Гликозилированный флагеллин полярного жгутика бактерий рода Azospirillum

Беляков, Алексей Евгениевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гликозилированный флагеллин полярного жгутика бактерий рода Azospirillum
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гликозилированный флагеллин полярного жгутика бактерий рода Azospirillum"

г!

1 -

На правах рукописи

дичи«»—

Беляков Алексей Евгениевич

ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЙ ФЛАГЕЛЛИН ПОЛЯРНОГО ЖГУТИКА БАКТЕРИЙ РОДА АгОЭРШИ-ШМ: ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА

03.01.04-биохимия 03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 3 ОЕЗ 2011

Саратов - 2011

4843622

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: доктор биологических наук

Матора Лариса Юрьевна

кандидат биологических наук Бурыгин Геннадий Леонидович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Соколов Олег Игоревич

кандидат биологических наук Волох Оксана Александровна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН

Защита состоится «16 » февраля 2011 г. в 14.00 ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.1 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте института http://wwvv.ibppm.saratov.ru/obyav dis.html http://ibpprri.ru/dissertacionnvv-sovet/

Автореферат разослан « января 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Полярные жгутики ассоциативных микроорганизмов рода Azospirillum являются одними из главных клеточных структур, определяющих успешность взаимодействия азоспирилл с растениями. Они отвечают за направленное перемещение бактерий (Zhulin and Armitage, 1993), выполняют функцию адгезинов (Michiels et al., 1991), участвуют в реализации социальной подвижности (Кацы, 2007) и представляют собой один из важнейших поверхностных антигенов азоспирилл (Бурыгин, 2003).

Гликозилирование белка в прокариотических организмах - относительно редкий процесс посттрансляционной модификации. Более десяти лет назад был установлен факт гликозилирования главного структурного белка азоспирилл -флагеллина (Moens et al., 1995а), что ставит эти бактерии в один ряд с такими представителями прокариот как Campylobacter (Logan et al., 1989), Helicobacter (Josenhans et al., 1999), Aeromonas (Rabaan et al., 2001), Caulobacter (Johnson et al., 1983), Pseudomonas (Takeuchi et al., 2003), Agrobacterium (Deakin et al., 1999), Listeria (Schirm et al., 2004), Clostridium (Arnold et al., 1998). Однако до сих пор в известной нам литературе отсутствуют сведения о размерах, структуре и функциях О-связанного углевода гликозилированного флагеллина полярного жгутика А. brasilense Sp7, а также о наличии углеводных фрагментов в составе флагеллинов других штаммов азоспирилл. Отчасти это объясняется сложностью получения достаточных для анализа объемов химически чистого гликозилированного флагеллина, освобожденного от весьма прочно ассоциированного с ним чехла поли-сахаридной природы, который изолирует от окружающей среды филамент полярного жгутика азоспирилл (Бурыгин с соавт., 2007). Это обстоятельство делает актуальными усилия, направленные на разработку приемов выделения и очистки гликозилированного флагеллина данных почвенных бактерий.

Изучение структуры и свойств полярных жгутиков ассоциативных азоспирилл является весьма перспективной фундаментальной задачей, имеющей большое значение для понимания механизмов взаимодействия микроорганизмов с растениями. При этом следует отметить, что изучение гликозилированных бактериальных флагеллинов представляет несомненный практический интерес, поскольку основанная на полученных знаниях углеводная инженерия может способствовать решению проблемы микробного производства гликопротеинов с заданными свойствами.

Целью настоящей работы было получение новых сведений о строении и свойствах гликозилированного флагеллина полярного жгутика ассоциативных бактерий рола Azospirillum.

Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи: . .

1. Оптимизировать способ препаративного получения химически чистого гликозилированного флагеллина полярного жгутика бактерий рода Azospirillum.

2. Изучить структуру углеводных фрагментов флагеллина типового штамма A. brasílense.

3. Провести сравнительный анализ антигенных свойств белковых и углеводных доменов флагеллинов различных штаммов азоспирилл.

4. Оценить вариабельность углеводных фрагментов в составе флагеллина у штаммов азоспирилл, относящихся к различным О-серотипам.

Научная новизна работы.

Проведена оптимизация метода выделения и очистки гликозилированного флагеллина полярного жгутика азоспирилл, позволившая впервые получить данный белок в препаративном количестве. В работе впервые показано наличие нетипичной для бактериальных гликозилированных флагеллинов доли углеводных фрагментов у типового штамма A. brasilense Sp7. Впервые установлено строение повторяющегося звена О-связанного полисахарида, входящего в состав молекулы гликозилированного флагеллина полярного жгутика A. brasilense Sp7, состоящего из остатков рамнозы, глюкозамина, фукозы и галактозы. Впервые показана серологическая вариабельность углеводных фрагментов флагеллинов азоспирилл.

Практическая значимость работы.

Выделены и иммунохимически охарактеризованы флагеллины 22 штаммов бактерий рода Azospirillum, которые могут быть рекомендованы к использованию в in vitro экспериментах по исследованию роли этих структур в реализации различных типов межорганизменных взаимодействий. Полученные в работе препараты были использованы при выполнении плановых НИР ИБФРМ РАН. Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами химического факультета Саратовского госуниверситета.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Типовой штамм A. brasilense Sp7 обладает нетипичной для бактериальных гликозилированных флагеллинов долей углеводных фрагментов, представленных полисахаридом. Соотношение белковой и углеводной долей флагеллина составляет 3:1.

- Углеводные фрагменты флагеллина полярного жгутика типового штамма A. brasilense Sp7 состоят из остатков рамнозы, глюкозамина, фукозы и галактозы в равном соотношении.

- Серологическая вариабельность углеводных фрагментов сочетается с родовой специфичностью белковых детерминант флагеллина азоспирилл.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на 2-ой и 4-ой Региональных и 5-ой Всероссийской конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2004; 2008; 2010); Международной научной конференции молодых ученых «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006); 12-й, 13-ой и 14-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008; 2009; 2010) и 5-й Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН 8 октября 2010 года.

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.) и «Комплексный иммунохимический анализ эктосимбиотических растительно-микробных систем» (№ гос. регистрации 01200904388, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.). Работа поддержана грантами Президента РФ №№ НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 для молодых российских ученых и ведущих научных школ Российской Федерации.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в совместной работе с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН. Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) сняты и расшифрованы совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов ИОХ РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных источников, содержащего 192 наименования. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, включает 27 рисунков и 1 таблицу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава посвящена описанию современного состояния исследований структуры и функционирования бактериальных жгутиков, а также углеводных фрагментов, входящих в состав их флагеллинов. Особое внимание уделено процессу гликозилирования бактерильных белков и роли этого процесса в физиологии и экологии микроорганизмов. Приведена подробная характеристика ассоциативных бактерий рода АювртИит и обобщена литературная информация об их поверхностных антигенах.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе были использованы 22 штамма бактерий рода АгояртПит из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН. Для препаративных целей исследуемые микроорганизмы выращивали на жидкой модифицированной синтетической среде

(Day and Döbereiner, 1976) до экспоненциальной фазы роста. Осаждение бактериальных клеток осуществляли центрифугированием в течение 60 мин при 3000g.

Для получения препарата полярного жгутика бактериальные клетки отмывали в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 40 мл ЗФР. Полученную суспензию гомогенизировали в течение 90 сек 3500 об/мин с помощью блендера Braun Multiquick 350 (Braun, Испания). В некоторых случаях для отделения жгутиков от клеток применяли ультразвуковую обработку клеток с помощью дезинтегратора UD-20 (Techpan, Польша) в течение 1 или 10 сек при действии 22 кГц, а также понижение pH бактериальной суспензии до 2,0 при добавлении IM HCl. Для осаждения клеток суспензию дважды центрифугировали в течение 15 мин при 3000g.

Полученный супернатант подвергали ультрацентрифугированию в течение 1 часа при 100000g. Для получения реассоциированного жгутика препарат растворяли в дистиллированной воде и доводили pH среды до значения 2,0 с помощью IM HCl. Суспензию инкубировали в течение 60 мин при +4°С для полной диссоциации жгутиков на мономерные молекулы флагеллина. Нерастворенный материал удаляли с помощью центрифугирования при 100000g в течение 1 часа. pH су-пернатанта доводили до значения 7,0 с помощью 1 M Трис, инкубировали при +4°С в течение 8 часов и проводили еще одно центрифугирование.

В ходе работы был использован метод дробного осаждения (фракционирования) флагеллина сульфатом аммония. Осаждение белков проводили добавлением насыщенного (условно 100%) раствора (NH4)2S04 к охлаждённому (+4°С) раствору белка, последовательно достигая концентраций 30%, 40%, 50%, 60%, 70% и 80% сульфата аммония (m/m) в растворе.

При получении хроматографически чистого препарата флагеллина полярного жгутика A. brasilense Sp7 проводили гель-хроматографию с использованием матриц фирмы Pharmacia (Швеция): Sepharose PD-10, Sephadex G-50. Ионообменную хроматорафию проводили на колонке с анионообменной смолой DEAE-Toyopearl 650М (Toyo-Soda Company, Япония).

Водно-фенольную экстракцию проводили из раствора электрофоретически чистого препарата флагеллина, для чего к раствору флагеллина добавляли равный объём 80%-ного водного раствора фенола. Смесь нагревали на водяной бане до +45°С и инкубировали при этой температуре в течение 10 мин, после чего центрифугировали при 3000g в течение 30 мин. Отобранные фракции подвергали диализу против 1000-кратного объёма дистиллированной воды в течение 16 часов.

При анализе углеводного состава флагеллина полярного жгутика А. brasilense Sp7 проводили гидролиз гликопротеина как описано в работе Карлсона (Carlson, 1966). Деградацию полисахарида по Смиту, хроматографическую очистку продуктов гидролиза и ЯМР-анализ проводили как описано Федоненко с соавторами (Fedonenko et al., 2002).

Для иммуноэлектрофореза использовали 1%-ные агарозные гели, приготовленные на Трис-глицин-барбитуровом буфере. Гель после процедур отжима и трёхкратной отмывки в дистиллированной воде окрашивали раствором Кумасси синего R-250.

Электрофорез (Hitchcock and Brown, 1983) проводили в 5%, 7,5%, 10% и

12,5% ПААГ. С целью визуализации липополисахаридов (ЛПС) и белков гели окрашивали серебром (Tsai and Frasch, 1982) или Кумасси синим R-250, а также использовали их для электропереноса на нитроцеллюлозные фильтры. Для имму-нодетекции антигенов в качестве первых антител (Ат) использовали кроличьи Ат к флагеллину полярного жгутика A. brasilense Sp7, к О-антигенам A. brasilense Sp7 и Sp245, а также к интактным клеткам A. brasilense Sp7. В качестве вторых Ат использовали меченые пероксидазой козьи анти-кроличьи антитела (Tsang et al., 1983).

Иммуноферментный анализ, вариант ELISA (ИФА) проводили в 96-луночных планшетах. Тестируемые образцы иммобилизовали за счет простой адсорбции. В качестве субстратного реагента использовали орто-фенилендиамин с перекисью водорода. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 им (А490) на иммуноферментном анализаторе Multiskan Ascent (Thermo, Финляндия). Полученные результаты подвергали статистической обработке.

Электронно-микроскопический анализ проводили на просвечивающем электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 120 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Жгутики бактерий рода Azospirillum являются одними из важнейших клеточных структур, определяющих успешность взаимодействия бактерий с растениями (Nur et al., 1980). Вскоре после появления первых публикаций на эту тему исследователи приступили к изучению строения и функционирования жгутиков азоспирилл (Hall and Krieg, 1984). Но если аминокислотный состав и структура флагеллина латеральных жгутиков типового штамма А. brasilense Sp7 были описаны ещё в 1995 г. (Moens et al., 1995а), то структура флагеллина полярного жгутика неизвестна до сих пор. Одна из возможных причин задержки получения таких сведений заключается в том, что молекулы флагеллина полярного жгутика гликозилированы (Moens et al., 1995b) и не способны к самосборке в филамент при варьировании значения pH (Бурыгин, 2003). Данная особенность отличает их от «типичного» флагеллина бактерий и диктует необходимость разработки специального подхода к получению высокоочищенного изолированного от примесей флагеллина полярного жгутика для дальнейшей аналитической работы. Решению этой задачи был посвящен первый этап настоящей работы.

Оптимизированная схема выделения гликозилированного

флагеллина

Оценка удельного содержания флагеллина на разных стадиях роста бактериальной культуры A. brasilense Sp7, проведенная методами электрофореза в ПААГ и твердофазного ИФА с использованием полученных ранее специфических антител (Бурыгин с соавт., 2007) показала, что оптимальное выделение флагелли-

на полярного жгутика достигается из бактериальной культуры, находящейся на фазе экспоненциального роста (8-10 часов культивирования).

Основным способом выделения и очистки бактериальных флагеллинов является понижение рН раствора, содержащего отделенные жгутики, до 2,0 с последующим повышением до 7,0 с центрифугированием на каждом этапе (Метлина, 2001). При этом происходит последовательная диссоциация и реассоциация нитей жгутика. Для флагеллинов полярных жгутиков А. brasilen.se ранее была отмечена неприменимость данного подхода для выделения флагеллина (Бурыгин, 2003). В настоящей работе была оптимизирована процедура препаративного выделения высокоочищенного гликозилированного флагеллина и доказана неспособность к самосборке надмолекулярных структур при варьировании кислотности среды (возможно, определяемая присутствием углеводных фрагментов в составе жгутика). При получении хроматографически чистого препарата флагеллина полярного жгутика Л. ЬгаяИеняе Бр7 проводили гель-хроматографию и ионообменную хрома-торафию.

Оптимизированная процедура получения флагеллина состоит в следующем. Бактерии выращивают на жидкой питательной среде до логарифмической фазы роста, отделяют от среды культивирования и отмывают ЗФР от внеклеточных и капсульных полисахаридов с помощью центрифугирования. При этом в процессе культивирования контролируют оптическую плотность суспензии клеток и рН культуральной среды (после осаждения бактериальных клеток центрифугированием). По достижении суспензии клеток оптимальных значений данных показателей (А6б0 = 0,6 и рН 6,8-7,4), её центрифугируют при 3000£ для осаждения бактерий (рис. 1, стадия 1); супернатант, содержащий остатки питательной среды и продукты жизнедеятельности бактерий, отбрасывают.

Отмытые клетки суспендируют в ЗФР и обрабатывают в течение 1,5 мин блендером (3500 об/мин), после чего вновь осаждают центрифугированием. При этом помимо супернатанта (содержащего жгутики) и осадка (бактериальные клетки), формируется пена. В ее составе по результатам фенол-сернокислотной реакции присутствуют сахара, а по результатам окрашивания Кумасси отсутствуют белки (см. образец 3 на рис. 2).

Электрофоретический анализ препарата супернатанта (рис. 1, стадия 1) показал, что в его составе присутствует флагеллин полярного жгутика и большое количество примесных белков (рис. 2, образец 2).

Для концентрирования флагеллина из первоначального объёма и освобождения от белков с низкой молекулярной массой полученный супернант ультрацентрифугируют при ЮООООё в течение 40 мин.

Бактериальная культура в питательной среде

, Отмывка РВЯ и центрифугирование 3000р|

Супернатант Обработка блендепом 1,5мнн Осадок растворить в РВ8

_| Центрифугирование 3000", ,_

С.Чпернатант Осадок

Стадия 1 У'льтрлцентрнфупфованне 100000?

Супернатант

Осадок

Ресуспендцрованне в воде

Стадия 2 Центрифугирование 3000«

Супернатант Осадок

Стадия 3

Доведение рН р-ра до 2,0

I Ультрацентрифугнрованнс 100000;;

Стадия 4

Супернатант 1

Осадок

Повышение рН раствора до 7,0

Ультрацентрнфугнрование 100000«

СЧпернатант

Осадок

Обессолшанне (гель-фильтрация) РВ-10

Ионообменная хроматография (ПЕЛЕ) в 0,2 М Трнс-НС'1 буфере (рН 6,5), смыв градиентом №)(! (0 -> 0,5 М)

Рис. 1 Модифицированная схема выделения флагеллина полярного жгутика А. ЬгазИепье 8р7 с применением ионообменной хроматографии

В обычной схеме выделения конечным продуктом является сформировавшийся на данном этапе осадок. В настоящей работе предложено продолжение процедуры для дальнейшей очистки субъединиц гликозилированного флагеллина (рис. 1). Для этого осадок образец 2 (рис. 2) растворяют в 8-кратном объеме глицин-соляно-кислого буфера (рН 2,0) (рис. 1, стадия 3), что приводит к деструкции биомакромолекул флагеллина и других способных к реассоциации белков (например, пилина) на мономерные полипептиды. Следует отметить, что даже в результате такого воздействия в препарате присутствуют остатки агрегированных макромолекул, от которых необходимо освобождаться с помощью центрифугирования (рис. 1, стадия 2).

После процедуры ультрацентрифугирования диссоциированные до мономеров белки остаются в надосадочной жидкости, и на электрофореграмме препарата 5 (рис. 2) можно выделить всего две зоны, характеризующие флагеллин и, предположительно, пилин - сходный с фла-геллином структурный белок.

Установленное ранее обстоятельство, что флагеллин азоспирилл не способен к самосборке надмолекулярных структур в нейтральной среде, позволяет при повышении значения рН (рис. 1, стадия 4) и последующего ультрацентрифугирования препарата отделить флагеллин от второго белка (который, напротив, ассоциируется в крупный агрегат). Электрофореграмма на рисунке 2 свидетельствует о том, что полученный после всех описанных шагов надосадок (образец 7) содержит электрофоретически чистый флагеллин.

Таким образом, общепринятая схема нехроматографического выделения бактериального флагеллина по результатам исследований полярного жгутика азоспирилл дополнена процедурой диссоциации полимеров в кислой среде с последующим осаждением недиссоциированных молекул с помощью ультрацентрифугирования. С помощью описанной процедуры нами были выделены препараты из более чем двух десятков штаммов для изучения иммунохимических свойств флагеллинов бактерий рода АюхрпШит.

Рис. 2 Результат электрофореза в ПААГ препаратов, полученных при выделении и очистке флагеллина полярных жгутиков А. Ьга$Иеп$е 8р7 методом ультрацентрифугирования. Белковые маркеры (М), супернатант (!) и осадок (2) после первого ультрацентрифугирования, пена после обработки блендером (3), осадок (4) и супернантант (5) после второго ультрацентрифугирования, осадок (6) и супернантнт (7) после третьего ультрацентрифугирования. Окрашивание Кумасси синим 11-250

Кроме того, в настоящей работе проведено выделение флагеллина азоспи-рилл с использованием метода концентрирования и дробного осаждения (фракционирования) макромолекул раствором сульфата аммония. Установлено, что максимальное количество флагеллина присутствует во фракции, соответствующей 60%-ому от насыщения раствору сульфата аммония. Таким образом, эта концентрация соли является оптимальной для выделения флагеллина и максимально возможной (в данной методике) очистки его от примесей. Этот подход можно рекомендовать в качестве относительно простого приема концентрирования нативного флагеллина.

Изучение физико-химических и иммунохимических свойств флагеллина полярного жгутика типового штамма А. brasilense Sp7

Препарат флагеллина полярного жгутика А. brasilense Sp7, очищенный с помощью ионообменной хроматографии, был исследован на способность к поглощению света в ультрафиолетовом диапазоне (240-350 нм). Измеренный спектр поглощения показал наличие невыраженного пика в диапазоне 260-265 нм, характерного для остатков фенилаланина и тирозина, и отсутствие максимума на 280 нм, что свидетельствует об отсутствии в составе полипептида флагеллина полярного жгутика А. brasilense Sp7 остатков триптофана. Эти результаты согласуются с литературными данными для других бактериальных флагеллинов (низкое содержание ароматических аминокислот и отсутствие триптофана) (Метлина, 2001), и, как следствие, позволяют сделать важный практический вывод о малой эффективности спектрофотометрического метода измерения концентрации белка применительно к флагеллину полярного жгутика азоспирилл.

Калориметрическим методом и по характеру распределения между фазами в системе фенол/вода определена массовая доля углеводов в молекуле флагеллина, составляющая 0,25-0,3. Следует подчеркнуть, что в дальнейшей работе эти данные были подтверждены при изучении состава углеводных фрагментов флагеллина А. brasilense Sp7.

Для получения сведений об иммунохимических свойствах полярного жгутика азоспирилл использовали препараты флагеллина, выделенные с помощью оптимизированной процедуры из 22 штаммов, относящихся к родам А. brasilense. А. lipoferum и А. irakense. Иммунохимический анализ проводили с использованием антител на флагеллин типового штамма А. brasilense Sp7, антител на интактные клетки этого штамма, а также обладающих О-антигенной специфичностью антител на обработанные глутаровым альдегидом клетки штаммов А. brasilense Sp7 и Sp245, относящихся к различным серологическим группам согласно характеристикам их ЛПС или О-антигена (Матора с соавт., 2005). Анализ проводили методами линейного иммуноэлектрофореза, иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа (вариант ELISA).

Результаты линейного иммуноэлектрофореза препарата флагеллина А. ЬгаяИепзе Бр7 с использованием гомо-гичных антител приведены на рисунке 3. По результатам этого анализа две визуализо-ванные с помощью денатурирующего электрофореза в ПААГ изоформы флагеллина проявляли антигенную идентичность и формировали сливающиеся полосы преципитации. При этом одна из форм флагеллина Бр7 имела анодную подвижность (отрицательный заряд), а вторая была нейтральной.

Результаты электрофореза в ПААГ и иммуноблоттинга препарата флагеллина полярного жгутика Бр7 с использованием антител на флагеллин и ЛПС этого штамма представлены на рисунке 4. Можно видеть, что молекулы флагеллина в иммуноблоттинге выявлялись не только антителами на флагеллин, но и антителами на ЛПС, что свидетельствовало о наличии в составе флагеллина полярного жгутика А. ЬгаяИеняе Бр7 антигенных детерминант углеводной природы, идентичных эпитопам ЛПС данного штамма.

Исследование углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика А. ЬгавИете Хр7

Совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов Института органической химии РАН и лаборатории биохимии ИБФРМ РАН были выделены и исследованы углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика А. ЬгазИепэе Яр7 и определен их моносахаридный состав.

В результате анализа препарата флагеллина, подвергнутого гидролизу белковой части, было показано, что в его составе имеется О-связанный полисахарид, состоящий не менее чем из 30 моносахаридных остатков. В целом углеводный фрагмент был по заряду нейтрален. В составе углеводных фрагментов флагеллина были идентифицированы моносахариды рамноза, глюкозамин, фукоза и галактоза в равном соотношении.

Установленный факт приобретает особое значение при сопоставлении его с результатами, ранее полученными Ванблю с соавторами (УапЫеи е/ а/., 2005). Эти авторы установили, что в составе ЛПС А. Ьгазйете Бр7 доминирующими сахара-ми также являются рамноза, фукоза и галактоза. Следует также отметить, что в работе Матора с соавторами (1998) была показана роль галактозы и рамнозы в качестве иммунодоминантных моносахаридов антигенных детерминант О-специфического полисахарида у А. ЬгазИепзе 8р7. Совокупность полученных ре- ( зультатов и анализ литературных данных позволяют сделать вывод о близком сходстве полисахаридных структур флагеллина и ЛПС этих бактерий.

Рис. 3 Результат линейного иммуноэлектрофореза препарата флагеллина полярного жгутика А. ЬгавИете Бр7 (1) с гомологичными антителами (21.

Таким образом, в настоящей работе впервые была показана нетипично большая для бактериальных полярных жгутиков доля углеводных I фрагментов в составе глико-' зилированного флагеллина и установлено сходство моно-сахаридного состава и антигенных свойств этих углеводных фрагментов и ЛПС у типового штамма А. ЪгазИепзе Бр7.

При этом особый интерес, с нашей точки зрения, представлял тот факт, что иммунохимический анализ, проведенный методом имму-ноблоттинга, не выявил симметричных перекрестов, т.е. антитела на гликозилирован-ный флагеллин не распознавали детерминанты ЛПС (рис. 4).

Для того чтобы дополнительно оценить вклад белковых и (возможно) углеводных детеминант в антигенность флагеллина А. ЬгазИепзе Бр7 была проведена серия экспериментов с использованием метода ИФА и антител на флагеллин и ЛПС данного штамма. Препарат флагеллина в этих экспериментах подвергали ферментативному протеолизу (для разрушения белковых антигенных детерминант) и диссоциации на мономеры при низком значении рН (для увеличения экспонированности белковых и углеводных детерминант).

В результате этих экспериментов не было выявлено сколь-нибудь значительного вклада углеводных детерминант в продукцию антител, специфичных флагеллину Бр7. Так, обработка препарата флагеллина протеолитическим ферментом протеиназа К приводила к полной утрате способности результанта реагировать в ИФА с гомологичными антителами. При этом значения оптической плотности продуктов иммуноферментной реакции нативного и разрушенного протеолизом флагеллина с использованием антител на ЛПС существенным образом не отличались от фоновых значений. Следовательно, антитела на флагеллин А. ЬгаяНете 8р7 взаимодействуют только с белковой частью макромолекулы.

А Б В Г

Рис. 4 Результаты электрофореза в ПААГ и им-муноблоттинга препаратов флагеллина (1) и ЛПС (2) А. ЬгазПепзе Бр7. А - окраска нитратом серебра (на белки); Б - окраска нитратом серебра после периодатного окисления; В - иммуноблоттинг с Ат на флагеллин А. ЬгазИепзе Эр7; Г - иммуноблоттинг с Ат на ЛПС А. Ьгазйепяе 8р7

Об этом же говорят результаты иммуноферментного анализа препаратов флагеллина, подвергнутых кислотной

диссоциации. На рисунке 5 можно видеть, что жгутик после кислотной диссоциации не отличим по уровню |

взаимодействия с антителами от | нативного жгутика.

Опираясь на известные сведения о том, что наиболее экс- ; понированным доменом флагеллина (ориентированным во внешнее пространство в сформирован- | ном филаменте жгутика) является [ средний домен БЗ, и учитывая тот I факт, что при диссоциации нити не наблюдается увеличение 1 сайтов взаимодействия с антителами, можно утверждать, что за иммунохимические свойства флагеллина полярного жгутика у данных бактерий ответственен средний структурный домен молекулы.

Таким образом, установлено, что углеводные фрагменты в составе флагеллина не обладают иммуногенной активностью, и в процессе получения антител на флагеллин синтезируются иммуноглобулины, специфичные только к белковой части молекулы.

Серологические свойства флагеллина азоспирилл

Антитела на флагеллин штамма А. Ьга-чИепяв 8р7 в иммуноблоттинге I взаимодействовали с препаратами флагеллина серологически различных штаммов азоспирилл, что позволило констатировать высокую консервативность белковых антигенных детерминант Н-антигена данных бактерий (рис. 6, Б).

Белковые детерминанты субъединиц полярного жгутика типового штамма | обладали примерно одинаковой и весьма высокой иммуногенностью, поскольку оба мономера взаимодействовали в иммуноблоттинге как с антителами на изолированный флагеллин А. Ъга$Иеп&е Бр7, так и с антителами, полученными на : интактные клетки А. ЬгаяНете Бр7 (рис. 6, В). |

Следует подчеркнуть, что в последнем случае антитела на белковые детер- ■ минанты субъединиц синтезировались вопреки экранирующему эффекту полиса-харидного чехла по отношению к флагеллину А. ЬгаяИепье, установленному ранее по результатам тестов агглютинации и ингибирования подвижности азоспирилл под действием Ат к ЛПС (Бурыгин с соавт., 2007).

А„

2.5 ,

123456789

Номер двукратного рашеденни

Рис. 5 Результаты ИФА препарата флагеллина полярного жгутика А. Ъга$Иете Бр7, подвергнутого кислотной диссоциации (1), по сравнению с нативным препаратом (2) с Ат к флагеллину А. Ъгазйеп$е Эр7

Анализ результатов иммуноблот-тинга препаратов гликозилированных флагеллинов с антителами на О-антигены азоспирилл выявил различия в антигенных свойствах углеводных фрагментов флагеллинов.

Для штаммов азоспирилл, относящихся к разным серологическим типам (8р7 и 8р245), было установлено, что углеводные фрагменты их флагеллинов проявляют групповую серологическую специфичность, сходную со специфичностью их О-антигенов. В частности, для штаммов серотипа Бр7 (Сё, 81155, 7.к.2) показано взаимодействие их флагеллинов как с Ат к флагеллину А. Ъгаьйете 8р7, так и с Ат к соматическому антигену этого штамма. Для штаммов серотипа Бр245 (рис. 7) показано взаимодействие препаратов их полярных жгутиков с Ат к флагеллину А. ЬгаБИепБе 8р7.

При этом можно видеть, что Ат к ЛПС штамма А. ЬгазИепяе 8р245 реагировали в иммуноблоттинге с флагеллином штамма А. ЬгавИете 81175, для которого установлена идентичность строения повторяющегося звена О-ПС таковому штамма Л. ЬгазИете 8р245 (Федоненко с соавт., 2005). Полученные результаты говорят о весьма высокой вариабельности углеводных фрагментов, входящих в состав флагеллинов полярных жгутиков азоспирилл.

SR8 SR64 BR14 SR41

Рис. 6 Результаты электрофореза в ПААГ (А) и иммуноблоттин-га с Ат к флагеллину (Б) и интактным клеткам (В) А. Ъгаь'йепве 8р7 препаратов полярных жгутиков штаммов А. ЬгазИепяв 8Я8, 81164, ВШ4 и 8Я41

Рис. 7 Результаты электрофореза в ПААГ (А) и имму-ноблоттинга с Ат к флагеллину A. brasilense Sp7 (Б) и ЛПС A. brasilense Sp245 (В) препаратов полярных жгутиков штаммов A. brasilense Sp245, Spl07, SR75 и SR15

Ю h-

^t О и

N *- N

a a Dí

(Л (Л (Л

ОТ

Ю N

■ф о ю

см ^

а а К К

ОТ «Я (0 <0

í " I

Ю h>

О V) Щ

СМ г- N та. а К 0£

ОТ ОТ ОТ ОТ

Термостабильность белковых антигенных детерминант гликозилированного флагеллина азоспирилл

В настоящей работе была продемонстрирована необычно высокая термостабильность белковых антигенных детерминант флагеллина исследуемых бактерий.

Для изучения термостабильности флагеллина полярного жгутика А. brasilense Sp7 очищенный препарат этого белка подвергали термообработке при 100°С в течение 10 минут, раствор центрифугировали и освобождали от осадка. Наличие и концентрацию флагеллина оценивали методом ИФА с гомологичными антителами. В качестве контроля выступал исходный раствор флагеллина, не подвергнутый термической обработке. Приведенные на рисунке 8 результаты свидетельствовали о том, что количество нативных детерминант после кипячения сокращается совсем незначительно. Следовательно, можно утверждать, что флагел-лин полярного жгутика азоспирилл характеризуется очень высокой термостабильностью.

Можно предположить, что структурную стабилизацию мономеров жгутика азоспирилл обеспечивают углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина. С учетом полученных нами данных о неиммуногенности этих структур в составе флагеллина наряду с их способностью in vitro взаимодействовать с ЛПС-специфичными антителами, весьма непротиворечивой выглядит гипотеза о том, что углеводные фрагменты у A. brasilense Sp7 могут входить в состав стержня нити бактериального жгутика (образованного D1 и D2 доменами флагеллина).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ем

Номер двукратного разведения

Рис. 8 Результаты ИФА препаратов полярных жгутиков А. ЬгстИепче Бр7, подвергнутых кипячению (1), по сравнению с нативным препаратом (2) с Ат к флагеллину штамма А. ЬгазИепзе Бр7

ем других примесных макромолекул, и наиболее эффективный способ отделения нити жгутика от бактериальной клетки. В процессе отработки процедуры препаративного получения флагеллина азоспирилл доказана неспособность к самосборке надмолекулярных структур при варьировании кислотности среды (возможно, определяемая присутствием углеводных фрагментов в составе жгутика). Обнаружено, что гликозилированный флагеллин полярного жгутика азоспирилл при вод-но-фенольной экстракции переходит в фенольную фракцию; а при высаливании сульфатом аммония наиболее эффективны концентрации 50-70% от насыщенной.

В работе впервые показана нетипично большая для бактериальных полярных жгутиков доля углеводных фрагментов в составе гликозилированного флагеллина и установлено сходство моносахаридного состава и антигенных свойств этих углеводных фрагментов и ЛПС у типового штамма A. brasilense Sp7. В качестве одного из наиболее существенных результатов работы мы рассматриваем получение приоритетных данных о наличии О-полисахарида в составе субъединиц полярного жгутика азоспирилл. Следует отметить, что ранее в составе гликозили-рованных флагеллинов бактерий другие исследователи описывали только моно-или олигосахаридные заместители (Logan, 2006).

Обнаружение полисахарида в составе флагеллина хорошо объясняет природу прочной ассоциации ранее выявленного (липо)полисахаридного чехла с нитью полярного жгутика у бактерий рода Azospirillum (Бурыгин с соавт., 2007), поскольку основой прочной связи могут являться углевод-углеводные взаимодействия О-полисахарида флагеллина с соответствующими структурами в составе чехла.

Оптимизированный в работе способ препаративного получения высоко-очищенного гликозилированного флагеллина полярного жгутика азоспирилл позволил выделить и иммунохимически охарактеризовать флагеллины двух десятков штаммов азоспирилл, относящихся к трем видам: A. brasilense. A. lipoferum и А. irakense. Методом иммуноэлектрофореза выявлены две изоформы флагеллина, проявляющие антигенную идентичность и формирующие сливающиеся полосы преципитации.

Анализ методом иммуноблоттинга препаратов флагеллинов серологически различных штаммов азоспирилл с использованием антител на флагеллин типового штамма A. brasilense Sp7 выявил высокую консервативность белковых антигенных детерминант Н-антигена данных бактерий. В то время как результаты иммуноблоттинга препаратов флагеллинов с антителами на О-антигены азоспирилл выявили различия в антигенных свойствах углеводных фрагментов флагеллинов. Для штаммов азоспирилл, относящихся к разным серологическим типам (Sp7 и Sp245) установлено, что углеводные фрагменты их флагеллинов проявляют групповую серологическую специфичность, сходную со специфичностью их О-антигенов. Совокупность полученных результатов и анализ литературных данных позволили сделать вывод о близком сходстве полисахаридных структур флагеллина и ЛПС у бактерий рода Azospirillum.

Установлено, что углеводные фрагменты в составе флагеллина не обладают иммуногенной активностью, и в процессе получения антител на флагеллин синтезируются иммуноглобулины, специфичные только к белковой части молекулы.

При этом показано, что белковые детерминанты флагеллина полярного жгутика азоспирилл характеризуются очень высокой термостабильностью, вероятно, обеспечиваемой полисахаридными фрагментами гликозилированного флагеллина. Таким образом, с учетом полученных данных о неиммуногенности этих структур в составе флагеллина наряду с их способностью in vitro взаимодействовать с О-специфическими антителами, весьма непротиворечивым выглядит предположение о том, что полисахаридные фрагменты у азоспирилл могут входить в состав стержня нити бактериального жгутика.

Полученные в работе результаты существенным образом расширяют представления о строении главного структурного белка бактерий, а выделенные и охарактеризованные препараты флагеллинов различных штаммов почвенных бактерий рода Azospirillum могут быть рекомендованы для детального исследования роли этих структур в реализации молекулярных механизмов взаимовыгодных растительно-микробных взаимоотношений.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован способ препаративного получения химически чистого гликозилированного флагеллина полярного жгутика азоспирилл, позволивший выделить и иммунохимически охарактеризовать флагелли-ны двух десятков штаммов азоспирилл.

2. Впервые продемонстрировано наличие 0-полисахарида в составе бактериального флагеллина.

3. Показано, что в состав углеводных фрагментов флагеллина типового штамма A. brasilense Sp7 входят остатки рамнозы, глюкозамина, фуко-зы и галактозы в равном соотношении.

4. Продемонстрирована серологическая вариабельность углеводных фрагментов, сочетающаяся с родовой специфичностью детерминант собственно флагеллина азоспирилл.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

* - публикации в изданиях перечня ВАК

1. Бурыгин Г.Л., Беляков А.Е., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Спектрофотомет-рические характеристики поверхностных углеводов бактерий рода Azospirillum // Матер. 2-й регион, конфер. молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». - Саратов: Изд-во «Научная книга», 2004. - С. 13-14.

2. Belyakov A.Ye., Burygin G.L., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu. Isolation of the flagellin of the bacterium Azospirillum brasilense, having a sheathed polar flagellum // Modern problems of Microbiology and biotechnology / The young

scientists' and students' international scientific conference, 28-31 May 2007. -Odesa, 2007. - P. 62.

3. Беляков A.E., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю. Иммунохимическая специфичность флагеллинов полярных жгутиков ризобактерий Azospirillum brasilense II Матер. IV межрегион, конф. молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». - Саратов: Изд-во «Научная книга», 2008. - С. 46.

4. Бурыгин Г.Л., Филипьечева Ю.А., Беляков А.Е., Матора Л.Ю. Разнообразие поверхностных антигенов рост-стимулирующих ризобактерий рода Azospirillum II Сб. тез. 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 10-14 ноября 2008 г. - Пущино, 2008. - С. 253-254.

5. Бурыгин Г.Л., Беляков А.Е., Селиванов Н.Ю., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Структура и свойства флагеллина полярного жгутика ризобактерий рода Azospirillum II Сб. тез. 13-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 28 сентября - 2 октября 2009 г. - Пущино, 2009. - С. 193-194.

6. Бурыгин Г.Л., Филипьечева Ю.А., Беляков А.Е., Попова И.А., Шувалова Э.В., Матора Л.Ю. Серологическое разнообразие почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum И Сб. тез. V Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», 26 - 27 октября 2009 г. - Москва, 2009. - С. 15-16.

7. Беляков А.Е., Бурыгин Г.Л., Селиванов Н.Ю., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Сравнительное изучение углеводных фрагментов жгутика и липополисаха-рида Azospirillum brasilense II Сб. тез. 14-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 19 - 23 апреля 2010 г. - Пущино, 2010. - С. 9-10.

8.* Филипьечева Ю.А., Беляков А.Е., Бурыгин Г.Л., Коннова С.А. Иммунохими-ческое исследование антигенных свойств почвенных рост-стимулирующих бактерий рода Azospirillum // Известия Саратовского университета - 2010, Т. 10. - Сер. Химия. Биология. Экология, вып. 1. - С. 62-65.

9. * Беляков А.Е., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л. Получение и исследование глико-

зилированного флагеллина почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense II Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова -2010,-№9. -С. 3-6.

10. Fedonenko Yu.P., Smol'kina O.N., Belyakov A.Ye., Burygin G.L., Shchegolev S.Yu., Konnova S.A., Ignatov V.V. Structural and cross-serological analysis of the O-, С- and H-antigens of Azospirillum brasilense type strain Sp7 // Abstr. 4th Baltic meeting on Microbial Carbohydrates. - Hyytiälä Forestry Field Station, Finland, 19 - 22 September, 2010. - P. 34.

11. Беляков A.E., Селиванов Н.Ю., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Структура и иммунохимические свойства гликозилированного флагеллина полярного жгутика бактерий Azospirillum brasilense II Матер. V Всеросс.

конф. молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». - Саратов: Изд-во «Наука», 2010. - С. 110. Беляков А.Е., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю. Серологические свойства флагел-лина полярного жгутика ассоциативных бактерий рода АгозртИит // Матер. межд. науч.-практ. конф. «Вавиловские чтения - 2010». Саратов: «КУБИК», 2010.-Т. 1.-С. 189-190.

Подписано в печать 12.01.2011

Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Беляков, Алексей Евгениевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Жгутики бактерий как важный компонент поверхности прокариотической клетки.

1.1.1. Строение бактериальных жгутиков.

1.1.2. Механизмы сборки бактериального жгутика.

1.1.3. Общие свойства бактериальных флагеллинов.

1.2. Гликозилирование белка в прокариотических организмах.

1.2.1. Феномен гликозилирования бактериальных белков.:.

1.2.2. Гликозилирование флагеллина бактериальных жгутиков.

1.3. Характеристика бактерий рода АгояртПит.

1.3.1. Разнообразие азоспирилл.

1.3.2. Поверхностные антигены бактерий рода АгозртИит.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Бактериальные штаммы и условия выращивания бактерий.

2.2. Получение антител.

2.3. Получение препаратов липополисахаридов

2.4. Получение препаратов флагеллина полярного жгутика бактерий рода АгозртИит.

2.5. Водно-фенольная экстракция флагеллин-содержащих систем.

2.6. Спектроскопические исследования.

2.7. Гидролиз флагеллина и деградация полисахаридов

2.8. Линейный иммуноэлектрофорез

2.9. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг.

2.10. Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ

2.11. Просвечивающая электронная микроскопия.

Глава 3. Полученные результаты и их обсуждение.

3.1. Выделение и очистка гликозилированного флагеллина полярного жгутика бактерий рода АгоБршИит.

3.1.1. Оценка удельного содержания флагеллина на разных стадиях роста бактериальной культуры.

3.1.2. Сравнение эффективности различных методов отделения жгутика от бактериальной клетки.^

3.1.3. Оптимизированная схема выделения гликозилированного флагеллина.

3.1.4. Осаждение флагеллина полярного жгутика А. ЬгаяИепзе 8р раствором сульфата аммония.

3.1.5. Водно-фенольная экстракция флагеллин-содержащих систем.

3.2. Изучение физико-химических и иммунохимических свойств флагеллина полярного жгутика А. ЬгазИете Бр7.

3.2.1. Иммунохимический анализ флагеллина полярного жгутика азоспирилл.

3.2.2. Исследование углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика А. ЬгаяИете 8р7.

3.2.3. Серологические свойства флагеллина азоспирилл.

3.2.4. Термостабильность белковых антигенных детерминант гликозилированного флагеллина азоспирилл.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гликозилированный флагеллин полярного жгутика бактерий рода Azospirillum"

Полярные жгутики ассоциативных микроорганизмов рода Azospirillum являются одними из главных клеточных структур, определяющих успешность к взаимодействия азоспирилл с растениями. Они отвечают за направленное перемещение бактерий» (Zhulin and Armitage, 1993), выполняют функцию адгези-нов * (Michiels et al., 1991), участвуют в реализации социальной подвижности (Кацы, 2007) и представляют собой один из важнейших поверхностных антигенов азоспирилл (Бурыгин, 2003).

Гликозилирование белка в прокариотических организмах - относительно редкий процесс посттрансляционной модификации. Более десяти лет назад был установлен факт гликозилирования главного структурного'белка азоспирилл -флагеллина (Moens et al., 1995а), что ставит эти бактерии в один ряд с такими, представителями прокариот как Campylobacter (Logan et al., 1989), Helicobacter (Josenhans et al., 1999), Aeromonas (Rabaanef al., 2001), Caulobacter (Johnson et al., 1983), Pseudomonas (Takeuchi et al., 2003), Agrobacterium (Deakin et al., 1999),.Listeria (Schirm et al., 2004), Clostridium (Arnold et al., 1998). Однако до сих пор в известной нам литературе отсутствуют сведения- о размерах, структуре и функциях (^-связанного углевода гликозилированного флагеллина, полярного жгутика A brasilense Sp7, а также о наличии углеводных фрагментов в составе флагеллинов* других штаммов азоспирилл. Отчасти это объясняется сложностью получения достаточных для анализа объемов химически чистого гликозилированного флагеллина, освобожденного от весьма прочно ассоциированного с ним чехла полисахаридной природы, который изолирует от окружающей среды филамент полярного жгутика азоспирилл (Бурыгин с соав!., 2007). Это обстоятельство делает актуальными усилия, направленные на разработку приемов выделения и очистки гликозилированного флагеллина данных почвенных бактерий.

Изучение структуры и свойств полярных жгутиков ассоциативных азоспирилл является весьма перспективной фундаментальной задачей, имеющей большое значение для понимания механизмов взаимодействия микроорганизмов с растениями. При этом следует отметить, что изучение гликозилирован-ных бактериальных флагеллинов представляет несомненный практический интерес, поскольку основанная на полученных знаниях углеводная инженерия может способствовать решению проблемы микробного производства гликопро-теинов с заданными свойствами.

Целью настоящей работы было получение новых сведений о строении и свойствах гликозилированного флагеллина полярного жгутика ассоциативных бактерий рода. Люярп-Шит.

Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Оптимизировать способ препаративного получения химически чистого гликозилированного флагеллина полярного жгутика бактерий рода А2ояр1гШит.

2. Изучить структуру углеводных фрагментов флагеллина типового штамма^. ЬгазИете.

Научная новизна работы.

Проведена оптимизация метода выделения и очистки гликозилированного флагеллина полярного жгутика азоспирилл, позволившая впервые получить данный белок в препаративном количестве. В работе впервые показано наличие нетипичной для бактериальных гликозилированных флагеллинов доли углеводных фрагментов у типового штамма А. ЬгазИепБе 8р7. Впервые установлено строение повторяющегося звена О-связанного полисахарида, входящего в состав молекулы гликозилированного флагеллина полярного жгутика А. Ьгаййете 8р7, состоящего из остатков рамнозы, глюкозамина, фукозы и галактозы. Впервые показана серологическая вариабельность углеводных фрагментов флагеллинов азоспирилл.

Практическая значимость работы.

Выделены и иммунохимически охарактеризованы флагеллины полярных j жгутиков 22 штаммов бактерий рода Azospirillum, которые могут быть рекомендованы к использованию в in vitro экспериментах по исследованию роли этих структур в реализации различных типов межорганизменных взаимодействий. Полученные в работе препараты были использованы при выполнении плановых НИР ИБФРМ РАН. Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами химического факультета Саратовского госуниверситета.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Углеводные фрагменты флагеллина полярного жгутика типового, штамма A. brasilense Sp7 состоят из остатков рамнозы, глюкозами на, фукозы и галактозы в равном соотношении.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на 2-ой и 4-ой Региональных и 5-ой Всероссийской конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2004; 2008; 2010); Международной научной конференции молодых ученых «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006); 12-ой, 13-ой и 14-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008; 2009; 2010) и 5-ой Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Беляков, Алексей Евгениевич

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован способ препаративного получения химически чистого гликозилированного флагеллина полярного жгутика азоспирилл, позволивший выделить и иммунохимически охарактеризовать флагеллины двух десятков штаммов азоспирилл.

2. Впервые продемонстрировано наличие О-полисахарида в составе бактериального флагеллина.

3. Показано, что в состав углеводных фрагментов флагеллина типового штамма А. brasilen.se Бр7 входят остатки рамнозы, глюкоза-мина, фукозы и галактозы в равном соотношении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе изучены особенности строения и антигеных свойств гликозилированного флагеллина полярного жгутика ассоциативных бактерий рода Azospirillum. При этом большое внимание отведено решению проблемы получения химически чисюго фла1 еллина, освобожденною oí весьма прочно ассоциированного с ним чехла полисахаридной природы (Бу-рыгин с соавт., 2007). В этой связи определены фаза роста бактериальной культуры, на которой обеспечивается эффективное выделение флагеллина полярного жгутика с минимальным содержанием других примесных макромолекул, и наиболее эффективный способ отделения нити жгутика от бак i е-риальной клетки. В процессе отработки процедуры препаративного получения флагеллина азоспирилл доказана неспособность к самосборке надмолекулярных структур при варьировании кислотности среды (возможно, определяемая присутствием углеводных фрагментов в составе жгутика). Обнаружено, что гликозилированный флагеллин полярного жгутика азоспирилл при водно-фенольной экстракции переходит в фенольную фракцию; а при высаливании сульфатом аммония наиболее эффективны концентрации 50-70% от насыщенной.

В работе впервые показана нетипично большая для бактериальных полярных жгутиков доля углеводных фрагментов в составе гликозилированного флагеллина и установлено сходство моносахаридного состава и антигенных свойств этих углеводных фрагментов и Л ПС у типового штамма А. brasilense Sp7. В качестве одного из наиболее существенных результатов работы мы рассматриваем получение приоритетных данных о наличии О-полисахарида в составе субъединиц полярного жгутика азоспирилл. Следуе1 отметить, что ранее в составе гликозилированных флагеллинов бактерий другие исследователи описывали только моно- или олигосахаридные заместители (Logan, 2006).

Обнаружение полисахарида в составе флагеллина хорошо объясняет природу прочной ассоциации ранее выявленного (липо)полисахаридного чехла* с нитью полярного жгутика у бактерий рода АгоБртПит (Бурыгин с соавт., 2007), поскольку основой прочной связи могу г являться углевод-углеводные взаимодействия О-полисахарида флагеллина с соответствующими структурами в составе чехла.

Оптимизированный в.работе способ препаративного получения высо-коочищенного гликозилированного флагеллина полярного жгутика азоспи-рилл позволил выделить и иммунохимически охарактеризовать флагеллины двух десятков штаммов азоспирилл, относящихся к трем видам: А. Ьга$Иеп$е. А. Нро/егит и А. /гакете. Методом иммуноэлектрофореза выявлены две изо-формы флагеллина, проявляющие антигенную идентичность и формирующие сливающиеся полосы преципитации.

Анализ методом иммуноблоттинга препаратов флагеллинов серологически различных штаммов азоспирилл с использованием Ат к флагеллину типового штамма А. ЬгаБПете 8р7 выявил высокую консервативность белковых антигенных детерминант Н-антигена данных бактерий. В то время как результаты иммуноблоттинга препаратов флагеллинов с Ат к О-антигенам азоспирилл выявили различия в антигенных свойствах углеводных фрагментов флагеллинов. Для штаммов азоспирилл, относящихся к разным серологическим типам (8р7 и 8р245) установлено, что углеводные фрагменты их флагеллинов проявляют групповую серологическую специфичность, сходную со специфичностью их О-антигенов. Совокупность полученных результатов и анализ литературных данных позволили сделать вывод о близком сходстве полисахаридных структур флагеллина и ЛПС у бактерий рода А208рич11ит.

Установлено, что углеводные фрагменты в составе флагеллина не обладают иммуногенной активностью, и в процессе получения Ат к флагеллину синтезируются иммуноглобулины, специфичные только к белковой части молекулы. При этом показано, что белковые детерминанты флагеллина полярного жгутика азоспирилл характеризуются очень высокой термостабильностью, вероятно, обеспечиваемой полисахаридными фрагментами гликози-лированного флагеллина. Таким образом, с учетом полученных данных о не-иммуногенности этих структур в составе флагеллина наряду с их способностью in vitro взаимодействовать с О-специфическими антителами, весьма непротиворечивым выглядит предположение о том, что полисахаридные фрагменты у азоспирилл могут участвовать в формировании нити бактериального жгутика.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Беляков, Алексей Евгениевич, Саратов

1. Аленькина С.А., Петрова Л.П., Никитина В.Е. Получение и характеристика мутанта Azospirillum brasilense Sp7 по лектиновой активности // Микробиология. 1998. - Т. 63, №6 - С. 763-768.

2. Бойко A.C. Структурные особенности липополисахаридов азоспирилл в связи с их участием в коммуникации микроорганизмов в ризосфере: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов: ИБФРМ РАН, 2009. 24 с.

3. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Изменение антигенных свойств липополисахаридов Azospirillum brasilense при внесении в среду культивирования трис(гидроксиметил)аминометана // Прикл. био-хим. и микробиол. 2002. - Т.38, №3. - С. 292-294.

4. Бурыгин Г.Л. Сравнительное изучение О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillm: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов* ИБФРМ РАН, 2003. 22 с.

5. Бурыгин ГЛ., Широков A.A., Шелудько A.B., Кацы Е.И., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. // Выявление чехла на поверхности полярного жгутика Azospirillum brasilense // Микробиология. 2007. - Т. 76, №6 - С. 822-829.

6. Дорошенко Е.В., Булыгина Е.С., Спиридонова Е.М., Турова Т.П., Кравченко И.К. Выделение и характеристика азот фиксирующих бак хер и й рода Azospirillum из почвы сфагнового болота // Микробиология. -2007. Т. 76, №1 - С. 107-115.

7. Каталог коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН: Электронный документ. (http://www.ibppm.saratov.ru/PDF/collcct.pdi). Проверено 25.11.2010.

8. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та; 2003. 172 с.

9. Кацы Е.И. Молекулярная генетика ассоциативного взаимодействия бактерий и растений / Под. ред. В.В. Игнатова. М.: Наука, 2007. - 86 с.

10. П.Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин Г.Л., Ще-голев С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense II Микробиология. 2003. - Т. 72, №1 - С. 60-63.

11. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 1998. - T. 67, №6 -С. 815-820.

12. Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Антигенная идентичность липополисаха-ридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense II Микробиология. 2002. - T. 71, №2 - С. 211-214.

13. Метлина А.Л. Жгутики прокариот как система биологической подвижности // Успехи биол. химии. 2001. - Т. 41. - С. 229-282.

14. Метлина А.Л., Поглазов Б.Ф. Изучение конформационных изменений флагеллина при самосборке методом дисперсии оптического вращения // Биохимия. 1970. - Т. 35. - В. 5. - С. 994-1001.

15. Петрова Л.П., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Борисов И.В., Кацы Е.И. Анализ ДНК, ряда культурально-морфологических свойств и структуры липополисахаридов у близкородственных штаммов Azospirillum brasilense II Микробиология. 2005. - T. 74, № 2. - С. 224-230.

16. Позднякова Л.И., Каневская C.B., Леванова Г.Ф. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология. 1988. - Т. 57, № 2. - С. 275 - 278.

17. Тимаков В.Д., Левашев B.C., Борисов Л.Б. Микробиология. М.: Медицина, - 1983. - 512с.

18. Широков А.А. Иммунохимическая идентификация поверхностных структур Azospirillum brasilense, участвующих в реализации «социального» поведения бактерий: Дис. канд. биол. наук. Саратов: ИБФРМ РАН, 2008. 24 с.

19. Agarwala-Dutt R., Tilak K.V.B.R., Rana J.P.S. Isolation of Azospirillum from interior of various parts of some graminaceous plants // Z. Mikrobiol. -1991.-B. 146.-S. 217-219.

20. Aizawa S. Flagellar motor proteins // Tanpakushitsu kakusan koso. 2001. -V. 46.-P. 1750-1753.

21. Aizawa S. A top runner of the flagellar world has unexpectedly gone // Biochim. Biophys. Acta. 2004. - V. 1694(1-3). - P. 3-4.

22. Aizawa S.-I. What is essential for flagellar assembly? // Pili and flagella: current research and future trends / Ed. K.F. Jarrell. Caister Academic Press, 2009.-P. 91-98.

23. Alexandre G., Rohr R., Bally R. A phase variant of Azospirillum lipoferum lacks a polar flagellum and constitutively expresses mechanosensing lateral flagella // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 4701 -4704.

24. Aim R.A., Trust T.J. Analysis of the genetic diversity of Helicobacter pylori: the tale of two genomes // J. Mol. Med. 1999. - V. 77. - P. 834846.

25. Apweiler R., Hennjakob H., Sharon N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1473(1). - P. 4-8.

26. Arnold, F., Bedouet, L., Batina, P., Robreau, G., Talbot, F., Lecher, P. & Malcoste, R. Biochemical and immunological analyses of the flagellin of Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 // Microbiol. Immunol. 1998. -V. 42.-P. 23-31.

27. Arora S. K., Bangera M., Lory S., Ramphai R. A genomic island in Pseudomonas aeruginosa carries the determinants of flagellin glycosylation I I Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. - V. 98. - P. 9342-9347.

28. Arora S.K., Neely A.N., Blair B., Lory S., Ramphai R. Role of motility and flagellin glycosylation in the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa burn wound infections // Infect. Immun. 2005. - V. 73. - P. 4395-4398.

29. Asakura S., Eguchi G., lino T. Reconstitution of bacterial flagella in vitro II J. Mol. Biol. 1964. - V. 10. - P. 42-56.

30. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Döbereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - P. 924-929.

31. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Döbereiner J. Inoculation of field-grown wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum sp. // Brasil. Biol. Fertil. Soils. -1987.-4.-P. 37-40.

32. Barbieri P., Zanelli T., Galli E., Zanetti G. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1986. - V«. 36.-P. 87-90.

33. Bashan Y., Holguin G. Azospir ilium-p 1 ant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) 11 Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. -P. 103-121.

34. Bashan Y., Levanony H. Active attachment of Azospirillum brasilense Cd to quartz sand and to light-textured soil by protein bridging // J. General Microbiol. 1988. - V. 134. - P. 2269-2279.

35. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (19972003) // Can. J. Microbiol. 2004. - V. 50. - P. 521-577.

36. Bashan Y., de-Bashan L.E. How the plant growth-promoting bacterium Azospirillum promotes plant growth a critical assessment // Adv. Agronomy.-2010.-V. 108.-P. 77-136.

37. Beijerinck M.W. Über ein Spirillum, welches freien Stickstoff binden kann? // Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkun. Infektionskr. Hyg. 1925. - B. 63. - S. 353-359.

38. Bekri M.A., Desair J., Keijers V., Proost .P, Searle-van Leeuwen M., Vanderleyden J., Vande Broek A. Azospirillum irakense produces a novel type of pectate lyase // J. Bacteriol. 1999. - V. 181(8). - P. 2440-2447.

39. Bhattacharya P. Mode of utilization of amino acids as growth substrates by Azospirillum brasilense II Indian J. Exp. Biol. 2005. - V. 43. - P. 11821191.

40. Bradford M. N. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

41. Brimer C.D., Montie T.C. Cloning and comparison of fliC genes and identification of glycosylation in the flagellin of Pseudomonas aeruginosa atype strains// J. Bacteriol. 1998.- V. 180.-P. 3209-3217.J

42. Carlson M. Oligosaccharides isolated from pig submaxillary mucin // J. Biol. Chem. 1966. - V. 241. - P. 2984-2986.

43. Castric P. pilO, a gene required for glycosylation of Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin//Microbiology. 1995.-V. 141.-P. 1247-1254.

44. Day J.M., Dobereiner J. Physiological aspects of N2-fixation by a Spirillum from Digitaria roots II Soil Biol. Bochem. 1976. - V.8. - P. 45-50.

45. Dazzo F.B., Brill W.J. Bacterial polysaccharide which binds Rhizobium trifolii to clover root hairs // J. Bacteriol. 1979. - V. 137(3). - P. 13621373.

46. Del Gallo M., Negi M., Neira C.A. Calcofluor- and lectin-binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum ¡1 J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 3504-3510.

47. Del Gallo M., Haegi A. Characterization and quantification of exocellular polysaccharides in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum // Symbiosis.-1990.-V. 9.-P. 1-3.

48. Dennis J.W., Granovsky M., Warren C.E. Glycoprotein glycosylation and cancer progression//Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1473(1). - P. 2134.

49. Diaz-Zortia M., Fernandez-Canigia M.V. Field performance of a liquid formulation of Azospirillum brasilense on dryland wheat productivity // Eur. J. Soil Biol. 2009. - V. 45. - P. 3-11.

50. Dobereiner J., Baldani V.L. Selective infection of maize roots by streptomycin-resistant Azospirillum lipoferum and other bacteria // Can. J. Microbiol. 1979.- V. 25-P. 1264-1269.

51. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. Intern. Symp. on N2-Fixation. Washington, 1976. - P. 518-537.

52. Dobereiner J., Pedrosa F.O. Nitrogen-fixing bacteria in nonleguminous crop plants. Berlin, 1987. - 150 p.

53. Doig P., Kinsella N., Guerry P., Trust T. J. Characterization of a post-translational modification of Campylobacter flagellin: identification of asero-specific glycosyl moiety // Mol. Microbiol. 1996. - V. 19. - P. 379387.

54. Driks A., Bryan R., Shapiro L., DeRosier D.J. The organization of the Caulobacter crescentus flagellar filament // J. Mol. Biol. 1989. - V. 206(4). - P. 627-636.

55. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Roberts P. A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugar and related substances // Anal. Biochem. 1956. - V. 72. - P. 350-356.

56. Eckert B., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffels M., Hartmann A. Azospirillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51.-P. 17-26.

57. Emerson S.U., Tokuyasu K., Simon M.I. Bacterial flagella: polarity of elongation// Science. 1970. - V. 169. - P. 190-192.

58. Evans L.D., Stafford G.P., Ahmed S., Fraser G.M., Hughes C. An escort mechanism for cycling of export chaperoncs during flagellum assembly // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006. - V. 103(46). - P. 17474-17479.

59. Ewing C.P., Andreishcheva E., Guerry P. Functional characterization of flagellin glycosylation in Campylobacter jejuni 81-176 // J. Bacteriology. -2009.-V.188 (12).-P. 7086-7093.

60. Feizi T. Carbohydrate-mediated recognition systems in innate immunity // Immunol. Rev. 2000. - V. 173. - P. 79-88.

61. Felix G., Duran J.D., Volko S., Boiler T. Plants recognise bacteria through the most conserved domain of flagellin // Plant J. 1999. - V. 18. - P. 265276.

62. Fischer S.E., Miguel M.J., Mori G.B. Effect of root exudates on the exopolysaccharide composition and the lipopolysaccharide profile of Azospirillum brasilense Cd under saline stress // FEMS Microbiol. Lett. -2003.-V. 219(1).-P. 53-62.

63. Franklin C.L., Gorelick P.L., Riley L.K., Dewhirst F.E., Livingston R.S., Ward J.M., Beckwith C.S., Fox J.G. Helicobacter typhlonius sp. nov., a novel vurine urease-negative Helicobacter species // J. Clin. Microbiol. -2002. V. 39. - P. 3920-3926.

64. Fujii M., Shibata S., Aizawa S. Polar, peritrichous. and lateral flagella belong to three distinguishable flagellar families // J. Mol. Biol. 2008. - V. 379(2).-P. 273-283.

65. Ge Y., Li C., Corum L., Slaughter C. A., Charon N. W. Structure and expression of the FlaA periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi II J. Bacteriol. 1998. - 180. - P. 2418-2425.

66. Gómez-Gómez L., Bauer Z., Boiler T. Both the extracellular leucinc-rich repeat domain and the kinase .activity of FSL2 are required for flagellin binding and signaling in Arabidopsis II Plant Cell. 2001. - 13. - P. 11551163.

67. Gómez-Gómez L., Boiler T. FLS2: A LRR receptor-like kinase involved in recognition of the flagellin elicitor in Arabidopsis II Mol. Cell. 2000. - V. 5.-P. 1-20.

68. Gómez-Gómez L., Felix G., Boiler T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana II Plant J. 1999. - V. 18. - P. 277-284.

69. Gryllos I., Shaw J.G., Gavin R., Merino S., Tomas J.M. Role offlm locus in mesophilic Aeromonas species adherence // Infect. Immun. 2001. - V. 69. -P. 65-74.

70. Goon S., Kelly J.F., Logan S.M., Ewing C.P., Guerry P. Pseudaminic acid, the major modification on Campylobacter flagellin, is synthesized via the Cjl293 gene // Mol. Microbiol. 2003. - V. 50(2). - P. 659-671

71. Hall>P.G., Krieg N.R. Application of the indirect immunoperoxidase stain technique to the flagella of Azospirillum brasilense II Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 47. - P. 433-435.

72. Halsall D.M., Gibson A.H. Cellulose Decomposition and Associated Nitrogen Fixation by Mixed Cultures of Cellulomonas gelida and Azospirillum Species or Bacillus macerans II Appl. Environ. Microbiol. -1985.-V. 50(4).-P. 1021-1026.

73. Hadas R., Okon Y. Effect of Azospirillum brasilense inoculation on root morphology and respiration in tomato seedlings 11 Biol. Fertil. Soils. 1987. -V. 5.-P. 241-247.

74. Hartmann A., Bashan Y. Ecology and application of Azospirillum and other plant growth-promoting bacteria (PGPB) // Eur. J. Soil Biol. 2009. - V. 45.-P. 1-2.

75. Herrmann J.L., O'Gaora P., Gallagher A., Thole J.E., Young D.B. Bacterial glycoproteins: a link between glycosylation and proteolytic cleavage of a 19 kDa antigen from Mycobacterium tuberculosis II EMBO J. 1996. - V. 15(14).-P. 3547-3554.

76. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella polysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983. -V. 154. - P. 269-277.

77. Hitchen P.G., Dell A. Bacterial glycoproteomics // Microbiology. 2006. -V. 152.-P. 1575-80.

78. Johnson, R. C., Ferber, D. M. & Ely, B. Synthesis and assembly of flagellar components by Caulobacter crescentus motility mutants // J. Bacteriol. -1983.-V. 154.-P. 1137-1144.

79. Josenhans C., Ferrero R. L., Labigne A., Suerbaum S. Cloning and allelic exchange mutagenesis of two flagellin genes of Helicobacter felis // Mol. Microbiol. 1999. - V. 33. - P. 350-362.

80. Kagawa Ii., Morishita H., Enomoto M. Reconstitution in vitro of flagellar filaments onto hook structures attached to bacterial cells // J. Mol. Biol. -1981.-V. 153(2).-P. 465-470.

81. Kapulnik Y., Okon Y., Henis Y. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation // Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31. -P. 881-887.

82. Katzy E.I., Matora L. Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-Mda plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in the production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. - V. 40. - P. 73-83.

83. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A.D., Kaiser P. Azospirillum , irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil // Res. Microbiol. 1989. - V. 140. - P. 679-693.

84. Krieg N.R., Dobereiner J. Genus Azospirillum Tarrand, Krieg and Dobereiner 1979 // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. V. 1. -Baltimore/London: Williams & Wilkins, 1984. P. 94-104.

85. Krupski G., Gotz R., Ober K., Pleier E., Schmitt R. Structure of complex flagellar filaments in Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1985. - V. 162(1). -P. 361-366.

86. Kubori T., Shimamoto N., Yamaguchi S., Namba K., Aizawa S. Morphological pathway of flagellar assembly in Salmonella typhimurium II J. Mol. Biol. 1992. - V. 226(2). - P. 433-446.

87. Kutsukake K., Okada T., Yokoseki T., lino T. Sequence analysis of the JlgA gene and its adjacent region in Salmonella typhimurium, andidentification of another flagellar gene, flgN II Gene. 1994. - V. 143(1). -P. 49-54.

88. LeClerc G., Wang S. P., Ely B. A new class of Caulobacter crescentus flagellar genes // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 5010-5019.

89. Levanony H., Bashan Y. Enhancement of cell division in root tips and growth of the elongation zone in wheat roots induced by Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Bot. 1989. - V. 67. - P. 56-61.

90. Levanony H., Bashan Y. Localization of Specific Antigens of Azospirillum brasilense Cd in Its Exopolysaccharide by Immuno-Gold Staining // Curr. Microbiol.- 1989.-V. 18.-P. 145-149.

91. Lin S.Y., Young C.C., Hupfer H., Siering C., Arun A.B., Chen W.M., Lai W.A., Shen F.T., Rekha P.D., Yassin A.F. Azospirillum picis sp. nov., isolated from discarded tar // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. - V. 59. -P. 761-765.

92. Lisowska E. The role of glycosylation in protein antigenic properties // Cell. Mol. Life Sci. 2002. - V. 59(3). - P. 445-455.

93. Logan S.M., Trust T.J., Guerry P. Evidence for posttranslational modification and gene duplication of Campylobacter flagellin // J. Bacteriol. 1989.-V. 171(6).-P. 3031-3038.

94. Logan S.M. Flagellar glycosylation a new component of the motility repertoire? //Microbiology. -2006. - V. 152.-P. 1249-1262.

95. Logan S.M., Kelly J.F., Thibault P., Ewing C.P., Guerry P. Structural heterogeneity of carbohydrate modifications affects serospecificity of Campylobacter flagellins // Mol. Microbiol. 2002. - V. 46. - P. 587-597.

96. Lu D., Wu Sh., He P., Shan L. Phosphorylation of receptor-like cytoplasmic kinases by bacterial flagellin // Plant Signal Behav. 2010. - V. 5.-P. 598-600.

97. Macnab R.M. How bacteria assemble flagella // Annu. Rev. Microbiol. -2003.-V. 57.-P. 77-100.

98. Magalhaes F.M., Baldani J.I., Souto S.M., Kuykendall J.R., Dobereiner J. A new acid-tolerant Azospirillum species // An. Acad. Brasil Cienc. 1983. - 55.-S. 417-430.

99. Martin-Didonet C.C., Chubatsu L.S., Souza E.M:, Kleina M., Rego F.G., ■ Rigo L.U., Yates M.G., Pedrosa F.O. Genome structure of the genus

100. Azospirillum II J. Bacteriol. 2000. - V. 182(14). - P. 4113-4116.

101. McGarter L.L. Dual'flagellar systems enable motility under different circumstances // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2004. - V. 7(1-2). - P. 1829.

102. McMurry J.L., Murphy J.W., Gonzalez-Pedrajo B. The FliN-FliH interaction mediates localization of flagellar export ATPase Flil to the C ring complex // Biochemistry. -2006. V. 45(39). - P. 11790-11798.

103. Mehnaz S., Weselowski B., Lazarovits G. Azospirillum canadense sp: nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. - V. 57. - P. 620-624.

104. Mescher M.F., Strominger J.L. Purification and characterization of a prokaryotic glucoprotein from the cell envelope of Halobacterium salinarium II J. Biol. Chem. 1976. - V. 251(7). - P. 2005-2014.

105. Michiels K., Croes C.L., Vanderleyden J. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137. - P. 2241-2246.

106. Mimori-Kiyosue Y., Yamashita I., Yamaguchi S., Namba K. Role of the outermost subdomain of Salmonella flagellin in the filament structure revealed by electron microscopy // J. Mol. Biol. 1998: - V. 284. — P. 521530.

107. Minamino T., Yamaguchi S., Macnab R. M. Interaction between FliE and FlgB, a proximal rod component of the'flagellar basal body of Salmonella II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 3029-3036.

108. Minamino T., Namba K. Self-assembly and type III protein export of the bacterial flagellum // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2004. - V. 7. - P. 5-17.

109. Minamino T., Imada K., Namba K. Mechanisms of type III protein export for bacterial flagellar assembly // Mol. Biosyst. 2008. - V. 4. - P.^l 1051115.

110. Moens S., Michiels K., Vanderleyden J. Glycosylation of the flagellin of the polar flagellum of Azospirillum brasilense, a gram-negative nitrogen-fixing bacterium // Microbiology. 1995. - V. 141. - P. 2651-2657.

111. Moens S., Michiels K., Keijers V., van Leuven F., Vanderleyden J. Cloning, sequencing, and phenotypic analysis of lafl, encoding the flagellin of the lateral flagella of Azospirillum brasilense Sp7 // J. Bacteriol. 1995. -V. 177.-P. 5419-5426.

112. Nambu T., 'Minamino T., Macnab R.M., Kutsukake K. Peptidoglycan-hydrolyzing activity of the FlgJ protein, essential for flagellar rod formation in Salmonella typhimurium I I J. Bacteriol. 1999. - V. 181(5). - P. 15551561.

113. Novikov V.V., Metlina A.L., Poglazov B.F. A study on the mechanism of polymerisation of Bacillus brevis flagellin // Biochem. Mol. Biol. Int. -1994. V. 33(4). - P. 723-728.

114. Nlihse T.S., Peck S.G., Hirt H., Boiler T. Microbial elicitors induce activation and dual phosphorylation of the Arabidopsis thaliana МАРК 6 // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 7521-7526.

115. Nur I., Okon Y., Henis Y. Comparative studies of nitrogen-fixing bacteria associated with grasses in Israel with Azospirillum brasilense II Can. J. Microbiol. 1980. -V. 26. - P. 714-718.

116. Okon Y., Albrecht S.L., Burris R.H. Factors affecting growth and nitrogen fixation of Spirillum lipoferum //J. Bacteriol. 1976. - V. 127(3), - P. 12481254.

117. Okon Y., Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum-inoculated roots // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 3-16.

118. Onyeocha I., Vieille C., Zimmer W., Baca B.E., Flores M., Palacios R., Elmerich C. Physical map and properties of a 90-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp7 // Plasmid. 1990. - V. 23(3). - P. 169-182.

119. Parge H.E., Forest K.T., Hickey M.J., Christensen D.A., Getzoff E.D., Tainer J.A. Structure of the fibre-forming protein pilin at 2.6 A resolution // Nature. 1995. - V. 378. - P. 32-38.

120. Paul K., Erhardt M., Hirano Т., Blair D.F., Hughes K.T. Energy source of flagellar type III secretion // Nature. 2008. - V. 451(7177). - P. 489-492.

121. Peng, G., Wang, H., Zhang, G., Hou, W., Liu, Y., Wang, E. Т., Tan, Z. Azospirillum. melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006.- 56. - 1263-127.

122. Power'P.M., Jennings M.P. The genetics of glycosylation in Gramnegative bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V. 218. - P. 211-222.

123. Rabaan, A.A., Gryllos, I., Tomas, J.M., Shaw, J. G. Motility and the polar flagellum are required for Aeromonas caviae adherence to HEp-2 cells // Infect. Immun. 2001. - V. 69. - P. 4257-4267.

124. Reinhold B.B., Hauer C.R., Plummer T.H., Reinhold VN. Detailed structural analysis of a novel, specific O-linked glycan from the prokaryote Flavobacterium meningosepticum II J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 13197-13203.

125. Reuter G., Gabius H.J. Eukaryotic glycosylation: whim of nature or multipurpose tool? // Cell. Mol. Life Sei. 1999. - V. 55. - P. 368-422.

126. Sadasivan L., Neyra C.A. Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum: exopolysaccharides and cyst formation // J. Bacteriol. 1985. - V. 163(2). - P. 716-723.

127. Schirm M., Kalmakoff M., Aubry A., Thibault P., Sandoz M., Logan S.M. Flagellin from Listeria monocytogenes glycosylated with beta-O-linked N-acetylglucosamine // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - P. 6721-6727.

128. Schirm M., Schoenhofen I.C., Logan S.M., Waldron K.C., Thibault P. Identification of unusual bacterial glycosylation by tandem massspectrometry analyses of intact proteins // Anal. Chem. 2005. - V. 77(23).- P. 7774-7782.

129. Schloter M., Bode W., Hartmann A. Characterization of monoclonal antibodies against cell surface structures of Azospirillum brasilense Sp 7 using ELISA Techniques // Symbiosis. 1992. - v. 13. - p. 37-45.

130. Schrader K.N., Fernandez-Castro A., Cheung W.K., Crandall C.M., Abbott S.L. Evaluation of commercial antisera for Salmonella serotyping // J. Clin. Microbiol. 2008. - V. 46. - P. 685-688.

131. Soufiane B., Xu D., Côté J.C. Flagellin (FliC) protein sequence diversity among Bacillus thuringiensis does not correlate with H.serotype diversity // Antonie Van Leeuwenhoek. 2007. - 92(4). - P. 449-461.

132. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24,- P. 487-506.

133. Stevenson G., Neal B., Liu D., Hobbs M., Packer N.H., Batley M„ Redmond J.W., Lindquist L., Reeves P. Structure of the O antigen of Escherichia coli K-12 and the sequence of its rfb gene cluster // J. Bacteriol.- 1994. V. 176(13). - P. 4144-4156.

134. Suzuki T., lino T., Horiguchi T., Yamaguchi S. Incomplete flagellar structures in nonflagellate mutants of Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1978. -V. 133(2). - P. 904-915.

135. Szymanski C.M., Yao R., Ewing C.P., Trust T.J., Guerry P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni // Mo I. Microbiol. 1999. -V. 32(5). - P. 1022-1030.

136. Szymanski C.M., Burr D.H., Guerry P. Campylobacter protein glycosylation affects host cell interactions // Infect. Immun. 2002. - V. 70. - P. 2242-2244.

137. Szymanski C.M., Logan S.M., Linton D., Wren B.W. Campylobacter a tale of two protein glycosylation systems // Trends Microbiol. - 2003. - V. 11(5).-P. 233-238.

138. Szymanski C.M., Wren B.W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - V. 3(3). - P. 225-237.

139. Taguchi F., Shimizu R., Inagaki Y., Toyoda K., Shiraishi T., Ichinose Y Post-translational modification of flagellin determines the specificity of HR induction // Plant Cell Physiol. 2003. - V. 44. - P. 342-349.

140. Takahashi N., Mizuno S., Hirano T., Chevance F.F., Hughes K.T., Aizawa S. Autonomous and FliK-dependent length control of the flagellar lod in Salmonella enterica II J. Bacteriol. 2009. - V. 191(20). - P. 6469-6472.

141. Takai R., Isogai A., Takayama S., Che F.S. Analysis of flagellin perception mediated by flg22 receptor OsFLS2 in rice // Mol. Plant Microbe Interact. -2008.-V.21.-P. 1635-1642.

142. Takeuchi, K., Taguchi, F., Inagaki, Y., Toyoda, K., Shiraishi, T. & Ichinose, Y. // Flagellin glycosylation island in Pseudomonas syringae pv glycinea-and its role in host specificity // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P 6658-6665.

143. Thibault P, Logan SM, Kelly JF, Brisson JR, Ewing CP, Trust TJ, Guerry P. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276(37). - P. 34862-34870.

144. Tien T.M., Diem H.G., Gaskins M.H., Hubbell D.H. Polygalacturonie acid transeliminase production by Azospirillum species // Can. J. Microbiol. -1981.-V. 27.-P. 426-431.

145. Tronick S.R, Martinez'R.J. Methylation of the flagellin of Salmonellattyphimurium IIJ Bacteriol. 1971. - V. 105. - P. 211-219.

146. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharidesin polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. - V. 119.-P. 115-119.

147. Tsang V.C.W., Peralta J.M., Simons A.R. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot techniques (ELISA) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis // Methods Enzymol. 1983. - V. 92. - P. 377-391.

148. Tsuboi S., Fukuda M. Roles of O-linked oligosaccharides in immune responses // Bioessays. 2001. - V. 23(1). - P. 46-53.

149. Tyler M.E., Milam J.R., Smith R.L., Schank S.C., Zuberer D.A. Isolation of Azospirillum from diverse geographic regions // Can. J. Microbiol. -1979.-V. 25.-P. 693-697.

150. Umali-Garcia M., Hubbell D., Gaskins M., Dazzo F. Association of Azospirillum with grass roots I I Appl. Environ. Microbiol. 1980. - V. 53. -P. 1397-1405.

151. Vanbleu E., Choudhuru B.P., Carlson R.W., Vanderleyden J. The nodPQ genes in Azospirillum brasilense Sp7 are involved in sulfation of lipopolysaccharides // Environ. Microbiol. 2005. - V. 7. - P. 1769-1774.

152. Van den Steen P., Rudd P.M., Dwek R.A., Opdenakker G. Concepts and principles of (9-linked glycosylation // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. -1998.-V. 33(3).-P. 151-208.

153. Verma A., Schirm M., Arora S.K., Thibault P., Logan S.M., Ramphai R. Glycosylation of b-type flagellin of Pseudomonas aeruginosa: structural andgenetic basis // J. Bacteriology. 2006. - V.188 (12). - P. 4395-4403.i

154. Weil E., Felix A. Untersuchungen über das Wesen der Flickfieberagglutination // Wien Klin. Wochenschr. 1917. - B. 30. - S. 393-399.

155. Westby C.A., Cutshall D.S., Vigil G.V. Metabolism of various carbon sources by Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 1983. - V. 156(3). - P. 1369-1372.

156. Wieland F., Paul G., Sumper M. Halobacterial flagellins are sulfated glycoproteins // J. Biol. Chem. 1985. -V. 260(28). - P. 15180-15185.

157. Wyss C. Flagellins, but not endoflagellar sheath proteins, of Treponema-pallidum and of pathogen-related oral spirochetes are glycosylated // Infect. Immun. 1998.-V. 66.-P. 5751-5754.

158. Xie, C.-H., Yokota, A. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from,the roots of the rice plant Oryza sativa II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2005 -V. 55. P. 1435-1438.

159. Yegorenkova I.V., Konnova S.A., Sachuk V.N., Ignatov V.V. Azospirillum brasilense colonisation of wheat root and the role of lectin-carbohydrate interactions in bacterial adsorption and root-hair deformation // Plant Soil. -2001. V. 231. - P. 275-282.

160. Yonekura K., Maki S., Morgan D.G., DeRosier D.J., Vonderviszt F., Imada K., Namba K. The bacterial flagellar cap as the rotary promoter of flagellin self-assembly // Science. 2000. - V. 290. - P. 2148-2152.

161. Young C.C., Hupfer H., Siering C., Ho M.J., Arun A.B., Lai W.A., Rekha P.D., Shen F.T., Hung M.H., Chen W.M., Yassin A.F. Azospirillum rugosum sp. nov., isolated from oil-contaminated soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2008.-V. 58.-P. 959-963.

162. Zhou Y., Wei W., Wang X., Xu L., Lai R. Azospirillum palatum sp. nov., isolated from forest soil in Zhejiang province, China // J. Gen. Appl. Microbiol. 2009. - V. 55(1). - P. 1-7.

163. Zhulin I.B, Armitage J.P. Motility, chemokinesis and methylation-independent chemotaxis in Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 1993. -V. 175.-P. 952-958.

Информация о работе

Беляков, Алексей Евгениевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Гликозилированный флагеллин полярного жгутика бактерий рода Azospirillum - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Гликозилированный флагеллин полярного жгутика бактерий рода Azospirillum ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гликозилированный флагеллин полярного жгутика бактерий рода Azospirillum"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Беляков, Алексей Евгениевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гликозилированный флагеллин полярного жгутика бактерий рода Azospirillum"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Беляков, Алексей Евгениевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Беляков, Алексей Евгениевич, Саратов

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гликозилированный флагеллин полярного жгутика бактерий рода Azospirillum
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия