования и добавляли к нему протеиназу К до конечной концентрации 80 мкг/мл. Данную смесь инкубировали в течении 60 мин при температуре 56-60°С. Получаемый ЛПС использовали как в растворе, так и после выделения из раствора с помощью стандартных процедур осаждения.

Препарат ЛПС, полученный с помощью предлагаемого нами способа (рис. 13 А, 3), при электрофоретическом разделении демонстрировал более чёткий трек, чем препарат ЛПС, полученный с помощью протеиназной обработки целых клеток (рис. 13 А, 1). Результаты иммунодиффузии (рис. 13 Б) свидетельствуют о том, что ЛПС, экстрагированный из наружной мембраны бактерий, ЛПС, выделенный из бактериального лизата, а также ЛПС, полученный с помощью усо-

*

I

Рис. 13 А. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС Бр245, полученных протеиназной обработкой бактериального лизата (1), экстракцией из целых клеток с помощью ЭДТА (2) и протеиназной обработкой экстракта, выделенного с помощью ЭДТА (3).

Б. Результаты иммунодиффузионного анализа данных препаратов с Ат на ЛПС 8р245.

вершенствованного метода, идентичны с иммунохимической точки зрения.

Таким образом, в результате протеиназной обработки солюбилизата наружной мембраны, полученного с помощью ЭДТА, мы получали препарат ЛПС, применимый для анализа в ПААГ и продемонстрировавший при электрофорезе более чёткое разделение. При этом данный препарат антигенно идентичен ЛПС, выделенному из бактериального лизата, но выгодно отличается простотой получения. Выделенный описанным способом препарат, благодаря отсутствию труд-ноудалимых примесей ДСН, может быть использован не только в электрофоре-тических экспериментах, но и в широком наборе микробиологических, биохимических и иммунологических исследований.

Выводы

1. Выявлены и охарактеризованы структуры, определяющие антигенные пере-крёсты между соматическим антигеном и полярным жгутиком бактерий р. АгозртИит.

2. Установлено наличие чехла (липо)полисахаридной природы, ассоциированного с поверхностью полярного жгутика и экранирующего флагеллин у типовых штаммов А. ЬгазИете.

3. Показано, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма А. ЬгазИете Бр7 антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.

4. Продемонстрировано наличие антигенных перекрёстов у Н-антигена бактерий для представителей видов А. ЬгазИете и А. Нро/егит.

5. Для серологически различных штаммов азоспирилл установлены характерные отличия спектров поглощения света препаратами ЛПС и отмечены изменения спектров, наблюдаемые внутри одного серотипа, коррелирующие с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.

6. Показана роль галактозы как иммунодоминантного моносахарида в составе антигенных детерминат липополисахарид-белкового комплекса, выделенного из капсульного материала штамма А. ЬгазИете Бр245.

7. Установлено, что структура антигенных детерминант О-специфических полисахаридов ЛПС может изменяться под влиянием условий культивирования бактерий на лабораторных средах. При этом экспонированность самих О-ПС в составе соматического антигена варьирует в зависимости от фазы роста бактериальной культуры.

8. Показано, что усовершенствованный способ выделения высокоочшценных ЛПС из солюбилизата наружных мембран бактерий обеспечивает получение препаратов, демонстрирующих эффективное разделение при электорофорезе в ПААГ и обладающих полным спектром антигенных детерминант.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Burygin G., Matora L., Shchyogolev S. Structural alteration of lipopolysaccha-rides from the nitrogen-fixing bacteria Azospirillum brasilense as a result of a modification of culture growth conditions // Abstr. IVth Eur. N2-fixation Conf. -Sevilla, Spain, 2000. - P. 135.

2. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Изменение антигенных свойств липополнсахаридов Azospirillum brasilense при внесении в среду культивирования трис(гидроксиметил)аминометана // Прикл. биохим. и микробиол. -2002. - Т.38, №3,- С. 292-294.

3. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Изучение липополнсахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum // Сб. тез. Конф. «Молодые учёные Волго-Уральского региона на рубеже веков». - Уфа: Башкирский университет, 2001. - Т. 2. - С. 23-25.

4. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Исследование гомологичных структур в составе липополисахарида и полярного жгутика бактерий рода Azospirillum II Сб. тез. Первой региональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». — Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2002. - С. 14.

5. Бурыгин Г.Л., Серебренникова О.Б., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Быстрый метод скринирования мутантов по структуре липополисахарида ассоциативных бактерий рода Azospirillum II Сб. тез. VI Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». - Тула: Изд-во Тул. гос. пед. ун-та им. Л.Н. Толстого, 2002. - Т. 3. - С. 10.

6. Burygin G.L. Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu. Investigation of homologous structures that are part of the lipopolysaccharide and the polar flagellum of Azospirillum brasilense II Abstr. Xth Intern. Congr. on Bacteriology and Applied Microbiology "The World of Microbes". - Paris, France, 2002. - P. 261.

7. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин Г.Л., Щёголев С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense II Микробиология. - 2003. - Т. 72, № 1. - С. 60-63.

8. Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам

исследования биополимеров: Учебное издание / И.Н. Клочкова, С.А. Кон-нова, Л.Ю. Матора, Г.Л. Бурыгин, С.Ю. Щёголев / Под ред. С.Ю. Щёголева. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. - 87 с.

9. Katzy E.I., Petrova L.P., Shelud'ko A.V., Borisov I.B., Kamneva A.B., Matveeva E.V., Matora L.Yu., Burygin G.L. Properties of the plant-growth-promoting rhizobacterium Azospirillum brasilense relevant to colonization of artificial media and wheat roots and to bioremediation // Abstr. Int. Symp. "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants With Technogenic Environmental Pollutants". - Saratov: Saratov University Publishing House, 2003. - P. 15.

10. Matora L.Yu., Burygin G.L., Shchyogolev S.Yu. Immunochemical analysis of Azospirillum lipopolysaccharides // Abstr. Xl-th Intern. Congr. on Molecular

Plant-Microbial Interactions "New bridges between Past and Future". Petersburg, Russia, 2003. - P. 309.

Подписано в печать 08.10.2003. Формат 60x84/16. Гаршпура Типев. Бумага типовая. Объем 1 печл. Тираж 100 экз. Заказ №5

Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13

2 e>o?-fl

P1 58 И

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бурыгин, Геннадий Леонидович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Бактерии рода АгоярМИит — модельный объект в исследованиях эффектов ассоциативности.

1.2. Строение наружной мембраны и характеристика основных поверхностных антигенов грамотрицательных бактерий.

1.2.1. Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

1.2.2. Основные антигены грамотрицательных микроорганизмов и их взаимодействие с иммунной системой животных.

1.3. Липополисахарид грамотрицательных бактерий.

1.3.1. ЛПС как соматический антиген.

1.3.2. Гетерогенность препаратов ЛПС в отношении их физико-химических свойств.

1.3.3. Изменения ЛПС в зависимости от возраста и условий культивирования бактерий.

1.4. Капсульные полисахариды.

1.5. Бактериальный жгутик.

1.5.1. Строение бактериальных жгутиков.

1.5.2. Жгутик как Н-антиген.

1.5.3. Гликозилирование полярного жгутика.

1.5.4. Выявление чехла на поверхности полярного жгутика.

1.6. Формулировка задач исследования.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Бактериальные штаммы, условия выращивания бактерий и использованные реактивы.

2.2. Получение антител, специфичных к бактериальным липополисахаридам.

2.3. Получение препаратов липополисахаридов.

2.4. Получение препаратов полярного жгутика.

2.5. Изучение подвижности бактериальных клеток.

2.6. Двойная иммунодиффузия.

2.7. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг.

2.8. Дот-анализ целых клеток и иммуноэлектронная микроскопия.

2.9. Спектрофотометрический анализ препаратов ЛПС.

2.10. Конкурентный иммуноанализ.

Глава 3. Полученные результаты и их обсуждение.

3.1. Исследование антигенов полярного жгутика бактерий р. АгоэрШиит.

3.1.1. Выявление липополисахаридного чехла на поверхности полярного жгутика.

3.1.2. Исследование углеводных фрагментов гликозилиро-ванного флагеллина полярного жгутика.

3.1.3. Получение и анализ антител на флагеллин

А. ЬгаБИете Эр7.

3.1.4. Исследование изменений подвижности клеток азос-пирилл при взаимодействии с антителами к О- и Н-антигенам.

3.2. Изучение О-антигенов азоспирилл.

3.2.1. Сравнительный анализ ЛПС различных штаммов азоспирилл.

3.2.2. Конкурентный иммуноанализ в оценке строения углеводных эпитопов бактерий.

3.3.Изменения иммунохимических характеристик ЛПС азоспирилл в зависимости от возраста бактериальной культуры и условий выращивания бактерий.

3.3.1.Влияние возраста культуры на экспонированность различных О-ПС в составе ЛПС.

3.3.2. Изменение антигенных свойств ЛПС азоспирилл при модификации условий культивирования.

3.4. Модификация способа получения высокоочищенных препаратов ЛПС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum"

Молекулярная архитектура клеточной оболочки грамотрицательных бактерий достаточно хорошо изучена. Однако авторы, как правило, уточняют, что приведенные сведения справедливы для семейства ЕшегоЪаМе-пасеае. В тоже время, разнообразие грамотрицательных микроорганизмов не исчерпывается представителями этого семейства. Очевидно, что экстраполяция представлений о клеточной стенке семейства энтеробактерий на всю группу грамотрицательных прокариот не вполне правомерна.

Основанием для этого, в частности, служат результаты, полученные при изучении клеточной поверхности почвенных ассоциативных бактерий рода АюБртИит. К числу таких результатов можно отнести: способность азоспирилл к образованию на поверхности клетки полярного пучка пилей (Шелудько и Кацы, 2001); наличие углеводных фрагментов в составе полярного жгутика (МоепБ et а1, 1995); обнаружение липополисахарид-белковых и полисахарид-липидных комплексов в составе капсульного материала (Кон-нова с соавт., 1994); отсутствие индивидуального капсульного антигена (Ма-тора и Щеголев, 2002); установленный для азоспирилл характер Я-Б диссоциации, нетипичный для грамотрицательных микроорганизмов (Серебренникова, 1998) и др.

Таким образом, азоспирилла, являясь, безусловно, типичным представителем грамотрицательных бактерий, демонстрирует особенности строения своей наружной мембраны. В первую очередь, это относится к структуре основных антигенов - соматического, жгутикового и капсульного. Исследование деталей строения этих важнейших бактериальных антигенов представляет фундаментальный интерес, поскольку дает возможность узнать, как организована поверхность бактерий, функционирующих в ризосфере растений. А ответ на вопрос «как устроено?» несомненно, поможет ответить на вопрос «как функционирует?».

Целью настоящей работы было получение новых сведений о строении жгутикового и соматического антигенов азоспирилл типовых штаммов и изучение топографической диспозиции этих антигенов в составе клеточной поверхности бактерий.

Примененный в работе комплексный иммунохимический анализ с использованием антител, специфичных к изучаемым структурам, а также использование мутантных штаммов, дефектных по синтезу данных структур, позволили впервые получить сведения о деталях строения и топографическом распределении О- и Н-антигенов в составе клеточной поверхности бактерий p. Azospirillum. Впервые выявлено наличие чехла (ли-по)полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика бактерий p. Azospirillum. Обнаружена иммунохимическая идентичность углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика и О-специфического полисахарида соматического антигена у азоспирилл. Продемонстрировано наличие антигенных перекрестов у Н-антигена бактерий для представителей видов A. brasilense и A. lipoferum. Определен иммунодоми-нантный моносахарид в составе антигенных детерминант ЛПС типового штамма A. brasilense Sp245. Продемонстрированы изменения экспонирован-ности О-специфических полисахаридов в составе ЛПС азоспирилл на разных фазах роста культуры. Кроме того, установлено, что структура антигенных детерминант ЛПС азоспирилл может изменяться под влиянием изменений состава среды культивирования.

Предложенный оригинальный способ получения высокоочищенных препаратов ЛПС может быть использован при решении широкого круга исследовательских и практических задач.

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. per. 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д. х. н. профессор Щеголев С. Ю.).

Работа была также поддержана грантами Комиссии РАН по работе с молодежью по итогам конкурсов 2002 и 2003 г.г. по поддержке базовых кафедр и филиалов кафедр, созданных при институтах РАН, грантом РФФИ № 02-04-58780з для поездки на 10-й Международный Конгресс по бактериологии и прикладной микробиологии «Мир микробов» (Париж, Франция, 2002) и гратом Президента РФ № НШ-1529.2003.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Бурыгин, Геннадий Леонидович

Выводы

1. Выявлены и охарактеризованы структуры, определяющие антигенные перекресты между соматическим антигеном и полярным жгутиком бактерий р. АгозртИит.

2. Установлено наличие чехла полисахаридной природы, ассоциированного с поверхностью полярного жгутика и экранирующего флагеллин у типовых штаммов А. ЪгаьНете.

3. Показано, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма А. ЪгазИете Бр7 антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.

4. Продемонстрировано наличие антигенных перекрестов у Н-антигена бактерий для представителей видов А. ЪгавИете и А. Иро/егит.

5. Для серологически различных штаммов азоспирилл установлены характерные отличия спектров поглощения света препаратами ЛПС и отмечены изменения спектров, наблюдаемые внутри одного серотипа, коррелирующие с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.

6. Показана роль галактозы как иммунодоминантного моносахарида в составе антигенных детерминат липополисахаридбелкового комплекса, выделенного из капсульного материала штамма А. ЬгаяИете 8р245.

7. Установлено, что структура антигенных детерминант О-специфических полисахаридов ЛПС может изменяться под влиянием условий культивирования бактерий на лабораторных средах. При этом экспонированность самих О-ПС в составе соматического антигена варьирует в зависимости от фазы роста бактериальной культуры.

8. Показано, что усовершенствованный способ выделения высокоочищен-ных ЛПС из солюбилизата наружных мембран бактерий обеспечивает получение препаратов, демонстрирующих эффективное разделение при электорофорезе в ПААГ и обладающих полным спектром антигенных детерминант.

Заключение

Проведенный нами комплексный анализ поверхностных структур клеток, содержащих О- и Н- антигены, дает представление о распределении данных антигенов в пределах клеточной поверхности азоспирилл. В свою очередь, это позволяет судить о возможной роли соматического и жгутикового антигенов (относящихся к категории важнейших) при разнообразных контактных взаимодействиях исследуемых бактерий.

Установленная достаточно высокая консервативность Н-антигена может быть обусловлена наличием на нем чехла (липо)полисахаридной природы, экранирующего флагеллин от непосредственных взаимодействий с окружающей средой. По этой же причине, вероятно, углеводные структуры в составе гликозилированного флагеллина полярного жгутика (оказавшиеся ан-тигенно идентичными О-ПС) не расширяют антигенный спектр исследуемых бактерий, а выполняют, главным образом, структурообразующую функцию.

Обнаруженная иммунохимическая идентичность углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма А. Ьга-йИете 8р7 одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена представляется достаточно важным наблюдением. С учетом полученных ранее данных об идентичности антигенных детерминант в составе капсульных полисахаридов, экзополисахаридов и липополисахаридов азоспирилл (Матора и Щеголев, 2002), это позволяет предположить наличие некоего общего пути (либо нескольких перекрещивающихся путей) биосинтеза углеводных поверхностных структур у бактерий рода АгоБрггШит.

Выявление чехла (липо)полисахаридной природы на флагеллине полярного жгутика бактерий р. АгоБртИит, а также описание роли полярного жгутика на этапе адсорбции этих бактерий на корнях растений (МкЫеЬ ег а1., 1991), позволяют расценивать поверхностные полисахариды азоспирилл как субстанцию, обеспечивающую адсорбцию данных бактерий на корнях растения. Кроме того, результаты, полученные при исследовании изменений подвижности азоспирилл под влиянием различных антител и свидетельствующие об экранирующем эффекте полисахаридного чехла, могут иметь практическое приложение. Тест на ингибирование подвижности бактерий при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител на ЛПС может быть использован для быстрой штаммовой идентификации азоспирилл.

Продемонстрированная роль галактозы как иммунодоминантного моносахарида в составе антигенных детерминант соматического антигена А. ЬгазНете Бр245 (с учетом результатов, полученных ранее для штамма 8р7) побуждает нас продолжить исследования в данном направлении. Их целью является проверка предположения о том, что галактоза может служить терминальным моносахаридом любого биологического повторяющегося звена О-ПС азоспирилл, вне зависимости от его иммунохимической специфичности и, соответственно, штаммовой принадлежности.

Существенными представляются также установленные нами факты, свидетельствующие об изменениях экспонированности О-специфических полисахаридов в составе ЛПС на разных фазах роста культуры. Мы предполагаем продолжить исследования строения и времени экспрессии липополиса-харидных антигенов азоспирилл, поскольку эти факторы могут быть ответственны за экологическое поведение данных бактерий.

Выявленное модифицирующее влияние ТРИС свидетельствует о том, что параметры культивирования азоспирилл в лабораторных условиях могут изменять структуру антигенных детерминат их ЛПС. Тот факт, что ТРИС не является инертным соединением и может взаимодействовать с исследуемой системой, на наш взгляд, должен учитываться при различных экспериментах с бактериальными культурами.

Сочетание результатов спектроскопических исследований ЛПС с данными иммунохимического анализа позволило сделать заключения о принципиальных различиях (или сходстве) в общей химической структуре О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС азоспирилл. В этой связи представляются важными результаты, свидетельствующие о том, что иммунохимическая гетерогенность О-специфических полисахаридов в пределах ЛПС одного штамма не связана с радикальными различиями их моно-сахаридного состава. Было бы весьма интересно проверить этот вывод с использованием более детальных структурных исследований ЛПС химическими методами.

Усовершенствованный способ быстрого выделения высокоочищен-ных бактериальных ЛПС, апробированный на бактериях р. АгоБртЦит, может быть использован при получении препаратов ЛПС для разнообразных микробиологических и биохимических исследований.

Реализованный в работе усовершенствованный вариант метода спек-тротурбидимерии, позволивший впервые для изучаемых систем определить как размер, так и состав коллоидных частиц нерастворимых иммунных комплексов, создает основу для более корректных количественных исследований процессов комплексообразования в иммунохимических системах.

В заключение я выражаю глубокую признательность Богатырёву В.А, Серебренниковой О.Б., Сумарока М.В., Дыкману Л.А., Александре Г., Жули-ну И.Б., Хлебцову Н.Г., Хлебцову Б.Н., Кацы Е.И., Шелудько А.В., Панасен-ко В.И., Конновой С.А. и Федоненко Ю.П за предоставленные объекты для исследования и возможность использовать соответствующее оборудование, за помощь в проведении экспериментов и плодотворное сотрудничество.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бурыгин, Геннадий Леонидович, Саратов

1. Аленькина С.А., Петрова Л.П., Никитина В.Е. Получение и характеристика мутанта Azospirillum brasilense Sp7 по лектиновой активности // Микробиология. 1998. - Т. 63. - С. 763-768 .

2. Антонюк Л.П., Игнатов В.В. О роли агглютинина зародышей пшеницы в растительно-бактериальном взаимодействии: гипотеза и экспериментальные данные в её поддержку // Физиология растений. 2001. - Т. 48. — С. 427-433.

3. Баканчикова Т.И., Лобанок Е.В., Павлова-Иванова Л.К., Редькина Т.В., Нагапстян Ж.А., Майсурян А.Н. Подавление процесса опухолеобразова-ния у двудольных растений штаммами Azospirillum brasilense // Микробиология. 1993. - Т. 62. - С. 515-523.

4. Бахолдина С.И., Красикова И.Н., Соловьёва Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липополисахаридный состав Yersinia pseudotuberculosis П Биоорг. химия. 2001. -Т. 27. - С. 151-155.

5. Громов Б.В. Строение бактерий. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1985. — 190 с.

6. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1985. -376 с.

7. Домарадский И.В. Роль поверхностных структур клеток-реципиентов при конъюгации бактерий // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология- 1985. -№12. -С. 3-11.

8. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. — 172 с.

9. Книрель Ю.А. Липополисахариды грамотрицательных бактерий // Прогресс химии углеводов / Под ред. И.В. Торгова — М.: Наука, 1985. — С. 5471.

10. Ю.Книрель Ю.А., Кочетков H.K. Строение липополисахаридов грамотрица-тельных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (обзор) // Биохимия. 1993. - Т. 58. - С. 166-181.

11. Коннова С.А., Брыкова О.С., Сачкова O.A., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Исследование защитной роли полисахаридных компонентов капсулы бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. — 2001. Т. 70. - С. SOSSOS.

12. Коннова С.А., Скворцов И.М., Макаров O.E., Игнатов В.В. Свойства полисахаридных комплексов, продуцируемых Azospirillum brasilense, и получаемых из них полисахаридов // Микробиология. 1994. - Т. 63. — С. 1020-1030.

13. Кэбот Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Медицина, 1968.-684 с.

14. И.Матвеев В.Ю., Петрова Л.П., Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Особенности диссоциации в культурах Azospirillum brasilense Sp7 II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1987. - №8. — С. 16-18.

15. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense II Микробиология. 2003. - Т. 72. - С. 60-63.

16. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 1998. - Т. 67. - С. 815-820.

17. Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Антигенная идентичность липополисахаридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense II Микробиология. 2002. - Т. 71. - С. 211-214.

18. Метлина А.Л. Жгутики прокариот как система биологической подвижности // Успехи биол. химии. 2001. - Т. 41. - С. 229-282.

19. Муравлёв А.И., Чикаев H.A., Никонова A.A., Шелковникова Э.М., Мертвецов Н.П. Иммунохимическая идентификация белковых продуктов трёхновых генов из области р13-14 хромосомы 11 человека // Молекул, биология. 1999. - Т. 33. - С. 163-168.

20. Никитина В.Е. Лектины азоспирилл: свойства, биологическая активность и перспективы их практического использования: Автореф. дисс. д-ра биол. наук. Саратов: РНИПЧИ "Микроб", 2001. 43 с.

21. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Итальянская Ю.В., Пономарёва Е.Г. Очистка и сравнение лектинов с клеточной поверхности активных и неактивных по гемагглютинации клеток азоспирилл // Биохимия. 1994. - Т. 59. — С. 656-662.

22. Серебренникова О.Б. Изучение липополисахаридов бактерий рода Azospi-rillum и их роли при контактных взаимодействиях микроорганизмов с растениями: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Саратов: РНИПЧИ "Микроб", 1998. 18 с.

23. Соловьёва Т.Ф., Оводов Ю.С. Липополисахарид-белковые комплексы внешней мембраны грамотрицательных бактерий // Биоорган, химия. -1983.-9.-С. 725-733.

24. Тимаков В.Д., Левашев B.C., Борисов Л.Б. Микробиология. М.: Медицина, - 1983. - 512с.

25. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Давыдов М.В., Шварцбурд Б.И. Спектро-турбидиметрический метод изучения дрожжевых суспензий // Прикл. биохим. микробиол. 1988. - Т. 24. - С. 581-586.

26. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на стенке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. - Т. 70. - С. 662-667.

27. Щёголев С.Ю. Физико-химический анализ дисперсных систем на основе спктротурбидиметрии: Автореф. дис. д-ра хим. наук. Саратов: СГУ им. Н.Г. Чернышевского, 1999. 39 с.

28. Яковлев М.Ю. «Эндотоксиновая агрессия» как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных // Успехи современной биологии. 2003. - Т. 123. - С. 31-40.

29. Agarwala-Dutt R., Tilak K.V.B.R., Rana J.P.S. Isolation of Azospirillum from interior of various parts of some graminaceous plants // Z. Mikrobiol. — 1991. — B. 146.-S. 217-219.

30. Albrecht S.L., Okon Y., Lonnquist L., Burris R.H. Nitrogen fixation by corn-Azospirillum associations in a temperate climate // Crop. Sci. 1981. - V. 21. -P. 301-306.

31. Alexander C., Rietschel E.T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. 2001. - V. 7. - P. 167-202.

32. Alexandre G., Rohr R., Bally R. A phase variant of Azospirillum lipoferum lacks a polar flagellum and constitutively expresses mechanosensing lateral flagella // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 4701-4704.

33. Arora S. K., Bangera M., Lory S., Ramphal R. A genomic island in Pseudomonas aeruginosa carries the determinants of flagellin glycosylation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.-V. 98.-P. 9342-9347.

34. Attridge S.R., Fazeli A., Manning P.A., Stroeher U.H. Isolation and characterization of bacteriophage-resistant mutants of Vibrio cholerae 0139 // Microb. Pathog. 2001. - V. 30. - P. 237-246.

35. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. -1983.-V. 29.-P. 924-929.

36. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Inoculation of field-grown wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum sp. // Brasil. Biol. Fertil. Soils. — 1987. — 4.-P. 37-40.

37. Baldani V.L.D., Dobereiner J. Host-plant specificity in the infection of cerals with Azospirillum spp. // Soil Biol. Biochem. 1980. - 12. - P. 433-439.

38. Barbieri P., Zanelli T., Galli E., Zanetti G. Wheat .inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1986. - V. 36. - P. 87-90.

39. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) I I Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. - P. 103-121.

40. Bashan Y., Levanony H. Active attachment of Azospirillum brasilense Cd to quartz sand and to light-textured soil by protein bridging // J. General Microbiol. 1988. - V. 134. - P. 2269-2279.

41. Bashan Y., Levanony H. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture I I Can. J. Microbiol. 1990. — V. 36. -P. 591-608.

42. Bashan Y., Levanony H., Klein E. Evidence for a weak active external adsorption of Azospirillum brasilense Cd to wheat roots // J. Gen. Microbiol. — 1986. -V. 132.-P. 3069-3073.

43. Baxa U., Cooper A., Weintraub A., Pfeil W., Seckler R. Enthalpic barriers to the hydrophobic binding of oligosaccharides to phage P22 tailspike protein // Biochemistry. 2001. - 40. - P. 5144-5150.

44. Beijerinck M.W. Über ein Spirillum, welches freien Stickstoff binden kann? // Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkun. Infektionskr. Hyg. 1925. - B. 63. - S. 353359.

45. Berg H. C., Brown D. A. Chemotaxis in Escherichia coli analyzed by three-dimensional tracking//Nature. 1972. - 239. - P. 500-504.

46. Bilar R., Rasul G., Arshad M., Malik K.A. Attachment, colonization and proliferation of Azospirillum brasilense and Enterobacter spp. on root surface of grasses II Word J. Microbiol. Biotechnol. 1993. - V. 9. - P. 63-69.

47. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Y., Schwartsburd B.I. The serotyping of Azospirillum spp. by cell-gold immunoblotting // FEMS Microbiol. Lett. — 1992. — V. 96.-P. 115-118.

48. Bradford M. N. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

49. Brimer C.D., Montie T.C. Cloning and comparison offliC genes and identification of glycosylation in the flagellin of Pseudomonas aeruginosa a-type strains // J Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 3209-3217.

50. Carlin N.I., Lindberg A.A., Bock K., Bundle D.R. The Shigella flexneri O-antigenic polysaccharide chain. Nature of the biological repeating unit // Eur. J. Biochem. 1984. - V. 139. - P. 189-194.

51. Carlson R.W., Kalembasa S., Turowski D., Pachori P., Noel K.D. Characterization of the lipopolysaccharide from a mutant of Rhizobium phaseoli which isdefective in infection thread development I I J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P.4923-4928.

52. Castric P. pilO, a gene required for glycosylation of Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin // Microbiology.- 1995. -V. 141.-P. 1247-1254.

53. Chaudhury S., Sengupta A. Association of nitrogen fixing bacteria with leaves of Avicennia officinalis L. a tidal mangrove tree of Sandarban // Indian. J. Microbiol. 1991.-V. 31.-P. 321-322.

54. Choma A. Lipopolysaccharides from Mesorhizobium huakuii and Mesorhizo-bium cicereti: chemical and immunological comparative data // Acta Biochim. Polonica. 2002. - V. 49. - P. 1043-1052.

55. Ciacci-Woolwine F., Blomfield I. C., Richardson S. H., Mizel S. B. Salmonella flagellin induces tumor necrosis factor alpha in a human promonocytic cell line I I Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 1127-1134.

56. Dahm H., Rozycki H., Strzelczyk E., Li C.Y. Production of B-group vitamins by Azospirillum spp. grown in media of different pH at different temperatures // Z. Mikrobiol.- 1993. -B. 148. S. 195-203.

57. Dazzo F.B., Brill W.J. Bacterial polysaccharide which binds Rhizobium trifolii to clover root hairs // J. Bacteriol. 1979. - V. 137. - P. 1362-1373.

58. Del Gallo M., Negi M., Neira C.A. Calcofluor- and lectin-binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II J. Bacterid. 1989.- V. 171.-P. 3504-3510.

59. Deloe I.M., Gilchrist J.E. Release of endotoxin in the form of cell wall blebs in vitro growth of Neisseria meningitidis II J. Exp. Med. — 1973. — V. 138. — P. 1156-1167.

60. Dobereiner J., Baldani V.L. Selective infection of maize roots by streptomycin-resistant Azospirillum lipoferum and other bacteria // Can. J. Microbiol. 1979. - V. 25 - P. 1264-1269.

61. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. Intern. Symp. on N2-Fixation. Washington, 1976. - P. 518-537.

62. Doig P., Kinsella N., Guerry P., Trust T. J. Characterization of a post-translational modification of Campylobacter flagellin: identification of a serospecific glycosyl moiety // Mol. Microbiol. 1996. - V. 19. - P. 379-387.

63. Doig P., Trust T.J. Identification of surface-exposed outer membrane antigens of Helicobacter pylori II Infect. Immun. 1994. - V. 62. - P. 4526-4533.

64. Dow M., Newman M.A., von Roepenack E. The induction and modulation of plant defense responses by bacterial lipopolysaccharides // Annu. Rev. Phyto-pathol. 2000. - V. 38. - P. 241-261.

65. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Roberts P. A. Smith F. Colorimetric method for determination of sugar and related substances // Anal. Biochem. — 1956.-V. 72.-P. 350-356.

66. Eckert B., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffels M., Hartmann A. Azospirillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus. I I Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. -P. 17-26.

67. Fedonenko Y.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - V. 337. - P. 869872.

68. Felix G., Duran J.D., Volko S., Boiler T. Plants recognise bacteria through the most conserved domain of flagellin // Plant J. 1999. - V. 18. - P. 265-276.

69. Freer J.H. Illustrated guide to the anatomy of the bacterial cell envelope // In: Immunology of the bacterial cell envelope / Eds. D.E.S. Stewart-Tull and M. Davies. John Wiley & Sons. - 1985. - P. 355-384.

70. Fuerst J.A., Perry J.W. Demonstration of lipopolysaccharide on sheathed flagella of Vibrio cholerae 0:1 by protein A-gold immunoelectron microscopy // J. Bacteriol.-1988.-V. 170.-P. 1488-1494.

71. Ge Y., Li C., Corum L., Slaughter C. A., Charon N. W. Structure and expression of the FlaA periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi // J. Bac-teriol.- 1998.- 180.-P. 2418-2425.

72. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Raetz C.R., Wright S.D. Human phagocytes have multiple lipid A-binding sites // Infect. Immun. 1990. - V. 58. - P. 40694075.

73. Gómez-Gómez L., Bauer Z., Boller T. Both the extracellular leucine-rich repeat domain and the kinase activity of FSL2 are required for flagellin binding and signaling in Arabidopsis II Plant Cell. 2001. - 13. - P. 1155-1163.

74. Gómez-Gómez L., Boiler T. FLS2: A LRR receptor-like kinase involved in recognition of the flagellin elicitor in Arabidopsis H Mol. Cell. 2000. — V. 5. — P. 1-20.

75. Gómez-Gómez L., Felix G., Boller T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana I I Plant J. 1999. - V. 18. - P. 277284.

76. Gryllos I., Shaw J.G., Gavin R., Merino S., Tomas J.M. Role of flm locus in mesophilic Aeromonas species adherence I I Infect. Immun. 2001. - V. 69. - P. 65-74.

77. Gustafsson B., Holme T. Rapid detection of Vibrio cholerae 0:1 by motility inhibition and immunofluorescence with monoclonal antibodies // Eur. J. Clin. Microbiol. 1985. - V. 4. - P. 291-294.

78. Hadas R., Okon Y. Effect of Azospirillum brasílense inoculation on root morphology and respiration in tomato seedlings // Biol. Fértil. Soils. 1987. - V. 5. -P. 241-247.

79. Hayashi F., Smith K.D., Ozinsky A., Hawn T.R., Yi E.C., Goodlett D.R., Eng J.K., Akira S., Underhill D.M., Aderem A. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5 // Nature. 2001. - V. 410. - P. 1099-1103.

80. He X., Rivkina M., Stocker B., Robinson W. S. Hypervariable region IV of Salmonella gene fliCd encodes a dominant surface epitope and a stabilizing factor for function flagella // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 2406-2414.

81. Heckels J.E., Virji M. Preparation of lipopolysaccharide and enterobacterial common antigen // In: Bacterial Cell Surface Techniques / Eds. I. Hancock and I. Poxton. John Wiley & Sons. - 1988. - P. 90-96.

82. Henrichsen J. Bacterial surface translocation: a survey and a classification // Bacteriol. Rev. 1972. - V. 36. - P. 478-503.

83. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella polysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. — 1983.-V. 154.-P. 269-277.

84. Holme T., Rahman M., Jansson P.E., Widmalm G. The lipopolysaccharide of Moraxella catarrhalis structural relationships and antigenic properties // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 265. - P. 524-529.

85. Hrabak E., Urbano M., Dazzo F. Growth-phase-dependent immunodetermi-nants of Rhizobium trifolii lipopolysaccharide which bind trifoliin A, a white clover lectin //J. Bacteriol. 1981. - V. 148. - P. 697-711.

86. Irvin R.T., MacAlister T.J., Costerton J.W. Tris(hydroxymethyl)-aminometane buffer modification of Escherichia coli outer membrane permeability // J. Bacteriol. 1981. - V. 145. - P. 1397-1403.

87. Jacques M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adhesion // Trends Microbiol. 1996. - V. 4. - P. 408-410.

88. Jain D., Partiquin D. Root hair deformation, bacterial attachment and plant growth in wheat-Azospirillum association // Appl. Environ. Microbiol. 1984. -V.48.-P. 1208-1213.

89. Jann B., Jann K. Structure and biosynthesis of the capsular antigens of Escherichia colill Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. - V. 150. - P. 19-42.

90. Jann K., Westphal O. Microbiol polysaccharides // The antigens / Ed. M. Sela. New York, 1975. - P. 1-126.

91. Josenhans C., Ferrero R. L., Labigne A., Suerbaum S. Cloning and allelic exchange mutagenesis of two flagellin genes of Helicobacter felis // Mol. Microbiol.- 1999.-V. 33.-P. 350-362.

92. Kabat E.A. Basic principles of antigen-antibody reaction // Meth. Enzymol. Immunochemical Techniques. New York: Acad. Press, 1980. - V. 70. - P. 349.

93. Kannenberg E.L., Carlson R.W. Lipid A and O-chain modifications cause Rhizobium lipopolysaccharides to become hydrophobic during bacteroid development // Mol. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 379-391.

94. Kapulnik Y., Okon Y., Henis Y. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation // Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31. - P. 881-887.

95. Katzy E.I., Matora L. Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-Mda plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in the production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. - V. 40. - P. 73-83.

96. Kenne L., Lindberg B. Bacterial polysaccharides // In: The polysaccharides, V. 2 / Ed. Aspinall G.O. Academic Press, Inc., 1983. - P. 287-363.

97. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A.D., Kaiser P. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizos-phere soil I I Res. Microbiol. 1989. - V. 140. - P. 679-693.

98. Kijne J.W. The Rhizobium infection process // In: Biogical Nitrogen Fixation / Eds. G. Stacey, R.H. Burris, H.J. Evans. Chapman and Hall, New York. - 1992.-P. 349-398.

99. Koch A.L. The biophysics of the gram-negative periplasmic space // Crit. Rev. Microbiol. 1998. - V. 24. - P. 23-59.

100. Korhonen T.K, Tarkka E., Ranta H, Haahtela K. Type 3 fimbriae of Klebsiella sp.: molecular characterization and role in bacterial adhesion to plant roots //J. Bacteriol. 1983. - V. 155. - P. 860-865.

101. Krieg N.R., Döbereiner J. Genus Azospirillum Tarrand, Krieg and Döbereiner 1979 // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. V. 1. — Baltimore/London: Williams & Wilkins, 1984. P. 94-104.

102. Lechner J., Wieland F. Structure and biosynthesis of prokaryotic glycoproteins // Annu. Rev. Biochem. 1989. - V. 58. - P. 173-194.

103. LeClerc G., Wang S. P., Ely B. A new class of Caulobacter crescentus flagellar genes // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 5010-5019.

104. Leive L., Shovlin V.K., Mergemhagen S.E. Physical, chemical and immunological properties of lipopolysaccharides released from Escherichia coli by ethylenediaminetetraacetate // J. Biol. Chem. 1968. - V. 243. - P. 6384-6391.

105. Lerouge I., Vanderleyden J. O-antigen structural variation: mechanisms and possible roles in animal/plant-microbe interactions // FEMS Microbiol. Rev. -2001.-V. 26.-P. 17-47.

106. Levanony H., Bashan Y. Enhancement of cell division in root tips and growth of the elongation zone in wheat roots induced by Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Bot. 1989. - V. 67. - P. 56-61.

107. Levanony H., Bashan Y. Localization of Specific Antigens of Azospirillum brasilense Cd in Its Exopolysaccharide by Immuno-Gold Staining // Curr. MiI crobiol. — 1989. V. 18.-P. 145-149.

108. Logan S.M., Kelly J.F., Thibault P., Ewing C.P., Guerry P. Structural heterogeneity of carbohydrate modifications affects serospecificity of Campylobacter flagellins // Mol. Microbiol. 2002. - V. 46. - P. 587-597.

109. Lugtenberg В., van Aphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other Gram-negative bacteria // Bio-chem. Biophis. Acta. 1983. - V. 737. - P. 51-115.

110. Magalhaes F.M., Baldani J.I., Souto S.M., Kuykendall J.R., Dobereiner J. A new acid-tolerant Azospirillum species // An. Acad. Brasil Cienc. — 1983. — 55. -S. 417-430.

111. Mamat U., Seydel U., Grimmecke D., Hoist O., Rietschel E.T. Lipopolisac-charides // Carbohydrates and Their Derivative Including Tannins, Cellulose and Related Lignins / Ed. Pinto B.M. Amsterdam: Elsevier, 1999. - V. 3. — P. 179-239.

112. Marceau M., Forest K., Beretti J.L., Tainer J., Nassif X. Consequences of the loss of O-linked glycosylation of meningococcal type IV pilin on piliation and pilus-mediated adhesion // Mol. Microbiol. 1998. - V. 27. - P. 705-715.

113. McCartney A.C., Wardlaw A.C. Endotoxin activities of lipopolysaccharides // Immunology of the Bacterial Cell Envelope / Eds. D.E.S. Stewart-Tull and

114. M. Davies. Chichester, John Wiley & Sons, 1985. - P. 203-238.

115. McDermott P.F., Ciacci-Woolwine F., Snipes J.A., Mizel S.B. High-affinity interaction between gram-negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation // Infect. Immun. 2000. - V. 68. — P. 5525-5529.

116. Michiels K., Croes C.L., Vanderleyden J. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots // J. Gen. Microbiol. -1991.-V. 137.-P. 2241-2246.

117. Mimori-Kiyosue Y., Yamashita I., Yamaguchi S., Namba K. Role of the outermost subdomain of Salmonella flagellin in the filament structure revealed by electron microscopy // J. Mol. Biol. 1998. - V. 284. - P. 521-530.

118. Minamino T., Yamaguchi S., Macnab R. M. Interaction between FliE and FlgB, a proximal rod component of the flagellar basal body of Salmonella II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 3029-3036.

119. Moens S., Michiels K., Vanderleyden J. Glycosylation of the flagellin of the polar flagellum of Azospirillum brasilense, a gram-negative nitrogen-fixing bacterium//Microbiology.-1995.-V. 141.-P. 2651-2657.

120. Moors M.A., Li L., Mizel S.B Activation of interleukin-1 receptor-associated kinase by gram-negative flagellin // Infect. Immun. 2001. - V. 69. P. 4424-4429.

121. Murty M.G., Ludha J.K. Differential colonization of Azospirillum lipoferum on roots of two varieties of rice (Oryza sativa L.) // Biol. Fertil. Soils. 1987. -V. 4.-P. 3-7.m

122. Namba K., Yamashita I., Vonderviszt F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella // Nature. 1989. - 342. - P. 648-654.

123. Newman M.A., Van Roepenack E., Daniels M., Dow M. Lipopolysaccha-rides and plant responses to phytopathogenic bacteria // Plant Pathol. 2000. -V. l.-P. 25-31.

124. Newton S.M.C., Wasley R.D., Wilson A., Rosenberg L.T., Miller J.F., Stocker B.A. Segment IV of a Salmonella flagellin gene specifies flagellar antigen epitopes // Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 419-425.

125. Noel K.D. Rhizobial polysaccharides required in symbiosis with legumes // Molecular signals in Plant-Microbe Communications / Ed. D.P.S. Verma. -CRC Press, Boca Raton, 1992. - P. 341-357.

126. Noel K.D., Duelli D.M., Neumann V.J. Rhizobium etli lipopolysaccharide alterations triggered by host exudate compounds // Biology of Plant-Microbe Interactions / Eds. Stacey G., Mullin B., P. Gresshoff. St. Paul, USA. - 1996. -P. 337-342.

127. Nosko P., Bliss L.C., Cook F.D. The association of free-living nitrogen-fixing bacteria with the roots of High Arctic graminoids // Arct. Alp. Res. — 1994.-V. 26.-P. 180-186.

128. Niihse T.S., Peck S.C., Hirt H., Boiler T. Microbial elicitors induce activation and dual phosphorylation of the Arabidopsis thaliana MAPK 6 // J. Biol. Chem. 2000. -V. 275. - P. 7521-7526.

129. Ohta-Tada U., Takagi A., Koga Y., Kamiya S., Miwa T. Flagellin gene diversity among Helicobacter pylori strains and IL-8 secretion from gastric epithelial cells // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - V. 32. - P. 455-459.

130. Okon Y., Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum-inoculated roots // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 3-16.

131. Okon Y., Itzigsohn R. Poly-p-hydroxybutyrate metabolism in Azospirillum brasilense and the ecological role of PHB in the rhizosphera // FEMS Microbiol. Lett.- 1992.-V. 103.-P. 131-139.

132. Orskov F., Orskov I. Escherichia coli serotyping and disease in man and animals // Can. J. Microbiol. 1992. - V. 38. - P. 699-704.

133. Ouchterlony O., Nilsson L.-A. Immunodiffusion and immunoelectrophoresis // Handbook of Experimental Immunology. Vol. 1. Immunochemistry / Ed. D.M. Weiz. Oxford: Alden Press, 1979. - P. 19-33.

134. Parge H. E., Forest K. T., Hickey M. J., Christensen D. A., Getzoff E. D., Tainer J. A. Structure of the fibre-forming protein pilin at 2.6 A resolution // Nature. 1995. - V. 378. - P. 32-38.

135. Patriquin D.J., Dobereiner J. Light microscopy observations of tetrazolium-reducing bacteria in the endorhizosphere of maize and other grasses in Brasil // Can. J. Microbiol. 1978. - V. 24. - P. 734-747.

136. Power P.M., Jennings M.P. The genetics of glycosylation in Gram-negative bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V. 218. - P. 211-222.

137. Qadri F, Haque A, Hossain A, Albert MJ. Production of slime polysaccharides by Shigella dysenteriae type 1 // Microbiol Immunol. 1994. — V. 38. - P. 11-18.

138. Reinhold B. B., Hauer C. R., Plummer T. H., Reinhold V. N. Detailed structural analysis of a novel, specific O-linked glycan from the prokaryote Flavobacterium meningosepticum II J. Biol. Chem. — 1995. — V. 270. — P. 13197-13203.

139. Rodelas B., Salmeron V., Martinez-Toledo M.V., Gonzalez-Lopez J. Productions of vitamins by Azospirillum brasilense in chemically-defined media // Plant Soil. 1993. -V. 153. - P. 97-101.

140. Russel S., Muszyski S. Reduction of 4-chloronitrobenzene by Azospirillum lipoferum II Azospirillum VI and Related Microorganisms / Eds. I. Fendrik, M.

141. Del Gallo, M. de Zamaroczy, J.Vanderleyden. Berlin: Springer, 1995. — P. 369-375.

142. Sarig S., Blum A., Okon Y. Improvement of the water status and yield of field-grown grain sorghum {Sorghum bicolor) by inoculation with Azospirillum brasilense II J. Agric. Sci 1988. - V. 110. - P. 271-277.

143. Schank S.C., Smith R.L., Weiser G.C. Fluorescent antibody technique to identify Azospirillum brasilense associated with roots of grasses // Soil Biol. Biochem. 1979. - V. 11. - P. 287-295.

144. Schloter M., Bode W., Hartmann A. Characterization of monoclonal antibodies against cell surface structures of Azospirillum brasilense Sp 7 using ELISA Techniques // Symbiosis. 1992. - V. 13. - P. 37-45.

145. Sen K., Nikaido H. Lipopolysaccharide structure required for in vitro trimerization of Escherichia coli OmpF porin // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. — P. 926-928.

146. Shah S., Karkhanis V., Desai A. Isolation and characterization of sidero-phore, with antimicrobial activity, from Azospirillum lipoferum II Curr. Microbiol. 1992. - V. 25. - P. 347-351.

147. Skerman V.B.D., McGowan V., Sneath P.H.A. Approved lists of bacterial names // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. - V. 30. - P. 225-420.

148. Skvortsov I.M., Ignatov V.V. Extracellular polysaccharides and polysaccha-ride-containing biopolymers from Azospirillum species: properties and possible role in interaction with plant roots // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 165. -P. 223-229.

149. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg B.J.J. Correlation between extracellular fibrils and attachment of Rhizobium leguminosarum to pea root hair tips // J. Bacteriol. 1986. - V. 168. - P. 821-827.

150. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg B.J.J. Roles of flagella, lipopolysaccharideIand Ca -dependent cell surface protein in attachment of Rhizobium leguminosarum biovar viciae to pea root hair tips // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 569-572.

151. Soto G.E., Hultgren S.J. Bacterial adhesins: common themes and variations in architecture and assembly // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 1059-1071.

152. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24 - P. 487-506.

153. Syzmanski C. M., Yao R., Ewing C. P., Trust T. J., Guerry P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni II Mol. Microbiol. 1999.-V. 32.-P. 1022-1030.

154. Tapia-Hernandez A., Mascarua-Esparza M.A., Caballero Mellado J. Production of bacteriocins and siderophore-like activity by Azospirillum brasilense I I Microbiology. 1990. - V. 64. - P. 73-83.

155. Thomashow L.S., Rittenberg S.C. Isolation and composition of sheathed flagella from Bdellovibrio bacteriovorus 109J I I J. Bacteriol. 1985. - V. 163. — P. 1047-1054.

156. Tronick S.R, Martinez R.J. Methylation of the flagellin of Salmonella typhi-murium II. J Bacteriol. 1971. - V. 105. - P. 211-219.

157. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccha-ridesin Polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. - V. 119. - P. 115-119.

158. Tsang V.C.W., Peralta J.M., Simons A.R. Enzyme-linked immunoelectro-transfer blot techniques (ELISA) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis // Methods Enzymol. 1983. - V. 92.-P. 377-391.

159. Tyler M.E., Milam J.R., Smith R.L., Schank S.C., Zuberer D.A. Isolation of Azospirillum from diverse geographic regions // Can. J. Microbiol. 1979. - V. 25. - P. 693-697.

160. Umali-Garcia M., Hubbell D., Gaskins M., Dazzo F. Adsorption and mode of entry of Azospirillum brasilense to grass roots // Associative ^-Fixation, Boca Raton: CRC Press, 1981. Vol. 1. - P. 49-62.

161. Umali-Garcia M., Hubbell D., Gaskins M., Dazzo F. Association of Azospirillum with grass roots // Appl. Environ. Microbiol. — 1980. V. 53. - P. 13971405.

162. Westphal O., Lüderitz O. Chemische Erforschung von lipopolysacchariden gramnegativer Bakterien // Angew. Chem. 1954. - B. 66. - S. 407-417.

163. Wyss C. Flagellins, but not endoflagellar sheath proteins, of Treponema pallidum and of pathogen-related oral spirochetes are glycosylated // Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 5751-5754.

164. Yegorenkova I.V., Konnova S.A., Sachuk V.N., Ignatov V.V. Azospirillum brasilense colonisation of wheat root and the role of lectin-carbohydrate interactions in bacterial adsorption and root-hair deformation // Plant Soil. 2001. — V.231.-P. 275-282.

165. Yonekura K., Maki S., Morgan D.G., DeRosier D.J., Vonderviszt F., Imada K., Namba K. The bacterial flagellar cap as the rotary promoter of flagellin self-assembly II Science. 2000. - V. 290. - P. 2148-2152.

166. Zhulin I.B, Armitage J.P. Motility, chemokinesis and methylation-independent Chemotaxis in Azospirillum brasilense II J. Bacterid. — 1993. — V. 175.-P. 952-958.